EP4068965A1 - Utilisation de saccharides de dattes seuls ou en melange avec des polyphenols pour proteger les plantes contre des pathogenes - Google Patents

Utilisation de saccharides de dattes seuls ou en melange avec des polyphenols pour proteger les plantes contre des pathogenes

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EP4068965A1
EP4068965A1 EP20819668.3A EP20819668A EP4068965A1 EP 4068965 A1 EP4068965 A1 EP 4068965A1 EP 20819668 A EP20819668 A EP 20819668A EP 4068965 A1 EP4068965 A1 EP 4068965A1
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EP
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extract
plant
use according
polyphenols
plants
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Application number
EP20819668.3A
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German (de)
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Inventor
Fethi HAKKAR
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Mytamar GmbH
Original Assignee
Mytamar GmbH
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Publication date
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    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/40—Liliopsida [monocotyledons]
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
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    • A01N43/14—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings
    • A01N43/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings with oxygen as the ring hetero atom
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    • A01N2300/00—Combinations or mixtures of active ingredients covered by classes A01N27/00 - A01N65/48 with other active or formulation relevant ingredients, e.g. specific carrier materials or surfactants, covered by classes A01N25/00 - A01N65/48

Definitions

  • the present invention belongs to the technical field of agronomic or agricultural protection products and relates to the use of an extract of saccharides, or of a mixture of extracts of saccharides and polyphenols, obtained from fruits of the date palm Phoenix dactylifera for protect plants against pathogens, in particular to stimulate the natural defenses of plants and develop their resistance against pathogens.
  • Grapevine downy mildew is a disease caused by an oomycete, Plasmopara viticola, which causes many losses every year and which is likely to appear all over the world. Prevention is necessary and requires the establishment of regular treatments throughout the year. Other pathogens, such as fungi or insects, are also feared in agronomic and horticultural environments.
  • substances of natural origin as protective agents for plants against pathogens has been the subject of research.
  • These substances can be of plant, animal or mineral origin. They generally have a short lifespan, which limits their presence in food products and in the environment. They can act in different ways, for example by stimulating the natural defenses of the plant or by acting directly on a population of pathogens to inhibit its growth and development.
  • Plants do not have an immune system equivalent to that of humans and animals, however they are able to set up defense mechanisms which can be induced by compounds acting as signals on the defense genes to trigger the synthesis of anti-pathogenic molecules or molecules capable of structurally strengthening the plant. Such compounds are said to be elicitors.
  • the present invention relates to the use of an extract of water-soluble saccharides obtained from fruits of the date palm Phoenix dactylifera for the protection of plants against pathogens.
  • such an extract is used for stimulating the defense and resistance reactions of the plant for treatment or prevention, in particular for inducing an eliciting activity of the defense mechanisms.
  • Dates can be considered as an interesting source of compounds with various biological activities.
  • a significant part of the production of dates is transformed into derived products, such as jams, juices and syrups. Therefore, a large amount of date kernels and unmarketed fruit is produced as waste which can be recovered on the basis of its high content of bioactive compounds such as polysaccharides.
  • a saccharide extract in the context of the invention can comprise a quantity of saccharides greater than or equal to 40%, 50% or even 60%, by weight of the extract.
  • the saccharides contain rhamnose, arabinose, fucose, xylose, mannose, galactose, galacturonic acid, glucose and / or glucuronic acid.
  • Saccharides within the meaning of the invention, are monosaccharides, oligosaccharides or polysaccharides. Preferably, they will be polysaccharides.
  • Polysaccharides are organic compounds that are abundant in nature. They are homo or heteropolymers formed by the linear or branched chain of oses.
  • the polysaccharides found in dates are cellulose, pectin and hemicelluloses. These polysaccharides are part of the category of dietary fiber and are divided into two groups: soluble fibers, or water soluble, including pectins and some hemicelluloses, and insoluble fibers, insoluble in water, including cellulose and certain other hemicelluloses .
  • the saccharides are naturally water-soluble polysaccharides or a mixture of such polysaccharides with hydrolysates of naturally non-water-soluble polysaccharides.
  • the extraction carried out on the date fruits makes it possible to obtain a fraction enriched in soluble and insoluble polysaccharides.
  • the initially insoluble polysaccharides can be upgraded within the framework of the invention once made water-soluble, in particular after the implementation of a method of enzymatic or chemical hydrolysis, for example by acid hydrolysis.
  • the saccharide extract contains, by weight: at least 20% mannose, at least 7% arabinose, at least 6% glucose, at least 5% galactose.
  • This saccharide extract is generally obtained from the kernel of date fruits.
  • the saccharide extract contains, by weight: at least 40% galacturonic acid, at least 7% arabinose, at least 3% xylose.
  • This saccharide extract is obtained from the skin and pulp tissues of date fruits.
  • the polysaccharides extracted from dates have a very high inducing effect on the natural defenses of plants.
  • they make it possible to induce the genes most representative of the PR (Pathogenesis Related) proteins involved in plant defense reactions. They are therefore good agents for stimulating the natural defense reactions of plants.
  • PR proteins accumulate in the tissues of a plant in response to biotic or abiotic stress, or following the application of a product that induces the defenses. Each PR protein has its own function. They accumulate at a local and systemic level and their presence is an indicator of the establishment of defense mechanisms by the plant.
  • PR1 proteins would be involved in the sequestration of sterols. They are thought to have an anti-fungal and anti-oomycete action, by inhibiting the growth and germination of spores, in particular against downy mildew and gray rot in tomatoes (Niderman et al., 1995; Garnish et al., 2016). They would also have a favorable action in drought resistance (Liu et al., 2013).
  • PR2 proteins have a glucanase (b-1,3-glucanase) action, responsible for the degradation of glucan, a major polysaccharide constituent of the wall of fungi (Benhamou, 2009). PR2 is induced in response to the salicylic acid pathway. PR2 is a protein that may also be involved in tolerances to abiotic stresses such as drought (Liu et al., 2013).
  • PR3 proteins have chitinase activity. They have a direct antimicrobial effect through the degradation of the fungal wall and an indirect effect through the possible release of fragments inducing defense genes (Benhamou, 2009).
  • PR4 proteins showed in particular ribonuclease and chitinase activity.
  • Studies in wheat have suggested anti-fungal activity against Fusarium culmorun (Bertini et al., 2009; Caruso et al., 2001; Filipenko et al., 2013).
  • Another study reported possible antifungal activity in corn (Bravo et al., 2003).
  • PR4 is a protein that appears to be activated by both SA and JA pathways (Bertini et al., 2003; Wang et al., 2011).
  • PR5 proteins are “Thaumatin like” proteins with activity against oomycetes but also against Verticillium, Fusarium, and necrotrophic fungi. This protein also helps induce drought tolerance (Liu et al., 2013).
  • PR8 proteins exhibit antibacterial action through lysosomal and antifungal activity, catalyzing hydrolysis of chitin from fungal walls and inhibiting hyphal growth. By virtue of their degradation action, they are thought to be at the origin of the production of endogenous elicitors, thus triggering the establishment of defense reactions within the attacked plant (Métraux et al., 1988).
  • the PR14 proteins are lipid transfer proteins expressed in young leaves and appear to have a role in the transport of cutin monomers; they are associated with the assembly of cutin and wax (Sels et al., 2008). They have antimicrobial properties, for example against Pseudomonas, Fusarium, Pythium and Botrytis (Kido et al., 2010).
  • the extract also contains at least 5%, by weight, of proteins, preferably at least 10%, more preferably between 5 and 15%.
  • the extract of water-soluble saccharides is a mixture with an extract of polyphenols also obtained from fruits of the date palm Phoenix dactylifera.
  • the mixture will be in the form of a composition.
  • Polyphenols are antioxidant compounds specific to the plant kingdom, and endowed with various biological activities demonstrated by numerous studies described in the scientific literature. Mention will in particular be made of their antioxidant, anti-inflammatory, antimicrobial, antiviral or even anticancer activity.
  • the saccharides / polyphenols ratio is between 30/70 and 70/30, expressed by weight.
  • Polyphenols are present in all organs of the plant. They present a very wide variety of structures. Thus, they are divided into different families:
  • Phenolic acids such as derivatives of hydroxy-benzoic acid and derivatives of cinnamic acid
  • Flavonoids such as flavan-3-ols, including catechins and tannins, and flavones, including flavonols.
  • the date palm fruit consists of three tissues: the stone, the pulp and the skin. It also evolves according to four stages of maturity: Hababouk, Blah (Kimri), Besser (Khalal) and Tamar. The selection of the fruit according to one of these stages, and according to the tissues, makes it possible to obtain different results in terms of polyphenol content.
  • the polyphenol extract contains up to 80% polyphenols, by weight relative to the total weight of the purified dry extract.
  • the polyphenol extract contains at least 95%, more preferably at least 97%, even more preferably at least 99% of condensed tannins, by weight relative to the total weight of polyphenols.
  • the tannins condensed in the extract according to the invention are oligomers or polymers of pro-anthocyanidins.
  • an effective amount of the extract of saccharides, or of the mixture of extracts of saccharides and of polyphenols, supplied to the plants is at least 0.01 g per liter, preferably of at least 0.1 g per liter, more preferably at least 0.7 g per liter, for a contribution in liquid form, or at least 10 g per hectare, preferably at least 100 g per hectare for a intake in solid form.
  • the effective amount should be sufficient to induce defense and resistance mechanisms and will vary from plant to plant or depending on the method of treatment. This amount can be easily determined by a person skilled in the art.
  • the saccharide extract or the mixture of extracts of saccharides and polyphenols, is applied to the whole plant, to the leaves, to the flowers, to the roots, to the fruits, to the seeds, to seedlings, soil, solid or liquid culture medium, culture material.
  • the application is carried out by sprinkling, irrigation, spraying, soaking or injection.
  • the plants are agronomic, ornamental, aromatic or medicinal plants, in particular, the plants are fruit plants, in particular vines, vegetable plants, flowers, trees, shrubs.
  • the plant pathogens are fungi, bacteria, viruses, nematodes, parasitic plants, protozoa or insects, in particular Plasmopora viticola.
  • the invention also relates to a method of protecting a plant against pathogens, in particular for activating defense and resistance reactions of the plant, the method comprising application to said plant, or in the environment of the plant. , an effective amount of an extract of water-soluble saccharides obtained from fruits of the date palm Phoenix dactylifera alone or as a mixture with an extract of polyphenols obtained from this same date palm, the extracts being as described above and applied in the same way as mentioned above previously.
  • the invention also relates to a plant protection product containing an effective amount of a saccharide extract obtained from fruits of the Phoenix dactylifera date palm alone or as a mixture with a polyphenol extract from this same date palm, the extracts being as described above.
  • the plant protection product further comprises at least one other component such as a solvent, a surfactant, an emulsifier, a dispersing agent, a filler, a fertilizing compound or a plant protection compound.
  • at least one other component such as a solvent, a surfactant, an emulsifier, a dispersing agent, a filler, a fertilizing compound or a plant protection compound.
  • the plant protection product is in liquid form, in gel form, in powder or granule form.
  • Fruits can be selected according to one of the following four stages of maturity: Hababouk (stage 1), Blah (Kimri) (stage 2), Besser (Khalal) (stage 3), Tamar (stage 4).
  • stage 1 the first stage of maturity
  • stage 2 the second stage
  • Stage 3 the second stage
  • Tamar stage 4
  • the tissues that is, the skin, the pulp and the nucleus, are separated from each other. After a grinding operation, the fabrics are dried and powdered. It should be noted that in stage 1 of ripening, the fruit is studied entirely without separation of the tissues because the stone is not yet formed.
  • Saccharide extracts can be obtained from tissue powders according to a process consisting in first extracting the alcohol-insoluble matter (MIA) and then, in a second step, in purifying the water-soluble saccharides, in particular the polysaccharides , from this material.
  • MIA alcohol-insoluble matter
  • other extraction methods can be implemented.
  • MIA is obtained using the process below:
  • the determination of the mass composition of neutral and acidic monosaccharides is carried out by gas chromatography coupled with mass spectrometry (in English Gas chromatography-mass spectrometry or GC-MS). This analysis is carried out on the MIAs obtained from the nuclei and on the soluble fractions obtained from the MIAs of skin, pulp and nucleus tissues as well as on the insoluble fractions obtained from the MIAs of nuclei.
  • the analyzes by GC-MS of the simple sugars constituting the polysaccharide structures of AIMs show us a great variability of the quantities of polysaccharides according to the fractions resulting from pulp, skin or stones.
  • Rha rhamnose; Macaw: arabinose; Fuc: fucose; Xyl: xylose; Man: mannose; Gai: galactose; GalA: galacturonic acid, GIc: glucose, GIcA: glucuronic acid.
  • MIA fraction of Alcohol-Insoluble Matter from the nucleus
  • FSN fraction of soluble polysaccharides obtained from MIA of nuclei
  • FISN fraction of insoluble polysaccharides obtained from MIA of nuclei.
  • fraction of soluble polysaccharides extracted from nuclei is characterized by a polysaccharide content of nearly 50%, by weight.
  • the fraction of soluble polysaccharides extracted from pulps and skins is for its part characterized by a polysaccharide content of more than 66%, by weight.
  • polysaccharides are composed of monosaccharides of rhamnose, arabinose, fucose, xylose, mannose, galactose, galacturonic acid, glucose and glucuronic acid.
  • mannose is the monosaccharide which is found in greater quantity. There is also a significant amount of glucose. This testifies to the presence of polysaccharides from the glucomannan family. In the fraction derived from FSC tissues and skin, it is galacturonic acid which is in significant quantity. The presence in this fraction of galactose and xylose testifies to the presence of pectin-type polysaccharides.
  • the fraction of insoluble polysaccharides obtained from MIA of FISN cores is also rich in monosaccharides, in particular in mannose. Mannose forms about 90% of the weight by weight of the insoluble fiber fraction. This testifies to the presence of polysaccharides of the galactomannan family. Thus, it may be advantageous, from this fraction of insoluble fibers, to prepare a soluble fraction of monosaccharides (see Example 4) which can be used in the context of the applications targeted by the invention. d) Determination of the mass protein composition of the soluble and insoluble polysaccharide fractions obtained from the AIMs of nuclei and tissues (pulp and skin):
  • the method for determining the protein concentration of the MIA, FSC, FISN and FSN fractions is based on the determination of nitrogen and carbon by combustion of samples of each of these fractions, in the form of lyophilized powder, according to the method well known to Dumas. The results are reported in Table 2.
  • the contents vary from 40 to 50% for carbon and from 1.0 to 2.2% for nitrogen. These data make it possible to estimate protein contents varying from 6 to 14% depending on the samples.
  • the FISN fraction with an estimated protein content of almost 14% is significantly richer in protein than the other fractions. There is no significant difference between the estimated protein contents for the FSN and FSC fractions.
  • Polyphenols can be obtained from tissue powders according to a process for extracting and purifying polyphenols essentially comprising the following steps: solid-liquid extraction using a solvent, preferably polar, and recovery of an extract containing polyphenolic compounds, purification of the polyphenolic compounds of the extract by a solid phase chromatography method, for example in reverse phase or by ion exchange, recovery of a purified extract concentrated in polyphenolic compounds.
  • the implementation is as follows:
  • the polar solvent is composed of ethanol / water / acetic acid in a ratio of 50 to 80 ethanol: 1 to 10 acetic acid: qs in water (V / V / V) (hydroalcoholic solvent).
  • a ratio of 80: 19: 1 Vol. Ethanol / Vol. Water / Vol. Acetic acid /
  • a ratio of 50: 49: 1 can be used.
  • the extract obtained, named El is stored, and the residue obtained is subjected to a second extraction by bringing into contact with 30 ml of the same solvent for 15 min., With stirring and then filtered.
  • the extract obtained, named E2 is stored and the residue obtained is recovered and subjected to a third extraction by bringing into contact with 30 ml of the same solvent for 15 min., With stirring and then filtered.
  • the extract obtained, named E3, is kept.
  • the extracts E1, E2 and E3 are mixed. Filtration is carried out in order to recover the supernatant and then the phenolic compounds in the extract are concentrated by evaporation under vacuum.
  • the extracts are centrifuged at 4500 rev / min for 10 min at 4 ° C in order to recover the supernatant which will be used for the Sep Pack C18 cartridge (sold by the company Waters) for the implementation of a solid phase extraction ( SPE).
  • the purification can be carried out using an FPX 66 ion exchange column (Rohm & Haas France SAS).
  • Concentration of the extracts is carried out by evaporation of the solvent and a purified fraction of polyphenols is obtained. The fraction is then dried to obtain a polyphenol powder.
  • the extracts obtained contain up to 80% polyphenols, by weight relative to the total weight of the purified dry extract.
  • the extracts contain at least 95%, more preferably at least 97%, even more preferably at least 99% of condensed tannins, by weight relative to the total weight of polyphenols.
  • 70 mg of soluble fibers previously extracted are dissolved in 200 ml of water acidified with 0.1% formic acid.
  • 70 mg of previously extracted polyphenols are dissolved in 50 mL of water acidified with 0.1% formic acid.
  • the two solutions are mixed, stirred and then centrifuged at 4500 rpm for 10 min. The supernatant is recovered and then dried.
  • the mixtures to be studied are prepared by soluble fiber-tannin fractions (50/50 w: w).
  • the objective is to prepare fractions of soluble saccharides rich in oligomeric mannoses from the fraction containing insoluble polysaccharides FISN obtained from MIA.
  • beta-mannanase bacterial or fungal in particular beta-mannanase derived from Aspergillus Niger including beta-mannanase purified û'Aspergillus Niger marketed under the tradename Gamanase ® (NOVO-NORDISK, Denmark).
  • the unit of beta-mannanase is defined as being the quantity of beta-mannanase which releases, from locust bean gum, a quantity of reducing sugars equivalent to 1 micromole of mannose per minute, at pH5 and at 30C.
  • Beta-mannanase can be immobilized by covalent bonding to the surface of a traditional support, or else immobilized by polymerization after having been adsorbed to the surface of a traditional support.
  • the liquid extract can then be hydrolyzed at a temperature of 40-70 ° C with the immobilized enzymes.
  • the analyzes by GC-MS of the polysaccharide structures of the hydrolyzed and solubilized insoluble fractions show the richness of this fraction in mannose.
  • This mannose obviously comes from polysaccharides of the galactomannan and glucomannan family since this soluble part is rich in glucose and galactose.
  • the sugars identified are mannose (Man); galactose (Gai); a trisaccharide with a galactose / mannose ratio of 1: 2 (Gal-Man2); a tetrasaccharide with a galactose / mannose ratio of 1: 3 (Gal-Man3); and a pentasaccharide with a galactose / mannose ratio of 1: 4 (Gal-Man4).
  • Man mannose
  • Gai galactose
  • Gal-Man2 trisaccharide with a galactose / mannose ratio of 1: 2
  • Gal-Man3 tetrasaccharide with a galactose / mannose ratio of 1: 3
  • Gal-Man4 pentasaccharide with a galactose / mannose ratio of 1: 4
  • the objective is to evaluate, under semi-controlled conditions, the inducing effect of the extract containing water-soluble polysaccharides (obtained according to Example 1 and named hereafter “Polysaccharides”) on the expression of 7 genes of PR proteins, markers of defense mechanisms, using the qPFD ® tool (described in the patent application WO2011 / 161388) on wheat plants.
  • Polysaccharides obtained according to Example 1 and named hereafter “Polysaccharides”
  • the wheat plants were produced from seeds of the soft wheat variety ALIXAN. For each modality, 30 grains of wheat were sown in 3 pots (2 repetitions / modality) then placed under controlled conditions for 1 week (25 ° C constant, 16h photoperiod), until the emergent F2 leaf stage. The young plants were then transferred to a climatic chamber dedicated to experimentation.
  • Tween 20 was added to each candidate product, at a concentration of 0.05%, ie 25 ⁇ l per 50 ml of product.
  • the 7 genes of the PR (Pathogenesis Related) proteins below have been selected as being representative of the major PR proteins involved in plant defense.
  • PR-1 Pathogenesis-related protein 1
  • PR-2 Pathogenesis-related protein 2 (glucanases)
  • PR-4 Pathogenesis-related protein 4 (hevein-like)
  • PR-5 Pathogenesis-related protein 5 (thaumatin-like, osmotin)
  • PR-8 Pathogenesis-related protein 8 (class III chitinase)
  • PR-14 Pathogenesis-related protein 14 (lipid transfer protein)
  • PR-15 Pathogenesis-related protein 15 (oxalate oxidase)
  • the tests are carried out in a climatic chamber, under controlled conditions (21 ° C day / 19 ° C night, 16h photoperiod) on wheat plants (2/3 leaf stage), randomized in blocks of 7 pots.
  • each modality (2 pots) are applied twice, with the exception of the WATER control which is applied once only (OJ).
  • the candidate product and the SDP control are applied 4 days apart, on D-4 and on D0.
  • Each modality is then treated on D1 with hydrogen peroxide (H202) to simulate a pest attack. All treatments are carried out up to the limit of runoff, with a sprayer connected to compressed air.
  • H202 hydrogen peroxide
  • RNAs were extracted from the leaf tissues collected, using the NucleoSpin RNA Plant kit (Macherey-Nagel). The yield and the quality of the extracted RNAs were evaluated using a spectrophotometer (Nanodrop ND-1000). The RNAs were then reverse-transcribed into cDNA and the expression levels of 7 PR protein genes were monitored (3 technical repeats) by quantitative PCR (SYBR Green intercalating agent) using the qPFD ® tool ( “Low Quantitative Density Chip” developed by INRA).
  • the relative expression levels were calculated using the 2 DDa method: these are expressions relative to the OJ sample (before treatment) at each sample time, normalized by the geometric mean of the relative expressions of 3 genes reference (TuB, Actin, GAPDH). These relative expressions are transformed into log2 to give the same weight to the inductions and repressions of the genes.
  • Relative expression density map of PR protein genes Table 5 below shows the density map of the relative expressions of the 7 genes of the PR proteins.
  • the expression levels of the 7 genes, transformed into log2 are represented by a density map. This makes it possible to have a global view of the induction profile and to directly visualize the differences in the levels of expression of the marker genes between the treated samples, after having subtracted the variations in expression of the EAU control.
  • Log2 variation scale (relative expression): the more the value extends in the positive, the stronger the induction.
  • the SDP control has a very strong capacity for inducing the PR1, PR4 and PR5 genes, 2 and 3 days after the second treatment (D2). It also shows a moderate induction of the PR8 gene on date D2.
  • the induction profile of the SDP control in this test corresponds to the known effects of this product. The test is therefore validated.
  • the polysaccharides show a strong capacity for inducing the PR1, PR4 and PR5 genes, 2 days after the second treatment (D2).
  • the PR14 gene is also induced at a high level, 2 days after the last treatment (D2).
  • the Fold change corresponds to the ratio of the level of expression of a gene for a treatment modality (SDP control, candidate product) compared to the EAU control, without log2 transformation and averaged for the 2 repeats. Fold change values greater than or equal to 2 represent moderate to strong inductions.
  • the SDP control very strongly induces the PR1, PR4 and PR5 genes, at a level 253 to 1515 times higher than the WATER control.
  • the PR8 and PR14 genes are induced respectively 4 and 3 times more than with the EAU control.
  • the polysaccharides exhibit a strong capacity for inducing the PR1, PR4, PR5 and PR14 genes, at a level 7 to 40 times higher than the EAU control.
  • the SDP control exhibits a strong capacity for inducing the PR1, PR4 and PR5 genes, 100 to 170 times higher than the EAU control.
  • the polysaccharides strongly induce the PR1, PR4 and PR5 genes, respectively 18, 78 and 85 times more than the EAU control.
  • the polysaccharides derived from the fruits of the date palm Phoenix dactylifera have a high capacity for inducing PR protein genes in wheat. They therefore have an inducing effect of the defense genes on the wheat crop and can be used as elicitors.
  • Aim The objective is to confirm on vine plants what was observed on wheat plants in the previous example.
  • the vines were produced from seeds of the Chardonnay grape variety. They were cultivated for 9 to 10 weeks in a greenhouse under semi-controlled conditions (19 ° C, 16 hours of daylight) then selected at the 4 - 6 leaf stage and transferred to a greenhouse dedicated to experimentation.
  • Tween 20 was added to each candidate product, at a concentration of 0.05%, ie 25 ⁇ l for 50 ml of product.
  • Each block of each modality is treated twice, with the exception of the WATER indicator which is applied once only (J0).
  • the candidate products are applied 4 days apart (D-4 / D0) and the SDP control at 6-day intervals (D-6 / D0).
  • Each modality is then treated on D1 with hydrogen peroxide (H202) to simulate an attack by pests and diseases. All the treatments are carried out on the 2 leaf faces, up to the limit of runoff, with a sprayer connected to compressed air.
  • H202 hydrogen peroxide
  • RNA extraction, retro-transcription and quantitative PCR The procedure is identical to that of Example 4.
  • Table 9 below shows the density map of the relative expressions of the 7 genes of the PR proteins.
  • the SDP control exhibits a strong capacity for inducing PR protein genes, with the exception of the PR14 gene, 2 days after the second treatment (D2). On the other hand, it no longer shows induction of the PR protein genes, 3 days after the second treatment (D3).
  • the profile and the high level of induction on D2 of the SDP control in this test correspond to the known effects of this product under our conditions. The test is therefore validated.
  • the polysaccharides show a strong inducing capacity of the PR protein genes, 2 days after the second application (D2).
  • the SDP control induces the PR2, PR3, PR4, PR5, PR8 and PR14 genes, at a level 2 to 27 times higher than the WATER control.
  • the PR1 gene is the most induced, 158 times more than with the EAU control.
  • the polysaccharides exhibit a capacity for inducing the PR5 and PR14 genes, at a level 3 times higher than the EAU control. They strongly induce the PR1, PR3, PR4 and PR8 genes, at a level 5 to 36 times higher than the EAU control.
  • the PR2 gene is the most induced, 50 times more than with the EAU control.
  • the SDP control exhibits a low capacity for inducing the PR14 gene, at a level 1.5 times higher than the EAU control. It does not induce the other PR protein genes.
  • the polysaccharides induce the PR3 gene at a level 3 times higher than the EAU control.
  • polysaccharides derived from the fruits of the date palm Phoenix dactylifera have a high capacity for inducing PR protein genes in grapevine. They therefore have an inducing effect of the defense genes on the wheat crop and can be used as elicitors.
  • Example 7 The polysaccharides derived from the fruits of the date palm Phoenix dactylifera have a high capacity for inducing PR protein genes in grapevine. They therefore have an inducing effect of the defense genes on the wheat crop and can be used as elicitors.
  • Aim The study is being carried out in order to determine the effectiveness of protection of a mixture of water-soluble polysaccharides and polyphenols against downy mildew (Plasmopara viticola) of the vine (Vitis vinifera), at three different doses, in preventive or curative application .
  • the tests are carried out on vine discs under controlled conditions.
  • water and Bordeaux mixture are also applied 24 hours before or 24 hours after contamination of the plant by Plasmopara viticola.
  • Table 12 illustrates the application modalities.
  • Plant material vine seedlings are obtained from seeds of the Chardonnay grape variety.
  • Plasmopara viticola Leaves 5 cm in diameter with large sporulation spots were frozen. The strain is then multiplied just before the experiment on vine plants, in order to have a fresh inoculum.
  • Culture the seedlings are cultivated for 6 weeks under controlled conditions (25 ° C, 16h photoperiod) then selected at the 4-leaf stage and transferred to a dedicated climatic module for experimentation at the time of inoculation (21 ° C day, 19 ° C night, 16h photoperiod).
  • Treatment the products are applied by spraying using a sprayer connected to compressed air up to the point of runoff on both leaf faces. The treatments were applied as a preventive measure, at -24h before inoculation, on plants, or curative, at +24h on discs.
  • Tinoculum production and inoculation the leaves with dense sporulation are rinsed with reverse osmosis water and the suspension is filtered. The final concentration of the inoculum is adjusted to the concentration of 5.10 4 in sp / ml.
  • Leaf discs are made using a cookie cutter at the rate of 8 discs per Petri dish. The inoculum is then applied to the underside of the discs with a fine droplet sprayer. The dishes are kept at room temperature until reading.
  • Method of analysis the results are read between 6 and 9 days after inoculation using a quantitative scale for the severity of the disease varying from 0 to 100% of sporulation covering the surface of the leaf discs.
  • the severity (intensity) of the disease is calculated by averaging the scores (%) obtained by modality.
  • the incidence (frequency) of the disease is calculated and corresponds to the percentage of plants affected by late blight.
  • the percentage of protection is calculated by the formula ((Water witness score-X score / Water witness score) x 100) from the severity scores.
  • the data were analyzed with the XLSTAT software with an ANOVA.
  • the statistical analysis used to differentiate the means is the Fisher Minimum Significant Difference (LSD) procedure. It indicates statistically significant differences at the 95% confidence level.
  • a severity score is also observed which is significantly lower than the corresponding treated water control for the doses at 0.01%, 0.1% and 0.7% of the mixture according to the invention, which are respectively 79 , 80 and 71%, with a positive dose effect.
  • the degree of protection obtained for the mixture at the dose of 0.7% is 30%.
  • the mixture has the ability to induce natural defense reactions in the plant and to protect it before it is attacked by the pathogen but also to induce defense mechanisms in treatment when the plant is in contact with the pathogen.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un extrait de saccharides hydrosolubles issus de fruits du dattier Phoenix dactylifera pour la protection des plantes contre des pathogènes. En particulier, selon l'invention, un tel extrait est utilisé pour la stimulation des réactions de défense et de résistance de la plante en traitement ou en prévention, en particulier pour induire une activité élicitrice des mécanismes de défense.

Description

UTILISATION DE SACCHARIDES DE DATTES SEULS OU EN MELANGE AVEC DES POLYPHENOLS POUR PROTEGER LES PLANTES CONTRE DES PATHOGENES
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention appartient au domaine technique des produits de protection agronomique ou agricole et a pour objet l'utilisation d'un extrait de saccharides, ou d'un mélange d'extraits de saccharides et de polyphénols, issus de fruits du dattier Phoenix dactylifera pour protéger les plantes contre les pathogènes, en particulier pour stimuler les défenses naturelles des plantes et développer leur résistance contre des pathogènes.
Les plantes font l'objet d'attaques régulières de pathogènes avec pour conséquences des dommages importants pour les récoltes, voire des pertes totales de récoltes. Le mildiou de la vigne, par exemple, est une maladie provoquée par un oomycète, Plasmopara viticola, qui occasionne chaque année de nombreuses pertes et qui est susceptible de faire son apparition partout dans le monde. La prévention est nécessaire et nécessite la mise en place de traitements réguliers tout au long de l'année. D'autres pathogènes, tels que des champignons ou des insectes, sont également redoutés dans les milieux agronomiques et horticoles.
La lutte contre ces pathogènes implique souvent l'utilisation de produits issus de l'industrie chimique pour la mise en place des réactions de défense et de résistance de la plante nécessaires au maintien de la culture et du rendement. Cependant, si de tels traitements sont efficaces, l'impact de ces produits sur l'environnement et la santé des consommateurs est inquiétant. Par ailleurs, de tels traitements ne sont pas compatibles avec l'agriculture biologique.
Ainsi, depuis plusieurs années déjà, l'utilisation de substances d'origine naturelle à titre d'agents protecteurs des plantes contre les pathogènes a fait l'objet de recherches. Ces substances peuvent être d'origine végétale, animale, ou minérale. Elles possèdent généralement une durée de vie courte ce qui limite leur présence dans les produits alimentaires et dans l'environnement. Elles peuvent agir de différentes façons, par exemple en stimulant les défenses naturelles de la plante ou en agissant directement sur une population de pathogènes pour inhiber sa croissance et son développement.
A titre de composés agissant en déclenchant les mécanismes de défenses de la plante, on citera par exemple la laminarine extraite des algues brunes ou encore l'extrait de marc de raisin.
Les plantes ne possèdent pas de système immunitaire équivalent à celui des humains et des animaux, cependant elles sont capables de mettre en place des mécanismes de défenses qui peuvent être induits par des composés agissant comme des signaux sur les gènes de défense pour déclencher la synthèse de molécules anti-pathogènes ou de molécules aptes à renforcer structurellement la plante. De tels composés sont dits éliciteurs.
Ainsi, si l'on met une plante en contact avec un composé éliciteur avant qu'elle ne soit en contact avec un pathogène, la plante sera en quelque sorte immunisée contre ce pathogène.
Les éliciteurs sont donc extrêmement intéressants dans la lutte contre les pathogènes de plantes. EXPOSE DE l'INVENTION
Ainsi, le besoin de proposer des composés d'origine naturelle, respectueux de l'environnement, des cultures et de la santé, pour la protection des plantes, est aujourd'hui au cœur des préoccupations. En particulier, il existe un besoin d'identifier et de proposer de tels composés qui présentent une activité de stimulation du système de défense des plantes contre les pathogènes et d'inhibition de la croissance et du développement des pathogènes.
C'est dans ce contexte que la société déposante a travaillé et démontré que des composés issus de fruits du dattier Phoenix dactylifera pouvaient protéger les plantes contre les pathogènes, en particulier pouvaient induire et stimuler les réactions de défense des plantes contre les pathogènes.
Ainsi, la présente invention concerne l'utilisation d'un extrait de saccharides hydrosolubles issu de fruits du dattier Phoenix dactylifera pour la protection des plantes contre des pathogènes.
En particulier selon l'invention, un tel extrait est utilisé pour la stimulation des réactions de défense et de résistance de la plante en traitement ou en prévention, en particulier pour induire une activité élicitrice des mécanismes de défense.
Les dattes peuvent être considérées comme une source intéressante de composés à activités biologiques variées. En outre, une part importante de la production de dattes est transformée en produits dérivés, tels que des confitures, des jus et des sirops. Par conséquent, une grande quantité de noyaux de dattes et de fruits non commercialisés est produite comme un déchet qui peut être valorisé sur la base de sa teneur élevée en composés bioactifs tels que les polysaccharides.
En effet, un extrait de saccharides dans le cadre de l'invention peut comprendre une quantité de saccharides supérieure ou égale à 40%, 50% ou encore 60%, en poids de l'extrait.
Selon une caractéristique de l'invention, les saccharides contiennent du rhamnose, de l'arabinose, du fucose, du xylose, du mannose, du galactose, de l'acide galacturonique, du glucose et/ou de l'acide glucuronique.
Les saccharides, au sens de l'invention, sont des monosaccharides, des oligosaccharides ou des polysaccharides. Préférentiellement, il s'agira de polysaccharides.
Les polysaccharides sont des composés organiques abondants dans la nature. Ce sont des homo ou hétéropolymères formés par l'enchaînement linéaire ou ramifié d'oses.
Les polysaccharides que l'on trouve chez la datte sont la cellulose, la pectine et les hémicelluloses. Ces polysaccharides font partie de la catégorie des fibres alimentaires et sont divisés en deux groupes : les fibres solubles, ou hydrosolubles, comprenant les pectines et certaines hémicelluloses, et les fibres insolubles, non solubles dans l'eau, comprenant la cellulose et certaines autres hémicelluloses.
Les saccharides, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, sont les polysaccharides naturellement hydrosolubles ou un mélange de tels polysaccharides avec des hydrolysats de polysaccharides naturellement non hydrosolubles.
En effet, l'extraction menée sur les fruits de dattes permet l'obtention d'une fraction enrichie en polysaccharides solubles et insolubles. Les polysaccharides initialement insolubles peuvent être valorisés dans le cadre de l'invention une fois rendu hydrosolubles, notamment après la mise en œuvre d'une méthode d'hydrolyse enzymatique ou chimique, par exemple par hydrolyse acide.
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'extrait de saccharides contient, en poids : au moins 20% de mannose, au moins 7% d'arabinose, au moins 6 % de glucose, au moins 5% de galactose.
Cet extrait de saccharides est obtenu généralement à partir du noyau des fruits de dattes.
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'extrait de saccharides contient, en poids : au moins 40 % d'acide galacturonique, au moins 7% d'arabinose, au moins 3% de xylose.
Cet extrait de saccharides est obtenu quant à lui à partir des tissus de peau et de pulpe des fruits de dattes.
Comme le démontreront les exemples qui suivent, les polysaccharides extraits de datte présentent un effet inducteur des défenses naturelles des plantes très élevé. En particulier, ils permettent d'induire les gènes les plus représentatifs des protéines PR (Pathogenesis Related) impliquées dans les réactions de défense des plantes. Ils constituent donc de bons agents de stimulation des réactions de défense naturelles des plantes.
Les protéines PR s'accumulent dans les tissus d'une plante en réponse à un stress biotique ou abiotique, ou suite à l'application d'un produit inducteur des défenses. Chaque protéine PR possède sa propre fonction. Elles s'accumulent à un niveau local et systémique et leur présence est un indicateur de la mise en place des mécanismes de défense par la plante.
Les protéines PR1 seraient impliquées dans la séquestration des stérols. Elles auraient une action anti-fongique et anti-oomycète, à travers l'inhibition de la croissance et la germination des spores, notamment vis-à-vis du mildiou et de la pourriture grise de la tomate (Niderman et al., 1995 ; Garnir et al., 2016). Elles auraient également une action favorable dans la résistance à la sécheresse (Liu et al., 2013).
Les protéines PR2 ont une action glucanase (b-1,3- glucanases), responsable de la dégradation du glucane, constituant polysaccharidique majeur de la paroi des champignons (Benhamou, 2009). La PR2 est induite en réponse à la voie de l'acide salycilique. La PR2 est une protéine qui peut être impliquée également dans les tolérances aux stress abiotiques comme celui de la sécheresse (Liu et al., 2013).
Les protéines PR3 ont une activité chitinase. Elles ont un effet antimicrobien direct à travers la dégradation de la paroi fongique et un effet indirect via la libération éventuelle de fragments inducteurs des gènes de défense (Benhamou, 2009).
Les protéines PR4 ont montré notamment une activité ribonucléase et chitinase. Des études chez le blé ont suggéré une activité anti-fongique contre Fusarium culmorun (Bertini et al., 2009 ; Caruso et al., 2001 ; Filipenko et al., 2013). Une autre étude a rapporté une activité antifongique possible chez le maïs (Bravo et al., 2003). La PR4 est une protéine qui semble être activée à la fois par les voies SA et JA (Bertini et al., 2003 ; Wang et al., 2011).
Les protéines PR5 sont des protéines « Thaumatin like » avec une activité contre les oomycètes mais aussi contre les Verticillium, Fusarium, et les champignons nécrotrophes. Cette protéine permet aussi d'induire une tolérance à la sécheresse (Liu et al., 2013). Les protéines PR8 présentent une action antibactérienne à travers une activité lysosomale et antifongique, en catalysant l'hydrolyse de la chitine des parois fongiques et en inhibant la croissance des hyphes. De par leur action de dégradation, elles seraient à l'origine de la production d'éliciteurs endogènes, déclenchant ainsi la mise en place de réactions de défense au sein de la plante attaquée (Métraux et al., 1988).
Les protéines PR14, sont des protéines de transfert lipidique, exprimées dans les jeunes feuilles et semblent avoir un rôle dans le transport de monomères de cutines ; elles sont associées à l'assemblage de la cutine et de la cire (Sels et al., 2008). Elles ont des propriétés antimicrobiennes, par exemple contre les Pseudomonas, Fusarium, Pythium et Botrytis (Kido et al., 2010).
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'extrait contient, de plus, au moins 5 %, en poids, de protéines, préférentiellement au moins 10%, plus préférentiellement entre 5 et 15%.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'extrait de saccharides hydrosolubles est un mélange avec un extrait de polyphénols également issu de fruits du dattier Phoenix dactylifera.
Le mélange se trouvera sous la forme d'une composition.
Les polyphénols sont des composés antioxydants spécifiques du règne végétal, et dotés de diverses activités biologiques démontrées par de nombreuses études décrites dans la littérature scientifique. On citera notamment leur activité antioxydante, anti-inflammatoire, antimicrobienne, antivirale ou encore anticancéreuse.
Avantageusement selon l'invention, le ratio saccharides / polyphénols est compris entre 30/70 et 70/30, exprimé en poids.
Les polyphénols sont présents dans tous les organes de la plante. Ils présentent une très grande variété de structures. Ainsi, ils se répartissent dans différentes familles :
Les acides phénoliques, tels que les dérivés de l'acide hydroxy-benzoïque et les dérivés de l'acide cinnamique,
Les flavonoïdes tels que les flavan-3-ols, dont les catéchines et les tanins, et les flavones, dont les flavonols.
Le fruit du dattier comprend trois tissus : le noyau, la pulpe et la peau. Il évolue également selon quatre stades de maturité : Hababouk, Blah (Kimri), Besser (Khalal) et Tamar. La sélection du fruit en fonction de l'un de ces stades, et en fonction des tissus, permet d'obtenir des résultats différents en terme de teneur en polyphénols.
Avantageusement, l'extrait de polyphénols contient jusqu'à 80% de polyphénols, en poids par rapport au poids total de l'extrait purifié sec.
Préférentiellement, l'extrait de polyphénols contient au moins 95%, plus préférentiellement au moins 97%, encore plus préférentiellement au moins 99% de tanins condensés, en poids par rapport au poids total de polyphénols.
Les tanins condensés dans l'extrait selon l'invention sont des oligomères ou des polymères de pro- anthocyanidines.
L'extrait peut être plus ou moins concentré en polyphénols en fonction du tissu et du stade de maturité mais également en fonction de la méthode d'extraction. Ces choix pourront être guidés par les exemples qui suivent. Selon un mode de réalisation de l'invention, une quantité efficace de l'extrait de saccharides, ou du mélange d'extraits de saccharides et de polyphénols, apportée aux plantes est d'au moins 0,01 g par litre, préférentiellement d'au moins 0,1 g par litre, plus préférentiellement d'au moins 0,7 g par litre, pour un apport sous forme liquide, ou d'au moins 10 g par hectare, préférentiellement d'au moins 100 g par hectare pour un apport sous forme solide.
La quantité efficace doit être suffisante pour induire des mécanismes de défense et de résistance et varie d'une plante à l'autre ou en fonction de la méthode de traitement. Cette quantité pourra être déterminée facilement par un homme du métier.
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'extrait de saccharides, ou le mélange d'extraits de saccharides et de polyphénols, est appliqué à la plante entière, aux feuilles, aux fleurs, aux racines, aux fruits, aux graines, aux semis, au sol, au milieu de culture solide ou liquide, au matériel de culture.
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'application est réalisée par arrosage, irrigation, pulvérisation, trempage ou injection.
Selon une caractéristique de l'invention, les plantes sont des plantes agronomiques, ornementales, aromatiques ou médicinales, en particulier, les plantes sont des plants fruitiers, en particulier des vignes, des plants de légumes, des fleurs, des arbres, des arbustes.
Selon une autre caractéristique de l'invention, les pathogènes de plantes sont des champignons, des bactéries, des virus, des nématodes, des plantes parasites, des protozoaires ou des insectes, en particulier Plasmopora viticola.
En effet, comme le démontreront les exemples qui suivent, le mélange d'extraits de saccharides et de polyphénols s'est particulièrement montré efficace contre le pathogène responsable du mildiou de la vigne.
L'invention concerne encore une méthode de protection d'une plante contre des pathogènes, en particulier pour activer des réactions de défense et de résistance de la plante, la méthode comprenant l'application à ladite plante, ou dans l'environnement de la plante, d'une quantité efficace d'un extrait de saccharides hydrosolubles issu de fruits du dattier Phoenix dactylifera seul ou en mélange avec un extrait de polyphénols issu de ce même dattier, les extraits étant tels que décrits précédemment et appliqués de la même manière que mentionnée précédemment.
L'invention concerne encore un produit phytosanitaire contenant une quantité efficace d'un extrait de saccharides issu de fruits du dattier Phoenix dactylifera seul ou en mélange avec un extrait de polyphénols de ce même dattier, les extraits étant tels que décrits précédemment.
Selon un mode de réalisation, le produit phytosanitaire comprend, de plus, au moins un autre composant tel qu'un solvant, un tensioactif, un émulsifiant, un agent dispersant, une charge, un composé fertilisant ou un composé phytosanitaire.
Avantageusement, le produit phytosanitaire se présente sous une forme liquide, sous forme de gel, sous forme de poudre ou de granulés.
EXPOSE DETAILLE DE MODES DE REALISATION Les caractéristiques de l'invention mentionnées ci-dessus, ainsi que d'autres, apparaîtront plus clairement à la lecture de la description suivante d'exemples de réalisation.
Matériel végétal :
Toutes les variétés de dattes peuvent être utilisées. Les fruits peuvent être sélectionnés selon l'un ou l'autre des quatre stades de maturité suivants : Hababouk (stade 1), Blah (Kimri) (stade 2), Besser (Khalal) (stade 3), Tamar (stade 4). Les tissus, c'est-à-dire la peau, la pulpe et le noyau, sont séparés les uns des autres. Après une opération de broyage, les tissus sont séchés et réduits en poudre. Il convient de noter qu'au stade 1 de maturation, le fruit est étudié entièrement sans séparation des tissus car le noyau n'est pas encore formé.
Exemple 1
Obtention d'extraits de polysaccharides hydrosolubles
Les extraits de saccharides peuvent être obtenus à partir des poudres de tissus selon un procédé consistant à extraire dans un premier temps la matière insoluble à l'alcool (MIA) puis, dans un second temps, à purifier les saccharides hydrosolubles, en particulier les polysaccharides, à partir de cette matière. Bien entendu, d'autres méthodes d'extraction peuvent être mises en oeuvre. a) Obtention des matières insolubles à l'alcool :
La MIA est obtenue à l'aide du procédé ci-dessous :
• Etape d'extraction : la poudre de dattes est dispersée dans une solution d'éthanol (96 % + 1 % HCl) (V/P) préalablement portée à ébullition. Après agitation, les mélanges sont immédiatement refroidis et placés à 4°C pendant une nuit,
• Etape de filtration,
• Etape de rinçage par éthanol (65 % + 1 % HCl),
• Etape de filtration,
• Etape de rinçage avec l'acétone,
• Séchage à l'étuve à 45°C,
• Obtention d'une poudre contenant des polysaccharides.
Il convient de noter qu'en fonction des tissus et du stade de maturité du fruit, les pourcentages de matières insolubles à l'alcool varient mais peuvent atteindre près de 90%, en poids de matière fraîche. b) Procédé de purification des polysaccharides hydrosolubles à partir de la MIA :
• Agitation des poudres obtenues en (a) dans de l'eau acidifiée à 1% d'acide acétique,
• Centrifugation,
• Lyophilisation de surnageant pour obtenir une fraction contenant les fibres solubles sous forme d'une poudre, • Le résidu, c'est à dire la fraction contenant les fibres insolubles, est passé à l'étuve à 45°C pour séchage. c) Détermination de la composition massique des monosaccharides des MIA et des fractions de polysaccharides solubles et insolubles obtenues à partir des MIA :
La détermination de la composition massique en monosaccharides neutres et acides est réalisée par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (en anglais Gas chromatography-mass spectrometry ou GC-MS). Cette analyse est réalisée sur les MIA obtenues des noyaux et sur les fractions solubles issues des MIA des tissus de peau, de pulpe et de noyaux ainsi que sur les fractions insolubles issues des MIA de noyaux.
Les analyses par GC-MS des sucres simples constitutifs des structures polysaccharidiques des MIA nous montrent une grande variabilité des quantités de polysaccharides en fonction des fractions issues de pulpe, de peau ou de noyaux.
Les résultats sont consignés dans le tableau 1 suivant dans lequel les unités sont exprimées en pg/mg.
Tableau 1
Rha : rhamnose ; Ara : arabinose ; Fuc : fucose ; Xyl : xylose ; Man : mannose ; Gai : galactose ; GalA : acide galacturonique, GIc : glucose, GIcA : acide glucuronique.
MIA : fraction de Matières Insolubles à l'Alcool issue du noyau ; FSN : fraction de polysaccharides solubles obtenue à partir de MIA de noyaux ; FSC fraction de polysaccharides solubles obtenue à partir de MIA de pulpes et de peaux; FISN : fraction de polysaccharides insolubles obtenue à partir de MIA de noyaux.
Ainsi, la fraction de polysaccharides solubles extraite à partir de noyaux (FSN) est caractérisée par une teneur en polysaccharides de près de 50%, en poids. La fraction de polysaccharides solubles extraite à partir de pulpes et de peaux (FSC) est quant à elle caractérisée par une teneur en polysaccharides de plus de 66 %, en poids.
Ces polysaccharides sont composés de monosaccharides de rhamnose, arabinose, fucose, xylose, mannose, galactose, acide galacturonique, glucose et acide glucuronique.
Dans la fraction issue du noyau FSN, le mannose est le monosaccharide qui se trouve en plus grande quantité. On note également une quantité importante de glucose. Ceci témoigne de la présence de polysaccharides de la famille des glucomannanes. Dans la fraction issue des tissus et peaux FSC, c'est l'acide galacturonique qui est en quantité importante. La présence dans cette fraction de galactose et de xylose témoigne de la présence de polysaccharides de type pectine.
La fraction de polysaccharides insolubles obtenue à partir de MIA de noyaux FISN est également riche en monosaccharides, en particulier en mannose. Le mannose forme environ 90% du poids massique de la fraction des fibres insolubles. Ceci témoigne de la présence de polysaccharides de la famille des galactomannanes. Ainsi, il peut être intéressant, à partir de cette fraction de fibres insolubles, de préparer une fraction soluble de monosaccharides (voir exemple 4) qui pourra être utilisée dans le cadre des applications visées par l'invention. d) Détermination de la composition massique en protéines des fractions de polysaccharides solubles et insolubles obtenues à partir des MIA de noyaux et de tissus (pulpe et peau) :
La méthode de détermination de la concentration en protéines des fractions MIA, FSC, FISN et FSN repose sur le dosage de l'azote et de carbone par combustion d'échantillons de chacune de ces fractions, sous forme de poudre lyophilisée, selon la méthode bien connue de Dumas. Les résultats sont consignés dans le Tableau 2.
Tableau 2
La valeur entre parenthèse correspond à l'intervalle de confiance a 0.05% avec n=3 ; 1 conversion utilisant le facteur 6. 25 selon la norme IS016634
Selon les échantillons, les teneurs varient de 40 à 50 % pour le carbone et de 1,0 à 2,2 % pour l'azote. Ces données permettent d'estimer des teneurs en protéines variant de 6 à 14 % selon les échantillons. La fraction FISN avec une teneur estimée en protéines de près de 14% est significativement plus riche en protéines que les autres fractions. Il n'y a pas de différence significative entre les teneurs en protéines estimées pour les fractions FSN et FSC.
Exemple 2
Obtention d'extraits de polyphénols :
Les polyphénols peuvent être obtenus à partir des poudres de tissus selon un procédé d'extraction et de purification de polyphénols comprenant essentiellement les étapes suivantes : extraction solide-liquide à l'aide d'un solvant, préférentiellement polaire, et récupération d'un extrait contenant des composés polyphénoliques, purification des composés polyphénoliques de l'extrait par une méthode de chromatographie en phase solide, par exemple en phase inverse ou par échange d'ions, récupération d'un extrait purifié concentré en composés polyphénoliques.
La mise en oeuvre est la suivante :
10 g de poudre de tissus de fruit sont mis en contact avec 80 mL d'hexane durant 15 min., sous agitation, puis filtrés, lors d'une première extraction. Le résidu obtenu est soumis à une seconde extraction par mise en contact avec 80 mL d'hexane durant 15 min., sous agitation puis filtré. Le résidu obtenu est récupéré puis séché sous azote durant lh. Cette étape est optionnelle. Le résidu sec de l'extraction est mis en contact avec 30 ml de solvant polaire durant 15 min., sous agitation, puis filtré, lors d'une première extraction. Le solvant polaire est composé d'éthanol/eau/acide acétique selon un ratio de 50 à 80 d'éthanol : 1 à 10 d'acide acétique : qsp en eau (V/V/V) (solvant hydroalcoolique). Par exemple, un ratio de 80 :19 :1 (Vol. éthanol/ Vol. eau/Vol. acide acétique/) est adapté. Dans une variante, un solvant composé d'acétone/eau/acide acétique selon un ratio de 50 à 80 d'acétone : 1 à 10 d'acide acétique : qsp eau (V/V/V) (solvant hydro- acétonique). Par exemple, un ratio de 50 :49 : 1 peut être utilisé.
L'extrait obtenu, nommé El, est conservé, et le résidu obtenu est soumis à une seconde extraction par mise en contact avec 30 mL du même solvant durant 15 min., sous agitation puis filtré. L'extrait obtenu, nommé E2, est conservé et le résidu obtenu est récupéré et soumis à une troisième extraction par mise en contact avec 30 mL du même solvant durant 15 min., sous agitation puis filtré. L'extrait obtenu, nommé E3, est conservé. Les extraits El, E2 et E3 sont mélangés. Une filtration est réalisée afin de récupérer le surnageant puis les composés phénoliques dans l'extrait sont concentrés par évaporation sous vide.
Les extraits sont centrifugés à 4500 tr/min pendant 10 min à 4°C afin de récupérer le surnageant qui sera utilisé pour la cartouche Sep Pack C18 (commercialisée par la société Waters) pour la mise en oeuvre d'une extraction en phase solide (SPE).
Des cartouches SPE contenant 5 g de gel C18 (cartouche Sep Pack C18 commercialisée par la société Waters) sont conditionnées à l'éthanol (20 mL) puis équilibrées à l'eau acidifiée (40 mL) avant que ne soient déposés les extraits aqueux de chaque échantillon (40 ml), préalablement centrifugés à 4500 tr/min pendant 10 min à 4°C. Un rinçage est effectué par 40 mL d'eau acidifiée (à 2% d'acide acétique), puis la fraction retenue est éluée par 40 mL de mélange éthanol/eau/acide acétique (50 à 80 éthanol : 1 à 50 acide acétique : qsp eau), préférentiellement 50 : 49 :1 (V/V/V). La colonne est ensuite lavée par 30 mL d'éthanol pour éliminer les polyphénols très hydrophobes qui peuvent être encore fixés.
Dans une variante, la purification peut être réalisée à l'aide d'une colonne échangeuse d'ions FPX 66 (Société Rohm & Haas France SAS).
Une concentration des extraits est réalisée par évaporation du solvant et une fraction purifiée de polyphénols est obtenue. La fraction est ensuite séchée pour obtenir une poudre de polyphénols.
Les extraits obtenus contiennent jusqu'à 80% de polyphénols, en poids par rapport au poids total de l'extrait purifié sec. De plus, les extraits contiennent au moins 95%, plus préférentiellement au moins 97%, encore plus préférentiellement au moins 99% de tanins condensés, en poids par rapport au poids total de polyphénols.
Exemple 3
Préparation d'une composition contenant un extrait de polysaccharides hydrosolubles et un extrait de polyphénols
70 mg de fibres solubles précédemment extraites sont dissoutes dans 200 mL d'eau acidifiée à 0,1% d'acide formique. 70 mg de polyphénols précédemment extraits sont dissouts dans 50 mL d'eau acidifiée à 0,1% d'acide formique.
Les deux solutions sont mélangées, agitées puis centrifugées à 4500tr/min pendant 10min. Le surnageant est récupéré puis séché.
Les mélanges à étudier sont préparés par des fractions de fibres solubles-tanins (50 /50 w :w).
Exemple 4
Obtention et analyse d'un hydrolysat de polysaccharides initialement non hydrosolubles et issus de fruits du dattier Phoenix dactylifera a) Obtention :
L'objectif est de préparer des fractions de saccharides solubles riches en mannoses oligomères à partir de la fraction contenant des polysaccharides insolubles FISN issue de la MIA.
On utilise une bêta-mannanase bactérienne ou fongique, en particulier la bêta-mannanase extraite à'Aspergillus niger, notamment la bêta-mannanase purifiée û'Aspergillus niger commercialisée sous la marque Gamanase® (NOVO-NORDISK, Danemark).
On définit l'unité de bêta-mannanase comme étant la quantité de bêta-mannanase qui libère, à partir de gomme de caroube, une quantité de sucres réducteurs équivalente à 1 micromole de mannose par minute, à pH5 et à 30C.
La bêta-mannanase peut être immobilisée par liaison covalente à la surface d'un support traditionnel, ou encore immobilisée par polymérisation après avoir été adsorbée à la surface d'un support traditionnel. On peut alors hydrolyser l'extrait liquide à une température de 40-70 °C avec les enzymes immobilisées.
Des conditions d'incubation identiques ont été utilisées avec chaque b-mannanase (McCleary, B. V.,1979). La fraction insoluble FISN (20 ml, 0,5% p / v, sans tampon) a été incubée avec de la b- mannanase (0,8 pkat sur de la caroube galactomannane; 0,4 pkat sur du mannane soluble). Des aliquotes (4 ml) ont été prélevées à des intervalles de 20 minutes, 1, 6 et 18 heures, chauffées pour dénaturer l'activité de la b-mannanase, lyophilisées et réajustées à 2% en poids de glucide. Des aliquotes (20 pl) ont été appliquées sur des plaques préparées deux fois avec du n-PrOH-EtOH-H20 (7: 1: 2). Les taches ont été visualisées par pulvérisation de 5% de H2S04 dans EtOH et chauffant à 110°C pendant environ 10 min.
Cette technique a permis de solubiliser 99,5 % de la fraction contenant des fibres insolubles. b) Analyse : détermination de la composition massique en monosaccharides par GC-MS dans les fractions insolubles hydrolysées par voie enzymatique
Les analyses par GC-MS des structures polysaccharidiques des fractions insolubles hydrolysées et solubilisées montrent la richesse de cette fraction en mannose. Ce mannose provient à l'évidence de polysaccharides de la famille des galactomannanes et glucomannanes puisque cette partie soluble est riche en glucose et galactose. Les sucres identifiés sont du mannose (Man) ; galactose (Gai) ; un trisaccharide avec un rapport galactose / mannose de 1: 2 (Gal-Man2) ; un tétrasaccharide avec un rapport galactose / mannose de 1: 3 (Gal-Man3) ; et un pentasaccharide avec un rapport galactose / mannose de 1: 4 (Gal-Man4). Les résultats sont consignés dans le Tableau 3 et les unités en pg/mg.
Tableau 3
Exemple 5
Mise en évidence de l'efficacité des polysaccharides hydrosolubles issus de fruits du dattier Phoenix dactylifera, dans la stimulation des défenses naturelles du blé.
But : l'objectif est d'évaluer, en conditions semi-contrôlées, l'effet inducteur de l'extrait contenant des polysaccharides hydrosolubles (obtenu selon l'exemple 1 et nommé par la suite « Polysaccharides ») sur l'expression de 7 gènes des protéines PR, marqueurs des mécanismes de défense, à l'aide de l'outil qPFD® (décrit dans la demande de brevet WO2011/161388) sur plants de blé.
Matériel biologique
Les plants de blé ont été produits à partir de semences de la variété de blé tendre ALIXAN. Pour chaque modalité, 30 grains de blé ont été semés dans 3 pots (2 répétitions / modalité) puis placés en conditions contrôlées pendant 1 semaine (25°C constant, 16h de photopériode), jusqu'au stade feuille F2 émergente. Les jeunes plants ont ensuite été transférés dans une chambre climatique dédiée à l'expérimentation.
Produits testés et témoins
Les modalités suivantes ont été comparées (Tableau 4).
Tableau 4
Afin de faciliter l'adhésion du produit candidat sur les plants de blé, du Tween 20 a été ajouté à chaque produit candidat, à une concentration de 0.05% soit 25 pl pour 50 ml de produit.
Marqueurs de défenses utilisés
Les 7 gènes des protéines PR (Pathogenesis Related) ci-dessous ont été sélectionnés comme étant représentatifs des protéines PR majeures impliquées dans la défense des plantes.
PR-1 : Pathogenesis-related protein 1
PR-2 : Pathogenesis-related protein 2 (glucanases)
PR-4 : Pathogenesis-related protein 4 (hevein-like) PR-5 : Pathogenesis-related protein 5 (thaumatin-like, osmotin) PR-8 : Pathogenesis-related protein 8 (class III chitinase)
PR-14 : Pathogenesis-related protein 14 (lipid transfer protein) PR-15 : Pathogenesis-related protein 15 (oxalate oxidase)
Protocole
Deux répétitions de l'ensemble de l'expérience ont été réalisées, ainsi que deux analyses par PCR quantitative.
Les tests sont conduits en chambre climatique, en conditions contrôlées (21°C jour / 19°C nuit, 16h de photopériode) sur des plants de blé (stade 2/3 feuilles), randomisés en blocs de 7 pots.
Les produits de chaque modalité (2 pots) sont appliqués 2 fois, à l'exception du témoin EAU qui est appliqué 1 seule fois (JO). Le produit candidat et le témoin SDP sont appliqués à 4 jours d'intervalle, à J-4 et à JO. Chaque modalité est ensuite traitée à J1 avec du peroxyde d'hydrogène (H202) pour simuler une attaque de bioagresseurs. Tous les traitements sont réalisés jusqu'à limite de ruissellement, avec un pulvérisateur relié à de l'air comprimé.
Pour chaque modalité, dix fragments foliaires (env. 1 cm) sont prélevés en combinant 5 feuilles F2 issues de 5 plants différents, aux dates suivantes :
- JO : prélèvement initial sur 5 plants n'ayant reçu aucun traitement
- J2 : prélèvement 2 jours après traitement
- J3 : prélèvement 3 jours après traitement
Ces échantillons sont placés dans l'azote liquide puis conservés à -80°C jusqu'à l'extraction des ARN.
Extraction d'ARN, rétro-transcription et PCR quantitative
Les ARN ont été extraits à partir des tissus foliaires prélevés, à l'aide du kit NucleoSpin RNA Plant (Macherey-Nagel). Le rendement et la qualité des ARN extraits ont été évalués à l'aide d'un spectrophotomètre (Nanodrop ND-1000). Les ARN ont ensuite été rétro-transcrits en ADNc et les niveaux d'expression de 7 gènes des protéines PR ont été suivis (3 répétitions techniques) par PCR quantitative (agent intercalant SYBR Green) à l'aide de l'outil qPFD® (« Puce à Faible Densité Quantitative » développé par l'INRA). Les niveaux d'expression relative ont été calculés avec la méthode du 2 DDa : il s'agit d'expressions relatives par rapport au prélèvement JO (avant traitement) à chaque temps de prélèvement, normalisées par la moyenne géométrique des expressions relatives de 3 gènes de référence (TuB, Actin, GAPDH). Ces expressions relatives sont transformées en log2 pour donner le même poids aux inductions et aux répressions des gènes.
Résultats
Carte de densité des expressions relatives des gènes des protéines PR Le Tableau 5 ci-dessous présente la carte de densité des expressions relatives des 7 gènes des protéines PR. Les niveaux d'expression des 7 gènes, transformés en log2, sont représentés par une carte de densité. Celle-ci permet d'avoir une vision globale du profil d'induction et de visualiser directement les différences de niveaux d'expression des gènes marqueurs entre les échantillons traités, après avoir retranché les variations d'expression du témoin EAU. Echelle de variation des log2 (expression relative) : plus la valeur s'étend dans le positif, plus l'induction est forte.
Tableau 5
Le témoin SDP présente une très forte capacité d'induction des gènes PR1, PR4 et PR5, 2 et 3 jours après le second traitement (J2). Il montre également une induction modérée du gène PR8 à la date J2. Le profil d'induction du témoin SDP dans cet essai correspond aux effets connus de ce produit. L'essai est donc validé.
Les polysaccharides montrent une forte capacité d'induction des gènes PR1, PR4 et PR5, 2 jours après le second traitement (J2). Le gène PR14 est également induit à un niveau élevé, 2 jours après le dernier traitement (J2).
Fold change des gènes des protéines PR
Les valeurs « Fold change » des 7 gènes des protéines PR, pour chacune des modalités de traitement (produit candidat et témoin SDP), aux dates de prélèvement J2 et J3, sont détaillées dans les tableaux 6 et 7 ci-dessous.
Le Fold change correspond au rapport du niveau d'expression d'un gène pour une modalité de traitement (témoin SDP, produit candidat) par rapport au témoin EAU, sans transformation log2 et moyenné pour les 2 répétitions. Les valeurs Fold change supérieures ou égales à 2 représentent des inductions modérées à fortes.
Tableau 6 Tableau 7
Deux jours après le traitement, le témoin SDP induit très fortement les gènes PR1, PR4 et PR5, à un niveau 253 à 1515 fois plus élevé que le témoin EAU. Les gènes PR8 et PR14 sont induits respectivement 4 et 3 fois plus qu'avec le témoin EAU. Les polysaccharides présentent une forte capacité d'induction des gènes PR1, PR4, PR5 et PR14, à un niveau 7 à 40 fois plus élevé que le témoin EAU.
Trois jours après le traitement, le témoin SDP présente un forte capacité d'induction des gènes PR1, PR4 et PR5, 100 à 170 fois plus élevée que le témoin EAU. Les polysaccharides induisent fortement les gènes PR1, PR4 et PR5, respectivement 18, 78 et 85 fois plus que le témoin EAU.
Conclusions :
Les polysaccharides issus des fruits du dattier Phoenix dactylifera présentent une grande capacité d'induction des gènes des protéines PR chez le blé. Ils ont donc un effet inducteur des gènes de défense sur la culture de blé et peuvent être utilisés en tant qu'éliciteurs.
Exemple 6
Mise en évidence de l'efficacité d'un extrait de polysaccharides hydrosolubles issus de fruits du dattier Phoenix dactylifera, dans la stimulation des défenses naturelles de la vigne.
But : L'objectif est de confirmer sur plants de vigne ce qui a été observé sur plants de blé dans l'exemple précédent.
Matériel biologique
Les plants de vigne ont été produits à partir de pépins du cépage Chardonnay. Ils ont été cultivés pendant 9 à 10 semaines sous serre en conditions semi-contrôlées (19°C, 16h de jour) puis sélectionnés au stade 4 - 6 feuilles et transférés dans une serre dédiée à l'expérimentation.
Produits testés et témoins
Les modalités suivantes ont été comparées (Tableau 8).
Tableau 8
Afin de faciliter l'adhésion des produits candidats sur les plants de vigne, du Tween 20 a été ajouté à chaque produit candidat, à une concentration de 0.05% soit 25 pl pour 50 ml de produit.
Marqueurs de défenses utilisés
Les 7 gènes des protéines PR mentionnés dans l'exemple 4 : PR-1 ; PR-2 ; PR-4 ; PR-5 ;PR-8 ; PR- 14 ; PR-15.
Protocole
Deux répétitions de l'ensemble de l'expérience ont été réalisées, ainsi que deux analyses par PCR quantitative.
Chaque bloc de chaque modalité est traité 2 fois, à l'exception du témoin EAU qui est appliqué 1 seule fois (J0). Les produits candidats sont appliqués à 4 jours d'intervalle (J-4/J0) et le témoin SDP à 6 jours d'intervalle (J-6/J0). Chaque modalité est ensuite traitée à J1 avec du peroxyde d'hydrogène (H202) pour simuler une attaque de bio agresseurs. Tous les traitements sont réalisés sur les 2 faces foliaires, jusqu'à limite de ruissellement, avec un pulvérisateur relié à de l'air comprimé.
Pour chaque modalité, 8 disques foliaires (diamètre de 6 mm) sont prélevés en combinant 4 feuilles développées issues de 4 plants différents, aux dates suivantes :
- J0 : prélèvement initial sur 5 plants n'ayant reçu aucun traitement,
- J2 : prélèvement 2 jours après traitement,
- J3 : prélèvement 3 jours après traitement.
Ces échantillons sont placés dans l'azote liquide puis conservés à -80°C jusqu'à l'extraction des ARN. Extraction d'ARN, rétro-transcription et PCR quantitative Le déroulement est identique à celui de l'exemple 4.
Résultats
Carte de densité des expressions relatives des gènes des protéines PR
Le Tableau 9 ci-dessous présente la carte de densité des expressions relatives des 7 gènes des protéines PR.
Tableau 9
Le témoin SDP présente une forte capacité d'induction des gènes des protéines PR, à l'exception du gène PR14, 2 jours après le second traitement (J2). En revanche, il ne montre plus d'induction des gènes des protéines PR, 3 jours après le second traitement (J3). Le profil et le fort niveau d'induction à J2 du témoin SDP dans cet essai correspondent aux effets connus de ce produit dans nos conditions. L'essai est donc validé.
Les polysaccharides montrent une forte capacité d'induction des gènes des protéines PR, 2 jours après la seconde application (J2).
Fold change des gènes des protéines PR
Les valeurs « Fold change » des 7 gènes des protéines PR, pour chacune des modalités de traitement (produits candidats et témoin SDP), aux dates de prélèvement J2 et J3, sont détaillées dans les tableaux 10 et 11 ci-dessous.
Tableau 10
Tableau 11
Deux jours après le traitement, le témoin SDP induit les gènes PR2, PR3, PR4, PR5, PR8 et PR14, à un niveau 2 à 27 fois plus élevé que le témoin EAU. Le gène PR1 est le plus induit, 158 fois plus qu'avec le témoin EAU. Les polysaccharides présentent une capacité d'induction des gènes PR5 et PR14, à un niveau 3 fois plus élevé que le témoin EAU. Ils induisent fortement les gènes PR1, PR3, PR4 et PR8, à un niveau 5 à 36 fois plus élevé que le témoin EAU. Le gène PR2 est le plus induit, 50 fois plus qu'avec le témoin EAU.
Trois jours après le traitement, le témoin SDP présente une faible capacité d'induction du gène PR14, à un niveau 1.5 fois plus élevé que le témoin EAU. Il n'induit pas les autres gènes des protéines PR.
Les polysaccharides induisent le gène PR3 à un niveau 3 fois plus élevé que le témoin EAU.
Conclusions :
Les polysaccharides issus des fruits du dattier Phoenix dactylifera présentent une grande capacité d'induction des gènes des protéines PR chez la vigne. Ils ont donc un effet inducteur des gènes de défense sur la culture de blé et peuvent être utilisés en tant qu'éliciteurs. Exemple 7
Mise en évidence de l'efficacité d'un mélange d'extrait de polysaccharides hydrosolubles et d'extrait de polyphénols issus de fruits du dattier Phoenix dactylifera dans la protection des plantes contre le mildiou de la vigne
But : L'étude est menée afin de déterminer l'efficacité de protection d'un mélange de polysaccharides hydrosolubles et de polyphénols contre le mildiou ( Plasmopara viticola) de la vigne (Vitis vinifera), à trois différentes doses, en application préventive ou curative. Les essais sont réalisés sur disques de vigne en conditions contrôlées.
Modalités : Dans cette étude, des mélanges de polyphénols et polysaccharides hydrosolubles (ratio pondéral de 50/50) sont appliqués à différentes doses (0,01% ; 0,1% ; 0,7%) (g/L) à titre préventif, c'est-à-dire 24 h avant que la plante soit contaminée par Plasmopara viticola, et à titre curatif, c'est- à-dire 24 h après que la plante ait été contaminée.
A titre de témoins, de l'eau et de la bouillie bordelaise (produit de référence) sont également appliqués 24h avant ou 24h après contamination de la plante par Plasmopara viticola.
Le Tableau 12 illustre les modalités d'application.
Tableau 12
Matériel végétal : des semis de vigne sont obtenus à partir de pépins du cépage Chardonnay.
Plasmopara viticola : des feuilles de 5 cm de diamètre avec de larges taches de sporulation ont été congelées. La souche est ensuite multipliée juste avant l'expérimentation sur des plants de vigne, pour avoir un inoculum frais.
Culture : les semis sont cultivés pendant 6 semaines en conditions contrôlées (25°C, 16h de photopériode) puis sélectionnés au stade 4 feuilles et transférés dans un module climatique dédié pour l'expérimentation au moment de l'inoculation (21°C jour, 19°C nuit, 16h de photopériode). Traitement : les produits sont appliqués par pulvérisation à l'aide d'un pulvérisateur relié à l'air comprimé jusqu'au point de ruissellement sur les deux faces foliaires. Les traitements ont été appliqués en préventif, à -24h avant inoculation, sur plants, ou en curatif, à +24h sur disques.
Production de Tinoculum et inoculation : les feuilles avec une sporulation dense sont rincées à l'eau osmosée et la suspension est filtrée. La concentration finale de l'inoculum est ajustée à la concentration de 5.104 en sp/ml. Des disques foliaires sont réalisés à l'aide d'un emporte-pièce à raison de 8 disques par boîte de Pétri. L'inoculum est ensuite appliqué sur la face inférieure des disques avec un pulvérisateur à fines gouttelettes. Les boîtes sont maintenues à température ambiante jusqu'à la lecture.
Mode d'analyse : la lecture des résultats est réalisée entre 6 et 9 jours après inoculation en utilisant une échelle quantitative de sévérité de la maladie variant de 0 à 100% de sporulation recouvrant la surface des disques foliaires.
La sévérité (intensité) de la maladie est calculée en faisant la moyenne des notes (%) obtenues par modalité. L'incidence (fréquence) de la maladie est calculée et correspond au pourcentage de plantes atteintes par le mildiou. Enfin, le pourcentage de protection est calculé par la formule ((Note témoin eau-Note X/ Note témoin eau) x 100) à partir des notes de sévérité.
Les données ont été analysées avec le logiciel XLSTAT avec une ANOVA. L'analyse statistique utilisée pour différencier les moyennes est la procédure des différences significatives minimales de Fisher (LSD). Elle indique des différences statistiquement significatives au niveau de confiance de 95%.
Cette analyse a été réalisée sur les notations des notes de sévérité. En cas de test non paramétrique, le test de Kruskal-Wallis est utilisé ; ce test est un équivalent non paramétrique de l' ANOVA à un facteur contrôlé. Ce test non paramétrique repose sur la comparaison des intervalles de confiance de la médiane sur une représentation en boîtes à moustaches de Tukey.
Résultats : l'incidence et la sévérité du mildiou sur les disques foliaires inoculés artificiellement en conditions contrôlées et les pourcentages de protection sont indiqués dans le Tableau 13 ci-dessous.
Tableau 13 D'après ces données on observe, en application préventive, une note de sévérité significativement plus faible que le témoin eau traitée correspondant pour les doses à 0,1 et 0,7% du mélange polyphénols et polysaccharides hydrosolubles, respectivement de 73 et 35%, avec un effet dose positif. Le taux de protection obtenu pour le mélange selon l'invention à la dose de 0,7% est élevé (61%).
En application curative, on observe également une note de sévérité significativement plus faible que le témoin eau traitée correspondant pour les doses à 0,01%, 0,1% et 0,7% du mélange selon l'invention, qui sont respectivement de 79, 80 et 71%, avec un effet dose positif. Le taux de protection obtenu pour le mélange à la dose de 0,7% est de 30%.
En conclusion : on observe que le mélange présente la capacité d'induire des réactions de défense naturelle de la plante et de protéger celle-ci avant qu'elle ne soit attaquée par le pathogène mais également d'induire des mécanismes de défense en traitement lorsque la plante est en contact avec le pathogène.
La combinaison d'un extrait contenant des polysaccharides et d'un extrait contenant des polyphénols s'avère donc très utile dans la protection des plantes contre des pathogènes. En effet, un tel mélange, une fois appliqué sur la plante, va pouvoir agir sur le long terme, à la fois en prévention, en induisant des mécanismes de défense et de protection, notamment par une activité d'éliciteur, et en traitement. Il est donc possible de formuler un produit de soin des cultures à large spectre d'activité.

Claims

REVENDICATIONS
1) Utilisation d'un extrait de composés hydrosolubles issu de fruits du dattier Phoenix dactylifera, l'extrait contenant au moins 30%, en poids, de saccharides hydrosolubles, pour la protection des plantes contre des pathogènes.
2) Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle l'extrait contient, de plus, au moins 5 %, en poids, de protéines, préférentiellement au moins 10%, plus préférentiellement entre 5 et 15%.
3) Utilisation selon la revendication 1 ou 2, pour la stimulation des réactions de défense et de résistance de la plante en traitement ou en prévention, en particulier pour induire une activité élicitrice des mécanismes de défense.
4) Utilisation selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle l'extrait contient des polysaccharides naturellement hydrosolubles ou un mélange de tels polysaccharides avec des hydrolysats de polysaccharides naturellement non hydrosolubles.
5) Utilisation selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle les saccharides contiennent du rhamnose, de l'arabinose, du fucose, du xylose, du mannose, du galactose, de l'acide galacturonique, du glucose et/ou de l'acide glucuronique.
6) Utilisation selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle l'extrait contient, en poids : au moins 20% de mannose, au moins 7% d'arabinose, au moins 6 % de glucose, au moins 5% de galactose.
7) Utilisation selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle l'extrait contient, en poids : au moins 40 % d'acide galacturonique, au moins 7% d'arabinose, au moins 3% de xylose.
8) Utilisation selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle l'extrait de saccharides hydrosolubles est en mélange avec un extrait de polyphénols issu de fruits du dattier Phoenix dactylifera.
9) Utilisation selon la revendication 8, dans laquelle le ratio entre l'extrait de saccharides et l'extrait de polyphénols est compris entre 30/70 et 70/30, exprimé en poids.
10) Utilisation selon l'une des revendications 5 à 6, dans laquelle l'extrait de polyphénols comprend au moins 95%, plus préférentiellement au moins 97%, encore plus préférentiellement au moins 99% de tanins condensés, en poids par rapport au poids total de polyphénols.
11) Utilisation selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle la quantité efficace de l'extrait de saccharides, ou du mélange d'extraits de saccharides et de polyphénols, apportée aux plantes, est d'au moins 0,01 g par litre, préférentiellement d'au moins 0,1 g par litre, plus préférentiellement d'au moins 0,7 g par litre, pour un apport sous forme liquide, ou d'au moins 10 g par hectare, préférentiellement d'au moins 100 g par hectare pour un apport sous forme solide.
12) Utilisation selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle l'extrait de saccharides, ou le mélange d'extraits de saccharides et de polyphénols, est appliqué à la plante entière, aux feuilles, aux fleurs, aux racines, aux fruits, aux graines, aux semis, au sol, au milieu de culture solide ou liquide, au matériel de culture.
13) Utilisation selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle l'application est réalisée par arrosage, irrigation, pulvérisation, trempage ou injection.
14) Utilisation selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle les plantes sont des plantes agronomiques, en particulier du blé, ornementales, aromatiques ou médicinales, en particulier des plants fruitiers, en particulier des vignes, des plants de légumes, des fleurs, des arbres, des arbustes.
15) Utilisation selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle lesdits pathogènes de plantes sont des champignons, des bactéries, des virus, des nématodes, des plantes parasites, des protozoaires ou des insectes, en particulier Plasmopora viticola.
16) Méthode de protection d'une plante contre des pathogènes, en particulier pour activer des réactions de défense et de résistance de la plante, caractérisée en ce qu'elle comprend l'application à ladite plante, ou dans l'environnement de la plante, d'une quantité efficace d'un extrait de saccharides hydrosolubles issu de fruits du dattier Phoenix dactylifera seul ou en mélange avec un extrait de polyphénols de ce dattier, ladite composition étant telle que décrite dans l'une ou l'autre des revendications 1 à 15.
17) Produit phytosanitaire contenant une quantité efficace d'un extrait de saccharides issu de fruits du dattier Phoenix dactylifera, seul ou en mélange avec un extrait de polyphénols de ce même dattier, lesdits extraits étant tels que décrits dans l'une ou l'autre des revendications 1 à 15.
18) Produit phytosanitaire selon la revendication 17, comprenant, de plus, au moins un autre composant tel qu'un solvant, un tensioactif, un émulsifiant, un agent dispersant, une charge, un composé fertilisant ou un composé phytosanitaire.
19) Produit phytosanitaire selon l'une des revendications 17 ou 18, caractérisé en ce qu'il se présente sous une forme liquide, sous forme de gel, sous forme de poudre ou de granulés.
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