ES2808287T9

ES2808287T9 - Métodos y composiciones para la producción mejorada de ácidos grasos y derivados de los mismos

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Publication number: ES2808287T9
Application number: ES12719914T
Authority: ES
Inventors: Derek L Greenfield; Louis G Hom; Fernando A Sanchez-Riera; Zhihao Hu; Vikranth Arlagadda; Eli S Groban; Scott A Frykman
Original assignee: Genomatica Inc
Current assignee: Genomatica Inc
Priority date: 2011-04-01
Filing date: 2012-04-02
Publication date: 2021-03-05
Anticipated expiration: 2032-04-02
Also published as: EP2906587B9; WO2012154329A1; US11066682B2; EP2906587A1; SI2906587T1; EP3702363A1; US20210371889A1; EP2906587B1; ES2808287T3; US20140179940A1

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para la producción mejorada de ácidos grasos y derivados de los mismos

Antecedentes de la invención

El petróleo crudo es un recurso natural limitado, que se encuentra en la Tierra en forma líquida, gaseosa y sólida. Aunque el petróleo crudo es un recurso valioso, se descubre y se extrae de la Tierra a un coste financiero y ambiental considerable. Además, en su forma natural, el petróleo crudo extraído de la Tierra tiene pocos usos comerciales. El petróleo crudo es una mezcla de hidrocarburos (por ejemplo, parafinas (o alcanos), olefinas (o alquenos), alquinos, naftenos (o cicloalcanos), compuestos alifáticos, compuestos aromáticos, etc.) de longitud y complejidad variables. Además, el petróleo crudo contiene otros compuestos orgánicos (por ejemplo, compuestos orgánicos que contienen nitrógeno, oxígeno, azufre, etc.) e impurezas (por ejemplo, azufre, sal, ácido, metales, etc.). Por tanto, el petróleo crudo debe refinarse y purificarse a un coste considerable antes de que pueda usarse comercialmente.

El petróleo crudo es también una fuente primaria de materias primas para la producción de productos petroquímicos. Las dos clases principales de materias primas derivadas del petróleo son olefinas de cadena corta (por ejemplo, etileno y propileno) y compuestos aromáticos (por ejemplo, isómeros de benceno y xileno). Estas materias primas derivan de hidrocarburos de cadena más larga del petróleo crudo mediante craqueo del mismo a un coste considerable usando una diversidad de métodos, tales como craqueo catalítico, craqueo por vapor o reforma catalítica. Estas materias primas pueden usarse para fabricar productos petroquímicos tales como monómeros, disolventes, detergentes y adhesivos, que de otra manera no pueden refinarse directamente a partir de petróleo crudo.

Los productos petroquímicos, a su vez, pueden usarse para fabricar productos químicos especiales, tales como plásticos, resinas, fibras, elastómeros, productos farmacéuticos, lubricantes y geles. Los productos químicos especiales que pueden producirse a partir de materias primas petroquímicas incluyen ácidos grasos, hidrocarburos (por ejemplo, de larga cadena, de cadena ramificada, saturados, insaturados, etc.), aldehídos grasos, alcoholes grasos, ésteres, cetonas, lubricantes, etc.

Debido a los desafíos inherentes que plantea el petróleo, existe la necesidad de una fuente de petróleo renovable que no sea necesario explorar, extraer, transportar a largas distancias o refinar sustancialmente como el petróleo crudo. También existe la necesidad de una fuente de petróleo renovable que pueda producirse económicamente sin crear el tipo de daño ambiental que produce la industria petrolera y la quema de combustibles a base de petróleo. Por razones similares, también existe la necesidad de una fuente renovable de productos químicos que normalmente derivan del petróleo.

Un método para producir petróleo renovable es mediante ingeniería de microorganismos para producir productos del petróleo renovables. Desde hace mucho tiempo se sabe que algunos microorganismos poseen una capacidad natural para producir productos del petróleo (por ejemplo, levadura para producir etanol). Más recientemente, el desarrollo de biotecnologías avanzadas ha hecho posible modificar mediante ingeniería metabólica un organismo para producir bioproductos y biocombustibles. Los bioproductos (por ejemplo, los productos químicos) y los biocombustibles (por ejemplo, el biodiésel) son alternativas renovables a los productos químicos y los combustibles a base de petróleo, respectivamente. Los bioproductos y los biocombustibles pueden derivar de fuentes renovables, tales como materia vegetal, materia animal y materia de desecho orgánica, conocidos colectivamente como biomasa.

Los biocombustibles pueden sustituir cualquier combustible a base de petróleo (por ejemplo, gasolina, diésel, combustible de aviación, aceite de calefacción, etc.) y ofrecen varias ventajas con respecto a los combustibles a base de petróleo. Los biocombustibles no requieren una exploración o extracción cara y arriesgada. Los biocombustibles pueden producirse localmente y por tanto no requieren transporte a largas distancias. Además, los biocombustibles pueden fabricarse directamente y requieren poco o ningún refinado adicional. Además, la combustión de biocombustibles provoca una menor carga sobre el medio ambiente puesto que la cantidad de emisiones nocivas (por ejemplo, gases de efecto invernadero, contaminación del aire, etc.) que se libera durante la combustión se reduce en comparación con la combustión de los combustibles a base de petróleo. Además, los biocombustibles mantienen un ciclo de carbono equilibrado porque los biocombustibles se producen a partir de biomasa, un recurso natural renovable. Aunque la combustión de biocombustibles libera carbono (por ejemplo, en forma de dióxido de carbono), este carbono se reciclará durante la producción de biomasa (por ejemplo, el cultivo de cultivos), equilibrando de este modo el ciclo del carbono, que no se consigue con el uso de combustibles a base de petróleo.

Los productos químicos derivados biológicamente ofrecen ventajas sobre los productos petroquímicos similares a las que los biocombustibles ofrecen sobre los combustibles a base de petróleo. En particular, los productos químicos derivados biológicamente pueden convertirse a partir de biomasa en el producto químico deseado directamente sin necesidad de un refinado exhaustivo, a diferencia de los productos petroquímicos, que deben producirse mediante el refinado de petróleo crudo para recuperar materias primas que después se procesan adicionalmente en el producto petroquímico deseado.

Los hidrocarburos tienen muchos usos comerciales. Por ejemplo, los alcanos de cadena más corta se usan como combustibles. El metano y el etano son los componentes principales del gas natural. Se usan alcanos de cadena más larga (por ejemplo, de cinco a dieciséis carbonos) como combustibles para el transporte (por ejemplo, gasolina, diésel o combustible de aviación). Los alcanos que tienen más de dieciséis átomos de carbono son componentes importantes de aceites combustibles y aceites lubricantes. Los alcanos aún más largos, que son sólidos a temperatura ambiente, pueden usarse, por ejemplo, como cera de parafina. Se encuentran alcanos que contienen aproximadamente treinta y cinco carbonos en el betún, que se usa para el asfaltado de carreteras. Además, pueden craquearse alcanos de cadena más larga para producir hidrocarburos de cadena más corta comercialmente útiles.

Como los alcanos de cadena corta, los alquenos de cadena corta se usan en combustibles para el transporte. Se usan alquenos de cadena más larga en plásticos, lubricantes y lubricantes sintéticos. Además, se usan alquenos como materia prima para producir alcoholes, ésteres, plastificantes, tensioactivos, aminas terciarias, agentes de recuperación de aceite potenciada, ácidos grasos, tioles, epóxidos de anhídridos alquenilsuccínicos, alcanos clorados, alquenos clorados, ceras, aditivos de combustible y reductores de flujo de arrastre.

Los ésteres tienen muchos usos comerciales. Por ejemplo, el biodiésel, un combustible alternativo, se compone de ésteres (por ejemplo, éster metílico de ácido graso, ésteres etílicos de ácidos grasos, etc.). Algunos ésteres de bajo peso molecular son volátiles con un olor agradable que los hace útiles como fragancias o agentes aromatizantes. Además, se usan ésteres como disolventes para lacas, pinturas y barnices. Además, algunas sustancias de origen natural, tales como ceras, grasas y aceites se componen de ésteres. Los ésteres también se usan como agentes suavizantes en resinas y plásticos, plastificantes, retardantes de llama y aditivos en la gasolina y el aceite. Además, pueden usarse ésteres en la fabricación de polímeros, películas, tejidos, colorantes y productos farmacéuticos.

Se usan aldehídos para producir muchos productos químicos especiales. Por ejemplo, se usan aldehídos para producir polímeros, resinas (por ejemplo, baquelita), colorantes, aromatizantes, plastificantes, perfumes, productos farmacéuticos y otros productos químicos, algunos de los cuales pueden usarse como disolventes, conservantes o desinfectantes. Además, determinados compuestos naturales y sintéticos, tales como vitaminas y hormonas, son aldehídos, y muchos azúcares contienen grupos aldehído. Los aldehídos grasos pueden convertirse en alcoholes grasos por reducción química o enzimática.

Los alcoholes grasos tienen muchos usos comerciales. Las ventas anuales mundiales de alcoholes grasos y sus derivados superan los 1.000 millones de dólares. Los alcoholes grasos de cadena más corta se usan en las industrias cosmética y alimentaria como emulsionantes, emolientes y espesantes. Debido a su naturaleza anfífila, los alcoholes grasos se comportan como tensioactivos no iónicos, que son útiles en productos de cuidado personal y para el hogar, tales como, por ejemplo, detergentes. Además, se usan alcoholes grasos en ceras, gomas, resinas, ungüentos y lociones farmacéuticas, aditivos de aceite lubricante, antiestáticos textiles y agentes de acabado, plastificantes, cosméticos, disolventes industriales y disolventes para grasas.

La Acil-CoA sintasa (ACS) esterifica los ácidos grasos libres a acil-CoA mediante un mecanismo de dos etapas. El ácido graso libre se convierte en primer lugar en un intermedio de acil-AMP (un adenilato) a través de la pirofosforolisis de ATP. El carbono de carbonilo activado del adenilato después se acopla con el grupo tiol de CoA, liberando AMP y el producto final de acil-CoA (Shockey et al., Plant. Physiol., 129: 1710-1722 (2002)).

FadR es un factor regulador clave que participa en la degradación de los ácidos grasos y las vías de biosíntesis de los ácidos grasos (Cronan et al., Mol. Microbiol., 29(4): 937-943 (1998)). La enzima ACS de E. coli FadD y la proteína de transporte de ácidos grasos Fadl son componentes esenciales de un sistema de captación de ácidos grasos. Fadl media el transporte de los ácidos grasos a la célula bacteriana, y FadD media la formación de ésteres de acil-CoA. Cuando no hay otra fuente de carbono disponible, los ácidos grasos exógenos son captados por bacterias y convertidos en ésteres de acil-CoA, que puede unirse al factor de transcripción FadR y desreprimir la expresión de los genes fad que codifican las proteínas responsables del transporte (Fadl), la activación (FadD) y la p-oxidación de ácidos grasos (FadA, FadB, FadE y FadH). Cuando hay fuentes alternativas de carbono disponibles, las bacterias sintetizan ácidos grasos como acil-ACP, que se usan para la síntesis de fosfolípidos, pero no son sustratos para la poxidación. Por tanto, acil-CoA y acil-ACP son fuentes independientes de ácidos grasos que pueden dar lugar a diferentes productos finales (Caviglia et al., J. Biol. Chem., 279(12): 1163-1169 (2004)). El documento US 2010/242345 describe microorganismos modificados mediante ingeniería genética que producen productos de la vía biosintética de los ácidos grasos (derivados de ácidos grasos) y métodos para su uso.

Sigue existiendo la necesidad de métodos y composiciones para potenciar la producción de productos químicos derivados biológicamente, tales como ácidos grasos y derivados de ácidos grasos. La presente invención proporciona dichos métodos y composiciones. La invención proporciona adicionalmente productos derivados de los ácidos grasos y derivados de los mismos producidos mediante los métodos que se describen en el presente documento, tales como combustibles, tensioactivos y detergentes.

Breve sumario de la invención

La invención proporciona métodos mejorados para producir un ácido graso o un derivado de ácido graso del mismo en una célula hospedadora bacteriana. El método consiste en (a) proporcionar una célula hospedadora bacteriana modificada por ingeniería genética que comprende un promotor heterólogo y/o un sitio de unión a ribosomas unido operativamente a una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido FadR, provocando dicho promotor y/o sitio de unión a ribosomas la sobreexpresión del polipéptido FadR en dicha célula, (b) cultivar la célula hospedadora bacteriana modificada por ingeniería genética en un medio de cultivo en condiciones que permitan la producción de un ácido graso o un derivado de ácido graso del mismo y (c) aislar el ácido graso o un derivado de ácido graso del mismo de la célula hospedadora bacteriana modificada por ingeniería genética, en donde el ácido graso o derivado de ácido graso del mismo es un ácido graso, una acil-ACP, una acil-CoA, un aldehído graso, un alcohol de cadena corta, un alcohol de cadena larga, un alcohol graso, un hidrocarburo o un éster. Como resultado de este método, uno o más de entre el título, el rendimiento o la productividad del ácido graso o derivado de ácido graso producido por la célula hospedadora bacteriana modificada por ingeniería genética aumentan con respecto al de la célula hospedadora de tipo silvestre correspondiente.

También se desvelan ácidos grasos y derivados de ácidos grasos, tales como un acil-CoA, un aldehído graso, un alcohol de cadena corta, un alcohol de cadena larga, un alcohol graso, un hidrocarburo o un éster, producidos mediante los métodos de la invención. Se desvelan adicionalmente composiciones de biocombustible y composiciones de tensioactivo que comprenden un ácido graso o un derivado de ácido graso producidos mediante los métodos de la invención.

Breve descripción de las distintas vistas de los dibujos

La FIG. 1 es un cuadro de genes de ejemplo adecuados para su uso en la práctica de la invención. Los números de registro de polipéptidos y/o polinucleótidos son de la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI, por sus siglas en inglés) y los números CE de enzimas son del Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (NC-IUBMB, por sus siglas en inglés).

La FIG. 2 es un gráfico de la producción de especies grasas en una cepa de E. coli de control (ALC310) o la cepa de inserción de transposón, D288.

La FIG. 3 es un diagrama que representa la ubicación de la inserción de transposón en la cepa D288.

La FIG. 4 es un gráfico de barras de títulos totales de especies grasas (FA, por sus siglas en inglés) de la biblioteca de expresión de las cepas de E. coli que tienen una expresión alterada de FadR de tipo silvestre o FadR[S219N] mutante en comparación con los títulos de FA de la cepa de E. coli de control (ALC487).

La FIG. 5 es un gráfico de barras de títulos totales de especies grasas (FA) en tres fermentaciones en matraz de agitación (SF, por sus siglas en inglés) separadas de la cepa D512 de E. coli que tiene una expresión alterada de FadR de tipo silvestre en comparación con los títulos de fA en la cepa ALC487 de control.

La FIG. 6 es un gráfico de barras de rendimiento total de especies grasas en carbono en fermentaciones en matraz de agitación de la cepa ALC487 de control o de la cepa D512 de E. coli que tiene una expresión alterada de FadR de tipo silvestre.

La FIG. 7 es un gráfico de producción de ácido graso y alcohol graso y de rendimiento total de especies grasas en fermentaciones de biorreactores de 5 l de la cepa ALC487 de control alimentada a una tasa de glucosa de 10 g/l/h o de la cepa D512 que tiene una expresión alterada de FadR de tipo silvestre alimentada a una tasa de glucosa de 10 g/l/h o 15 g/l/h. Las barras representan el título de alcohol graso o ácido graso, y los círculos representan el rendimiento total de especies grasas en carbono.

La FIG. 8 es un gráfico de producción de ácido graso y alcohol graso y rendimiento total de especies grasas en fermentaciones en matraz de agitación de la cepa D512 o una cepa D512 en la que se suprimió el gen entD. Las barras representan el título de ácido graso o alcohol graso y los círculos representan el rendimiento de ácido graso. La FIG. 9 es un gráfico de títulos y rendimientos totales de especies grasas (ácidos grasos y FAME) en dos cepas de E. coli de la biblioteca de sitios de unión de ribosomas (RBS) que tienen una expresión alterada de FadR[S219N] mutante (es decir, P1A4 y P1G7) en comparación con los títulos y rendimientos totales de especies grasas en la cepa de E. coli parental (DAM1-pDS57) en fermentaciones en matraz de agitación (SF) a 32 °C. Las barras representan los títulos totales de especies grasas después de 56 horas de cultivo y los cuadrados representan el rendimiento total de especies grasas después de 56 horas de cultivo.

La FIG. 10 es un gráfico de líneas de títulos combinados de FAME y ácidos grasos libres (FFA) en la cepa parental DAM1 pDS57 o cepas de biblioteca de RBS P1A4 o P1G7 en fermentaciones en biorreactor en varios puntos temporales tras la inducción de la producción de FAME y FFA, en donde DAM1 P1A4 y DAM1 P1G7 expresan FadR y DAM1 pDS57 no expresa FadR.

La FIG. 11 es un gráfico de líneas de rendimientos combinados de FAME y FFA en la cepa parental DAM1 pDS57 o cepas de biblioteca de RBS P1A4 o P1G7 en fermentaciones en biorreactor en varios puntos temporales tras la inducción de la producción de FAME y FFA, en donde DAM1 P1A4 y DAM1 P1G7 expresan FadR y DAM1 pDS57 no expresa FadR.

Descripción detallada de la invención

La invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que la alteración del nivel de expresión de FadR en una célula hospedadora facilita una producción potenciada de ácidos grasos y derivados de ácidos grasos por la célula hospedadora.

La invención proporciona métodos mejorados para producir un ácido graso o un derivado de ácido graso en una célula hospedadora bacteriana. El método consiste en (a) proporcionar una célula hospedadora bacteriana modificada por ingeniería genética que comprende un promotor heterólogo y/o un sitio de unión a ribosomas unido operativamente a una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido FadR, provocando dicho promotor y/o sitio de unión a ribosomas la sobreexpresión del polipéptido FadR en dicha célula, (b) cultivar la célula hospedadora bacteriana modificada por ingeniería genética en un medio de cultivo en condiciones que permitan la producción de un ácido graso o un derivado del mismo y (c) aislar el ácido graso o un derivado del mismo de la célula hospedadora bacteriana modificada por ingeniería genética, en donde el ácido graso o el derivado del mismo es un ácido graso, una acil-ACP, una acil-CoA, un aldehído graso, un alcohol de cadena corta, un alcohol de cadena larga, un alcohol graso, un hidrocarburo o un éster. Como resultado de este método, uno o más de entre el título, el rendimiento o la productividad del ácido graso o derivado de ácido graso producido por la célula hospedadora bacteriana modificada por ingeniería genética aumentan con respecto al de la célula hospedadora de tipo silvestre correspondiente.

Definiciones

Como se utilizan en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el" o "la" incluyen los referentes en plural salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula hospedadora recombinante" incluye dos o más de dichas células hospedadoras recombinantes, la referencia a "un alcohol graso" incluye uno o más alcoholes grasos o mezclas de alcoholes grasos, la referencia a "una secuencia codificante de ácido nucleico" incluye una o más secuencias codificantes de ácido nucleico, la referencia a "una enzima" incluye una o más enzimas, y similares.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la invención. Aunque en la práctica de la presente invención pueden usarse otros métodos y materiales similares, o equivalentes, a los que se describen en el presente documento, los materiales y métodos preferidos se describen en el presente documento.

En la descripción y la reivindicación de la presente invención, se usará la siguiente terminología de acuerdo con las definiciones que se exponen a continuación.

Números de registro: Los números de registro de secuencias a lo largo de la presente descripción se obtuvieron de las bases de datos proporcionadas por el NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica) mantenido por los Institutos Nacionales de Salud, EE.UU. (que se identifican en el presente documento como "Números de registro del NCBI" o, como alternativa, como "Números de registro del GenBank"), y de la base de conocimiento UniProt (UniProtKB) y las bases de datos Swiss-Prot proporcionadas por el Instituto Suizo de Bioinformática (que se identifican en el presente documento como "Números de registro del UniProtKB").

Números de la clasificación de enzimas (CE): Los números CE son establecidos por el Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (IUBMB), cuya descripción se encuentra disponible en el sitio web de la Nomenclatura de enzimas IUBMB en la World Wide Web. Los números CE clasifican las enzimas de acuerdo con la reacción catalizada.

La expresión "polipéptido FadR" se refiere a un polipéptido que tiene una actividad biológica que corresponde a la de FadR derivado de E. coli MG1655 (SEQ ID NO: 1).

Como se usa en el presente documento, la expresión "ácido graso o derivado del mismo" significa un "ácido graso" o un "derivado de ácido graso". El término "ácido graso" significa un ácido carboxílico que tiene la fórmula RCOOH. R representa un grupo alifático, preferentemente, un grupo alquilo. R puede comprender entre aproximadamente 4 y aproximadamente 22 átomos de carbono. Los ácidos grasos pueden estar saturados, monoinsaturados o poliinsaturados. En una realización preferida, el ácido graso se prepara a partir de una vía biosintética de ácidos grasos. Un "derivado de ácido graso" es un producto preparado en parte a partir de la vía biosintética de ácidos grasos del organismo hospedador de producción. "Derivados de ácidos grasos" incluye productos preparados en parte a partir de acil-ACP o derivados de acil-ACP. Los derivados de ácidos grasos de ejemplo incluyen, por ejemplo, acil-CoA, ácidos grasos, aldehídos grasos, alcoholes de cadena corta y larga, hidrocarburos, alcoholes grasos, ésteres (por ejemplo, ceras, ésteres de ácidos grasos o ésteres grasos), olefinas terminales, olefinas internas y cetonas.

Una "composición de derivado de ácido graso", como se denomina en el presente documento, es producida por una célula hospedadora recombinante y normalmente comprende una mezcla de derivado de ácido graso. En algunos casos, la mezcla incluye más de un tipo de producto (por ejemplo, ácidos grasos y alcoholes grasos, ácidos grasos y ésteres de ácidos grasos o alcanos y olefinas). En otros casos, las composiciones de derivado de ácido graso pueden comprender, por ejemplo, una mezcla de alcoholes grasos (u otro derivado de ácido graso) con diversas longitudes de cadena y características de saturación o ramificación. En otros casos más, la composición de derivado de ácido graso comprende una mezcla tanto de más de un tipo de producto como de productos con diversas longitudes de cadena y características de saturación o ramificación.

Como se usa en el presente documento "acil-CoA" se refiere a un aciltioéster formado entre el átomo de carbono carbonílico de la cadena de alquilo y el grupo sulfhidrilo de la fracción 4'-fosfopantetionilo de la coenzima A (CoA), que tiene la fórmula R-C(O)S-CoA, donde R es cualquier grupo alquilo que tiene al menos 4 átomos de carbono.

Como se usa en el presente documento "acil-ACP" se refiere a un aciltioéster formado entre el carbono carbonílico de una cadena de alquilo y el grupo sulfhidrilo de la fracción fosfopanteteinilo de una proteína portadora de acilo (ACP).

La fracción fosfopanteteinilo se une después de la traducción a un resto de serina conservado en la ACP mediante la acción de la proteína sintasa portadora de holo-acilo (ACPS), una fosfopanteteinil transferasa. En algunas realizaciones, una acil-ACP es un intermedio en la síntesis de acil-ACP completamente saturadas. En otras realizaciones, una acil-ACP es un intermedio en la síntesis de acil-ACP insaturadas. En algunas realizaciones, la cadena de carbono tendrá aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 26 carbonos. Cada una de estas acil-ACP son sustratos para las enzimas que los convierten en derivados de ácidos grasos.

Como se usa en el presente documento, la expresión "vía biosintética de los ácidos grasos" significa una vía biosintética que produce ácidos grasos. La vía biosintética de los ácidos grasos incluye ácido graso sintasas que pueden modificarse por ingeniería genética para producir ácidos grasos y, en algunas realizaciones, pueden expresarse con enzimas adicionales para producir ácidos grasos que tengan las características deseadas de la cadena de carbono.

Como se usa en el presente documento, "aldehído graso" significa un aldehído que tiene la fórmula RCHO caracterizada por un grupo carbonilo (C=O). En algunas realizaciones, el aldehído graso es cualquier aldehído preparado a partir de un ácido graso o derivado de ácido graso.

Como se usa en el presente documento, "alcohol graso" significa un alcohol que tiene la fórmula ROH. En algunas realizaciones, el alcohol graso es cualquier alcohol preparado a partir de un ácido graso o derivado de ácido graso.

En determinadas realizaciones, el grupo R de un ácido graso, aldehído graso o alcohol graso tiene al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18 o al menos 19, carbonos de longitud. Como alternativa, o además, el grupo R tiene 20 o menos, 19 o menos, 18 o menos, 17 o menos, 16 o menos, 15 o menos, 14 o menos, 13 o menos, 12 o menos, 11 o menos, 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, o 6 o menos átomos de carbono de longitud. Por tanto, el grupo R puede tener un grupo R limitado por dos cualquiera de los criterios de valoración anteriores. Por ejemplo, el grupo R puede tener 6-16 átomos de carbono de longitud, 10-14 átomos de carbono de longitud, o 12-18 átomos de carbono de longitud. En algunas realizaciones, el ácido graso, aldehído graso o alcohol graso es un ácido graso, aldehído graso o alcohol graso C6, C⁷, Cs, C⁹, C¹⁰, C¹¹, C¹², C¹³, C¹⁴, C¹⁵, C¹⁶, C¹⁷, C¹⁸, C¹⁹,

C²⁰, C²¹, C²², C²³, C²⁴, C²⁵o C²⁶. En determinadas realizaciones, el ácido graso, aldehído graso o alcohol graso es un ácido graso, aldehído graso o alcohol graso C6, C8, C¹⁰, C¹², C¹³, C¹⁴, C¹⁵, C¹⁶, C¹⁷o C¹⁸.

El grupo R de un ácido graso, aldehído graso o alcohol graso puede ser una cadena lineal o una cadena ramificada.

Las cadenas ramificadas pueden tener más de un punto de ramificación y pueden incluir ramificaciones cíclicas. En algunas realizaciones, el ácido graso ramificado, aldehído graso ramificado o alcohol graso ramificado es un ácido graso ramificado, aldehído graso ramificado o alcohol graso ramificado C6, C⁷, C8, C⁹, C¹⁰, C¹¹, C¹², C¹³, C¹⁴, C¹⁵, C¹⁶,

C¹⁷, C¹⁸, C¹⁹, C²⁰, C²¹, C²², C²³, C²⁴, C²⁵o C²⁶. En realizaciones particulares, el ácido graso ramificado, aldehído graso ramificado o alcohol graso ramificado es un ácido graso ramificado, aldehído graso ramificado o alcohol graso ramificado C6, C8, C¹⁰, C¹², C¹³, C¹⁴, C¹⁵, C¹⁶, C¹⁷o C¹⁸. En determinadas reali graso ramificado, aldehído graso ramificado o alcohol graso ramificado está en la posición primaria (C¹).

En determinadas realizaciones, el ácido graso ramificado, aldehído graso ramificado o alcohol graso ramificado es un iso-ácido graso, iso-aldehído graso o iso-alcohol graso, o un anteiso-ácido graso, un anteiso-aldehído graso o anteisoalcohol graso. En realizaciones de ejemplo, el ácido graso ramificado, aldehído graso ramificado o alcohol graso ramificado se selecciona entre ácido graso ramificado, aldehído graso ramificado o alcohol graso ramificado iso-C70, iso-C^8:0, iso-C9:0, iso-C^10:0, iso-^11:0, iso-C^12:0, iso-C13:0, iso-C14:0, iso-15:0, iso-C^16:0, iso-C17:0, iso-C^18:0, iso-C19:0, anteiso-C7:0, anteiso-C^8:0, anteiso-C9:0, anteiso-Cm⁰, anteiso-Cn ^:0, anteiso-C^12:0, anteiso-C13:0, anteiso-C14:0, anteiso-C15:0, anteiso-C^16:0, anteiso-C17:0, anteiso-C^18:0y anteiso-C19:0.

El grupo R de un ácido graso ramificado o no ramificado, aldehído graso ramificado o no ramificado o alcohol graso ramificado o no ramificado puede estar saturado o no saturado. Si está insaturado, el grupo R puede tener uno o más de un punto de insaturación. En algunas realizaciones, el ácido graso insaturado, aldehído graso insaturado o alcohol graso insaturado es un ácido graso monoinsaturado, aldehído graso monoinsaturado o alcohol graso monoinsaturado.

En determinadas realizaciones, el ácido graso insaturado, aldehído graso insaturado o alcohol graso insaturado es un ácido graso insaturado, aldehído graso insaturado o alcohol graso insaturado C6:1, C7:1, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1, C20:1, C21:1, C22:1, C23:1, C24:1, C25:1 o C26:1. En determinadas realizaciones preferidas, el ácido graso insaturado, aldehído graso insaturado o alcohol graso insaturado es C10:1, C12:1, C14:1, C16:1 o C18:1. En otras realizaciones más, el ácido graso insaturado, aldehído graso insaturado o alcohol graso insaturado está insaturado en la posición omega-7. En determinadas realizaciones, el ácido graso insaturado, aldehído graso insaturado o alcohol graso insaturado comprende un doble enlace cis.

Como se usa en el presente documento, el término "alcano" significa hidrocarburos saturados o compuestos que consisten solamente en carbono (C) e hidrógeno (H), en donde estos átomos están unidos entre sí por enlaces sencillos (es decir, son compuestos saturados).

Los términos "olefina" y "alqueno" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a hidrocarburos que contienen al menos un doble enlace carbono-carbono (es decir, son compuestos insaturados).

Las expresiones "olefina terminal", "a-olefina", "alqueno terminal" y "1-alqueno" se usan indistintamente en el presente documento con referencia a a-olefinas o alquenos con una fórmula química CxH2x, se distinguen de otras olefinas con una fórmula molecular similar por la linealidad de la cadena hidrocarbonada y la posición del doble enlace en la posición primaria o alfa.

Como se usa en el presente documento, la expresión "éster graso" puede usarse en referencia a un éster. En una realización preferida, un éster graso es cualquier éster preparado a partir de un ácido graso, por ejemplo, un éster de ácido graso. En algunas realizaciones, un éster graso contiene un lado A y un lado B. Como se usa en el presente documento, un "lado A" de un éster se refiere a la cadena de carbono unida al oxígeno de carboxilato del éster. Como se usa en el presente documento, un "lado B" de un éster se refiere a la cadena de carbono que comprende el carboxilato parental del éster. En realizaciones en las que el éster graso deriva de la vía biosintética de ácidos grasos, el lado A es aportado por un alcohol y el lado B es aportado por un ácido graso.

Puede usarse cualquier alcohol para formar el lado A de los ésteres grasos. Por ejemplo, el alcohol puede derivar de la vía biosintética de ácidos grasos. Como alternativa, el alcohol puede producirse a través de vías biosintéticas de ácidos no grasos. Además, el alcohol puede proporcionarse exógenamente. Por ejemplo, el alcohol puede suministrarse en el caldo de fermentación en los casos en los que el éster graso es producido por un organismo. Como alternativa, un ácido carboxílico, tal como un ácido graso o ácido acético, puede suministrarse exógenamente en los casos en los que el éster graso es producido por un organismo que también puede producir alcohol.

Las cadenas de carbono que comprenden el lado A o el lado B pueden tener cualquier longitud. En una realización, el lado A del éster tiene al menos aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16 o 18 carbonos de longitud. Cuando el éster graso es un éster metílico de ácido graso, el lado A del éster tiene 1 carbono de longitud. Cuando el éster graso es un éster etílico de ácido graso, el lado A del éster tiene 2 carbonos de longitud. El lado B del éster puede tener al menos aproximadamente 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26 carbonos de longitud. El lado A y/o el lado B pueden ser de cadena lineal o ramificada. Las cadenas ramificadas pueden tener uno o más puntos de ramificación. Además, las cadenas ramificadas pueden incluir ramas cíclicas. Además, el lado A y/o el lado B pueden estar saturados o insaturados. Si está insaturado, el lado A y/o el lado B pueden tener uno o más puntos de insaturación.

En algunas realizaciones, el éster de ácido graso es un éster metílico de ácido graso (FAME) o un éster etílico de ácido graso (FAEE). En determinadas realizaciones, el FAME es un beta-hidroxi (B-OH) FAME. En una realización, el éster graso se produce biosintéticamente. En esta realización, primero el ácido graso se "activa". Son ejemplos no limitantes de ácidos grasos "activados" acil-CoA, acil ACP y acil fosfato. Acil-CoA puede ser un producto directo de la biosíntesis o degradación de ácidos grasos. Además, puede sintetizarse acil-CoA a partir de un ácido graso libre, una CoA y un trifosfato de nucleótido de adenosina (ATP). Un ejemplo de una enzima que produce acil-CoA es la acil-CoA sintasa.

Después de que un ácido graso se activa, puede transferirse fácilmente a un nucleófilo receptor. Son nucleófilos de ejemplo alcoholes, tioles o fosfatos.

En una realización, el éster graso es una cera. La cera puede derivar de un alcohol de cadena larga y un ácido graso de cadena larga. En otra realización, el éster graso es un tioéster de ácido graso, por ejemplo, acil Coenzima A (CoA) grasa. En otras realizaciones, el éster graso es un acil pantotenato graso, una proteína portadora de acilo (ACP) o un éster de fosfato graso.

Como se usa en el presente documento "acil CoA" se refiere a un aciltioéster formado entre el átomo de carbono carbonílico de la cadena de alquilo y el grupo sulfhidrilo de la fracción 4'-fosfopantetionilo de la coenzima A (CoA), que tiene la fórmula R-C(O)S-CoA, donde R es cualquier grupo alquilo que tiene al menos 4 átomos de carbono. En algunos casos, una acil CoA será un intermedio en la síntesis de acil CoA totalmente saturadas, incluyendo, pero sin limitación, 3-ceto-acil CoA, una 3-hidroxi acil CoA, una delta-2-trans-enoil-CoA o una alquil acil CoA. En algunas realizaciones, la cadena de carbono tendrá aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 26 átomos de carbono. En otras realizaciones la acil CoA estará ramificada. En una realización, la acil CoA ramificada es una isoacil CoA, en otra, es una anti-isoacil CoA. Cada una de estas "acil CoA" son sustratos para enzimas que las convierten en derivados de ácidos grasos tales como los que se describen en el presente documento.

La expresión "nivel de expresión alterado" y "nivel de expresión modificado" se usan indistintamente, y significan que un polinucleótido, polipéptido o hidrocarburo está presente a una concentración diferente en una célula hospedadora modificada en comparación con su concentración en una célula de tipo silvestre correspondiente en las mismas condiciones.

"Polinudeótido" se refiere a un polímero de ADN o ARN, que puede ser monocatenario o bicatenario y que puede contener nucleótidos no naturales o modificados. Las expresiones "polinudeótido", "ácido nucleico", y "molécula de ácido nucleico" se usan en el presente documento indistintamente para referirse a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos (ARN) o desoxirribonucleótidos (ADN). Estos términos se refieren a la estructura primaria de la molécula y, por lo tanto, incluyen ADN bicatenario y monocatenario, y ARN bicatenario y monocatenario. Los términos incluyen, como equivalentes, análogos de ARN o ADN hechos de análogos de nucleótidos y polinucleótidos modificados tales como, pero sin limitación, polinucleótidos metilados y/o protegidos terminalmente. El polinudeótido puede estar en cualquier forma, incluyendo, pero sin limitación, plásmido, vírico, cromosómico, EST, ADNc, ARNm y ARNr.

El término "nucleótido", como se usa en el presente documento, se refiere a una unidad monomérica de un polinudeótido que consiste en una base heterocíclica, un azúcar y uno o más grupos fosfato. Las bases naturales (guanina, (G), adenina, (A), citosina, (C), timina, (T) y uracilo (U)) normalmente derivan de purina o pirimidina, aunque debe entenderse que también se incluyen análogos de bases naturales y no naturales. El azúcar natural es la pentosa (azúcar de cinco átomos de carbono) desoxirribosa (que forma el ADN) o ribosa (que forma el ARN), aunque debe entenderse que también se incluyen análogos de azúcares naturales y no naturales. Los ácidos nucleicos normalmente están unidos mediante enlaces fosfato para formar ácidos nucleicos o polinucleótidos, aunque se conocen muchos otros enlaces en la técnica (por ejemplo, fosforotioatos, boranofosfatos y similares).

Los polinucleótidos que se describen en el presente documento pueden comprender nucleótidos degenerados que se definen de acuerdo con el código IUPAC para la degeneración de nucleótidos en donde B es C, G o T; D es A, G o T; H es A, C o T; K es G o T; M es A o C; N es A, C, G o T; R es A o G; S es C o G; V es A, C o G; W es A o T; y Y es C o T.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se refieren a un polímero de restos de aminoácidos. La expresión "polipéptido recombinante" se refiere a un polipéptido que se produce mediante técnicas de ADN recombinante, en donde generalmente el ADN que codifica la proteína expresada o el ARN se inserta en un vector de expresión adecuado que a su vez se usa para transformar una célula hospedadora para producir el polipéptido o ARN.

En algunas realizaciones, el polipéptido, polinudeótido o hidrocarburo que tiene un nivel de expresión alterado o modificado está "sobreexpresado" o tiene un "nivel de expresión aumentado". Como se usa en el presente documento, "sobreexpresar" y "aumentar el nivel de expresión" significan expresar o hacer que se exprese un polinudeótido, polipéptido o hidrocarburo en una célula a una concentración superior a la que se expresa normalmente en una célula de tipo silvestre correspondiente en las mismas condiciones. Por ejemplo, un polipéptido puede "sobreexpresarse" en una célula hospedadora modificada por ingeniería genética cuando el polipéptido está presente en una concentración mayor en la célula hospedadora modificada por ingeniería genética en comparación con su concentración en una célula hospedadora no modificada por ingeniería genética de la misma especie en las mismas condiciones.

En otras realizaciones, el polipéptido, polinudeótido o hidrocarburo que tiene un nivel de expresión alterado está "atenuado" o tiene un "nivel de expresión disminuido". Como se usa en el presente documento, "atenuar" y "disminuir el nivel de expresión" significan expresar o hacer que se exprese un polinudeótido, polipéptido o hidrocarburo en una célula a una concentración inferior a la que se expresa normalmente en una célula de tipo silvestre correspondiente en las mismas condiciones.

El grado de sobreexpresión o atenuación puede ser de 1,5 veces o más, por ejemplo, 2 veces o más, 3 veces o más, 5 veces o más, 10 veces o más, o 15 veces o más. Como alternativa, o además, el grado de sobreexpresión o atenuación puede ser de 500 veces o menos, por ejemplo, 100 veces o menos, 50 veces o menos, 25 veces o menos, o 20 veces o menos. Por tanto, el grado de sobreexpresión o atenuación puede estar limitada por dos cualquiera de los criterios de valoración anteriores. Por ejemplo, el grado de sobreexpresión o atenuación puede ser de 1,5-500 veces, 2-50 veces, 10-25 veces o 15-20 veces.

En algunas realizaciones, un polipéptido que se describe en el presente documento tiene "un nivel de actividad aumentado". Por "nivel de actividad aumentado" se entiende que un polipéptido tiene un nivel mayor de función bioquímica o biológica (por ejemplo, unión a ADN o actividad enzimática) en una célula hospedadora modificada por ingeniería genética en comparación con su nivel de función bioquímica y/o biológica en una célula hospedadora de tipo silvestre correspondiente en las mismas condiciones. El grado de actividad potenciada puede ser de aproximadamente el 10 % o más, aproximadamente el 20 % o más, aproximadamente el 50 % o más, aproximadamente el 75 % o más, aproximadamente el 100 % o más, aproximadamente el 200 % o más, aproximadamente el 500 % o más, aproximadamente el 1000 % o más, o cualquier intervalo incluido en los mismos.

Un polinucleótido o polipéptido puede atenuarse usando métodos conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, la expresión de un gen o polipéptido codificado por el gen se atenúa mediante la mutación de las secuencias polinucleótidas reguladoras que controlan la expresión del gen. En otras realizaciones, la expresión de un gen o polipéptido codificado por el gen se atenúa mediante la sobreexpresión de una proteína represora o proporcionando un elemento regulador exógeno que active una proteína represora. En aún otras realizaciones, se usan métodos de silenciamiento de genes basados en ADN o ARN para atenuar la expresión de un gen o polinucleótido. En algunas realizaciones, la expresión de un gen o polipéptido se atenúa totalmente, por ejemplo, suprimiendo toda o una porción de la secuencia polinucleotídica de un gen.

Un polinucleótido o polipéptido puede sobreexpresarse usando métodos conocidos en la técnica. En algunos aspectos, la sobreexpresión de un polipéptido se consigue mediante el uso de un elemento regulador exógeno. La expresión "elemento regulador exógeno" se refiere generalmente a un elemento regulador que se origina fuera de la célula hospedadora. Sin embargo, en determinados aspectos, la expresión "elemento regulador exógeno" puede referirse a un elemento regulador derivado de la célula hospedadora cuya función se replica o se usurpa con el fin de controlar la expresión de un polipéptido endógeno. Por ejemplo, si la célula hospedadora es una célula de E. coli y el polipéptido FadR es codificado por un gen endógeno fadR, entonces la expresión del fadR endógeno puede controlarse mediante un promotor derivado de otro gen de E. coli.

En algunos aspectos, el elemento regulador exógeno es un compuesto químico, tal como una molécula pequeña. Como se usa en el presente documento, la expresión "molécula pequeña" se refiere a una sustancia o compuesto que tiene un peso molecular inferior a aproximadamente 1.000 g/mol.

En algunos aspectos, el elemento regulador exógeno que controla la expresión de un gen fadR endógeno es una secuencia de control de la expresión que se une operativamente al gen fadR endógeno mediante integración recombinante en el genoma de la célula hospedadora. En determinados aspectos, la secuencia de control de la expresión se integra en un cromosoma de la célula hospedadora mediante recombinación homóloga, usando métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97(12): 6640-6645 (2000)).

Las secuencias de control de la expresión son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadores de la transcripción, sitios de entrada de ribosomas internos (IRES), sitios de unión de ribosomas (RBS) y similares, que proporcionan la expresión de la secuencia polinucleotídica en una célula hospedadora. Las secuencias de control de la expresión interactúan específicamente con proteínas celulares que participan en la transcripción (Maniatis et al., Science, 236: 1237-1245 (1987)). Se describen ejemplos de secuencias de control de la expresión en, por ejemplo, Goeddel, "Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). En los métodos de la invención la secuencia de control de la expresión es un promotor heterólogo y/o un sitio de unión de ribosomas.

En los métodos de la invención, una secuencia de control de la expresión está unida operativamente a una secuencia polinucleotídica. Por "unidas operativamente" se entiende que una secuencia polinucleotídica y una secuencia o secuencias de control de la expresión están conectadas de manera que permiten la expresión génica cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo, proteínas activadoras de la transcripción) se unen a la secuencia o secuencias de control de la expresión. Los promotores unidos operativamente se encuentran en dirección 5' de la secuencia polinucleotídica seleccionada en términos de la dirección de transcripción y traducción. Los potenciadores unidos operativamente se pueden ubicar en dirección 5', dentro o en dirección 3' del polinucleótido seleccionado.

En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica se proporciona a la célula hospedadora por medio de un vector recombinante, que comprende un promotor unido operativamente a la secuencia polinucleotídica. En determinadas realizaciones, el promotor es un promotor regulado por el desarrollo, específico de orgánulo, específico de tejido, inducible, constitutivo o específico de la célula.

Como se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico, es decir, una secuencia polinucleotídica, al que se ha unido. Un tipo de vector útil es un episoma (es decir, un ácido nucleico capaz de realizar la replicación extracromosómica). Los vectores útiles son aquellos capaces de realizar la replicación autónoma y/o expresión de ácidos nucleicos a los que están unidos. Los vectores capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están unidos operativamente se denominan, en el presente documento, "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión útiles en las técnicas de ADN recombinante se encuentran normalmente en forma de "plásmidos" que, en general, se refieren a bucles de ADN bicatenarios circulares que, en su forma vectorial, no están unidos al cromosoma. Los términos "plásmido" y "vector" se usan indistintamente en el presente documento, ya que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, también se incluyen otras formas de vectores de expresión que tienen funciones equivalentes y que se dan a conocer en la técnica a continuación.

La expresión "secuencias reguladoras", como se usa en el presente documento, normalmente se refiere a una secuencia de bases en el ADN, unida operativamente a secuencias de ADN que codifican una proteína que finalmente controla la expresión de la proteína. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen, pero sin limitación, secuencias promotoras de ARN, secuencias de unión de factor de transcripción, secuencias de terminación de la transcripción, moduladores de la transcripción (tales como elementos potenciadores), secuencias de nucleótidos que afectan a la estabilidad del ARN y secuencias reguladoras de la traducción (tales como sitios de unión a ribosomas (por ejemplo, secuencias de Shine-Dalgarno en procariotas o secuencias de Kozak en eucariotas), codones de inicio, codones de terminación).

Como se usa en el presente documento, la expresión "la expresión de dicha secuencia de nucleótidos se modifica con respecto a la secuencia de nucleótidos de tipo silvestre", significa un aumento o una disminución en el nivel de expresión y/o la actividad de una secuencia de nucleótidos endógena o la expresión y/o actividad de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido heterólogo o no nativo.

Como se usa en el presente documento, el término "expresar" con respecto a un polinucleótido es hacer que funcione. Un polinucleótido que codifica un polipéptido (o una proteína), cuando se expresa, se transcribirá o se traducirá para producir ese polipéptido (o esa proteína). Como se usa en el presente documento, el término "sobreexpresar" significa expresar o hacer que se exprese un polinucleótido o polipéptido en una célula a una concentración superior a la expresada normalmente en una célula de tipo silvestre correspondiente en las mismas condiciones.

En algunos aspectos, el vector recombinante comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en (a) una secuencia de control de la expresión acoplada operativamente a la secuencia polinucleotídica; (b) un marcador de selección acoplado operativamente a la secuencia polinucleotídica; (c) una secuencia marcadora acoplada operativamente a la secuencia polinucleotídica; (d) una fracción de purificación acoplada operativamente a la secuencia polinucleotídica; (e) una secuencia de secreción acoplada operativamente a la secuencia polinucleotídica; y (f) una secuencia de direccionamiento acoplada operativamente a la secuencia polinucleotídica.

Los vectores de expresión descritos en el presente documento incluyen una secuencia polinucleotídica que se describe en el presente documento en una forma adecuada para la expresión de la secuencia polinucleotídica en una célula hospedadora. Los expertos en la materia apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora que se vaya a transformar, el nivel de expresión del polipéptido deseado, etc. Los vectores de expresión descritos en el presente documento pueden introducirse en células hospedadoras para producir polipéptidos, incluyendo polipéptidos de fusión, codificados por las secuencias polinucleotídicas como se describe en el presente documento.

La expresión de genes que codifican polipéptidos en procariotas, por ejemplo, E. coli, se realiza con mayor frecuencia con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de polipéptidos de fusión o no fusión. Los vectores de fusión agregan una cantidad de aminoácidos a un polipéptido codificado en los mismos, por lo general al extremo amino o carboxilo del polipéptido recombinante. Dichos vectores de fusión normalmente sirven para uno o más de los tres fines siguientes: (1) aumentar la expresión del polipéptido recombinante; (2) aumentar la solubilidad del polipéptido recombinante; y (3) ayudar en la purificación del polipéptido recombinante actuando como ligando en la purificación por afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión de la fracción de fusión y el polipéptido recombinante. Esto permite la separación del polipéptido recombinante de la fracción de fusión después de la purificación del polipéptido de fusión. Los ejemplos de dichas enzimas, y sus secuencias de reconocimiento afines, incluyen el factor Xa, la trombina y la enterocinasa. Los vectores de expresión de fusión de ejemplo incluyen pGEX (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ; Smith et al., Gene, 67: 31-40 (1988)), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRITS (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, N.J.), que fusionan glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa E o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana.

Se conocen bien en la técnica sistemas de expresión adecuados para células procariotas y eucariotas; véase, por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory (1989). Los ejemplos de vectores de expresión de E. coli no de fusión inducibles incluyen pTrc (Amann et al., Gene, 69: 301-315 (1988)) y PET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA, págs. 60-89 (1990)). En determinadas realizaciones, una secuencia polinucleotídica de la invención está unida operativamente a un promotor derivado del bacteriófago T5. Los ejemplos de vectores para la expresión en levadura incluyen pYepSec1 (Baldari et al., EMBO J., 6: 229-234 (1987)), pMFa (Kurjan et al., Cell, 30: 933-943 (1982)), pJRY88 (Schultz et al., Gene, 54: 113-123 (1987)), pYES2 (Invitrogen Corp., San Diego, CA) y picZ (Invitrogen Corp., San Diego, CA). Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (por ejemplo, células Sf9) incluyen, por ejemplo, la serie pAc (Smith et al., Mol. Cell Biol., 3: 2156 2165 (1983)) y la serie de pVL (Lucklow et al., Virology, 170: 31-39 (1989)). Los ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed, Nature, 329: 840 (1987)) y pMT2PC (Kaufinan et al., EMBO J , 6: 187-195 (1987)).

Los vectores pueden introducirse en células procariotas o eucariotas mediante técnicas convencionales de transformación o transfección. Como se usa en el presente documento, los términos "transformación" y "transfección" se refieren a diversas técnicas reconocidas por la técnica para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) en una célula hospedadora, incluyendo la coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, la transfección mediada por DEAE-dextrano, la lipofección o la electroporación. Se pueden encontrar métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedadoras en, por ejemplo, Sambrook et al. (citado anteriormente).

Para la transformación estable de células bacterianas, se sabe que, según el vector de expresión y la técnica de transformación utilizada, solo una fracción pequeña de células captará y replicará el vector de expresión. Para identificar y seleccionar estos transformantes, se puede introducir un gen que codifique un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a un antibiótico) en las células hospedadoras junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionares incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos tales como, pero sin limitación, ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Los ácidos nucleicos que codifican un marcador seleccionable pueden introducirse en una célula hospedadora en el mismo vector que el que codifica un polipéptido descrito en el presente documento o pueden introducirse en un vector separado. Las células transformadas de manera estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse mediante crecimiento en presencia de un fármaco de selección apropiado.

De la misma manera, para la transfección estable en células de mamífero, se sabe que, según el vector de expresión y la técnica de transfección utilizada, solo una pequeña fracción de las células puede integrar el ADN extraño en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, se puede introducir un gen que codifique un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a un antibiótico) en las células hospedadoras junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen los que confieren resistencia a fármacos, tal como G418, higromicina y metotrexato. Los ácidos nucleicos que codifican un marcador seleccionable pueden introducirse en una célula hospedadora en el mismo vector que el que codifica un polipéptido descrito en el presente documento o pueden introducirse en un vector separado. Las células transfectadas de manera estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse mediante crecimiento en presencia de un fármaco de selección apropiado.

En algunas realizaciones, el polipéptido FadR tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

En otras realizaciones, el polipéptido FadR está codificado por un gen fadR obtenido de microorganismos del género Escherichia, Salmonella, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Cronobacter, Yersinia, Serratia, Erwinia, Pectobacterium, Photorhabdus, Edwardsiella, Shewanella o Vibrio.

En otras realizaciones, el polipéptido FadR es un homólogo de FadR que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

La identidad de un polipéptido FadR que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 no está particularmente limitada y un experto habitual en la técnica puede identificar fácilmente los homólogos de FadR derivado de E. coli MG1655 usando los métodos que se describen en el presente documento así como métodos conocidos en la técnica.

Como se usan en el presente documento, los términos "homólogo", y "homólogos" se refieren a un polinucleótido o un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 50 % idéntica a la secuencia polinucleotídica o polipeptídica correspondiente. Preferentemente, los polinucleótidos o polipéptidos homólogos tienen secuencias de polinucleótidos o secuencias de aminoácidos que tienen al menos aproximadamente un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 2 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o al menos aproximadamente un 99 % de homología con la secuencia de aminoácidos o la secuencia polinucleotídica correspondientes. Como se usan en el presente documento, los términos "homología" de secuencia e "identidad" de secuencia se usan indistintamente.

En resumen, los cálculos de "homología" entre dos secuencias se pueden realizar de la siguiente manera. Se alinean las secuencias con fines comparativos óptimos (por ejemplo, se pueden introducir huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para un alineamiento óptimo, y las secuencias no homólogas se pueden descartar para fines comparativos). Luego se comparan los restos de aminoácidos o nucleótidos de las posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes de la primera y segunda secuencias. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se usa en el presente documento, "identidad" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a "homología" de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para una alineación óptima de las dos secuencias.

Puede realizarse la comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de homología entre dos secuencias usando un algoritmo matemático, tal como BLAST (Altschul et al. J. Mol. Biol., 215(3): 403-410 (1990)). El porcentaje de homología entre dos secuencias de aminoácidos también se puede determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch, que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 444-453 (1970)). El porcentaje de homología entre dos secuencias de nucleótidos también se puede determinar usando el programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Un experto en la materia puede realizar cálculos iniciales de homología y ajustar los parámetros del algoritmo en consecuencia. Un conjunto preferido de parámetros (y el que debería usarse si un profesional no estuviera seguro acerca de qué parámetros deben aplicarse para determinar si una molécula está dentro de una limitación de homología de las reivindicaciones) es una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización por hueco de 12, una penalización por hueco extendido de 4 y una penalización por hueco de desplazamiento de fase de 5. Se conocen métodos adicionales de alineamiento de secuencias en las técnicas de biotecnología (véase, por ejemplo, Rosenberg, BMC Bioinformatics, 6: 278 (2005); Altschul et al., FEBS J , 272(20): 5101-5109 (2005)).

Como se usa en el presente documento, la expresión "híbrida en condiciones de rigurosidad bajas, rigurosidad media, rigurosidad alta o rigurosidad muy alta" describe las condiciones para la hibridación y el lavado. Puede encontrarse orientación para llevar a cabo las reacciones de hibridación en "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1 - 6.3.6. En esa referencia, se describen métodos acuosos y no acuosos, y puede usarse cualquier método. Las condiciones de hibridación específicas citadas en el presente documento son las siguientes: 1) condiciones de hibridación de baja rigurosidad en cloruro de sodio/citrato de sodio 6X (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido de dos lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1 % al menos a 50 °C (la temperatura de los lavados puede aumentarse a 55 °C para las condiciones de baja rigurosidad); 2) condiciones de hibridación de rigurosidad media en SSC 6X a aproximadamente 45 °C, seguida de uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1 % a 60 °C; 3) condiciones de hibridación de rigurosidad elevada en SSC 6X a aproximadamente 45 °C, seguido de uno o más lavados en 0,2x SSC, SDS al 0,1 % a 65 °C; y preferentemente 4) condiciones de hibridación de muy alta rigurosidad son fosfato de sodio 0,5M, SDS al 7 % a 65 °C, seguida de uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 1 % a 65 °C. Las condiciones de rigurosidad muy alta (4) son las condiciones preferidas a menos que se especifique lo contrario.

En algunas realizaciones, el polipéptido es un fragmento de cualquiera de los polipéptidos que se describen en el presente documento. El término "fragmento" se refiere a una parte más corta de un polipéptido o de una proteína de longitud completa que varía en tamaño desde cuatro restos de aminoácidos hasta la secuencia de aminoácidos completa menos un resto de aminoácido. En determinadas realizaciones de la invención, un fragmento se refiere a la secuencia de aminoácidos completa de un dominio de un polipéptido o de una proteína (por ejemplo, un dominio de unión al sustrato o un dominio catalítico).

Un polipéptido "endógeno" se refiere a un polipéptido codificado por el genoma de la célula microbiana parental (también denominada "célula hospedadora") a partir de la que la célula recombinante se modifica por ingeniería genética (o se "deriva").

Un polipéptido "exógeno" se refiere a un polipéptido que no está codificado por el genoma de la célula microbiana parental. Una variante de polipéptido (es decir, mutante) es un ejemplo de un polipéptido exógeno.

El término "heterólogo", como se usa en el presente documento, se refiere normalmente a una secuencia de nucleótidos o a una proteína que no está presente de forma natural en un organismo. Por ejemplo, una secuencia polinucleotídica endógena a una planta puede introducirse en una célula hospedadora mediante métodos recombinantes y el polinucleótido vegetal es entonces un polinucleótido heterólogo en una célula hospedadora recombinante.

En algunas realizaciones, el polipéptido es un mutante o una variante de cualquiera de los polipéptidos descritos en el presente documento. Los términos "mutante" y "variante", como se usan en el presente documento, se refieren a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de un polipéptido de tipo silvestre en al menos un aminoácido. Por ejemplo, el mutante puede comprender una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos conservadoras: el reemplazo de un aminoácido alifático, tal como alanina, valina, leucina e isoleucina, con otro aminoácido alifático; el reemplazo de una serina con una treonina; el reemplazo de una treonina con una serina; el reemplazo de un resto ácido, tal como el ácido aspártico y el ácido glutámico, con otro resto ácido; el reemplazo de un resto portador de un grupo amida, tal como la asparagina y la glutamina, con otro resto portador de un grupo amida; el intercambio de un resto básico, tal como lisina y arginina, con otro resto básico; y el reemplazo de un resto aromático, tal como fenilalanina y tirosina, con otro resto aromático. En algunas realizaciones, el polipéptido mutante tiene aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más sustituciones, adiciones, inserciones o supresiones de aminoácidos.

Como se usa en el presente documento, el término "mutagénesis" se refiere a un proceso mediante el que la información genética de un organismo se cambia de manera estable. La mutagénesis de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína produce una proteína mutante. La mutagénesis también se refiere a cambios en las secuencias de ácido nucleico no codificantes que producen una actividad proteica modificada.

Como se usa en el presente documento, el término "gen" se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican un producto de ARN o un producto proteico, así como secuencias de ácido nucleico unidas operativamente que afectan a la expresión del ARN o proteína (por ejemplo, dichas secuencias incluyen, pero sin limitación, secuencias promotoras o potenciadoras) o secuencias de ácido nucleico unidas operativamente que codifican secuencias que afectan a la expresión del ARN o proteína (por ejemplo, dichas secuencias incluyen, pero sin limitación, sitios de unión a ribosomas o secuencias de control de la traducción).

En determinadas realizaciones, el polipéptido FadR comprende una mutación en un resto de aminoácido que corresponde al aminoácido 219 de la s Eq ID NO: 1. En determinadas realizaciones, la mutación da como resultado una sustitución del resto de aminoácido correspondiente al aminoácido 219 de la SEQ ID NO: 1 con un resto de asparagina. La mutación FadR(S219N) se ha descrito anteriormente (Raman et al., J. Biol. Chem., 270: 1092-1097 (1995)).

Los fragmentos preferidos o mutantes de un polipéptido conservan una parte o la totalidad de la función biológica (por ejemplo, la actividad enzimática) del polipéptido de tipo silvestre correspondiente. En algunas realizaciones, el fragmento o mutante conserva al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98 % o más de la función biológica del polipéptido de tipo silvestre correspondiente. En otras realizaciones, el fragmento o mutante conserva aproximadamente el 100 % de la función biológica del polipéptido de tipo silvestre correspondiente. Puede encontrarse orientación para determinar qué restos de aminoácidos pueden sustituirse, insertarse o suprimirse sin afectar a la actividad biológica usando programas informáticos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, software LASERGENE™ (DNASTAR, Inc., Madison, WI).

En otras realizaciones más, un fragmento o mutante presenta una función biológica aumentada en comparación con el polipéptido de tipo silvestre correspondiente. Por ejemplo, un fragmento o mutante puede mostrar al menos un 10 %, al menos un 25 %, al menos un 50 %, al menos un 75 % o al menos un 90 % de mejora en la actividad enzimática en comparación con el polipéptido de tipo silvestre correspondiente. En otras realizaciones, el fragmento o mutante presenta una mejora de al menos el 100 % (por ejemplo, al menos el 200 % o al menos el 500 %) de la actividad enzimática en comparación con el polipéptido de tipo silvestre correspondiente.

Se entiende que los polipéptidos descritos en el presente documento pueden tener sustituciones de aminoácidos conservativas o no esenciales adicionales, que no tengan un efecto sustancial sobre la función del polipéptido. Si se tolerará o no una determinada sustitución (es decir, si no afectará negativamente a la función biológica deseada), como la unión del ADN o la actividad enzimática) puede determinarse como se describe en Bowie et al. (Science, 247: 1306-1310 (1990)).

Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la que se reemplaza el resto de aminoácido por un resto de aminoácido que tenga una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tiroides, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

Las variantes pueden ser naturales o creadas in vitro. En particular, dichas variantes se pueden crear usando técnicas de ingeniería genética, tales como mutagénesis dirigida, mutagénesis química aleatoria, procedimientos de eliminación de exonucleasa III o técnicas de clonación convencionales. Como alternativa, dichas variantes, fragmentos, análogos o derivados se pueden crear mediante síntesis química o procedimientos de modificación.

Los métodos para crear variantes son bien conocidos en la técnica. Estos incluyen procedimientos en los que se modifican las secuencias de ácido nucleico obtenidas a partir de aislados naturales para generar ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que tienen características que potencian su valor en aplicaciones industriales o de laboratorio. En dichos procedimientos, se genera y se caracteriza un gran número de secuencias variantes que tienen una o más diferencias de nucleótidos con respecto a la secuencia obtenida del aislado natural. Normalmente, estas diferencias de nucleótidos dan como resultado cambios en los aminoácidos con respecto a los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos de los aislados naturales.

Por ejemplo, las variantes pueden prepararse usando mutagénesis aleatoria y dirigida (véase, por ejemplo, Arnold, Curr. Opin. Biotech., 4: 450-455 (1993)). La mutagénesis aleatoria se puede lograr usando PCR propensa a errores (véase, por ejemplo, Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989); y Caldwell et al., PCR Methods Applic., 2: 28-33 (1992)). La mutagénesis dirigida se puede realizar usando mutagénesis dirigida a oligonucleótidos para generar mutaciones específicas del sitio en cualquier ADN clonado de interés (véase, por ejemplo, Reidhaar-Olson et al., Science, 241: 53-57 (1988)). Otros métodos para generar variantes incluyen, por ejemplo, ensamblaje PCR (véase, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. 5.965.408), mutagénesis sexual por PCR (véase, por ejemplo, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 91: 10747-10751 (1994) y la Patentes de los EE.UU. 5.965.408 y 5.939.250), mutagénesis de conjunto recursiva (véase, por ejemplo, Arkin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 89: 7811-7815 (1992)) y mutagénesis de conjunto exponencial (véase, por ejemplo, Delegrave et al., Biotech. Res, 11: 1548-1552 (1993).

También pueden crearse variantes por mutagénesis in vivo. En algunas realizaciones, se generan mutaciones aleatorias en una secuencia de ácido nucleico propagando la secuencia en una cepa bacteriana, tal como una cepa de E. coli, que porta mutaciones en una o más de las vías de reparación del ADN. Dichas cepas "mutadoras" tienen una tasa de mutación aleatoria más alta que la de una cepa de tipo silvestre. La propagación de una secuencia de ADN (por ejemplo, una secuencia polinucleotídica que codifica una PPTasa) en una de estas cepas finalmente generará mutaciones aleatorias en el ADN. Se describen cepas mutadoras adecuadas para su uso en mutagénesis in vivo, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N.° WO 1991/016427.

Las variantes también se pueden generar usando mutagénesis en casete. En la mutagénesis en casete, una pequeña región de una molécula de ADN bicatenaria se reemplaza con un "casete" de oligonucleótido sintético que difiere de la secuencia nativa. El oligonucleótido suele contener una secuencia nativa completa y/o parcialmente aleatoria.

Como se usa en el presente documento, una "célula hospedadora" es una célula utilizada para producir un producto que se describe en el presente documento (por ejemplo, un aldehído graso o un alcohol graso). En cualquiera de los aspectos de la divulgación descritos en el presente documento, la célula hospedadora puede seleccionarse del grupo que consiste en una célula de mamífero, célula vegetal, célula de insecto, célula fúngica (por ejemplo, una célula fúngica filamentosa o una célula de levadura) y célula bacteriana. En la presente invención, la célula hospedadora es una célula bacteriana. Una célula hospedadora se denomina "célula hospedadora modificada por ingeniería genética" o "célula hospedadora recombinada" si la expresión de uno o más polinucleótidos o polipéptidos en la célula hospedadora se altera o modifica en comparación con su expresión en una célula hospedadora de tipo silvestre correspondiente en las mismas condiciones.

En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula bacteriana grampositiva. En otras realizaciones, la célula hospedadora es una célula bacteriana gramnegativa.

En algunos aspectos, la célula hospedadora se selecciona entre el género Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Stenotrophamonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia o Streptomyces.

En otras realizaciones, la célula hospedadora es una célula de Bacillus lentus, una célula de Bacillus brevis, una célula de Bacillus stearothermophilus, una célula de Bacillus lichenformis, una célula de Bacillus alkalophilus, una célula de Bacillus coagulans, una célula de Bacillus circulans, una célula de Bacillus pumilis, una célula de Bacillus thuringiensis, una célula de Bacillus clausii, una célula de Bacillus megaterium, una célula de Bacillus subtilis o una célula de Bacillus amyloliquefaciens.

En otros aspectos, la célula hospedadora es una célula de Trichoderma koningii, una célula de Trichoderma viride, una célula de Trichoderma reesei, una célula de Trichoderma longibrachiatum, una célula de Aspergillus awamori, una célula de Aspergillus fumigates, una célula de Aspergillus foetidus, una célula de Aspergillus nidulans, una célula de Aspergillus niger, una célula de Aspergillus oryzae, una célula de Humicola insolens, una célula de Humicola lanuginose, una célula de Rhodococcus opacus, una célula de Rhizomucor miehei o una célula de Mucor michei.

En otras realizaciones más, la célula hospedadora es una célula de Streptomyces lividans o una célula de Streptomyces murinus.

En otras realizaciones más, la célula hospedadora es una célula de Actinomycetes.

En algunos aspectos, la célula hospedadora es una célula de Saccharomyces cerevisiae. En algunos aspectos, la célula hospedadora es una célula de Saccharomyces cerevisiae.

En otros aspectos más, la célula hospedadora es una célula CHO, una célula COS, una célula VERO, una célula BHK, una célula HeLa, una célula Cvl, una célula MDCK, una célula 293, una célula 3T3 o una célula PC12.

En otros aspectos, la célula hospedadora es una célula de una planta eucariota, alga, cianobacteria, bacteria verde de azufre, bacteria verde no de azufre, bacteria púrpura de azufre, bacteria púrpura no de azufre, extremófilo, levadura, hongo, un organismo de modificado por ingeniería genética de la misma o un organismo sintético. En algunos aspectos, la célula hospedadora depende de la luz o fija el carbono. En algunos aspectos, la célula hospedadora tiene actividad autótrofa. En algunos aspectos, la célula hospedadora tiene actividad fotoautótrofa, tal como en presencia de luz. En algunos aspectos, la célula hospedadora es heterótrofa o mixotrófica en ausencia de luz. En determinados aspectos, la célula hospedadora es una célula de Avabidopsis thaliana, Panicum virgatum, Miscanthus giganteus, Zea mays, Botryococcuse braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Dunaliela salina, Synechococcus Sp. PCC 7002, ^{Synechococcus Sp. PCC 7942, Synechocystis Sp. PCC 6803, Thermosynechococcus elongates}bP-1, ^Chlorobiumtepidum, Chlorojlexus auranticus, Chromatiumm vinosum, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter capsulatus, Rhodopseudomonas palusris, Clostridium ljungdahlii, Clostridiuthermocellum, Penicillium chrysogenum, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pseudomonasjluorescens o Zymomonas mobilis.

En determinadas realizaciones preferidas, la célula hospedadora es una célula de E. coli. En algunas realizaciones, la célula de E. coli es una célula de E. coli cepa B, una cepa C, una cepa K o cepa W.

En otras realizaciones, la célula hospedadora es una célula de Pantoea citrea.

Como se usa en el presente documento, la expresión "condiciones permisivas para la producción" significa cualesquier condiciones que permitan a una célula hospedadora producir un producto deseado, tal como un ácido graso o un derivado de un ácido graso. De la misma manera, la expresión "condiciones en las que se expresa la secuencia polinucleotídica de un vector" significa cualesquier condiciones que permitan que una célula hospedadora sintetice un polipéptido. Las condiciones adecuadas incluyen, por ejemplo, las condiciones de fermentación. Las condiciones de fermentación pueden comprender muchos parámetros, tales como intervalos de temperatura, niveles de aireación y composición de los medios. Cada una de estas condiciones, de forma individual y en combinación, permite que la célula hospedadora crezca. Los medios de cultivo ilustrativos incluyen caldos o geles. Generalmente, el medio incluye una fuente de carbono que puede ser metabolizada directamente por una célula hospedadora. Además, pueden usarse enzimas en el medio para facilitar la movilización (por ejemplo, la despolimerización de almidón o celulosa a azúcares fermentables) y el metabolismo posterior de la fuente de carbono.

Como se usa en el presente documento, la frase "fuente de carbono" se refiere a un sustrato o compuesto adecuado para usarse como fuente de carbono para el crecimiento de células procarióticas o eucariotas simples. Las fuentes de carbono pueden ser de diferentes formas, incluyendo, pero sin limitación, polímeros, hidratos de carbono, ácidos, alcoholes, aldehídos, cetonas, aminoácidos, péptidos y gases (por ejemplo, CO y CO²). Los ejemplos de fuentes de carbono incluyen, pero sin limitación, monosacáridos, tales como glucosa, fructosa, manosa, galactosa, xilosa y arabinosa; oligosacáridos, tales como fructo-oligosacárido y galacto-oligosacárido; polisacáridos, tales como almidón, celulosa, pectina y xilano; disacáridos, tales como sacarosa, maltosa y turanosa; material celulósico y variantes tales como metilcelulosa y carboximetilcelulosa de sodio; ésteres de ácidos grasos saturados o insaturados, succinato, lactato y acetato; alcoholes, tales como etanol, metanol y glicerol, o mezclas de los mismos. Además, la fuente de carbono puede ser un producto de la fotosíntesis, tal como glucosa. En determinadas realizaciones preferidas, la fuente de carbono es biomasa. En otras realizaciones preferidas, la fuente de carbono es glucosa. En otras realizaciones preferidas, la fuente de carbono es sacarosa.

Como se usa en el presente documento, El término "biomasa" se refiere a cualquier material biológico del que deriva una fuente de carbono. En algunas realizaciones, una biomasa se procesa en una fuente de carbono, que es adecuada para la bioconversión. En otras realizaciones, la biomasa no requiere procesamiento adicional en una fuente de carbono. La fuente de carbono puede convertirse en un biocombustible. Una fuente ilustrativa de biomasa es materia vegetal o vegetación, tal como de maíz, caña de azúcar o césped de pradera. Otra fuente ilustrativa de biomasa son los productos de desecho metabólicos, tales como materia animal (por ejemplo, estiércol de vaca). Otras fuentes ilustrativas de biomasa incluyen algas y otras plantas marinas. La biomasa también incluye productos de desecho de la industria, agricultura, la silvicultura y los hogares, incluyendo, pero sin limitación, residuos de fermentación, ensilado, paja, madera no procesada, aguas residuales, basura, restos celulósicos urbanos y restos de comida. El término "biomasa" también puede referirse a fuentes de carbono, tales como hidratos de carbono (por ejemplo, monosacáridos, disacáridos o polisacáridos).

Como se usa en el presente documento, el término "clon" normalmente se refiere a una célula o a un grupo de células descendientes de y esencialmente idénticas genéticamente a un único ancestro común, por ejemplo, las bacterias de una colonia bacteriana clonada surgieron de una sola célula bacteriana.

Como se usa en el presente documento, el término "cultivo" típico se refiere a un medio líquido que comprende células viables. En una realización, un cultivo comprende células que se reproducen en un medio de cultivo predeterminado en condiciones controladas, por ejemplo, un cultivo de células hospedadoras recombinantes cultivadas en medios líquidos que comprenden una fuente de carbono y nitrógeno seleccionados.

Por "cultivo" o "cultivo" se entiende el cultivo de una población de células hospedadoras recombinantes en condiciones adecuadas en un medio líquido o sólido. En realizaciones particulares, cultivar se refiere a la bioconversión fermentativa de un sustrato hasta la obtención de un producto final. Los medios de cultivo son bien conocidos, y los componentes individuales de dichos medios de cultivo están disponibles en fuentes comerciales, por ejemplo, con las marcas comerciales Difco™ y BBL™. En un ejemplo no limitante, el medio de nutrientes acuoso es un "medio rico" que comprende fuentes complejas de nitrógeno, sales y carbono, tales como el medio YP, que comprende 10 g/l de peptona y 10 g/l de extracto de levadura de dicho medio.

Para determinar si las condiciones son suficientes para permitir la producción de un producto o la expresión de un polipéptido, una célula hospedadora puede cultivarse, por ejemplo, durante aproximadamente 4, 8, 12, 24, 36, 48, 72 o más horas. Durante y/o después del cultivo, pueden obtenerse y analizarse muestras para determinar si las condiciones permiten la producción o la expresión. Por ejemplo, las células hospedadoras en la muestra o el medio en el que se cultivaron las células hospedadoras pueden someterse a ensayo para detectar la presencia de un producto deseado. Cuando se somete a ensayo la presencia de un ácido graso o un derivado de un ácido graso, pueden usarse ensayos, tales como, pero sin limitación, EM, cromatografía de capa fina (CCF), cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), cromatografía líquida (CL), CG acoplada a un detector de ionización de llama (DIL), CG-EM y CL-EM. Cuando se somete a ensayo para determinar la expresión de un polipéptido, pueden usarse técnicas tales como, pero sin limitación, transferencia Western y transferencia puntual.

En los métodos de la invención, la producción y el aislamiento de ácidos grasos y derivados de ácidos grasos pueden potenciarse optimizando las condiciones de fermentación. En algunas realizaciones, las condiciones de fermentación se optimizan para aumentar el porcentaje de la fuente de carbono que se convierte en productos hidrocarbonados. Durante los ciclos de vida celular normales, el carbono se usa en funciones celulares, tales como la producción de lípidos, sacáridos, proteínas, ácidos orgánicos y ácidos nucleicos. La reducción de la cantidad de carbono necesaria para las actividades relacionadas con el crecimiento puede aumentar la eficacia de la conversión de la fuente de carbono en producto. Esto puede conseguirse mediante, por ejemplo, en primer lugar cultivar las células hospedadoras hasta una densidad deseada (por ejemplo, una densidad alcanzada en el pico de la fase logarítmica de crecimiento). En dicho punto, los genes de punto de control de la replicación pueden aprovecharse para detener el crecimiento de las células. Específicamente, pueden usarse mecanismos de detección de quórum (revisado en Camilli et al., Science 311: 1113 (2006); Venturi, FEMS Microbiol. Rev., 30: 274-291 (2006); y Reading et al., FEMS Microbiol. Lett, 254: 1 11 (2006)) para activar los genes de punto de control, tales como p53, p21 u otros genes de punto de control.

Los genes que pueden activarse para detener la replicación celular y el crecimiento de E. coli incluyen los genes de umuDC. La sobreexpresión de los genes de umuDC detiene la progresión de la fase estacionaria al crecimiento exponencial (Murli et al., J. Bacteriol., 182: 1127-1135 (2000)). La UmuC es una ADN polimerasa que puede realizar la síntesis por translesión sobre las lesiones no codificantes que habitualmente son resultado de la mutagénesis ultravioleta (UV) y química. Los productos génicos de umuDC están implicados en el proceso de síntesis por translesión y también sirven como punto de control del daño de secuencia de ADN. Los productos génicos de umuDC incluyen UmuC, UmuD, umuD', UmuD'²C, UmuD'²y UmuD². Simultáneamente, los genes productores de productos pueden activarse, de manera que se minimiza la necesidad de usar vías de replicación y mantenimiento mientras se prepara un aldehído graso o alcohol graso. También pueden modificarse por ingeniería genética células hospedadoras para que expresen umuC y umuD de E. coli en pBAD24 bajo el sistema del promotor de prpBCDE a través de síntesis de novo de este gen con los genes de producción de productos finales apropiados.

La célula hospedadora puede modificarse por ingeniería genética adicionalmente para expresar un celulosoma recombinante, que puede permitir que la célula hospedadora use material celulósico como fuente de carbono. Los celulosomas de ejemplo adecuados para su uso en los métodos de la invención incluyen, por ejemplo, los celulosomas descritos en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional WO 2008/100251. La célula hospedadora también puede modificarse por ingeniería genética para asimilar el carbono de manera eficiente y usar materiales celulósicos como fuentes de carbono de acuerdo con los métodos descritos en las Patentes de los EE.UU. 5.000.000; 5.028.539; 5.424.202; 5.482.846; y 5.602.030. Además, la célula hospedadora se puede diseñar genéticamente para expresar una invertasa a fin de poderse usar la sacarosa como fuente de carbono.

En algunas realizaciones de los métodos de fermentación de la invención, la cámara de fermentación encierra una fermentación que experimenta una reducción continua, creando de este modo un entorno reductor estable. El equilibrio de electrones puede mantenerse mediante la liberación de dióxido de carbono (en forma gaseosa). Los esfuerzos para aumentar el equilibrio de NAD/H y NADP/H también pueden facilitar la estabilización del equilibrio de electrones. La disponibilidad del NADPH intracelular también puede potenciarse mediante ingeniería genética de la célula hospedadora para expresar una transhidrogenasa NADH:NADPH. La expresión de una o más transhidrogenasas NADH:NADPH convierte el NADH producido en la glicólisis en NADPH, que puede potenciar la producción de aldehídos grasos y alcoholes grasos.

Para la producción a pequeña escala, las células hospedadoras diseñadas se pueden cultivar en lotes de, por ejemplo, aproximadamente 100 ml, 500 ml, 1 l, 2 l, 5 l o 10 l; fermentarse; e inducirse para expresar una secuencia polinucleotídica deseada, tal como una secuencia polinucleotídica que codifica una PPTasa. Para la producción a gran escala, las células hospedadoras modificadas por ingeniería genética pueden crecer en lotes de aproximadamente 10 l, 100 l, 1000 l, 10.000 l, 100.000 l, 1.000.000 l o más grandes; fermentarse; e inducirse para expresar una secuencia polinucleotídica deseada.

Los ácidos grasos y derivados de los mismos producidos mediante los métodos de la invención generalmente se aíslan de la célula hospedadora. El término "aislado", como se usa en el presente documento con respecto a los productos, tales como ácidos grasos y derivados de los mismos, se refiere a los productos que se separan de los componentes celulares, medios de cultivo celular, o precursores químicos o sintéticos. Los ácidos grasos y derivados de los mismos producidos mediante los métodos descritos en el presente documento pueden ser relativamente inmiscibles en el caldo de fermentación, así como en el citoplasma. Por tanto, los ácidos grasos y sus derivados pueden acumularse en una fase orgánica, ya sea intracelular o extracelularmente. La recogida de los productos en la fase orgánica puede reducir el impacto del ácido graso o derivado de ácido graso en la función celular y puede permitir a la célula hospedadora producir más producto.

En algunas realizaciones, los ácidos grasos y derivados de ácidos grasos producidos mediante los métodos de la invención se purifican. Como se usa en el presente documento, el término "purificar", "purificado/a" o "purificación" significan la eliminación o el aislamiento de una molécula de su entorno mediante, por ejemplo, aislamiento o separación. Las moléculas "esencialmente purificadas" están al menos aproximadamente un 60 % libres (por ejemplo, al menos aproximadamente un 70 % libres, al menos aproximadamente un 75 % libres, al menos aproximadamente un 85 % libres, al menos aproximadamente un 90 % libres, al menos aproximadamente un 95 % libres, al menos aproximadamente un 97 % libres, al menos aproximadamente un 99 % libres) de otros componentes con los que están asociados. Como se usa en el presente documento, estos términos también se refieren a la eliminación de contaminantes de una muestra. Por ejemplo, la eliminación de contaminantes puede dar como resultado un aumento del porcentaje de un aldehído graso o un alcohol graso en una muestra. Por ejemplo, cuando se produce un aldehído graso o un alcohol graso en una célula hospedadora, el aldehído graso o el alcohol graso puede purificarse mediante la eliminación de las proteínas de la célula hospedadora. Después de la purificación, el porcentaje de un ácido graso o derivado del mismo en la muestra se aumenta.

Como se usa en el presente documento, Los términos "purificar", "purificado/a" y "purificación" son términos relativos que no requieren una pureza absoluta. Por tanto, por ejemplo, cuando se produce un ácido graso o un derivado del mismo en las células hospedadoras, un ácido graso o derivado del mismo purificado es un ácido graso o un derivado del mismo que se separa sustancialmente de otros componentes celulares (por ejemplo, ácidos nucleicos, polipéptidos, lípidos, carbohidratos u otros hidrocarburos).

Adicionalmente, una preparación de ácidos grasos purificados o una preparación de derivados de ácidos grasos purificados es una preparación de ácidos grasos o una preparación de derivados de ácidos grasos en las que el ácido graso o el derivado del mismo está sustancialmente libre de contaminantes, como los que podría haber después de la fermentación. En algunas realizaciones, se purifica un ácido graso o derivado del mismo cuando al menos el 50 % en peso de una muestra está compuesto por el ácido graso o derivado de ácido graso. En otras realizaciones, un ácido graso o un derivado del mismo se purifica cuando al menos aproximadamente el 60 %, por ejemplo, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 92 % o más en peso de una muestra está compuesto por el ácido graso o derivado del mismo. Como alternativa, o además, un ácido graso o derivado del mismo se purifica cuando menos de aproximadamente el 100 %, por ejemplo, menos de aproximadamente el 99 %, menos de aproximadamente el 98 %, menos de aproximadamente el 95 %, menos de aproximadamente el 90 % o menos de aproximadamente el 80 % en peso de una muestra está compuesto por el ácido graso o derivado del mismo. Por tanto, un ácido graso o derivado del mismo purificado puede tener un nivel de pureza limitado por cualquiera de los dos criterios de valoración anteriores. Por ejemplo, un ácido graso o derivado del mismo puede purificarse cuando al menos aproximadamente el 80 %-95 %, al menos aproximadamente el 85 %-99 % o al menos aproximadamente el 90 %-98 % de una muestra está compuesto por el ácido graso o derivado de ácido graso.

El ácido graso o derivado del mismo puede estar presente en el ambiente extracelular, o puede aislarse del ambiente extracelular de la célula hospedadora. En determinadas realizaciones, un ácido graso o derivado del mismo es secretado por la célula hospedadora. En otras realizaciones, un ácido graso o derivado del mismo es transportado al medio extracelular. En otras realizaciones más, el ácido graso o derivado del mismo es transportado pasivamente al medio extracelular. Un ácido graso o derivado del mismo puede aislarse de una célula hospedadora usando métodos conocidos en la técnica, tales como los desvelados en las Publicaciones de Solicitud de Patente Internacional WO 2010/042664 y WO 2010/062480.

Los métodos que se describen en el presente documento pueden dar como resultado la producción de compuestos homogéneos en donde al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 % o al menos aproximadamente el 95 %, de los ácidos grasos o derivados de ácidos grasos producidos tendrán longitudes de cadena de carbono que varían en menos de 6 carbonos, menos de 5 carbonos, menos de 4 carbonos, menos de 3 carbonos o menos de aproximadamente 2 carbonos. Como alternativa, o además, los métodos que se describen en el presente documento pueden dar como resultado la producción de compuestos homogéneos en donde menos de aproximadamente el 98 %, menos de aproximadamente el 95 %, menos de aproximadamente el 90 %, menos de aproximadamente el 80 % o menos de aproximadamente el 70 % de los ácidos grasos o derivados de ácidos grasos producidos tendrán longitudes de cadena de carbono que varían en menos de 6 carbonos, menos de 5 carbonos, menos de 4 carbonos, menos de 3 carbonos o menos de aproximadamente 2 carbonos. Por tanto, los ácidos grasos o derivados de ácidos grasos pueden tener un grado de homogeneidad limitado por cualquiera de los dos criterios de valoración anteriores. Por ejemplo, el ácido graso o derivado de ácido graso puede tener un grado de homogeneidad en donde aproximadamente el 70 %-95 %, aproximadamente el 80 %-98 % o aproximadamente el 90 %-95 % de los ácidos grasos o derivados de ácidos grasos producidos tendrán longitudes de cadena de carbono que varían en menos de 6 carbonos, menos de 5 carbonos, menos de 4 carbonos, menos de 3 carbonos o menos de aproximadamente 2 carbonos. Estos compuestos también pueden producirse con un grado de saturación relativamente uniforme.

Como resultado de los métodos de la presente invención, uno o más de entre el título, el rendimiento o la productividad del ácido graso o derivado del mismo producido por la célula hospedadora modificada por ingeniería genética que tiene un nivel de expresión alterado de un polipéptido FadR aumenta con respecto al de la célula hospedadora de tipo silvestre correspondiente.

El término "título" se refiere a la cantidad de ácido graso o derivado de ácido graso producida por unidad de volumen de cultivo de célula hospedadora. En cualquier aspecto de las composiciones y de los métodos descritos en el presente documento, un ácido graso o un derivado de ácido graso tal como una olefina terminal, un aldehído graso, un alcohol graso, un alcano, un éster graso, una cetona o una olefina interna se produce en un título de aproximadamente 25 mg/l, aproximadamente 50 mg/l, aproximadamente 75 mg/l, aproximadamente 100 mg/l, aproximadamente 125 mg/l, aproximadamente 150 mg/l, aproximadamente 175 mg/l, aproximadamente 200 mg/l, aproximadamente 225 mg/l, aproximadamente 250 mg/l, aproximadamente 275 mg/l, aproximadamente 300 mg/l, aproximadamente 325 mg/l, aproximadamente 350 mg/l, aproximadamente 375 mg/l, aproximadamente 400 mg/l, aproximadamente 425 mg/l, aproximadamente 450 mg/l, aproximadamente 475 mg/l, aproximadamente 500 mg/l, aproximadamente 525 mg/l, aproximadamente 550 mg/l, aproximadamente 575 mg/l, aproximadamente 600 mg/l, aproximadamente 625 mg/l, aproximadamente 650 mg/l, aproximadamente 675 mg/l, aproximadamente 700 mg/l, aproximadamente 725 mg/l, aproximadamente 750 mg/l, aproximadamente 775 mg/l, aproximadamente 800 mg/l, aproximadamente 825 mg/l, aproximadamente 850 mg/l, aproximadamente 875 mg/l, aproximadamente 900 mg/l, aproximadamente 925 mg/l, aproximadamente 950 mg/l, aproximadamente 975 mg/l, aproximadamente 1000 g/l, aproximadamente 1050 mg/l, aproximadamente 1075 mg/l, aproximadamente 1100 mg/l, aproximadamente 1125 mg/l, aproximadamente 1150 mg/l, aproximadamente 1175 mg/l, aproximadamente 1200 mg/l, aproximadamente 1225 mg/l, aproximadamente 1250 mg/l, aproximadamente 1275 mg/l, aproximadamente 1300 mg/l, aproximadamente 1325 mg/l, aproximadamente 1350 mg/l, aproximadamente 1375 mg/l, aproximadamente 1400 mg/l, aproximadamente 1425 mg/l, aproximadamente 1450 mg/l, aproximadamente 1475 mg/l, aproximadamente 1500 mg/l, aproximadamente 1525 mg/l, aproximadamente 1550 mg/l, aproximadamente 1575 mg/l, aproximadamente 1600 mg/l, aproximadamente 1625 mg/l, aproximadamente 1650 mg/l, aproximadamente 1675 mg/l, aproximadamente 1700 mg/l, aproximadamente 1725 mg/l, aproximadamente 1750 mg/l, aproximadamente 1775 mg/l, aproximadamente 1800 mg/l, aproximadamente 1825 mg/l, aproximadamente 1850 mg/l, aproximadamente 1875 mg/l, aproximadamente 1900 mg/l, aproximadamente 1925 mg/l, aproximadamente 1950 mg/l, aproximadamente 1975 mg/l, aproximadamente 2000 mg/l o un intervalo limitado por cualquiera de los dos valores anteriores. En otras realizaciones, un ácido graso o derivado de ácido graso se produce en un título de más de 2000 mg/l, más de 5000 mg/l, más de 10.000 mg/l o más, tal como 50 g/l, 70 g/l, 100 g/l, 120 g/l, 150 g/l o 200 g/l.

Como se usa en el presente documento, el "rendimiento de derivado de ácido graso producido por una célula hospedadora" se refiere a la eficiencia con la que una fuente de carbono de entrada se convierte en producto (es decir, alcohol graso o aldehído graso) en una célula hospedadora. Las células hospedadora modificada por ingeniería genética para producir derivados de ácidos grasos de acuerdo con los métodos de la invención tienen un rendimiento de al menos un 3 %, al menos un 4 %, al menos un 5 %, al menos un 6 %, al menos un 7 %, al menos un 8 %, al menos un 9 %, al menos un 10 %, al menos un 11 %, al menos un 12 %, al menos un 13 %, al menos un 14 %, al menos un 15 %, al menos un 16 %, al menos un 17 %, al menos un 18 %, al menos un 19 %, al menos un 20 %, al menos un 21 %, al menos un 22 %, al menos un 23 %, al menos un 24 %, al menos un 25 %, al menos un 26 %, al menos un 27 %, al menos un 28 %, al menos un 29 % o al menos un 30 % o un intervalo limitado por cualquiera de los dos valores anteriores. En otras realizaciones, se produce un derivado o derivados de ácidos grasos con un rendimiento superior al 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más. Como alternativa, o además, el rendimiento es de aproximadamente el 30 % o inferior, de aproximadamente el 27 % o inferior, de aproximadamente el 25 % o inferior, o de aproximadamente el 22 % o inferior. Por tanto, el rendimiento puede estar limitado por dos cualquiera de los criterios de valoración anteriores. Por ejemplo, el rendimiento de un derivado o derivados de ácido graso producidos por la célula hospedadora recombinante de acuerdo con los métodos de la invención puede ser del 5 % al 15 %, del 10 % al 25 %, del 10 % al 22 %, del 15 % al 27 %, del 18 % al 22 %, del 20 % al 28 % o del 20 % al 30 %. El rendimiento puede referirse a un derivado de ácido graso particular o a una combinación de derivados de ácidos grasos producidos por un cultivo de células hospedadora recombinantes dado.

En un enfoque, la expresión "productividad del ácido graso o derivado del mismo producido por una célula hospedadora" se refiere a la cantidad de ácido graso o derivado de ácido graso producido por unidad de volumen de cultivo de célula hospedadora por unidad de densidad de cultivo de célula hospedadora. En cualquier aspecto de las composiciones y de los métodos descritos en el presente documento, la productividad de un ácido graso o un derivado de ácido graso tal como una olefina, un aldehído graso, un alcohol graso, un alcano, un éster graso o una cetona producidos por una célula hospedadora modificada por ingeniería genética es de al menos aproximadamente 3 mg/l/DO⁶⁰⁰, al menos aproximadamente 6 mg/l/DO⁶⁰⁰, al menos aproximadamente 9 mg/l/DO⁶⁰⁰, al menos aproximadamente 12 mg/l/DO⁶⁰⁰o al menos aproximadamente 15 mg/l/DO⁶⁰⁰. Como alternativa, o además, la productividad es de aproximadamente 50 mg/l/DO⁶⁰⁰o menos, aproximadamente 40 mg/l/DO⁶⁰⁰o menos, aproximadamente 30 mg/l/DO⁶⁰⁰o menos o aproximadamente 20 mg/l/DO⁶⁰⁰o menos. Por tanto, la productividad puede estar limitada por dos cualquiera de los criterios de valoración anteriores. Por ejemplo, la productividad puede ser de aproximadamente 3 a aproximadamente 30 mg/l/DO⁶⁰⁰, de aproximadamente 6 a aproximadamente 20 mg/l/DO⁶⁰⁰o de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 mg/l/DO⁶⁰⁰.

En otro enfoque, el término "productividad" se refiere a la cantidad de un derivado o derivados de ácidos grasos producidos por unidad de volumen de cultivo de células hospedadoras por unidad de tiempo. En cualquier aspecto de las composiciones y de los métodos descritos en el presente documento, la productividad de un derivado o derivados de ácidos grasos producidos por una célula hospedadora recombinante es de al menos 100 mg/l/hora, al menos 200 mg/l/hora0, al menos 300 mg/l/hora, al menos 400 mg/l/hora, al menos 500 mg/l/hora, al menos 600 mg/l/hora, al menos 700 mg/l/hora, al menos 800 mg/l/hora, al menos 900 mg/l/hora, al menos 1000 mg/l/hora, al menos 1100 mg/l/hora, al menos 1200 mg/l/hora, al menos 1300 mg/l/hora, al menos 1400 mg/l/hora, al menos 1500 mg/l/hora, al menos 1600 mg/l/hora, al menos 1700 mg/l/hora, al menos 1800 mg/l/hora, al menos 1900 mg/l/hora, al menos 2000 mg/l/hora, al menos 2100 mg/l/hora, al menos 2200 mg/l/hora, al menos 2300 mg/l/hora, al menos 2400 mg/l/hora o al menos 2500 mg/l/hora. Como alternativa, o además, la productividad es de 2500 mg/l/hora o menos, 2000 mg/l/DO600 o menos, 1500 mg/l/DO600 o menos, 120 mg/l/hora o menos, 1000 mg/l/hora o menos, 800 mg/l/hora o menos, o 600 mg/l/hora o menos. Por tanto, la productividad puede estar limitada por dos cualquiera de los criterios de valoración anteriores. Por ejemplo, la productividad puede ser de 3 a 30 mg/l/hora, de 6 a 20 mg/l/hora o de 15 a 30 mg/l/hora. Por ejemplo, la productividad de un derivado o derivados de ácidos grasos producidos por una célula hospedadora recombinante de acuerdo con los métodos puede ser de 500 mg/l/hora a 2500 mg/l/hora, o de 700 mg/l/hora a 2000 mg/l/hora. La productividad puede referirse a un derivado de ácido graso particular o a una combinación de derivados de ácidos grasos producidos por un cultivo de células hospedadora recombinantes dado.

En los métodos de la invención, la producción y el aislamiento de un ácido graso deseado o derivado del mismo (por ejemplo, acil-CoA, ácidos grasos, olefinas terminales, aldehídos grasos, alcoholes grasos, alcanos, alquenos, ésteres de cera, cetonas y olefinas internas) puede potenciarse alterando la expresión de uno o más genes implicados en la regulación de la producción, degradación y/o secreción de ácido graso, éster graso, alcano, alqueno, olefina, alcohol graso, en la célula hospedadora modificada por ingeniería genética.

Se sabe que FadR modula la expresión y/o actividad de numerosos genes, incluyendo fabA, fabB, iclR, fadA, fadB, fadD, fadE, fadI, fadJ, fadl, fadM, uspA, aceA, aceB y aceK. En algunas realizaciones de los métodos que se describen en el presente documento, la célula hospedadora modificada por ingeniería genética comprende adicionalmente un nivel alterado de expresión de uno o más genes seleccionados entre el grupo que consiste en fabA, fabB, iclR, fadA, fadB, fadD, fadE, fadI, fadJ, fadl, fadM, uspA, aceA, aceB y aceK en comparación con el nivel de expresión del gen o los genes seleccionados en una célula hospedadora de tipo silvestre correspondiente. Los números de registro de ejemplo para polipéptidos codificados por los genes diana de FadR incluyen fabA (NP_415474), fabB (BAA16180), (NP_418442), fadA (YP_026272.1), fadB(NP_418288.1), fadD (AP_002424), fadE(NP_414756.2), fadI (NP_416844.1), fadJ (NP_416843.1), fadl (AAC75404), fadM (NP_414977.1), uspA (AAC76520), aceA (AAC76985.1), aceB (AAC76984.1) y aceK (AAC76986.1).

En la FIG. 1 se enumeran enzimas y polipéptidos de ejemplo para su uso en la práctica de la invención. Un experto habitual en la materia comprenderá que dependiendo del fin (por ejemplo, el ácido graso deseado o el producto derivado de ácido graso), los genes específicos (o combinaciones de genes) enumerados en la FIG. 1 pueden sobreexpresarse, modificarse, atenuarse o suprimirse en una célula hospedadora que tiene un nivel de expresión alterado de un polipéptido FadR.

En algunas realizaciones, el método comprende modificar la expresión de un gen que codifica una o más de entre una tioesterasa (por ejemplo, TesA), una descarboxilasa, una ácido carboxílico reductasa (CAR; por ejemplo, CarB), una alcohol deshidrogenasa (aldehído reductasa); una aldehído descarbonilasa, una acil-CoA reductasa que forma alcohol graso (FAR), una acil ACP reductasa (AAR), una éster sintasa, una acil-CoA reductasa (ACR1), OleA, OleCD y OleBCD.

En determinadas realizaciones de la invención, la célula hospedadora modificada por ingeniería genética que tiene un nivel de expresión alterado de un polipéptido FadR puede modificarse por ingeniería genética para que comprenda adicionalmente una secuencia polinucleotídica que codifique un polipéptido: (1) que tenga actividad tioesterasa (CE 3.1.2.14), en donde la célula hospedadora modificada por ingeniería genética sintetiza ácidos grasos; (2) que tenga actividad descarboxilasa, en donde la célula hospedadora modificada por ingeniería genética sintetiza olefinas terminales; (3) que tenga actividad ácido carboxílico reductasa, en donde la célula hospedadora modificada por ingeniería genética sintetiza aldehídos grasos; (4) que tenga actividad ácido carboxílico reductasa y alcohol deshidrogenasa (CE 1.1.1.1), en donde la célula hospedadora modificada por ingeniería genética sintetiza alcoholes grasos; (5) que tenga actividad ácido carboxílico reductasa y aldehído descarbonilasa (CE 4.1.99.5), en donde la célula hospedadora modificada por ingeniería genética sintetiza alcanos; (6) que tenga actividad acil-CoA reductasa (CE 1.2.1.50) , en donde el microorganismo sintetiza aldehídos grasos; (7) que tenga actividad acil-CoA reductasa (CE 1.2.1.50) y actividad alcohol deshidrogenasa (CE 1.1.1.1), en donde la célula hospedadora modificada por ingeniería genética sintetiza alcoholes grasos; (8) que tenga actividad acil-CoA reductasa (CE 1.2.1.50) y actividad aldehído descarbonilasa (CE 4.1.99.5), en donde la célula hospedadora modificada por ingeniería genética sintetiza alcanos; (9) que tenga actividad acil CoA reductasa que forma alcohol en donde la célula hospedadora modificada por ingeniería genética sintetiza aldehídos grasos y alcoholes grasos; (10) que tenga actividad ácido carboxílico reductasa, en donde la célula hospedadora modificada por ingeniería genética sintetiza aldehídos grasos; (11) que tenga actividad acil ACP reductasa, en donde la célula hospedadora modificada por ingeniería genética sintetiza aldehídos grasos; (12) que tenga actividad acil ACP reductasa y actividad alcohol deshidrogenasa (CE 1.1.1.1), en donde la célula hospedadora modificada por ingeniería genética sintetiza alcoholes grasos; (13) que tenga actividad acil ACP reductasa y actividad aldehído descarbonilasa (CE 4.1.99.5), en donde la célula hospedadora modificada por ingeniería genética sintetiza alcanos; (14) que tenga actividad éster sintasa (CE 3.1.1.67), en donde la célula hospedadora modificada por ingeniería genética sintetiza ésteres grasos; (15) que tenga actividad éster sintasa (CE 3.1.1.67) y (a) actividad ácido carboxílico reductasa, (b) actividad acil-CoA reductasa, (c) actividad acil ACP reductasa o (d) actividad alcohol deshidrogenasa (CE 1.1.1.1), en donde la célula hospedadora modificada por ingeniería genética sintetiza ésteres de cera; (16) que tenga actividad OleA, en donde la célula hospedadora modificada por ingeniería genética sintetiza 2-alquil-3-ceto-acil CoA y cetonas; o (17) que tenga actividad OleCD u OleBCD, en donde la célula hospedadora modificada por ingeniería genética sintetiza olefinas internas.

En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente modificar la expresión de un gen que codifica una ácido graso sintasa en la célula hospedadora. Como se usa en el presente documento, "ácido graso sintasa" significa cualquier enzima implicada en la biosíntesis de ácidos grasos. En determinadas realizaciones, la modificación de la expresión de un gen que codifica una ácido graso sintasa incluye la expresión de un gen que codifica una ácido graso sintasa en la célula hospedadora y/o el aumento de la expresión o la actividad de una ácido graso sintasa endógena en la célula hospedadora. En realizaciones alternativas, la modificación de la expresión de un gen que codifica una ácido graso sintasa incluye la atenuación de un gen que codifica una ácido graso sintasa en la célula hospedadora y/o la disminución de la expresión o la actividad de una ácido graso sintasa endógena en la célula hospedadora. En algunas realizaciones, la ácido graso sintasa es una tioesterasa (CE 3.1.1.5 o CE 3.1.2.14). En realizaciones particulares, la tioesterasa está codificada por tesA, tesA sin secuencia líder, tesB, fatB, fatB2, fatB3, fatA o fatA1.

En otras realizaciones, la célula hospedadora se modifica genéticamente para expresar un nivel atenuado de una enzima de degradación de ácidos grasos con respecto a una célula hospedadora de tipo silvestre. Como se usa en el presente documento, la expresión "enzima de degradación de ácidos grasos" significa una enzima implicada en la descomposición o la conversión de un ácido graso o derivado de ácido graso en otro producto, tal como, pero sin limitación, una acil-CoA sintasa. En algunas realizaciones, la célula hospedadora se modifica genéticamente para expresar un nivel atenuado de una acil-CoA sintasa con respecto a una célula hospedadora de tipo silvestre. En realizaciones particulares, la célula hospedadora expresa un nivel atenuado de una acil-CoA sintasa codificada por fadD, fadK, BH3103, yhfl, PJI-4354, EAV15023, fadDI, fadD2, RPC_4074, fadDD35, fadDD22, faa3p o el gen que codifica la proteína YP_002028218. En determinadas realizaciones, la célula hospedadora modificada genéticamente comprende una inactivación de uno o más genes que codifican una enzima de degradación de ácidos grasos, tales como los genes de acil-CoA sintasa mencionados anteriormente.

La vía biosintética de ácidos grasos en las células hospedadoras usa los precursores acetil-CoA y malonil-CoA. Las etapas en esta vía son catalizados por enzimas de las familias de genes de biosíntesis de ácidos grasos (fab) y acetil-CoA carboxilasa (acc) (véase, por ejemplo, Heath et al., Prog. Lipid Res. 40(6): 467-97 (2001)). La acetil-CoA es carboxilada por la acetil-CoA carboxilasa (CE 6.4.1.2), que es una enzima de múltiples subunidades codificada por cuatro genes separados (accA, accB, accC y accD) en la mayoría de los procariotas, para formar malonil-CoA. En algunas bacterias, tales como Corynebacterium glutamicus, la acetil-CoA carboxilasa consiste en dos subunidades, ^{AccDA [YP_225123.1] y AccBC}[Yp_224991], ^{codificadas por accDA y accBC, respectivamente. Dependiendo del}ácido graso deseado o del producto derivado de ácido graso, los genes fab y/o acc específicos (o combinaciones de los mismos) pueden sobreexpresarse, modificarse, atenuarse o suprimirse en una célula hospedadora modificada por ingeniería genética.

En algunas realizaciones, un complejo acetil-CoA carboxilasa se sobreexpresa en la célula hospedadora modificada por ingeniería genética. En determinadas realizaciones, los genes de subunidades de la acetil-CoA carboxilasa se obtienen de una o más de entre Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, Lactococcus lactis, Kineococcus radiotolerans, Desulfovibrio desulfuricans, Erwinia amylovora, Rhodospirillum rubrum, Vibrio furnissii, Stenotrophomonas maltophilia, Synechocystis sp. PCC6803 y Synechococcus elongatus.

La biotina proteína ligasa (CE 6.3.4.15) es una enzima que cataliza la unión covalente de biotina a la subunidad de proteína portadora de carboxilo de biotina (BCCP) de acetil-CoA carboxilasa. En algunas realizaciones de la presente invención, una biotina proteína ligasa se expresa o sobreexpresa en la célula hospedadora modificada por ingeniería genética. En determinadas realizaciones, la biotina proteína ligasa es birA de Corynebacterium glutamicum (YP_225000) o bpll de Saccharomyces cerevisiae (NP_010140).

La producción de ésteres de ácidos grasos tales como FAME o FAEE en una célula hospedadora puede facilitarse mediante la expresión o sobreexpresión de un éster sintasa (CE 2.3.1.75 o CE 3.1.1.67) en una célula hospedadora modificada por ingeniería genética. En algunas realizaciones, la éster sintasa es ES9 de Marinobacter hidrocarbonoclasticus (SEQ ID NO: 2), ES8 de Marinobacterhidrocar-bonoclasticus (SEQ ID NO: 3), AtfA1 de Alcanivorax borkumensis SK2 (SEQ ID NO: 4), AtfA2 de Alcanivorax borkumensis SK2 (SEQ ID NO: 5), diacilglicerol O-aciltransferasa de Marinobacter aquaeolei VT8 (SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7), una cera sintasa o una cera éster sintasa bifuncional/acil-CoA:diacilglicerol aciltransferasa (cera-dgaT).

En determinadas realizaciones, un gen que codifica un polipéptido biosintético de aldehído graso se expresa o sobreexpresa en la célula hospedadora. Se desvelan polipéptidos biosintéticos de aldehídos grasos de ejemplo adecuados para su uso en los métodos de la invención, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional WO 2010/042664. En realizaciones preferidas, el polipéptido biosintético de aldehído graso tiene actividad de ácido carboxílico reductasa (CE 6.2.1.3 o CE 1.2.1.42), por ejemplo, actividad ácido graso reductasa.

En los métodos de la invención, el polipéptido que tiene actividad ácido carboxílico reductasa no está particularmente limitado. Se desvelan polipéptidos de ejemplo que tienen actividad ácido carboxílico reductasa que son adecuados para su uso en los métodos de la presente invención, por ejemplo, en las Publicaciones de Solicitud de Patente ^{Internacional WO 2010/062480 y}wO ^{2010/042664. En algunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad ácido}carboxílico reductasa es CarB de M. smegmatis (YP_889972) (SEQ ID NO: 8). En otras realizaciones, el polipéptido que tiene actividad ácido carboxílico reductasa es CarA [ABK75684] de M. smegmatis, FadD9 [AAK46980] de M. tuberculosis, CAR [AAR91681] de Nocardia sp. NRRL 5646, CAR [YP-001070587] de Mycobacterium sp. JLS o CAR [YP-118225] de Streptomyces griseus. Las expresiones "ácido carboxílico reductasa", "CAR", y "polipéptido biosintético de aldehido graso" se usan indistintamente en el presente documento.

En determinadas realizaciones, una tioesterasa y una ácido carboxílico reductasa se expresan o sobreexpresan en la célula hospedadora modificada por ingeniería genética.

En algunas realizaciones, un gen que codifica un polipéptido biosintético de alcohol graso se expresa o sobreexpresa en la célula hospedadora. Se desvelan polipéptidos biosintéticos de alcohol graso de ejemplo adecuados para su uso en los métodos de la invención, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional WO 2010/062480. En determinadas realizaciones, el polipéptido biosintético de alcohol graso tiene actividad aldehído reductasa o alcohol deshidrogenasa (CE 1.1.1.1). Los ejemplos de polipéptidos biosintéticos de alcohol graso incluyen, pero sin limitación AlrA de Acenitobacter sp. M-1 (SEQ ID NO: 9) u homólogos de AlrA y alcohol deshidrogenasas de E. coli endógenas tales como YjgB, (AAC77226) (SEQ ID NO: 10), DkgA (NP_417485), DkgB (NP_414743), YdjL (AAC74846), YdjJ (NP_416288), AdhP (NP_415995), YhdH (NP_417719), YahK (NP_414859), YphC (AAC75598), YqhD (446856) y YbbO [AAC73595.1].

Como se usa en el presente documento, la expresión "alcohol deshidrogenasa" es un péptido capaz de catalizar la conversión de un aldehído graso en alcohol (por ejemplo, alcohol graso). Un experto habitual en la materia apreciará que determinadas alcohol deshidrogenasas son capaces de catalizar otras reacciones también. Por ejemplo, determinadas alcohol deshidrogenasas aceptarán otros sustratos además de los aldehídos grasos, y estas alcohol deshidrogenasas inespecíficas también se incluyen en la expresión "alcohol deshidrogenasa". Se desvelan alcohol deshidrogenasas de ejemplo adecuadas para su uso en los métodos de la invención, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional WO 2010/062480.

En algunas realizaciones, una tioesterasa, una ácido carboxílico reductasa y una alcohol deshidrogenasa se expresan o sobreexpresan en la célula hospedadora modificada por ingeniería genética. En determinadas realizaciones, la tioesterasa es tesA (SEQ ID NO: 11), la ácido carboxílico reductasa es carB (SEQ ID NO: 8) y la alcohol deshidrogenasa es YjgB (SEQ ID NO: 10) o AlrAadp1 (SEQ ID NO: 9).

Las fosfopanteteína transferasas (PPTasas) (CE 2.7.8.7) catalizan la transferencia de 4'-fosfopanteteína de CoA a un sustrato. CAR de Nocardia y varios de sus homólogos contienen un supuesto sitio de fijación para la 4-fosfo-panteteína (PPT) (He et al., Appl. Environ. Microbiol., 70(3): 1874-1881 (2004)). En algunas realizaciones de la invención, una PPTasa se expresa o sobreexpresa en una célula hospedadora modificada por ingeniería genética. En determinadas realizaciones, la PPTasa es EntD de E. coli MG1655 (SEQ ID NO: 12).

En algunas realizaciones, una tioesterasa, una ácido carboxílico reductasa, una PPTasa y una alcohol deshidrogenasa se expresan o sobreexpresan en la célula hospedadora modificada por ingeniería genética. En determinadas realizaciones, la tioesterasa es tesA (SEQ ID NO: 11), la ácido carboxílico reductasa es carB (SEQ ID NO: 8), la PPTasa es entD (SEQ ID NO: 12) y la alcohol deshidrogenasa es yjgB (SEQ ID NO: 10) o alrAadp1 (SEQ ID NO: 9).

La divulgación también proporciona un ácido graso o un derivado graso producidos mediante cualquiera de los métodos que se describen en el presente documento. Un ácido graso o derivado del mismo producido mediante cualquiera de los métodos que se describen en el presente documento puede usarse directamente como combustible, aditivos de combustible, materiales de partida para la producción de otros compuestos químicos (por ejemplo, polímeros, tensioactivos, plásticos, tejidos, disolventes, adhesivos, etc.) o aditivos para el cuidado personal. Estos compuestos también pueden usarse como materia prima para reacciones posteriores, por ejemplo, hidrogenación, craqueo catalítico (por ejemplo, a través de hidrogenación, pirolisis o ambos), para preparar otros productos.

En algunos aspectos, la divulgación proporciona una composición de biocombustible que comprende el ácido graso o derivado del mismo producido mediante los métodos que se describen en el presente documento. Como se usa en el presente documento, el término "biocombustible" se refiere a cualquier combustible derivado de biomasa. Los biocombustibles pueden sustituir los combustibles a base de petróleo. Por ejemplo, los biocombustibles incluyen combustibles para el transporte (por ejemplo, gasolina, diésel, combustible para reactores, etc.), combustibles de calefacción y combustibles de generación de electricidad. Los biocombustibles son una fuente de energía renovable. Como se usa en el presente documento, el término "biodiésel" significa un biocombustible que puede ser un sustituto del diésel, que deriva del petróleo. El biodiésel puede usarse en motores diésel de combustión interna, ya sea en forma pura, que se denomina biodiésel "puro", o como una mezcla en cualquier concentración con diésel a base de petróleo. El biodiésel puede incluir ésteres o hidrocarburos, tales como alcoholes. En determinados aspectos, el biocombustible se selecciona entre el grupo que consiste en un biodiésel, un alcohol graso, un éster graso, un triacilglicérido, una gasolina o un combustible para reactores.

Para potenciar el rendimiento de un combustible o motor, se utilizan aditivos de combustible. Por ejemplo, pueden utilizarse aditivos de combustible para alterar el punto de congelación/gelificación, el punto de turbidez, la lubricidad, la viscosidad, la estabilidad oxidativa, la calidad de ignición, el nivel de octanaje y/o el punto de inflamación de un combustible. En Estados Unidos, todos los aditivos de combustibles deben estar registrados en la Agencia de Protección Ambiental (EPA). Los nombres de los aditivos de combustibles y las empresas que venden los aditivos de combustibles están a disposición del público poniéndose en contacto con la EPA o visitando el sitio web de la EPA.

Un experto habitual en la materia apreciará que un biocombustible producido de acuerdo con los métodos que se describen en el presente documento puede mezclarse con uno o más aditivos de combustible para transmitir una calidad deseada.

La divulgación también proporciona una composición de tensioactivo o una composición de detergente que comprende un alcohol graso producido mediante cualquiera de los métodos que se describen en el presente documento. Un experto habitual en la materia apreciará que, dependiendo del fin previsto de la composición de tensioactivo o detergente, pueden producirse y usarse diferentes alcoholes grasos. Por ejemplo, cuando los alcoholes grasos que se describen en el presente documento se usan como materia prima para la producción de tensioactivos o detergentes, un experto habitual en la materia apreciará que las características de la materia prima de alcohol graso afectarán a las características de la composición de tensioactivo o detergente producida. Por tanto, las características de la composición de tensioactivo o detergente pueden seleccionarse produciendo alcoholes grasos particulares para su uso como materia prima.

Una composición de tensioactivo y/o detergente a base de alcohol graso que se describe en el presente documento puede mezclarse con otros tensioactivos y/o detergentes bien conocidos en la técnica. En algunos aspectos, la mezcla puede incluir al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 % o un intervalo limitado por cualquiera de los dos valores anteriores, en peso del alcohol graso. En otros ejemplos, puede prepararse una composición de tensioactivo o detergente que incluya al menos aproximadamente el 5 %, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o un intervalo limitado por cualquiera de los dos valores anteriores, en peso de un alcohol graso que incluye una cadena de carbono que tiene 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22 carbonos de longitud. Dichas composiciones de tensioactivo o detergente también pueden incluir al menos un aditivo, tal como una microemulsión o un tensioactivo o detergente de fuentes no microbianas tales como aceites vegetales o petróleo, que puede estar presente en una cantidad de al menos aproximadamente el 5 %, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o un intervalo limitado por cualquiera de los dos valores anteriores, en peso del alcohol graso.

Los bioproductos (por ejemplo, ácidos grasos, acil-CoA, hidrocarburos, aldehídos grasos, alcoholes grasos, ésteres grasos, composiciones de tensioactivo y composiciones de biocombustible) producidos de acuerdo con los métodos de la invención pueden distinguirse de los compuestos orgánicos derivados del carbono petroquímico basándose en la huella isotópica del carbono doble o la datación por 14C. Adicionalmente, la fuente específica de carbono de origen biológico (por ejemplo, glucosa frente a glicerol) puede determinarse mediante la huella isotópica del carbono doble (véase, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. 7.169.588).

La capacidad de distinguir los bioproductos de los compuestos orgánicos a base de petróleo es beneficiosa para rastrear estos materiales en el comercio. Por ejemplo, los compuestos orgánicos o productos químicos que comprenden los perfiles de isótopos de carbono tanto biológicos como derivados del petróleo, pueden distinguirse de los compuestos orgánicos y de los productos químicos hechos solo de materiales a base de petróleo. Por tanto, los materiales preparados de acuerdo con los métodos inventivos pueden seguirse en el comercio basándose en su perfil único de isótopos de carbono.

Los bioproductos pueden distinguirse de los compuestos orgánicos a base de petróleo mediante la comparación de la relación de isótopos de carbono estables (13C/12C) en cada combustible. La relación 13C/12C en un bioproducto dado es una consecuencia de la relación 13C/12C en el dióxido de carbono atmosférico en el momento en que se fija el dióxido de carbono. También refleja la vía metabólica exacta. También se producen variaciones regionales. El petróleo, las plantas C³(las de hoja ancha), las plantas C⁴(las gramíneas) y los carbonatos marinos muestran diferencias significativas en 13C/12C y los valores de 813C correspondientes. Además, la materia lipídica de plantas C³y C⁴se analiza de manera diferente a la de los materiales derivados de los componentes de hidratos de carbono de las mismas plantas como consecuencia de la vía metabólica.

La escala de medición de 13C se definió originalmente por un ajuste a cero con piedra caliza belemnita Pee Dee (PDB, Pee Dee Belemnite), en donde los valores se dan en partes por mil desviaciones con respecto a este material. Los valores de "813C" se expresan en partes por mil (por mil), abreviado, %o y se calculan como se indica a continuación:

813C (%o) =[(13C/12C)muestra -(13C/12C)patrón] / (13C/12C)patrón X 1000

En algunos aspectos, un bioproducto producido de acuerdo con los métodos de la invención tiene un 813C de aproximadamente -30 o más, aproximadamente -28 o más, aproximadamente -27 o más, aproximadamente -20 o más, aproximadamente -18 o más, aproximadamente -15 o más, aproximadamente -13 o más o aproximadamente -10 o más. Como alternativa, o además, un bioproducto tiene un 813C de aproximadamente -4 o menos, aproximadamente -5 o menos, aproximadamente -8 o menos, aproximadamente -10 o menos, aproximadamente -13 o menos, aproximadamente -15 o menos, aproximadamente -18 o menos o aproximadamente -20 o menos. Por tanto, el bioproducto puede tener un 813C limitado por dos cualesquiera de los criterios de valoración anteriores. Por ejemplo, el bioproducto puede tener un 813C de aproximadamente -30 a aproximadamente -15, de aproximadamente -27 a aproximadamente -19, de aproximadamente -25 a aproximadamente -21, de aproximadamente -15 a aproximadamente -5, de aproximadamente -13 a aproximadamente -7, o de aproximadamente -13 a aproximadamente -10. En algunas realizaciones, el bioproducto puede tener un 813C de aproximadamente -10, -11, -12 o -12,3. En otros aspectos, el bioproducto tiene un 813C de aproximadamente -15,4 o más. En otros aspectos más, el bioproducto tiene un 813C de aproximadamente -15,4 a aproximadamente -10,9, o un 813C de aproximadamente -13,92 a aproximadamente -13,84.

Los bioproductos también pueden distinguirse de los compuestos orgánicos a base de petróleo comparando la cantidad de 14C en cada compuesto. Porque 14C tiene una vida media nuclear de 5730 años, los combustibles a base de petróleo que contienen carbono "más antiguo" pueden distinguirse de los bioproductos que contienen carbono "más nuevo" (véase, por ejemplo, Currie, "Source Apportionment o f Atmospheric Partióles", Characterization o f Environmental Partióles, J. Buffle y H. P. van Leeuwen, Eds., Vol. I de la Serie de Química Analítica Ambiental de la IUPAC, Editorial Lewis, Inc., págs. 3-74 (1992)).

El 14C puede medirse mediante espectrometría de masas con acelerador (EMA), con resultados proporcionados en unidades de "fracción de carbono moderno" (fM). La fM se define por los Materiales de Referencia Patrón (MRP) 4990B y 4990C del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST, National Institute o f Standards and Technology). Como se usa en el presente documento, la "fracción de carbono moderno" o fM tiene el mismo significado definido por los materiales de referencia estándar (SRM) 4990B y 4990C del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NISt , National Institute o f Standards and Technology), conocidos como patrones de ácidos oxálicos HOxI y HOxII, respectivamente. La definición fundamental se refiere a 0,95 veces la relación de isótopos de 14C/12C de HOxI (denominada AD 1950). Esto es más o menos equivalente a la madera de antes de la revolución industrial corregida para la desintegración. Para la biosfera viva actual (materia vegetal), fM es aproximadamente 1,1.

En algunos aspectos, un bioproducto producido de acuerdo con los métodos de la invención tiene una fM14C de al menos aproximadamente 1, por ejemplo, al menos aproximadamente 1,003, al menos aproximadamente 1,01, al menos aproximadamente 1,04, al menos aproximadamente 1,111, al menos aproximadamente 1,18 o al menos aproximadamente 1,124. Como alternativa, o además, el bioproducto tiene una fM14C de aproximadamente 1,130 o menos, por ejemplo, aproximadamente 1,124 o menos, aproximadamente 1,18 o menos, aproximadamente 1,111 o menos o aproximadamente 1,04 o menos. Por tanto, el bioproducto puede tener una fM14C limitada por dos cualesquiera de los criterios de valoración anteriores. Por ejemplo, el bioproducto puede tener una fM14C de aproximadamente 1,003 a 1,124, una fM14C de aproximadamente 1,04 a aproximadamente 1,18 o una fM14C de aproximadamente 1,111 a aproximadamente 1,124.

Otra medida de 14C se conoce como el porcentaje de carbono moderno, es decir, pMC. Para un arqueólogo o geólogo que usa dataciones con 14C, AD 1950 es igual a "cero años". Esto también representa un pMC de 100. La "bomba de carbono" en la atmósfera alcanzó casi el doble del nivel normal en 1963 en el pico de ensayos de armas termo nucleares. Su distribución dentro de la atmósfera se ha aproximado desde su aparición, mostrando valores superiores a pMC de 100 para plantas y animales que viven desde AD 1950. Ha disminuido gradualmente con el tiempo y el valor actual está cerca de un pMC de 107,5. Esto significa que un material de biomasa nuevo, tal como de maíz, proporcionaría un distintivo de 14C de pMC cercano a 107,5. Los compuestos a base de petróleo tendrán un valor de pMC de cero. La combinación de carbono fósil con carbono actual dará lugar a una dilución del contenido actual de pMC. Suponiendo que un pMC de 107,5 representa el contenido de 14C de los materiales de biomasa actuales y un pMC de 0 representa el contenido de 14C de los productos derivados del petróleo, el valor medido de pMC para ese material reflejará las proporciones de los dos tipos de componentes. Por ejemplo, un material derivado al 100 % de la soja actual tendría un distintivo de radiocarbono de un valor de pMC cercano a 107,5. Si ese material se diluyera al 50 % con productos a base de petróleo, la mezcla resultante tendría un distintivo de radiocarbono de un pMC de aproximadamente 54.

Se deriva un contenido de carbono con base biológica asignando el "100 %" igual a 107,5 pMC y el "0 %" igual a 0 pMC. Por ejemplo, una muestra que mide un pMC de 99 proporcionará un contenido de carbono con base biológica equivalente del 93 %. Este valor se conoce como el resultado medio de carbono con base biológica, y supone que todos los componentes de dentro del material analizado se originaron a partir del material biológico actual o del material a base de petróleo.

En algunos aspectos, un bioproducto producido de acuerdo con los métodos de la invención tiene un pMC de al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 75, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 85, al menos aproximadamente 90, al menos aproximadamente 95, al menos aproximadamente 96, al menos aproximadamente 97 o al menos aproximadamente 98. Como alternativa, o además, el bioproducto tiene un pMC de aproximadamente 100 o menos, aproximadamente 99 o menos, aproximadamente 98 o menos, aproximadamente 96 o menos, aproximadamente 95 o menos, aproximadamente 90 o menos, aproximadamente 85 o menos o aproximadamente 80 o menos. Por tanto, el bioproducto puede tener un pMC limitado por dos cualesquiera de los criterios de valoración anteriores. Por ejemplo, un bioproducto puede tener un pMC de aproximadamente 50 a aproximadamente 100; de aproximadamente 60 a aproximadamente 100; de aproximadamente 70 a aproximadamente 100; de aproximadamente 80 a aproximadamente 100; de aproximadamente 85 a aproximadamente 100; de aproximadamente 87 a aproximadamente 98; o de aproximadamente 90 a aproximadamente 95. En otros aspectos, un bioproducto que se describe en el presente documento tiene un pMC de aproximadamente 90, aproximadamente 91, aproximadamente 92, aproximadamente 93, aproximadamente 94 o aproximadamente 94,2.

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención.

EJEMPLO 1

Este ejemplo demuestra un método para identificar células hospedadoras modificadas por ingeniería genética que muestran una producción potenciada de ácidos grasos y derivados de los mismos.

ALC310 es una cepa de E. coli caracterizada anteriormente que tiene el genotipo MG1655 (AfadE::FRT AfhuA::FRT fabB[A329V] AentD::PT5-entD) que porta el plásmido ALC310 (pCL1920_PTRc_carBopt_13G04_alrA_sthA) (SEQ ID NO: 13) y produce ácidos grasos y derivados de los mismos. Para identificar las cepas que presentan un título o un rendimiento mejorados de los ácidos grasos o derivados de los mismos, se realizó la mutagénesis por transposón de ALC310, seguida de un cribado de alto rendimiento.

El ADN de transposón se preparó mediante la clonación de un fragmento de ADN en el plásmido EZ-Tn5™ pMOD™<R6K ori/MCS> (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI). El fragmento de ADN contiene un promotor T5 y un gen de resistencia al cloranfenicol (cat) flanqueado por sitios loxP. El plásmido resultante se denominó p100.38 (SEQ ID NO: 14). El plásmido p100.38 se digirió opcionalmente con la enzima de restricción PshAI, se incubó con la enzima Transposasa EZ-Tn5™ (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI) y se electroporó en células ALC310 electrocompetentes según las instrucciones del fabricante. Las colonias resultantes contenían el ADN de transposón insertado aleatoriamente en el cromosoma de ALC31 0.

Después, los clones de transposón se sometieron a un cribado de alto rendimiento para medir la producción de alcoholes grasos. En resumen, las colonias se cultivaron picando en placas de pocillos profundos que contenían medio Luria-Bertani (LB). Después del crecimiento nocturno, cada cultivo se inoculó en LB fresco. Después de 3 horas de crecimiento, cada cultivo se inoculó en medio FA-2 fresco. Se incluyó espectinomicina (100 pg/ml) en todos los medios para mantener la selección del plásmido 7P36. El medio FA-2 es medio M9 con glucosa al 3 % complementado con antibióticos, citrato de hierro 10 pg/l, tiamina 1 pg/l, tampón Bis-Tris 0,1 M (pH 7,0) y una dilución 1:1000 de la solución de minerales traza descrita en la Tabla 1.

TABLA 1

Después de 20 horas de crecimiento en FA-2, los cultivos se extrajeron con acetato de butilo. El extracto en bruto se derivatizó con BSTFA (N,O-bis[trimetilsilil]trifluoroacetamida) y las especies grasas totales (por ejemplo, alcoholes grasos, aldehídos grasos y ácidos grasos) se midieron con CG-DIL como se describe en la Publicación de Solicitud ^{de Patente Internacional}Wo ^2008/119082.

Los clones que produjeron un 15 % más de especies grasas totales que ALC310 se sometieron a una verificación adicional usando una fermentación en matraz de agitación. En resumen, los clones se cultivaron en 2 ml de medio LB complementado con espectinomicina (100 mg/l) a 37 °C. Después del crecimiento nocturno, se transfirieron 100 pl de cultivo a 2 ml de LB fresco complementado con antibióticos. Después de 3 horas de crecimiento, se transfirieron 2 ml ^{de cultivo a un matraz de 125 ml que contenía 18 ml de medio f}A-2 ^{complementado con espectinomicina (100 mg/l).}Cuando la DO⁶⁰⁰del cultivo alcanzó 2,5, se añadió 1 mM de IPTG a cada matraz. Después de 20 horas de crecimiento a 37 °C, se extrajo una muestra de 400 pl de cada matraz y las especies grasas totales se extrajeron con 400 pl de acetato de butilo. Los extractos en bruto se analizaron directamente con CG-DIL como se ha descrito anteriormente.

Se identificó un clon de transposón (denominado D288) que presentó títulos aumentados de las especies grasas totales en comparación con la cepa ALC310 parental (FIG. 2).

Los resultados de este ejemplo demuestran un método para identificar células hospedadoras modificadas por ingeniería genética que presentan una producción potenciada de ácidos grasos y derivados de los mismos en comparación con una célula hospedadora de tipo silvestre correspondiente.

EJEMPLO 2

Este ejemplo demuestra que una célula hospedadora modificada por ingeniería genética con una inserción de transposón en el gen nhaB presenta una producción potenciada de ácidos grasos y derivados de los mismos en comparación con la célula hospedadora de tipo silvestre correspondiente.

Se realizó un análisis de secuencia para identificar la ubicación de la inserción del transposón en la cepa D288 identificada en el Ejemplo 1. Para ello, se purificó ADN genómico de un cultivo de 3 ml de LB durante una noche de células D288 usando el kit ZR de ADN fúngico/bacteriano MiniPrep™ (Zymo Research) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN genómico purificado se secuenció hacia afuera del transposón usando los cebadores DG150 (GCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGTGTTGCTACGCCTG) (SEQ ID NO: 15) y DG153 (CCCAGGCTTCCCGGTATCAACAGGACACCAGG) (SEQ ID NO: 16), internos al transposón.

Se determinó que la cepa D288 tenía una inserción de transposón en el gen nhaB (FIG. 3).

Los resultados de este ejemplo demuestran que una célula hospedadora de E. coli modificada por ingeniería genética con una inserción de transposón en el gen nhaB presenta una producción potenciada de ácidos grasos y derivados de los mismos en comparación con una célula hospedadora de E. coli de tipo silvestre correspondiente.

EJEMPLO 3

Este ejemplo demuestra que las células hospedadoras modificadas por ingeniería genética que tienen un nivel alterado de producción de FadR presentan una producción potenciada de ácidos grasos y derivados de los mismos.

El gen nhaB está próximo al gen que codifica el regulador de la degradación de ácidos grasos, FadR (FIG. 3). Para determinar si la alteración de la expresión de FadR afecta a la producción de ácidos grasos o derivados de los mismos en las células hospedadoras, se clonó y se cribó una biblioteca de expresión de FadR.

Para clonar la biblioteca de expresión, el gen fadR de tipo silvestre se amplificó a partir de ADN genómico de E. coli MG1655 por PCR usando los cebadores DG191 (SEQ ID NO: 17) y DG192 (SEQ ID NO: 18). Un gen fadR mutante que contenía el cambio de aminoácidos S219N también se amplificó a partir de ADN genómico de E. coli MG1655 fadR[S219N] usando el conjunto de cebadores DG191 y DG192. Los cebadores utilizados en este ejemplo se enumeran en la Tabla 2.

TABLA 2

Identificador de Cebador Secuencia secuencia

DG191 ATGGTCATTAAGGCGCAAAGCCCGG SEQ ID NO: 17

^DG192GAGACCCCACACTACCATCCTCGAGTTATCGCCCCTGA ^{SEQ ID NO: 18}

________ ATGGCTAAATCACCC_____________________________________________

SL03 CTCGAGGATGGTAGTGTGGGGTCTCCC SEQ ID NO: 19

^SL23GAGACCGTTTCTCGAATTTAAATATGATACGCTCGAGC1 ^{SEQ ID NO: 20}

________ TCGTCTGTTTCTACTGGTATTGGCACAAAC_________________________

^DG193TGAAAGATTAAATTTNHHARNDDHDDNWAGGAGNNNN ^{SEQ ID NO: 21}

NNNATGGTCATTAAGGCGCAAAGCCCGG

Se amplificó por PCR un casete génico que codificaba la resistencia a la kanamicina (kan) a partir del plásmido pKD13 usando los cebadores SL03 (SEQ ID NO: 19) y SL23 (SEQ ID NO: 20). Cada casete de fadR (es decir, el tipo silvestre y el mutante S219N) se unió por separado con el casete de resistencia a kanamicina usando corte y empalme mediante PCR de extensión de solapamiento (SOE) usando los cebadores SL23 y DG193 (SEQ ID NO: 21). El cebador DG193 contenía nucleótidos degenerados para la generación de variantes de expresión.

El plásmido p100.487 (pCL1920_PTRC_carBopt_13G04_alrA_fabB[A329G]) (SEQ ID NO: 22) se linealizó a través de digestión por restricción con enzimas SwaI y XhoI. Cada uno de los dos productos fadR-kan de PCR SOE se clonó por separado en plásmido linealizado p100.487 usando el sistema INFUSION™ (Clontech, Mountain View, CA) y después los plásmidos se transformaron en células químicamente competentes NEB TURBO™ (New England Biolabs, Ipswich, MA). Los transformantes se cultivaron en placa en agar LB que contenía kanamicina 50 |jg/ml.

Se obtuvieron miles de colonias para fadR y fadR [S219N]. Las colonias se rasparon de las placas y los plásmidos se aislaron mediante minipreparación de acuerdo con protocolos convencionales. El conjunto de plásmidos resultante se transformó en una cepa de E. coli EG149 con un genotipo de MG1655 (AfadE::FRT AfhuA::FRT fabB[A329V] AentD::PT5-entD)) y se seleccionó en placas de LB que contenían espectinomicina 100 jg/ml.

Después, los transformantes se cribaron para la producción de especies grasas totales (por ejemplo, ácidos grasos, aldehidos grasos y alcoholes grasos) usando el procedimiento en pocillo profundo descrito en el Ejemplo 1. Se identificaron numerosas cepas que presentaron una producción potenciada de especies grasas totales en comparación con la cepa ALC487 de control (cepa EG149 que porta plásmido p100.487) (FIG. 4). Las cepas que expresan fadR de tipo silvestre o fadR [S219N] presentaron una producción potenciada de especies grasas totales en comparación con la cepa ALC487, aunque los títulos más altos se observaron en cepas que expresaban FadR de tipo silvestre (FIG. 4).

A varias de las principales cepas productoras que expresaban FadR de tipo silvestre identificadas en el cribado inicial se les asignaron ID de cepa y se validaron en una fermentación en matraz de agitación. En resumen, cada cepa se sembró en estrías para determinar colonias individuales y se cultivaron tres colonias separadas de cada cepa en tres matraces separados de acuerdo con el protocolo de fermentación en matraces de agitación descrito en el Ejemplo 1. Las especies grasas totales se midieron usando CG-DIL como se describe en el Ejemplo 1. Todas las cepas que expresaban FadR de tipo silvestre presentaron títulos de especies grasas totales más altos en comparación con la cepa ALC487 de control (FIG. 5).

Varias de las principales cepas productoras que expresaban FadR de tipo silvestre después se caracterizaron con el fin de determinar el rendimiento de especies grasas. Para ello, se realizó una fermentación en matraz de agitación como se ha descrito anteriormente, excepto porque (i) la temperatura se mantuvo a 32 °C, (ii) se añadió glucosa adicional después de 18 y 43 horas y (iii) la extracción se realizó a las 68,5 horas. Las especies grasas totales producidas se dividió por la glucosa total consumida para calcular el rendimiento de especies grasas. Todas las cepas que expresaban FadR de tipo silvestre presentaron un mayor rendimiento de especies grasas totales en comparación con la cepa ALC487 de control (FIG. 6).

La cepa D512 se caracterizó adicionalmente evaluando el título de especies grasas totales y el rendimiento después de la fermentación en un biorreactor de 5 l. A una tasa de alimentación de glucosa de glucosa de 10 g/l/h, la cepa D512 produjo títulos más altos de ácidos grasos y alcoholes grasos en comparación con la cepa ALC487 de control (FIG. 7). Además, el rendimiento total de todas las especies grasas aumentó en la cepa D512 en comparación con la cepa ALC487 (FIG. 7). A una tasa de alimentación de glucosa más alta de 15 g/l/h, la cepa D512 produjo aproximadamente 68,5 g/l de especies grasas totales con un rendimiento de aproximadamente el 20 % (FIG. 7). La cepa D512 produjo un título de especies grasas totales más alto y un rendimiento de 15 g/l/h en comparación con 10 g/l/h (FIG. 7).

Se aisló ADN plasmídico de la cepa D512 y se secuenció de acuerdo con protocolos convencionales. Se determinó que el plásmido obtenido de la cepa D512, denominado pDG109, tenía la secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 23.

Los resultados de este ejemplo demuestran que las células hospedadoras modificadas por ingeniería genética que tienen un nivel de expresión alterado de FadR producen títulos y rendimientos más altos de ácidos grasos y derivados de los mismos en comparación con las células hospedadoras de tipo silvestre correspondientes.

EJEMPLO 4

Este ejemplo demuestra un método para producir títulos altos de ácidos grasos en células hospedadoras modificadas por ingeniería genética que tienen un nivel alterado de expresión de FadR.

La cepa EG149 de E. coli utilizada en el Ejemplo 3 sobreexpresa el gen de entD, que codifica una fosfopanteteína transferasa (PPTasa) implicada en la activación de la enzima CarB que cataliza la reducción de los ácidos grasos a aldehídos y alcoholes grasos.

Para evaluar el efecto de la expresión de entD en la producción de ácido graso y alcohol graso en la cepa D512, se generó una variante D512 que contenía una supresión del gen de entD (D512 AentD). Las fermentaciones en matraz de agitación se realizaron con la cepa D512 y la cepa D512 AentD como se describe en el Ejemplo 1. La cepa D512 produjo títulos altos de alcoholes grasos y comparativamente títulos y rendimientos menores de ácidos grasos (FIG.

7). Por el contrario, la cepa D512 AentD produjo títulos y rendimientos altos de ácidos grasos y títulos relativamente bajos de alcoholes grasos (FIG. 8). Los títulos de especies grasas totales fueron similares entre la cepa D512 y la cepa D512 AentD (FIG. 8).

Los resultados de este ejemplo demuestran que las células hospedadoras modificadas por ingeniería genética que tienen un nivel alterado de expresión de FadR producen títulos altos de ácidos grasos cuando se suprime el gen de entD.

EJEMPLO 5

Para evaluar adicionalmente el efecto de la expresión alterada de FadR en la producción de ácidos grasos y derivados de los mismos, se prepararon bibliotecas de sitios de unión de ribosomas (RBS) de FadR (S219N) y FadR de tipo silvestre y se cribaron en células hospedadora de E. coli.

Una biblioteca de RBS se insertó en dirección 5' del gen fadR (S219N) en pDS57 como se indica a continuación. El ADN genómico de una cepa que contenía el alelo de fadR(S219N) Moniker stEP005; id: s26z7 se amplificó mediante PCR usando el conjunto de cebadores DG191 (SEQ ID No : 17) y fadR (S219N)_pme319rc (SEQ ID NO: 24). Los cebadores utilizados en este ejemplo se enumeran en la Tabla 3.

TABLA 3

Cebador Secuencia Identificador de secuencia DG191 ATGGTCATTAAGGCGCAAAGCCCGG SEQ ID NO: 17 fadR (S219N)_ C AA A AC AGCC A AGCT GGAGACCGTTTTT ATCGCC SEQ ID NO: 24 pme31 9rc

CCTGAATGGCTAAATCACC

377-rbs-fadR SEQ ID NO: 25 (S219N)f GCCCGAACCCGCAAGTAANHHARNDDHDDNWAG

GARNNNNNNNATGGTCATTAAGGCGCAAAGCCC

GG ^NH246AAAAACGGTCTCCAGCTTGGCTGTTTTGGCGGAT SEQ ID NO: 26 GAGAGAAGATTTTC

377-3r TT ACTT GCGGGTTCGGGCGC SEQ ID NO: 27

Después de que se preparase el molde de fadR (S219N), el RBS se añadió mediante PCR usando el conjunto de cebadores 377-rbs-fadR (S219N)f (SEQ ID NO: 25) y fadR (S219N)-pme319rc (SEQ ID NO: 24). El cebador 377-rbsfadR (S219N)f contenía nucleótidos degenerados para introducir variabilidad en la biblioteca de RBS. El RBS- fadR (S219N) se ligó con una cadena principal de vector pDS57 (descrito en el Ejemplo 5), usando el kit CLONEZ™ disponible en el mercado de Genscript (Piscataway, NJ) con el conjunto de cebadores NH246 (SEQ ID NO: 26) y 377-3r (SEQ ID NO: 27).

Una biblioteca RBS también se insertó en dirección 5' del gen fadR de tipo silvestre en pDS57 usando un protocolo similar, excepto porque el gen fadR de tipo silvestre se amplificó mediante PCR usando ADN genómico de DV2 de E. coli.

Las construcciones ligadas de pDS57-rbs- fadR (S219N) y pDS57-rbs- fadR se transformaron por separado en una cepa DAM1 de E. coli por electroporación. La cepa DAM1 se produjo como un derivado de la cepa DV2 (MG1655 AfadE, AfhuA), donde los genes l acIq-PTrc-tesA-fadD se integraron en el cromosoma usando el sistema de entrega basado en Tn7 presente en el plásmido pGRG25 (descrito en McKenzie et al., BMC Microbiology 6: 39 (2006)). Tras la transformación, las células se recuperaron durante 1 hora a 37 °C, seguido de cultivo en placa agar LB que contenía espectinomicina. Después de la incubación durante una noche a 37 °C, se escogieron colonias individuales para el cribado en 96 placas de pocillos profundos que contenían 300 pl/pocillo de LB con espectinomicina. Las placas se incubaron en un agitador de 32 °C con 80 % de humedad y se agitaron a 250 RPM durante aproximadamente 5 horas. Después de 5 horas de crecimiento, se transfirieron 30 pl/pocillo de cultivo de LB a medio FA2 300 pl/pocillo (2 g/l de nitrógeno) que contenía espectinomicina. Las placas se incubaron de nuevo en un agitador de 32 °C con 80 % de humedad y se agitaron a 250 RPM durante una noche. Se inocularon 30 pl/pocillo del cultivo durante la noche en medio FA2300 pl/pocillo (1 g/l de nitrógeno) que contenía espectinomicina, IPTg ImM y metanol al 2 %. Una placa de réplica se incubó en un agitador a 32 °C y otra se incubó en un agitador a 37 °C con 80 % de humedad y agitación a 250 RPM durante una noche. La receta para el medio FA2 se enumera en la Tabla 4.

TABLA 4

Reactivo ml de Reactivo por 1000 ml de FA2 Solución salina 5X 200

Tiamina (10 mg/ml) _{0 ,1}

MgSO41M 1

CaCb 1M _{0 ,1}

Glucosa al 50 % 60

TM2 (minerales traza sin hierro) 1

Citrato férrico 10 g/l 1

Tampón Bis-Tris 2M 50

NH4Cl* 10

Agua c.s. para 1000 ml

* eliminado para medio FA2 (nitrógeno 1 g/l)

Después de aproximadamente 24 horas de incubación, las placas se extrajeron añadiendo HCl 1M 40 pl/pocillo y acetato de butilo 300 pl/pocillo. Las placas se agitaron durante 15 minutos a 2000 RPM y después se centrifugaron durante 10 minutos a 4500 RPM a temperatura ambiente. Se transfirieron 50 pl de la capa orgánica por pocillo a una placa de 96 pocillos poco profunda que contenía BSTFA 50 pl/pocillo (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) y los extractos se analizaron mediante CG-DlL.

Se identificaron varios clones de DAM1 de E. coli transformados con pDS57-rbs- fadR como que producían títulos sustancialmente más altos de FAME y ácidos grasos libres en comparación con DAM1 de E. coli de control transformado con pDS57 solo. En general, las variantes de FadR produjeron relaciones de C14 a C16 bajas y presentaron títulos generales más altos a 32 °C en comparación con 37 °C.

También se identificaron numerosos clones de DAM1 de E. coli transformados con pDS57-rbs-FadR(S219N) que como que producían títulos sustancialmente más altos de FAME y ácidos grasos libres en comparación con el DV2 de E. coli de control o DAM1 de E. coli transformado con pDS57 solo.

Dos de los clones transformados con pDS57-rbs-FadR(S219N) identificados en el cribado inicial (designados como P1A4 y P1G7) se caracterizaron adicionalmente en fermentaciones en matraz de agitación. En resumen, cada colonia fue inoculada en 5 ml de LB que contenía espectinomicina y se incubaron a 37 °C con agitación a aproximadamente 200 RPM durante aproximadamente 5 horas. Se transfirieron 1,5 ml del cultivo de LB a 13,5 ml de medio FA2 (2 g/l de nitrógeno) que contenía Tritón X-100 al 0,05 % y espectinomicina en un matraz con deflectores de 125 ml. Los cultivos en matraz se incubaron durante una noche a 32 °C, 80 % de humedad y 250 RPM. Se transfirieron 1,5 ml del cultivo de una noche a un nuevo matraz con deflectores de 125 ml que contenía 13,5 ml de medio FA2 (1 g/l de nitrógeno) que contenía Tritón X-100 al 0,05 %, IPTG ImM, metanol al 2 % y espectinomicina. Después, los cultivos en matraz se incubaron a 32 °C, 80 % de humedad y 250 RPM. Después de 56 horas de incubación, se tomaron muestras de 500 pl de cada matraz. Se diluyeron 100 pl de cada muestra con 900 pl de agua para medir la DO del cultivo, se diluyeron 100 pl de cada muestra con 900 pl de agua para medir la glucosa restante y se extrajeron 300 pl de cada muestra y se analizaron usando CG-DIL como se ha descrito anteriormente.

Ambas variantes de FadR (es decir, P1A4 y P1G7) produjeron títulos y rendimientos más altos de especies grasas totales en comparación con la cepa de control transformada con pDS57 solo en la fermentación en matraz de agitación (FIG. 9).

La producción de especies grasas por P1A4 y P1G7 también se midió en fermentaciones a gran escala. Para ello, se cultivaron células de una solución madre congelada en medio LB durante unas horas y después se transfirieron a un medio definido que consistía en KH²PO⁴3 g/l, dihidrato de Na2HPO46 g/l, NH4Cl 2 g/l, MgSO4 x 7 H²O 0,24 g/l, glucosa 20 g/l, tampón Bis-Tris 200 mM (pH 7,2), solución de metales traza 1,0 ml/l y tiamina 1,0 mg/l, y se cultivaron durante una noche. La solución de metales traza estaba compuesta por FeCb x 6 H²O 27 g/l, ZnCb x ⁴H²O 2 g/l, CaCb x 6 H²O 2 g/l, Na2MoO4 x ²H²O 2 g/l, CuSO4 x 5 H²O 1,9 g/l, H³BO³0,5 g/l y HCl concentrado 40 ml/l.

Se inocularon 50 ml de cada cultivo durante una noche en 1 litro de medio de producción en un fermentador con control de temperatura, pH, agitación, aireación y oxígeno disuelto. La composición del medio era como se indica a continuación: KH²PO⁴1 g/l, (NH4)2SO4 0,5 g/l, MgSO4 x 7 H²O 0,5 g/l, Bacto casaminoácidos 5 g/l, citrato férrico 0,034 g/l, HCl 1M 0,12 ml/l, ZnCb x 4 H²O 0,02 g/l, CaCb x ²H²O 0,02 g/l, Na2MoO4 x ²H²O 0,02 g/l, CuSO4 x 5 H²O 0,019 g/l, H³BO³0,005 g/l y 1,25 ml/l de una solución vitamínica. La solución vitamínica contenía riboflavina 0,06 g/l, ácido pantoténico 5,40 g/l, niacina 6,0 g/l, piridoxina 1,4 g/l y ácido fólico 0,01 g/l.

Las fermentaciones se realizaron a 32 °C, pH 6,8 y oxígeno disuelto (DO) igual al 25 % de la saturación. El pH se

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir un ácido graso o derivado del mismo, que comprende;

(a) proporcionar una célula hospedadora bacteriana modificada por ingeniería genética que comprende un 5 promotor heterólogo y/o un sitio de unión a ribosomas unido operativamente a una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido FadR, provocando dicho promotor y/o sitio de unión a ribosomas la sobreexpresión del polipéptido FadR en dicha célula,

(b) cultivar la célula hospedadora bacteriana modificada por ingeniería genética en un medio de cultivo en condiciones que permitan la producción de un ácido graso o un derivado del mismo, y

(c) aislar el ácido graso o derivado del mismo de la célula hospedadora bacteriana modificada por ingeniería genética,

en donde el ácido graso o el derivado del mismo es un ácido graso, una acil-ACP, una acil-CoA, un aldehído graso, un alcohol de cadena corta, un alcohol de cadena larga, un alcohol graso, un hidrocarburo o un éster.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido FadR es codificado por un gen FadR obtenido de Escherichia, Salmonella, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Cronobacter, Yersinia, Serratia, Erwinia, Pectobacterium, Photorhabdus, Edwardsiella, Shewanella o Vibrio.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el polipéptido FadR es un polipéptido FadR de tipo silvestre o un polipéptido FadR mutante.

4. El método de la reivindicación 3, en donde el polipéptido FadR comprende una mutación en un resto de aminoácido que corresponde al aminoácido 219 de la SEQ ID NO: 1, preferentemente en donde la mutación es una sustitución del resto de aminoácido correspondiente al aminoácido 219 de la SEQ ID NO: 1 con un resto de asparagina.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el polipéptido FadR comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la expresión de uno o más genes seleccionados entre el grupo que consiste en fabA, fabB, iclR, fadA, fadB, fadD, fadE, fadl, fadJ, fadl, fadM, uspA, aceA, aceB y aceK está atenuado en la célula hospedadora bacteriana modificada por ingeniería genética.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el ácido graso o derivado del mismo es un éster, y el éster es una cera, un éster graso o un éster de ácido graso.

8. El método de la reivindicación 7, en donde el ácido graso o derivado del mismo es un éster de ácido graso, y el éster de ácido graso es un éster metílico de ácido graso (FAME) o un éster etílico de ácido graso (FAEE).

9. El método de la reivindicación 7 u 8, en donde una éster sintasa se sobreexpresa en la célula hospedadora modificada por ingeniería genética, preferentemente en donde la éster sintasa es ES9 de Marinobacter hidrocarbonoclasticus (SEQ ID NO: 2), ES8 de Marinobacter hydrocarbonoclasticus (SEQ ID NO: 3), AtfAl de Alcanivorax borkumensis SK2 (SEQ ID NO: 4), AtfA2 de Alcanivoraxborkumensis SK2 (s Eq ID NO: 5), O-acilglicerol diacetiltransferasa de Marinobacteraquaeolei VT8 (SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7), una cera sintasa o un éster de cera bifuncional sintasa/acil-CoA:aciltransferasa de diacilglicerol (cera-dgaT).

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en donde un complejo acetil-CoA carboxilasa se sobreexpresa en la célula hospedadora modificada por ingeniería genética, preferentemente en donde el complejo acetil-CoA carboxilasa está codificado por dos o más genes de la subunidad acetil-CoA carboxilasa obtenidos de uno o más de entre Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, Lactococcus lactis, Kineococcus radiotolerans, Desulfovibrio desulfuricans, Erwinia amylovora, Rhodospirillum rubrum, Vibrio furnissii, Stenotrophomonas maltophilia, Synechocystis sp. PCC6803 o Synechococcus elongatus.

11. El método de la reivindicación 10, en donde una biotina proteína ligasa se sobreexpresa en la célula hospedadora modificada por ingeniería genética.

12. El método de la reivindicación 7, en donde el ácido graso o derivado del mismo es un aldehído graso o un alcohol graso y en donde una ácido carboxílico reductasa y una tioesterasa se sobreexpresan en la célula hospedadora modificada por ingeniería genética, preferentemente en donde una alcohol deshidrogenasa se sobreexpresa en la célula hospedadora modificada por ingeniería genética.

13. El método de la reivindicación 12, en donde la ácido carboxílico reductasa es carB (SEQ ID NO: 8), la tioesterasa es tesA (SEQ ID NO: 11) y la alcohol deshidrogenasa es YjgB (SEQ ID NO: 10) o AlrAadpl (SEQ ID NO: 9).

14. El método de la reivindicación 12 o 13, en donde una fosfopanteteinil transferasa (PPTasa) se sobreexpresa en la célula hospedadora modificada por ingeniería genética, preferentemente en donde la PPTasa es EntD de E. coli MG1655 (SEQ ID NO: 12).

15. El método de la reivindicación 14, en donde la célula hospedadora se selecciona entre el grupo que consiste en una célula de E. coli, una célula de Pantoea citrea, una célula de Bacillus lentus, una célula de Bacillus brevis, una célula de Bacillus stearothermophilus, una célula de Bacillus lichen formis, una célula de Bacillus alkalophilus, una célula de Bacillus coagulans, una célula de Bacillus circulans, una célula de Bacillus pumilis, una célula de Bacillus thuringiensis, una célula de Bacillus clausii, una célula de Bacillus megaterium, una célula de Bacillus subtilis, una célula de Bacillus amyloliquefaciens, una célula de Trichoderma koningii, una célula de Trichoderma viride, una célula de Trichoderma reesei, una célula de Trichoderma longibrachiatum, una célula de Aspergillus awamori, una célula de Aspergillus fumigates, una célula de Aspergillus foetidus, una célula de Aspergillus nidulans, una célula de Aspergillus niger, una célula de Aspergillus oryzae, una célula de Humicola insolens, una célula de Humicola lanuginose, una célula de Rhodococcus opacus, una célula de Rhizomucor miehei, una célula de Mucor miehei, una célula de Streptomyces lividans, una célula de Streptomyces murinus, una célula de Actinomycetes, una célula de Avabidopsis thaliana, una célula de Panicum virgatum, una célula de Miscanthus giganteus, una célula de Zea mays, una célula de Botryococcuse braunii, una célula de Chlamydomonas reinhardtii, una célula de Dunaliela salina, un Synechococcus Sp. célula PCC 7002, un Synechococcus Sp. célula PCC 7942, un Synechocystis Sp. célula PCC 6803, una célula de Thermosynechococcus elongates BP-1, una célula de Chlorobium tepidum, una célula de Chlorojlexus auranticus, una célula de Cromatiumm vinosum, una célula de Rhodospirillum rubrum, una célula de Rhodobacter capsulatus, una célula de Rhodopseudomonas palusris, una célula de Clostridium ljungdahlii, una célula de Clostridiuthermocellum, una célula de Penicillium chrysogenum, una célula de Pichia pastoris, una célula de Saccharomyces cerevisiae, una célula de Schizosaccharomyces pombe, una célula de Pseudomonasjluorescens y una célula de Zymomonas mobilis.