ES2900839T3

ES2900839T3 - Combinaciones quimioterapéuticas de péptidos antimicrobianos catiónicos y quimioterapéuticos

Info

Publication number: ES2900839T3
Application number: ES15793749T
Authority: ES
Inventors: Liv Marie Eike; Ketil Camilio; Baldur SVEINBJØRNSSON; Øystein Rekdal; John Sigurd Mjøen Svendsen
Original assignee: Lytix Biopharma AS
Current assignee: Lytix Biopharma AS
Priority date: 2014-12-11
Filing date: 2015-11-04
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2035-11-04
Also published as: EP3229823B1; US11123398B2; US20170340696A1; JP2016145183A; JP6813258B2; AU2015359884A1; EP3229823A1; AU2015359884B2

Abstract

Un compuesto de la fórmula: CCLLCCLLC (I) (SEQ ID No. 1) en la que C representa un aminoácido catiónico y L representa un aminoácido con un grupo R lipófilo y en el que uno de los aminoácidos que tiene un grupo R lipófilo es un aminoácido no codificado genéticamente, dicho compuesto opcionalmente está en la forma de una sal, éster o amida; para uso en el tratamiento de un tumor, en el que el agente inmunoterapéutico ciclofosfamida se administra a una dosis subcitotóxica antes de la primera administración del compuesto de la fórmula (I).

Description

DESCRIPCIÓN

Combinaciones quimioterapéuticas de péptidos antimicrobianos catiónicos y quimioterapéuticos

La presente invención se refiere a péptidos o moléculas similares a péptidos y particularmente a preparaciones combinadas de dichos péptidos con un agente adicional, y sus usos en terapia, en particular como agentes antitumorales.

La prevalencia del cáncer en poblaciones humanas y animales y su función en la mortalidad significa que existe una necesidad continua de nuevos fármacos que sean eficaces contra los tumores. La eliminación de un tumor o la reducción de su tamaño o la reducción del número de células de cáncer que circulan en la sangre o los sistemas linfáticos pueden ser benéficos de diversas formas; reducir el dolor o el malestar, prevenir la metástasis, facilitar la intervención quirúrgica, prolongar la vida.

Las alteraciones genéticas y epigenéticas que son características de los cánceres dan como resultado antígenos que el sistema inmunitario puede reconocer y utilizar para diferenciar entre las células tumorales y sus equivalentes sanos. En principio, esto significa que el sistema inmunitario podría ser un arma poderosa para controlar los tumores. Sin embargo, la realidad es que el sistema inmunitario generalmente no proporciona una respuesta fuerte a las células tumorales. Es de gran interés terapéutico manipular y, por tanto, potenciar el sistema inmunitario en la lucha contra el cáncer (Mellman et al. Nature 2011, vol. 480, 480-489).

Se han realizado varios intentos para ayudar al sistema inmunitario a luchar contra los tumores. Un enfoque inicial implicó una estimulación general del sistema inmunitario, por ejemplo, mediante la administración de bacterias (vivas o muertas) para provocar una respuesta inmunitaria general que también estaría dirigida contra el tumor. Esto también se llama inmunidad inespecífica.

Los enfoques recientes destinados a ayudar al sistema inmunitario específicamente a reconocer antígenos específicos de tumores implican la administración de antígenos específicos de tumores, normalmente combinados con un adyuvante (una sustancia que se sabe que causa o potencia una respuesta inmunitaria) al sujeto. Este enfoque requiere el aislamiento y/o síntesis in vitro de antígenos, lo cual es costoso y requiere mucho tiempo. A menudo, no se han identificado todos los antígenos específicos de tumores, por ejemplo, en el cáncer de mama, los antígenos conocidos se encuentran en el 20-30 % del total de tumores. Por tanto, el uso de vacunas específicas para tumores ha tenido un éxito limitado.

Sigue existiendo una gran necesidad de métodos alternativos para tratar tumores y de métodos alternativos para inhibir el crecimiento o la formación de tumores secundarios. 'Vacuna contra el cáncer' es un término utilizado para describir agentes terapéuticos que están diseñados para estimular el sistema inmunitario del paciente contra los antígenos tumorales y conducir a un ataque a las células tumorales y mejorar el resultado del paciente. A pesar del nombre, las vacunas contra el cáncer generalmente están destinadas a generar o mejorar una respuesta inmunitaria contra un cáncer existente, en lugar de prevenir una enfermedad. Una vez más, a diferencia de las vacunas tradicionales contra agentes infecciosos, una vacuna contra el cáncer o un tumor puede no requerir la administración de un antígeno tumoral, el producto administrado puede utilizar antígenos tumorales ya presentes en el cuerpo como resultado del desarrollo del tumor y servir para modificar la respuesta inmunitaria a los antígenos asociados a tumores (TAA) existentes.

Se reconoce que la falta habitual de una potente respuesta inmunitaria al TAA se debe a una combinación de factores. Las células T tienen una función clave en la respuesta inmunitaria, que se inicia a través del reconocimiento de antígenos por el receptor de células T (TCR), y coordinan un equilibrio entre las señales coestimuladoras e inhibidoras conocidas como puntos de control inmunitarios (Pardoll, Nature 2012, vol. 12, 252 264). Las señales inhibidoras inhiben el sistema inmunitario, lo cual es importante para el mantenimiento de la autotolerancia y para proteger los tejidos del daño cuando el sistema inmunitario responde a una infección patógena. Sin embargo, la supresión inmunitaria reduce lo que de otro modo podría ser una respuesta útil del cuerpo al desarrollo de tumores.

Este equilibrio de estimulación y supresión inmunitaria mediado por células T ha llevado, en los últimos años, a la adopción de un principio de inmunoterapia tumoral conocido como enfoque de 'empujar-jalar' en el que se podrían utilizar terapias de combinación para mejorar simultáneamente el efecto estimulante factores (empujar) y reducir los factores inhibidores (jalar). Una analogía útil es la de una terapia combinada que presiona el acelerador (empujar) y reduce los frenos (jalar). (Berzofsky et al. Semin Oncol. Junio de 2012; 39 (3) 348-57).

Por ejemplo, las citocinas, otras moléculas estimulantes tales como CpG (células dendríticas estimulantes), ligandos de receptores similares a Toll y otros adyuvantes moleculares mejoran la respuesta inmunitaria. Las interacciones coestimuladoras que involucran a las células T directamente pueden potenciarse utilizando anticuerpos agonistas para receptores que incluyen OX40, CD28, CD27 y CD137. Todos estos son enfoques de tipo “empujar” para la inmunoterapia contra el cáncer.

Las terapias complementarias de “jalar” pueden bloquear o agotar células o moléculas inhibidoras e incluyen el uso de anticuerpos antagonistas contra lo que se conocen como puntos de control inmunitarios. Los puntos de control inmunitarios incluyen CTLA-4 y PD-1 y los anticuerpos contra estos se conocen en la técnica; ipilimumab fue el primer anticuerpo de punto de control antiinmunitario aprobado por la FDA para el tratamiento del melanoma metastásico y esto bloquea el antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) (Naidoo et al. British Journal of Cancer (2014) 111, 2214-2219). Existen otros agentes que se considerarían quimioterapéuticos clásicos que pueden reducir la supresión inmunitaria a dosis subcitotóxicas, entre ellos la ciclofosfamida y la doxorrubicina.

Los presentes inventores han establecido que algunos péptidos conocidos por lisar células tumorales a través de perturbar y permeabilizar la membrana celular, también son muy eficaces para atacar orgánulos tales como mitocondrias y lisosomas y pueden provocar la lisis de los mismos. Esto se puede lograr a concentraciones bajas que no provocan la lisis directa de las membranas celulares, aunque eventualmente se observa pérdida de la integridad de la membrana celular incluso con la administración de dosis bajas. En dosis más altas, estas moléculas pueden provocar la lisis de la membrana celular y luego de las membranas de los orgánulos.

Los péptidos de interés son un subconjunto del grupo de péptidos comúnmente conocidos como péptidos antimicrobianos Catiónicos (CAP). Estos son péptidos anfipáticos cargados positivamente y los péptidos de este tipo se encuentran en muchas especies y forman parte del sistema inmunitario innato. La CAP Lactoferricina (LfcinB) es un péptido de 25 aminoácidos que ha mostrado tener un efecto sobre las mitocondrias (Eliasen et al. Int. J. Cancer (2006) 119, 493-450). Ahora se ha descubierto sorprendentemente que el péptido LTX-315, mucho más pequeño, un péptido de 9 aminoácidos (del tipo descrito en el documento WO 2010/060497), también se dirige a las mitocondrias. Esto fue inesperado porque este pequeño péptido actúa mucho más rápido (provocando la muerte celular después de 30 minutos de exposición) en comparación con LfcinB (que es más efectivo después de 24 horas de exposición) y el pequeño péptido actúa contra un espectro más amplio de tipos de células, lo que sugiere un efecto directo sobre la membrana plasmática. La actividad de este péptido y otros péptidos similares se discute en Camilio, Short Lytic Anticancer Peptides as a Novel Therapy against Cancer, 2013.

Esta ruptura de la membrana del orgánulo da como resultado la liberación de agentes de la misma que tienen una potente función inmunoestimuladora, dichos agentes se conocen generalmente como DAMP (moléculas de patrón molecular asociado a daño) e incluyen ATP, citocromo C, secuencias de ADN CpG mitocondrial, péptidos de formilo mitocondrial, catepsinas (a partir de lisosomas) y HMGB1 (a partir de núcleo). La lisis de orgánulos también puede resultar en la liberación de antígenos específicos de tumor (tAa ) adicionales.

Esta capacidad para estimular la respuesta inmunitaria a los tumores mediante la alteración de las membranas mitocondriales y de otros orgánulos hace que estos péptidos sean muy adecuados como agentes “de empujar” en inmunoterapias combinadas “empujar-jalar” diseñadas para tratar y proteger contra el desarrollo de tumores.

Por tanto, en el presente documento se divulgan:

Un compuesto, preferiblemente un péptido, que tiene las siguientes características:

a) que consiste en 9 aminoácidos en una disposición lineal;

b) de esos 9 aminoácidos, 5 son catiónicos y 4 tienen un grupo R lipófilo;

c) al menos uno de dichos 9 aminoácidos es un aminoácido no codificado genéticamente (por ejemplo, un derivado modificado de un aminoácido codificado genéticamente); y opcionalmente

d) los residuos lipófilo y catiónico se disponen de manera que no haya más de dos de cualquier tipo de residuo adyacentes entre sí; y además opcionalmente

e) la molécula comprende dos pares de aminoácidos catiónicos adyacentes y uno o dos pares de residuos lipófilos adyacentes;

para uso en el tratamiento de un tumor mediante la administración combinada, secuencial o separada con un agente quimioterapéutico citotóxico que inhibe la tolerancia inmunitaria, en el que el agente quimioterapéutico se administra a una dosis subcitotóxica.

La terapia de combinación propuesta en el presente documento puede, en ciertas realizaciones ventajosas, proporcionar un efecto sinérgico.

La presente invención proporciona:

Un compuesto de la fórmula:

CCLLCCLLC (I) (SEQ ID NO: 1) en la que C representa un aminoácido catiónico y L representa un aminoácido con un grupo R lipófilo y en el que uno de los aminoácidos que tiene un grupo R lipófilo es un aminoácido no codificado genéticamente, dicho compuesto opcionalmente está en la forma de una sal, éster o amida;

para uso en el tratamiento de un tumor, en el que el agente inmunoterapéutico ciclofosfamida se administra a una dosis subcitotóxica antes de la primera administración del compuesto de la fórmula (I).

Las moléculas que contienen aminoácidos definidas anteriormente, es decir, compuestos de fórmula I, se denominan convenientemente en el presente documento como el “compuesto peptídico de la invención”, expresión que incluye los peptidomiméticos divulgados en el presente documento.

Los aminoácidos catiónicos, que pueden ser iguales o diferentes, son preferiblemente lisina o arginina pero pueden ser histidina o cualquier aminoácido no codificado genéticamente que lleve una carga positiva a pH 7.0. Los aminoácidos catiónicos no codificados genéticamente adecuados incluyen análogos de lisina, arginina e histidina tales como homolisina, ornitina, ácido diaminobutírico, ácido diaminopimélico, ácido diaminopropiónico y homoarginina, así como trimetilisina y trimetilornitina, ácido 4-aminopiperidina-4-carboxílico, ácido 4-amino-1-carbamimidoilpiperidina-4-carboxílico y 4-guanidinofenilalanina.

Los aminoácidos no codificados genéticamente incluyen derivados modificados de aminoácidos codificados genéticamente y aminoácidos naturales distintos de los 20 aminoácidos estándar del código genético. En este contexto, un aminoácido D, aunque estrictamente no esté codificado genéticamente, no se considera un “aminoácido no codificado genéticamente”, que debería ser estructuralmente, no solo estereoespecíficamente, diferente de los 20 aminoácidos L codificados genéticamente. Las moléculas de la invención pueden tener algunos o todos los aminoácidos presentes en la forma D, sin embargo, preferiblemente todos los aminoácidos están en la forma L. Los aminoácidos lipófilos (es decir, aminoácidos con un grupo R lipófilo), que pueden ser iguales o diferentes, poseen todos un grupo R con al menos 7, preferiblemente al menos 8 o 9, más preferiblemente al menos 10 átomos que no son de hidrógeno. Un aminoácido con un grupo R lipófilo se denomina en el presente documento aminoácido lipófilo. Normalmente, el grupo R lipófilo tiene al menos uno, preferiblemente dos grupos cíclicos, que pueden estar fusionados o conectados.

El grupo R lipófilo puede contener heteroátomos tales como O, N o S pero normalmente no hay más de un heteroátomo, preferiblemente es nitrógeno. Este grupo R preferiblemente no tendrá más de 2 grupos polares, más preferiblemente ninguno o uno, lo más preferiblemente ninguno.

El triptófano es un aminoácido lipófilo preferido y las moléculas comprenden preferiblemente 1 a 3, más preferiblemente 2 o 3, lo más preferiblemente 3 residuos de triptófano. Los aminoácidos lipófilos codificados genéticamente adicionales que se puede incorporar son fenilalanina y tirosina.

Preferiblemente, la molécula consiste en 3 aminoácidos lipófilos codificados genéticamente, 5 aminoácidos catiónicos codificados genéticamente y 1 aminoácido lipófilo no codificado genéticamente. Las moléculas incluyen un aminoácido lipófilo no codificado genéticamente (por ejemplo, un derivado de aminoácido); el grupo R de ese aminoácido contiene preferiblemente no más de 35 átomos que no son de hidrógeno, más preferiblemente no más de 30, lo más preferiblemente no más de 25 átomos que no son de hidrógeno.

Los aminoácidos no codificados genéticamente preferidos incluyen: ácido 2-amino-3-(bifenil-4-il)propanoico (bifenilalanina), ácido 2-amino-3,3-difenilpropanoico (difenilalanina), ácido 2-amino-3-(antracen-9-il)propanoico, ácido 2-amino- 3-(naftalen-2-il)propanoico, ácido 2-amino-3-(naftalen-1-il)propanoico, ácido 2-amino-3-[1,1':4',1”-terfenil-4-il]-propiónico, ácido 2-amino-3-(2,5,7-tri-tert-butil-1H-indol-3-il)propanoico, ácido 2-amino-3-[1,1':3',1”-terfenil-4-il]-propiónico, ácido 2-amino-3-[1,1':2',1”-terfenil-4-il]-propiónico, ácido 2-amino-3-(4-naftalen-2-il-fenil)-propiónico, ácido 2-amino-3-(4'-butilbifenil-4-il)propanoico, ácido 2-amino-3-[1,1':3',1”-terfenil-5'-il]-propiónico y ácido 2-amino-3-(4-(2,2-difeniletil)fenil)propanoico.

Los compuestos peptídicos de la invención tienen la fórmula I enumerada a continuación, en la que C representa un aminoácido catiónico como se definió anteriormente y L representa un aminoácido lipófilo como se definió anteriormente. Los aminoácidos se conectan covalentemente, preferiblemente mediante enlaces de péptidos que dan como resultado un péptido verdadero o mediante otras conexiones que dan como resultado un peptidomimético, se prefieren los péptidos. Los terminales amino o carboxi libres de estas moléculas se pueden modificar, el terminal carboxi se modifica preferiblemente para eliminar la carga negativa, lo más preferiblemente se amida el terminal carboxi, este grupo amida puede estar sustituido.

CCLLCCLLC (I) (SEQ ID NO: 1)

También se divulgan en el presente documento compuestos que tienen una de las fórmulas II a V enumeradas a continuación, en las que C representa un aminoácido catiónico como se definió anteriormente y L representa un aminoácido lipófilo como se definió anteriormente.

LCCLLCCLC (II) (SEQ ID NO: 2)

CLLCCLLCC (III) (SEQ ID NO: 3)

CCLLCLLCC (IV) (SEQ ID NO: 4)

CLCCLLCCL (V) (SEQ ID NO: 5)

Un peptidomimético se caracteriza normalmente por retener la polaridad, el tamaño tridimensional y la funcionalidad (bioactividad) de su péptido equivalente, pero en el que se han reemplazado los enlaces de péptidos, a menudo por conexiones más estables. Por “estable” se entiende más resistente a la degradación enzimática por enzimas hidrolíticas. Generalmente, el enlace que reemplaza al enlace amida (sustituto del enlace amida) conserva muchas de las propiedades del enlace amida, por ejemplo, conformación, volumen estérico, carácter electrostático, posibilidad de enlaces de hidrógeno, etc. Capítulo 14 de “Drug Design and Development”, Krogsgaard, Larsen, Liljefors and Madsen (Eds) 1996, Horwood Acad. Pub proporcionan una discusión general de técnicas para el diseño y síntesis de peptidomiméticos. En el presente caso, cuando la molécula se hace reaccionar con una membrana en lugar del sitio activo específico de una enzima, algunos de los problemas descritos de imitar exactamente la afinidad y la eficacia o la función del sustrato no son relevantes y se puede preparar fácilmente un peptidomimético basado en una estructura peptídica dada o un motivo de los grupos funcionales requeridos. Los sustitutos de enlace amida adecuados incluyen los siguientes grupos: N-alquilación (Schmidt, R. et al., Int. J. Peptide Protein Res., 1995, 46,47), amida retroinversa (Chorev, M and Goodman, M., Acc. Chem. Res, 1993, 26, 266), tioamida (Sherman D.B. and Spatola, A.F. J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 433), tioéster, fosfonato, cetometileno (Hoffman, R.V. and Kim, H.O. J. Org. Chem., 1995, 60, 5107), hidroximetileno, fluorovinilo (Allmendinger, T. et al., Tetrahydron Lett., 1990, 31, 7297), vinilo, metilenoamino (Sasaki, Y and Abe, J. Chem. Pharm. Bull. 1997 45, 13), metilenetio (Spatola, A.F., Methods Neurosci, 1993, 13, 19), alcano (Lavielle, S. et. al., Int. J. Peptide Protein Res., 1993, 42, 270) y sulfonamido (Luisi, G. et al. Tetrahedron Lett. 1993, 34, 2391).

Los compuestos peptidomiméticos pueden tener 9 subunidades identificables que son aproximadamente equivalentes en tamaño y función a los 9 aminoácidos catiónicos y lipófilos. Por tanto, el término “aminoácido” se puede utilizar convenientemente en el presente documento para hacer referencia a las subunidades equivalentes de un compuesto peptidomimético. Más aún, los peptidomiméticos pueden tener grupos equivalentes a los grupos R de aminoácidos y se aplica la discusión en el presente documento de los grupos R adecuados y de los grupos modificadores del terminal N y C, mutatis mutandis, a los compuestos peptidomiméticos.

Como se discute en “Drug Design and Development”, Krogsgaard et al., 1996, así como el reemplazo de enlaces amida, los peptidomiméticos pueden implicar el reemplazo de fracciones estructurales más grandes con estructuras di o tripeptidomiméticas y, en este caso, las fracciones miméticas que implican el enlace de péptidos, tales como miméticos derivados de azol, se pueden utilizar como reemplazos de dipéptidos. Sin embargo, se prefieren los peptidomiméticos y, por lo tanto, las cadenas principales peptidomiméticas en las que solo se han reemplazado los enlaces amida como se discutió anteriormente.

Los peptidomiméticos adecuados incluyen péptidos reducidos en los que el enlace amida se ha reducido a una metileno amina mediante tratamiento con un agente reductor, por ejemplo, borano o un reactivo de hidruro tal como hidruro de litio y aluminio. Dicha reducción tiene la ventaja agregada de incrementar la cationicidad global de la molécula.

Otros peptidomiméticos incluyen peptoides formados, por ejemplo, mediante la síntesis en forma de etapas de poliglicinas funcionalizadas con amida. Algunas cadenas principales peptidomiméticas estarán fácilmente disponibles a partir de sus precursores de péptidos, tales como péptidos que han sido permetilados, métodos adecuados están descritos por Ostresh, J.M. et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994)91, 11138-11142. Las condiciones fuertemente básicas favorecerán la N-metilación sobre la O-metilación y darán como resultado la metilación de algunos o todos los átomos de nitrógeno en los enlaces de péptidos y el nitrógeno de terminal N. Las cadenas principales peptidomiméticas preferidas incluyen poliésteres, poliaminas y derivados de los mismos, así como alcanos y alquenos sustituidos. Los peptidomiméticos preferiblemente tendrán terminales N y C que se pueden modificar como se discute en el presente documento.

Los aminoácidos p y y, así como los aminoácidos a, se incluyen dentro del término “aminoácidos”, al igual que las glicinas N-sustituidas. Los compuestos peptídicos de la invención incluyen péptidos beta y depsipéptidos.

Como se discutió anteriormente, los compuestos peptídicos de la invención incorporan al menos uno, y preferiblemente un, aminoácido no codificado genéticamente. Cuando este residuo se denota con L', los compuestos preferidos se representan mediante las siguientes fórmulas:

CCL'LCCLLC (I') (SEQ ID NO: 6)

CCLLCCLL'C (I”) (SEQ ID NO: 7)

CCLL'CCLLC (I-) (SEQ ID NO: 8)

También se divulgan en el presente documento compuestos representados por la siguiente fórmula: LCCLL'CCLC (II') (SEQ ID NO: 9)

Se prefieren especialmente los compuestos (preferiblemente péptidos) de fórmula I”.

Los siguientes péptidos, tal como se presentan en la Tabla 1, son los más preferidos.

Tabla 1

También se describen en el presente documento los siguientes péptidos.

Nombre SEQ ID NO Secuencia

LTX-301 10 Dip-K- K-W-W- K-K-W-K-NH2-LTX-302 11 W- K- K-W- Dip-K- K-W- K-NH2-LTX-303 12 W-K-K-W-W-K-K-Dip-K-NH2-LTX-304 13 Bip-K- K-W-W- K-K-W-K-NHs

LTX-305 14 W-K-K-Bip-W-K-K-W-K-NH2-LTX-306 15 w-k-k-w-dip-k-k-w-k-N H2 LTX-312 20 K-Bip-K-K-W-W-K-K-W-NH2-L TX-316 24 K-W-Dip-K- K-W-W- K-K-NH2-LTX-317 25 K-K-W-W-K-W-Dip-K-K-NH2-L TX-321 29 K-W-W-K-K-Dip-W-K-K-NH2-LTX-323 30 K-Dip-K- K-W-W- K-K-W-NH2-LTX-325 32 k-w-w-k-k-dip-w-k-k-NH2-En la cual:

• el código estándar de una sola letra se utiliza para los aminoácidos codificados genéticamente • la minúscula indica aminoácidos D

• Dip es difenilalanina

• Bip es bifenilalanina

• Orn es ornitina

• Dap es ácido 2,3-diaminopropiónico

• Dab es ácido 2,4-diaminobutírico

• 1 -Nal es 1-naftilalanina

• 2-Nal es 2-naftilalanina

• Ath es ácido 2-amino-3-(antracen-9-il)propanoico

• Phe(4,4'Bip) es ácido 2-amino-3-[1,1':4',1”-terfenil-4-il]propiónico.

El compuesto LTX-315 es el más preferido.

Todas las moléculas descritas en el presente documento pueden estar en forma de sal, éster o amida.

Las moléculas son preferiblemente péptidos y preferiblemente tienen un terminal C modificado, particularmente amidado. Los péptidos amidados pueden estar ellos mismos en forma de sal y se prefieren las formas de acetato. Las sales fisiológicamente aceptables adecuadas son bien conocidas en la técnica e incluyen sales de ácidos inorgánicos u orgánicos e incluyen trifluoracetato así como acetato y sales formadas con HCl.

Los compuestos peptídicos descritos en el presente documento son de naturaleza anfipática, su estructura de 2°, que puede o no tender a la formación de una hélice a, proporciona una molécula anfipática en condiciones fisiológicas.

Las terapias de combinación definidas en el presente documento son para el tratamiento de tumores, en particular tumores sólidos y, por tanto, para el tratamiento del cáncer.

Los compuestos peptídicos de la invención desestabilizan y/o permeabilizan las membranas de los orgánulos de las células tumorales, por ejemplo, las mitocondrias, el núcleo o el lisomoma, en particular las mitocondrias.

Por “desestabilizador” se entiende una perturbación de la configuración bicapa de lípidos normal que incluye, pero no se limita a, adelgazamiento de la membrana, aumento de la permeabilidad de la membrana al agua, iones o metabolitos, etc.

Un “agente quimioterapéutico citotóxico” es un agente que, a una dosis máxima tolerada (MTD), es eficaz para destruir células que se dividen rápidamente y, por tanto, se puede utilizar como terapia contra el cáncer. Estos fármacos normalmente actúan al interferir con la síntesis de a Dn o producir daño químico al ADN. Dichos agentes no serán eficaces en todos los pacientes, pero se prescriben por esta capacidad de destruir células de cáncer que se dividen rápidamente. Citotoxicidad y quimioterapia son términos bien conocidos en el campo de la oncología. El término no cubre los agentes que son selectivamente citotóxicos (agentes que pueden destruir células de cáncer específicamente) tales como los anticuerpos monoclonales. El experto conoce los agentes quimioterapéuticos citotóxicos utilizados en la técnica y también puede determinar fácilmente si un agente putativo tiene propiedades quimioterapéuticas citotóxicas. El experto puede, por ejemplo, realizar un ensayo antiproliferativo, tal como un ensayo m Ts descrito en el Ejemplo 1, contra células que se dividen rápidamente. Como se discute más adelante, estos agentes no se utilizan por su capacidad para destruir células tumorales que se dividen rápidamente y la dosis empleada se denomina “subcitotóxica”, es decir, menos que citotóxica.

Algunos agentes quimioterapéuticos citotóxicos inhiben la tolerancia inmunitaria (es decir, reducen los mecanismos de supresión inmunitaria). Como se describe en Zheng et al (2015) Cell. Immunol., 294, pp. 54-9, las células inmunitarias específicas, las moléculas efectoras y las rutas de señales pueden actuar en un proceso denominado tolerancia inmunitaria, dando como resultado el crecimiento tumoral en lugar de una inhibición del crecimiento tumoral. Las células T reguladoras (Treg), las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) y los macrófagos asociados a tumores (TAM) tienen funciones clave en lo que puede ser una tolerancia inmunitaria inducida por cáncer. Se ha informado que los agentes quimioterapéuticos citotóxicos interrumpen esta tolerancia inmunitaria que conduce a una respuesta inmunitaria contra las células tumorales. Los agentes que han mostrado estimular la activación inmunitaria incluyen doxorrubicina (Alizadeh et al. Cancer Res. (2014) 74(1); 104-118), paclitaxel (Michels et al. J. Immunotoxicol. (2012) 9(3); 292-300), ciclofosfamida (Heylmann et al. PL^oS one, (2013) Vol. 8, Edición 12, e83384), gemcitabina y 5-fluorouracilo; el agente quimioterapéutico de la invención es preferiblemente uno de los enumerados en el presente documento, más preferiblemente ciclofosfamida o doxorrubicina.

Los agentes quimioterapéuticos citotóxicos estándar tienen muchos efectos secundarios no deseados. Sin embargo, se ha observado (Heylmann, Alizadeh and Michels supra) que algunos agentes quimioterapéuticos en concentraciones subcitotóxicas pueden facilitar eficazmente la activación inmunitaria con poca toxicidad y con pocos de los efectos secundarios desafiantes de la quimioterapia convencional. A estas concentraciones subcitotóxicas, los agentes pueden reducir la tolerancia inmunitaria y, por tanto, potenciar la inmunidad contra el cáncer, por ejemplo, al agotar las células inmunosupresoras altamente proliferativas mientras se conservan los linfocitos menos proliferativos con una función protectora. Las células inmunosupresoras, tales como las células T reguladoras y las MDSC, son dianas de estos agentes, al igual que las citocinas, que pueden servir para evitar que los linfocitos T citotóxicos y las células destructoras naturales destruyan las células tumorales.

El experto en la técnica podrá determinar fácilmente si un agente quimioterapéutico citotóxico inhibe la tolerancia inmunitaria, por ejemplo, a través de la monitorización de los cambios de tolerancia inmunitaria tales como la maduración de las células dendríticas, un aumento en la expresión de receptores auxiliares en las células T y una disminución de las células inmunosupresoras después de la administración del agente in vivo, por ejemplo, en un modelo animal o en un estudio clínico. Dicha monitorización se puede llevar a cabo, por ejemplo, utilizando inmunhistoquímica sobre tejido tumoral aislado o utilizando citometría de flujo sobre suspensiones de células individuales aisladas de tejido tumoral. El grado de inhibición será terapéuticamente significativo y puede ser al menos 10% o 20%, preferiblemente al menos 30% o 40%, más preferiblemente al menos 50% o 60% en comparación con un control adecuado.

Una “dosis subcitotóxica” del agente quimioterapéutico es una que es menor que la dosis normalmente prescrita para destruir directamente las células de cáncer, por ejemplo, menor que la MTD para la quimioterapia estándar. Para los agentes quimioterapéuticas citotóxicos utilizados clínicamente, estas dosis citotóxicas se conocen comúnmente en la técnica y se pueden establecer en cualquier aprobación regulatoria. Por ejemplo, una dosis común de ciclofosfamida utilizada en la terapia contra el cáncer es de 40 a 50 mg/kg divididos en 2 a 5 días, lo que equivale a 8 mg/kg/día en el extremo inferior del rango de dosificación. Por lo tanto, una dosis no citotóxica de ciclofosfamida sería menor de 8 mg/kg/día en humanos, normalmente menor de 6 o 4 mg/kg/día.

Las dosis subcitotóxicas preferidas están entre el 1 % (por ejemplo, el 5 %) y el 90 % de la dosis que se utiliza normalmente para la terapia contra el cáncer directa. La dosis puede ser, por ejemplo, menos del 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 % o 10 % de la dosis citotóxica estándar. Preferiblemente, la dosis está entre el 5 % y el 50 %, más preferiblemente entre el 10 % y el 40 %. Dosis subcitotóxicas adecuadas, a menudo denominadas simplemente “dosis bajas”; se conocen y describen en la técnica, por ejemplo, en la técnica citada en el presente documento. La dosis no citotóxica puede ser aún tóxica para las células no cancerosas que se dividen rápidamente, y dicha dosis aún puede provocar reacciones adversas al fármaco (ADR) en el sujeto. Por ejemplo, una dosis no citotóxica aún puede afectar negativamente a la hematopoyesis en un sujeto.

Para los agentes quimioterapéuticos citotóxicos que no se utilizan comúnmente clínicamente, se puede determinar una dosis subcitotóxica in vivo al aumentar gradualmente la titulación de una dosis y monitorizar regularmente los efectos sobre la citotoxicidad.

La dosis subcitotóxica se puede administrar como dosis única o como dosis múltiples. La dosis no citotóxica se puede administrar en bloques, tal como una o dos veces al día durante 3-7 días, seguida de una pausa de 3-7 días, seguida de un curso de administración adicional. Incluso si se administran dosis múltiples, el impacto sobre el cuerpo y la clasificación del régimen de dosificación que entendería el médico sigue siendo “subcitotóxico”. Por tanto, visto alternativamente, los usos y métodos de la invención emplean un agente quimioterapéutico citotóxico como se define en el presente documento administrado de acuerdo con un régimen de dosificación subcitotóxico.

Preferiblemente, la dosis subcitotóxica es una dosis metronómica (la dosificación metronómica se pretende normalmente que sea antiangiogénica). Una dosis metronómica es una dosis no citotóxica administrada diariamente o cada dos días durante un período de tiempo prolongado, por ejemplo, al menos 2, 3, 4 o 6 semanas. Normalmente, de 6 a 45 dosis, por ejemplo, de 6 a 20 dosis.

La invención proporciona un compuesto para uso en el tratamiento de un tumor y para uso en el tratamiento de células tumorales, en el que el agente inmunoterapéutico ciclofosfamida se administra en una dosis subcitotóxica antes de la primera administración del compuesto. La terapia de combinación debe ser eficaz para destruir todas o una proporción de las células tumorales diana o para prevenir o reducir su tasa de multiplicación, o para inhibir la metástasis o de otra manera para disminuir el efecto dañino del tumor en el paciente. El médico o el paciente deben observar una mejora en uno o más de los parámetros o síntomas asociados con el tumor. La administración también puede ser profiláctica y esto está abarcado por el término “tratamiento”. El paciente será normalmente un paciente humano, pero también se pueden tratar animales no humanos, tales como animales domésticos o ganado.

Las dianas del cáncer incluyen sarcomas, linfomas, leucemias, neuroblastomas y glioblastomas (por ejemplo, del cerebro), carcinomas y adenocarcinomas (particularmente de mama, colon, riñón, hígado (por ejemplo, carcinoma hepatocelular), pulmón, ovario, páncreas, próstata y piel) y melanomas. Los cánceres de mama, cabeza y cuello son las dianas preferidas. El melanoma, el sarcoma y el linfoma son los tipos de tumores preferidos para el tratamiento. Los tumores para tratamiento normalmente son tumores sólidos y pueden ser lesiones metastásicas accesibles para inyección transdérmica.

Los péptidos se pueden sintetizar de cualquier forma conveniente. Generalmente, los grupos reactivos presentes (por ejemplo, amino, tiol y/o carboxilo) estarán protegidos durante la síntesis general. La etapa final de la síntesis será, por tanto, la desprotección de un derivado protegido de la invención. Al construir el péptido, en principio se puede comenzar en el terminal C o en el de terminal N, aunque se prefiere el procedimiento que inicia en el terminal C. Los métodos de síntesis de péptidos son bien conocidos en la técnica pero para la presente invención puede ser particularmente conveniente llevar a cabo la síntesis sobre un soporte en fase sólida, siendo dichos soportes bien conocidos en la técnica. Se conoce una amplia variedad de grupos protectores para aminoácidos que se utilizan en la síntesis de péptidos.

Las referencias y técnicas para sintetizar compuestos peptidomiméticos y las otras moléculas bioactivas de la invención se describen en el presente documento y son bien conocidas en la técnica.

Aunque es posible que los compuestos peptídicos (que incluyen sales, ésteres o amidas de los mismos) se administren como compuestos puros, es preferible presentarlos como formulaciones farmacéuticas, es decir incorporando uno o más diluyentes, portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Los agentes activos de acuerdo con la invención se pueden presentar, por ejemplo, en una forma adecuada para administración oral, tópica, nasal, parenteral, intravenal, intratumoral, rectal o regional (por ejemplo, perfusión de extremidades aisladas). A menos que se indique lo contrario, la administración es normalmente por ruta parenteral, preferiblemente mediante inyección por vía subcutánea, intramuscular, intracapsular, intraespinal, intrapenteral, intratumoral, transdérmica o intravenosa. Para el compuesto peptídico, la administración es preferiblemente intratumoral. Se prefieren particularmente las inyecciones intratumorales del compuesto peptídico de la invención una vez al día durante varios días consecutivos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, preferiblemente en 2-4 días consecutivos, o en intervalos diarios de 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días.

Preferiblemente, existen múltiples administraciones del compuesto peptídico, preferiblemente 2-4, por ejemplo, 3 administraciones.

Los compuestos activos definidos en el presente documento se pueden presentar en las formas de administración farmacológica convencionales, tales como comprimidos, comprimidos recubiertos, pulverizadores nasales, soluciones, emulsiones, liposomas, polvos, cápsulas o formas de liberación sostenida. Se pueden emplear excipientes farmacéuticos convencionales así como los métodos habituales de producción para la preparación de estas formas. Se prefieren las soluciones simples.

También se pueden utilizar sistemas portadores específicos de órganos.

Las soluciones de inyección se pueden producir, por ejemplo, de manera convencional, tal como mediante la adición de agentes de conservación, tales como p-hidroxibenzoatos, o estabilizadores, tales como EDTA. Luego, las soluciones se introducen en viales o ampollas para inyección.

Las formulaciones preferidas son aquellas en las que las moléculas están en solución salina. Dichas formulaciones son adecuadas para uso en métodos de administración preferidos, especialmente la administración local, es decir, intratumoral, por ejemplo, mediante inyección.

A menos que se indique lo contrario, las unidades de dosificación que contienen las moléculas peptídicas contienen preferiblemente 0.1-10 mg, por ejemplo 1-5 mg. La formulación puede comprender adicionalmente ingredientes activos adicionales, que incluyen otros agentes citotóxicos tales como otros péptidos antitumorales. Otros ingredientes activos pueden incluir diferentes tipos de citocinas, por ejemplo, IFN-^y, TNF, CSF y factores de crecimiento, inmunomoduladores, quimioterapéuticos, por ejemplo, cisplatino o anticuerpos o vacunas contra el cáncer.

También se divulga en el presente documento un paquete o composición farmacéutica que comprende:

(i) un compuesto peptídico como se define en el presente documento; y

(ii) un agente quimioterapéutico como se describe en el presente documento, a una dosis subcitotóxica.

En los paquetes farmacéuticos, los componentes pueden administrarse por separado. Por supuesto, el paquete farmacéutico también puede comprender instrucciones para la administración. El paquete y la composición son para uso en el tratamiento de un tumor.

Como se discutió anteriormente, los compuestos peptídicos de la invención son capaces de desestabilizar las membranas mitocondriales y provocar la liberación de DAMP y material antigénico. Esto puede tener un poderoso efecto positivo en la respuesta del sistema inmunitario a las células de cáncer. En ciertos tratamientos contra el cáncer, la respuesta inmunitaria es de importancia primordial, por ejemplo, para tratar tumores secundarios no identificados, para prevenir la formación de tumores metastásicos, cuando no es posible la cirugía u otra intervención directa. Los diferentes tipos de cáncer son más o menos inmunogénicos y, por lo tanto, en algunos escenarios es vital reforzar la respuesta inmunitaria contra el cáncer.

Por tanto, también se divulga en el presente documento un compuesto peptídico como se define en el presente documento para uso en la desestabilización de una membrana mitocondrial, en el que dicho uso es en el tratamiento de un tumor. Esto puede considerarse como un uso o tratamiento inmunoterapéutico y el tumor normalmente será canceroso. Se aplican las características y realizaciones preferidas discutidas en otra parte en relación con las terapias de combinación, mutatis mutandis, a este aspecto.

También se divulga en el presente documento una composición que comprende o consiste en un compuesto peptídico como se define en el presente documento y un agente inmunoterapéutico. La presente divulgación proporciona un compuesto peptídico de la invención y un agente inmunoterapéutico para uso en el tratamiento de tumores.

Por “agente inmunoterapéutico” se entiende un agente que modula la respuesta inmunitaria. Preferiblemente, el agente inmunoterapéutico mejora la respuesta inmunitaria contra uno o más antígenos tumorales, por ejemplo al suprimir (preferiblemente selectivamente) las células Treg y/o MDSC y/o bloquear el antígeno 4 de linfocitos T citotóxico (CTLA-4), un receptor inhibidor expresado sobre las células T. En todos los aspectos y realizaciones de la invención, el agente inmunoterapéutico es ciclofosfamida (CY).

El experto podrá seleccionar las dosificaciones adecuadas del agente inmunoterapéutico.

El agente inmunoterapéutico, por ejemplo, el agente quimioterapéutico, se administra antes de la primera administración del compuesto peptídico de la invención. Preferiblemente, se administra antes del compuesto peptídico de la invención, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 días antes del compuesto peptídico de la invención. Se prefiere una dosis única, pero se pueden utilizar dosis múltiples, que pueden ser, por ejemplo, con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 días de diferencia.

La “coadministración” puede ser simultánea o secuencial y mediante la misma o diferentes rutas de administración, por ejemplo, oral y/o parenteral.

Los inventores también han encontrado sorprendentemente que el tratamiento de un tumor con un compuesto peptídico de la invención junto con un agente inmunoterapéutico puede inducir una inmunidad adaptativa contra tumores adicionales. Por lo tanto, los métodos, usos y productos (composiciones) anteriores se pueden extender opcionalmente a la inducción de una inmunidad adaptativa contra tumores adicionales. Por lo tanto, por ejemplo, también se divulga en el presente documento un compuesto peptídico como se define en el presente documento y un agente inmunoterapéutico para uso en el tratamiento de tumores en un paciente e inducción de inmunidad adaptativa contra el crecimiento, desarrollo o establecimiento de tumores en dicho paciente.

También se divulga en el presente documento un compuesto peptídico como se define en el presente documento y un agente inmunoterapéutico para uso en la inducción de una inmunidad adaptativa contra el crecimiento, desarrollo o establecimiento de tumores.

Por tanto, en el presente documento se divulga un producto que contiene un compuesto peptídico como se define en el presente documento y un agente inmunoterapéutico como una preparación combinada para uso separado, simultáneo o secuencial en la inducción de una inmunidad adaptativa contra el crecimiento, desarrollo o establecimiento de tumores.

La invención se describirá ahora con más detalle en los siguientes Ejemplos (algunos de los cuales se proporcionan a modo de antecedentes y no son realizaciones de la invención) y con referencia a las figuras en las que:

Figura 1 es un gráfico que muestra el porcentaje de muerte de glóbulos rojos en una serie de experimentos para probar el péptido LTX-315 en concentraciones variables. El eje X muestra la concentración de péptidos (|jg/ml). El eje Y muestra el % de muerte celular;

Figura 2 muestra el crecimiento tumoral en ratones reinoculados con células de linfoma de células B A20 de murino en comparación con el crecimiento en los animales de control del estudio inicial. Los diamantes indican controles de estudios primarios. Los cuadrados sólidos indican ratones reinoculados;

Figura 3 muestra el crecimiento tumoral en ratones individuales reinoculados con células de linfoma de células B A20 de murino que han sido inicialmente tratadas con LTX-315. Los cuadrados indican Ratón 1. Los triángulos (la base en la parte inferior) indican el Ratón 2. Los triángulos (la base en la parte superior) indican el Ratón 3. Los diamantes indican el Ratón 4;

Figura 4 muestra el crecimiento tumoral en ratones reinoculados con células de carcinoma de colon CT26WT de murino en comparación con el crecimiento en los animales de control. Los diamantes indican controles de estudios primarios. Los cuadrados sólidos indican ratones reinoculados;

Figura 5 muestra el crecimiento tumoral en ratones individuales reinoculados con células de carcinoma de colon CT26WT de murino que han sido tratados inicialmente con LTX-315. Los cuadrados pequeños indican el Ratón 1. Los triángulos pequeños (base en la parte inferior) indican el Ratón 2. Los triángulos pequeños (base en la parte superior) indican el Ratón 3. Los diamantes pequeños indican el Ratón 4; los círculos indican el Ratón 5. Los cuadrados grandes indican el Ratón 6. Los triángulos grandes (base en la parte inferior) indican el Ratón 7. Los triángulos grandes (base en la parte superior) indican el Ratón 8. Los diamantes grandes indican el Ratón 9;

Figura 6 muestra el crecimiento de linfomas de células B A20 en ratones irradiados que recibieron esplenocitos de ratones donantes que muestran una regresión tumoral completa después del tratamiento con LTX-315 (Grupo 1) o ratones de control (Grupo 2) que recibieron esplenocitos de ratones donantes neófitos Los cuadrados indican el Grupo 1 (ratones que recibieron esplenocitos de donantes que muestran regresión completa). Los diamantes indican el Grupo 2 (ratones que recibieron esplenocitos de donantes neófitos);

Figura 7 muestra el efecto contra el cáncer de dos regímenes de tratamiento diferentes en tumores A20 de murino sólidos (Grupos 1 y 2) en comparación con controles no tratados (Grupo 3). Los triángulos sólidos invertidos (la base en la parte superior) indican el Grupo 1 (tratamiento). Los cuadrados abiertos indican el Grupo 2 (tratamiento adyuvante). Los triángulos abiertos (la base en la parte inferior) indican el Grupo 3 (control). El orden del tamaño del tumor (mm2) en el día 21 es (de mayor a menor): Grupo 3, Grupo 1, Grupo 2.

Figura 8 LTX-315 provoca la muerte celular rápida en células de melanoma humano. (a) Cinética de destrucción celular in vitro de LTX-315 (IC50) contra células de melanoma humano después de los puntos de tiempo designados (5, 15, 30, 45, 60, 90, 120 y 180 min) y (b) demostrar la viabilidad de células A375 después del tratamiento con diferentes concentraciones de LTX-315 durante 60 min. Los resultados de tres experimentos se presentan para cada punto de tiempo como la media de ± DE.

Figura 9 LTX-315 se internaliza y se acumula cerca de las mitocondrias. Células A375 tratadas durante 30 minutos con LTX-315 marcado con fluorescencia 1.5 pM y con mitocondrias y núcleo marcados. El péptido se internalizó y se detectó muy cerca de las mitocondrias. A: canales superpuestos, B: primer plano, C: mitocondrias. D: péptido Figura 10 La internalización se produce sólo en compuestos líticos de 9 meros tales como LTX-315 y no en el péptido simulado no lítico LTX-328. Células A375 tratadas con péptido LTX-315 o LTX-328 3 pM durante 60 min. LTX-315 se detectó en el citoplasma, mientras que LTX-328 no se internalizó. A: LTX-31560 min de incubación, B: LTX-32860 min de incubación.

Figura 11 El tratamiento con LTX-315 provoca cambios ultraestructurales. Imágenes TEM de células A375 tratadas con LTX-315 durante 60 minutos en comparación con células de control. A&D: células de control no tratadas, B&E: células tratadas con 3.5 pM, C:&F células tratadas con 17 pM. Ampliación 10000X AC, 30000 DF, barra de escala 5 pm.

Figura 12 Generación de ROS en muerte celular inducida por LTX-315. Las células A375 se trataron con LTX-315 a diferentes concentraciones durante 15 minutos. Después del tratamiento con péptidos, se agregó carboxi-H2DCFDA a las muestras y se analizó la fluorescencia con un lector de placas de fluorescencia. El experimento se realizó por duplicado, con barras que representan la fluorescencia media - D.E.

Figura 13 Las células de melanoma humano tratadas con LTX-315 liberan citocromo-C en el sobrenadante. La liberación de citocromo C en el sobrenadante después del tratamiento con LTX-315 de A375 después de los puntos de tiempo designados (5, 15, 45 min) se determinaron mediante ensayo ELISA.

Figura 14 HMGB1 se libera en el sobrenadante después del tratamiento con LTX-315. Las células de melanoma humano A375 se trataron con LTX-315 35 pM (parte superior) o LTX-328 (parte inferior), y el lisado celular (L) y el sobrenadante (S) se analizaron con transferencia de Western, y las células tratadas con LTX-315 mostraron una translocación gradual del lisado celular al sobrenadante celular. Las células de control se trataron solo con medio y no mostraron translocación después de 60 minutos.

Figura 15 Niveles extracelulares de ATP luego del tratamiento con LTX-315: Se trataron células A375 con LTX-315 durante diferentes puntos de tiempo (5, 15, 30, 45, 60 min) a diferentes concentraciones o se mantuvieron bajo condiciones controladas, y se analizó el sobrenadante para la cuantificación de la secreción de ATP mediante bioluminiscencia de luciferasa. Se informan los datos cuantitativos (media -D.E.) para un experimento representativo.

Figura 16 LTX-315 desintegra la membrana mitocondrial. Imágenes TEM de células de melanoma A547 humanas tratadas con LTX-315 (10 mg/ml) durante 60 minutos en comparación con las células de control.

Figura 17 Efecto de dosis bajas de ciclofosfamida sola (b), lTX-315 solo (c) y la combinación de las dos terapias (d) sobre el crecimiento tumoral de linfomas A20 de murino. Los tumores de linfoma palpable singénicos con ratones Balb/c se inyectaron i.p. con ciclofosfamida metronómica (día 4) o vehículo (controles de vehículo, (a)), y con 1.0 mg de LTX-315 (20 mg/ml) una vez al día el día 8, 9 y 10 después de la exposición al tumor.

Figura 18 Curvas de supervivencia de ciclofosfamida metronómica sola, LTX-315 solo y la combinación de las dos terapias sobre el crecimiento tumoral contra el control, analizadas utilizando una prueba de log-rango (Mantel-Cox). Se demostró que los resultados eran significativamente diferentes (p <0.0001).

En resumen, los ejemplos a continuación muestran:

Ejemplo 1 - que LTX-315 es el más potente de los 5 compuestos probados en un estudio de actividad citotóxica in vitro contra un panel de 37 estirpes celulares de cáncer humano.

Ejemplo 2: - que LTX-315 es el más potente de los 5 compuestos probados en un estudio de actividad citotóxica in vitro contra un panel de 10 estirpes celulares de linfoma.

Ejemplo 3: - que LTX 315 tiene un valor de EC50 medio superior a 1200 pg/ml (833 pM) contra los glóbulos rojos humanos.

Ejemplo 4: - que la actividad antitumoral de LTX-315 dio como resultado una respuesta tumoral completa en 3 de 7 ratones tratados para el Grupo que recibió la dosis óptima (Grupo 1) en una investigación sobre el efecto de LTX-315 a diferentes niveles de dosis sobre un linfoma de murino de células B A20 en ratones.

Ejemplo 5: - que cuatro regímenes de tratamiento con LTX-315 diferentes demostraron un fuerte efecto antitumoral contra tumores CT26WT de murino (resistentes a múltiples fármacos).

Ejemplo 6 - que LTX-315 tiene un amplio espectro de actividad contra varias estirpes celulares de cáncer resistentes a múltiples fármacos y, significativamente, un efecto citotóxico mucho más débil sobre células humanas normales.

Ejemplo 7 - que la regresión tumoral completa después del tratamiento inicial de tumores de murino sólidos con LTX-315 dio como resultado una forma de protección endógena a largo plazo contra el crecimiento de los mismos tumores después de la reinoculación.

Ejemplo 8: - que el tratamiento con LTX-315 puede conferir protección a largo plazo contra tumores específicos al provocar una respuesta inmunitaria.

Ejemplo 9: - que se ha inducido una respuesta inmunitaria de células anti-A20 mediante la inyección del cóctel de lTx -315 y células A20 lisadas.

Ejemplo 10: - que el tratamiento con LTX-315 induce características distintivas de muerte celular inmunogénica por distorsión de las mitocondrias en células de melanoma humano.

Ejemplo 11: que el tratamiento con LTX-315 en combinación con CY provocó una regresión tumoral completa y duradera en una alta proporción de sujetos de prueba.

Ejemplo 1

Estudio de la actividad citotóxica in vitro de 5 compuestos de prueba contra un panel de 37 estirpes celulares de cáncer humano

1. Objetivo del estudio

• Determinar las concentraciones de cinco compuestos novedosos para obtener un 50 % de inhibición de la proliferación (IC50) contra un panel de 37 estirpes celulares de cáncer humano.

2. Materiales y métodos

2.1. Sustancias de prueba

2.1.1. Sustancias de prueba

• Sustancias de prueba, LTX-302 (compuesto de referencia), LTX-313, LTX-315, LTX-320 y LTX-329 (véase Tabla 1) proporcionadas en forma de polvo.

2.1.2. Control positivo

• Se utilizó Triton X-100 como control positivo, suministrado por Oncodesign (Dijon, Francia) de Sigma (Saint Quentin Fallavier, Francia).

2.1.3. Condiciones de almacenamiento y vehículo del fármaco

• Los compuestos se almacenaron a 4 °C. El polvo se disolvió primero en medio de cultivo libre de suero (RPMI 1640, Lonza, Verviers, Bélgica) y se diluyó adicionalmente utilizando medio de cultivo libre de suero para alcanzar las diluciones apropiadas. La solución madre no se almacenó y se preparó fresca el día del experimento.

• Se obtuvo Triton X-100 al 1% (concentración final) mediante dilución utilizando medio de cultivo.

2.2. Estirpes celulares tumorales y condiciones de cultivo

2.2.1. Estirpes celulares tumorales

Las estirpes celulares de cáncer y los medios de cultivo fueron adquiridos y proporcionados por Oncodesign. Los detalles de las estirpes celulares se presentan en la Tabla 1 a continuación.

Tabla 1

continuación

2.2.2. Condiciones de cultivo

Las células tumorales se cultivaron como monocapas adherentes o como suspensiones a 37 °C en una atmósfera humidificada (CO2 al 5 %, aire al 95 %). El medio de cultivo fue RPMI 1640 que contenía L-glutamina 2 mM (Lonza, Bélgica) y se complementó con suero bovino fetal al 10% (FBS, Lonza). Para uso experimental, las células adherentes se separaron del matraz de cultivo mediante un tratamiento de 5 minutos con tripsina-verseno (Lonza), se diluyeron en medio de Hanks sin calcio ni magnesio (Lonza) y se neutralizaron mediante la adición de medio de cultivo completo. Se contaron las células en un hemocitómetro y se evaluó su viabilidad mediante exclusión de azul tripán al 0.25 %.

La detección de micoplasma se realizó utilizando el Kit de Detección de Micoplasma MycoAlert (RTM) (Lonza) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se encontró que todas las células probadas fueron negativas para contaminación por micoplasmas.

3. Diseño experimental y tratamientos

3.1. Amplificación y siembra de estirpes celulares

Las células tumorales se sembraron en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos (Nunc, Dutscher, Brumath, Francia) y se incubaron a 37 °C durante 24 horas antes del tratamiento en 190 pl de medio de cultivo libre de fármaco suplementado o no con FBS al 10 % para estirpes celulares en crecimiento adherente o en suspensión, respectivamente.

Las densidades de implantación para cada estirpe celular se resumen en la Tabla 2 a continuación:

Tabla 2

3.2. Determinación de IC50

Las estirpes celulares adherentes se lavaron una vez con 200 |jl de medio de cultivo libre de FBS antes del tratamiento. Las células tumorales se incubaron durante 4 horas con 10 concentraciones de compuestos en % de etapa de dilución con una dosis máxima de 400 jM (rango 4X 10 -4 a 4 X10-10 M), con Triton X-100 al 1% (concentración final) como control positivo y medio de cultivo libre de FBS como control negativo. Las células (190 jl) se incubaron en un volumen final de 200 j l de medio de cultivo libre de FBS que contenía sustancias de prueba a 37 °C bajo CO2 al 5 %.

Se realizaron tres experimentos independientes, cada concentración se probó por cuadriplicado. Las células de control se trataron solo con vehículo. Al final de los tratamientos, se evaluó la actividad citotóxica mediante un ensayo MTS (véase § 3.3.).

Las diluciones del compuesto probado así como la distribución a placas que contienen células se realizaron utilizando un sistema de manipulación de líquidos Sciclone ALH 3000 (Caliper Life Sciences SA). De acuerdo con el uso automatizado, se probó un solo rango de concentraciones independientemente de las estirpes celulares que se van a probar. El rango no se adaptó para cada estirpe celular.

3.3. Ensayo MTS

La actividad citotóxica in vitro de la sustancia de prueba se reveló mediante un ensayo MTS (BALTROP JA et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1991, 1: 611-614) utilizando un compuesto de tetrazolio novedoso (MTS, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio) y un reactivo de acoplamiento de electrones denominado PMS (metosulfato de fenazina). Al igual que el MTT, el MTS se biorreduce por las células en un producto de formazán que es directamente soluble en el medio de cultivo sin procesamiento, a diferencia del MTT. Al final del tratamiento de las células, 40 j l de una solución recién combinada filtrada de 0,22 jm de MTS (20 ml a 2 mg/ml, Ref G1111, Lote 235897, Exp 03/2009, Promega, Charbonniéres, Francia) y En cada pocillo se agregó PMS (1 ml a 0.92 mg/ml, Ref P9625, Lote 065K0961, Sigma) en Solución Salina Tamponada con Fosfato de Dulbecco (DPBS, Ref 17-513Q, Lote 6MB0152, Cambrex). Las placas de cultivo se incubaron durante 2 h a 37 °C. La absorbancia (OD) se midió a 490 nm en cada pocillo utilizando un contador de múltiples etiquetas VICTOR3™ 1420 (Wallac, PerkinElmer, Courtaboeuf, Francia).

4. Presentación de datos

4.1. Determinación de IC50

◦ La inhibición de la respuesta a dosis de la proliferación (IC) se expresó como sigue:

_{IC =}ODpocillos expuestos a fármaco x100

ODpocillos libres de fármaco

Los valores de OD son la media de 4 mediciones experimentales.

◦ IC50: concentración de fármaco para obtener un 50 % de inhibición de la proliferación celular.

Las curvas de respuesta a la dosis se representaron gráficamente utilizando XLFit 3 (IDBS, Reino Unido). Los valores de determinación de IC50 se calcularon utilizando el software XLFit 3 a partir de curvas semilogarítmicas. Se generaron valores de determinación de IC50 individuales, así como valores medios y de DE.

4.2. Índice de resistencia (RI)

El índice de resistencia se calculó utilizando la siguiente fórmula:

RI IC50compuesto a (Estirpe celular resistente)

compuesto

IC50compuesto a (Estirpe celular sensible)

Se calculó el índice de resistencia para cada compuesto para cada par de estirpes celulares sensibles y resistentes. El índice de resistencia individual se calculó cuando se determinaron los valores IC50 de ambas estirpes celulares sensibles y resistentes correspondientes dentro del mismo experimento. Además, también se calculó la relación del índice de resistencia de los valores medios de IC50 obtenidos durante tres experimentos independientes.

5. Resultados

5.1. LTX-302 (compuesto de referencia)

Todas las treinta y siete estirpes celulares tumorales humanas probadas fueron sensibles al compuesto LTX-302 con valores de IC50 que variaban de 4.83 ± 0.96 pM a 20.09 ± 4.07 pM para las estirpes celulares T-47D y Hep G2, respectivamente.

El valor medio de IC50 para el compuesto LTX-302 obtenido en las 37 estirpes celulares tumorales fue 12.05 ± 4.27 pM con un valor mediano de 11.70 pM. El valor medio de IC50 obtenido para la estirpe celular normal (HUV-EC-C) fue más alto que para cualquiera de las estirpes celulares tumorales.

Las estirpes celulares de cáncer de pulmón y hematológico fueron las más sensibles al compuesto LTX-302 (valores de mediana de IC50 7.96 pM (n = 7) y 9.02 pM (n = 3) para las estirpes celulares de cáncer de pulmón y hematológico, respectivamente) mientras que las estirpes celulares de cáncer de hígado fueron las más resistentes (valor mediano de IC5017.84 pM, n = 2).

La actividad del compuesto LTX-302 pareció disminuir ligeramente por la resistencia adquirida hacia la doxorrubicina, como se muestra en los valores de RI de las estirpes celulares HL-60/ADR y MCF-7/mdr (1.31 y 1.23 para estirpes celulares HL-60/ADR y MCF-7/mdr, respectivamente). Por el contrario, la actividad del compuesto LTX-302 pareció incrementarse por la resistencia adquirida hacia el cisplatino, como se exhibe por un valor de RI de 0.33 para la estirpe celular IGROV-1/CDDP.

5.2. LTX-313

Todas las treinta y siete (37) estirpes celulares tumorales humanas probadas fueron sensibles al compuesto LTX-313 con valores de IC50 en el intervalo de 4.01 ± 0.39 pM a 18.49 ± 4.86 pM para las estirpes celulares Rp MI 8226 y U-87 MG, respectivamente.

El valor medio de IC50 para el compuesto LTX-313 obtenido en las 37 estirpes celulares tumorales fue 9.60 ± 3.73 pM con un valor mediano de 8.83 pM. El valor medio de IC50 obtenido para la estirpe celular normal (HUV-EC-C) fue más alto que para cualquiera de las estirpes celulares tumorales.

Las estirpes celulares de cáncer hematológico fueron las más sensibles al compuesto LTX-313 (valor mediano de IC507.04 pM, n = 7) mientras que las estirpes celulares de cáncer de hígado fueron las más resistentes (valor mediano de IC5013.71 pM, n = 2).

La actividad del compuesto LTX-313 no pareció modificarse por la resistencia adquirida hacia la doxorrubicina como se exhibe por los valores de RI de las estirpes celulares c Cr F-CEM/VLB, HL-60/ADR y MCF-7/mdr (0.76, 1.16 y 1.24 para las estirpes celulares CCRFCEM/VLB, HL-60/ADR y MCF-7/mdr, respectivamente). Por el contrario, la actividad del compuesto LTX-313 pareció incrementarse por la resistencia adquirida hacia el cisplatino, como se exhibe por un valor de RI de 0.49 para la estirpe celular Ig Ro V-1/CDDP.

5.3. LTX-315

Todas las treinta estirpes celulares tumorales humanas probadas fueron sensibles al compuesto LTX-315 con valores de IC50 que varían de 1.18 ± 0.25 pM a 7.16 ± 0.99 pM para las estirpes celulares T-47D y SK-OV-3, respectivamente.

El valor medio de IC50 para el compuesto LTX-315 obtenido en las 37 estirpes celulares tumorales fue 3.63 ± 1.45 pM con un valor mediano de 3.27 pM. El valor medio de IC50 obtenido para la estirpe celular normal (HUV-EC-C) fue más alto que para cualquiera de las estirpes celulares tumorales.

Las estirpes celulares de cáncer de mama, hematológico y de pulmón fueron las más sensibles al compuesto LTX-315 (valores medianos de IC502.45 pM (n = 5), 2.60 pM (n = 7) y 2.83 pM (n = 3) para estirpes celulares de cáncer mama, de pulmón y hematológico respectivamente) mientras que las estirpes celulares de cáncer de hígado fueron las más resistentes (valor mediano de IC505.86 pM, n = 2).

La actividad del compuesto LTX-315 parecía estar ligeramente disminuida por la resistencia adquirida hacia la doxorrubicina como se exhibe por los valores de RI de las estirpes celulares HL-60/ADR y MCF-7/mdr (1.45 y 1.12 para las estirpes celulares HL-60/ADR y MCF-7/mdr, respectivamente). Por el contrario, la actividad del compuesto LTX-315 pareció incrementarse por la resistencia adquirida hacia el cisplatino, como se exhibe por un valor de RI de 0.50 para la estirpe celular IGROV-1/CDDP.

5.4. LTX-320

Todas las treinta y siete estirpes celulares tumorales humanas probadas fueron sensibles al compuesto LTX-320 con valores de IC50 que varían de 3.46 ± 0.22 pM a 16.64 ± 3.15 pM para las estirpes celulares T-47D y Hep G2, respectivamente.

El valor medio de IC50 para el compuesto LTX-320 obtenido en las 37 estirpes celulares tumorales fue 7.58 ± 2.79 pM con un valor mediano de 6.92 pM. El valor medio de IC50 obtenido para la estirpe celular normal (HUV-EC-C) fue más alto que para cualquiera de las estirpes celulares tumorales.

Las estirpes celulares de cáncer hematológico, de mama, de riñón y de cerebro fueron las más sensibles al compuesto LTX-320 (valores medianos de IC506.04 pM (n = 7), 6.60 pM (n = 5), 6.60 pM (n = 2) y 6.92 pM (n = 3) para las estirpes celulares de cáncer hematológico, de mama, de riñón y de cerebro respectivamente) mientras que las estirpes celulares de cáncer de hígado fueron las más resistentes (valor mediano de IC5011.46 pM, n = 2).

La actividad del compuesto LTX-320 no pareció modificarse por la resistencia adquirida hacia la doxorrubicina como se exhibe por los valores de RI de las estirpes celulares HL-60/ADR y MCF-7/mdr (0.90 y 1.19 para las estirpes celulares HL-60/ADR y MCF-7/mdr, respectivamente). Por el contrario, la actividad del compuesto LTX-320 pareció incrementarse por la resistencia adquirida hacia el cisplatino, como se exhibe por un valor de RI de 0.49 para la estirpe celular IGROV-1/CDDP.

5.5. LTX-329

Todas las treinta y siete estirpes celulares tumorales humanas probadas fueron sensibles al compuesto LTX-329 con valores de IC50 que varían de 2.43 ± 0.34 pM a 16.90 ± 1.18 mM para las estirpes celulares T-47D y U-87 MG, respectivamente.

El valor medio de IC50 para el compuesto LTX-329 obtenido en las 37 estirpes celulares tumorales fue 8.17± 3.20 pM con un valor mediano de 7.89 pM. El valor medio de IC50 obtenido para la estirpe celular normal (HUV-EC-C) fue más alto que para cualquiera de las estirpes celulares tumorales.

Las estirpes celulares de cáncer de mama y hematológico fueron las más sensibles al compuesto LTX-329 (valores medianos de IC504.92 pM (n = 5) y 5.26 pM (n = 7) para las estirpes celulares de cáncer de mama y hematológico respectivamente) mientras que las estirpes celulares de cáncer de ovario fueron las más resistentes (valor mediano de IC5013.37 pM, n = 4).

La actividad del compuesto LTX-329 no pareció modificarse por la resistencia adquirida hacia la doxorrubicina como se exhibe por los valores de RI de las estirpes celulares ^cC^rF-CEM/VLB, HL-60/ADR y MCF-7/mdr (0.76, 0.80 y 1.07 para las estirpes celulares CCRFCEM/VLB, HL-60/ADR y MCF-7/mdr, respectivamente). Por el contrario, la actividad del compuesto LTX-329 pareció aumentar por la resistencia adquirida hacia el cisplatino, tal como se exhibe por un valor de RI de 0.46 para la estirpe celular IGROV-1/CDDP.

5.6. Comentarios generales

La estirpe celular de cáncer de mama T-47D es la estirpe celular más sensible cualquiera que sea el compuesto LTX probado.

Las estirpes celulares de cáncer hematológico son el tipo histológico más sensible para los cinco compuestos probados, las estirpes celulares de cáncer de hígado y ovario están dentro de las estirpes celulares más resistentes. todos los cinco compuestos probados exhibieron la mayor actividad sobre la estirpe celular IGROV-1/CDDP (resistente a cisplatino) que sobre la estirpe celular de cáncer de ovario IGROV-1 parental. La resistencia a la doxorrubicina pareció disminuir ligeramente la actividad de los compuestos LTX.

El compuesto LTX-315 es el compuesto más potente de los cinco compuestos probados.

6. Conclusiones

> Los cinco compuestos probados (es decir, LTX-302 (compuesto de referencia), LTX-313, LTX-315, LTX-320 y LTX-329) exhibieron actividad citolítica contra 37 estirpes celulares de cáncer humanas probadas con valores de IC50 en rango micromolar a diez micromolares.

> Un compuesto LTX-315 es el compuesto más potente probado con valores de IC50 entre 1 y 5 micromolar sobre todas las 37 estirpes celulares de cáncer humanas probadas.

Ejemplo 2

Estudio de la actividad citotóxica in vitro de 5 compuestos de prueba contra un panel de 10 estirpes celulares de linfoma

1. Objetivo del estudio

• Determinar las concentraciones de cinco compuestos novedosos para obtener un 50 % de inhibición de la proliferación (IC50) contra un panel de 10 estirpes celulares de linfoma.

2. Materiales y métodos

2.1. Sustancias de ensayo

2.1.1. Sustancias de prueba

2.1.2. Control positivo

• Se utilizó Triton X-100 como control positivo y se suministró por Oncodesign (Dijon, Francia) de Sigma (Saint Quentin Fallavier, Francia).

2.1.3. Vehículo de fármaco y condiciones de almacenamiento

2.2. Estirpes celulares tumorales y condiciones de cultivo

2.2.1. Estirpes celulares tumorales

LAs estirpes celulares de cáncer y medios de cultivo fueron adquiridos y proporcionados por Oncodesign. Los detalles de las estirpes celulares se presentan en la Tabla 3 a continuación.

Tabla 3

(continuación)

2.2.2. Condiciones de cultivo

Se cultivaron células tumorales como suspensiones a 37 °C en una atmósfera humidificada (CO2 al 5 %, aire al 95 %). El medio de cultivo para cada estirpe celular se describe en la Tabla 4 a continuación. Para uso experimental, las células se contaron en un hemocitómetro y se evaluó su viabilidad mediante exclusión de azul tripán al 0.25 %.

Tabla 4

La detección de micoplasma se realizó utilizando el Kit de Detección de Micoplasma MycoAlert (RTM) (Lonza) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se encontró que todas las células analizadas fueron negativas para contaminación por micoplasmas.

3. Diseño experimental y tratamientos

3.1. Amplificación y siembra de estirpes celulares

Las células tumorales se sembraron en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos (Nunc, Dutscher, Brumath, Francia) y se incubaron a 37 °C durante 24 horas antes del tratamiento en 190 pl de medio de cultivo libre de fármaco y libre de FBS.

Las densidades de implantación para cada estirpe celular se resumen en la Tabla 5 a continuación: 3.2. Determinación de IC50

Tabla 5

3.2 Determinación de IC50

Las células tumorales se incubaron durante 4 horas con 10 concentraciones de compuestos en % de etapa de dilución ' con una dosis máxima de 400 pM (rango 4X 10-4 a 4 X 10-10 M), con Triton X-100 al 1% (concentración final) como control positivo y medio de cultivo libre de FBS como control negativo. Las células (190 pl) se incubaron en un volumen final de 200 pl de medio de cultivo libre de FBS que contenía sustancias de ensayo a 37 °C bajo CO2 al 5 %.

Se realizaron tres experimentos independientes, cada concentración se emitió por cuadriplicado. Las células de control se trataron solo con vehículo. Al final de los tratamientos, se evaluó la actividad citotóxica mediante un ensayo MTS (véase el § 3.3 a continuación)

Las diluciones del compuesto probado así como la distribución a placas que contenían células se realizaron utilizando un sistema de manipulación de líquidos Sciclone ALH 3000 (Caliper Life Sciences SA). De acuerdo con el uso automatizado, se probó un solo rango de concentraciones independientemente de las estirpes celulares que se van a probar. El rango no se adaptó para cada estirpe celular.

3.3. Ensayo MTS

La actividad citotóxica in vitro de la sustancia de prueba se reveló mediante un ensayo MTS (Baltorp et al.) utilizando un compuesto de tetrazolio novedoso (MTS, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio) y un reactivo de acoplamiento de electrones denominado PMS (metosulfato de fenazina). Al igual que el MTT, el MTS se biorreduce por las células en un producto de formazán que es directamente soluble en el medio de cultivo sin procesamiento, a diferencia del MTT.

Al final del tratamiento de las células, 40 pl de una solución recién combinada filtrada de 0.22 pm de MTS (20 ml a 2 mg/ml, Ref G1111, Lote 235897, Exp 03/2009, Promega, Charbonniéres, Francia) y en cada pocillo se agregaron PMS (1 ml a 0.92 mg/ml, Ref P9625, Lote 065K0961, Sigma) en Solución Salina Tamponada con Fosfato de Dulbecco (DPBS, Ref 17-513Q, Lote 6MB0152, Cambrex). Las placas de cultivo se incubaron durante 2 h a 37 °C. La absorbancia (OD) se midió a 490 nm en cada pocillo utilizando un contador de múltiples etiquetas VICTOR3™ 1420 (Wallac, PerkinElmer, Courtaboeuf, Francia).

4. Presentación de datos

4.1. Los datos de IC50 se determinaron como en el Ejemplo 1.

5. Resultados

5.1. LTX-302 (compuesto de referencia)

Todas las diez estirpes celulares de linfoma humano probadas fueron sensibles al compuesto LTX-302 con valores de IC50 que varían de 5.30 ± 2.02 pM a 12.54 ± 3.52 pM para las estirpes celulares U-937 y Raji, respectivamente. El valor medio de IC50 para el compuesto LTX-302 obtenido en 10 estirpes celulares sensibles fue 8.11 ± 2.44 pM con un valor mediano de 7.53 pM.

5.2. LTX-313

Todas las diez estirpes celulares de linfoma humano probadas fueron sensibles al compuesto LTX-313 con valores de IC50 que variaban de 3.21 ± 2.81 pM a 16.08 ± 4.86 pM para las estirpes celulares Ramos y Raji, respectivamente.

El valor medio de IC50 para el compuesto LTX-313 obtenido en 10 estirpes celulares sensibles fue 7.05 ± 3.91 pM con un valor mediano de 5.89 pM.

5.3. LTX-315

Todas las diez estirpes celulares de linterna humano probadas fueron sensibles al compuesto LTX-315 con valores de IC50 que oscilan entre 1.15 ± 0.42 mM y 4.93 ± 1.03 pM para las estirpes celulares U-937 y Raji, respectivamente. El valor medio de IC50 para el compuesto LTX-315 obtenido en 10 estirpes celulares sensibles fue 3.01 ± 1.36 pM con un valor mediano de 2.93 pM.

5.4. LTX-320

Todas las diez estirpes celulares de linterna humano probadas fueron sensibles al compuesto LTX-320 con valores de IC50 que variaban de 2.22 ± NA pM a 11.26 ± 3.42 pM para las estirpes celulares Hs 445 y Raji, respectivamente. El valor medio de IC50 para el compuesto LTX-320 obtenido en 10 estirpes celulares sensibles fue 5.03 ± 2.82 pM con un valor mediano de 4.84 pM.

5.5. LTX-329

Todas las diez estirpes celulares de linfoma humano probadas fueron sensibles al compuesto LTX-329 con valores de IC50 que varían de 2.46 ± NA pM a 8.70 ± 1.70 pM para las estirpes celulares Hs 445 y Raji, respectivamente. El valor medio de IC50 para el compuesto LTX-329 obtenido en 10 estirpes celulares sensibles fue 5.76 ± 2.27 pM con un valor mediano de 5.72 pM.

5.6. Comentarios generales

Las estirpes celulares KARPAS-299 y Raji son las estirpes celulares más resistentes cualquiera que sea el compuesto LTX probado.

Las estirpes celulares Hs 445, Ramos y U-937 son las estirpes celulares más sensibles cualquiera que sea el compuesto LTX probado.

6. Conclusiones

> Todos los cinco compuestos probados (es decir, LTX-302 (compuesto de referencia), LTX-313, LTX-315, LTX-320 y LTX-329) exhibieron actividad citolítica contra las 10 estirpes celulares de linfoma humano probadas con valores de IC50 en rango micromolar.

> El compuesto LTX-315 es el compuesto más potente probado con valores de IC50 entre 1 y 5 micromolar en las 10 estirpes celulares de linfoma humano probadas.

Ejemplo 3

Actividad hemolítica in vitro

Principio de prueba

Se midió la actividad hemolítica del péptido LTX-315 contra los glóbulos rojos humanos.

Materiales y métodos

La sangre humana recién recolectada se centrifugó a 1500 rpm durante 10 minutos para aislar los glóbulos rojos. Los glóbulos rojos (RBC) se lavaron tres veces con PBS [tampón fosfato 35 mM con NaCl 150 mM, pH 7.4] mediante centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos y se ajustaron a un hematocrito al 10% con PBS. Se agregaron soluciones de LTX-315 para dar un rango de concentración final del péptido de 1200 pg/ml a 1 pg/ml y una concentración de RBC del 1 %. La suspensión resultante se incubó con agitación durante una hora a 37 °C. Después de la incubación, la suspensión se centrifugó a 4000 rpm durante 5 minutos y se monitorizó la hemoglobina liberada al medir la absorbancia del sobrenadante a 405 nm. Se utilizó PBS como control negativo y se asumió que no probocaba hemólisis. Se utilizó Triton al 0.1% como control positivo y se asumió que probocaba una hemólisis completa.

Sustancia de prueba: LTX-315

Sustancias de referencia: PBS (control negativo) y Tritón X-100 (control positivo). Componentes de las mezclas de reacción: LTX-315, Triton X-100 al 10%, PBS y RBC (hematocrito al 10%). Los detalles con respecto a estas sustancias se presentan en la Tabla 6 a continuación.

Tabla 6

Método de evaluación:

Se monitorizó la hemoglobina liberada al medir la absorbancia del sobrenadante a 405 nm, y se calculó el porcentaje de hemólisis mediante la ecuación:

% de hemólisis = [(A405 LTX-315 - A405 PBS)/(A405 Triton X-100 al 0.1% - A405 PBS)] x 100

La concentración de LTX-315 correspondiente al 50 % de hemólisis (EC50) se determinó a partir de una curva de respuesta a dosis.

Resultados

El valor medio de cinco experimentos diferentes con desviación estándar se presenta en la Tabla 7 a continuación.

Tabla 7

Los datos también se representan en la Figura 1. La Figura 1 muestra que LTX-315 tiene un valor medio de EC50 superior a 1200 jg/ml (833 j M).

Ejemplo 4

Efectos farmacodinámicos relativos a los tumores de linfoma de células B A20 de murino en ratones

Principio de prueba

El objetivo del estudio fue investigar el efecto de LTX-315 a diferentes niveles de dosis sobre un linfoma de células B A20 murino en ratones.

Materiales y métodos

La administración se realizó mediante inyección intratumoral de LTX-315 disuelto en solución salina estéril.

Se inocularon ratones hembra por vía subcutánea en el abdomen con 5 millones de células A20 de murino (ATCC, LGC Promochem AB, Middlesex, Inglaterra) en un volumen de 50 jl. Los ratones se dividieron en cuatro grupos (véase Tabla 8 a continuación para obtener detalles). El tratamiento intratumoral se inició cuando los tumores habían alcanzado el tamaño deseado de aproximadamente 5 mm de diámetro (mínimo de 20 mm2).

Se investigaron tres niveles de dosis de LTX-315, 1 mg (Grupo 1), 0.5 mg (Grupo 2) y 0.25 mg (Grupo 3) por inyección. El volumen fue de 50 |jl para todas las inyecciones. Se disolvió LTX-315 en una solución acuosa estéril de NaCI al 0.9%. Este vehículo se utilizó como control (Grupo 4). Los cuatro grupos recibieron tres inyecciones.

Los ratones se monitorizaron durante el estudio al medir los tumores y pesar a los animales con regularidad. Se siguió a los ratones hasta que se alcanzó la carga tumoral máxima de 125 mm2, o hasta que se produjeron acontecimientos adversos graves (es decir, formación de heridas tras tratamientos repetidos durante el período de seguimiento), luego se sacrificaron los ratones. Se utilizó un calibre para medir el tamaño del tumor y se utilizaron el pesaje y el examen físico como control de salud.

Animales: Ratones Balb/c hembra libres de patógenos específicos, de 6 a 8 semanas de edad, suministrados de Harlan (Inglaterra, Reino Unido).

Acondicionamiento de los animales: Los animales se mantuvieron con comida de laboratorio estándar y agua.

El peso corporal medio, la dosis, la ruta y el programa de tratamiento se dan en la Tabla 8 a continuación.

Tabla 8

Resultados:

El efecto antitumoral de los diversos tratamientos se presenta como tamaño de tumor medio en la Tabla 9 a continuación.

Tabla 9

El grado de respuesta tumoral en los diferentes grupos de tratamiento se resume en la Tabla 10 a continuación.

Tabla 10

Discusión/Conclusiones

En el Grupo 3, al recibir la dosis más baja de LTX-315 (0.25 mg/dosis), se observa un pequeño efecto inhibidor durante los primeros días. En el Grupo 1 y el Grupo 2, que recibieron dosis de LTX-315 de 1.0 mg/dosis y 0.5 mg/dosis respectivamente, todos los animales mostraron una respuesta tumoral parcial o completa. Se encontró que la actividad antitumoral dio como resultado una respuesta tumoral completa en 3 de 7 ratones tratados para el Grupo que recibió la dosis óptima (Grupo 1).

Se observó una necrosis generalmente más fuerte y más formación de heridas en el Grupo 1 en comparación con los otros dos grupos. Excepto por la formación de la herida, no se observaron otros eventos adversos o efectos tóxicos en ninguno de los grupos de animales.

Tanto 1 mg como 0.5 mg de LTX-315 demostraron un efecto antitumoral fuerte y rápido en el primer período del estudio. Sin embargo, a medida que avanza el estudio, más animales en el Grupo 2 recaen que en el Grupo 1. Ejemplo 5

El efecto de LTX-315 sobre tumores de carcinoma de colon CT26WT de murino en ratones

Materiales y métodos

La administración se realiza mediante inyección intratumoral de LTX-315 disuelto en solución salina estéril (NaCl al 0. 9% en agua estéril).

Se inoculó cada uno de un total de 40 ratones hembra con cinco millones de células CT26WT de murino (ATCC, LGC Promochem AB, Boras, Suecia) por vía subcutánea sobre la superficie del abdomen en un volumen de 50 pl. Los ratones se dividieron en cinco grupos, 8 ratones en cada grupo. Cuando los tumores alcanzaron el tamaño deseado de 20 mm2 se inició el tratamiento mediante inyección intratumoral. El grupo uno se trató únicamente el día 1, el grupo dos el día 1 y 2, el grupo tres el día 1 y 3 y el grupo cuatro el día 1, 2 y 3. Todos los tratamientos diarios fueron una sola inyección de 1.0 mg de LTX-315 disuelto en 50 pl (20 mg/ml). El grupo cinco se trató con 50 pl de vehículo para LTX-315 (Grupo 5).

Los ratones se monitorizaron durante el estudio al medir los tumores (calibre digital) y pesar los animales con regularidad. Se siguió a los ratones hasta que se alcanzó la carga tumoral máxima de 125 mm2, o hasta que se produjeron acontecimientos adversos graves (es decir, formación de heridas debido a inyecciones repetidas), luego se sacrificaron los ratones. El pesaje y el examen físico se utilizaron como controles sanitarios.

Animales: ratones Balb/c hembra libres de patógenos específicos, de 6 a 8 semanas de edad, suministrados de Harlan (Inglaterra, Reino Unido)

Acondicionamiento de animales: condiciones estándar de instalaciones para animales. El peso corporal medio, la dosis, la vía y el programa de tratamiento se dan en la Tabla 11 a continuación.

Tabla 11

Resultados

El efecto antitumoral de los diversos tratamientos se presenta como tamaño medio del tumor en la Tabla 12 a continuación.

Tabla 12

Se observó una respuesta tumoral completa en la gran mayoría de todos los animales tratados con LTX-315. El grado de respuesta tumoral en los diferentes grupos de tratamiento se resume en la Tabla 13 a continuación.

Tabla 13

Discusión/Conclusiones

El tratamiento se inició cuando los tumores habían alcanzado el tamaño deseado de un mínimo de 20 mm2 y los animales se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron la carga tumoral máxima de 125 mm2.

El final del estudio se definió como el día 17 cuando se sacrificaron seis de los ocho animales de control (Grupo 5). Todos los regímenes de tratamiento con LTX-315 dieron como resultado un fuerte efecto anti-tumor CT26WT.

Se observó un total de 27 de los 32 animales tratados con una respuesta tumoral completa y cuatro con una respuesta parcial. Solo un animal (en el Grupo 3) no respondió al tratamiento. Los resultados presentados muestran que los cuatro grupos tratados tienen una respuesta tumoral general muy similar, los datos también indican que el grado de recaída del tumor fue mayor en el Grupo 2 que en los Grupos 1, 3 y 4. Además, se observó que menos animales estaban libres del tumor al final del seguimiento en el Grupo 2 (figura 2).

Se observó necrosis y respuesta tumoral completa en todos los grupos tratados. En el Grupo 1, cuatro de ocho animales, en el Grupo 2 dos de ocho animales, en el Grupo 3 cinco de ocho animales y en el Grupo 4 cinco de ocho animales mostraron una respuesta tumoral completa. En esta etapa, el tumor estaba completamente necrótico y se formó una costra en la ubicación del tumor.

Se observó necrosis en el sitio del tumor en todos los grupos de tratamiento. Generalmente, los animales del Grupo 2, 3 y 4 mostraron más necrosis, formación de heridas y costras que los animales del Grupo 1 que recibieron solo una inyección de LTX-315. Los animales del Grupo 4, que recibieron tres inyecciones, mostraron la mayor necrosis, formación de heridas y costras. La diferencia de necrosis entre el Grupo 1 y el Grupo 4 fue bastante grande, pero los animales que recibieron el mayor número de tratamientos parecieron adaptarse bien. No se observaron efectos tóxicos u otros efectos adversos además del tejido necrótico local y la formación de heridas en ninguno de los grupos de animales tratados.

Los cuatro regímenes de tratamiento de LTX-315 probados demostraron un fuerte efecto antitumoral contra tumores CT26WT de murino.

La cantidad de necrosis, formación de heridas y costras fue proporcional al número de tratamientos con LTX-315 proporcionados.

Ejemplo 6

Actividad de LTX-315 contra células de cáncer sensibles y multirresistentes y células humanas normales

Las características de las estirpes celulares probadas se presentan en la Tabla 14 a continuación.

Tabla 14

Los datos anteriores muestran el amplio espectro de actividad de LTX-315 contra varias estirpes celulares de cáncer y, significativamente, un efecto citotóxico mucho más débil sobre células humanas normales.

Ejemplo 7

Reexposición con linfoma de células B A20 murino y células de carcinoma de colon CT26WT de murino en ratones con regresión tumoral completa.

Este estudio buscó investigar los efectos del crecimiento tumoral en animales que habían mostrado previamente una regresión tumoral completa después del tratamiento con LTX-315.

Métodos: ratones Balb-c hembra (n = 4), previamente tratados con LTX-315, 1 mg) o (n = 9); tratados previamente con LTX-3150.5 o 1 mg) se volvieron a inocular (s.c. en el área abdominal) con células de linfoma de células B A20 o células de carcinoma de colon CT26WT de murino (5 millones) respectivamente 6 semanas después del tratamiento inicial con LTX-315. Se monitorizó el crecimiento del tumor durante hasta 36 días después de la reinoculación.

Se observó una inhibición significativa (P <0.006) del crecimiento tumoral en los 4 ratones tratados previamente con LTX-315 (1 mg) en el estudio R315-03 en comparación con los animales de control (Figura 2) y mientras se observó recaída en 1 animal., 3 semanas después, se observó una regresión tumoral completa en los otros 3 ratones (Figura 3).

En 9 ratones tratados previamente con LTX-315 (0.5 o 1 mg) se observó inhibición (P < 0.01) del crecimiento tumoral en comparación con los animales de control (Figura 3). La caída repentina del tamaño del tumor en la Figura 20, después del Día 18, se explica por la muerte de 6 animales que portaban tumores grandes. Se observó inhibición en 7 ratones y regresión completa en 2 de los animales (Figura 5).

Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la regresión tumoral completa después del tratamiento inicial de tumores sólidos de murino (linfoma de células B A20 murino o carcinoma de colon CT26WT) con LTX-315 dio como resultado una forma de protección endógena a largo plazo contra el crecimiento de los mismos tumores después de la reinoculación. La inhibición del crecimiento tumoral fue más pronunciada en animales que llevaban tumores de linfoma de células B A20 en comparación con animales que llevaban tumores de colon CT26WT.

Ejemplo 8

Efectos inmunológicos de LTX-315 en un modelo de linfoma de células B A20 murino. Un estudio piloto de transferencia de células de bazo adoptivo in vivo.

Este estudio se llevó a cabo para investigar si la protección a largo plazo contra el crecimiento de los mismos tumores después de la reinoculación en animales observada en el estudio R315-33 podría transferirse pasivamente a receptores neófitos a través de células de bazo tomadas de animales donantes tratados con LTX-315.

Se inocularon diez ratones Balb/c hembra (n = 32) cada uno con células A20 (5 millones en 50 pl s.c.) sobre la superficie abdominal. Una vez que los tumores alcanzaron los 20 mm2, se les inyectó LTX-315 (1 mg) por vía intratumoral, una vez al día durante 3 días, en un volumen de 50 pl. Posteriormente se monitorizó el tamaño del tumor (mm2) y el peso corporal y se proporcionó una inyección adicional de LTX-315 si se observaba algún nuevo crecimiento del tumor. Posteriormente, los ratones que mostraban una regresión tumoral completa se sacrificaron y se utilizaron como donantes para la transferencia de esplenocitos, mientras que se utilizaron ratones donantes neófitos como controles. Se estirparon los bazos de ratones donantes y células aisladas. Se irradiaron ratones receptores neófitos y se dividieron en 2 grupos. El Grupo 1 recibió esplenocitos aislados de ratones curados, mientras que el grupo 2 recibió esplenocitos aislados de ratones neófitos. Se inyectaron células recién preparadas (20 x 106 por 100 |jl) a través de la vena de la cola. Veinticuatro horas después, se inocularon los ratones receptores con 5 millones de células de linfoma de células B A20 de murino sobre la superficie abdominal como se describió anteriormente. El tamaño del tumor y el peso corporal se monitorizaron hasta que se alcanzó la carga tumoral máxima de ~125 mm2 o se produjeron acontecimientos adversos graves (es decir, formación de heridas debido a la necrosis del tejido tumoral), momento en el que se sacrificaron los ratones.

Se observó inhibición del crecimiento tumoral en ratones irradiados que recibieron esplenocitos aislados de animales que habían mostrado una regresión tumoral completa después del tratamiento con LTX-315 en comparación con animales de control que recibieron esplenocitos de donantes neófitos (Figura 6). También se observó que había una diferencia en el color y la textura de los tumores en los receptores de esplenocitos de los ratones tratados con LTX-315, lo que sugiere una respuesta inflamatoria inmediata.

En base a estas observaciones, los datos proporcionan evidencia de una respuesta inmunitaria adaptativa en los animales que recibieron esplenocitos de animales que previamente mostraron una regresión completa de los tumores de linfoma A20-B después del tratamiento con LTX-315. Estos datos sugieren que el tratamiento con LTX-315 puede conferir protección a largo plazo contra tumores específicos al provocar una respuesta inmunitaria.

Ejemplo 9

El objetivo del estudio fue investigar el efecto contra el cáncer de la vacunación profiláctica con células de linfoma A20 lisadas con 10 mg/ml de LTX-315:

(i) solo; y

(ii) en combinación con 20 mg/ml de LTX-315 inyectados en el sitio de vacunación antes de la vacuna.

En total, se utilizaron dos regímenes de tratamiento diferentes.

La administración se realizó mediante inyección subcutánea de LTX-315 disuelto en medio de crecimiento que contenía células de linfoma A20. El “cóctel” de células-LTX-315 se dejó durante 30 minutos antes de la inyección para asegurar la lisis completa de las células de cáncer.

Se inyectaron ratones del Grupo 1 (“vacuna”) por vía subcutánea sobre la superficie del abdomen con 50 j l de un “cóctel” de diez millones de células A20 de murino (ATCC, LGC Promochem AB, Boras, Suecia) y 10 mg/ml de LTX-315 (“lisado A20”). Los ratones del Grupo 2 (“vacuna adyuvante”) se trataron como en el Grupo 1, pero además se les administraron 25 j l de LTX-315 20 mg/ml por vía subcutánea en el sitio de vacunación 5 minutos antes de la inyección del lisado A20. Los ratones del Grupo 3 (“control”) no recibieron tratamiento.

Seis semanas después del tratamiento, todos los ratones se inocularon con 5 millones de células de linfoma de células B A20 viables por vía subcutánea sobre la superficie del abdomen en un volumen de 50 jl.

Los ratones se monitorizaron durante el estudio al medir el tamaño del tumor y pesar a los animales con regularidad. Se siguió a los ratones hasta que se alcanzó la carga tumoral máxima de -130 mm2, momento en el que se sacrificaron los ratones.

Materiales y métodos

Animales: Ratones Balb/c hembra libres de patógenos específicos, de 6 a 8 semanas de edad, suministrados por Harlan Laboratories (Inglaterra, Reino Unido; www.harlan.com).

Acondicionamiento de animales: Condiciones estándar de instalaciones para animales en la Universidad de Troms0. Sustancia de prueba: solo células A20 de murino lisadas con LTX-315 (lote 1013687) y LTX-315 (lote 1013687) Preparación de la sustancia de prueba: se agregaron 10 x 106 células A20 a 50 j l de 10 mg/ml de LTX-315/vehículo (“lisado de A20 “). La sustancia de prueba estaba lista para uso 30 minutos después de la mezcla. LTX-315 solo se disolvió en NaCl al 0.9% en H2O estéril Vehículo: RPMI-1640 con L-glutamina 2 mM o NaCl al 0.9% en H2O estéril Sustancias de referencia: No se aplica

Tratamiento de los controles: No se aplica

Método de evaluación: Mediciones del tamaño del tumor y control de la salud mediante pesaje y examen Datos adicionales sobre el método: Se utilizó un calibre digital para medir el tamaño del tumor y el pesaje y el examen físico se utilizaron como control de salud

El peso corporal medio, dosis, ruta y programa de tratamiento se muestran en la Tabla 15 (a continuación).

Tabla 15

Resultados:

El efecto contra el cáncer de los diversos tratamientos se presenta como tamaño medio del tumor en la Tabla 16 a continuación y se proporciona una presentación gráfica de los datos en la Figura 7. En la Tabla 16, el Día 1 fue el día de inoculación de células A20 viables seis semanas después de la vacunación.

Tabla 16

Discusión/Conclusiones:

La inoculación de células viables de linfoma de células B A20 se logró 6 semanas después de que se administró el tratamiento (día 1) y los animales se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron la carga tumoral máxima permitida de -130 mm2

Los resultados muestran que los tumores se desarrollaron más lentamente en ambos Grupos de tratamiento con lisado de LTX-315/A20 en comparación con el Grupo de control. La mediana de supervivencia del Grupo 1 fue de 28 días, 33 días para el Grupo 2 y 25 días para el grupo de control (Grupo 3). El aumento de la mediana de supervivencia fue del 12% para el Grupo 1 y del 35% para el Grupo 2 en comparación con el grupo de control (Grupo 3).

Los datos indican una supervivencia prolongada de los grupos tratados en comparación con el grupo de control no tratado. El día 34, cuando se sacrificó el último animal del grupo de control, el 50 % de los animales del Grupo 2 seguían vivos mientras que el 37.5 % de los animales del Grupo 1 seguían vivos. El final del estudio se definió como el día 60. En este punto de tiempo, un total de 3 de los 16 animales tratados tuvieron una regresión completa de un tumor en desarrollo inicial y estaban libres de tumor. Al final del estudio, se observó que el 25 % de los animales del Grupo 1 y el 12.5 % de los animales del Grupo 2 estaban libres de tumores.

Macroscópicamente hubo diferencias morfológicas entre los grupos tratados (Grupo 1 y 2) en comparación con el grupo de control no tratado (Grupo 3). Se observó que los tumores en desarrollo en los dos grupos de tratamiento eran más blancos y más duros que los tumores observados en el grupo de control. Este hallazgo, junto con la tasa de crecimiento más lenta de los tumores, indica que se indujo una respuesta inmunitaria de células anti-A20 mediante la vacunación con el cóctel de LTX-315 y células A20 lisadas.

Por tanto, LTX-315 puede tener un uso doble al lisar las células tumorales e inducir la liberación de señales de peligro de las células normales en el sitio de la inyección.

Ejemplo 10

En este estudio, investigamos el efecto tumoricida de LTX-315 sobre células de melanoma humano. El péptido se internalizó y se mostró en asociación con las mitocondrias, lo que finalmente condujo a una muerte celular lítica. El péptido LTX-315 fue diseñado para tratar tumores sólidos con inyecciones intratumorales a través de un modo de acción de dos fases: la primera es el colapso del tumor en sí, mientras que la segunda son las moléculas de patrón molecular asociadas al daño (DAMP) liberadas de la célula tumoral moribunda, que puede inducir una protección inmunitaria posterior contra las recurrencias y la metástasis.

Material y métodos

Reactivos

LTX-315 y LTX-328 (K-A-Q-Dip-Q-K-Q-A-W-NH2) se elaboraron a pedido por Bachem AG (Bubendorf, Suiza) e Innovagen (Lund, Suecia), respectivamente. Pacific Blue LTX-315 y Pacific Blue LTX-328 se compraron a pedido de Innovagen (Lund, Suecia) Norud (Troms0, Noruega), respectivamente.

Cultivo de células

La estirpe celular A375 (ECACC, 88113005) es un melanoma maligno humano derivado del material del paciente y se adquirió de Public Health Inglaterra (PHE Culture Collections, Porton Down, Salisbury, Reino Unido). Las células se mantuvieron como cultivos en monocapa en DMEM con alto contenido de glucosa al 4.5 % suplementado con FBS al 10 % y L-glutamina al 1%, pero no como antibióticos (medio completo). La estirpe celular se cultivó en una atmósfera humidificada de CO2 al 5 % a 37 °C y se probó regularmente la presencia de micoplasma con MycoAlert (Lonza).

Citotoxicidad in vitro, ensayo MTT

El efecto citotóxico de LTX-315 se investigó utilizando el ensayo de viabilidad colorimétrico de MTT como se describe en Eliassen et al. (2002), 22(5): pp2703-10. Las células A375 se sembraron a una concentración de 1 x 105 células/ml en un volumen de 0.1 ml en placas de 96 pocillos y se dejaron adherir en un medio de crecimiento completo durante la noche. A continuación, se retiró el medio y las células se lavaron dos veces en medio RPMI-1650 sin suero, antes de agregar LTX-315 disuelto en RPMI libre de suero a concentraciones que variaban entre 2.5 y 300 |jg/ml, y se incubaron durante 5 a 180 minutos. Las células tratadas con un RPMI libre de suero se utilizaron como células de control negativo, mientras que las células tratadas con Triton X-100 al 1% en medio libre de suero se utilizaron como control positivo. Los resultados finales se calcularon utilizando la media de tres experimentos, cada uno con pocillos por triplicado.

Microscopia confocal

Formación de imágenes de células vivas con células no marcadas: se sembraron células A375 a 10.000 células/pocillo en un medio completo en vidrio recubierto con cámara de 8 pocillos Nunc Lab-Tec (Sigma) prerrecubierto con 25 jg/ml de fibronectina humana (Sigma) que se deja adherir durante la noche. Las células se lavaron dos veces con un RPMI libre de suero, se trataron con péptido disuelto en RPMI y se investigaron utilizando Bright en un microscopio confocal Leica TCS SP5, con un objetivo de 63X/1.2W. El microscopio se equipó con una cámara de incubación con CO2 y control de temperatura.

Células fijadas, Mitotracker: las células se sembraron como para la formación de imágenes de células vivas y se trataron con Mitotracker CMH2XROS (Invitrogen) a 100 nm durante 15 minutos antes del tratamiento con péptidos. Las células se trataron con LTX-31517 jM , solo con RPMI libre de suero de control negativo. Después de 60 min de incubación, las células se analizaron utilizando un microscopio Zeiss. Todos los experimentos de imágenes confocales se realizaron posteriormente al menos dos veces con resultados similares.

Células fijadas, péptido marcado con fluorescencia - Se sembraron células A375 subconfluentes a 8.000 células/pocillo como anteriormente, y se transfectaron el segundo día utilizando Lipofectamine LTX con reactivos de transfección Plus (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante. Las mitocondrias se marcaron utilizando el pDsRed2-Mito, y el núcleo se marcó utilizando el plásmido GFP-Histon2B (Imaging Platform, Universidad de Troms0). Un día después de la transfección, las células se lavaron dos veces con RPMI libre de suero y se trataron a diferentes concentraciones y períodos de incubación con Pacific Blue LTX-315 o Pacific Blue LTX-328. LTX-315 PB exhibió un perfil citotóxico similar al LTX-315 no marcado según se determinó mediante ensayo MTT. Las células de control solo se trataron con LTX-315 sin marcar y también con RPMI libre de suero. Después de incubación, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS, y los pocillos se cubrieron con antidesvanecimiento Prolong Gold (Invitrogen). Las células se analizaron adicionalmente mediante el uso de un microscopio confocal Leica TCS SP5, con un objetivo de 693, 1.2 W. Pacific Blue, GFP y Red Ds se excitaron utilizando UV, con láseres 488 y 561, y los canales de fluorescencia se detectaron secuencialmente utilizando los siguientes pases de banda: UV: 420-480 nm (con atenuación), 488: 501-550 nm y 561: 576- 676 nm.

Microscopía electrónica TEM

Se sembraron células A375 a 1 x 105 células por pocillo en placas de 6 pocillos y se dejaron crecer durante tres días para optimizar las estructuras de membrana en el cultivo, y el medio se cambió el segundo día. Las células se lavaron dos veces en RPMI libre de suero antes de ser tratadas con LTX-315 disuelto en RPMI libre de suero a 5, 10 y 25 mg/ml, con RPMI libre de suero como control negativo. Después, las células se lavaron con PBS dos veces antes de la fijación durante 24 horas a 4 °C con formaldehído al 4% y gluteralaldehído al 1% en un tampón Hepes a pH 7.8. Los protocolos de deshidratación y posfijación incluyeron la incubación en un ácido tánico tamponado al 5 % y la incubación en un ferrocianuro reducido en osmio al 1%. Se prepararon secciones ultrafinas y se utilizaron acetato de uranilo (5 %) y citrato de plomo de Reynolds para teñir y contrastar. Las muestras se examinaron sobre un microscopio electrónico de transmisión JEOL JEM-1010, y las imágenes se tomaron con una cámara CCD TEM de montaje lateral Olympus Morada (Olympus soft Imaging Solutions, GmbH, Alemania).

Medición de fluorescencia de especies reactivas de oxígeno (ROS)

Se adquirió un kit de ensayo de detección de especies de oxígeno reactivo celular DCFDA de abcam®, y se sembraron células A375 en una placa de fondo transparente negra Costar de 96 pocillos con 20.000 células por pocillo incubadas a 37 °C 16 horas antes del ensayo DCFDA. Las células se lavaron con 100 pl/pocillo de PBS precalentado una vez y se incubaron con 20 xM de DCFDA en una solución tampón suministrada con el kit a 37 °C en una incubadora de cultivo celular durante 45 min y luego se lavaron nuevamente con una solución tampón de 100 pL/pocillo. A continuación, las células se estimularon con un péptido LTX-315 de 100 pl/pocillo disuelto en una solución tampón a concentraciones de 17 mM durante 30 min, y las células no tratadas se utilizaron como control negativo. La intensidad de la fluorescencia se determinó a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm sobre un lector de placas FLUOstar Galaxy.

Liberación de caja de grupo de alta movilidad-1 (HMGB1)

Se sembraron células A375 con 3x 105 células/pocillo en placas de 6 pocillos en un medio completo y se dejaron adherir durante la noche. Las células se trataron con LTX-315 o LTX-328 a 35 pM y se incubaron a 37 °C y CO2 al 5 % para diferentes puntos de tiempo (5, 10, 15, 30, 60 min), y los controles negativos fueron RPMI-1650 libre de suero. Los sobrenadantes (S) se recolectaron y centrifugaron a 1,400 g durante cinco minutos, y los lisados celulares (L) se recolectaron después de lavar con PBS dos veces y luego se lisaron posteriormente utilizando un tampón de Muestra 4X (Invitrogen, número), DTT 0.1 M (número Sigma) y agua. Los sobrenadantes se concentraron utilizando filtros centrífugos Amicon Ultra 50K (Millipore UFC505024) y el lisado celular se sonicó. Tanto los sobrenadantes como el lisado se hirvieron y se resolvieron en una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 10 % (SDS-PAGE), y luego se transfirieron eléctricamente a una membrana de difluoruro de polivindilina (PVDF) (Millipore). La membrana se bloqueó en leche al 5 % y se incubó con el anticuerpo HMGB1 (conejo, policlonal, abcam ab 18256); A continuación, la membrana se enjuagó varias veces con TBST, se incubó con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (abcam ab6721), se enjuagó nuevamente con TBST y luego se desarrolló utilizando el reactivo WB Luminol (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemania).

Liberación de citocromo-C

Se sembraron células A375 como en los estudios de HMGB1 y se trataron con 35 pM para diferentes puntos de tiempo (5, 15, 45). Los sobrenadantes se recolectaron y concentraron como en los estudios de HMGB1, y las muestras de los sobrenadantes se analizaron utilizando un kit Cytochrome C-Elisa de forma sólida de 4.5 horas (R&D Systems, EE.UU., #DCTC0) siguiendo la descripción del fabricante. Poco después, se analizó una muestra diluida al 50 % y se determinó la densidad óptica utilizando un lector de microplacas ajustado a 450 nm, y esta lectura se restó luego de la lectura a 540 nm. Se generó una curva estándar para cada conjunto de muestras probadas. Las muestras se procesaron en cuatro paralelos, y el citocromo-c liberado en el sobrenadante se expresó como un pliegue sobre el nivel de citocromo-c en el sobrenadante de células no tratadas.

Liberación de ATP

El sobrenadante de las células A375 tratadas con LTX-315 se analizó utilizando un kit de ensayo de luciferasa ATP Enliten (Promega, EE.UU.). Luego, las células se sembraron como con un ensayo ROS y se trataron con LTX-315 en diferentes tiempos de incubación, de 1 a 15 minutos con dos paralelos, que luego se realizó tres veces. Los controles negativos fueron células A375 sin tratar expuestas a solo medio libre de suero. Las muestras se diluyeron a 1:50 y 1: 100 y se analizaron con un luminómetro Luminoscan RT de acuerdo con el protocolo del fabricante. Análisis estadístico

Todos los datos representan al menos dos experimentos independientes con al menos dos paralelos, que se expresaron como la media de ± DE. Los datos de liberación de citocromo C y liberación de ATP se compararon utilizando ANOVA de una vía y una prueba de comparación múltiple, y se consideró que el valor de P <0.05 indicaba significación estadística.

Resultados

Efecto citotóxico de LTX-315 sobre células de melanoma

Para investigar el efecto de LTX-315 sobre células de melanoma A735 in vitro, determinamos los valores de IC-50 para el péptido mediante un ensayo de viabilidad celular MTT en diferentes tiempos de incubación. El valor de IC-50 fue 30 pM después de solo cinco minutos de incubación y progresó a 14 pM después de 90 minutos. Una incubación adicional de hasta 180 minutos no ofreció ningún efecto adicional (Figura 8).

El tratamiento con LTX-315 provoca una rápida lisis celular

A continuación, quisimos evaluar la morfología celular de las células de melanoma A735 tratadas con LTX-315. Las células se trataron con LTX-315 a un valor de IC-50 y se investigaron mediante microscopía confocal de campo brillante. Las células tratadas mostraron un cambio rápido de una morfología epitelial normal a un colapso total de las células con una extrusión del contenido citoplásmico, que fue precedido por un redondeo de la célula (datos no mostrados). Estos cambios se produjeron normalmente dentro de los 15 a 60 minutos a un valor de IC-50 en la mayoría de las células.

LTX-315 internaliza y se dirige a las mitocondrias

Para investigar la internalización y el destino del péptido dentro de las células, se marcó LTX-315 con Pacific Blue y se incubó con células a concentraciones de 3 j M y 1.5 j M, respectivamente. El LTX-315 marcado penetró rápidamente en la membrana plasmática y, a 1.5 ^jM, el péptido mostró una acumulación alrededor de las mitocondrias después de 30 minutos de incubación, pero no se detectó en el núcleo celular (Figura 9). El péptido LTX-328 de secuencia simulada no lítico marcado no demostró ninguna internalización a ninguna concentración o tiempo de incubación probado (Figura 10).

LTX-315 induce cambios ultraestructurales en las células

Se evaluaron además los cambios ultraestructurales en las células tratadas mediante la realización de microscopía electrónica de transmisión (TEM), en la que las células A375 se trataron con péptidos disueltos directamente en medio o en medio solo. Un número significativo de células tratadas con una concentración baja (3.5 ^jM) del péptido LTX-315 durante 60 minutos mostraron vacuolización, así como alguna alteración de la morfología mitocondrial (Figura 11). Las mitocondrias parecían ser menos electrondensas, también exhibían cierto grado de reorganización, con las crestas más separadas o no visibles en absoluto. El número de células necróticas en estas muestras fue inferior al 5 %. En estas bajas concentraciones, se observó vacuolización del citoplasma. Otro hallazgo común en estas muestras fueron las vacuolas colocadas periféricamente, que estaban revestidas con una sola capa de membrana que contenía un material homogéneo (Figura 11B). Cuando las células se trataron con una concentración más alta (17 j M) durante 60 min, aproximadamente el 40% de ellas mostraron una morfología necrótica con una pérdida de la integridad de la membrana plasmática (Figura 11C y E). Las células que aún estaban intactas mostraron una gran heterogeneidad, desde un aspecto normal con microvellosidades hasta un aspecto redondo, con mitocondrias claramente afectadas. En esta alta concentración, solo el 4% de las células investigadas mostraron vacuolización, y la condensación de cromatina no fue visible en este material en ninguna concentración de péptido probada. Estos resultados demuestran que LTX-315 destruyen las células tumorales con un modo de acción lítico, mientras que concentraciones más bajas hacen que las células experimenten cambios de ultraestructura, tales como vacuolización y una morfología mitocondrial alterada. Más aún, no se observaron cambios morfológicos significativos que sugieran muerte celular apoptótica.

En un experimento separado, la exposición de LTX-315 a 10 jg/ml a células A547 humanas (una estirpe celular de melanoma de ovario) condujo a la desintegración de la membrana mitocondrial (Figura 16).

El tratamiento con LTX-315 conduce a la liberación extracelular de ATP

Los DAMP son moléculas que se liberan de fuentes intracelulares durante el daño celular. Los DAMP pueden iniciar y perpetuar una respuesta inmunitaria a través de la unión a los Receptores de Reconocimiento de Patrones (PRR) sobre las células presentadoras de antígenos (APC). Entre los DAMP comúnmente conocidos están ATP, HMGB1, calreticulina, citocromo C, ADN mitocondrial y especies reactivas de oxígeno (ROS). A continuación, queríamos investigar si se liberó ATP en el sobrenadante de las células tratadas con LTX-315. Por tanto, el sobrenadante de las células tratadas y no tratadas se analizó utilizando un ensayo de detección de luciferasa. Como se muestra en la Figura 15, se detectó ATP en el sobrenadante tan pronto como después de 5 minutos de tratamiento con LTX-315, y la liberación dependía de la concentración.

El tratamiento con LTX-315 induce la liberación de citocromo C en el sobrenadante

Para evaluar si las células tratadas con LTX-315 liberaron citocromo-C en el medio, las células A375 se trataron con LTX-315 a 35 j M en diferentes puntos de tiempo (5, 15, 45 min). El sobrenadante se analizó posteriormente utilizando un ensayo ELISA. Las células tratadas con un valor de 35 ^jM tenían tres veces más citocromo C en el sobrenadante en comparación con las células de control no tratadas. El aumento del citocromo C se detectó después de solo cinco minutos de tratamiento, y también hubo un aumento después de 15 y 45 minutos de tratamiento con péptidos, respectivamente (Figura 13).

El tratamiento con LTX-315 conduce a la liberación extracelular de HMGB1

HMGB1 es una proteína nuclear de unión a cromatina no histona. Una vez liberada pasivamente de las células necróticas, HMGB1 puede desencadenar la maduración funcional de las células dendríticas, la estimulación de citocinas y la quimiotaxis, entre varios efectos inmunopotenciadores.

La HMGB1 se encuentra normalmente en el núcleo celular y se esperaría en un lisado celular de células sanas, aunque no en el medio de cultivo (sobrenadante). Para evaluar la liberación de HMGB1 de las células tratadas con LTX-315, medimos la translocación y la HMGB1 libre del compartimento nuclear dentro del lisado celular en el sobrenadante celular.

Se analizaron tanto el lisado celular como el sobrenadante celular de células de melanoma A375 tratadas con LTX-315 y LTX-328 utilizando una transferencia Western. Las células se trataron con 35 pM de LTX-315 o LTX-328, con una translocación gradual del lisado celular al sobrenadante detectado en las células de melanoma tratadas con LTX-315, pero no en las células tratadas con el péptido de secuencia simulada LTX -328 o solo un medio libre de suero (Figura 14).

El tratamiento con LTX-315 provoca la producción de Especies Reactivas de Oxígeno (ROS) en las células de melanoma A375

La generación de ROS después del tratamiento con LTX-315 se midió mediante un ensayo fluorométrico de CH2DCFDA. Se generaron cantidades significativas de ROS después de 15 minutos de incubación con LTX-315, y los niveles de ROS dependieron de la concentración (Figura 12).

Discusión

El LTX-315 marcado con la molécula fluorescente Pacific Blue se internalizó minutos después de la incubación con células de melanoma A375 y se distribuyó en el citoplasma (Figura 9). A bajas concentraciones, la acumulación del péptido alrededor de las mitocondrias fue evidente, mientras que a concentraciones más altas, el péptido se extendió más dentro del citoplasma y se acumuló en estructuras circulares más cercanas a la membrana celular (Figura 10). Si el péptido ataca la membrana mitocondrial, se esperaría una disminución o incluso un colapso total del potencial de la membrana mitocondrial. Una formación de imágenes confocales de células con la tinción mitocondrial dependiente del potencial de membrana Mitotracker CMXh2ROS mostró una pérdida de señal mitocondrial poco tiempo después del tratamiento con péptidos (datos no mostrados). La pérdida de la señal muestra que la interacción del péptido con las mitocondrias provoca una pérdida del potencial de la membrana mitocondrial, que es crucial para las funciones celulares más importantes de las mitocondrias. También se demostró una morfología mitocondrial alterada con TEM. Las células tratadas con LTX-315 durante 60 minutos tenían mitocondrias menos densas en electrones con una organización alterada de las crestas, así como vacuolización dentro de las mitocondrias en comparación con las células no tratadas (Figura 11). Adicionalmente, la vacuolización fue evidente en aproximadamente el 20 % de las células tratadas con 3.5 pM de LTX-315. Cuando las mitocondrias son disfuncionales, se pueden formar radicales libres de oxígeno (ROS) y, al utilizar ensayos fluorométricos, demostramos la formación de ROS pocos minutos después del tratamiento con péptidos (Figura 12).

En este estudio, demostramos que el tratamiento con el péptido LTX-315 provoca un aumento en los niveles de ROS en las células de melanoma A375 después del tratamiento. Una explicación de estos niveles más altos de ROS después del tratamiento con péptidos podría ser que el péptido ingresa a las células y se dirige a las mitocondrias, y las mitocondrias disfuncionales luego liberan ^rO^s. A través de un ensayo ELISA, detectamos la liberación de citocromo C en el sobrenadante de las células tratadas con péptidos después de solo unos minutos de tratamiento (Figura 13). El citocromo C es una proteína mitocondrial liberada desde el espacio intermembrana y hacia el citosol cuando se perturba la membrana mitocondrial externa, y al unirse al factor de activación de proteasa apoptótica 1 (Apaf-1), también es parte de la cascada apoptótica que eventualmente conduce a la muerte celular por apoptosis. Sin embargo, si el citocromo C se encuentra en el espacio extracelular, se ha informado que actúa como un mediador proinflamatorio, activando así NF-kB e induciendo la producción de citocinas y quimiocinas. La transición de HMGB1 del compartimento celular al compartimento extracelular se detectó utilizando una transferencia de Western (Figura 14). Cuando la proteína nuclear HMBG1 se libera en el fluido extracelular, funciona como una DAMP y se puede unir tanto a los PRR TLR como a los receptores RAGE; la activación de estos puede conducir a una serie de respuestas inflamatorias, como la transcripción de citocinas proinflamatorias. También detectamos ATP liberado en el sobrenadante después de la incubación del péptido (Figura 15), y presentado extracelularmente funciona tal como una DAMP al activar los receptores purinerg P2RX7 sobre las DC. Este receptor no solo funciona como un poro que se abre para pequeñas moléculas catiónicas y luego más grandes después de unirse al ATP, su activación también provoca el procesamiento y liberación de la citocina proinflamatoria IL-1p.

En resumen, nuestros datos sugieren que LTX-315 induce la muerte celular lítica en células de cáncer, no solo por ataque directo sobre la membrana plasmática, sino también como resultado de una lesión en orgánulos intracelulares vitales después de la internalización del péptido en concentraciones demasiado bajas para provocar una pérdida inmediata de la integridad de la membrana plasmática. Demostramos que el tratamiento con péptidos provoca la liberación de varios DAMP como CytC, ATP, HMGB1 y ROS. Las DAMP pueden afectar la integridad celular de las células dañadas de varias formas, pero también están asociados con la llamada muerte celular inmunogénica. La liberación de antígenos específicos del tumor en el compartimento extracelular, junto con potentes moléculas inmunoestimuladoras (DAMP), tal como ATP, CytC y HMGB1, puede generar una fuerte respuesta inmunitaria. A su vez, estos factores conducirán a una maduración y activación de las CD y otras células accesorias del sistema inmunitario adaptativo.

Ejemplo 11

Introducción

La noción de que el tratamiento exitoso del cáncer se encuentra dentro de la medicina personalizada y requiere una combinación de diferentes modalidades para maximizar el compromiso y la activación inmunitarias, está ampliamente aceptada. En dosis más altas, la ciclofosfamida (CY) puede provocar inmunosupresión. Sin embargo, en dosis bajas (metronómicas) el fármaco puede conducir a respuestas inmunes mejoradas contra una variedad de antígenos, más específicamente a través de la supresión selectiva de subconjuntos de células inhibidoras que incluyen MDSC y células Treg. La CY también puede provocar la activación de las células dendríticas a través de la liberación de HMGB1 y ecto-CRT, que tiene efectos en cadena en términos de producción de citocinas proinflamatorias y proliferación de células T. Se demostró que una sola inyección i.p. de 2 mg de CY conduce a una reducción de las células del bazo dentro de las 24 horas, y con un punto bajo (caída del 50 %) en el cuarto día después de la administración de CY. El número relativo de linfocitos T CD4 y CD8 aumentó en los bazos y los LN después de la administración de CY, mientras que el número relativo de CD19 y Tregs disminuyó drásticamente.

Principio de prueba

Se investigan los efectos sinérgicos potenciales de combinar LTX-315 con CY metronómico en un modelo de linfoma A20.

Sustancia de prueba: LTX-315 (número de lote 1037915, factor de corrección 76.5%, suministrado por Lytix Biopharma). Sendoxan (monohidrato de ciclofosfamida), comprado en la farmacia del hospital.

Vehículo lTx -315: solución salina (NaCl al 0.9 % en H2O estéril).

Vehículo Sendoxan: solución salina (NaCl al 0.9 % en H2O estéril).

Control de vehículo: solución salina (NaCl al 0.9 % en H2O estéril).

Método de evaluación

Animales: Se obtuvieron ratones hembra Balb/c de tipo silvestre, de 5-6 semanas de edad, de Charles River, Reino Unido. Todos los ratones se alojaron en jaulas en una instalación para animales libre de patógenos de acuerdo con las directrices del Comité de Ética Local y Europeo.

Tratamiento del tumor: se recolectaron células tumorales, se lavaron en RPMI-1640 y se inyectaron intradérmicamente (i.d.) en el lado derecho del abdomen en ratones Balb/c (5x 106 células A20 por ratón/50 pl de RPMI-1640). Cuando los animales obtuvieron tumores palpables (20-30 mm2), se inyectaron a los animales una dosis única i.p. de CY (día 4) disuelta en solución salina (2.0 mg de CY/500 pl de solución salina). El día 8 se inició el tratamiento con péptidos utilizando inyecciones i.t. únicas de LTX-315 (1.0 mg de LTX-315/50 pl de solución salina) una vez al día durante 3 días consecutivos, y el control del vehículo fue solo solución salina (NaCl al 0.9% en H2O estéril). El tamaño del tumor se midió utilizando un calibre electrónico y se expresó como el área de una elipse [(dimensión máxima/2) x (dimensión mínima/2) x n]. Luego, los animales se sacrificaron cuando el producto de las dimensiones perpendiculares del tumor alcanzó 130 mm2 o cuando se desarrolló una ulceración del tumor.

Resultados

Se ha mostrado que los linfomas A20 son difíciles de tratar debido al patrón de crecimiento del tumor (tumor viscoso e indefinido) y su potencial metastásico. LTX-315 indujo la regresión completa de los tumores A20 palpables en uno de los animales y una respuesta parcial en el resto de los animales, después de la inyección intratumoral. Para investigar el efecto sinérgico de LTX-315 en combinación con CY metronómico, se trataron ratones Balb/c con linfomas A20 con una única inyección i.p. de CY (2 mg/500 pl) el día 4 y con inyecciones i.t. de LTX-315 (1 mg/50 pl) durante tres días consecutivos (Figuras 17 y 18). Los controles se inyectaron i.p. y con vehículo equivalente al volumen del tratamiento correspondiente. Es de destacar que los tumores en el grupo de solo LTX-315 eran más grandes cuando se inició el tratamiento en comparación con el grupo que recibió tanto LTX-315 como CY metronómico, ya que el CY metronómico inhibió el crecimiento tumoral durante 7-10 días.

Conclusión

La mayoría de los animales tratados con LTX-315 en combinación con CY metronómico experimentaron una regresión tumoral completa y duradera y estuvieron libres de tumor 4 semanas después del tratamiento.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de la fórmula:

CCLLCCLLC (I) (SEQ ID No. 1)

en la que C representa un aminoácido catiónico y L representa un aminoácido con un grupo R lipófilo y en el que uno de los aminoácidos que tiene un grupo R lipófilo es un aminoácido no codificado genéticamente, dicho compuesto opcionalmente está en la forma de una sal, éstero amida;

2. El compuesto para uso como se reivindica en la reivindicación 1 en el que cada grupo R lipófilo tiene al menos 9 átomos que no son de hidrógeno.

3. El compuesto para uso como se reivindica en la reivindicación 1 o 2 en el que cada grupo R lipófilo tiene al menos un grupo cíclico.

4. El compuesto para uso como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que 1 a 3 de los aminoácidos con grupos R lipófilo son triptófano.

5. El compuesto para uso como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que incorpora un aminoácido no codificado genéticamente seleccionado del grupo que consiste en: ácido 2-amino-3-(bifenil-4-il)propanoico (bifenilalanina), ácido 2-amino-3,3-difenilpropanoico (difenilalanina), ácido 2-amino-3-(antracen-9-il)propanoico, ácido 2-amino-3-(naftalen-2-il)propanoico, ácido 2-amino-3-(naftalen-1-il)propanoico, ácido 2-amino-3-[1,1':4',1”-terfenil-4-il]-propiónico, ácido 2-amino-3-(2,5,7-tri-tert-butil-1H-indol-3-il)propanoico, ácido 2-amino-3-[1,1':3',1”-terfenil-4-il]-propiónico, ácido 2-amino-3-[1,1':2', 1”-terfenil-4-il]-propiónico, ácido 2-amino-3-(4-naftalen-2-ilfenil)-propiónico, ácido 2-amino-3-(4'-butilbifenil-4-il)propanoico, ácido 2-amino-3-[1,1':3',1”-terfenil-5'-il]-propiónico y ácido 2-amino-3-(4-(2,2-difeniletil)fenil)propanoico.

6. El compuesto para uso como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el compuesto tiene la fórmula de la SEQ ID NO: 23, o una sal, éster o amida de la misma.

7. El compuesto para uso como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la ciclofosfamida se administra a una dosis metronómica.