CN102905713A - 一种递送和采用异硫氰酸酯预防和/或治疗膀胱癌的新型方法 - Google Patents

一种递送和采用异硫氰酸酯预防和/或治疗膀胱癌的新型方法 Download PDF

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Abstract

提供一种组合物，其中包含茎椰菜种子和芥菜种子的混合物。在混合茎椰菜种子和芥菜种子之前，茎椰菜受烘烤和加压热处理。该茎椰菜种子在温度至少200华氏度下烘烤至少60分钟，并在温度至少200华氏度下且压力至少10磅/平方英寸下受加压热处理至少5分钟。本发明还提供了一种在个体中治疗和/或预防膀胱癌的方法。该方法包括口服给予个体含有异硫氰酸酯（ITC）的组合物使得所述给予抑制膀胱癌的生长和/或复发。

Description

一种递送和采用异硫氰酸酯预防和/或治疗膀胱癌的新型方法
相关申请的交叉引用
本申请请求2010年3月11日提交的美国临时专利申请61/313,004的优先权，其内容通过引用纳入本文。
政府权利
本发明在国立癌症研究院提供的R01CA124627号政府资助下完成。政府对本发明享有一定的权利。
发明领域
本发明一般涉及癌症治疗的领域，并且更具体涉及异硫氰酸酯(ITC)治疗和/或预防膀胱癌的用途。
发明背景
在西方社会，膀胱癌在男性和女性中分别是第四和第八位最常见恶性肿瘤[1]，大部分（约80%）初始诊断为浅表性非浸润性肿瘤，对其进行经尿道切除术仍是首选疗法，而在复发风险高的情况中则再进行膀胱内免疫治疗或化疗。即使如此，几乎80％的患者会复发，约10％发展为更有侵略性的肌层浸润性肿瘤[2,3]。处于该病较高阶段的病人发展更频繁，其中三分之一死于该病。诊断出膀胱癌的年龄中值接近70岁(late 60s)[4]。顺铂联合化疗仍然是浸润性膀胱癌的主要疗法。在这种高龄下常见的肾功能障碍和性能不佳使得无法进行顺铂化疗，而所用的其他方案相对于顺铂联合化疗都不是最理想[5]。胆囊切除术和放疗与化疗经常伴有高发病率和死亡率[4]。因此，膀胱癌在治疗和处理上仍然是最昂贵的癌症之一。另外，大部分人膀胱癌检测为没有肌层浸润性的浅表性癌并用经尿道切除术治疗。因此，高复发危险的患者在手术后通过使用减毒卡介苗(BCG)的免疫疗法或化疗（例如丝裂霉素）来抑制复发。这些疗法不仅必须经过尿道递送来防止全身毒性作用，而且疗效有限并且局部副作用明显。另一方面，有可观比例的肌层浸润性膀胱癌患者先前没有发生浅表性疾病，并且，约50％的肌层浸润性膀胱癌患者在病情出现时已发生远距离转移[6]。尽管转移病例中初始应答率高达40-70%，但化疗的总存活率只有5-20%[5]。因此，对治疗以及预防膀胱癌，尤其是复发膀胱癌的方法一直有需求且未得到满足。
发明简述
本发明提供了治疗和/或预防膀胱癌的组合物和方法。该方法包括向诊断为、疑似患有、或有患膀胱癌风险的个体给予包括一种或多种ITC的组合物，以至该ITC的给予能够抑制膀胱癌的生长、肌层浸润和/或复发。该组合物包含各种ITC，包括但不限于含有ITC或其前体(硫代葡萄糖苷(glucosinolate))的蔬菜制品的各种混合物。
在一个实施方式中，本发明包括一种包含给予含ITC组合物的方法，其中所述ITC以含ITC的蔬菜制品的形式提供。该蔬菜制品包括但不限于：茎椰菜/茎椰菜芽提取物、茎椰菜种子粉、芥菜种子粉、辣根粗粉（meal）/粉末（powder）、山葵粉或其组合。在一个实施方式中，蔬菜制品包括茎椰菜种子。所述种子通过经受烘烤和加压热处理（例如高压蒸汽灭菌）来制备用于膀胱癌的治疗和/或预防。我们发现该方法可使表硫特异蛋白(epithiospecifier)（ESP）失活，这在经相应处理的种子与含黑芥子苷的产品（例如芥菜种子粉）混合时很有利。因此，在一个实施方式中，用于本发明的茎椰菜产品包含热/压力失活的ESP。这个独特的方法产生了适于优化递送异硫氰酸烯丙酯(AITC)和萝卜硫素(SF)两者的稳定产品。
本发明还提供了一种独特的给药方案，将含至少一种ITC的组合物以口服的方式给予个体并且优选在个体即将入睡的时候给予。该给药方案包括每日给予所述个体单份或多份无毒剂量的ITC并持续一段时间（至少几天）。
在各实施方式中，ITC是作为药物制品来提供的分离的和/或纯化的或合成的ITC。ITC的一些例子是AITC、异硫氰酸苄酯(BITC)、异硫氰酸苯乙酯(PEITC)和SF。在另一个实施方式中，ITC的衍生物和/或代谢物(包括谷胱苷肽偶联物、胱氨酰甘氨酸偶联物、半胱氨酸偶联物和N-乙酰半胱氨酸（NAC）偶联物)可单独或以各种组合给予。
附图简要说明
图1.AITC和SF的化学结构和推定的抗癌机制。箭头表示活化，符号T表示抑制。图中信息汇编自不同细胞系的已公开研究的集合。
图2.葡糖硫苷酶催化转化硫代葡萄糖苷为ITC以及ESP的干扰。
图3.AITC对细胞存活和增殖的作用。在人膀胱癌UM-UC-3细胞、大鼠膀胱癌AY-27细胞和正常的人膀胱上皮细胞(HUC)中以指定浓度来评估AITC。A.MTT试验测定的细胞生长抑制，AITC处理72小时。通过非线性回归曲线拟合计算IC50。B.流式细胞仪测定的细胞周期停滞(□,亚G1;
Figure BDA00002125813100031
G1;
Figure BDA00002125813100032
S;■,G2/M)，AITC处理24小时。均值±SE,n=3-6),*P<0.05。
图4.人膀胱癌UM-UC-3细胞中AITC对有丝分裂、微管蛋白表达以及细胞凋亡的影响。细胞用载剂或AITC处理24小时（各数值是均值±SD）。A.流式细胞仪对细胞周期停滞的分析。B.瑞式－姬姆萨(Wright-Giemsa)染色对核分裂像计数。箭头指向有丝分裂或有丝分裂崩溃中的细胞。C.微管的免疫荧光染色（绿色）以及DNA的DAPI染色（蓝色）。D.微管蛋白的蛋白质印记(GAPDH作为加样对照)。E.流式细胞仪测定的线粒体跨膜电位流失。F.胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3的蛋白质印记（GAPDH作为加样对照）。G.流式细胞仪测定的凋亡细胞（TUNEL细胞）。F和G中的细胞是用或不用20微摩尔Z-LEHD-FMK（胱天蛋白酶9抑制剂）共同处理过的细胞。
图5.人膀胱癌细胞中AITC和SF对环氧合酶2（Cox-2）表达的影响。人膀胱癌HT1376细胞过量表达Cox-2，该细胞用所示浓度的AITC或SF处理24小时，然后收集用于Cox-2的蛋白质印记分析。GAPDH用作加样对照。
图6.AITC抑制膀胱癌发展。雌性F344大鼠膀胱内接种膀胱癌AY-27细胞，以启动原位膀胱肿瘤发展。AY-27细胞接种一天后，开始每天一次口服给予0、10、25、50和300微摩尔/千克的AITC，三周后停止。每组的大鼠个数为6～33只不等；一些数据，尤其是对照组（n=33）和用最低剂量AITC处理组的数据，是从多个试验合并得来。A.初始和最终体重。B.膀胱肿瘤重量。荷瘤膀胱重量减去正常膀胱的平均重量得到膀胱肿瘤重量。*P<0.05.C.肿瘤浸润肌肉组织的膀胱百分比。D.正常大鼠膀胱壁(D1)，浅表性大鼠膀胱肿瘤(D2)和浸润肌层的大鼠膀胱肿瘤(D3)的H/E染色。
图7.F344大鼠中AITC的药物动力学。A和B.给予各含4～6只雌性大鼠的5个组10或300微摩尔/千克的单次口服量AITC，然后将所述大鼠置于代谢笼中用以在1.5、3、6、12和24小时时采集尿液（1只大鼠/笼）。每段时期结束时，取一组大鼠抽血，从中制备血浆。C.大鼠接种AY-27细胞3周后，给予原位膀胱肿瘤荷瘤大鼠300微摩尔/千克的单次口服量AITC。给予AITC后0小时(T1)、1.5小时(T2)和6小时(T3)时取出原位肿瘤。采用我们实验室研发的环缩合试验测定血浆、尿液和肿瘤组织匀浆中的AITC当量浓度。各数值是均值±SE。
图8.MSP-1抑制膀胱癌发展。雌性F344大鼠通过尿道导尿管接种AY-27细胞膀胱内，以启动原位膀胱癌发展。癌细胞接种一天后，开始每日一次用载剂（水）给予MSP-1，三周后停止。每组的大鼠个数为11～29不等。A.初始(□)和最终(■)体重。B.荷瘤膀胱重量减去正常膀胱的平均重量计算得到肿瘤重量。*P<0.05。A和B中的各数值为均值±SEM。C.肿瘤浸润肌肉组织的膀胱百分比。D.在UM-UC-3细胞(体外)、AY-27细胞（体外）和AY-27肿瘤（体内）中MSP-1对选定抗癌靶标的作用。细胞用MSP-1以13和26微摩尔的黑芥子苷浓度处理24小时。癌细胞接种一天后，开始每日一次用MSP-1以9或90微摩尔/千克的黑芥子苷剂量处理3周，然后从大鼠中取出膀胱肿瘤。用蛋白质印记检测细胞裂解物和肿瘤匀浆，使用GAPDH作为加样对照。
图9.MSP-1和茎椰菜种子粉（BSP）的混合物（MSP-1:BSP=1:1）抑制膀胱癌发展。雌性F344大鼠接种膀胱癌AY-27细胞以启动原位膀胱癌发展。AY-27细胞接种一天后，开始每日一次口服给予所述的粉末（黑芥子苷和萝卜硫苷(glucoraphanin)：各为10微摩尔/千克），三周后停止。每组的大鼠个数为9～10只。各数值是均值±SE。
发明内容
本发明涉及含ITC的组合物来治疗和/或预防膀胱癌的用途。ITC存在于日常消耗的十字花科蔬菜中。例如，AITC(其化学结构见图1)富含于芥菜，辣根和山葵中[8]，SF富含于茎椰菜（其化学结构见图1）[9,10]。ITC以生物惰性的硫代葡萄糖苷（β-硫糖苷N-羟基硫酸盐(β-thioglucosideN-hydroxysulfates)）储存于十字花科蔬菜中，并且所述硫代葡萄糖苷（例如黑芥子苷（AITC硫代葡萄糖苷））和萝卜硫苷（SF硫代葡萄糖苷）通过葡糖硫苷酶(硫糖苷-葡萄糖苷酶)转化为可快速自发重排而产生ITC的亚氨逐硫代羧酸酯-O-磺酸盐（thiohydroximate-O-sulfonates）。正常情况下，葡糖硫苷酶通常与硫代葡萄糖苷分开地存在于相同植物中。然而，一些植物还含有ESP，所述ESP以损失ITC为代价将亚氨逐硫代羧酸酯-O-磺酸盐转化为生物学上无价值的腈和氰基表硫烷(cyanoepithioalkane)(图2)。已知ESP存在于茎椰菜和茎椰菜种子中[7]，但不存在于芥菜子中。还已知通过人类或动物肠道菌群的葡糖硫苷酶活性，摄取的硫代葡萄糖苷在脱离植物葡糖硫苷酶的情况下，可在体内转化成ITC[11]。认为AITC和SF以及其它ITC具有很高的生物利用度并主要通过尿排泄消除[12-14]。ITC在体内主要通过硫醇尿酸途径代谢，致使形成通过尿液排泄的N-乙酰半胱氨酸（NAC）偶联物。所述NAC偶联物自身没有生物学活性，但当它们储存在膀胱的尿液中时，可被解离为母体ITC，因此可作为ITC的前药。在各种实施方式中，本发明的组合物和方法包括以硫醇偶联物或其衍生物提供ITC。在一个实施方式中，硫醇偶联物的衍生物是N-乙酰半胱氨酸偶联物。
AITC和SF[11,15]以及其它ITC已显示具有抗菌和杀虫的活性。这些化合物的化学预防活性也可能部分由于它们抑制第I相酶和诱导第II相酶的能力[14]。图1概述了AITC和SF的推定化学预防机制。然而，本领域没有认识或证实有关ITC可用于设计以预防或治疗膀胱癌的方法，并且本领域中也没有适于预防和/或治疗膀胱癌的ITC制剂的启示。另外，本领域也没有对于使茎椰菜产品（例如茎椰菜种子）经受烘烤并加压加热如以加压蒸汽处理(即高压灭菌)的形式加压加热的任何提示。因此，据信这是首次公开如下方法：烘烤并加压热处理茎椰菜产品，并将所述处理过的茎椰菜产品与芥菜产品混合以提供针对膀胱癌具有治疗和预防功效的组合物。不想受任何特定理论的限制，还认为本文公开的茎椰菜产品处理方法有破坏其内源ESP的作用。因此，当经处理茎椰菜产品与适当芥菜产品(例如芥菜种子粉)混合时提供了一种可用来递送AITC和SF的稳定的经优化的组合物。
更具体地，本发明是基于我们的以下意外发现：在口服给药时，某些ITC，例如AITC、SF和含ITC的蔬菜制品（例如芥菜种子粉，和芥菜种子粉与茎椰菜种子粉的混合物）适于治疗和/或预防膀胱癌。具体而言，我们证实AITC在膀胱癌细胞中引起强烈的细胞周期停滞（有丝分裂停滞）和细胞凋亡（有丝分裂崩溃），但对正常人膀胱上皮细胞的毒性作用明显较低。已证实本发明的组合物和方法抑制了癌症发展，包括以很低剂量水平抑制肌层浸润，以及通过尿排泄选择性递送到膀胱癌组织。因此，认为富含AITC的芥菜种子粉和热处理过的茎椰菜种子粉的混合物适用于人膀胱癌的治疗。就此而言，SF显著下调抗膀胱癌的熟知靶标环氧合酶2（Cox-2），而AITC没有表现出该活性(图5)。另外，在原位大鼠膀胱癌模型中展示了该方法的特定实施方式。因此，表明本发明的方法在体内有作用。
在各种实施方式中，本发明提供一种组合物，其包含蔬菜制品和芥菜产品的混合物，其中，所述蔬菜制品经受烘烤和加压热处理，所述加压热处理可以加压蒸汽处理的方式提供。
适用与本发明的蔬菜包括但不限于：茎椰菜/茎椰菜芽提取物、茎椰菜种子粉、芥菜种子粉、辣根粗粉/粉末、山葵粉或其组合。在某些实施方式中，所述蔬菜制品是任何十字花科蔬菜或其衍生产品。
在各种实施方式中，十字花科蔬菜制品是包括茎椰菜产品或基本由茎椰菜产品组成或由茎椰菜产品组成的组合物。在某些实施方式中，茎椰菜产品包括茎椰菜种子或基本由茎椰菜种子组成或由茎椰菜种子组成。
在各种实施方式中，将十字花科蔬菜制品与芥菜产品联用。芥菜产品可包括芥菜种子或基本由芥菜种子组成或由芥菜种子组成。
在某些实施方式中，本发明的组合物包括茎椰菜种子和芥菜种子的混合物或基本由该混合物组成或由该混合物组成。可以粉末形式提供茎椰菜种子和/或芥菜种子。
在一个实施方式中，将茎椰菜产品在足以灭活所述茎椰菜产品中的部分或全部表硫特异蛋白(ESP)的温度和持续时间下烘烤，所述茎椰菜产品例如可以是以种子粉提供的茎椰菜种子。本领域技术人员知道如何确定ESP是否已失活。例如，可用Matusheski等所述的方法测定ESP失活[7]，该方法通过引用纳入本文。
在各个实施方式中，茎椰菜产品在至少华氏200度下烘烤至少30分钟。烘烤可持续进行10分钟至300分钟之间的任何时长，包含上限和下限、并包括该范围间的所有数字以及连续整数间至十分位的所有数值。在一个实施方式中，茎椰菜产品在华氏250度下烘烤至少90分钟。
茎椰菜产品还可经受加压热处理。所述的加压热处理包括加压蒸汽处理，即加压热处理可包括高压灭菌。在各种实施方式中，加压热处理在至少华氏200度下以至少10磅/平方英寸（p.s.i.）压力进行至少5分钟。
可从前述内容中认识到该烘烤和/或加压热处理(可以是加压蒸汽处理)，可以在至少华氏200度实施，并可以在华氏200至350度间任何温度实施，包含上限和下限并包括它们之间的所有数字以及连续整数间到十分位的所有数值。所述加压热处理(可以是加压蒸汽处理如高压灭菌)，可以在至少10磅/平方英寸（p.s.i.）的压力下实施，最高至40p.s.i.，包含上限和下限并包括它们之间的所有数字以及所连续整数间到十分位的所有数值。在一个实施方式中，加压蒸汽处理在15p.si.的压力下实施。在一个实施方式中，茎椰菜在本文公开的任何温度下，于15p.si.压力下经受15分钟加压蒸汽处理。可以认识到，需要时，可在一次或多次处理过程中，改变处理茎椰菜产品所用的温度和/或压力。
烘烤和加压蒸汽处理优选通过连续烘烤和进行加压蒸汽处理的次序来实行。在一个实施方式中，茎椰菜产品先经受烘烤和加压蒸汽处理，然后再混合芥菜产品和该茎椰菜产品。在一个实施方式中，该组合物包含已烘烤并经受加压热处理的茎椰菜产品的混合物，还包含未经烘烤或加压热处理的芥菜产品。因此，在一个实施方式中，包含所述经处理茎椰菜产品和所述芥菜产品的混合物的组合物不包含经过烘烤的芥菜产品和/或不包含经受加压热处理的芥菜产品。
可以任何比例混合茎椰菜和芥菜产品。在特定实施方式中，它们可以1:1至10:1的比例混合，该比例包含上限和下限并包括该范围间的所有数字以及连续整数间至十分位的所有数值。所述比例可以是茎椰菜比芥菜产品，反之亦然。本发明考虑所有能使硫代葡萄糖苷的水解最大化的比例。
可在茎椰菜粉烘烤处理之前或之后，和/或在茎椰菜受加压热处理之前或之后，将茎椰菜产品和/或芥菜产品研磨成粉末。在各个实施方式中，粉末可包括直径小于1mm的茎椰菜和/或芥菜颗粒。在各个实施方式中，本发明的粉末可包括至少50%、60%、70%、80%、90%、99%或100%的直径小于1mm的颗粒。在特定实施方式中，颗粒大小可小到5微米。
不受限于理论，认为本发明提供的经处理茎椰菜/芥菜种子粉混合物由于以硫代葡萄糖苷（黑芥子苷和萝卜硫苷）的方式保存AITC和SF而包含AITC和SF的稳定来源，并且由于芥菜种子粉中的葡糖硫苷酶会在无ESP干扰下水解硫代葡萄糖苷还在水合或摄取后提供AITC和SF的最佳量。
在各个实施方式中，十字花科蔬菜制品包括富含萝卜硫苷的茎椰菜种子。在特定实施方式中，富含萝卜硫苷的茎椰菜含有至少50、60、70、80、90或100，或110微摩尔/克萝卜硫苷，包括它们之间的所有整数以及连续整数间至十分位的所有数值。
在各个实施方式中，芥菜产品包含至少50、60、70、80、90或100，或110微摩尔/克黑芥子苷，包括它们之间的所有整数以及连续整数间至十分位的所有数值。此类十字花科蔬菜和芥菜产品可存在于本发明的组合物中，并可用于本发明所述方法。
本领域的技术人员可以认识到本发明包括制备本发明组合物的方法。制备本发明组合物的方法包括但不必限于实施上述任何或所有方法，以及使用上述任何或所有温度、压力、时间参数，以及具有上述任何或所有的功能和/或物理性质的茎椰菜和芥菜产品。因此，在一种实施方式中，制备本发明组合物的方法包括使茎椰菜产品如本文所述经受烘烤和加压热处理，然后将所述茎椰菜产品与芥菜产品混合。
在一个实施方式中，本发明所述预防和/或治疗膀胱癌的方法包括向有需要的个体口服递送包含一种ITC或多种ITC或其前体的组合物，使得ITC通过尿排泄选择性递送到膀胱来特异性抑制膀胱癌发展/复发和/或转移，例如通过肌层浸润的疾病扩散。
在一个实施方式中，ITC作为含有分离的和/或纯化的ITC和/或合成的ITC的组合物向个体给予。该ITC可以是任何合适的ITC。该组合物可以包括ITC，基本由ITC组成，或由ITC组成。例如，该组合物可包含10%-100%（包括该范围内的所有数值）的一种ITC或多种ITC的混合物。在一个实施方式中，该组合物包含芥菜种子粉。在一个实施方式中，该组合物包含芥菜种子粉和茎椰菜种子粉，后者由加热处理过的种子（如上述的烘烤和高压灭菌）制得。
含有ITC如AITC或其衍生物的组合物可以任何合适的方式和/或递送载剂配制用于口服递送。例如，可作为粉末、液体、凝胶、喷雾、悬浮剂、乳剂，片剂，胶囊，作为缓释或速释制剂等来提供该组合物。该组合物可作为水性溶液提供，其还可包括合适的调味糖浆，水性或油性悬浮剂，或含食用油的调味乳剂。口服方法可包括但不限于吞服或通过例如医疗设备（例如饲管）递送到胃。如需要，该组合物也可通过如导管插入而直接递送到膀胱。
本发明使用的组合物可包括药学上接受的载体、赋形剂和/或稳定剂。适合与ITC混合的组合物的一些例子可参见：Remington:The Science andPractice of Pharmacy(《雷明顿：药物科学与实践》)(2005)，第21版，宾夕法尼亚州费城，LWW出版社(Lippincott Williams&Wilkins)。
在一个实施方式中，对需要治疗膀胱癌或预防膀胱癌的人实施本发明的方法。因此给予含ITC组合物的个体可以是患有、疑似患有或已诊断有膀胱癌的个体。所述个体也可以是具有膀胱癌复发和/或膀胱癌转移的风险。在一个实施方式中，所述个体是先前接受过膀胱癌治疗的个体。
本发明的方法可以联同旨在治疗和预防膀胱癌的常规疗法一起实施。例如，附加的治疗形式包括但不限于：化疗、手术治疗和放射治疗，上述治疗可在本发明的方法之前，同时或之后进行。
本发明还提供一种用于治疗和/或预防膀胱癌的新型给药方案。我们的结果出乎意料，与认为消耗十字花科蔬菜和/或其提取物所得益处通常随摄入量的增加而提高的传统观念相反，我们证实较高剂量的ITC并没有比某些较低剂量更好地抑制膀胱癌的生长以及肌层浸润。另外，我们证实并非所有含ITC前体（葡萄糖硫苷）的天然产品必然能够抑制膀胱癌生长。例如，我们证实AITC的前体黑芥子苷自身没有抗癌活性，并极少在体内被肠道菌落葡糖硫苷酶水解。因此，在一个实施方式中，本发明的新型给药方案包括口服给予含有AITC的组合物，其中，所述AITC以无毒性剂量提供给个体。具体但非限制性的剂量示例包括但不限于5、10、25和50微摩尔/千克，包含上限和下限并包括它们之间的所有数字以及连续整数间到十分位的所有数值。
含ITC组合物的给予可在任何时间进行。优选在个体接近入睡时给予该组合物，使得ITC可在该个体膀胱的尿液中浓缩。因此，在一个实施方式中，在晚上实施给予。不受限于任何具体理论，认为这在个体膀胱中提供增加的局部浓度，有效地抑制膀胱癌细胞/肿瘤的生长。也可在白天的任何时间给予含ITC的组合物。所述给予可以每日一次或每日多次，并且可以持续给予任何所需的时间，例如数日、数周、数月或数年。
本发明的方法的效果可用多种参数证明，所述参数包括但不限于膀胱癌细胞和/或膀胱肿瘤的生长抑制、膀胱癌浸润的和转移的抑制、和/或患有膀胱癌的个体的存活寿命的延长。
以下实施例意在说明而非限制本发明。
实施例1
本实施例证实AITC对正常和恶性膀胱癌细胞增殖和存活的影响。用AITC处理人膀胱癌UM-UC-3细胞和大鼠膀胱癌AY-27细胞导致对细胞增殖的剂量依赖性抑制，IC50分别为2.7和3.3μM（图3A）。该抑制与显著细胞周期停滞有关，相对对照细胞9.9-11.5%处于G2/M期，用7.5～15μMAITC处理24小时后多达72％的UM-UC-3细胞和49％的AY-27细胞处于G2/M期(图3B)。AITC强烈诱导细胞凋亡还表现为，亚G1群(图3B)增加至最高达6.5倍（UM-UC-3）和7.8倍（AY-27）(图3B)，并且在组蛋白关联DNA的胞质水平增加至最高达3.9倍（UM-UC-3）和5.2倍（AY-27）。相反，发现AITC对正常膀胱上皮细胞（HUC）的毒性低很多，IC50是69.4μM(图3A)，该值比AITC在恶性细胞组中的相应IC50值高21.0～25.7倍。另外，在HUC中，7.5和/或15μM剂量的AITC没有导致细胞周期停滞和细胞凋亡(图3B和3C)。
实施例2
本实施例证实了AITC靶向α-微管蛋白和β-微管蛋白，使细胞有丝分裂停滞，并激活线粒体介导的细胞凋亡。对流式细胞仪检测为被AITC停滞在G2/M期的UM-UC-3细胞(图4A)和用瑞氏－姬姆萨染色检测为被AITC停滞在有丝分裂阶段的细胞作比较，发现AITC所停滞的细胞几乎只在有丝分裂阶段(图4B)。另外，许多AITC处理过的细胞表现出多微核化，表明有丝分裂崩溃。同时对α-微管蛋白做免疫染色（绿色）和用4’,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI,蓝色)进行DNA染色，显示对照细胞进行典型的有丝分裂和细胞分裂（二极的有丝分裂纺锤体和姐妹染色体分离），而AITC处理过的细胞呈现异常的多极有丝分裂纺锤体并且缺乏姐妹染色体分离(图4C)，使人联想到长春新碱（微管解聚剂）和紫杉醇（微管稳定剂）的影响[17]。然而，AITC看来不影响微管蛋白聚合，因为在体外测试中AITC不影响微管蛋白的聚合速率（结果未显示）。相反，AITC显著下调α-微管蛋白和β-微管蛋白，但没有下调γ-微管蛋白(图4D)，表明α-微管蛋白和β-微管蛋白可能是AITC对有丝分裂停滞的关键靶标。进一步的实验表明，AITC使α-微管蛋白和β-微管蛋白不稳定（结果未显示）。我们的发现证实AITC是新一类有丝分裂阻断剂，因为它的作用机理不同于紫杉醇和长春新碱。另外，我们发现AITC导致线粒体膜电位的流失(图4E)，细胞色素c从线粒体释放到细胞质（结果未显示），胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3的活化（图4F），和TUNEL阳性细胞的形成(图4G)，以及胱天蛋白酶9抑制剂Z-LEHD-FMK完全阻断AITC引起的胱天蛋白酶激活和TUNEL阳性细胞形成。这些结果表明AITC通过引起有丝分裂停滞和活化线粒体介导的细胞凋亡通路来杀死膀胱癌细胞。
实施例3
本实施例证实SF下调人膀胱癌细胞中的Cox-2。Cox-2是熟知的致癌基因，在大多数人膀胱癌中过量表达，并被认为是膀胱癌治疗的主要药靶。我们揭示SF通过破坏Cox-2mRNA的稳定性（结果未显示），显著下调过量表达Cox-2的所培养人膀胱癌细胞中的Cox-2（图5）。然而，AITC对Cox-2的抑制作用未能测得（图5）。
实施例4
本实施例证实通过施行本发明的实施方式来体内抑制膀胱癌生长。在原位大鼠膀胱癌模型中评估AITC。在膀胱内滴注1x 106AY-27细胞之后三周，肿瘤平均重0.30克，约是正常膀胱重量的4.4倍。滴注AY-27细胞一天后开始每日口服给予AITC并持续3周。以4个剂量水平评估AITC：10、25、50和300微摩尔/千克。未见动物体重下降的情况反映出没有治疗相关不良作用(图6A)。300微摩尔/千克的AITC对原位膀胱癌发展的抑制为20％，但因为某些原因较低剂量水平变得更加有效，并对肿瘤生长的抑制为30％，10微摩尔/千克的作用显示出统计显著性(P=0.034)(图6B)。肿瘤的组织学检测表明了对肌层浸润的抑制随AITC剂量减少而增强(图6C)。在用10微摩尔/千克的AITC处理过的大鼠中，只有18.9％的荷瘤膀胱显示肌层浸润，相比之下，以25微摩尔/千克的AITC处理过的大鼠中有27％，以50或300微摩尔/千克的AITC处理过的大鼠中有50％，而对照大鼠中有71％（图6C）。图6D显示正常大鼠膀胱壁（D1），浅表性AY-27大鼠膀胱肿瘤（D2），以及肌层浸润性AY-27大鼠膀胱肿瘤(D3)的代表性图像。
实施例5
本实施例证实在血浆，尿液和肿瘤组织中的AITC水平。向大鼠给予单次口服剂量为10或300微摩尔/千克的AITC，在数次间隔时间采集尿液和血液直至24小时。通过环缩合试验检测样品中的AITC当量[12]。口服给予AITC引起血浆和尿液中AITC当量水平的剂量依赖性增长(图7A和7B)。以10和300微摩尔/千克剂量给予AITC的三小时内到达血浆AITC当量浓度峰值，分别是1.5μM和23.4μM。在给予后6小时，相应的尿液AITC当量浓度达到0.6mM和9.9mM。尿液的AITC当量浓度峰值比血浆中高400～423倍。另外，尽管血浆AITC当量浓度此后快速下降（低AITC剂量的半衰期不到3小时，较高剂量约为6小时），但尿液AITC当量浓度下降缓慢。例如，24小时平均尿液AITC当量浓度为63.8μM（低AITC剂量）和4.5mM（高AITC剂量），该浓度是尿液浓度峰值的11.6～45.2％，但比给药24小时后的相应血浆浓度高4,911～14,501倍。
在原位肿瘤中测得AITC当量的低基础水平（2.4微摩尔/毫克蛋白质）(图7C)，这可能是由于大鼠膳食含有微量AITC或相关化合物。以300微摩尔/千克的单次口服剂量给予AITC后1.5和6小时，原位膀胱肿瘤中的AITC当量水平为1.9和2.5毫摩尔/毫克蛋白质，该水平比基础水平高790～1,071倍。这些数据清楚地表明，口服给予的AITC可通过尿排泄选择性递送到膀胱中的癌组织。
总的来说，口服递送AITC在以下方面显示有效抗癌活性：口服后24小时内显著递送至并浓缩于尿液和膀胱癌组织中；抑制膀胱癌生长；防止膀胱肌层浸润并因此减缓膀胱癌转移。这些数据说明将本发明的组合物递送进尿道膀胱中的功效，所述组合物在尿道膀胱中有活性且其可利用浓度能选择性靶向恶性细胞但不伤及正常细胞。另外，我们揭示SF也能通过尿排泄选择性递送到膀胱组织。
实施例6
本实施例证实黑芥子苷自身没有生物活性。硫代葡萄糖苷（例如萝卜硫苷和黑芥子苷）是十字花科蔬菜及其种子（例如，芥菜种子粉，辣根粉，和山葵粉等）中的ITC前体。硫代葡萄糖苷可通过葡糖硫苷酶转化为各种ITC。黑芥子苷是AITC的特异前体。发现黑芥子苷本身在体外对膀胱癌细胞系如UM-UC-3和AY-27没有活性，并需要葡糖硫代酶的存在（因而转化为AITC）以得到和AITC相似的结果（结果未显示）。肠道中的微生物群落具有一些葡糖硫代酶的活性，可在体内将黑芥子苷部分转化为AITC。然而，我们的分析显示只有3～5％的黑芥子苷在大鼠体内转化为AITC，并且在体内黑芥子苷在原位膀胱癌模型中无效。这说明如果黑芥子苷不水解为AITC，摄入黑芥子苷或含有黑芥子苷的天然产品（不伴有葡糖硫苷酶）可能无法释放AITC的全部功效。本发明解决了此问题。
实施例7
本实施例证实芥菜种子粉是有效的抗膀胱癌物质。我们的数据证实十字花科蔬菜如山葵粉、辣根粉和芥菜种子粉包含的黑芥子苷/AITC量有很大差异。关于芥菜种子，就我们的一些测试而言，分析了一种购自辣屋公司(Spice House)(伊利诺伊州芝加哥)的市售芥菜种子粉(MSP-1)。我们显示其含有129微摩尔/克的黑芥子苷。根据我们的分析，相信该粉末中不存在AITC，但存在足够的葡糖硫苷酶，在体内或体外水合后，能使黑芥子苷显然完全转化为AITC。我们对室温存放的粉末的分析表明该粉末中的黑芥子苷可稳定至少2年。在上述的原位大鼠膀胱癌模型中，该物质对体重增加没有影响（图8A），但在9微摩尔/千克的黑芥子苷剂量下对膀胱癌生长的抑制为35％，而在90微摩尔/千克的黑芥子苷剂量下抑制23％（图8B），以及在9微摩尔/千克的黑芥子苷剂量下完全抑制肌层浸润并在90微摩尔/千克的剂量下对肌层浸润的抑制为13％（图8C）。因此，MSP-1低剂量比高剂量更有效。然而，进一步降低MSP-1剂量导致抗癌效力降低。更感兴趣的是，在等摩尔时，作为芥菜种子粉递送的AITC的抗癌活性比纯AITC更有效。另外，在培养的膀胱癌细胞和体内膀胱肿瘤中，MSP-1都引起了强烈的胱天蛋白酶3活化并降低血管内皮生长因子（VEGF）水平(图8D)。VERF是主要的肿瘤血管生成刺激因子。胱天蛋白酶3和VEGF都是抗癌靶标。感兴趣的是，MSP-1在体内只在低剂量时才对VEGF有效，这说明VEGF可能是通过MSP-1抑制肿瘤肌层浸润的关键靶标。
实施例8
本实施例证实MSP-1和茎椰菜种子混合物抑制膀胱癌发展。从考迪尔种子公司（Caudill Seed）(肯塔基州路易斯维尔)购得富含萝卜硫苷的茎椰菜种子(cultiva SAGA)，如上文所述进行烘烤和高压灭菌以使ESP失活(据信在次过程中葡糖硫苷酶也被灭活)，然后研磨成细粉。据信去除ESP对于萝卜硫苷尽可能转化成ITC很重要，因为SF得率从每克普通种子（粉末）60微摩尔提高27％升至每克热处理过的种子（粉）76微摩尔。将该粉末与MSP-1混合（约1:1）。该混合物包含萝卜硫苷和黑芥子苷以及葡糖硫苷酶（由MSP-1携带）。水合或摄入后，粉末中葡糖硫苷酶显然将萝卜硫苷和黑芥子苷全部转化为SF和AITC（数据没有显示）。我们已经证实，该混合粉末在用来评估AITC和MSP-1的相同原位大鼠膀胱癌模型体中，体内抑制膀胱癌的发展。以黑芥子苷和萝卜硫苷各10微摩尔/千克的剂量，用粉末喂食大鼠，每日一次持续三周。膀胱肿瘤生长被抑制了46％（图9A），这比单独使用MSP-1时更显著，以9微摩尔/千克的黑芥子苷剂量单用MSP-1时肿瘤生长被抑制了35％（图8B）。另外，联合处理还强烈抑制膀胱癌的肌层浸润（图9B）。值得关注的是，AY-27细胞并没有过度表达Cox-2（结果未显示），并且在该动物模型中的SF的抗癌功效可能没有完全显现。因此，预期本发明的方法会对患有膀胱癌的人群更有效。
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Claims (15)

1.一种包含茎椰菜种子和芥菜种子混合物的组合物，其特征在于，茎椰菜种子经受烘烤和加压热处理，然后与芥菜种子混合。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述茎椰菜种子在至少华氏200度的温度下烘烤至少60分钟，然后与芥菜种子混合。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述加压热处理包括在至少华氏200度的温度下，以至少10磅/平方英寸(p.s.i.)的压力加压蒸汽处理至少5分钟。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述茎椰菜种子包含至少90微摩尔/克的萝卜硫苷。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述茎椰菜种子包含加热失活的表硫特异蛋白（ESP）。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述芥菜种子包含至少90微摩尔/克的黑芥子苷。
7.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述茎椰菜种子和芥菜种子的混合物是粉末状。
8.一种在个体中治疗和/或预防膀胱癌的方法，包括向所述个体口服给予包含异硫氰酸酯（ITC）的组合物，使得所述给予抑制膀胱癌的生长和/或复发。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述组合物在晚上口服给予所述个体。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述ITC分离自蔬菜。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述ITC是异硫氰酸烯丙酯（AITC）、萝卜硫素或其组合物。
12.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述ITC是硫醇偶联物或其衍生物。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述ITC以硫代葡萄糖苷的形式和葡糖硫苷酶存在于权利要求1所述的组合物中。
14.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述个体具有膀胱癌复发的风险。
15.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述组合物至少每日给予一次，持续至少一周。
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