ES2795981T3

ES2795981T3 - BAG3 como marcador bioquímico de suero y tejidos

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Publication number: ES2795981T3
Application number: ES13728180T
Authority: ES
Inventors: Maria Caterina Turco
Original assignee: Intrepida Bio Inc
Current assignee: Intrepida Bio Inc
Priority date: 2012-06-19
Filing date: 2013-06-11
Publication date: 2020-11-25
Anticipated expiration: 2033-06-11
Also published as: BR112014031958A2; CN104507965B; US20150147767A1; AU2013279601A1; JP2015529633A; BR112014031957A2; EP2676966A1; EP2861618A1; JP2015521475A; KR102150903B1; US20150132764A1; AU2013279604A1; CA2876922C; AU2013279604B2; CN104619861A; KR20150036111A; IN2014DN10562A; PL2861618T3; CN104507965A; CA2876872A1

Abstract

Método para el diagnóstico de un estado patológico caracterizado por detectar la presencia de un anticuerpo anti-BAG3 o un anticuerpo anti-BAG3 unido a BAG3 soluble para formar un inmunocomplejo en una muestra biológica, que comprende la etapa de: a. determinar la presencia de un anticuerpo anti-BAG3 o un anticuerpo anti-BAG3 unido a BAG3 soluble para formar un inmunocomplejo en la muestra biológica que consiste suero, plasma, orina o saliva, obtenida de un sujeto; b. comparar los valores obtenidos de la muestra biológica con valores de referencia o con los valores obtenidos de donantes sanos, en donde dicho estado patológico se selecciona de angina de pecho, angina preinfarto, infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca, enfermedad coronaria aguda, isquemia, insuficiencia cardiaca aguda, insuficiencia cardiaca crónica o enfermedad cardiaca yatrógena y cáncer pancreático y dicho diagnóstico es in vitro o ex vivo.

Description

DESCRIPCIÓN

BAG3 como marcador bioquímico de suero y tejidos

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-BAG3 para uso como marcadores bioquímicos en el diagnóstico de un estado patológico.

Estado de la técnica

BAG3 (RefSeq: NP_004272; ID génico 9531) es una proteína citoplásmica de 74 kDa particularmente concentrada en el retículo endoplásmico rugoso. La proteína BAG3 pertenece a la familia de cochaperonas que interaccionan con el dominio ATPasa de la proteína de choque térmico HSP70 a través del dominio estructural conocido como dominio BAG (110-124 aminoácidos). Además del dominio BAG, BAG3 contiene un dominio WW y una repetición rica en prolina (PXXP), que puede mediar la unión a otras proteínas. Además, dos motivos IPV (Ile-Pro-Val) conservados están localizados entre las regiones WW y PXXP y median la unión de BAG3 a HspB8, un miembro de la familia HspB de chaperonas moleculares. Por tanto, bAG3, debido a la naturaleza adaptadora de su estructura multidominio, puede interaccionar con diferentes proteínas compañeras. La expresión del gen bag3 es constitutiva en unos pocos tipos de células normales, incluyendo miocitos, y en varios tumores primarios o líneas de células tumorales. Además, puede ser inducida por una variedad de agentes de estrés: en efecto, los estímulos estresantes activan el factor de transcripción de choque término (HSF) 1, que es responsable de la expresión de genes activados por estrés, incluyendo bag3 (Rosati A, Graziano V, De Laurenzi V, Pascale M, Turco MC. BAG3: a multifaceted protein that regulates major cell pathways. Cell Death Dis. 2011; 2: e141). La evidencia indica que BAG3 desempeña un papel en sostener la supervivencia celular, al modular, ya sea de una manera dependiente o independiente de Hsp70, los niveles o localización de proteínas que regulan apoptosis, tal como IKKy, Bax o BRAF, dependiendo del contexto celular.

La proteína BAG3 parece expresarse durante la diferenciación de cardiomioblastos y sostener la expresión de miogenina. Estos hallazgos indican una implicación de BAG3 en desarrollo tardío del corazón (De Marco M, Turco MC, Rosati A. BAG3 protein is induced during cardiomyoblast differentiation and modulates myogenin expression. Cell Cycle. 2011; 10: 850-852). Además, se ha mostrado que en cardiomiocitos BAG3 se localiza en el disco z e interacciona con la proteína que recubre actina, CapZp1, estabilizando la estructura de la miofibrilla y posiblemente conservando la integridad miofibrilar durante el estrés mecánico. Las mutaciones en BAG3 pueden alterar el ensamblaje del disco Z y aumentar la sensibilidad a apoptosis inducida por estrés. De acuerdo con el papel de BAG3 en la supervivencia e integridad miofibrilar en cardiocitos y, en general, en células musculares, las mutaciones en el gen bag3 se han asociado con algunas formas de miopatía miofibrilar y cardiomiopatía dilatada.

Hasta ahora tanto una forma de BAG3 citoplásmica como forma sérica soluble de BAG3 se han detectado y encontrado asociadas con diferentes patologías, así como más en general con la supervivencia celular.

Se siente cada vez más la necesidad e importancia para la identificación de un marcador biológico que permita la rápida identificación de tales patologías, sin tener las desventajas de estar asociado con diagnóstico invasivo de una manera sorprendentemente específica y sensible, y/o que pueda permitir detectar antes la patología, seguir el efecto de terapia, predecir el riesgo de complicaciones, realizar un seguimiento informativo.

Compendio de la invención

La presente descripción se refiere a anticuerpos anti-BAG3 para uso como marcadores bioquímicos en el diagnóstico de un estado patológico.

Preferiblemente, dichos anticuerpos anti-BAG3 se unen a BAG3 soluble para formar inmunocomplejos.

Según un aspecto preferido dicho diagnóstico es in vitro o ex vivo.

Un aspecto adicional es que el receptor de dicho diagnóstico es un mamífero, preferiblemente un ser humano.

Como se describirá adicionalmente en la descripción detallada el uso de los anticuerpos anti-BAG3 de la presente invención tiene las ventajas de ser específico para un estado patológico seleccionado del grupo que consiste en una enfermedad del corazón, cáncer, diabetes, inflamación y enfermedades inflamatorias de la piel, nervios, huesos, vasos sanguíneos y tejidos conjuntivos.

Según un aspecto, dicha enfermedad del corazón se selecciona de: angina de pecho, angina preinfarto, infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca, isquemia, enfermedad coronaria aguda, insuficiencia cardiaca aguda, insuficiencia cardiaca crónica y enfermedad cardiaca yatrógena.

Según otro aspecto, dicho cáncer se selecciona de: cáncer pancreático, cáncer de vejiga y cáncer de próstata.

Una forma de realización de la presente invención es un método para el diagnóstico de un estado patológico caracterizado por detectar la presencia de un anticuerpo anti-BAG3 o un anticuerpo contra BAG3 unido a BAG3 soluble para formar un inmunocomplejo en una muestra biológica, que comprende la etapa de:

a. determinar la presencia de un anticuerpo anti-BAG3 o anticuerpo contra BAG3 unido a BAG3 soluble para formar un inmunocomplejo en una muestra biológica que consiste en suero, plasma, orina o saliva, obtenida de un sujeto; b. comparar los valores obtenidos de la muestra biológica con valores de referencia o con los valores obtenidos de donantes sanos,

en donde dicho estado patológico se selecciona de angina de pecho, angina preinfarto, infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca, enfermedad coronaria aguda, isquemia, insuficiencia cardiaca aguda, insuficiencia cardiaca crónica o enfermedad cardiaca yatrógena y cáncer pancreático y dicho diagnóstico es in vitro o ex vivo.

En una forma de realización preferida, dicha etapa de determinación a. se realiza mediante una prueba ELISA.

Según una forma de realización preferida de la presente invención dicho suero, plasma, orina o saliva es de un mamífero, preferiblemente un ser humano.

También se divulga un kit de ELISA, que comprende una proteína recombinante BAG3 o anticuerpos monoclonales de ratón específicos de BAG3 AC-1, Ac -2 a C-3, AC-4, AC-5, AC-rb1a, AC-rb1b, AC-rb2a, AC-rb2b, AC-rb3a, AC-rb3b, AC-rb4a y AC-rb4b para capturar BAG3 soluble y anticuerpos capaces de reconocer inmunoglobulinas humanas, así como su uso para la detección de anticuerpos anti-BAG3 o anticuerpos anti-BAG3 unidos a BAG3 soluble para formar inmunocomplejos en una muestra biológica.

Una forma de realización adicional de la presente invención es un kit de ELISA que comprende una proteína recombinante BAG3 y anticuerpos capaces de reconocer inmunoglobulinas humanas, para la detección de anticuerpos anti-BAG3 o anticuerpos anti-BAG3 unidos a BAG3 soluble para formar inmunocomplejos en una muestra biológica, para uso en el diagnóstico de angina de pecho, angina preinfarto, infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca, enfermedad coronaria aguda, isquemia, insuficiencia cardiaca aguda, insuficiencia cardiaca crónica o enfermedad cardiaca yatrógena y cáncer pancreático.

Preferiblemente dicha muestra biológica es una muestra de suero, plasma, orina o saliva.

En una forma de realización preferida de la presente invención dicha muestra de suero, plasma, orina o saliva es de un mamífero, preferiblemente un ser humano.

También se divulga un kit de inmunohistoquímica (IHC) para la detección de proteína BAG3 en una muestra biológica, en donde dicha muestra biológica es preferiblemente una muestra de tejido, que comprende anticuerpos específicos para BAG3 y reactivos que incluyen sondas necesarias para la tinción.

El documento WO2011/067377 divulga un método para detectar la presencia y/o la concentración de la proteína BAG3 soluble en una muestra biológica desconocida, usando un método ELISA, en donde la presencia de dicha proteína en una forma soluble se asocia con enfermedad del corazón o con la presencia de tumores pancreáticos.

Breve descripción de los dibujos

Las características y ventajas de la presente invención serán aparentes de la descripción detallada relatada a continuación, de los ejemplos dados para fines ilustrativos y no limitantes, y de las figuras adjuntas 1-10, en donde:

Figura 1.

Figura 1A: detección de proteína BAG3 en sobrenadantes de cardiomiocitos cultivados. Se incubaron cardiomiocitos humanos (HCMa) y de rata (H9c2) al 80% de confluencia con o sin SBF al 10% durante 16 horas a 37°C en una atmósfera de CO²al 5%. Los sobrenadantes se dializaron en un tampón que contenía NaCl 50 mM e IGEPAL al 0,05%, se liofilizaron, resuspendieron en 1 ml de tampón RIPA (Tris HCl 50 mM pH 7,6, cloruro de sodio 150 mM, ortovanadato de sodio 2 mM, EDTA 4 mM, pirofosfato de sodio 10 mM, NP-40 al 1%, desoxicolato de sodio al 0,1%), y se analizaron con anticuerpos anti-BAG3 o anti-GAPDH por inmunotransferencia.

Figura 1B: detección de proteína BAG3 en vesículas exocíticas. Se sometieron sobrenadantes obtenidos de células H9c2 a centrifugaciones secuenciales: (i) 2.000*g durante 15 minutos, para eliminar células; (ii) 10.000*g durante 30 minutos, para eliminar restos celulares; (iii) 150.000*g durante 90 minutos, para precipitar vesículas exocíticas. El precipitado se lavó una vez en PBS a 150.000*g durante 90 minutos y se analizó con el anticuerpo policlonal anti-BAG3 TOS-2 en comparación con un lisado de células enteras por inmunotransferencia. Se analizó Rab-4 como un marcador para vesículas exocíticas. Se analizó GAPDH, una proteína citosólica, como control.

Figura 1C: Se analizaron sueros de dos donantes sanos y de dos pacientes afectados por insuficiencia cardiaca crónica con el anticuerpo anti-BAG3 anticuerpo policlonal t OS-2 en inmunotransferencia.

Figura 1D: Se cortaron del gel las bandas obtenidas en dos pacientes afectados por insuficiencia cardiaca crónica y su identidad se analizó por espectrometría de masas usando el programa MASCOT.

Figura 2.

Figura 2A: detección de proteína BAG3 en sueros de pacientes de ICC. Se analizaron la proteína recombinante BAG3 y lisado de células enteras de células HCMa por inmunotransferencia con suero (1:40) obtenido de un paciente con insuficiencia cardiaca. El análisis con suero de un donante sano se realizó como control negativo.

Figura 2B: detección de anticuerpos anti-BAG3 por ensayo ELISA. Se compararon sueros de 50 pacientes de ICC (con fracciones de eyección < 60%) con sueros de 50 donantes sanos para la presencia de anticuerpos anti-BAG3 en un ensayo ELISA específico. Los resultados se representan como unidades arbitrarias.

Figura 2C: Análisis ROC de los resultados del ensayo ELISA. El límite en 0,083 U.A. produce una sensibilidad del 74% y especificidad del 68%.

Figura 3.

Figura 3A: Análisis por microscopía confocal de fluorescencia directa realizado para la detección de la unión de rBAG3-FITC a células HCMa (a, b, c) y células J774 A1 (d, e, f, g, h, i). Se conjugaron proteína recombinante BAG3 y BSA (albúmina de suero bovino comprada de SIGMA) purificada a FITC usando el kit de conjugación a FITC FluoroTag comprado de SIGMA según las instrucciones del fabricante. Se añadieron cantidades iguales de proteínas rBAG3-FITC (b, e) y BSA-FITC (h), calculadas según las instrucciones del fabricante, en medios de cultivo de HCM y J774 A1 con NaN3 al 0,1% durante 1 h. Se analizó p-integrina como control (a, d, g). Las células se analizaron mediante un microscopio confocal Zeiss LSM. Se muestran imágenes fusionadas en c, f e i.

Figura 3B: BAG3 se une a macrófagos. Se incubaron macrófagos J774 A1 (1*10® células/ml) con diferentes concentraciones de proteína Fitc-BAG3 (7, 14 y 70 nm). Se usó FITC-BSA (70 nM) como un control negativo (gris). Se analizó la fluorescencia de las células por citometría de flujo.

Figura 3C panel a - Análisis de los niveles de Cox-2 e iNOS en macrófagos J774 A1 incubados con BAG3. Se incubaron células J774 A1 al 80% de confluencia con medio control, BSA, LPS o rBAG3 durante 20 horas. Se añadió polimixina donde se indica para verificar que los efectos de rBAG3 derivada de E. coli eran independientes de la presencia de endotoxina contaminante. Se analizó la expresión de Cox-2 e iNOS en lisados celulares por inmunotransferencia.

Figura 3C panel b - Análisis de la liberación de nitrito de macrófagos J774 A1 incubados con BAG3. Se incubaron células J774 A1 al 80% de confluencia con medio control, BSA, LPS o rBAG3 durante 24 horas. Se incubaron 100 pl de sobrenadantes de cada muestra con 100 pl de reactivo de Griess; se midió la densidad óptica a 550 nm (DO550) con un espectrofotómetro Beckman DU62. Se evaluó la concentración de nitrito comparando la DO550 de la muestra con la de una curva patrón de nitrito de sodio.

Figura 3C panel c - Análisis de la liberación de IL-6 de macrófagos J774 A1 incubados con BAG3. Se incubaron células J774 A1 al 80% de confluencia con medio control, BSA, LPS o BAG3 recombinante durante 5 horas. Se añadieron péptidos de BAG3 (péptido 1, péptido 2, péptido 3, péptido 4 o péptido mezclado) 625 nM donde se indica para verificar su capacidad para bloquear la actividad de BAG3. Se midió la producción de IL-6 en medio de cultivo de células usando un ensayo ELISA. La concentración de IL-6 se evaluó comparando la DO de la muestra con la de una curva patrón de IL-6 recombinante.

Figura 4.

Figura 4A: Imágenes representativas de tinción de BAG3 usando el anticuerpo monoclonal anti-BAG3 AC-1 en tejido de páncreas normal. Las secciones se contratiñeron con hematoxilina. La tinción reveló una positividad moderada de islotes de Langerhans, mientras que los conductos pancreáticos y células acinares pancreáticas normales no tenían expresión de BAG3.

Figura 4B: Imágenes representativas de muestras tumorales positivas bajas para BAG3 y positivas altas para BAG3 teñidas usando un anticuerpo monoclonal anti-BAG3 revelado con un anticuerpo secundario biotinilado. Las secciones se contratiñeron con hematoxilina. Se muestran dos aumentos diferentes: 100x (paneles izquierdos) y 400X (paneles derechos). Se asignó una puntuación basada en la proporción de células cancerosas positivas en la muestra contando el número de células positivas sobre las células cancerosas totales en 10 campos no solapantes usando 400X aumentos. El porcentaje mediana de células positivas para BAG3, calculado como se describe, fue el 40% y este valor se usó como un límite para separar muestras positivas bajas y altas.

Figura 4C: Se hicieron curvas de supervivencia comparando 39 pacientes con baja tinción de BAG3 (<40% de células positivas) y 27 pacientes con alta tinción de BAG3 (> 40% de células positivas). Todos los pacientes analizados experimentaron extirpación R0 del adenocarcinoma pancreático. La supervivencia mediana aumenta desde 12 meses en el grupo positivo alto a 23 meses en el grupo positivo bajo. Valor p de la prueba de orden logarítmico = 0,0013.

Figura 5.

Imagen representativa de tinción de BAG3 en tejidos sinoviales de varias artritis reumatoides. La positividad de BAG3 se observa en fibroblastos sinoviales e infiltrados inflamatorios. Las secciones se contratiñeron con hematoxilina.

Figura 6.

Imagen representativa de tinción de BAG3 en vejiga urinaria normal que resultó negativa y en carcinoma de vejiga de células transicionales que resulto muy positiva para BAG3 en el citoplasma de células tumorales. Las secciones se contratiñeron con hematoxilina.

Figura 7.

Figura 7A: La expresión relativa del ARNm de bag3 evaluada por qRT-PCR se muestra en un gráfico donde los valores se describen como media D.E. La línea azul representa el valor de la mediana calculado.

Figura 7B: El análisis de supervivencia se hizo para todos los pacientes analizados con qRT-PCR. 13 pacientes con alta expresión de bag3 tuvieron supervivencia más corta (mediana de supervivencia = 19,0 meses) en comparación con 12 pacientes con baja expresión de bag3 (mediana de supervivencia = 32,0 meses). Valor p de la prueba de orden logarítmico = 0,0198.

Figura 8.

Figura 8A: Se trataron líneas celulares de cáncer pancreático (PSN1, Capan-1, AsPC-1, PANC-1 y MIA PaCa-2) con diferentes concentraciones de gemcitabina como se indica en el gráfico. Después de 48 horas, se analizó la muerte celular apoptótica. El gráfico representa el porcentaje medio de células Sub G0/G1 (± D.E.) Los datos son representativos de tres experimentos independientes.

Figura 8B: Análisis por inmunotransferencia de BAG3 en líneas celulares de cáncer pancreático; los contenidos en la proteína de mantenimiento GAPDH se usaron para controlar condiciones de carga iguales.

Figura 8C: Se trataron las líneas celulares MIA PaCa-2 y PANC-1 con gemcitabina (GEM) 2 pM durante los tiempos indicados. Se siguieron los niveles de expresión de la proteína BAG3 por inmunotransferencia.

Figura 8D: Se analizaron los niveles del ARNm de bag3 por RT-PCR; el gráfico representa niveles relativos del ARNm de bag3 (± D.E.) y los datos son representativos de tres experimentos independientes.

Figura 8E: Se transfectaron las líneas celulares MIA PaCa-2 y PANC-1 con ARNip de BAG3 o un ARNip no dirigido (ARNipND) durante 72 horas y después se trataron con gemcitabina (GEM) 2 pM durante 24 horas. Los niveles de BAG3 se analizaron por inmunotransferencia y se detectaron los niveles de GAPDh para controlar iguales condiciones de carga.

Figura 8F: Se transfectaron células MIA PaCa-2 y PANC-1 como se ha descrito anteriormente y se trataron con gemcitabina (GEM) 2 pM durante 24 h o 48 h. Se analizó la muerte celular apoptótica como se ha descrito. El gráfico representa el porcentaje medio de células Sub G0/G1 (± D.E.) Los datos son representativos de tres experimentos independientes.

Figura 9.

Figura 9A: Detección de inmunocomplejos específicos de BAG3 por ensayo ELISA. Se compararon sueros de 55 pacientes de adenocarcinoma pancreático con los sueros de 51 donantes sanos para la presencia de inmunocomplejos específicos de BAG3 en un ensayo ELISA específico. Los resultados se representan como unidades arbitrarias ± D.E.

Figura 9B: Análisis ROC de los resultados del ensayo ELISA. El límite en 0,183 U.A. produce una sensibilidad del 65% y una especificidad del 78%.

Figura 10.

La detección de anticuerpos específicos de BAG3 en sueros de pacientes de 49 sujetos femeninos a 0-1 años prediagnóstico para adenocarcinoma pancreático se compararon con sueros de 235 sujetos femeninos control para la presencia de anticuerpos específicos para BAG3 en un ensayo ELISA específico. Los sueros control eran aproximadamente cinco para cada sujeto caso y coincidentes en edad con el caso respectivo. Otros puntos de tiempo incluyeron: 53 sujetos a 1-2 años prediagnóstico para ACDP comparados con 251 controles; 44 sujetos a 2-3 años prediagnóstico para ACDP comparados con 212 controles; 42 sujetos a 3-4 años prediagnóstico para ACDP comparados con 187 controles. Los resultados se representan como unidades arbitrarias ± S. El valor P se calculó con la prueba de la t de Student.

Descripción detallada de la invención

La presente divulgación se refiere a anticuerpos anti-BAG3 para uso como marcadores bioquímicos en el diagnóstico de un estado patológico.

Con el término “diagnóstico” en la presente invención nos referimos al diagnóstico médico (con frecuencia simplemente denominado diagnóstico) que se refiere al proceso de intentar determinar o identificar una posible enfermedad o trastorno. El diagnóstico de la presente invención abarca también el diagnóstico temprano. Con el término “diagnóstico temprano” nos referimos a la capacidad de la prueba para discriminar un estado patológico antes de los síntomas específicos o no específicos.

Los anticuerpos anti-BAG3 se han detectado ahora ventajosamente en suero, plasma, orina o saliva. Hasta ahora tales anticuerpos no se habían encontrado nunca en suero ya fuera en estado fisiológico o patológico. La detección de anticuerpos anti-BAG3 en suero tiene la ventaja de ser una técnica rápida y no invasiva a ser explotada para fines diagnósticos, de diagnóstico temprano y pronóstico, estratificación de riesgo, como una herramienta para la identificación y para seguir terapias.

Una ventaja adicional de la detección de anticuerpos es que se requiere una cantidad muy pequeña de suero para la detección. De hecho, también se puede detectar la proteína BAG3 soluble en el suero de pacientes que padecen algunas patologías, pero la cantidad de suero pedida para la detección de la proteína soluble es mucho mayor que la requerida para la detección de anticuerpos. Además, es posible que los niveles de proteína BAG3 soluble puedan ser mucho menores que los de los anticuerpos y/o que, respecto a la proteína BAG3 soluble, los anticuerpos puedan ser detectables en fases más tempranas de patologías específicas y/o puedan predecir de forma más eficaz el riesgo de complicaciones o seguir los efectos de terapias.

Un aspecto adicional es que dichos anticuerpos anti-BAG3 se pueden detectar ventajosamente en diferentes muestras biológicas seleccionadas de suero, plasma, orina o saliva.

En la presente invención, mediante suero se pretende el componente de la sangre que ni es una célula sanguínea ni un factor de coagulación; es el plasma sanguíneo con los fibrinógenos eliminados. Suero incluye todas las proteínas no usadas en la coagulación de la sangre y todos los electrolitos, anticuerpos, antígenos, hormonas, y cualquier sustancia exógena.

En la presente invención, mediante plasma se pretende el componente líquido de color paja/amarillo pálido de la sangre que normalmente contiene las células sanguíneas en la sangre completa en suspensión. Contiene factores de coagulación, tal como fibrinógenos.

También se divulga el uso de anticuerpos anti-BAG3 como marcadores bioquímicos, en donde dichos anticuerpos anti-BAG3 se unen a BAG3 soluble para formar inmunocomplejos.

Los anticuerpos anti-BAG3, ya sean libres o unidos a BAG3 soluble para formar inmunocomplejos se han detectado ahora ventajosamente en una muestra biológica, y se pueden usar como un marcador en el diagnóstico de un estado patológico. La detección de tales anticuerpos y/o inmunocomplejos en una muestra biológica también tiene la ventaja de ser una técnica rápida y no invasiva para fines diagnósticos y/o pronósticos.

Según un aspecto preferido dicho diagnóstico es in vivo o ex vivo.

En la presente invención, mediante inmunocomplejo o complejo proteína/anticuerpo se pretende la unión integral de un anticuerpo a un antígeno soluble, el antígeno soluble que actúa como un epítopo específico, unido a un anticuerpo, se denomina un inmunocomplejo singular.

Tales inmunocomplejos tienen las mismas ventajas vistas para la detección de anticuerpos, ya que se requiere una cantidad de suero muy pequeña también para la detección del inmunocomplejo. La cantidad de suero requerida para la detección de BAG3 soluble es mucho mayor también que la requerida para la detección de los (inmuno)complejos proteína/anticuerpo. Los inmunocomplejos, así como los anticuerpos libres pueden ser detectables en fases más tempranas de patologías específicas y pueden predecir de forma más eficaz el riesgo de complicaciones o seguir los efectos de terapias. También se divulga el uso de anticuerpos anti-BAG3 o dichos inmunocomplejos (formados por anticuerpos anti-BAG3 unidos a BAG3 soluble) como marcadores biológicos de un estado patológico, en donde dicho estado patológico es una enfermedad del corazón, cáncer, diabetes, inflamación y enfermedades inflamatorias de la piel, nervios, huesos, vasos sanguíneos y tejidos conjuntivos.

Preferiblemente dicha enfermedad del corazón se selecciona del grupo que consiste en: angina de pecho, angina preinfarto, infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca, isquemia, enfermedad coronaria aguda, insuficiencia cardiaca aguda, insuficiencia cardiaca crónica y enfermedad cardiaca yatrógena.

Según una divulgación preferida, dicho cáncer se selecciona de: cáncer pancreático, cáncer de vejiga y cáncer de próstata.

Una forma de realización de la presente invención es un método para el diagnóstico de un estado patológico caracterizado por detectar la presencia de un anticuerpo anti-BAG3 o un anticuerpo anti-BAG3 unido a BAG3 soluble para formar un inmunocomplejo en una muestra biológica, que comprende la etapa de:

a. determinar la presencia de un anticuerpo anti-BAG3 o un anticuerpo contra BAG3 unido a BAG3 soluble para formar un inmunocomplejo en una muestra biológica que consiste en suero, plasma, orina o saliva, obtenida de un sujeto;

b. comparar los valores obtenidos de la muestra biológica con valores de referencia o con los valores obtenidos de donantes sanos,

El método según la presente invención tiene la ventaja de permitir detectar diferencias significativas entre anticuerpos anti-BAG3 y/o complejos BAG3/anticuerpos entre individuos sanos y pacientes afectados por patologías que implican BAG3. El método de ensayo propuesto permite una separación estadísticamente significativa del grupo de pacientes cardiacos del grupo de gente sana. También puede estratificar tales pacientes con enfermedad del corazón en subgrupos de pacientes con riesgo aumentado (insuficiencia cardiaca, IC).

En un aspecto preferido el método según la presente invención es un método en donde dicha etapa de determinación a. se realiza mediante un ensayo ELISA.

Según una forma de realización preferida en el método de la presente invención dicho suero, plasma, orina o saliva es de un mamífero, preferiblemente un ser humano.

El método según la presente invención tiene la ventaja de permitir la detección rápida y no invasiva de los marcadores biológicos que permiten la evaluación de patologías, riesgos para enfermedades y/o sus complicaciones, y seguimiento de terapias.

La invención se refiere además a un kit de ELISA que comprende una proteína recombinante BAG3 y anticuerpos capaces de reconocer inmunoglobulinas humanas, para la detección de anticuerpos anti-BAG3 o anticuerpos anti-BAG3 unidos s BAG3 soluble para formar inmunocomplejos en una muestra biológica, para uso en el diagnóstico de angina de pecho, angina preinfarto, infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca, enfermedad coronaria aguda, isquemia, insuficiencia cardiaca aguda, insuficiencia cardiaca crónica o enfermedad cardiaca yatrógena y cáncer pancreático.

También se divulga un kit de ELISA que comprende una proteína recombinante BAG3 para capturar anticuerpos anti-BAG3 o anticuerpos monoclonales de ratón específicos de BAG3 AC-1, AC-2, AC-3, AC-4, a C-5, AC-rb1a, AC-rb1b, AC-rb2a, AC-rb2b, AC-rb3a, AC-rb3b, AC-rb4a y AC-rb4b, para capturar BAG3 soluble y anticuerpos capaces de reconocer inmunoglobulinas humanas.

También se divulga un kit para la detección de anticuerpos asociados a BAG3 en una muestra biológica y se realiza mediante ELISA con anticuerpos monoclonales de ratón específicos de BAG3 AC-1, AC-2, AC-3, AC-4, AC-5, AC-rb1a, AC-rb1b, AC-rb2a, AC-rb2b, AC-rb3a, AC-rb3b, AC-rb4a y AC-rb4b, para capturar BAG3 soluble y anticuerpos unidos a enzimas para la detección capaces de reconocer inmunoglobulinas humanas.

Preferiblemente, dicha muestra biológica es una muestra de suero, plasma, orina o saliva.

En una forma de realización preferida de la presente invención, dicha muestra de suero, plasma, orina o saliva es de un mamífero, preferiblemente un ser humano.

También se divulga un kit de inmunohistoquímica (IHC) para la detección de proteína BAG3 en una muestra biológica, en donde dicha muestra biológica es preferiblemente una muestra de tejido. Las muestras de tejido pueden ser biopsias, tejidos congelados, tejidos embebidos en parafina.

El kit de IHC divulgado comprende anticuerpos específicos de BAG3 y reactivos que incluyen sondas necesarias para la tinción.

Dichos anticuerpos específicos de BAG3 pueden ser anticuerpos monoclonales de ratón AC-1, AC-2 y AC-3 y/o anticuerpos unidos a enzimas para la detección capaces de reconocer inmunoglobulinas de ratón.

En particular, el kit de IHC ventajosamente permite revelar proteína BAG3 en el 100% de muestras de tejido de carcinoma pancreático de pacientes que experimentan extirpación de páncreas y se expresa en la mayoría de las muestras de carcinoma de vejiga. Además, la proteína BAG3 se puede revelar con el kit para detección de BAG3 por IHC también en tejido de páncreas normal en islotes de Langerhans mientras que otros tejidos normales dan negativo (tal como, por ejemplo, vejiga urinaria normal). La positividad de BAG3 también se puede observar en fibroblastos sinoviales e infiltrados inflamatorios en muestras de tejido de artritis reumatoide.

La supervivencia a largo plazo de pacientes afectados por ACDP es muy mala: solo aproximadamente el 4% de los pacientes vivirá 5 años después del diagnóstico. En efecto, la extirpación quirúrgica es actualmente la única posibilidad de cura, pero solo aproximadamente el 20% de los pacientes están diagnosticados con enfermedad extirpable; además, en una gran proporción (aproximadamente el 80%) de tal subconjunto de pacientes, el proceso de metastatización ya se produce en el diagnóstico, y en efecto metástasis distantes aparecen después de la extirpación quirúrgica. Por tanto, se necesita entender mejor los estadios tempranos en el desarrollo del cáncer pancreático e identificar moléculas que puedan permitir detectarlos. Además, son muy requeridos marcadores que pueden permitir un mejor pronóstico y ayuda en la elección de terapias.

Ventajosamente, el kit de IHC para BAG3 permite la identificación del pronóstico de pacientes de ACDP. Se ha visto que intensidad de la expresión de BAG3 identificada por IHC, se correlaciona con la supervivencia de los pacientes. Por tanto, se puede usar tanto para pronóstico como para hacer una elección de terapia.

También se divulga un kit para la detección de la expresión génica de BAG3 en una muestra biológica que comprende un conjunto de cebadores de amplificación. Preferiblemente, dichos cebadores de amplificación son adecuados para la detección por RT-PCR en tiempo real cuantitativa.

Los cebadores de bag3 cebadores específicos según los conjuntos de cebadores 1 a 5, que se describen a continuación y se identifican por SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 10, permiten la detección y cuantificación de la expresión de BAG3 por PCR en tiempo real cuantitativa.

Conjunto de cebadores 1

directo: SEQ ID NO. 1: AACGGTGACCGCGACCCTTT;

inverso: SEQ ID NO. 2: CCTTCCCTAGCAGGCGGCAG

Conjunto de cebadores 2

directo: SEQ ID NO. 3: CCGGCTGGCCCTTCTTCGTG;

inverso: SEQ ID NO. 4: CAGCCTAGAGCCCTCCCGGG

Conjunto de cebadores 3

directo: SEQ ID NO. 5: GTCACCTCTGCGGGGCATGC;

inverso: SEQ ID NO. 6: GGTGACTGCCCAGGCTGCTC

Conjunto de cebadores 4

directo: SEQ ID NO. 7: CCAGCCTCCCACGGACCTGA;

inverso: SEQ ID NO. 8: CTGGTGACTGCCCAGGCTGC

Conjunto de cebadores 5

directo: SEQ ID NO. 9: CAGGAGCAGCACGCCACTCC;

inverso: SEQ ID NO. 10: TGGTCCAACTGGGCCTGGCT.

El kit de RT-PCR para la detección del ARNm de bag3 en una muestra biológica permite correlacionar los niveles de expresión del gen bag3 con la supervivencia de los pacientes y se puede usar para pronóstico y para la elección de terapia. Preferiblemente dicha muestra biológica es una muestra de tejido.

También se divulgan anticuerpos monoclonales anti-BAG3, sus fragmentos, y péptidos correspondientes a secuencias de aminoácidos específicas de la proteína BAG3 que son capaces de bloquear la activación de macrófagos y por tanto se pueden usar para terapia de enfermedades inflamatorias, oncológicas u otras que implican la activación de macrófagos. Véase en particular la figura 3 y la tabla I.

Esta divulgación se refiere al uso de anticuerpos monoclonales de ratón específicos de BAG3 AC-1, AC-2 y AC-3 o los mismos modificados como F(ab), F(ab')2, F(ab) o humanizados; o péptidos que comprenden secuencias como sigue:

PEP 1 : DRDPLPPGWEIKIDPQ (SEQ ID NO. 11)

PEP2: SSPKSVATEERAAPS (SEQ ID NO. 12)

P E P 3 : DKGKKNAGNAEDPHT (SEQ ID NO. 13)

P E P 4 : NPSSMTDTPGNPAAP (SEQ ID NO. 14)

como moléculas capaces de unirse y/o bloquear efectos de BAG3 soluble.

Ejemplos

Ejemplo 1

Estrés inducido por privación de suero en cardiomiocitos primarios humanos cultivados y la línea celular de cardiomiocitos de rata H9c2

Se sabe que los cardiomiocitos liberan factores protectores al montar una respuesta contra agentes estresantes. Puesto que las proteínas inducidas por estrés, tal como Hsp70, Hsp27, Hsp90 y otras, aunque ejercen una actividad intracelular, también se pueden secretar en respuesta a estrés, la liberación de BAG3 por cardiomiocitos se analizó en condiciones estresantes. Para este fin, se analizó el efecto del estrés inducido por la privación suero en cardiomiocitos primarios humanos cultivados o la línea celular de cardiomiocitos de rata H9c2. Como se muestra en la figura 1, se pudo detectar proteína BAG3 en los sobrenadantes de cardiomiocitos expuestos a privación de suero durante 16 h (Figura 1A). Puesto que en ese punto de tiempo la supervivencia celular no estaba afectada por la privación de suero (resultados no mostrados), se descartó la hipótesis de que la liberación de BAG3 fuera debida a necrosis celular. Por tanto, se verificó si BAG3 estaba presente en vesículas exocíticas. En efecto, al aislar vesículas extracelulares mediante un procedimiento de centrifugación diferencial (16), se encontró que contenían proteína BAG3 (Figura 1B).

Para verificar además la existencia de una forma soluble de BAG3, se investigó su presencia en dos sueros sanguíneos de pacientes afectados por insuficiencia cardiaca crónica (ICC). Mediante análisis de inmunotransferencia, se pudo identificar una banda reconocida por un anticuerpo anti-BAG3. Se cortó la banda y se sometió a espectrometría de masas, confirmando su identidad (Figura 1C). Esta evidencia confirmó que la proteína se podía detectar en una forma extracelular. No se pudo detectar la proteína en sueros de donantes sanos (Figura 1C). Los péptidos reconocidos y coincidentes por espectrometría de masas en la secuencia de la proteína BAG3 entera se indican en negrita:

MSAATHSPMM QVASGNGDRD PLPPGWEIKI DPQTGWPFFV DHNSRTTTWN DPRVPSEGPK ETPSSANGPS REGSRLPPAR EGHPVYPQLR PGYIPIPVLH EGAENRQVHP FHVYPQPGMQ RFRTEAAAAA PQRSQSPLRG MPETTQPDKQ CGQVAAAAAA QPPASHGPER SQSPAASDCS SSSSSASLPS SGRSSLGSHQ LPR G YISIPV 1HEQNVTRPA AQPSFHQAQK THYPAQQGEY QTHQPVYHK7

QGDDWEPRPL RAASPFRSSV QGASSREGSP ARSSTPLHSP SPIRVHTW D RPQQPMTHRE TAPVSQPENK PESKPGPVGP ELPPG H IPIQ VIRKEVDSKP VSQKPPPPSE KVEVKVPPAP VPCPPPSPGP SAVPSSPKSV ATEERAAPST APAEATPPKP GEAEAPPKHP GVLKVEAILE KVQGLEQAVD NFEGKKTDKK YLMIEEYLTK ELLALDSVDP EGRADVRQAR RDGVRKVQTI LEKLEQKAID VPGQVQVYEL QPSNLEADQP LQAIMEMGAV AADKGKKNAG NAEDPHTETQ QPEATAAATS NPSSMTDTPG NPAAP(SEQ ID NO: 15 ) .

La proteína BAG3 humana tiene la secuencia de aminoácidos según SEQ IS NO: 15.

Ejemplo 2.

Anticuerpos anti-BAG3 en sueros de pacientes de ICC

Se encontró que los sueros de pacientes de ICC reconocían la proteína BAG3 en inmunotransferencia, usando un anti-IgG humana como anticuerpo secundario (se muestran resultados representativos de experimentos con sueros de tres pacientes diferentes en la figura 2A). Este resultado indicaba la presencia de anticuerpos anti-BAG3 en los sueros de pacientes de ICC. Para confirmar este hallazgo, se analizaron los sueros de 50 pacientes de ICC (con fracción de eyección < 60%) comparados con los sueros de 50 donantes sanos, para la presencia de anticuerpos anti-BAG3 en un ensayo ELISA específico. Como se muestra en la figura 2B, se detectaron valores significativamente más altos de anticuerpos anti-BAG3 en los sueros de pacientes comparados con los de controles. El análisis ROC del ensayo ELISA produjo, usando como límite 0,083 U.A., el 74% de sensibilidad y el 68% de especificidad (Figura 2C).

Ejemplo 3.

Unión de BAG3 a macrófagos

Se abordó la significación funcional de la liberación de BAG3 por cardiomiocitos. Se excluyó que la proteína pudiera estar implicada en una ruta autocrina, porque aparentemente no se unía a la superficie de cardiomiocitos, como se valoró en experimentos usando BAG3 conjugada a isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Figura 3A). Por tanto, se investigó si BAG3 podría interaccionar con células sanguíneas. En efecto, se encontró que FITC-BAG3 se unía a macrófagos de la línea celular J774 (Figura 3B). La unión de BAG3 a macrófagos estaba específicamente alterada por péptidos de BAG3 competidores o por fragmentos F(ab')2 secuestradores de BAG3 de anticuerpos monoclonales anti-BAG3 (Tabla I). En particular, las células J774 se incubaron con proteína FITC-BAG3 14 nM y con 625 nM de péptidos de BAG3 (péptido 1, péptido 2, péptido 3, péptido 4 o péptido mezclado) o con 420 nM de fragmentos F(ab')2 de anticuerpos monoclonales y policlonales anti-BAG3 (monoclonales de ratón AC1, AC2 y policlonal de conejo TOS2). Los fragmentos F(ab')2 de IgG de ratón o los fragmentos F(ab')2 de IgG de conejo se usaron como control negativo.

Tabla I

Para explorar las consecuencias funcionales de la unión de BAG3 a macrófagos, se ensayó el efecto de BAG3 recombinante sobre la expresión de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y ciclooxigenasa (Cox-2) en las células. Como se muestra en la figura 3C panel a, los niveles de esas enzimas estaban aumentados en macrófagos tratados con BAG3. Además, BAG3 indujo la liberación de nitrito e interleuquina (IL)-6 (Figura 3C paneles b y c) lo que confirma que los macrófagos se activaban en respuesta a su unión a la proteína.

En sueros de pacientes de ICC se pudieron detectar cantidades significativas de anticuerpos anti-BAG3 (Figura 2A, B). La producción de autoanticuerpos está probablemente relacionada con la liberación extracelular de una proteína normalmente intracelular, como sucede, por ejemplo, en pacientes de isquemia crónica que producen autoanticuerpos anti-troponina. Los valores de ELISA de anticuerpos anti-BAG3 en los sueros de pacientes de ICC son significativamente mayores que los detectados en sueros de controles sanos.

Por tanto, la producción de anticuerpos anti-BAG3, detectada por ELISA, parece un biomarcador de insuficiencia cardiaca crónica. Su utilidad para estratificación de riesgo y seguimiento de terapia es digna de investigación.

La liberación de BAG3 por cardiomiocitos estresados y la posterior activación de macrófagos, que lleva a la liberación local de NO, podría constituir un circuito protector en la isquemia cardiaca. En efecto, vasodilatación, neoangiogénesis y remodelación podrían ser los objetivos. La liberación de BAG3 y sus efectos transitorios o crónicos merecen investigación y podrían contribuir a nuestro entendimiento de la isquemia y otros estados de estrés del corazón.

Además, los anticuerpos monoclonales de ratón específicos de BAG3 AC-1, AC-2 y AC-3 y/o otros o los mismos modificados como F(ab), F(ab')2, F(ab) o humanizados; o péptidos que comprenden las secuencias PEP 1 a 4 y/o otros son moléculas capaces de unirse y/o bloquear los efectos de BAG3 soluble que se van a usar para terapia de enfermedades inflamatorias, oncológicas u otras que implican la activación de macrófagos.

Ejemplo 4.

Expresión de BAG3 en ACDP por inmunohistoquímica

Hemos desarrollado un kit de inmunohistoquímica (IHC), que incluye nuestros anticuerpos monoclonales anti-BAG3 y capaz de detectar proteína BAG3 por inmunohistoquímica (IHC). Este kit reveló expresión de BAG3 en todas las 346 (100%) biopsias de ACDP que se analizaron. La tinción de BAG3 reveló una positividad moderada de islotes de Langerhans, mientras que los conductos pancreáticos y las células acinares pancreáticas normales no tenían expresión de BAG3. Esto era cierto tanto en páncreas normal como en tejido pancreático no neoplásico adyacente a la masa tumoral. Se observó tinción de BAG3 predominantemente en el citoplasma de células tumorales. La intensidad de la tinción de BAG3 era variable como lo era el número de células cancerosas positivas. Además, los islotes de Langerhans eran positivos y constituían un buen control interno de IHC (Figura 4A). Por tanto, nuestro kit permite la detección de proteína BAG3 en ACDP por IHC. Además, permite detectar proteína BAG3 por IHC también en otros tejidos tumorales o normales.

También se investigó la expresión de BAG3 en correlación con la supervivencia de los pacientes y en la respuesta a terapia. Se analizó una cohorte de 346 muestras de ACDP del mismo número de pacientes (Tabla II) que describen datos de todas las muestras tumorales analizadas por inmunohistoquímica y datos del subgrupo de pacientes R0 analizados con datos de supervivencia. Se asignó una puntuación basada en la proporción de células cancerosas positivas en la muestra contando el número de células positivas sobre el total de células cancerosas en 10 campos no solapantes usando 400x aumentos.

Tabla II

La mediana de porcentaje de células positivas para BAG3, calculada como se describe, fue el 40% y este valor se usó como un límite para separar muestras positivas bajas y altas. Basado en esta clasificación 190 muestras de pacientes (55%) se clasificaron como positivas bajas (<40% de células positivas), y 156 (45%) se clasificaron como positivas altas (>40% de células positivas) (Figura 4, panel B). El análisis de supervivencia se realizó en una cohorte de 66 pacientes de los que todas las lesiones examinadas fueron con márgenes de extirpación libres de células tumorales (R0) y solo el 3,7% mostró la presencia de metástasis a órganos distantes (Tabla II). Los datos obtenidos mostraron que pacientes con alta expresión de BAG3 tenían una supervivencia significativamente más corta (mediana de supervivencia = 12,0 meses) que esos con baja expresión de BAG3 (mediana de supervivencia = 23,0 meses), (p = 0,0013) (Figura 4, panel C). Basado en análisis proporcional Cox la alta expresión de BAG3 se asoció con un riesgo de muerte más de dos veces mayor (Tabla III).

Tabla III

Ejemplo 5.

Proteína BAG3 en respuesta a terapia

La quimioterapia de primera línea para el tratamiento de cáncer pancreático es gemcitabina. Con el fin de investigar el papel de la proteína BAG3 en la respuesta a terapia, se analizó el efecto de la disminución de BAG3 en células de ACDP humano. Se transfectaron las células con un ARNip específico que se dirige al ARNm de bag3 o con un ARNip no específico (ND), y se trataron las células con gemcitabina durante los tiempos indicados. El silenciamiento de BAG3 aumentó la apoptosis celular en respuesta al fármaco (Figura 8). Estos resultados demuestran la sobreexpresión de la proteína y el ARNm de BAG3 en adenocarcinoma pancreático y la asociación de altos niveles de expresión con un mayor riesgo de muerte, asignando a BAG3 un papel de marcador útil para el pronóstico y la elección de terapia. Además, muestran que la disminución de BAG3 aumenta la apoptosis en células de ACDp . Debido a su amplia expresión en todas las lesiones ensayadas y a su implicación en sostener la supervivencia de células cancerosas pancreáticas, BAG3 representa una diana valiosa para terapias innovadoras en ACDP.

Ejemplo 6.

Proteína BAG3 en sueros de pacientes de cáncer pancreático

Debido a su amplia expresión en pacientes de cáncer pancreático, se investigó si BAG3 estaba presente en sueros de pacientes de cáncer pancreático. Se encontró que en efecto BAG3 era detectable. También eran detectables anticuerpos anti-BAG3, aunque en prevalencia en complejo con BAG3. Por tanto, desarrollamos un ensayo ELISA para detectar complejos BAG3/anticuerpos. Se analizaron sueros de 51 donantes sanos y 55 pacientes afectados por ACDP (Tabla IV).

Tabla IV

Como se muestra en la figura 9A, los inmunocomplejos (medidos en unidades arbitrarias) eran significativamente mayores en sueros de pacientes que en esos de donantes sanos. Además, el análisis ROC del ensayo ELISA produjo, usando como límite 0,183 U.A., el 65% de sensibilidad y el 78% de especificidad (Figura 9B).

Ejemplo 7.

Expresión de BAG3 por PCR en tiempo real cuantitativa

Los datos inmunohistoquímicos sobre la expresión de BAG3 también se confirmaron midiendo los niveles del ARNm de bag3 en 25 muestras de tejido de ACDP (Tabla V).

Tabla V

En particular, hubo 16 supervivientes de 25 pacientes, mientras que 9 pacientes murieron de la evolución del cáncer pancreático, en el momento del análisis. La mediana de expresión del ARNm de bag3 en tumores analizados se ajustó a 0,0068 (Q1 = 0,004; Q3 = 0,010) (Figura 7, panel A). Todas las características demográficas y clínicas consideradas de los pacientes de ACDP no estaban relacionadas con los niveles del ARNm de bag3. Por tanto, se evaluó la correlación con supervivencia y la mediana de los niveles de expresión del ARNm de bag3 en muestras de ACDP se usó como un límite para separar pacientes con expresión de bag3 baja de esos con expresión alta. Por tanto, trece muestras (52%) se clasificaron como positivas para bag3 altas y 12 muestras (48%) como positivas para bag3 bajas. Los pacientes con alta expresión de bag3 tuvieron supervivencia más corta (mediana de supervivencia = 19,0 meses) que esos con baja expresión de bag3 (mediana de supervivencia = 32,0 meses), valor p = 0,0198 (Fig. 7, panel B). Basado en análisis proporcional Cox la alta expresión de bag3 se asoció con riesgo de muerte de más de seis veces mayor (univariable: HR = 6,094; IC del 95% = 1,105-33,597, p = 0,038).

Cebadores de bag3 que detectan la expresión de BAG3 por RT-PCR en tiempo real cuantitativa. Desarrollamos un kit de RT-PCR que contiene cebadores específicos para la detección y cuantificación del ARNm bag3.

Ejemplo 8

Se evaluaron los niveles de anticuerpos contra BAG3 antes del diagnóstico de ACDP en un estudio de casos y controles ajustado en el biobanco prospectivo derivado de UKCTOCS (Menon et al., BMJ, 337:a2079, 2008). La cohorte del ensayo de 202.000 mujeres posmenopáusicas donaron un suero único en la inclusión y 50.000 mujeres siguieron donando muestras de suero anualmente.

Las mujeres diagnosticadas con cáncer pancreático tras la aleatorización fueron identificadas por datos de registro de cáncer y cuestionarios de seguimiento postales.

Para estas mujeres diagnosticadas para ACDP se obtuvieron muestras de suero en diferentes puntos de tiempo antes del diagnóstico de ACDP. Se obtuvieron sueros control de sujetos sanos y se midieron los títulos de anticuerpos contra BAG3 en aproximadamente cinco sujetos control comparado con cada caso de ACDP. Además, los sueros control vinieron de sujetos con edad coincidente con el respectivo caso de ACDP. Estos sueros control coincidentes se usaron para cada punto de tiempo.

La detección de anticuerpos específicos de BAG3 en sueros de pacientes de 49 sujetos femeninos a 0-1 años prediagnóstico para adenocarcinoma pancreático se compararon con sueros de 235 sujetos femeninos control para la presencia de anticuerpos específicos de BAG3 en un ensayo ELISA específico.

Se detectaron concentraciones de anticuerpos contra BAG3 en un ensayo ELISA específico.

Como se muestra en la figura 10, los anticuerpos contra BAG3 eran significativamente más altos en casos al menos 3-4 años prediagnóstico con respecto a sujetos control.

Otros puntos de tiempo incluían: 53 sujetos a 1-2 años prediagnóstico para ACDP comparado con 251 controles; 44 sujetos a 2-3 años prediagnóstico para ACDP comparados con 212 controles; 42 sujetos a 3-4 años prediagnóstico para ACDP comparados con 187 controles.

Como se muestra en la figura 10, los anticuerpos contra BAG3 eran significativamente más altos en casos al menos 3-4 años prediagnóstico con respecto a sujetos controles.

Métodos

Cultivos celulares

Se compraron HCMa (miocitos cardiacos humanos adultos) de Sciencell Research Laboratories (San Diego, CA) y se hicieron crecer en medio de miocitos cardiacos (CMM, SBF al 5%, suplemento de crecimiento de miocitos cardiacos al 1%, solución de penicilina/estreptomicina al 1%) (Sciencell Research Laboratories, San Diego, CA). Todos los experimentos se realizaron en cultivos celulares de pase bajo. Se compraron cardiomioblastos de rata embrionarios (línea H9c2) de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCc , Manassas, VA, EE UU) y se hicieron crecer en Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal (SBF) al 10%, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 pg/ml. La línea celular de monocitos macrófagos murinos, J774A.1 (ATCC, Manassas, VA, EE UU) se hizo crecer en DMEM suplementado con suero bovino fetal (SBF) al 10%, HEPES 25 mM, glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 pg/ml.

Las líneas celulares de cáncer pancreático (MIA PaCa-2, AsPC-1, PSN1, Capan-1 y PANC-1) se recibieron del banco de células de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA). Las células MIA PaCa-2 se cultivaron en Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con SBF al 10% y suero de caballo al 2,5%. Las células AsPC-1 y PSN1 se hicieron crecer en medio RPMI-1640 suplementado con SBF al 10%. Se cultivaron Capan-1 en RPMI-1640 que contenía SBF al 20% mientras que las PANC-1 se cultivaron en DMEM suplementado con SBF al 10%. Todos los medios para las líneas celulares anteriores se compraron de BioWhittaker-Lonza (Bérgamo, Italia) MediaTech (Manassas, VA) y se suplementaron con 100 unidades de penicilina/ml y 2 pg de estreptomicina/ml (Sigma-Aldrich, San Luis, MO). Las células se incubaron a 37°C en un medio con CO²al 5%. Las células se trataron con gemcitabina (2',2'-difluorodesoxicitidina; GEM, Gemzar®) proporcionado por Eli Lilly (Sesto Fiorentino, Italia) a las concentraciones indicadas.

Disociación de anticuerpos contra BAG3 en sueros humanos

Los sueros se diluyeron 1:40 con tampón de disociación (PBS con BSA al 1,5% y glicina-acetato 0,2 M pH 2,5) a un volumen final de 500 pl y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. Los sueros se pipetearon después en el depósito de muestra de dispositivo de filtro de centrifugación Microcon, YM-100 (límite 100.000 MW; Millipore, Billerica, MA, EE UU) y se centrifugó a 14.100 rpm durante 20 min a temperatura ambiente. El depósito de muestra se separó después del flujo no retenido, se colocó invertido en un segundo tubo y se centrifugó a 5.000 rpm durante 3 min a temperatura ambiente. La solución recogida que contenía el anticuerpo disociado se ajustó a pH 7,0 con tampón Tris 1 M, pH 9,0. El volumen del retenido se reconstituyó al volumen inicial (500 pl) con tampón de dilución (PBS con BSA al 1,5% y Tween-20 al 0,1%). Para la detección de la proteína BAG3 por inmunotransferencia, los anticuerpos disociados se diluyeron 1:200 en TBST que contenía seroalbúmina bovina al 5% durante la noche a 4°C.

Análisis de inmunotransferencia

Las células se recogieron y lisaron en un tampón que contenía HEPES 20 mM (pH 7,5), NaCI 150 mM, Tritón al 0,1% (tampón TNN) suplementado con una mezcla de inhibidores de proteasas (fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, pepstatina A 1 mg/ml, aprotinina 2 mg/ml) mediante 3 ciclos de congelación y descongelación. Las proteínas solubles se recogieron después de una centrifugación a 10.000 g durante 15 min y su cantidad se determinó por el ensayo de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA). Se corrieron 25 |jg de proteína total y muestras de suero (1:2 en PBS-T al 0,05%) en geles de SDS-PAGE al 8% o 10% y se transfirieron electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas de nitrocelulosa se bloquearon con leche en polvo desnatada al 10% en tampón TBST (Tris-HCl 20 mM pH 7,4, NaCl 500 mM, Tween 20 al 0,1%) y se incubaron con los anticuerpos primarios en TBST que contenía seroalbúmina bovina al 5% o leche en polvo desnatada al 5%, durante la noche a 4°C. La inmunorreactividad se detectó por incubación secuencial con anticuerpos secundarios conjugados a peroxidasa de rábano comprados de Pierce (Rockford, IL) y reactivos de detección e Cl comprados de Amersham Life Sciences Inc. (Arlington Heights, IL, EE UU).

Se realizó la densitometría de barrido de las bandas con un Image Scan (SnapScan 1212; Agfa-Gevaeret NV). El área bajo la curva en relación a cada banda se determinó usando el software Gimp2. Se restó el fondo de los valores calculados.

Espectrometría de masas

Las bandas de proteínas se cortaron y los trozos de gel se lavaron posteriormente con agua MilliQ y acetonitrilo y las proteínas se digirieron in situ como se describe en el protocolo de Shevchenko. Brevemente, los trozos de gel se redujeron en 1,4-ditiotreitol (10 mM) y se alquilaron con yodoacetamida (50 mM), después se lavaron y rehidrataron en solución de tripsina (12 ng/jl) en hielo durante 1 h. Después de la adición de 30 j l de bicarbonato de amonio (10 mM, pH 7,5), las muestras se digirieron durante la noche a 25°C. Se inyectaron 5 j l de la mezcla de péptidos obtenida en un sistema nano Acquity LC (Waters Corp. Manchester, Reino Unido). Los péptidos se separaron en una columna BEH C-18 1,7 jm (Waters Corp. Manchester, Reino Unido) a una velocidad de flujo de 200 nl/min. El gradiente (solución A: ácido fórmico al 0,1%, solución B: ácido fórmico al 0,1%, ACN al 100%) empezó al 5% y terminó al 50% de B después de 55 min. Los datos de MS y MS/MS se adquirieron usando un espectrómetro de masas Q-TOF Premier (Waters Corp., Micromass, Manchester, Reino Unido). Péptido-iones cargados doble y triplemente fueron elegidos automáticamente por el software MassLynx y fragmentados. Los datos de MS se procesaron automáticamente y se generaron listas de picos para identificaciones de proteínas por búsquedas en bases de datos mediante el software ProteinLynx. Las búsquedas en bases de datos se llevaron a cabo con el servidor MASCOT usando la base de datos de proteínas SwissProt. Se hizo una búsqueda en la base de datos humana de SwissProt (405506 secuencias; 146166984 residuos) permitiendo 1 corte fallado, carbamidometilo (C) como modificación fija. La tolerancia de péptido se fijó a 60 ppm y la tolerancia de MS/MS a 0,8 Da.

Purificación de vesículas exocíticas por ultracentrifugación diferencial

Medio sin suero de H9c2 se clarificó de células y restos grandes por centrifugación en serie a 4°C (2000*g durante 15 min, 10.000*g durante 30 min). Después de cada una de las dos primeras centrifugaciones, los precipitados se desechan, y el sobrenadante se mantiene para la siguiente etapa. El sobrenadante final se ultracentrífuga después a 150.000*g durante 90 min a 4°C (con un rotor SW50.1, y una ultracentrífuga L-90K, Beckman Coulter) para precipitar exosomas. El precipitado se lava en PBS para eliminar proteínas contaminantes y se centrifuga una última vez a 150.000*g durante 90 min a 4°C. Después de lavar, el precipitado (exosomas) se resuspendió en 20 j l de PBS y se analizó con el anticuerpo policlonal anti-BAG3 TOS-2 en comparación con un lisado de células completas por inmunotransferencia. Se analizó Rab-4 como un marcador para vesículas exocíticas.

Análisis por FACS

Unión de rBAG3 - Se bloquearon células J774 A.1 con SFB al 2% NaN3 al 0,1% en PBS durante 15 min en hielo y se incubaron (2,5 * 105/100 j l) con diferente concentración de proteína FITC-rBAG3 (7, 14 y 70 nm) o FITC-BSA (70 nM) en PBS que contenía SFB al 2% NaN3 al 0,1% durante 30 min a 4°C en la oscuridad. Después de lavar con PBS, las células se resuspendieron en PBS SFB al 2% NaN3 al 0,1% y se analizaron con un citómetro de flujo FACScan (BD Biosciences).

Competición - Se incubaron células J774 A.1 (2,5x105/100 j l) con 625 nM de péptidos de BAG3 (péptido 1, péptido 2, péptido 3, péptido 4 o péptido mezclado) o con 420 nM de fragmentos F(ab')2 de anticuerpos monoclonales y policlonales anti-BAG3 (monoclonales de ratón AC1, AC2 y policlonal de conejo TOS2) o fragmentos F(ab')2 de IgG de ratón o fragmentos F(ab')2 de IgG de conejo en PBS que contenía SFB al 2% NaN3 al 0,1% durante 30 min en hielo. Después de la incubación las células se lavaron con PBS y después se incubaron con proteína FITC-rBAG3 (14 nM), en PBS que contenía SBF al 2% NaN³al 0,1% durante 30 min a 4°C en la oscuridad. Después de lavar con PBS, las células se resuspendieron en PBS SBF al 2% NaN3 al 0,1% y se analizaron por citómetro de flujo (BD Biosciences).

Detección de IL6 por ELISA

Se midió IL6 en sobrenadante de células J774 A.1 (5x104/ en microplacas de 96 pocilios) tratadas con LPS (10 ng/ml) o con rBAG3 (14 nM) o BSA (14 nM) durante 10 o 20 horas en ausencia o presencia de sulfato de polimixina B (5 |jg/ml). Después del tratamiento 50 j l de medio de cultivo celular se recogieron y analizaron en triplicado con un kit de IL6 de ratón (eBioscience).

Fluorescencia

Las células se cultivaron en cubreobjetos en placas de seis pocillos al 60-70% de confluencia y se añadieron cantidades iguales de proteína rBAG3-FITC y b Sa -FITC en medio de cultivo de HCMa y J774 A1 con NaN³al 0,1% durante 1 h. Los cubreobjetos se lavaron en PBS 1x y se fijaron en formaldehído al 3,7% en PBS 1x durante 30 min a temperatura ambiente, y después se incubaron durante 5 min con PBS 1x glicina 0,1 M. Después de la incubación con una dilución 1:100 de anticuerpo monoclonal anti-p-integrina a 4°C, los cubreobjetos se lavaron tres veces con PBS 1x. Después de incubación de una dilución 1:500 de anticuerpos conjugados a DyLight 594 anti-IgG de ratón de cabra (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EE UU) a temperatura ambiente durante 45 min, los cubreobjetos se lavaron de nuevo durante tres veces en PBS 1x. Una vez la incubación con Hoechst 33342 (Sigma Aldrich, 2 jg/m l) a temperatura ambiente durante 10 min, los cubreobjetos se lavaron de nuevo 3 veces en PBS y después en agua destilada. Los cubreobjetos se montaron después en un portaobjetos con intersticios que contenían glicerol al 47% (v/v). Las muestras se analizaron usando un microscopio de barrido láser confocal (microscopio confocal Zeiss LSM, Alemania). Las imágenes se adquirieron en modo de barrido secuencial usando los mismos parámetros de adquisición (intensidades de láser, fotomultiplicadores de ganancia, apertura del agujero, objetivo 63X, zoom 2) cuando se compara material experimental y control. Para la producción de las figuras, el brillo y el contraste de las imágenes se ajustaron teniendo cuidado de dejar un fondo de fluorescencia celular claro para apreciación visual de las características de menor intensidad de fluorescencia y para ayudar a la comparación entre los diferentes grupos experimentales. Las figuras finales se ensamblaron usando Adobe Photoshop 7 y Adobe Illustrator 10. Se usaron Software confocal Leica Q9 e ImageJ para el análisis de los datos.

Medida de los títulos de anticuerpos por ELISA

Se recubrieron placas de ELISA de 96 pocillos Maxisorp de NUNC con proteína BAG3 recombinante 1 jg/m l (50 jl/pocillo) en PBS, pH 7 y se incubaron durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron 2 veces con tampón de lavado (PBS Tween-20 al 0,05%), y después se bloquearon (150 jl/pocillo) durante 1 hora a temperatura ambiente con gelatina de pescado al 0,5% en PBS. Después de bloquear, las placas se lavaron 2 veces con tampón de lavado y los sueros se diluyeron 1:70 con gelatina de pescado al 0,5% en tampón de lavado y después se aplicaron (50 jl/pocillo) en triplicado y se incubaron a temperatura ambiente durante dos horas. Las placas se lavaron después 6 veces con tampón de lavado. Se diluyó anticuerpo anti-IgG humana (H+L) (Sigma Aldrich) 1:20.000 con gelatina de pescado al 0,5% en tampón de lavado, se añadió a 50 jl/pocillo y se incubó a 4°C durante 30 min. Después de la incubación, las placas se lavaron 6 veces, se revelaron con TMB (50 jl/pocillo) (eBioscience), la reacción se paró con ácido sulfúrico 4.5 M (25 jl/pocillo) y las placas se analizaron espectrofotométricamente a 450 nm.

Ensayo de NO?-

El contenido en nitrito (NO²‘), un metabolito estable de NO liberado por las células en el sobrenadante del cultivo, se midió en células J774 A.1 (5x104/ en microplacas de 96 pocillos) tratadas con LPS (10 ng/ml) o con rBAG3 (7, 14 y 28 nM) o BSA (28 nM) durante 24 horas en ausencia o presencia de sulfato de polimixina B (Sigma-Aldrich, San Luis, MO, EE UU) 5 jg/m l. Las cantidades de NO²' se midieron por reacción de Griess. Brevemente, se mezclaron 100 j l de medio de cultivo celular con 100 j l de reactivo de Griess -volúmenes iguales de sulfanilamida al 1% (p:v) en ácido fosfórico al 5% (v:v) y naftiletilendiamina-HCl al 0,1% (p:v)- y se incubó a temperatura ambiente durante 10 min, y después se midió la absorbancia a 550 nm en un lector de microplacas Titertek (Dasit, Cornaredo, Milán, Italia). La cantidad de NO2-(como jM ) en las muestras se calculó a partir de una curva patrón de nitrito de sodio.

Medida de inmunocomplejos BAG3/anticuerpo por ELISA

Se recubrieron placas de ELISA de 96 pocillos Maxisorp de NUNC con anticuerpo monoclonal anti-BAG3 AC-1, AC-2 o AC-3 en PBS, pH 7 y se incubaron durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron 2 veces con tampón de lavado (PBS Tween-20 al 0,05%), y después se bloquearon (150 jl/pocillo) durante 1 hora a temperatura ambiente con gelatina de pescado al 0,5% en PBS. Después de bloquear, las placas se lavaron 2 veces con tampón de lavado y los sueros se diluyeron 1:70 con gelatina de pescado al 0,5% en tampón de lavado y después se aplicaron (50 jl/pocillo) en triplicado y se incubaron a temperatura ambiente durante dos horas. Las placas se lavaron después 6 veces con tampón de lavado. Se diluyó anticuerpo anti-IgG humana (H+L) (Sigma Aldrich) 1:20.000 con gelatina de pescado al 0,5% en tampón de lavado, se añadió a 50 jl/pocillo y se incubó a 4°C durante 30 min. Después de la incubación, las placas se lavaron 6 veces, se revelaron con TMB (50 jl/pocillo) (eBioscience), la reacción se paró con ácido sulfúrico 4.5 M (25 jl/pocillo) y las placas se analizaron espectrofotométricamente a 450 nm.

Inmunohistoquímica

El protocolo de inmunohistoquímica incluía: desparafinación en xileno, rehidratación mediante concentraciones descendientes de alcohol hasta agua pura, recuperación de antígeno no enzimática en tampón citrato, pH 6,0, durante 30 minutos a 95°C, y extinción de peroxidasa endógena con H2O2 en metanol durante 20 minutos. Después de enjuagar con PBS, las muestras se bloquearon con suero normal de caballo al 5% en PBS/BSA al 0,1%. Para detectar bAG3, las muestras se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpo monoclonal contra BAG3 AC-1, AC-2 o AC-3 a la concentración de 3 microg/ml. Después de lavar exhaustivamente con PBS, las secciones se incubaron con un anti-IgG de ratón secundario biotinilado durante 20 minutos, después se enjuagaron, se incubaron con complejos avidina-biotina peroxidasa (comprado de Novocastra-Leica Microsystems, Milán, IT) y se revelaron con diaminobencidina (Sigma-Aldrich, San Luis, MO). Por último, las secciones se contratiñeron con hematoxilina, se deshidrataron en alcohol, se clarificaron en xileno, y se montaron con Permount (Fisher Scientific, Milán, IT).

RT-PCR en tiempo real cuantitativa

Se tomaron muestras de tejidos de cáncer pancreático extirpado, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido, y se almacenaron a -80°C hasta la extracción de ARN. Se aisló el ARN total de tejidos congelados y de líneas celulares de cáncer pancreático por medio de extracción con fenol (Reactivo TRIzol, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EE UU). En muestras de tejido la celularidad cancerosa se enriqueció por seccionamiento y disección con criostato de las áreas más celulares. La concentración y pureza del ARN (A260:A280 > 2,0; A260/A230 > 1,8) se validaron por espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Fisher, Waltham, MA, EE UU). 1,0 |jg de ARN total se sometió a transcripción inversa usando el kit de transcripción inversa a ADNc High-Capacity según las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, Applera, Foster City, CA, EE UU). Se usó ensayo de PCR en tiempo real cuantitativa para evaluar la expresión diferencial de BAG3 en muestras de tejido tumoral. Los cebadores para el gen bag3 humano fueron sintetizados por Primm srl (Milán, Italia) (cebador directo: (SEQ ID NO:16) CCT GTT AGC TGT GGT TG; cebador inverso: (Se Q ID NO:17) a A c ATA Ca G ATA TTC CTA t Gg C). Todas las qPCR se realizaron en un volumen final de 25 jl, en tres replicados por muestra, usando el kit QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN, Hamburgo, Alemania) y se corrieron en un sistema de detección de secuencia ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems, Applera, Foster City, CA, EE UU) según las siguientes condiciones; 95°C durante 5 min, 40 ciclos a 95°C durante 10 s y 60°C durante 30 s. Los datos se adquirieron como valor de ciclo umbral (Ct) usando el software S.D.S v 2.1. En cada muestra, se obtuvieron los niveles de expresión relativa del ARNm de bag3 usando el método comparativo, después de normalizar para la expresión de GAPDH endógeno.

De la descripción anterior y los ejemplos anteriormente indicados, la ventaja alcanzada por los marcadores biológicos descritos y obtenidos según la presente invención es aparente.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para el diagnóstico de un estado patológico caracterizado por detectar la presencia de un anticuerpo anti-BAG3 o un anticuerpo anti-BAG3 unido a BAG3 soluble para formar un inmunocomplejo en una muestra biológica, que comprende la etapa de:

a. determinar la presencia de un anticuerpo anti-BAG3 o un anticuerpo anti-BAG3 unido a BAG3 soluble para formar un inmunocomplejo en la muestra biológica que consiste suero, plasma, orina o saliva, obtenida de un sujeto;

2. Método según la reivindicación 1, en donde dicha etapa de determinación a. se realiza mediante un ensayo ELISA.

3. Método según las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho suero, plasma, orina o saliva es de un mamífero, preferiblemente un ser humano.

4. Kit de ELISA que comprende una proteína BAG3 recombinante y anticuerpos capaces de reconocer inmunoglobulinas humanas, para la detección de anticuerpos anti-BAG3 o anticuerpos anti-BAG3 unidos a BAG3 soluble para formar inmunocomplejos en una muestra biológica, para uso en el diagnóstico de angina de pecho, angina preinfarto, infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca, enfermedad coronaria aguda, isquemia, insuficiencia cardiaca aguda, insuficiencia cardiaca crónica o enfermedad cardiaca yatrógena y cáncer pancreático.

5. Kit de ELISA para uso según la reivindicación 4, en donde dicha muestra biológica es una muestra de suero, plasma, orina o saliva.

6. Kit de ELISA para uso según la reivindicación 5, en donde dicha muestra de suero, plasma, orina o saliva es de un mamífero, preferiblemente un ser humano.