ES2819282T3

ES2819282T3 - Combinaciones de inhibidores de puntos de control inmunitarios

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Publication number: ES2819282T3
Application number: ES15793746T
Authority: ES
Inventors: Liv Marie Eike; Ketil Camilio; Baldur SVEINBJØRNSSON; Laurence Zitvogel; Takahiro Yamazaki; Øystein Rekdal; John Sigurd Mjøen Svendsen
Original assignee: Lytix Biopharma AS
Current assignee: Lytix Biopharma AS
Priority date: 2014-12-11
Filing date: 2015-11-04
Publication date: 2021-04-15
Anticipated expiration: 2035-11-04
Also published as: PL3230318T3; EP3230318B1; AU2015359881A1; US11083774B2; AU2021204356B2; JP6767096B2; US20180264079A1; US20210401933A1; AU2015359881B2; US20250332217A1; US20240293506A1; US20230201305A9; PT3230318T; DK3230318T3; HUE051268T2; WO2016091487A1; US12239686B2; AU2019203199B2; AU2019203199A1; JP2016128399A

Abstract

Un compuesto que tiene la fórmula Lys Lys Trp Trp Lys Lys Trp Dip Lys, o una sal, éster o amida del mismo; para su uso en el tratamiento de un tumor mediante la coadministración con un agente inmunoterapéutico, en donde el agente inmunoterapéutico es un anticuerpo anti-CTLA-4.

Description

DESCRIPCIÓN

Combinaciones de inhibidores de puntos de control inmunitarios

La presente invención se refiere a péptidos o moléculas similares a péptidos, y particularmente a preparaciones combinadas de tales péptidos con un agente adicional, y a sus usos en terapia, en particular como agentes antitumorales.

La prevalencia del cáncer en poblaciones humanas y animales y su papel en la mortalidad significa que existe una necesidad continua de nuevos medicamentos que sean eficaces contra los tumores. La eliminación de un tumor o la reducción de su tamaño, o la reducción del número de células cancerosas que circulan en los sistemas sanguíneo o linfático, pueden resultar beneficiosas de diversas formas; en la reducción del dolor o el malestar, en la prevención de la metástasis, para facilitar una intervención quirúrgica, para prolongar la vida.

Las alteraciones genéticas y epigenéticas que son características de los cánceres dan como resultado antígenos que el sistema inmunitario puede reconocer y que pueden utilizarse para diferenciar entre las células tumorales y sus equivalentes sanas. En principio, esto significa que el sistema inmunitario podría ser un arma potente para el control de tumores. Sin embargo, la realidad es que el sistema inmunitario habitualmente no proporciona una respuesta fuerte frente a las células tumorales. Es de gran interés terapéutico manipular y, por lo tanto, utilizar el sistema inmunitario en la lucha contra el cáncer (Mellman et al. Naturaleza 2011, vol. 480, 480-489).

Se han realizado diversos intentos para ayudar al sistema inmunitario a combatir tumores. Uno de los primeros enfoques implicó una estimulación general del sistema inmunitario, por ejemplo, mediante la administración de bacterias (vivas o destruidas) para suscitar una respuesta inmunitaria general que también estaría dirigida contra el tumor. Esto también se llama inmunidad inespecífica.

Los enfoques recientes destinados específicamente a ayudar al sistema inmunitario a reconocer antígenos específicos de tumor implican la administración al sujeto de antígenos específicos de tumor, normalmente combinados con un adyuvante (una sustancia que se sabe que provoca o potencia una respuesta inmunitaria). Este enfoque precisa el aislamiento y/o la síntesis in vitro de antígenos, lo cual es costoso y lento. Hay casos en que no se han identificado todos los antígenos específicos del tumor, por ejemplo, en el cáncer de mama, los antígenos conocidos se encuentran en el 20-30 % del total de tumores. Por lo tanto, el uso de vacunas específicas para tumores ha tenido un éxito limitado. Sigue existiendo una gran necesidad de métodos alternativos para el tratamiento de tumores y de métodos alternativos para la inhibición del crecimiento o de la formación de tumores secundarios.

'Vacuna contra el cáncer' es una expresión utilizada para describir agentes terapéuticos que están diseñados para estimular el sistema inmunitario del paciente contra antígenos tumorales y dar lugar a un ataque sobre las células tumorales y a una mejor respuesta del paciente. A pesar del nombre, las vacunas contra el cáncer generalmente están destinadas a generar o potenciar una respuesta inmunitaria contra un cáncer existente, en lugar de a prevenir enfermedades. De nuevo, a diferencia de las vacunas tradicionales contra agentes infecciosos, una vacuna contra el cáncer o tumor puede no precisar la administración de un antígeno tumoral, el producto administrado puede utilizar antígenos tumorales ya presentes en el cuerpo como resultado del desarrollo del tumor y servir para modificar la respuesta inmunitaria a los antígenos asociados a tumores (los AAT) existentes.

Se reconoce que la falta habitual de una potente respuesta inmunitaria frente a los AAT se debe a una combinación de factores. Los linfocitos T tienen un papel fundamental en la respuesta inmunitaria, la cual se inicia mediante el reconocimiento de antígenos por parte del receptor de linfocitos T (TCR), y coordinan un equilibrio entre señales coestimulantes e inhibidoras conocidas como puntos de control inmunitario (Pardoll, Nature 2012, vol. 12, 252-264). Las señales inhibidoras suprimen el sistema inmunitario, lo cual es importante para el mantenimiento de la autotolerancia y para proteger a los tejidos del daño cuando el sistema inmunitario responde a una infección patógena. Sin embargo, la inmunosupresión reduce lo que de otro modo podría ser una respuesta útil del organismo al desarrollo de tumores.

En los últimos años este equilibrio de la estimulación y la supresión inmunitarias mediado por linfocitos T ha dado lugar a la adopción de un principio de la inmunoterapia tumoral conocido como enfoque de 'empujar-tirar' en el que las terapias de combinación podrían utilizarse para potenciar los factores estimulantes (empujar) y reducir los factores inhibidores (empujar) de forma simultánea. Una analogía útil es la de una terapia de combinación que presiona el acelerador (empujar) y reduce el freno (tirar). (Berzofsky et al. Semin Oncol. junio de 2012; 39(3) 348-57).

Por ejemplo, las citocinas, otras moléculas estimulantes tales como CpG (que estimulan a las células dendríticas), los ligandos del receptor de tipo Toll y otros adyuvantes moleculares potencian la respuesta inmunitaria. Las interacciones coestimulantes que implican de forma directa a los linfocitos T pueden potenciarse utilizando anticuerpos agonistas para receptores, entre ellos OX40, CD28, CD27 y CD137. Todos estos son enfoques de tipo empuje para la inmunoterapia contra el cáncer.

Las terapias complementarias de tipo 'tirar' pueden bloquear o empobrecer células o moléculas inhibidoras e incluir el uso de anticuerpos antagonistas contra lo que se conoce como puntos de control inmunitario.

Los puntos de control inmunitario incluyen al antígeno de los linfocitos T citotóxicos 4 (CTLA-4, forma siglada de cytotoxic T-lymphocyte antigen 4) y la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1, forma siglada de programmed cell death protein 1), y los anticuerpos contra estos son conocidos en la técnica; ipilimumab fue el primer anticuerpo anti punto de control inmunitario aprobado por la FDA para el tratamiento del melanoma metastásico y bloquea al antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) (Naidoo et al. British Journal of Cancer (2014) 111, 2214-2219). La proteína asociada a linfocitos T citotóxicos 4, también conocida como CD152, es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas, que se expresa en la superficie de los linfocitos T auxiliares y transmite una señal inhibidora a los linfocitos T. Se conoce su secuencia genómica, Secuencia de Referencia del NCBI: NG_011502.1, así como su secuencia proteica, Secuencia de Referencia del NCBI: NP_005205.2.

Los presentes inventores han establecido que algunos péptidos conocidos por lisar las células tumorales mediante la alteración y la permeabilización de la membrana celular, también son muy eficaces para atacar orgánulos tales como las mitocondrias y los lisosomas, y pueden provocar su lisis. Esto se puede lograr a concentraciones bajas que no provocan la lisis directa de las membranas celulares, aunque a la larga se observa pérdida de la integridad de la membrana celular, incluso con la administración de dosis bajas. A dosis más altas, estas moléculas pueden provocar la lisis de la membrana celular y luego de las membranas de los orgánulos.

Los péptidos de interés son un subconjunto del grupo de péptidos comúnmente conocidos como péptidos catiónicos antimicrobianos (los PCA). Se trata de péptidos anfipáticos con carga positiva y los péptidos de este tipo se encuentran en muchas especies y forman parte del sistema inmunitario innato. El PCA Lactoferricina (LfcinB) es un péptido de 25 aminoácidos que ha demostrado tener un efecto sobre las mitocondrias (Eliasen et al. Int. J. Cancer (2006) 119, 493 450). Ahora se ha descubierto, sorprendentemente, que el péptido LTX-315, mucho más pequeño, un péptido de 9 aminoácidos (del tipo descrito en el documento WO 2010/060497), también se dirige a las mitocondrias. Esto fue inesperado debido a que este pequeño péptido actúa mucho más rápido (provocando la muerte celular después de 30 minutos de exposición) en comparación con LfcinB (que es más eficaz después de 24 horas de exposición), y el péptido pequeño actúa contra un espectro más amplio de tipos celulares, lo que sugiere un efecto directo sobre la membrana plasmática.

Esta ruptura de la membrana de los orgánulos da como resultado la liberación de agentes de los mismos, lo que tiene una potente función inmunoestimulante, tales agentes se conocen generalmente como los DAMP (forma siglada de Damage-associated molecular pattern molecules, moléculas de patrones moleculares asociados a daños) e incluyen al ATP, Citocromo C, secuencias de ADN CpG mitocondrial, formil péptidos mitocondriales, catepsinas (de lisosomas) y HMGB1 (forma siglada de high mobility-group box-1, grupo de alta movilidad box 1) (del núcleo). La lisis de orgánulos también puede dar como resultado la liberación de antígenos específicos de tumor (los AAT) adicionales.

Esta capacidad para estimular la respuesta inmunitaria frente a tumores mediante la rotura de las membranas mitocondriales y de otros orgánulos hace que estos péptidos sean muy adecuados como agentes de "empuje" en inmunoterapias de combinación de "empujar-tirar" diseñadas para tratar y proteger contra el desarrollo de tumores. LTX-315 también se ha utilizado como adyuvante en combinación con una vacuna de lisado de células tumorales (Berge et al, 2013, Cancer Research, 73, 477).

Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un compuesto que tiene la fórmula Lys Lys Trp Trp Lys Lys Trp Dip Lys, o una sal, éster o amida del mismo, para su uso en el tratamiento de un tumor mediante la coadministración con un agente inmunoterapéutico, en donde el agente inmunoterapéutico es un anticuerpo anti-CTLA-4.

En el presente documento también se divulga:

Un compuesto, preferentemente un péptido, que tiene las siguientes características:

a) que consiste en 9 aminoácidos en una disposición lineal;

b) de esos 9 aminoácidos, 5 son catiónicos y 4 tienen un grupo R lipófilo;

c) al menos uno de dichos 9 aminoácidos es un aminoácido no codificado genéticamente (por ejemplo, un derivado modificado de un aminoácido codificado genéticamente); y, opcionalmente

d) los restos lipófilo y catiónico están dispuestos de manera que no haya más de dos de cualquiera de los tipos de resto adyacentes entre sí; y, además, opcionalmente

e) la molécula comprende dos parejas de aminoácidos catiónicos adyacentes y una o dos parejas de restos lipófilos adyacentes;

para su uso en el tratamiento de un tumor mediante la administración combinada, secuencial o separada de un inhibidor de punto de control inmunitario (IPCI).

La terapia de combinación propuesta en el presente documento puede, en determinadas realizaciones ventajosas, proporcionar un efecto sinérgico. Se han observado tales efectos sinérgicos tan sorprendentes, por ejemplo, cuando se utiliza un anticuerpo anti-CTLA-4 (Ejemplo 11).

Los aminoácidos catiónicos, que pueden ser iguales o distintos, son preferentemente lisina o arginina, pero pueden ser histidina o cualquier aminoácido no codificado genéticamente que porte una carga positiva a pH 7,0. Los aminoácidos catiónicos no codificados genéticamente adecuados incluyen análogos de lisina, arginina e histidina, tales como homolisina, ornitina, ácido diaminobutírico, ácido diaminopimélico, ácido diaminopropiónico y homoarginina, así como trimetilisina y trimetilornitina, acido 4-aminopiperidin-4-carboxílico, acido 4-amino-1-carbamimidoilpiperidin-4-carboxílico y 4-guanidinofenilalanina.

Los aminoácidos no codificados genéticamente incluyen derivados modificados de aminoácidos codificados genéticamente y aminoácidos naturales distintos de los 20 aminoácidos convencionales del código genético. En este contexto, un D-aminoácido, si bien no está estrictamente codificado genéticamente, no se considera un "aminoácido no codificado genéticamente", que debería ser estructuralmente, no solo estereoespecíficamente, distinto de los 20 L aminoácidos codificados genéticamente. Las moléculas de la invención pueden tener algunos o todos los aminoácidos presentes en la forma D, preferentemente, sin embargo, todos los aminoácidos están en forma L.

Los aminoácidos lipófilos (es decir, aminoácidos con un grupo R lipófilo), que pueden ser iguales o distintos, poseen todos un grupo R con al menos 7, preferentemente al menos 8 o 9, más preferentemente al menos 10 átomos distintos de hidrógeno. Un aminoácido con un grupo R lipófilo se denomina en el presente documento aminoácido lipófilo. Normalmente, el grupo R lipófilo tiene al menos uno, preferentemente dos, grupos cíclicos, que pueden estar fusionados o enlazados.

El grupo R lipófilo puede contener heteroátomos tales como O, N o S, pero normalmente no hay más de un heteroátomo, preferentemente es nitrógeno. Este grupo R preferentemente no tendrá más de 2 grupos polares, más preferentemente ninguno o uno, más preferentemente ninguno.

El triptófano es un aminoácido lipófilo preferente y las moléculas comprenden preferentemente de 1 a 3, más preferentemente 2 o 3, muy preferentemente 3 restos de triptófano. Otros aminoácidos lipófilos codificados genéticamente que pueden incorporarse son fenilalanina y tirosina.

Preferentemente, uno de los aminoácidos lipófilos es un aminoácido no codificado genéticamente. Muy preferentemente la molécula consiste en 3 aminoácidos lipófilos codificados genéticamente, 5 aminoácidos catiónicos codificados genéticamente y 1 aminoácido lipófilo no codificado genéticamente.

Cuando las moléculas incluyen un aminoácido lipófilo no codificado genéticamente (por ejemplo, un derivado de aminoácido), el grupo R de ese aminoácido preferentemente no contiene más de 35 átomos distintos de hidrógeno, más preferentemente no más de 30, muy preferentemente no más de 25 átomos distintos de hidrógeno.

Los aminoácidos no codificados genéticamente preferentes incluyen: ácido 2-amino-3-(bifenil-4-ilo)propanoico (bifenilalanina), acido 2-amino-3,3-difenilpropanoico (difenilalanina), ácido 2-amino-3-(antracen-9-il)propanoico, ácido 2-amino-3-(naftalen-2-il)propanoico, ácido 2-amino-3-(naftalen-1-il)propanoico, ácido 2-amino-3-[1,1':4',1"-terfenil-4-il]-popiónico, ácido 2-amino-3-(2,5,7-tri-ferc-butiMH-indol-3-il) propanoico, ácido 2-amino-3-[1,1':3',1"-terfenil-4-il]-popiónico, ácido 2-amino-3-[1,1':2',1"-terfenil-4-il]-popiónico, ácido 2-amino-3-(4-naftalen-2-il-fenil)-popiónico, ácido 2-amino-3-(4'-butilbufenil-4-il)propanoico, acido 2-amino-3-[1,1':3',1"-terfenil-5'-il]-propiónico y ácido 2-amino-3-(4-(2,2-difeniletil)fenil)propanoico.

Los compuestos peptídicos divulgados en el presente documento tienen una de las fórmulas I a V enumeradas a continuación, en que C representa un aminoácido catiónico como se define anteriormente y L representa un aminoácido lipófilo como se define anteriormente. Los aminoácidos están unidos covalentemente, preferentemente mediante enlaces peptídicos que dan como resultado un péptido verdadero o mediante otros ligamientos que dan como resultado un peptidomimético, siendo preferentes los péptidos. Los extremos amino o carboxilo libres de estas moléculas pueden modificarse, el extremo carboxilo se modifica preferentemente para eliminar la carga negativa, muy preferentemente, el extremo carboxilo está amidado, este grupo amida puede estar sustituido.

CCLLCCLLC (I) (SEQ ID NO: 1)

LCCLLCCLC (II) (SEQ ID NO: 2)

CLLCCLLCC (III) (SEQ ID NO: 3)

CCLLCLLCC (IV) (SEQ ID NO: 4)

CLCCLLCCL (V) (SEQ ID NO: 5)

Un peptidomimético se caracteriza normalmente por conservar la polaridad, el tamaño tridimensional y la funcionalidad (bioactividad) de su péptido equivalente, pero en el que los enlaces peptídicos se han reemplazado, a menudo por ligamientos más estables. Por 'estable' se entiende más resistente a la degradación enzimática por enzimas hidrolíticas. En general, el enlace que reemplaza al enlace amida (el sustituto del enlace amida) conserva muchas de las propiedades del enlace amida, por ejemplo, la conformación, el volumen estérico, el carácter electrostático, la posibilidad de enlaces de hidrógeno, etc. El Capítulo 14 de "Drug Design and Development", Krogsgaard, Larsen, Liljefors y Madsen (Eds) 1996, Horwood Acad. Pub proporciona un análisis general de técnicas para el diseño y síntesis de peptidomiméticos. En el presente caso, en que la molécula reacciona con una membrana en lugar de con el sitio activo específico de una enzima, algunos de los problemas descritos sobre la imitación de forma exacta de la afinidad y la eficacia, o de la función del sustrato, no son importantes y se puede preparar fácilmente un peptidomimético basándose en una estructura peptídica o un motivo dado de los grupos funcionales necesarios. Los sustitutos de enlace amida adecuados incluyen los siguientes grupos: N-alquilación (Schmidt, R. et al., Int. J. Peptide Protein Res., 1995, 46,47), amida retroinversa (Chorev, M y Goodman, M., Acc. Chem. Res, 1993, 26, 266), tioamida (Sherman D.B. y Spatola, A.F. J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 433), tioéster, fosfonato, cemetileno (Hoffman, R.V. y Kim, H.O. J. Org. Chem., 1995, 60, 5107), hidroximetileno, fluorovinilo (Allmendinger, T. et al., Tetrahydron Lett., 1990, 31, 7297), vinilo, metilenamino (Sasaki, Y y Abe, J. Chem. Pharm. Bull. 199745, 13), metilentio (Spatola, A.F., Methods Neurosci, 1993, 13, 19), alcano (Lavielle, S. et. al., Int. J. Peptide Protein Res., 1993, 42, 270) y sulfonamido (Luisi, G. et al. Tetrahedron Lett. 1993, 34, 2391).

Los compuestos peptidomiméticos pueden tener 9 subunidades identificables que son aproximadamente equivalentes en tamaño y función a los 9 aminoácidos catiónicos y lipófilos. Por lo tanto, la expresión 'aminoácido' puede utilizarse convenientemente en el presente documento para hacer referencia a las subunidades equivalentes de un compuesto peptidomimético. Además, los peptidomiméticos pueden tener grupos equivalentes a los grupos R de aminoácidos y el análisis en el presente documento de grupos R adecuados y de los grupos modificadores terminales N y C se aplica, haciendo los cambios necesarios, a los compuestos de peptidomiméticos.

Como se analiza en "Drug Design and Development", Krogsgaard et al., 1996, además de la sustitución de enlaces amida, los peptidomiméticos pueden implicar la sustitución de fracciones estructurales más grandes con estructuras di- o tripeptidomiméticas y, en este caso, pueden utilizarse como reemplazos de dipéptido fracciones miméticas que implican el enlace peptídico, tales como los miméticos derivados de azol. Los peptidomiméticos y, por lo tanto, las estructuras principales de peptidomiméticos en donde solo se han reemplazado los enlaces amida como se discute anteriormente son, sin embargo, preferentes.

Los peptidomiméticos adecuados incluyen péptidos reducidos en que el enlace amida se ha reducido a una metilen amina mediante tratamiento con un agente reductor, por ejemplo, borano o un reactivo de hidruro, tal como hidruro de litio y aluminio. Dicha reducción tiene la ventaja añadida de aumentar la cationicidad global de la molécula.

Otros peptidomiméticos incluyen peptoides formados, por ejemplo, mediante la síntesis en etapas de poliglicinas funcionalizadas con amida.

Algunas estructuras principales de peptidomiméticos estarán fácilmente disponibles a partir de sus precursores peptídicos, tales como péptidos que se han permetilado, Ostresh describe métodos adecuados, J.M. et al. en Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91,11138-11142. Las condiciones fuertemente básicas favorecerán la N-metilación sobre la O-metilación y darán como resultado la metilación de algunos o todos los átomos de nitrógeno en los enlaces peptídicos y del nitrógeno N-terminal.

Las estructuras principales de peptidomiméticos preferentes incluyen poliésteres, poliaminas y derivados de los mismos, así como alcanos y alquenos sustituidos. Los peptidomiméticos preferentemente tendrán extremos N y C que pueden modificarse como se describe en el presente documento.

Los aminoácidos p y y, así como los aminoácidos a, se incluyen dentro del término 'aminoácidos', al igual que las glicinas sustituidas en N. Los compuestos peptídicos de la invención incluyen péptidos beta y depsipéptidos.

Como se ha analizado anteriormente, los compuestos peptídicos divulgados en el presente documento incorporan al menos uno, y preferentemente un, aminoácido no codificados genéticamente. Cuando este resto se indica como L', los compuestos preferentes están representados por las siguientes fórmulas:

CCL’LCCLLC (I’) (SEQ ID NO: 6)

CCLLCCLL’C (I") (SEQ ID NO: 7)

CCLL’CCLLC (I"’) (SEQ ID NO: 8)

LCCLL’CCLC (II’) (SEQ ID NO: 9)

Son particularmente preferentes los compuestos (preferentemente péptidos) de fórmula I y II, y de estos, son especialmente preferentes los compuestos (preferentemente péptidos) de fórmula I''.

Los siguientes péptidos presentados en la Tabla 1 son muy preferentes.

Tabla 1

Nombre SEQ ID NO Secuencia

LTX-301 10 Dip-K-K-W-W-K-K-W-K-NH2

LTX-302 11 W-K-K-W-Dip-K-K-W-K-NH2

LTX-303 12 W-K-K-W-W-K-K-Dip-K-NH2

LTX-304 13 B/p-K-K-W-W-K-K-W-K-NHs

LTX-305 14 W-K-K-Bip-W-K-K-W-K-NH2

LTX-306 15 w-k-k-w-dip-k-k-w-k-NH²

LTX-307 16 K-K-W-Dip-K-K-W-W-K-NH2

LTX-308 17 k-k-W-Dip-k-k-W-W-k-NH2

LTX-309 18 K-K-W-Dip-K-K-W-Dip-K-NH2

LTX-310 19 K-K-W-B/p-K-K-W-W-K-NH2

LTX-312 20 K-B/p-K-K-W-W-K-K-W-NH2

LTX-313 21 K-K-B/p-W-K-K-W-W-K-NH2

LTX-314 22 K-K-W-W-K-K-Di p-W-K-NH2

LTX-315 23 K-K-W-W-K-K-W-Dip-K-NH2

LTX-316 24 K-W-Dip-K-K-W-W-K-K-NH2

LTX-317 25 K-K-W-W-K-W-Dip-K-K-NH2

LTX-318 26 Orn-Orn-W-Dip-Orn-Orn-W-W-Orn-NH²

LTX-319 27 Dap-Dap-W-Dip-Dap-Dap-W-W-Dap-NH²

LTX-320 28 R-R-W-Dip-R-R-W-W-R-NH2

LTX-321 29 K-W-W-K-K-Dip-W-K-K-NH2

LTX-323 30 K-Dip-K-K-W-W-K-K-W-NH2

LTX-324 31 K-K-Dip-W-K-K-W-W-K-NH2

LTX-325 32 k-w-w-k-k-dip-w-k-k-NH²

LTX-326 33 R-R-B/p-W-R-R-W-W-R-NH2

LTX-327 34 R-R-Dip-W-R-R-W-W-R-NH2

LTX-329 35 k-k-bip-w-k-k-w-w-k-NH²

LTX-331 36 k-k-Bip-w-k-k-w-w-k-NH²

LTX-332 37 K-K-bip-W-K-K-W-W-K-NH2

LTX-333 38 Dab-Dab-W-Dip-Dab-Dab-W-W-Dab-NH²

LTX-334 39 K-K-W-1-Nal-K-K-W-W-K-NH2

LTX-335 40 K-K-W-2-Nal-K-K-W-W-K-NH2

LTX-336 41 K-K-W-Ath-K-K-W-W-K-NH2

LTX-338 42 K-K-W-Phe(4-4'Bip)-K-K-W-W-K-NH2

En que:

• el código convencional de una sola letra se utiliza para los aminoácidos codificados genéticamente

• la minúscula indica D aminoácidos

• Dip es difenilalanina

• Bip es bifenilalanina

• Orn es ornitina

• Dap es ácido 2,3-diaminopropiónico

• Dab es ácido 2,4-diaminobutírico

• 1-Nal es 1 -naftilalanina

• 2-Nal es 2-naftilalanina

• Ath es ácido 2-amino-3-(antracen-9-il)propanoico

• Phe(4,4'Bip) es ácido 2-amino-3-[1,1':4',1"-terfenil-4-il]propiónico

El compuesto LTX-315 es muy preferente.

Todas las moléculas descritas en el presente documento pueden estar en forma de sal, éster o amida.

Las moléculas son preferentemente péptidos y preferentemente tienen un extremo C modificado, en particular amidado. Los péptidos amidados pueden estar ellos mismos en forma de sal y se prefieren las formas de acetato. Las sales fisiológicamente aceptables adecuadas son bien conocidas en la técnica e incluyen sales de ácidos inorgánicos u orgánicos, e incluyen trifluoroacetato así como acetato, y sales formadas con HCl.

Los compuestos peptídicos descritos en el presente documento son de naturaleza anfipática, su estructura de 2ria, que puede o no tender a la formación de una hélice a, proporciona una molécula anfipática en condiciones fisiológicas. Las terapias de combinación definidas en el presente documento son para el tratamiento de tumores, en particular tumores sólidos y, por lo tanto, para el tratamiento del cáncer.

Los compuestos peptídicos divulgados en el presente documento desestabilizan y/o permeabilizan las membranas de los orgánulos de células tumorales, por ejemplo, las mitocondrias, el núcleo o lisosomas, en particular las mitocondrias. Por 'desestabilizante' se entiende una perturbación de la configuración normal de la bicapa lipídica que incluye, pero sin limitación, el adelgazamiento de la membrana, el aumento de la permeabilidad de la membrana al agua, iones o metabolitos, etc.

Los puntos de control inmunitario son conocidos en la técnica (Naidoo et al. y Pardoll et al, citado anteriormente) y la expresión se entiende bien en el contexto de la terapia del cáncer. Los más conocidos son CTLA-4, PD-1 y su ligando PDL-1 (forma siglada de programmed cell death protein 1 ligand, ligando de proteína de muerte celular programada 1). Otros incluyen TIM-3, KIR, LAG-3, VISTA, BTLA. Los inhibidores de puntos de control inmunitarios inhiben su función inmunosupresora normal, por ejemplo, regulando a la baja la expresión de las moléculas de control o uniéndose a las mismas y bloqueando las interacciones receptor/ligando normales. Así como los puntos de control inmunitario frenan la respuesta del sistema inmunitario frente a un antígeno, un inhibidor de los mismos reduce este efecto inmunosupresor y potencia la respuesta inmunitaria. Los inhibidores de puntos de control inmunitarios se conocen en la técnica y son preferentes los anticuerpos anti-puntos de control inmunitarios, tales como anticuerpos anti-CTLA-4 (por ejemplo, ipilimumab y tremelimumab), anticuerpos anti-PD-1 (por ejemplo, nivolumab, lambrolozumab, pidilizumab y RG7446 (Roche)), y anticuerpos anti-PDL-1 (por ejemplo, BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb), MPDL3280A (Genentech), MSB0010718C (EMD-Serono) y MEDI4736 (AstraZeneca)).

Por lo tanto, los IPCI preferentes son anticuerpos que se unen a una molécula de punto de control inmunitario específica, ya sea que esa molécula de punto de control inmunitario sea en sí misma un receptor o un ligando del mismo. Las moléculas de punto de control inmunitario preferentes se enumeran anteriormente. Los receptores que forman parte de un punto de control inmunitario se encuentran normalmente en la superficie de los linfocitos T. Con el conocimiento de una diana de punto de control inmunitario, un experto en la materia puede desarrollar un inhibidor del mismo. Los inhibidores pueden seleccionarse de proteínas, péptidos, peptidomiméticos, peptoides, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, moléculas inorgánicas pequeñas, moléculas orgánicas pequeñas que no son ácidos nucleicos o ácidos nucleicos tales como ácidos nucleicos antisentido, moléculas de ARN de interferencia pequeñas (ARNip) u oligonucleótidos. Por lo tanto, el inhibidor puede actuar para regular a la baja la expresión de una molécula de punto de control inmunitario. El inhibidor puede ser, por ejemplo, una versión modificada del ligando natural (por ejemplo, para CTLA-4, CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2)), tal como una versión truncada de uno de los ligandos. Pueden ser de origen natural, recombinantes o sintéticos.

Preferentemente, el inhibidor es un anticuerpo, un ligando modificado o una molécula de ácido nucleico antisentido tal como un ARNip diseñado para inhibir una molécula de punto de control inmunitario particular. Preferentemente, el ARNip es capaz de prevenir o impedir la traducción del punto de control inmunitario, impidiendo de este modo la expresión de la proteína. Dado que se conoce la secuencia genómica de muchos puntos de control inmunitario, el experto en la materia será capaz de utilizar métodos de rutinarios para diseñar moléculas de ácido nucleico antisentido inhibidoras adecuadas.

Los inhibidores de CTLA-4, PD-1 y PD-L1 son preferentes, y son particularmente preferentes los anticuerpos contra los mismos. Dichos anticuerpos se conocen como anticuerpos bloqueantes de puntos de control inmunitario y pueden fortalecer la respuesta inmunitaria antitumoral.

En el presente documento se divulgan métodos para el tratamiento de un tumor y un método para el tratamiento de células tumorales. La terapia de combinación debería ser eficaz para destruir todas o una proporción de las células diana tumorales, o para prevenir o reducir su tasa de multiplicación, o para inhibir la metástasis o para disminuir de otra manera el efecto dañino del tumor en el paciente. El médico o el paciente deben observar una mejoría en uno o más de los parámetros o síntomas asociados con el tumor. La administración también puede ser profiláctica y esto está abarcado por el término "tratamiento". El paciente será normalmente un paciente humano, pero también se pueden tratar animales no humanos, tales como animales domésticos o de ganado.

Las dianas de cáncer incluyen melanomas, sarcomas, linfomas, leucemias, neuroblastomas y glioblastomas (por ejemplo, de cerebro), carcinomas y adenocarcinomas. Los cánceres de mama, colon, vejiga, riñón, hígado (por ejemplo, carcinoma hepatocelular), pulmón, ovario, páncreas, próstata y piel) son dianas preferentes. Los cánceres de cabeza y cuello también son dianas preferentes. Los melanomas, sarcomas y linfomas son dianas preferentes. Los tumores para tratamiento son normalmente tumores sólidos y pueden ser lesiones metastásicas accesibles para la inyección transdérmica.

Los péptidos pueden sintetizarse de cualquier forma conveniente. Generalmente, los grupos reactivos presentes (por ejemplo, amino, tiol y/o carboxilo) estarán protegidos durante la toda la síntesis. La etapa final de la síntesis será, por lo tanto, la desprotección de un derivado protegido de la invención. Al construir el péptido, en principio se puede comenzar en el extremo C o en el extremo N, aunque es preferente el procedimiento de inicio en el extremo C. Los métodos de síntesis peptídica son bien conocidos en la técnica, pero para la presente invención puede ser particularmente conveniente llevar a cabo la síntesis en un soporte de fase sólida, siendo dichos soportes bien conocidos en la técnica. Se conoce una amplia variedad de grupos protectores para aminoácidos que se utilizan en la síntesis de péptidos.

Las referencias y técnicas para sintetizar compuestos peptidomiméticos y las otras moléculas bioactivas de la invención se describen en el presente documento y son bien conocidas en la técnica.

Si bien es posible que los compuestos peptídicos (incluidas las sales, ésteres o amidas de los mismos) se administren como compuestos puros, es preferente presentarlos como formulaciones farmacéuticas, por ejemplo, incorporando uno o más diluyentes, transportadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Los agentes activos de acuerdo con la invención pueden presentarse, por ejemplo, en una forma adecuada para administración oral, tópica, nasal, parenteral, intravenosa, intratumoral, rectal o regional (por ejemplo, perfusión aislada de extremidades). Salvo que se indique otra cosa, la administración es normalmente por vía parenteral, preferentemente por inyección por vía subcutánea, vía intramuscular, vía intracapsular, vía intraespinal, vía intraperitoneal, vía intratumoral, vía transdérmica o vía intravenosa. Para el compuesto peptídico, la administración es preferentemente intratumoral. Son particularmente preferentes las inyecciones intratumorales del compuesto peptídico de la invención, una vez al día durante varios días consecutivos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, preferentemente en 2-4 días consecutivos o a intervalos de 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, por ejemplo, 2-4 veces a intervalos de 5, 6, 7, 8 o 9 días.

Para el inhibidor de punto de control, la administración es preferentemente intravenosa o intralesional.

El compuesto peptídico puede administrarse con o después del inhibidor de punto de control inmunitario, como se ha demostrado que es eficaz con respecto a los anticuerpos anti-PD1 y anti-CTLA4. Como alternativa, el compuesto peptídico puede administrarse con o antes del inhibidor de punto de control inmunitario, como se ha demostrado que es eficaz con respecto a los anticuerpos anti-CTLA4 y anti-PD-L1. Preferentemente, hay múltiples administraciones. El sistema inmunitario se estimula preferentemente conforme avanza el tiempo. Por ejemplo, las administraciones del compuesto peptídico y/o del inhibidor de punto de control se pueden llevar a cabo en el transcurso de ocho meses, preferentemente de cuatro meses, más preferentemente de dos meses; en tales regímenes, la administración es preferentemente semanal. Por lo tanto, puede haber de 2 a 40, preferentemente de 3 a 30, por ejemplo, de 6 a 30 o de 6 a 20 administraciones.

Los compuestos activos definidos en el presente documento pueden presentarse en las formas de administración farmacológica convencionales, tales como comprimidos, comprimidos recubiertos, aerosoles nasales, soluciones, emulsiones, liposomas, polvos, cápsulas o formas de liberación sostenida. Para la preparación de estas formas se pueden emplear excipientes farmacéuticos convencionales, así como los métodos habituales de producción. Son preferentes las soluciones simples.

Además, se pueden utilizar sistemas transportadores específicos de órganos.

Las soluciones de inyección pueden, por ejemplo, producirse de manera convencional, tal como mediante la adición de agentes conservantes, tales como p-hidroxibenzoatos o estabilizantes, tales como EDTA. A continuación, las soluciones se rellenan en viales o ampollas para inyección.

Las formulaciones preferentes son aquellas en que las moléculas están en solución salina. Siendo tales formulaciones adecuadas para su uso en métodos de administración preferentes, especialmente administración local, es decir, intratumoral, por ejemplo, mediante inyección.

Salvo que se indique otra cosa, las unidades de dosificación que contienen las moléculas peptídicas contienen preferentemente 0,1-10 mg, por ejemplo 1-5 mg. La formulación puede comprender adicionalmente otros principios activos, entre ellos otros agentes citotóxicos tales como otros péptidos antitumorales. Otros principios activos pueden incluir distintos tipos de citocinas, por ejemplo, IFN-y, TNF, CSF y factores de crecimiento, inmunomoduladores, quimioterápicos, por ejemplo cisplatino, o anticuerpos o vacunas contra el cáncer.

En el presente documento también se divulga el uso de un compuesto peptídico como se define anteriormente, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un tumor, en donde dicho compuesto peptídico se coadministra con un inhibidor de punto de control como se define anteriormente.

Preferentemente, el medicamento es para el tratamiento de tumores resistentes a múltiples fármacos (RMF).

En el presente documento también se divulga un envase o composición farmacéutica que comprende:

(i) un compuesto peptídico como se define en el presente documento; y

(ii) un inhibidor de punto de control como se describe en el presente documento.

Con los envases farmacéuticos, los componentes pueden ser para la administración por separado. Como es obvio, el envase farmacéutico también puede comprender instrucciones de administración. El envase y la composición son para su uso en el tratamiento de un tumor.

En el presente documento también se divulga un método de tratamiento de un tumor, que comprende la etapa de administrar un compuesto peptídico como se define en el presente documento y un inhibidor de punto de control como se describe en el presente documento, juntos en cantidades farmacéuticamente eficaces, a un paciente que lo necesite.

Como se ha analizado anteriormente, los compuestos peptídicos desvelados en el presente documento pueden desestabilizar las membranas mitocondriales y provocar la liberación de los DAMP y de material antigénico. Esto puede tener un potente efecto positivo sobre la respuesta del sistema inmunitario frente a células cancerosas.

En determinados tratamientos contra el cáncer, la respuesta inmunitaria es de primordial importancia, por ejemplo, para tratar tumores secundarios no identificados, para prevenir la formación de tumores metastásicos, cuando no es posible la cirugía u otra intervención directa. Los distintos cánceres son más o menos inmunogénicos y, por lo tanto, en algunos escenarios es vital reforzar la respuesta inmunitaria frente al cáncer.

Por lo tanto, en el presente documento también se divulga un compuesto peptídico como se define en el presente documento para su uso en la desestabilización de una membrana mitocondrial, en donde dicho uso es en el tratamiento de un tumor. Esto puede considerarse como un uso o tratamiento inmunoterapéutico, y el tumor será normalmente canceroso. Las características y realizaciones preferentes analizadas en otro lugar en relación con las terapias de combinación se aplican, haciendo los cambios necesarios, a este aspecto.

En el presente documento también se divulga una composición que comprende o consiste en un compuesto peptídico de la invención y un agente inmunoterapéutico. En un aspecto adicional, el presente documento se divulga un método para el tratamiento de tumores en un paciente, comprendiendo dicho método la administración de una cantidad eficaz de un compuesto peptídico de la invención, y la administración simultánea o secuencial de una cantidad eficaz de un agente inmunoterapéutico.

Como alternativa a lo observado, se proporciona un compuesto peptídico que tiene la fórmula Lys Lys Trp Trp Lys Lys Trp Dip Lys, o una sal, éster o amida del mismo, y un agente inmunoterapéutico para su uso en el tratamiento de tumores, en donde el agente inmunoterapéutico es un anticuerpo anti-CTLA-4.

Por "agente inmunoterapéutico" se entiende un agente que modula la respuesta inmunitaria. Preferentemente, el agente inmunoterapéutico potencia la respuesta inmunitaria contra uno o más antígenos tumorales, por ejemplo, mediante la supresión (preferentemente de manera selectiva) de linfocitos Treg y/o de las CSDM y/o mediante el bloqueo del antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), un receptor inhibidor expresado en linfocitos T. En todos los aspectos y realizaciones de la invención, el agente inmunoterapéutico es preferentemente un agente anti-CTLA-4. El experto en la materia será capaz de seleccionar las dosificaciones adecuadas del agente inmunoterapéutico. El agente inmunoterapéutico, por ejemplo, el inhibidor de punto de control inmunitario, tal como un agente anti-CTLA-4, se administra preferentemente antes o simultáneamente con el compuesto peptídico de la invención, es muy preferente que se administre antes de la primera administración del compuesto peptídico de la invención. Preferentemente, se administra antes del compuesto peptídico de la invención, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 días antes del compuesto peptídico de la invención. Preferentemente, la primera administración peptídica es 1 o 2 días después de la última administración del IPCI. Puede haber de 1 a 8 administraciones de IPCI, por ejemplo, 2 a 4 administraciones proporcionadas con 2, 3 o 4 días de diferencia. Pueden utilizarse múltiples dosis, que pueden ser, por ejemplo, con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 días de diferencia.

Por ejemplo, el agente anti-CTLA-4 ipilimumab se administra normalmente una vez cada tres semanas con un total de cuatro dosis. El agente anti-PD1 nivolumab se administra normalmente cada dos semanas y el agente anti-PD1 pembrolizumab se administra normalmente cada tres semanas. Tales regímenes de dosificación son preferentes. El anti-PD-L1 se administra preferentemente al mismo tiempo o después del compuesto peptídico.

En algunas realizaciones, el compuesto peptídico se administra el mismo día que la primera dosis del agente inmunoterapéutico, seguido de administraciones semanales durante cuatro a ocho semanas, por ejemplo, seis semanas, como parte de una fase de inducción. Después, el compuesto peptídico puede, a partir de entonces, administrarse cada dos semanas como parte de una fase de mantenimiento.

La coadministración puede ser simultánea o secuencial y por la misma o distintas vías de administración, por ejemplo, oral y/o parenteral, o i.p. para el IPCI e intratumoral para el compuesto peptídico.

Se proporciona adicionalmente un producto que contiene un compuesto peptídico que tiene la fórmula Lys Lys Trp Trp Lys Lys Trp Dip Lys y un agente inmunoterapéutico, en donde el agente inmunoterapéutico es un anticuerpo anti-CTLA-4, como una preparación combinada para el uso separado, simultáneo o secuencial en el tratamiento de tumores.

Los inventores también han descubierto sorprendentemente que el tratamiento de un tumor con un compuesto peptídico como se define en el presente documento junto con un agente inmunoterapéutico, puede inducir una inmunidad adaptativa contra otros tumores. Por lo tanto, los métodos, usos y productos (composiciones) anteriores pueden extenderse opcionalmente a la inducción de una inmunidad adaptativa contra otros tumores. Por lo tanto, por ejemplo, en el presente documento también se divulga un compuesto peptídico como se define en el presente documento y un agente inmunoterapéutico para su uso en el tratamiento de tumores en un paciente y la inducción de la inmunidad adaptativa contra el crecimiento, desarrollo o establecimiento de tumores en dicho paciente.

Por lo tanto, en un aspecto adicional, en el presente documento se divulga un método para la inducción de la inmunidad adaptativa contra el crecimiento, desarrollo o establecimiento de tumores en un paciente, comprendiendo dicho método la administración de una cantidad eficaz de un compuesto peptídico como se define en el presente documento, y la administración simultánea o secuencial de una cantidad eficaz de un agente inmunoterapéutico.

Como alternativa a lo observado, en el presente documento se divulga un compuesto peptídico como se define en el presente documento y un agente inmunoterapéutico para su uso en la inducción de una inmunidad adaptativa contra el crecimiento, desarrollo o establecimiento de tumores.

Como alternativa a lo observado, en el presente documento se divulga el uso de un compuesto peptídico como se define en el presente documento y un agente inmunoterapéutico en la fabricación de un medicamento para su uso como vacuna contra el crecimiento, desarrollo o establecimiento de tumores.

Por lo tanto, se divulga un producto que contiene un compuesto peptídico como se define en el presente documento y un agente inmunoterapéutico como una preparación combinada para el uso separado, simultáneo o secuencial en la inducción de una inmunidad adaptativa contra el crecimiento, desarrollo o establecimiento de tumores.

En el presente documento también se divulga un método para la vacunación de un sujeto contra el crecimiento, desarrollo o establecimiento de un tumor mediante la administración de una cantidad eficaz de un compuesto peptídico como se define en el presente documento y de un agente inmunoterapéutico a dicho paciente. La referencia a una 'vacuna' y 'vacunación' implican un efecto profiláctico, por lo tanto, si bien puede haber un tratamiento directo beneficioso de los tumores existentes, una motivación significativa en este aspecto de la invención es la prevención o reducción del crecimiento o desarrollo de futuros tumores.

La invención se describirá ahora con más detalle en los siguientes Ejemplos y con referencia a las figuras, en las que: La Figura 1 es un gráfico que muestra el porcentaje de muerte de glóbulos rojos en una serie de experimentos para probar el péptido LTX-315 a concentraciones variables. El eje X muestra la concentración de péptido (|jg/ml). El eje Y muestra el % de muerte celular;

La Figura 2 muestra el crecimiento tumoral en ratones reinoculados con células de linfoma de linfocitos B murino A20 en comparación con el crecimiento en los animales de control del estudio inicial. Los rombos indican los controles de los estudios primarios. Los cuadrados negros indican ratones reinoculados; La Figura 3 muestra el crecimiento tumoral en ratones individuales reinoculados con células de linfoma de linfocitos B murino A20 que se habían tratado inicialmente con LTX-315. Los cuadrados el indican al Ratón 1. Los triángulos (base hacia abajo) indican al Ratón 2. Los triángulos (base hacia arriba) indican al Ratón 3. Los rombos el indican al Ratón 4;

La Figura 4 muestra el crecimiento tumoral en ratones reinoculados con células de carcinoma de colon murino CT26WT en comparación con el crecimiento en los animales de control. Los rombos indican los controles de los estudios primarios. Los cuadrados negros indican ratones reinoculados;

La Figura 5 muestra el crecimiento tumoral en ratones individuales reinoculados con células de carcinoma de colon murino CT26WT que se habían tratado inicialmente con LTX-315. Los cuadrados pequeños el indican al Ratón 1. Los triángulos pequeños (base hacia abajo) indican al Ratón 2. Los triángulos pequeños (base hacia arriba) indican al Ratón 3. Los rombos pequeños el indican al Ratón 4; Los círculos el indican al Ratón 5. Los cuadrados grandes el indican al Ratón 6. Los triángulos grandes (base hacia abajo) indican al Ratón 7. Los triángulos grandes (base hacia arriba) indican al Ratón 8. Los rombos grandes el indican al Ratón 9;

La Figura 6 muestra el crecimiento de linfomas de linfocitos B A20 en ratones irradiados que recibieron esplenocitos de ratones donantes que muestran una remisión tumoral completa después del tratamiento con LTX-315 (Grupo 1) o de ratones de control (Grupo 2) que recibieron esplenocitos de ratones donantes sin tratamiento previo. Los cuadrados indican al Grupo 1 (ratones que recibieron esplenocitos de donantes que muestran remisión completa). Los rombos indican al Grupo 2 (ratones que recibieron esplenocitos de donantes sin tratamiento previo);

La Figura 7 muestra el efecto contra el cáncer de dos regímenes de tratamiento distintos sobre tumores A20 murinos sólidos (Grupos 1 y 2) en comparación con los controles no tratados (Grupo 3). Los triángulos negros invertidos (base hacia arriba) indican al Grupo 1 (tratamiento). Los cuadrados blancos indican el Grupo 2 (tratamiento adyuvante). Los triángulos blancos (base hacia abajo) indican al Grupo 3 (control). El orden del tamaño tumoral (mm2) en el Día 21 es (de mayor a menor): Grupo 3, Grupo 1, Grupo 2. Figura 8 LTX-315 provoca una muerte celular rápida en células de melanoma humano. La cinética de destrucción de células in vitro de LTX-315 contra la línea celular A375 de melanoma humano medida con MTT. Para cada punto de tiempo se presentan los resultados de tres experimentos como media ± DT. Figura 9 LTX-315 se internaliza y se acumula cerca de las mitocondrias. Las células A375 se trataron durante 30 minutos con LTX-315 marcado con fluorescencia 1,5 pM y se marcaron las mitocondrias y el núcleo. El péptido se internalizó y se detectó muy cerca de las mitocondrias. A: canales superpuestos, B: detalle, C: mitocondrias. D: péptido

Figura 10 La internalización se produce solo con compuestos líticos de 9 meros tal como LTX-315 y no con el péptido simulado no lítico LTX-328. Células A375 tratadas con péptido LTX-315 o LTX-3283 pM durante 60 min. LTX-315 se detectó en el citoplasma, mientras que LTX-328 no se internalizó. A: 60 min de incubación con LTX-315, B: 60 min de incubación con LTX-328.

Figura 11 El tratamiento con LTX-315 provoca cambios ultraestructurales. Imágenes MET (forma siglada de microscopía electrónica de transmisión) de células A375 tratadas con LTX-315 durante 60 minutos en comparación con células de control. A y D: células de control no tratadas, B y E: células tratadas con 3,5 pM, C y F: células tratadas con 17 pM. Aumento de 10000X, A-C, 30000, D-F, barra de escala de 5 pm.

Figura 12 Generación de ROS (forma siglada de reactive oxygen species, especies reactivas de oxígeno) en la muerte celular inducida por LTX-315. Se trataron células A375 con LTX-315 a distintas concentraciones durante 15 minutos. Después del tratamiento con el péptido, se añadió a las muestras carboxi-H2DCFDA y se analizó la fluorescencia con un lector de fluorescencia de placas. El experimento se realizó por duplicado, representando las barras la fluorescencia media - D.T.

Figura 13 Las células de melanoma humano tratadas con LTX-315 liberan citocromo C en el sobrenadante. La liberación de citocromo C en el sobrenadante tras el tratamiento de A375 con LTX-315, se determinó tras los puntos de tiempo designados (5, 15, 45 min) mediante un ensayo de ELISA.

Figura 14 Después del tratamiento con LTX-315 se libera HMGB1 en el sobrenadante. Se trataron células de melanoma humano A375 con LTX-31535 pM (parte superior) o con LTX-328 (parte inferior), y el lisado celular (L) y el sobrenadante (S) se analizaron con transferencia de Western, y las células tratadas con LTX-315 mostraron una translocación gradual del lisado celular al sobrenadante celular. Las células de control se trataron con medio solo y después de 60 minutos no mostraron translocación.

Figura 15 Niveles extracelulares de ATP después del tratamiento con LTX-315: Se trataron células A375 con LTX-315 a distintas concentraciones durante 5 minutos o se mantuvieron en condiciones controladas, y se analizó el sobrenadante en cuanto a la cuantificación de la secreción de ATP mediante bioluminiscencia de luciferasa. Se informan los datos cuantitativos (media ± D.T.) para un experimento representativo. Figura 16 LTX-315 desintegra la membrana mitocondrial. Imágenes MET de células de melanoma humano A547 tratadas con LTX-315 (10 pg/ml) durante 60 minutos en comparación con células de control. Figura 17 Configuración experimental en un modelo MCA205 de sarcoma, comenzando en primer lugar con LTX-315 y reforzando con anticuerpos anti-proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) o con anticuerpos anti-proteína asociada a linfocitos T citotóxicos 4 (CTLA-4) (a). Se observa remisión tumoral con LTX-315 combinado con Ac para CTLA-4 y con LTX-315 combinado con Ac para PD-1 ((b) y (c)).

Figura 18 Configuración experimental en un modelo de sarcoma MCA205, comenzando con anticuerpos anti-PD-1 o con anticuerpos anti-CTLA-4, y reforzando con LTX-315 (a) semanal. Se observa remisión tumoral con LTX-315 combinado con Ac para CTLA-4 y LTX-315 combinado con Ac para PD-1 ((b) y (c)). Figura 19 Configuración experimental en un modelo de sarcoma MCA205, comenzando con anticuerpos anti-PD-1 o con anticuerpos anti-CTLA-4, seguido de inoculaciones locales iterativas de LTX-315 (a). Se observa remisión tumoral con LTX-315 combinado con Ac para CTLA-4 y LTX-315 combinado con Ac para PD-1 ((b) y (c)).

Figura 20 Efectos de inmunidad adaptativa de la combinación de anticuerpos anti-CTLA-4 con LTX-315 en un modelo de sarcoma MCA205. (a) Configuración experimental que muestra el momento de las administraciones. Se inoculan células MCA205 en el flanco derecho del animal el día -8 y en el flanco izquierdo del animal el día -4. Se administra anticuerpo anti-CTLA-4 s.c. en el flanco derecho los días 0 y 3, y se administra LTX315 i.t. en el flanco derecho del animal los días 4, 5 y 6. El flanco izquierdo se deja sin tratar. (b) a (f) El tratamiento de combinación en el que se administra LTX-315 i.t. a un tumor en el flanco derecho del animal induce una inmunidad adaptativa que da como resultado la remisión del tumor en el flanco izquierdo no tratado del animal. Después de la administración de anticuerpo anti-CTLA-4 en combinación con LTX-315 tuvo lugar un rechazo tumoral en 3 de 5 (60 %) de los tumores tratados (flanco derecho) y en 3 de 5 (60 %) de los tumores no tratados (flanco izquierdo). Después de la administración de anticuerpo anti-CTLA-4 solo tuvo lugar un rechazo tumoral en 1 de 5 (20 %) de los tumores no tratados (flanco izquierdo).

Figura 21 Efectos antitumoral directo y de inmunidad adaptativa combinados y de la combinación de anticuerpos anti-PD-L1 con LTX-315 en un modelo de carcinoma mamario murino EMT-6.

En resumen, los Ejemplos siguientes muestran:

Ejemplo 1 - que LTX-315 es el más potente de los 5 compuestos analizados en un estudio de actividad citotóxica in vitro contra un panel de 37 líneas celulares de cáncer humano.

Ejemplo 2 - que LTX-315 es el más potente de los 5 compuestos analizados en un estudio de actividad citotóxica in vitro contra un panel de 10 líneas celulares de linfoma.

Ejemplo 3 - que LTX 315 tiene un valor de CE⁵⁰media superior a 1200 jg/m l (833 j M) contra glóbulos rojos humanos.

Ejemplo 4 - que la actividad antitumoral de LTX-315 dio como resultado una respuesta tumoral completa en 3 de 7 ratones tratados para el grupo que recibió la dosis óptima (Grupo 1), en una investigación sobre el efecto de LTX-315 a distintas cantidades de dosis sobre un linfoma de linfocitos B murino A20 en ratones.

Ejemplo 5 - que cuatro regímenes de tratamiento con LTX-315 distintos demostraron un fuerte efecto antitumoral contra tumores CT26WT murinos (resistentes a múltiples fármacos).

Ejemplo 6 - que LTX-315 tiene un amplio espectro de actividad contra diversas líneas de células de cáncer resistentes a múltiples fármacos y, de manera significativa, un efecto citotóxico mucho más débil sobre células humanas normales.

Ejemplo 7 - que la remisión tumoral completa después del tratamiento inicial de tumores sólidos murinos con LTX-315 dio como resultado una forma de protección endógena a largo plazo contra el crecimiento de los mismos tumores después de la reinoculación.

Ejemplo 8 - que el tratamiento con LTX-315 puede conferir protección a largo plazo contra tumores específicos al suscitar una respuesta inmunitaria.

Ejemplo 9 - que se ha inducido una respuesta inmunitaria anti-células A20 mediante la inyección del cóctel de LTX-315 y células A20 lisadas.

Ejemplo 10 - que el tratamiento con LTX-315 induce rasgos distintivos de muerte celular inmunogénica por distorsión de las mitocondrias en células de melanoma humano.

Ejemplo 11- que el tratamiento con LTX-315 en combinación con un anticuerpo anti-CTLA-4 provocó una remisión tumoral completa y duradera en una alta proporción de sujetos de prueba e indujo una respuesta inmunitaria adaptativa. El anticuerpo anti-PD-1 también mostró la capacidad de actuar en combinación con LTX-315 para inhibir el crecimiento tumoral.

Ejemplo 12- que el tratamiento con LTX-315 en combinación con un anticuerpo anti-PD-L1 provocó una remisión tumoral en una alta proporción de sujetos de prueba e indujo una respuesta inmunitaria adaptativa.

Ejemplo 1

Estudio de la actividad citotóxica in vitro de 5 compuestos de prueba contra un panel de 37 líneas celulares de cáncer humano

1. OBJETIVO DEL ESTUDIO

• Determinar las concentraciones de cinco compuestos nuevos para obtener una inhibición del 50 % de la proliferación (CI⁵⁰) contra un panel de 37 líneas celulares de cáncer humano.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Sustancias de prueba

2.1.1. Sustancias de prueba

• Sustancias de prueba, LTX-302, LTX-313, LTX-315, LTX-320 y LTX-329 (véase la Tabla 1), proporcionados en forma de polvo.

2.1.2. Control positivo

• Como control positivo se utilizó Triton X-100, suministrado por Oncodesign (Dijon, Francia) de Sigma (Saint Quentin Fallavier, Francia).

2.1.3. Vehículo farmacológico y condiciones de almacenamiento

• Los compuestos se almacenaron a 4 °C. El polvo se disolvió primer lugar en medio de cultivo sin suero (RPMI 1640, Lonza, Verviers, Bélgica) y se diluyó adicionalmente utilizando medio de cultivo sin suero para alcanzar las diluciones adecuadas. La solución madre no se almacenó y se preparó fresca el día del experimento.

• Se obtuvo Tritón X-100 al 1 % (concentración final) mediante dilución con medio de cultivo.

2.2. Líneas de células tumorales y condiciones de cultivo

2.2.1. Líneas de células tumorales

Las líneas de células de cáncer y los medios de cultivo se adquirieron en y fueron proporcionados por Oncodesign. Los detalles de las líneas celulares se presentan a continuación en la Tabla 1.

T l 1

continuación

2.2.2. Condiciones de cultivo

se cultivaron células tumorales como monocapas adherentes o como suspensiones a 37 °C en una atmósfera humidificada (CO²al 5 %, aire al 95 %). El medio de cultivo fue RPMI 1640 que contenía L-glutamina 2 mM (Lonza, Bélgica) y complementado con suero fetal bovino al 10 % (FBS, Lonza). Para su uso experimental, las células adherentes se desprendieron del matraz de cultivo mediante un tratamiento de 5 minutos con tripsina-versene (Lonza), se diluyeron en medio de Hanks sin calcio ni magnesio (Lonza) y se neutralizó mediante la adición de medio de cultivo completo. Las células se contaron en un hemocitómetro y se evaluó su viabilidad mediante exclusión de azul tripán al 0,25 %.

Se realizó una detección de micoplasma utilizando el kit de detección MycoAlert (RTM) Mycoplasma Detection Kit (Lonza), en conformidad con las instrucciones del fabricante. Todas las células analizadas resultaron negativas para la contaminación por micoplasma.

3. DISEÑO EXPERIMENTAL Y TRATAMIENTOS

3.1. Amplificación y siembra de líneas celulares

Las células tumorales se sembraron en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos (Nunc, Dutscher, Brumath, Francia) y se incubaron a 37 °C durante 24 horas antes del tratamiento en 190 pl de medio de cultivo sin fármaco, complementado o no con SFB al 10 %, respectivamente para las líneas celulares adherentes o en suspensión.

Las densidades de implantación para cada línea celular se resumen a continuación en la Tabla 2:

T l 2

3.2. Determinación de la CI⁵⁰

Antes del tratamiento las líneas celulares adherentes se lavaron una vez con 200 pl de medio de cultivo sin SFB. Las células tumorales se incubaron durante 4 horas con 10 concentraciones de los compuestos en una etapa de dilución 1/4 con una dosis máxima de 400 pM (intervalo de 4x10'4 a 4x10'10 M), con Triton X-100 al 1 % (concentración final) como control positivo y medio de cultivo sin SFB como control negativo. Las células (190 |jl) se incubaron en un volumen final de 200 j l de medio de cultivo sin SFB que contenía las sustancias de prueba a 37 °C en CO²al 5 %. Se realizaron tres experimentos independientes, analizándose cada concentración por cuadruplicado. Las células de control se trataron con vehículo solo. Al final de los tratamientos, se evaluó la actividad citotóxica mediante un ensayo de MTS (véase el punto 3.3.).

Las diluciones del compuesto analizado, así como la distribución en las placas que contenían células, se realizaron utilizando un sistema de manipulación de líquidos Sciclone ALH 3000 (Caliper Life Sciences SA). De acuerdo con el uso automatizado, se analizó un único intervalo de concentraciones, independientemente de las líneas celulares a analizar. El intervalo no se adaptó para cada línea celular.

3.3. Ensayo de MTS

La actividad citotóxica in vitro de la sustancia de prueba se reveló mediante un ensayo de MTS (BALTROP JA et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1991, 1:611-614) utilizando un nuevo compuesto de tetrazolio (MTS, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxi fenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio) y un reactivo de acoplamiento de electrones denominado PMS (metosulfato de fenazina). Como con el MTT, las células biorreducen el MTS para dar lugar a un producto de formazán que es directamente soluble en medio de cultivo sin procesamiento, a diferencia del MTT.

Al final del tratamiento de las células, se añadieron en cada pocillo 40 j l de una solución recién combinada filtrada de 0,22 jm de MTS (20 ml a 2 mg/ml, Ref. G1111, Lote 235897, Cad. 03/2009, Promega, Charbonnieres, Francia) y PMS (1 ml a 0,92 mg/ml, Ref. P9625, Lote 065K0961, Sigma) en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (Dp BS, Ref 17-513Q, Lote 6MB0152, Cambrex). Las placas de cultivo se incubaron durante 2 horas a 37 °C. La absorbancia (DO) se midió a 490 nm en cada pocillo utilizando un contador de multimarcaje VICTOR3™ 1420 (Wallac, PerkinElmer, Courtaboeuf, Francia).

4. PRESENTACIÓN DE DATOS

4.1. Determinación de la CI⁵⁰

o La inhibición de la proliferación (CI) de respuesta a la dosis se expresó de la siguiente manera:

Cl — DQpociUos expuestos a fármaco ^ 100

DOpocillos sin fármaco

Los valores de DO son la media de 4 mediciones experimentales.

o CI⁵⁰: concentración de fármaco para obtener un 50 % de inhibición de la proliferación celular.

Las curvas de respuesta a la dosis se representaron utilizando XLFit 3 (IDBS, Reino Unido). Los valores de la determinación de la CI⁵⁰se calcularon utilizando el programa informático XLFit 3 a partir de curvas semilogarítmicas. Se generaron los valores de la determinación de la CI⁵⁰individuales, así como los valores de la media de la DT. 4.2. Índice de resistencia (IR)

El índice de resistencia se calculó utilizando la siguiente fórmula:

Chocompuesto Alinea celular resistente)

IRcompuesto A — Chocompuesto Alinea celular sensible)

Se calculó el índice de resistencia para cada compuesto, para cada par de líneas celulares sensibles y resistentes. El índice de resistencia individual se calculó cuando los valores de CI⁵⁰de las líneas celulares tanto sensibles como las resistentes correspondientes se determinaron dentro del mismo experimento. Además, el índice de resistencia también se calculó como la relación de los valores medios de CI⁵⁰obtenidos durante tres experimentos independientes. 5. Resultados

5.1. LTX-302

Las treinta y siete líneas de células tumorales humanas analizadas fueron sensibles al compuesto LTX-302, con valores de CI⁵⁰que variaban de 4,83 ± 0,96 jM a 20,09 ± 4,07 jM para las líneas celulares T-47D y Hep G2, respectivamente.

El valor medio de la CI⁵⁰para el compuesto LTX-302 obtenido en las 37 líneas de células tumorales fue de 12,05 ± 4,27 jM con un valor mediano de 11,70 jM . El valor medio de la CI⁵⁰obtenido para la línea celular normal (HUV-EC-C) fue mayor que para cualquiera de las líneas de células tumorales.

Las líneas celulares de cáncer de pulmón y hemático fueron las más sensibles al compuesto LTX-302 (valores medianos de CI⁵⁰de 7,96 pM (n=7) y 9,02 pM (n=3) para las líneas celulares de cáncer de pulmón y hemático, respectivamente), mientras que las líneas celulares de cáncer hepático fueron las más resistentes (valor mediado de CI⁵⁰de 17,84 pM, n=2).

La actividad del compuesto LTX-302 pareció disminuir ligeramente por la resistencia adquirida hacia la doxorrubicina, como muestran los valores de IR de ambas líneas celulares HL-60/ADR y MCF-7/mdr (1,31 y 1,23 para las líneas celularesHL-60/ADR y MCF-7/mdr, respectivamente). Por el contrario, la actividad del compuesto lTX-302 pareció aumentar por resistencia adquirida hacia el cisplatino, como muestra un valor de IR de 0,33 para la línea celular IGROV-1/CDDP.

5.2. LTX-313

Las treinta y siete (37) líneas de células tumorales humanas analizadas fueron sensibles al compuesto LTX-313, con valores de CI⁵⁰que variaban de 4,01 ± 0,39 pM a 18,49 ± 4,86 pM para las líneas celulares RPMI 8226 y U-87 MG, respectivamente.

El valor medio de la CI⁵⁰para el compuesto LTX-313 obtenido en las 37 líneas de células tumorales fue de 9,60 ± 3,73 pM con un valor mediano de 8,83 pM. El valor medio de la CI⁵⁰obtenido para la línea celular normal (HUV-EC-C) fue mayor que para cualquiera de las líneas de células tumorales.

Las líneas celulares de cáncer hemático fueron las más sensibles al compuesto LTX-313 (valor mediano de CI⁵⁰de 7,04 pM, n=7), mientras que las líneas celulares de cáncer de hígado fueron las más resistentes (valor mediano de CI⁵⁰de 13,71 pM, n=2).

La actividad del compuesto LTX-313 no pareció modificarse por resistencia adquirida hacia la doxorrubicina, como muestran los valores de IR de las líneas celulares CCRF-CEM/VLB, HL-60/ADR y MCF-7/mdr (0,76, 1,16 y 1,24 para las líneas celulares CCRF-CEM/VLB, HL-60/ADR y MCF-7/mdr, respectivamente). Por el contrario, la actividad del compuesto LTX-313 pareció aumentar por resistencia adquirida hacia el cisplatino, como muestra un valor de IR de 0,49 para la línea celular IGROV-1/CDDP.

5.3. LTX-315

Las treinta y siete líneas de células tumorales humanas analizadas fueron sensibles al compuesto LTX-315, con valores de CI⁵⁰que variaban de 1,18 ± 0,25 pM a 7,16 ± 0,99 pM para las líneas celulares T-47D y SK-OV-3, respectivamente.

El valor medio de la CI⁵⁰para el compuesto LTX-315 obtenido en las 37 líneas de células tumorales fue de 3,63 ± 1,45 pM con un valor mediano de 3,27 pM. El valor medio de la CI⁵⁰obtenido para la línea celular normal (HUV-EC-C) fue mayor que para cualquiera de las líneas de células tumorales.

Las líneas celulares de cáncer de mama, hemático y de pulmón fueron las más sensibles al compuesto LTX-315 (valores medianos de CI⁵⁰de 2,45 pM (n=5), 2,60 pM (n = 7) y 2,83 pM (n = 3) respectivamente para las líneas celulares de cáncer de mama, hemático y de pulmón), mientras que las líneas celulares de cáncer de hígado fueron las más resistentes (valor mediano de CI⁵⁰de 5,86 pM, n=2).

La actividad del compuesto LTX-315 pareció disminuir ligeramente por la resistencia adquirida hacia la doxorrubicina, como muestran los valores de IR de las líneas celulares HL-60/ADR y MCF-7/mdr (1,45 y 1,12 para las líneas celularesHL-60/ADR y MCF-7/mdr, respectivamente). Por el contrario, la actividad del compuesto LTX-315 pareció aumentar por resistencia adquirida hacia el cisplatino, como muestra un valor de IR de 0,50 para la línea celular IGROV-1/CDDP.

5.4. LTX-320

Las treinta y siete líneas de células tumorales humanas analizadas fueron sensibles al compuesto LTX-320, con valores de CI⁵⁰que variaban de 3,46 ± 0,22 pM a 16,64 ± 3,15 pM para las líneas celulares T-47D y Hep G2, respectivamente.

El valor medio de la CI⁵⁰para el compuesto LTX-320 obtenido en las 37 líneas de células tumorales fue de 7,58 ± 2,79 pM con un valor mediano de 6,92 pM. El valor medio de la CI⁵⁰obtenido para la línea celular normal (HUV-EC-C) fue mayor que para cualquiera de las líneas de células tumorales.

Las líneas celulares de cáncer hemático, de mama, de riñón y de cerebro fueron las más sensibles al compuesto LTX-320 (valores medianos de CI⁵⁰de 6,04 pM (n=7), 6,60 pM (n=5), 6,60 pM (n=2) y 6,92 pM (n=3) respectivamente para las líneas celulares de cáncer hemático, de mama, de riñón y de cerebro), mientras que las líneas de células de cáncer de hígado fueron las más resistentes (valor mediano de CI⁵⁰de 11,46 j M, n=2).

La actividad del compuesto LTX-320 parecía no haberse modificado por la resistencia adquirida hacia la doxorrubicina, como muestran los valores de IR de las líneas celulares HL-60/ADR y MCF-7/mdr (0,90 y 1,19 para las líneas celularesHL-60/ADR y MCF-7/mdr, respectivamente). Por el contrario, la actividad del compuesto LTX-320 pareció aumentar por resistencia adquirida hacia el cisplatino, como muestra un valor de IR de 0,49 para la línea celular IGROV-1/CDDP.

5.5. LTX-329

Las treinta y siete líneas de células tumorales humanas analizadas fueron sensibles al compuesto LTX-329, con valores de CI⁵⁰que variaban de 2,43 ± 0,34 j M a 16,90 ± 1,18 j M para las líneas celulares T-47D y U-87 MG, respectivamente.

El valor medio de la CI⁵⁰para el compuesto LTX-329 obtenido en las 37 líneas de células tumorales fue de 8,17 ± 3,20 j M con un valor mediano de 7,89 j M. El valor medio de la CI⁵⁰obtenido para la línea celular normal (HUV-EC-C) fue mayor que para cualquiera de las líneas de células tumorales.

Las líneas celulares de cáncer hemático y de mama fueron las más sensibles al compuesto LTX-329 (valores medianos de CI ⁵⁰de 4,92 j M (n=5) y 5,26 j M (n=7) para las líneas celulares de cáncer hemático y de mama, respectivamente), mientras que las líneas celulares de cáncer de ovario fueron las más resistentes (valor mediano de CI⁵⁰de 13,37 j M, n=4).

La actividad del compuesto LTX-329 no pareció modificarse por resistencia adquirida hacia la doxorrubicina, como muestran los valores de IR de las líneas celulares CCRF-CEM/VLB, HL-60/ADR y MCF-7/mdr (0,76, 0,80 y 1,07 para las líneas celulares CCRF-CEM/VLB, HL-60/ADR y MCF-7/mdr, respectivamente). Por el contrario, la actividad del compuesto LTX-329 pareció aumentar por resistencia adquirida hacia el cisplatino, como muestra un valor de IR de 0. 46.para la línea celular IGROV-1/CDDP.

5.6. Comentarios generales

La línea celular de cáncer de mama T-47D es la línea celular más sensible cualquiera que sea el compuesto LTX analizado.

Las líneas celulares de cáncer hemático son el tipo histológico más sensible para los cinco compuestos analizados, estando las líneas celulares de cáncer de hígado y de ovario entre las líneas celulares más resistentes.

Los cinco compuestos analizados presentaron la mayor actividad en la línea celular IGROV-1/CDDP (resistente a cisplatino), con respecto a la línea celular parental de cáncer de ovario IGROV-1. La resistencia a la doxorrubicina pareció disminuir ligeramente la actividad de los compuestos LTX.

El compuesto LTX-315 es el compuesto más potente de los cinco compuestos analizados.

6. CONCLUSIONES

> Los cinco compuestos analizados: (es decir, LTX-302, LTX-313, LTX-315, LTX-320 y LTX-329) presentaron actividad citolítica contra 37 líneas celulares de cáncer humano analizadas, con valores de CI⁵⁰en el intervalo de micromolar a diez micromolar.

> El compuesto LTX-315 es el compuesto analizado más potente, con valores de CI⁵⁰entre 1 y 5 micromolar en las 37 líneas celulares de cáncer humano analizadas.

Ejemplo 2

Estudio de la actividad citotóxica in vitro de 5 compuestos de prueba contra un panel de 10 líneas celulares de linfoma 1. OBJETIVO DEL ESTUDIO

• Determinar las concentraciones de cinco compuestos nuevos para obtener una inhibición del 50 % de la proliferación (CI⁵⁰) contra un panel de 10 líneas celulares de linfoma.

2. m a t e r ia l e s y m é t o d o s

2.1. Sustancias de prueba

2.1.1. Sustancias de prueba

2.1.2. Control positivo

• Como control positivo se utilizó Triton X-100, suministrado por Oncodesign (Dijon, Francia), de Sigma (Saint Quentin Fallavier, Francia).

2.1.3. Vehículo farmacológico y condición de almacenamiento

• Se obtuvo Triton X-100 al 1 % (concentración final) mediante dilución con medio de cultivo.

2.2. Líneas de células tumorales y condiciones de cultivo

2.2.1. Líneas de células tumorales

Las líneas de células de cáncer y los medios de cultivo se adquirieron en y fueron proporcionados por Oncodesign. Los detalles de las líneas celulares se presentan a continuación en la Tabla 3.

T l

2.2.2. Condiciones de cultivo

Se cultivaron células tumorales como suspensiones a 37 °C en una atmósfera humidificada (CO²al 5 %, aire al 95 %). El medio de cultivo para cada línea celular se describe a continuación en la Tabla 4. Para su uso experimental, las células se contaron en un hemocitómetro y se evaluó su viabilidad mediante exclusión de azul tripán al 0,25 %.

T l 4

3. DISEÑO EXPERIMENTAL Y TRATAMIENTOS

3.1. Amplificación y siembra de líneas celulares

Las células tumorales se sembraron en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos (Nunc, Dutscher, Brumath, Francia) y se incubaron a 37 °C durante 24 horas antes del tratamiento en 190 pl de medio de cultivo sin fármaco ni SFB.

Las densidades de implantación para cada línea celular se resumen a continuación en la Tabla 5:

T l

3.2. Determinación de la CI⁵⁰

Las células tumorales se incubaron durante 4 horas con 10 concentraciones de los compuestos en una etapa de dilución 1/4 con una dosis máxima de 400 pM (intervalo de 4x10-4 a 4x10-10 M), con Triton X-100 al 1 % (concentración final) como control positivo y medio de cultivo sin SFB como control negativo. Las células (190 pl) se incubaron en un volumen final de 200 pl de medio de cultivo sin SFB que contenía las sustancias de prueba a 37 °C en CO²al 5 %. Se realizaron tres experimentos independientes, cada concentración se distribuyó por cuadruplicado. Las células de control se trataron con vehículo solo. Al final de los tratamientos, se evaluó la actividad citotóxica mediante un ensayo de MTS (véase el punto 3.3. a continuación).

3.3. Ensayo de MTS

La actividad citotóxica in vitro de la sustancia de prueba se reveló mediante un ensayo de MTS (BALTROP JA et al., utilizando un nuevo compuesto de tetrazolio (MTS, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio) y un reactivo de acoplamiento de electrones denominado PMS (metosulfato de fenazina). Como con el MTT, las células biorreducen el MTS para dar lugar a un producto de formazán que es directamente soluble en medio de cultivo sin procesamiento, a diferencia del MTT.

Al final del tratamiento de las células, se añadieron en cada pocillo 40 pl de una solución recién combinada filtrada de 0,22 pm de MTS (20 ml a 2 mg/ml, Ref. G1111, Lote 235897, Cad. 03/2009, Promega, Charbonnieres, Francia) y PMS (1 ml a 0,92 mg/ml, Ref. P9625, Lote 065K0961, Sigma) en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (Dp BS, Ref 17-513Q, Lote 6MB0152, Cambrex). Las placas de cultivo se incubaron durante 2 horas a 37 °C. La absorbancia (DO) se midió a 490 nm en cada pocillo utilizando un contador de multimarcaje VICTOR3™ 1420 (Wallac, PerkinElmer, Courtaboeuf, Francia).

4. PRESENTACIÓN DE DATOS

4.1. Los datos de CI⁵⁰se determinaron como en el Ejemplo 1

5. RESULTADOS

5.1. LTX-302

Las diez líneas celulares de linfoma humano analizadas fueron sensibles al compuesto LTX-302, con valores de CI⁵⁰que variaban de 5,30 ± 2,02 pM a 12,54 ± 3,52 pM para las líneas celulares U-937 y Raji, respectivamente.

El valor medio de la CI⁵⁰para el compuesto LTX-302 obtenido en las 10 líneas sensibles fue de 8,11 ± 2,44 pM con un valor mediano de 7,53 pM.

5.2. LTX-313

Las diez líneas celulares de linterna humano analizadas fueron sensibles al compuesto LTX-313, con valores de CI⁵⁰que variaban de 3,21 ± 2,81 pM a 16,08 ± 4,86 pM para las líneas celulares Ramos y Raji, respectivamente.

El valor medio de la CI⁵⁰para el compuesto LTX-313 obtenido en las 10 líneas sensibles fue de 7,05 ± 3,91 pM con un valor mediano de 5,89 pM.

5.3. LTX-315

Las diez líneas celulares de linterna humano analizadas fueron sensibles al compuesto LTX-315, con valores de CI⁵⁰que variaban de 1,15 ± 0,42 pM a 4,93 ± 1,03 pM para las líneas celulares U-937 y Raji, respectivamente.

El valor medio de la CI⁵⁰para el compuesto LTX-315 obtenido en las 10 líneas sensibles fue de 3,01 ± 1,36 pM con un valor mediano de 2,93 pM.

5.4. LTX-320

Las diez líneas celulares de linfoma humano analizadas fueron sensibles al compuesto LTX-320, con valores de CI⁵⁰que variaban de 2,22 ± ND pM a 11,26 ± 3,42 pM para las líneas celulares Hs 445 y Raji, respectivamente.

El valor medio de la CI⁵⁰para el compuesto LTX-320 obtenido en las 10 líneas sensibles fue de 5,03 ± 2,82 pM con un valor mediano de 4,84 pM.

5.5. LTX-329

Las diez líneas celulares de linfoma humano analizadas fueron sensibles al compuesto LTX-329, con valores de CI⁵⁰que variaban de 2,46 ± ND pM a 8,70 ± 1,70 pM para las líneas celulares Hs 445 y Raji, respectivamente.

El valor medio de la CI⁵⁰para el compuesto LTX-329 obtenido en las 10 líneas sensibles fue de 5,76 ± 2,27 pM con un valor mediano de 5,72 pM.

5.6. Comentarios generales

Las líneas celulares KARPAS-299 y Raji son las líneas celulares más resistentes, cualquiera que sea el compuesto LTX analizado.

Las líneas celulares Hs 445, Ramos y U-937 son las líneas celulares más sensibles, cualquiera que sea el compuesto LTX analizado.

6. CONCLUSIONES

> Los cinco compuestos analizados: (es decir, LTX-302, LTX-313, LTX-315, LTX-320 y LTX-329) presentaron actividad citolítica contra las 10 líneas celulares de linfoma humano analizadas, con valores de CI⁵⁰en el intervalo de micromolar.

> El compuesto LTX-315 es el compuesto analizado más potente, con valores de CI⁵⁰entre 1 y 5 micromolar en las 10 líneas celulares de cáncer de linfoma analizadas.

Ejemplo 3

Actividad hemolítica in vitro

Principio de la prueba

Se midió la actividad hemolítica del péptido LTX-315 contra glóbulos rojos humanos.

Materiales y métodos

Se centrifugó sangre humana recién recogida a 1500 rpm durante 10 minutos para aislar los glóbulos rojos. Los glóbulos rojos (GR) se lavaron tres veces con PBS [tampón fosfato 35 mM con NaCl 150 mM, pH 7,4] mediante centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos y se ajustaron a un hematocrito del 10 % hematocrito con PBS. Se añadieron soluciones de LTX-315 para dar lugar a un intervalo de concentraciones finales del péptido de 1200 pg/ml a 1 pg/ml, y una concentración de GR del 1 %. La suspensión resultante se incubó con agitación durante una hora a 37 °C. Después de la incubación, la suspensión se centrifugó a 4000 rpm durante 5 minutos y se controló la hemoglobina liberada midiendo la absorbancia del sobrenadante a 405 nm. Como control negativo se utilizó PBS y se asumió que no provocaba hemólisis. Como control positivo se utilizó Triton al 0,1 % y se asumió que provocaba hemólisis total.

Sustancia de prueba: LTX-315

Sustancias de referencia: PBS (control negativo) y Triton X-100 (control positivo). Componentes de las mezclas de reacción: LTX-315, Triton X-100 al 10 %, PBS y GR (hematocrito del 10 %). Los detalles con respecto a estas sustancias se presentan a continuación en la Tabla 6.

T l

Método de evaluación:

La hemoglobina liberada se controló midiendo la absorbancia del sobrenadante a 405 nm y el porcentaje de hemólisis se calculó mediante la ecuación:

% de hemólisis = [(A⁴⁰⁵LTX-315 - A⁴⁰⁵PBS)/( A⁴⁰⁵Triton X-100 al 0,1 % - A⁴⁰⁵PBS)] x 100 Se determinó la concentración de LTX-315 correspondiente al 50 % de hemólisis (CE⁵⁰) a partir de una curva respuesta a la dosis.

Resultados

El valor medio de cinco experimentos distintos, con la desviación típica, se presentan a continuación en la Tabla 7.

T l

Los datos también están representados en la Figura 1. La Figura 1 muestra que LTX-315 tiene un valor medio de CE⁵⁰superior a 1200 jg/m l (833 j M).

Ejemplo 4

Efectos farmacodinámicos con respecto a tumores de linfoma de linfocitos B murino A20 en ratones

Principio de la prueba

El objetivo del estudio fue investigar el efecto de LTX-315 a distintas cantidades de dosis en un linfoma de linfocitos B murino A20 en ratones.

Materiales y métodos

La administración tuvo lugar mediante inyección intratumoral de LTX-315 disuelto en solución salina estéril.

Se inocularon en ratones hembra, por vía subcutánea en el abdomen, 5 millones de células A20 murinas (ATCC, LGC Promochem AB, Middlesex, Inglaterra), en un volumen de 50 pl. Los ratones se dividieron en cuatro grupos (para obtener más detalles véase la Tabla 8 a continuación). El tratamiento intratumoral se inició cuando los tumores habían alcanzado el tamaño deseado de aproximadamente 5 mm de diámetro (mínimo de 20 mm 2).

Se examinaron tres cantidades de dosis de LTX-315, 1 mg (Grupo 1), 0,5 mg (Grupo 2) y 0,25 mg (Grupo 3) por inyección. El volumen fue de 50 pl para todas las inyecciones. Se disolvió LTX-315 en una solución acuosa estéril de NaCl al 0,9 %. Este vehículo se utilizó como control (Grupo 4). Los cuatro grupos recibieron tres inyecciones.

Los ratones se controlaron durante el estudio midiendo los tumores y pesando a los animales de forma regular. Los ratones se siguieron hasta alcanzar la carga tumoral máxima de 125 mm 2, o hasta que se produjeron acontecimientos adversos graves (es decir, la formación de heridas tras tratamientos repetidos durante el período de seguimiento), los ratones se sacrificaron entonces. Se utilizó un calibrador para medir el tamaño tumoral y se utilizaron el pesaje y la exploración física como control de salud. Animales: Ratones Balb/c hembra sin patógenos específicos, de 6-8 semanas de vida, suministrados por Harlan (Inglaterra, RU)

Acondicionamiento de animales: Los animales se mantuvieron con comida convencional de laboratorio y agua. El peso corporal medio, la dosis, la vía y el programa de tratamiento se proporcionan a continuación en la Tabla 8.

T l

Resultados:

El efecto antitumoral de los diversos tratamientos se presenta como tamaño tumoral medio a continuación en la Tabla 9.

T l

El grado de respuesta tumoral en los distintos grupos de tratamiento se resume a continuación en la Tabla 10.

T l 1

Discusión/Conclusiones

En el Grupo 3, que recibió la dosis más baja de LTX-315 (0,25 mg/dosis), se observa un pequeño efecto inhibidor durante los primeros días. En el Grupo 1 y el Grupo 2, que recibieron respectivamente dosis de LTX-315 de 1,0 mg/dosis y 0,5 mg/dosis, todos los animales mostraron una respuesta tumoral parcial o completa. Se descubrió que la actividad antitumoral dio como resultado una respuesta tumoral completa en 3 de 7 ratones tratados para el Grupo que recibió la dosis óptima (Grupo 1).

En general, se observó una necrosis más fuerte y más formación de heridas en el Grupo 1 en comparación con los otros dos grupos. Excepto por la formación de heridas, no se observaron otros acontecimientos adversos o efectos tóxicos en ninguno de los grupos de animales.

En el primer período del estudio, tanto 1 mg como 0,5 mg de LTX-315 demostraron un efecto antitumoral fuerte y rápido. Sin embargo, a medida que avanza el estudio, recaen más animales del Grupo 2 que del Grupo 1.

Ejemplo 5

El efecto de LTX-315 sobre tumores de carcinoma de colon de CT26WT de murino en ratones

Materiales y métodos

La administración tiene lugar mediante inyección intratumoral de LTX-315 disuelto en solución salina estéril (NaCl al 0,9 % en agua estéril).

A cada una de un total de 40 ratones hembra se le inocularon cinco millones de células CT26WT de murino (ATCC, LGC Promochem AB, Boras, Suecia), por vía subcutánea en la superficie del abdomen en un volumen de 50 pl. Los ratones se dividieron en cinco grupos, 8 ratones en cada grupo. Cuando los tumores alcanzaron el tamaño deseado de 20 mm2 se inició el tratamiento mediante inyección intratumoral. El grupo uno se trató únicamente el día 1, el Grupo dos el día 1 y 2, el Grupo tres el día 1 y 3, y el Grupo cuatro el día 1, 2 y 3. Todos los tratamientos diarios fueron una única inyección de 1,0 mg de LTX-315 disueltos en 50 pl (20 mg/ml). El grupo cinco se trató con 50 pl de vehículo para LTX-315 (Grupo 5).

Los ratones se controlaron durante el estudio midiendo los tumores (calibrador digital) y pesando a los animales de forma regular. Los ratones se siguieron hasta alcanzar la carga tumoral máxima de 125 mm 2, o hasta que se produjeron acontecimientos adversos graves (es decir, la formación de heridas debido a inyecciones repetidas), los ratones se sacrificaron entonces. Se utilizaron el pesaje y la exploración física como control de salud.

Animales: Ratones Balb/c hembra sin patógenos específicos, de 6-8 semanas de vida, suministrados por Harlan (Inglaterra, RU)

Acondicionamiento de animales: Condiciones convencionales de animalarios. El peso corporal medio, la dosis, la vía y el programa de tratamiento se proporcionan a continuación en la Tabla 11.

T l 11

Resultados

El efecto antitumoral de los diversos tratamientos se presenta como tamaño tumoral medio a continuación en la Tabla 12.

T l 12

Se observó una respuesta tumoral completa en la gran mayoría de todos los animales tratados con LTX-315. El grado de respuesta tumoral en los distintos grupos de tratamiento se resume a continuación en la Tabla 13.

T l 1

Discusión/Conclusiones

El tratamiento se inició cuando los tumores habían alcanzado el tamaño deseado de un mínimo de 20 mm2 y los animales se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron la carga tumoral máxima de 125 mm2.

El final del estudio se definió como el día 17, cuando se sacrificaron seis de los ocho animales de control (Grupo 5). Todos los regímenes de tratamiento con LTX-315 dieron como resultado un fuerte efecto anti-tumor de CT26WT. De los 32 animales tratados se observó un total de 27 con una respuesta tumoral completa y cuatro con una respuesta parcial. Solo un animal (en el Grupo 3) no respondió al tratamiento. Los resultados presentados muestran que los cuatro grupos tratados tienen una respuesta tumoral global muy similar, los datos también indican que el grado de recaída del tumor fue mayor en el Grupo 2 que en los Grupos 1, 3 y 4. Además, se observó que en el Grupo 2 menos animales no tenían tumor al final del seguimiento (Figura 2).

Se observó necrosis y respuesta tumoral completa en todos los grupos tratados. En el Grupo 1, cuatro de ocho animales, en el Grupo 2, dos de ocho animales, en el Grupo 3, cinco de ocho animales y en el Grupo 4, cinco de los ocho animales mostraron una respuesta tumoral completa. En esta fase el tumor estaba completamente necrótico y se formó una costra en el emplazamiento del tumor.

En todos los grupos de tratamiento se observó necrosis en el sitio del tumor. En general, los animales de los Grupos 2, 3 y 4 mostraron más necrosis, formación de heridas y de costra que los animales del Grupo 1 que recibieron solo una inyección de LTX-315. El Grupo 4, que recibió tres inyecciones, mostró la mayor necrosis, formación de heridas y de costras. La diferencia en la necrosis entre el Grupo 1 y el Grupo 4 fue bastante grande, pero los animales que recibieron el mayor número de tratamientos parecieron adaptarse bien. No se observaron efectos tóxicos u otros efectos adversos, además del tejido necrótico local y de la formación de heridas, en ninguno de los grupos de animales tratados.

Los cuatro regímenes de tratamiento con LTX-315 analizados demostraron un fuerte efecto antitumoral contra tumores de CT26WT murino.

La cantidad de necrosis, formación de heridas y de costras fue proporcional al número de tratamientos con LTX-315 administrados.

Ejemplo 6

Actividad de LTX-315 contra las células cancerosas sensibles y multirresistentes, y contra células humanas normales Las características de las líneas celulares analizadas se presentan a continuación en la Tabla 14.

T l 14

continuación

Los datos anteriores muestran el amplio espectro de actividad de LTX-315 diversas líneas de células cancerosas y, de manera significativa, un efecto citotóxico mucho más débil sobre células humanas normales.

Ejemplo 7

Re-exposición a linfoma de linfocitos B murino A20 y células de carcinoma de colon murino CT26WT en ratones con remisión tumoral completa.

Este estudio buscó investigar los efectos del crecimiento tumoral en animales que previamente habían mostrado una remisión tumoral completa después del tratamiento con LTX-315.

Métodos: Ratones Balb-c hembras (n=4), previamente tratados con LTX-315, 1 mg) o (n=9); previamente tratados con LTX-315, 0,5 o 1 mg) se reinocularon (s.c. en el área abdominal) respectivamente con células de linfoma de linfocitos B murino A20 o con células de carcinoma de colon CT26WT (5 millones), 6 semanas después del tratamiento inicial con LTX-315. Se controló el crecimiento tumoral durante hasta 36 días después de la reinoculación.

Se observó una inhibición significativa (P <0,006) del crecimiento tumoral en los 4 ratones previamente tratados con LTX-315 (1 mg) en el estudio R315-03, en comparación con los animales de control (Figura 2) y, aunque se observó recaída en 1 animal, 3 semanas después se observó una remisión tumoral completa en los otros 3 ratones (Figura 3). En 9 ratones previamente tratados con LTX-315 (0,5 o 1 mg) se observó inhibición (P <0,01) del crecimiento tumoral en comparación con los animales de control (Figura 3). La reducción repentina del tamaño tumoral de la Figura 20, después del día 18, se explica por la muerte de 6 animales portadores de grandes tumores. Se observó inhibición en 7 ratones y remisión completa en 2 de los animales (Figura 5).

Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la remisión tumoral completa después del tratamiento inicial de tumores sólidos murinos (linfoma de linfocitos B A20 o carcinoma de colon CT26WT murinos) con LTX-315 dio como resultado una forma de protección endógena a largo plazo contra el crecimiento de los mismos tumores después de la reinoculación. La inhibición del crecimiento tumoral fue más pronunciada en los animales portadores de tumores de linfoma de linfocitos B A20 en comparación con los animales portadores de tumores de colon de CT26WT.

Ejemplo 8

Efectos inmunológicos de LTX-315 en un modelo de linfoma de linfocitos B murino A20. Un estudio piloto in vivo de transferencia adoptiva de células de bazo.

Este estudio se llevó a cabo para investigar si la protección a largo plazo contra el crecimiento de los mismos tumores después de la reinoculación en animales observada en el estudio R315-33 podía transferirse de forma pasiva a receptores sin tratamiento previo a través de células de bazo tomadas de animales donantes tratados con lTX-315. Se inocularon en la superficie del abdomen diez ratones Balb/c hembra (n=32), cada uno con células A20 (5 millones en 50 |jl s.c.). Una vez que los tumores alcanzaron los 20 mm2, se les inyectó LTX-315 (1 mg) por vía intratumoral, una vez al día durante 3 días, en un volumen de 50 jl. Posteriormente se controlaron el tamaño tumoral (mm2) y el peso corporal, y se proporcionó una inyección adicional de LTX-315 si se observaba algún nuevo crecimiento tumoral. Posteriormente, los ratones que mostraban una remisión tumoral completa se sacrificaron y se utilizaron como donantes para la transferencia de esplenocitos, mientras que se utilizaron ratones donantes sin tratamiento previo como controles. Se extirparon los bazos de los ratones donantes y se aislaron las células. Se irradiaron ratones receptores sin tratamiento previo y se dividieron en 2 grupos. El Grupo 1 recibió esplenocitos aislados de ratones curados, mientras que el Grupo 2 recibió esplenocitos aislados de ratones sin tratamiento previo. Se inyectaron las células recién preparadas (20 x 106 por 100 j l) a través de la vena de la cola. Veinticuatro horas más tarde, se les inoculó a los ratones receptores 5 millones de células de linfoma de linfocito B murino A20, en la superficie del abdomen, como se describe anteriormente. Se controlaron el tamaño tumoral y el peso corporal hasta que se alcanzó una carga tumoral máxima de ~ 125 mm2, o que se produjeron acontecimientos adversos graves (es decir, formación de heridas debido a la necrosis del tejido tumoral), en cuyo punto se sacrificaron los ratones.

Se observó inhibición del crecimiento tumoral en los ratones irradiados que recibieron esplenocitos aislados de los animales que habían mostrado una remisión tumoral completa después del tratamiento con LTX-315, en comparación con los animales de control que recibieron esplenocitos de donantes sin tratamiento previo (Figura 6). Además, se observó que había una diferencia en el color y la textura de los tumores en receptores de esplenocitos de ratones tratados con LTX-315, lo que sugiere una respuesta inflamatoria inmediata.

Sobre la base de estas observaciones, los datos proporcionan pruebas de una respuesta inmunitaria adaptativa en los animales que recibieron esplenocitos de animales que previamente mostraron una remisión completa de los tumores de linfoma B A20 después del tratamiento con LTX-315. Estos datos sugieren que el tratamiento con LTX-315 puede conferir protección a largo plazo contra tumores específicos al suscitar una respuesta inmunitaria.

Ejemplo 9

El objetivo del estudio fue investigar el efecto contra el cáncer de la vacunación profiláctica con células de linfoma A20 lisadas con LTX-315 10 mg/ml:

(i) solas; y

(ii) en combinación con LTX-31520 mg/ml inyectado en el sitio de la vacunación antes de la vacuna.

En total, se utilizaron dos regímenes de tratamiento distintos.

La administración se realizó mediante inyección subcutánea de LTX-315 disuelto en medio de crecimiento que contenía células de linfoma A20. El "cóctel" de células-LTX-315 se dejó durante 30 min antes de la inyección, para garantizar la lisis completa de las células cancerosas.

A los ratones del Grupo 1 ("vacuna") se les inyectó por vía subcutánea, en la superficie del abdomen, 50 pl de un "cóctel" de diez millones de células A20 murinas (ATCC, LGC Promochem AB, Boras, Suecia) y LTX-315 10 mg/ml ("lisado de A20"). Los ratones del Grupo 2 ("vacuna adyuvante") se trataron como al Grupo 1, pero además se les administró 25 pl de LTX-31520 mg/ml por vía subcutánea en el sitio de vacunación, 5 minutos antes de la inyección del lisado de A20. Los ratones del Grupo 3 ("control") no recibieron tratamiento.

Seis semanas después del tratamiento, se les inocularon a todos los ratones por vía subcutánea, en la superficie del abdomen, 5 millones de células de linfoma de linfocito B A20 viables, en un volumen de 50 pl.

Los ratones se controlaron durante el estudio midiendo el tamaño tumoral y pesando a los animales de forma regular. Los ratones se siguieron hasta que se alcanzó una carga tumoral máxima de ~ 130 mm2, en cuyo punto se sacrificaron los ratones.

Materiales y métodos

Animales: Ratones Balb/c hembra sin patógenos específicos, de 6-8 semanas de vida, suministrados por Harlan Laboratories (Inglaterra, RU; www.harlan.com)

Acondicionamiento de animales: Condiciones convencionales de animalarios en la Universidad de Troms⁰.

Sustancia de prueba: Células A20 murinas lisadas con LTX-315 (lote 1013687), y LTX-315 (lote 1013687) solo Preparación de la sustancia de prueba: se añadieron 10x106 células A20 a 50 pl de LTX-31510 mg/ml/vehículo ("lisado de A20"). La sustancia de prueba estaba lista para su uso 30 minutos después del mezclado. El LTX-315 solo se disolvió en NaCl al 0,9 % en H²O estéril

Vehículo: RPMI-1640 c/ L-glutamina 2 mM o NaCl al 0,9 % en H²O estéril

Sustancias de referencia: No procede

Tratamiento de los controles: No procede

Método de evaluación: Mediciones del tamaño tumoral y control de salud mediante pesaje y exploración

Datos adicionales con respecto al método: Se utilizó un calibrador digital para medir el tamaño tumoral y se utilizaron el pesaje y la exploración física como control de salud

El peso corporal medio, la dosis, la vía y el programa de tratamiento se muestran en la Tabla 15 (a continuación).

T l 1

Resultados:

El efecto contra el cáncer de los diversos tratamientos se presenta como tamaño tumoral medio a continuación en la Tabla 16 y se proporciona una presentación gráfica de los datos en la Figura 7. En la Tabla 16, el Día 1 fue el día de la inoculación de células A20 viables seis semanas posvacunación.

T l 1

Discusión / Conclusiones:

La inoculación de células viables de linfoma de linfocitos B A20 se llevó a cabo 6 semanas después de que se proporcionara el tratamiento (día 1), y los animales se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron la carga tumoral máxima permitida de ~ 130 mm 2

Los resultados muestran que los tumores se desarrollaron más lentamente en ambos Grupos de tratamiento con LTX-315/lisado de A20 en comparación con el Grupo de control. La mediana de la supervivencia del Grupo 1 fue de 28 días, 33 días para el Grupo 2 y 25 días para el grupo de control (Grupo 3). El aumento de la supervivencia mediana fue del 12 % para el Grupo 1 y del 35 % para el Grupo, 2 en comparación con el grupo de control (Grupo 3).

Los datos indican una supervivencia prolongada de los grupos tratados en comparación con el grupo de control no tratado. En el día 34, cuando se sacrificó el último animal del grupo de control, seguía vivo el 50 % de los animales del Grupo 2 mientras que de los animales del Grupo 1 seguía vivo el 37,5 %. El final del estudio se definió como el día 60. En este momento, un total de 3 de los 16 animales tratados tuvieron una remisión completa de un tumor inicialmente en desarrollo y no presentaban tumor. Al final del estudio, se observó que el 25 % de los animales del Grupo 1 y el 12,5 % de los animales del Grupo 2 no presentaban tumor.

Macroscópicamente hubo diferencias morfológicas entre los grupos tratados (Grupo 1 y 2) en comparación con el grupo de control no tratado (Grupo 3). Se observó que los tumores en desarrollo en los dos grupos de tratamiento eran más blancos y más duros que los tumores observados en el grupo de control. Este hallazgo, junto con la velocidad de crecimiento de los tumores más lenta, indica que mediante la vacunación con el cóctel de LTX-315 y de células A20 lisadas se indujo una respuesta inmunitaria anti-células A20.

Por lo tanto, LTX-315 puede tener un doble uso al lisar las células tumorales e inducir la liberación de señales de peligro de las células normales en el lugar de la inyección.

Ejemplo 10

En este estudio, los inventores examinaron el efecto tumoricida de LTX-315 sobre células de melanoma humano. El péptido se internalizó y se apareció asociado con las mitocondrias, conduciendo finalmente a una muerte celular lítica. El péptido LTX-315 se diseñó para tratar tumores sólidos con inyecciones intratumorales mediante un modo de acción de dos fases: el primero es el colapso del propio tumor, mientras que el segundo son las moléculas de patrones moleculares asociados a daños (las DAMP) liberadas de la célula tumoral que está muriendo, lo que puede inducir una protección inmunitaria posterior contra las recaídas y metástasis.

Material y métodos

Reactivos

LTX-315 y LTX-328 (K-A-Q-Dip-Q-K-Q-A-W-NH²) se fabricaron bajo pedido en Bachem AG (Bubendorf, Suiza) e Innovagen (Lund, Suecia), respectivamente. LTX-315 Pacific Blue y LTX-328 Pacific Blue se compraron bajo pedido en Innovagen (Lund, Suecia) Norud (Troms⁰, Noruega), respectivamente.

Cultivo de células

La línea celular A375, A375 (ECACC, 88113005) es un melanoma maligno humano obtenido del material de un paciente, y se adquirió en Public Health England (PHE Culture Collections, Porton Down, Salisbury, RU). Las células se mantuvieron como cultivos en monocapa en DMEM con alto contenido de glucosa al 4,5 % complementado con SFB al 10 % y L-glutamina al 1 %, pero no con antibióticos (medios completos). La línea celular se cultivó en una atmósfera humidificada con CO²al 5 % a 37 °C, y se analizó periódicamente la presencia de micoplasma con MycoAlert (Lonza).

Citotoxicidad in vitro, ensayo de MTT

Se examinó el efecto citotóxico de LTX-315 utilizando el ensayo de viabilidad colorimétrico de MTT, como se describe en Eliassen et al. (2002), 22(5): pág. 2703-10. Se sembraron células A375 a una concentración de 1x105 células/ml en un volumen de 0,1 ml en placas de 96 pocillos, y se dejaron adherir en medio de cultivo completo durante una noche. A continuación, se retiró el medio y las células se lavaron dos veces con medio RPMI-1650 sin suero, antes de añadir LTX-315 disuelto en RPMI sin suero a concentraciones que variaban de 2,5-300 pg/ml, y se incubó durante 5 180 minutos. Como control negativo de células se utilizaron células tratadas con RPMI sin suero, mientras que se utilizaron como control positivo células tratadas con Triton X-100 al 1 % en medio sin suero. Los resultados finales se calcularon utilizando la media de tres experimentos, cada uno con pocillos por triplicado.

Microscopía confocal

Obtención de imágenes en células vivas con células sin marcar - Se sembraron células A375 a 10.000 células/pocillo, en un medio completo, en un cubreobjetos con cámaras de 8 pocillos Nunc Lab-Tec (Sigma) prerrecubierto con fibronectina humana 25 pg/ml (Sigma), que se dejaron adherir durante una noche. Las células se lavaron dos veces con RPMI sin suero, se trataron con péptido disuelto en RPMI y se examinaron utilizando Bright en un microscopio confocal Leica TCS SP5, con un objetivo 63X/1,2 W. El microscopio estaba equipado con una cámara de incubación con control de CO²y temperatura.

Células fijadas, mitotracker- Se sembraron células como para obtención de imágenes de células vivas y se trataron con Mitotracker CMH2XROS (Invitrogen) a 100 nm durante 15 minutos antes del tratamiento con los péptidos. Se trataron las células con LTX-315 17 pM, solo con RPMI sin suero como control negativo. Después de 60 min de incubación, las células se analizaron utilizando un microscopio Zeiss. Todos los experimentos de obtención de imágenes confocales se llevaron a cabo posteriormente al menos dos veces, con resultados similares.

Células fijadas, péptido marcado con fluorescencia - Se sembraron células A375 subconfluentes a 8.000 células/pocillo como anteriormente, y se transfectaron el segundo día utilizando los reactivos de transfección Lipofectamine lTx con Plus (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante. Las mitocondrias se marcaron utilizando el pDsRed2-Mito, y el núcleo se marcó utilizando el plásmido GFP-Histon2B (Imaging Platform, Universidad de Troms⁰). Un día después de la transfección, las células se lavaron dos veces con RPMI sin suero y se trataron a distintas concentraciones y períodos de incubación con LTX-315 Pacific Blue o LTX-328 Pacific Blue. LTX-315 PB presentó un perfil citotóxico similar a LTX-315 no marcado, según se determinó mediante un ensayo de MTT. Las células de control se trataron con LTX-315 no marcado y también solamente con RPMI sin suero. Después de la incubación, las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % en PBS y los pocillos se cubrieron con antidesvanecimiento Prolong Gold (Invitrogen). Las células se analizaron adicionalmente mediante el uso de un microscopio confocal Leica TCS SP5, con un objetivo 693, 1,2 W. Pacific Blue, GFP y Ds Red se excitaron con UV, con láseres de 488 y 561, y los canales de fluorescencia se detectaron secuencialmente utilizando los siguientes pasos de banda: UV: 420-480 nm (con atenuación), 488: 501 550 nm y 561: 576-676 nm.

Microscopía electrónica MET

Se sembraron células A375 a 1x105 células por pocillo en placas de 6 pocillos y se dejaron crecer durante tres días para optimizar las estructuras de la membrana en el cultivo, y al segundo día se cambió el medio. Las células se lavaron dos veces en RPMI sin suero antes de tratarlas con LTX-315 disuelto en RPMI sin suero, a 5, 10 y 25 pg/ml, con RPMI sin suero como control negativo. A continuación, las células se lavaron dos veces con PBS antes de la fijación durante 24 horas a 4 °C con formaldehído al 4 % y gluteralaldehído al 1 %, en un tampón Hepes a pH 7,8. Los protocolos de deshidratación y posfijación incluyeron la incubación en ácido tánico tamponado al 5 % y la incubación en ferrocianuro reducido con osmio al 1 %. Se prepararon cortes ultrafinos y se utilizaron acetato de uranilo (5 %) y citrato de plomo de Reynolds para teñir y para el contraste. Las muestras se examinaron en un microscopio electrónico de transmisión JEOL JEM-1010 y se tomaron imágenes con una cámara CCD de MET de montaje lateral Olympus Morada (Olympus soft imaging solutions, GmbH, Alemania).

Medición de fluorescencia de especies reactivas de oxígeno (ROS)

Se adquirió un kit de ensayo de detección de especies reactivas de oxígeno celular DCFDA de abcam®, y se sembraron células A375 en una placa negra de fondo transparente Costar de 96 pocillos, con 20.000 células por pocillo, incubada a 37 °C 16 horas antes del ensayo de DCFDA. Las células se lavaron una vez con 100 pl/pocillo de PBS precalentado y se incubaron con DCFDA 20 pM en una solución tampón suministrada con el kit, a 37 °C en una incubadora de cultivo celular durante 45 min, y a continuación se lavaron de nuevo con 100 pl/pocillo de una solución tampón. A continuación, las células se estimularon con 100 pl/pocillo de péptido LTX-315 disuelto en una solución tampón a concentraciones de 17 pM, durante 30 min, y como control negativo se utilizaron las células sin tratar. La intensidad de la fluorescencia se determinó a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm, en un lector de placas FLUOstar Galaxy.

Liberación del grupo de alta movilidad box 1 (HMGB1)

Se sembraron células A375 a 3x105 células/pocillo en placas de 6 pocillos en medio completo y se dejaron adherir durante una noche. Las células se trataron con LTX-315 o LTX-32835 pM y se incubaron a 37 °C y CO²al 5 % durante distintos puntos de tiempo (5, 10, 15, 30, 60 min), y los controles negativos fueron con RPMI-1650 sin suero. Se recolectaron los sobrenadantes (S) y centrifugaron a 1400 g durante cinco minutos, y se recogieron los lisados celulares (L) después de lavar con PBS dos veces y entonces se lisaron posteriormente utilizando un tampón de muestra 4X (Invitrogen, número), DTT 0,1 M (número Sigma) y agua. Los sobrenadantes se concentraron utilizando filtros centrífugos Amicon Ultra 50K (Millipore UFC505024) y se trató con ultrasonidos el lisado celular. Tanto los sobrenadantes como el lisado se hirvieron y se resolvieron en una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 10 % (SDS-PAGE), y a continuación se electrotransfirió a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore). La membrana se bloqueó en leche al 5 % y se incubó con el anticuerpo para HMGB1 (ac. policlonal de conejo, abcam 18256); a continuación, la membrana se enjuagó varias veces con Tb St , se incubó con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (abcam ab6721), se enjuagó nuevamente con TBST y a continuación se reveló utilizando WB Luminol Reagent (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemania).

Liberación de Citocromo-C

Las células A375 se sembraron como en los estudios de HMGB1 y se trataron con 35 pM para distintos puntos de tiempo (5, 15, 45). Los sobrenadantes se recolectaron y se concentraron como en los estudios de HMGB1, y se analizaron muestras de los sobrenadantes utilizando el kit Cytochrome C-Elisa en forma sólida de 4,5 horas (R&D Systems, EE. UU., n.° DCTC0) siguiendo, la descripción del fabricante. Poco después, se analizó una muestra diluida al 50 % y se determinó la densidad óptica utilizando un lector de microplacas ajustado a 450 nm, y esta lectura se restó después de la lectura a 540 nm. Se generó una curva patrón para cada conjunto de muestras sometidas a ensayo. Las muestras se procesaron con cuatro duplicados en paralelo, y el citocromo-c liberado en el sobrenadante se expresó en veces por encima del nivel de citocromo-c en el sobrenadante de las células no tratadas.

Liberación de ATP

Se analizó el sobrenadante de células A375 tratadas con LTX-315 utilizando un kit Enliten ATP luciferase assay (Promega, EE.UU.). A continuación, las células se sembraron como en un ensayo de ROS y se trataron con LTX-315 en distintos tiempos de incubación, de 1 a 15 minutos, con dos duplicados en paralelo, lo que luego se llevó a cabo tres veces. Los controles negativos fueron células A375 no tratadas expuestas a medio sin suero solo. Las muestras se diluyeron a 1:50 y 1:100, y se analizaron con un luminómetro Luminoscan RT de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Análisis estadístico

Todos los datos representan al menos dos experimentos independientes con al menos dos duplicados en paralelo, los cuales se expresaron como la media ± DT. Los datos de liberación de citocromo C y de liberación de ATP se compararon utilizando ANOVA unidireccional y una prueba de comparaciones múltiples, y los inventores consideraron el valor de P <0,05 para indicar significación estadística.

Resultados

Efecto citotóxico de LTX-315 sobre células de melanoma

Para investigar el efecto de LTX-315 sobre células de melanoma A735 in vitro, los inventores determinaron los valores de CI-50 para el péptido mediante un ensayo de viabilidad celular de MTT en distintos tiempos de incubación. El valor de CI-50 fue de 30 pM después de solo cinco minutos de incubación y progresó a 14 pM después de 90 minutos. Una incubación adicional de hasta 180 minutos no ofreció ningún efecto adicional (Figura 8).

El tratamiento con LTX-315 provoca una rápida lisis celular

A continuación, los inventores quisieron evaluar la morfología celular de las células de melanoma A735 tratadas con LTX-315. Las células se trataron con LTX-315 a un valor de CI-50 y se examinaron mediante microscopía confocal de campo brillante. Las células tratadas presentaron un cambio rápido de una morfología epitelial normal a un colapso total de las células con una extrusión de contenido citoplasmático, lo que estuvo precedido por un redondeamiento de la célula (datos no mostrados). Estos cambios se produjeron normalmente al cabo de 15-60 minutos a un valor de CI-50, en la mayoría de las células.

LTX-315 internaliza y se dirige a las mitocondrias

Para investigar la internalización y el destino del péptido dentro de las células, LTX-315 se marcó con Pacific Blue y se incubó con células a concentraciones respectivamente de 3 pM y 1,5 pM. El LTX-315 marcado penetró rápidamente en la membrana plasmática y a 1,5 pM, el péptido mostró una acumulación alrededor de las mitocondrias después de 30 minutos de incubación, pero no se detectó en el núcleo celular (Figura 9). El péptido LTX-328 de secuencia simulada no lítico marcado no demostró ninguna internalización a ninguna concentración o tiempo de incubación analizado (Figura 10).

LTX-315 induce cambios ultraestructurales en las células

Además, los inventores evaluaron los cambios ultraestructurales en las células tratadas realizando microscopía electrónica de transmisión (MET), en que las células A375 se trataron con péptidos disueltos directamente en medio o en medio solo. Un número significativo de las células tratadas con una concentración baja (3,5 j M) del péptido LTX-315 durante 60 minutos mostraron vacuolización, así como algo de alteración de la morfología mitocondrial (Figura 11). La mitocondria parecía ser menos electrodensa, mostrando también cierto grado de reorganización, con las crestas más separadas o no visibles en absoluto. El número de células necróticas en estas muestras fue inferior al 5 %. En estas concentraciones bajas, se observó vacuolización del citoplasma. Otro hallazgo común en estas muestras fueron las vacuolas ubicadas de forma periférica, que estaban revestidas con única capa de membrana que contenía un material homogéneo (Figura 11B). Cuando las células se trataron con una concentración más alta (17 j M) durante 60 min, aproximadamente el 40 % de ellas presentaba una morfología necrótica con pérdida de la integridad de la membrana plasmática (Figura 11C y E). Las células que aún estaban intactas presentaban una gran heterogeneidad, desde una apariencia normal con microvellosidades hasta una apariencia redonda, estando las mitocondrias claramente afectadas. En esta concentración alta, solo el 4 % de las células examinadas presentaron vacuolización, y no fue visible condensación de cromatina en este material a ninguna concentración de péptido analizada. Estos resultados demuestran que LTX-315 destruye las células tumorales con un modo de acción lítico, mientras que las concentraciones más bajas provocan que las células experimenten cambios ultraestructurales, tales como vacuolización y una morfología mitocondrial alterada. Además, no se observaron cambios morfológicos significativos que sugirieran muerte celular apoptótica.

En un experimento distinto, la exposición de células A547 humanas (una línea celular de melanoma de ovario) a LTX-315 10 jg/m l condujo a la desintegración de la membrana mitocondrial (Figura 16).

El tratamiento con LTX-315 conduce a la liberación extracelular de ATP

Las DAMP son moléculas que se liberan a partir de fuentes intracelulares durante el daño celular. Las DAMP pueden iniciar y perpetuar una respuesta inmunitaria mediante la unión a los Receptores de Reconocimiento de Patrones (los RRP) en las células presentadoras de antígeno (CPA). Entre los DAMP comúnmente conocidos se encuentran ATP, HMGB1, Calreticulina, Citocromo C, ADN mitocondrial y especies reactivas de oxígeno (ROS). A continuación, los inventores quisieron investigar si se liberaba ATP en el sobrenadante de las células tratadas con LTX-315. Por lo tanto, se analizó el sobrenadante de células tratadas y no tratadas utilizando un ensayo de detección de luciferasa. Como se muestra en la Figura 15, se detectó ATP en el sobrenadante tan pronto como después de 5 minutos de tratamiento con LTX-315, y la liberación era dependiente de la concentración.

El tratamiento con LTX-315 induce la liberación de citocromo C en el sobrenadante

Para evaluar si las células tratadas con LTX-315 liberaban citocromo C en el medio, se trataron células A375 con LTX-315 35 j M hasta distintos puntos de tiempo (5, 15, 45 min). El sobrenadante se analizó posteriormente utilizando un ensayo de ELISA. Las células tratadas con un valor de 35 j M tenían tres veces más citocromo-C en el sobrenadante en comparación con las células de control no tratadas. El aumento de citocromo C se detectó después de solo cinco minutos de tratamiento, y también hubo un aumento después de 15 y 45 minutos respectivamente de tratamiento con el péptido (Figura 13).

El tratamiento con LTX-315 conduce a la liberación extracelular de HMGB1

HMGB1 es una proteína nuclear de unión a cromatina que no es una histona. Una vez liberada de forma pasiva a partir de células necróticas, HMGB1 es capaz de desencadenar la maduración funcional de las células dendríticas, la estimulación de citocinas y la quimiotaxia, entre varios efectos inmunopotenciadores.

HMGB1 se encuentra normalmente en el núcleo celular y es de esperar que se encuentre en un lisado celular de células sanas, aunque no en el medio de cultivo (sobrenadante). Para evaluar la liberación de HMGB1 a partir de células tratadas con LTX-315, los inventores midieron la translocación y la HMGB1 libre desde el compartimento nuclear, en el lisado celular, hacia el sobrenadante celular.

El lisado celular y el sobrenadante celular de células de melanoma A375 tratadas con LTX-315 y con LTX-328 se analizaron utilizando una transferencia de Western. Las células se trataron con LTX-315 o con LTX-328 35 j M, detectándose una translocación gradual desde el lisado celular al sobrenadante en las células de melanoma tratadas con LTX-315, pero no en las células tratadas con el péptido de secuencia simulada LTX-328 o con solamente un medio sin suero (Figura 14).

El tratamiento con LTX-315 provoca la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) en células de melanoma A375

Mediante un ensayo fluorométrico con CH2DCFDA se midió la generación de ROS después del tratamiento con LTX 315. Después de 15 minutos de incubación con LTX-315 se generaron cantidades significativas de ROS, y los niveles de ROS fueron dependientes de la concentración (Figura 12).

Análisis

LTX-315 marcado con la molécula fluorescente Pacific Blue se internalizó al cabo de minutos tras la incubación con células de melanoma A375, y se distribuyó en el citoplasma (Figura 9).

A concentraciones bajas, la acumulación del péptido alrededor de las mitocondrias era evidente, mientras que, a concentraciones más altas, el péptido estaba más extendido dentro del citoplasma y se acumulaba en estructuras circulares más cercanas a la membrana celular (Figura 10). Si el péptido ataca la membrana mitocondrial, sería de esperar una disminución o incluso un colapso total del potencial de membrana mitocondrial. Una obtención de imágenes confocales de células con tinción mitocondrial dependiente del potencial de membrana Mitotracker CMXh2ROS mostró una pérdida de la señal mitocondrial poco tiempo después del tratamiento con péptido (datos no mostrados). La pérdida de la señal muestra que la interacción del péptido con las mitocondrias provoca una pérdida del potencial de membrana mitocondrial, lo que es fundamental para las funciones celulares más importantes de la mitocondria. Además, se demostró una morfología mitocondrial alterada con MET. Las células tratadas con LTX-315 durante 60 minutos tenían mitocondrias menos electrodensas, con una organización alterada de las crestas, así como la vacuolización dentro de las mitocondrias, en comparación con las células no tratadas (Figura 11). Adicionalmente, la vacuolización fue evidente en aproximadamente el 20 % de las células tratadas con LTX-315 3,5 pM. Cuando las mitocondrias son disfuncionales, se pueden formar radicales libres de oxígeno (ROS), y mediante el uso de ensayos fluorométricos los inventores demostraron la formación de ROS al cabo de pocos minutos tras el tratamiento con péptido (Figura 12).

En este estudio, los inventores demostraron que el tratamiento con el péptido LTX-315 provoca un aumento de los niveles de ROS en las células de melanoma A375 después del tratamiento. Una explicación para estos niveles más altos de ROS después del tratamiento con péptido podría ser que el péptido entra en las células y se dirige a las mitocondrias, y las mitocondrias disfuncionales liberan entonces ROS. Mediante un ensayo de ELISA, los inventores detectaron la liberación de citocromo C en el sobrenadante de las células tratadas con péptido después de solo unos minutos de tratamiento (Figura 13). El citocromo C es una proteína mitocondrial liberada desde el espacio intermembrana hacia el citosol cuando se perturba la membrana mitocondrial externa y, al unirse al factor 1 activador de proteasa apoptótica (Apaf-1), también es parte de la cascada apoptótica que finalmente conduce a la muerte celular por apoptosis. Sin embargo, si el citocromo C se encuentra en el espacio extracelular, se ha informado que actúa como un mediador proinflamatorio, activando de este así el NF-kB e induciendo la producción de citocinas y quimiocinas. La transición de HMGB1 desde el compartimento celular al compartimento extracelular se detectó utilizando una transferencia de Western (Figura 14). Cuando la proteína nuclear HMBG1 se libera en el líquido extracelular, actúa como una DAMP y puede unirse tanto a los TLR RRP como a los receptores RAGE; la activación de estos puede conducir a una serie de respuestas inflamatorias, tales como la transcripción de citocinas proinflamatorias. Además, los inventores detectaron ATP liberado en el sobrenadante después de la incubación con péptido (Figura 15), que presentado de forma extracelular actúa como una DAMP mediante la activación de los receptores purinérgicos P2RX7 en las CD. Este receptor no solo actúa como un poro que se abre para moléculas catiónicas pequeñas y más tarde moléculas más grandes tras la unión al ATP, su activación también provoca el procesamiento y liberación de la citoquina proinflamatoria IL-1 p.

En resumen, los datos de los inventores sugieren que LTX-315 induce la muerte celular lítica en células cancerosas, no solo mediante un ataque directo a la membrana plasmática, sino también como resultado de una lesión en los orgánulos intracelulares vitales después de la internalización del péptido a concentraciones demasiado bajas para provocar una pérdida inmediata de la integridad de la membrana plasmática. Los inventores demostraron que el tratamiento con péptido provoca la liberación de varias DAMP, tales como CytC, ATP, HMGB1 y ROS. Las DAMP pueden afectar la integridad celular de las células dañadas de varias formas, pero también están asociadas con la denominada muerte celular inmunogénica. La liberación de antígenos específicos de tumor en el compartimento extracelular, junto con potentes moléculas inmunoestimulantes (las DAMP) tales como ATP, CytC y HMGB1, puede proporcionar una fuerte respuesta inmunitaria. A su vez, estos factores conducirán a la maduración y activación de las CD y otras células accesorias del sistema inmunitario adaptativo.

Ejemplo 11

La combinación de LTX-315 con un anticuerpo anti-proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) o un anticuerpo anti-proteína asociada a linfocitos T citotóxicos 4 (CTLA-4) se ensayó en un modelo de sarcoma MCA205 de ratón. Se estudiaron siete animales por grupo. Para cada estudio, se realizaron dos experimentos independientes que produjeron resultados idénticos. Se realizaron análisis estadísticos por Anova.

El anticuerpo anti-PD-1 utilizado en este estudio fue de un isotipo IgG murino. El anticuerpo anti-CTLA-4 fue de un isotipo IgG de rata. Ambos anticuerpos se adquirieron en eBioscience.

Las Figuras 17a, 18a, 19a y 20a muestran los momentos y vías de administración de LTX-315 y los anticuerpos en los diversos estudios. Por lo tanto, en el día -8 se inoculó a los ratones con células cancerosas MCA205 y se dejó que se formaran tumores palpables. A continuación, se administró LTX-315 por vía intratumoral en los días mostrados en las Figuras y se administraron los anticuerpos anti-PD-1 o anti-CTLA-4 i.p. en los días mostrados.

Se llevó a cabo un estudio de inmunidad adaptativa utilizando la combinación de anticuerpo anti-CTLA-4 y LTX-315 de una manera similar a la analizada anteriormente.

Los resultados de estos estudios se analizan en la leyenda de las Figuras 17 a 20. Como los efectos de los anticuerpos anti-PD1 se producen en el microambiente local del tumor (el anti-CTLA-4 actúa en el tejido linfático), se predice que la combinación del compuesto peptídico con anticuerpos anti-PD1 sería más pronunciada en un contexto clínico en comparación con este modelo de tumor único que no es representativo de enfermedad metastásica.

Ejemplo 12

La combinación de LTX-315 con un anticuerpo anti-ligando de proteína de muerte celular programada 1 (PD-L1) se sometió a ensayo en un modelo de carcinoma de mama EMT-6 de ratón.

Materiales y métodos

El anticuerpo anti-PD-L1 tenía las siguientes características: ref: BE0101, Bioxcell; clon 10F.9G2; reactividad: ratón; isotipo: IgG2b de rata. Se preparó LTX-315 a una dosis de 0,5 mg/50 pl en una solución de cloruro de sodio al 0,9 %. Se preparó anticuerpo anti-PD-L1 a una concentración en solución salina tamponada con fosfato y se administró a una dosis de 10 mg/kg. Se inyectó LTX-315 en el tumor injertado en el flanco derecho de los ratones, se inyectó anticuerpo anti-PD-L1 en la cavidad peritoneal de los ratones.

La línea celular EMT-6 se estableció a partir de un carcinoma mamario murino trasplantable que surgió en un ratón BALB/cCRGL después de la implantación de un nódulo alveolar mamario hiperplásico (VOLENEC FJ., et al., J Surg Oncol. 13(1): 39-44, 1980).

Condiciones de los cultivos celulares: Se cultivaron células tumorales EMT-6 como una monocapa a 37 °C en una atmósfera humidificada (CO²al 5 %, aire al 95 %). El medio de cultivo fue RPMI 1640 que contenía L-glutamina 2 mM (ref: BE12-702F, Lonza, Verviers, Bélgica) complementado con suero bovino fetal al 10 % (ref: 3302, Lonza). Las células tumorales EMT-6 se adhieren a matraces de plástico. Para su uso experimental, las células tumorales se desprendieron del matraz de cultivo mediante un tratamiento de 5 minutos con tripsina-versene (ref: BE17-161E, Lonza), en medio de Hanks sin calcio ni magnesio (ref: BE10-543F, Lonza) y se neutralizó mediante la adición de medio de cultivo completo. Las células se contaron en un hemocitómetro y se evaluó su viabilidad mediante un ensayo de exclusión de azul tripán al 0,25 %.

Uso de ratones: Se obtuvieron ratones Balb/C hembras sanas, de 6-8 semanas de edad en el momento de la recepción, de CHARLES RIVER (L'Arbresles, Francia) y de Janvier (Francia). Los ratones se mantuvieron en un estado sanitario SPF (forma siglada de Specific pathogen free, sin patógenos específico) de acuerdo con las directrices de la FELASA (forma siglada de Federation of European Laboratory Animal Science Association, Federación de Asociaciones Europeas de Ciencias del Animal de Laboratorio). El alojamiento de los ratones y los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las normas francesas y europeas (Regla ética de la experimentación animal, Directiva n.° 2010/63 CEE del 22 de septiembre de 2010, Decreto n.° 2013-118 del 1 de febrero de 2013) y la Guía del NRC (forma siglada de National Research Council, Consejo nacional de investigación) para el cuidado y uso de animales de laboratorio (Guía del NRC para el cuidado y uso de animales de laboratorio). El animalario fue autorizado por las autoridades francesas (Acuerdo N.° B 21 231 011 EA). Todos los procedimientos utilizando ratones se enviaron al Comité de Uso y Cuidado Animal de Oncodesign (Oncomet) acordado por las autoridades francesas (acuerdo CNREEA N.° 91). Los ratones se identificaron individualmente con un transpondedor con IDRF y cada jaula se etiquetó con un código específico.

Condiciones de alojamiento: Los ratones se mantuvieron en salas de alojamiento en condiciones ambientales controladas: Temperatura: 22 ± 2 °C, Humedad 55 ± 10 %, Fotoperíodo (12 h de luz/12 h de oscuridad), Aire filtrado por HEPA, 15 intercambios de aire por hora sin recirculación. Los recintos para ratones proporcionaron un espacio estéril y adecuado con material de lecho, comida y agua, enriquecimiento ambiental y social (alojamiento grupal) como se describe: Jaulas de policarbonato con filtro superior Eurostandard Tipo III o IV, lecho de mazorcas de maíz (ref: LAB COB 12, SERLAB, Francia), dieta irradiada a 25 kGy (Ssniff® Soest, Alemania), alimento completo para roedores inmunocompetentes - extruido de R/M-H, agua estéril, filtrado a 0,2 pm y enriquecimiento ambiental (SIZZLE-dri kraft - D20004 SERLAB, Francia).

Inducción de tumores de MET-6 en ratones: Se indujo un primer tumor mediante inyección subcutánea de 1x106 células EMT-6 en 200 pl de RPMI 1640 en el flanco derecho de ratones hembra Balb/C. El día de la inyección de las células tumorales en el flanco derecho se consideró como D0. Se indujo un segundo tumor mediante inyección subcutánea de 1x105 células EMT-6 en 200 pl de RPMI 1640 en el flanco izquierdo de ratones hembra Balb/C. El día de la inyección de las células tumorales en el flanco izquierdo se consideró como D3.

Programa de tratamiento: Los ratones se asignaron al azar de acuerdo con su peso corporal el D3 en cuatro grupos, cada uno de 5 ratones (grupo 1) o 10 ratones (grupos 3, 5 y 7), utilizando el programa informático Vivo manager® (Biosystemes, Couternon, Francia). Se realizó una prueba estadística (análisis de varianza) para probar la homogeneidad entre los grupos. Se realizó una prueba estadística (análisis de varianza) para probar la homogeneidad entre los grupos.

El programa de tratamiento fue el siguiente: los ratones del grupo 1 no se trataron; los ratones del grupo 3 recibieron un total de 3 inyecciones intratumorales de LTX135; los ratones del grupo 5 recibieron un total de 6 inyecciones i.p. de anti-PD-L1; y los ratones del grupo 7 recibieron un total de 3 inyecciones intratumorales de LTX315 y un total de 6 inyecciones i.p. de anti-PD-L1.

El programa de tratamiento se resume a continuación en la Tabla 17:

T l 1

Control de los ratones: Todos los datos del estudio, entre ellos las mediciones del peso corporal de los ratones, el volumen del tumor, los registros clínicos y de mortalidad, y el tratamiento se programaron y registraron en la base de datos Vivo Manager® (Biosystemes, Dijon, Francia). La viabilidad y el comportamiento se registraron todos los días. Los pesos corporales se midieron tres veces por semana. La longitud y la anchura del tumor se midieron tres veces por semana con calibradores y el volumen del tumor se estimó mediante la siguiente fórmula: volumen del tumor = (anchura2 x largo)/2 (SIMPSo N-HERREN L. et al. Cancer Chemotherapy Rep., 54: 143, 1970).

Pruebas estadísticas: Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el programa informático Vivo manager® (Biosystemes, Couternon, Francia). Análisis estadísticos de los pesos corporales medios, el CPCM, los volúmenes tumorales medios en la asignación al azar, los volúmenes tumorales medios, los tiempos medios para alcanzar los volúmenes tumorales medios y los tiempos medios de duplicación del tumor se realizaron utilizando ANOVA y las pruebas por pares se realizaron utilizando la corrección de Bonferroni/Dunn en caso de resultados de ANOVA significativos. Un valor de p <0,05 se consideró significativo.

Resultados

Como se muestra en la Figura 21, el 50 % de los ratones de prueba sobrevivieron durante más de 50 días después de la inducción del tumor cuando se les administró tanto LTX-315 como anticuerpo anti-PD-L1, en comparación con el 40 % de los ratones de prueba tratados con anticuerpo anti-PD-L1 solo, el 30 % de los ratones de prueba tratados con LTX-315 solo y con ninguno en los ratones no tratados. Esto muestra que la terapia de combinación es más eficaz tanto para tratar directamente tumores (tratar el tumor en el flanco derecho del ratón) como para inducir una respuesta inmunitaria adaptativa (tratar el tumor en el flanco izquierdo del ratón).

Los detalles con respecto al porcentaje de ratones que muestran remisión tumoral total en el flanco derecho y/o izquierdo se muestran a continuación en la Tabla 18. Los ratones se analizaron el día 52 después de la inoculación o cuando se sacrificaron.

T l 1

La tabla muestra que la combinación de LTX-315 y anticuerpo anti-PD-L1 es particularmente eficaz para inducir la inmunidad adaptativa, ya que el 40 % de los ratones tratados con la combinación (G7) mostraron remisión total del

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que tiene la fórmula Lys Lys Trp Trp Lys Lys Trp Dip Lys, o una sal, éster o amida del mismo; para su uso en el tratamiento de un tumor mediante la coadministración con un agente inmunoterapéutico, en donde el agente inmunoterapéutico es un anticuerpo anti-CTLA-4.

2. El compuesto para su uso como se reivindica en la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-CTLA-4 se selecciona del grupo que consiste en ipilimumab y tremelimumab.

3. El compuesto para su uso como se reivindica en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el agente inmunoterapéutico se administra antes que o simultáneamente con el compuesto.

4. El compuesto para su uso como se reivindica en la reivindicación 3, en donde el agente inmunoterapéutico se administra antes que el compuesto.

5. Un producto que contiene:

(i) un compuesto como se define en la reivindicación 1; y

(ii) un agente inmunoterapéutico, en donde el agente inmunoterapéutico es un anticuerpo anti-CTLA-4, como una preparación combinada para el uso separado, simultáneo o secuencial en el tratamiento de tumores.

6. Un producto para su uso como se reivindica en la reivindicación 5, en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en ipilimumab y tremelimumab.