ES2788980T3 - Monocinas y métodos de uso - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una monocina, en donde la molécula de ácido nucleico comprende un primer polinucleótido que codifica las proteínas estructurales de una monocina funcional excepto la proteína de unión al receptor (RBP) natural correspondiente, en donde las proteínas estructurales codificadas por el primer polinucleótido son al menos un 80 % idénticas a las SEC ID NO: 7-16, en donde la molécula de ácido nucleico comprende además una segunda secuencia polinucleotídica heteróloga que codifica una RBP heteróloga, en donde la RBP comprende una región de unión a la placa de soporte (BPAR) y un dominio de unión al receptor (RBD), y en donde la monocina tiene la especificidad bactericida contra al menos una cepa de Listeria monocytogenes, u otras especies de Listeria, u otro género de bacterias, determinada por la RBP heteróloga y diferente de la determinada por la RBP natural.

Description

DESCRIPCIÓN

Monocinas y métodos de uso

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

Esta solicitud se refiere, en general, a la identificación, aislamiento, modificación y expresión de un grupo de genes suficiente para producir una bacteriocina y, más específicamente, a una bacteriocina similar a una cola de fago (PTLB) que destruye específicamente especies de Listeria y a métodos para alterar su especificidad bactericida, a su producción y al uso de la misma.

Antecedentes

Listeria es un género de bacterias que incluye al menos quince especies. Las especies de Listeria son bacilos grampositivos que son anaerobios facultativos (es decir, capaces de sobrevivir en presencia o ausencia de oxígeno). El principal patógeno humano del género Listeria es L. monocytogenes, que puede crecer y reproducirse dentro de las células hospedadoras infectadas y es uno de los patógenos más virulentos transmitidos por los alimentos. L. monocytogenes suele ser el agente causante de la enfermedad bacteriana relativamente rara conocida como listeriosis. La listeriosis es una enfermedad grave para los seres humanos que se produce al comer alimentos contaminados con la bacteria. La enfermedad afecta principalmente a mujeres embarazadas, recién nacidos, adultos con sistemas inmunológicos debilitados y ancianos. La forma manifiesta de la enfermedad tiene una tasa de mortalidad de aproximadamente un 20 por ciento. Las dos manifestaciones clínicas principales son septicemia y meningitis. Listeria ivanovii es un patógeno de mamíferos, específicamente rumiantes, y rara vez ha causado listeriosis en humanos.

Se han demostrado que varias cepas de especies de Listeria (monocytogenes, innocua, ivanovii), tras la inducción de la respuesta SOS, producen bacteriocinas de alto peso molecular (HMW) o bacteriocinas similares a una cola de fago (PTLB) denominadas "monocinas" (Zink et al., 1994). Estas partículas se liberan en el medio tras la lisis de las células productoras de monocina y, mediante un ensayo de placa puntual, se ha demostrado que tienen actividad bactericida en otras cepas de Listeria. La producción de partículas se confirmó por microscopía electrónica. Las monocinas producidas por diferentes cepas mostraron diferentes espectros bactericidas. No se ha identificado el locus genético que codifica una monocina. Hace muchos años se describió erróneamente la secuencia de una supuesta enzima lítica de monocina (Zink et al., 1995; véase a continuación).

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a la identificación, clonación y expresión de un locus genético dentro de un genoma de Listeria que como un grupo de genes codifica una bacteriocina similar a una cola del fago (PTLB), denominada monocina o listeriocina, indistintamente. La presente invención también se refiere a monocinas modificadas. Las monocinas contienen una proteína de unión al receptor (RBP) que dirige la unión de la monocina a la bacteria que destruye.

En consecuencia, la presente invención proporciona lo siguiente. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una monocina, en donde la molécula de ácido nucleico comprende un primer polinucleótido que codifica las proteínas estructurales de una monocina funcional excepto la proteína de unión al receptor (RBP) natural correspondiente, en donde las proteínas estructurales codificadas por el primer polinucleótido son al menos un 80 % idénticas a las SEC ID NO: 7-16, en donde la molécula de ácido nucleico comprende además una segunda secuencia polinucleotídica heteróloga que codifica una RBP heteróloga, en donde la RBP comprende una región de unión a la placa de soporte (BPAR) y un dominio de unión al receptor (RBD), y en donde la monocina tiene la especificidad bactericida contra al menos una cepa de Listeria monocytogenes, u otras especies de Listeria, u otro género de bacterias, determinada por la RBP heteróloga y diferente de la determinada por la RBP natural.

En otro aspecto, se proporcionan vectores de integración de células productoras que contienen la molécula de ácido nucleico desvelada que codifica una monocina, en donde la molécula de ácido nucleico está unida operativamente a un promotor inducible heterólogo. En algunas realizaciones, la célula productora es Bacillus subtilis. B. subtilis no produce naturalmente una monocina.

En otro aspecto más, se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican una monocina, en donde la molécula de ácido nucleico contiene un polinucleótido que codifica secuencias de aminoácidos que son al menos un 80 % idénticas a las SEQ ID NO: 5-17 y un promotor heterólogo inducible por una molécula pequeña, en donde la monocina tiene actividad bactericida y en donde el polinucleótido está unido operativamente al promotor heterólogo. En realizaciones particulares, el promotor está situado aproximadamente 11, 14, 17, 20 o 23 nucleótidos aguas arriba de la porción del polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 5. En un aspecto adicional, se proporcionan células productoras de monocina que contienen las moléculas de ácido nucleico desveladas que codifican una monocina. En algunas realizaciones, la célula productora de monocina contiene un primer polinucleótido extraño que codifica secuencias de aminoácidos que son al menos un 80 % idénticas a las SEQ ID NO: 7-16 y un segundo polinucleótido extraño que codifica una RBP, en donde el primer y segundo polinucleótidos codifican una monocina que tiene la especificidad bactericida determinada por la RBP. En otro aspecto más, se proporcionan métodos para producir una monocina, mediante la exposición de una célula productora de monocina que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica una monocina, en donde la molécula de ácido nucleico está unida operativamente a un promotor inducible heterólogo, a un agente inductor en una concentración eficaz para inducir la expresión de la monocina a través del promotor inducible, produciéndose así la monocina. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico que codifica una monocina se integra dentro del genoma de la célula productora para generar una célula productora de monocina estable. En otro aspecto, se proporcionan métodos para destruir una especie de Listeria, que comprenden poner en contacto la especie de Listeria con una cantidad eficaz de una monocina de la divulgación, de modo de la monocina se une y destruye la especie de Listeria. En algunas realizaciones, el contacto se realiza con una superficie contaminada con especies de Listeria. En un ejemplo, el contacto se realiza a 2-10 ° C. En otro aspecto, se proporcionan métodos para tratar una infección por una especie de Listeria en un animal, que comprende administrar a un animal que lo necesita una cantidad de una monocina de la divulgación, o una célula productora de monocina de la divulgación en una cantidad suficiente para producir una cantidad bactericida de la monocina, tratándose así la infección o colonización por Listeria.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Mapa del locus genético de las monocinas. La parte superior es todo el locus de tipo silvestre, incluidos los genes reguladores, estructurales y de lisis según se indica. A. Se muestran los genes estructurales de la monocina natural que codifican el armazón y la RBP natural. B-D muestran ejemplos de monocinas no naturales con 3 tipos representativos de RBP heterólogas. B. Una monocina no natural con una RBP mutante o nativa modificada. C. Una monocina no natural con una RBP nativa no modificada pero heteróloga (un ejemplo es la monocina 35152-33090 de la presente invención). D. Una monocina no natural con una fusión de RBP en la que una porción amino-terminal de la monocina BPAR está fusionada con un RBD heterólogo, que puede proceder de un bacteriófago, profago o resto de profago (un ejemplo es la monocina 35152-A118 de esta invención).

Figura 2. Ensayo puntual de la monocina 35152-33090 producida en la cepa sGL-075 de B. subtilis. Este grupo de genes de monocina no natural está bajo control transcripcional del promotor Phyper-spank. La bacteria diana es la cepa 19111 de L. monocytogenes.

Figura 3. Gráfico del espectro bactericida de las actividades de las monocinas naturales 35152 y 33090 y las monocinas no naturales 35152-33090 y 35152-A118 contra las cepas diana indicadas. Los cuadrados sombreados indican destrucción bactericida. Los cuadrados blancos indican insensibilidad.

Figura 4. Los resultados de los ensayos que muestran las actividades bactericidas de las monocinas a 3-4 ° C. Se enfriaron céspedes de bacterias L. monocytogenes diana a 3-4 ° C, se aplicaron sobre ellos preparaciones enfriadas de monocinas y luego se incubaron a 3-4 ° C durante 3 días antes de la obtención de imágenes. El carril A es la cepa 23074 de L. monocytogenes manchada con monocina 35152 y el carril B es la cepa 15313 de L. monocytogenes manchada con monocina 35152-A118. La aparición de zonas claras en el césped indicó actividad bactericida.

Figura 5. Ensayos puntuales de monocina 35152-A118 producida en construcciones que incluyen diversas combinaciones de supuestos conjuntos de fibra caudal o genes de chaperona. Si no estaban presentes los supuestos genes de fibra caudal, no se producía monocina activa. La inclusión de ORF21 dio como resultado una actividad robusta que era igual a la actividad de las monocinas producidas tanto con el ORF 21 como con el 22. Tener las tres supuestas proteínas de ensamblaje de fibra caudal fue realmente perjudicial.

Figura 6. Comparación de monocinas producidas en la cepa A8 vs BDG9.

Figura 7. Comparación del grupo de genes de monocina con el genoma del fago A118 similar a TP901-1. Los genes que son similares son de color negro. Tres genes reguladores del grupo de monocina (0126, 0128 y 0129) eran homólogos de genes reguladores del fago A118. Cinco de los genes de la estructura principal de la monocina (0131, 0134, 0135, 0136 y 0140) también eran homólogos a A118.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en la identificación, clonación y expresión de un locus genético dentro de un genoma de Listeria que codifica una bacteriocina similar a una cola de fago (PTLB), denominada monocina o listeriocina. También se proporcionan monocinas modificadas o no naturales, tales como las que se han modificado por ingeniería genética para tener una especificidad bactericida alterada. En consecuencia, en el presente documento se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican monocinas naturales o no naturales, construcciones de vectores de integración que contienen tales ácidos nucleicos unidos operativamente a un promotor heterólogo, células productoras que no producen monocinas de forma natural pero que contienen tales moléculas de ácido nucleico o vectores, las monocinas codificadas, así como métodos de fabricación y uso de tales monocinas.

Como se usan indistintamente en el presente documento, las expresiones "bacteriocina similar a una cola de fago" (PTLB) y bacteriocina de alto peso molecular (HMW) pueden incluir, bacteriocinas de tipo F (FTB) y bacteriocinas de tipo R (RTB). Por ejemplo, una monocina es una PTLB. Los presentes inventores postularon previamente que las monocinas como se contemplan en el presente documento tienen las estructuras de (RTB), véase la Solicitud Provisional de Estados Unidos N.° 62/076.691, pero como se describe en el presente documento, se parecen más a las FTB. Una PTLB puede ser natural o no natural, es decir, existe en la naturaleza o no existe en la naturaleza, respectivamente.

Los términos "monocina" y "listeriocina" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una PTLB aislada o derivada de una especie de Listeria. Las monocinas desveladas en el presente documento son moléculas complejas que comprenden múltiples subunidades de proteína, o polipéptido, y se parecen ligeramente a las estructuras caudales de los bacteriófagos. En las monocinas naturales, las estructuras de las subunidades están codificadas por un locus genético presente dentro del genoma bacteriano, tal como el de L. monocytogenes, L. ivanovii o L. innocua, y forman monocinas para servir como defensas naturales contra otras bacterias. Las monocinas pueden ser naturales o no naturales.

Una monocina funcional contiene un armazón estructural y una RBP (véase la Figura 1A). Por tanto, el "armazón estructural" (usado indistintamente con "armazón estructural de monocina" o "armazón") contiene todas las proteínas estructurales de una monocina funcional excepto la RBP. En algunas realizaciones, el armazón incluye los marcos de lectura abiertos (ORF) correspondientes a los ORF 130-139 de la cepa 35152 de Listeria. En realizaciones particulares, el armazón estructural incluye las SEQ ID NO: 7-16. En otras realizaciones, el armazón estructural es al menos un 80 % idéntico a las SEC ID NO: 7-16. En otras realizaciones, el armazón estructural tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 %, 88 %, 89 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o incluso 99 % idéntica a un polipéptido que contiene los ORF 130-139 o las SEQ ID NO: 7-16.

La RBP consiste en una porción amino terminal que proporciona la unión (denominada "región de unión a la placa de soporte" o BPAR) al resto del armazón estructural de monocina y una porción carboxilo terminal que proporciona un dominio de unión al receptor (RBD) que es el motivo de direccionamiento de la RBP. En algunas realizaciones, la BPAR es natural para el armazón estructural. En otras realizaciones, la BPAR es altamente homóloga a la BPAR nativa del armazón estructural. En realizaciones particulares, la BPAR es al menos un 80 % idéntica a la BPAR nativa del armazón estructural. En realizaciones particulares, la BPAR incluye solo el extremo amino de 20 a 60 aminoácidos del ORF 140 (véase la Figura 1D).

Las "monocinas naturales", tal como se usan en el presente documento, se refieren a las monocinas que existen en la naturaleza e incluyen partículas nativas obtenidas de Listeria, así como partículas obtenidas mediante la expresión de un grupo de genes de monocina naturales en una célula productora de monocinas que no produce una monocina de manera natural (véase la Figura 1A).

Las "monocinas no naturales", como se usan en el presente documento, se refieren a las monocinas que no existen en la naturaleza (véanse las Figuras 1B-1D). En otras realizaciones, la monocina no natural contiene una RBP heteróloga. Una "RBP heteróloga" puede ser una RBP nativa obtenida de una fuente diferente a la del armazón estructural al que se une (véase la Figura 1B); o una RBP heteróloga puede ser una RBP modificada que era una RBP natural antes de modificarse o mutarse para cambiar sus propiedades físicas y/o biológicas (véase la Figura 1C). En algunas realizaciones, una RBP modificada es una que contiene una secuencia de aminoácidos que es diferente (por ejemplo, se ha modificado por ingeniería genética para diferir) de una RBP nativa o natural y confiere a la monocina no natural resultante propiedades de unión al receptor diferentes (véase la Figura 1C). En otras realizaciones, una RBP modificada puede estar compuesta por una fusión entre una porción amino terminal de una RBP natural (la BPAR) y un dominio de unión al receptor heterólogo (RBD) (véase la Figura 1D). Un RBD es la porción de una RBP que dirige a la RBP, la cual, a su vez, dirige a la PTLB a su bacteria diana específica. En un ejemplo, una monocina no natural puede ser una partícula de PTLB modificada por ingeniería genética que comprende polipéptidos codificados por genes derivados de una o más cepas de especies de Listeria y con un 80 % o más de identidad con respecto a las proteínas estructurales codificadas por las SEQ ID NO: 7-16 que, cuando incorpora una RBP heteróloga, constituye una monocina activa completa.

En consecuencia, se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican una monocina no natural, en donde la molécula de ácido nucleico incluye un primer polinucleótido que codifica todas las proteínas estructurales de una monocina funcional excepto una RBP natural correspondiente, en donde la molécula de ácido nucleico incluye además una segunda secuencia polinucleotídica heteróloga que codifica la RBP heteróloga, y en donde la monocina no natural tiene la especificidad bactericida determinada por la RBP heteróloga. En realizaciones particulares, las proteínas estructurales codificadas por el primer polinucleótido corresponden a los ORF 130-139 de un locus genético de monocina. En un ejemplo, las proteínas estructurales son las SEQ ID NO: 7-16.

En realizaciones particulares, una monocina no natural puede incluir una fusión de RBP. En uno de esos ejemplos, la monocina no natural contiene un armazón estructural y una fusión de RBP que consiste en la BPAR de la RBP natural correspondiente y un RBD heterólogo. En algunos ejemplos, la BPAR incluye las posiciones de aminoácidos 1-40 de la ^r B^p natural. Para formar una molécula de monocina no natural completa, la fusión de RBP se une al armazón estructural, con lo que el RBD heterólogo determina el espectro bactericida de la monocina no natural resultante. En los ejemplos en los que la monocina no natural contiene una RBP heteróloga que es una fusión de RBP, la molécula de ácido nucleico que codifica el armazón y la RBP heteróloga está modificada por ingeniería genética de modo que la monocina resultante contendrá una RBP heteróloga que consiste en aminoácidos en las posiciones aproximadamente 1-40 de la BPAR natural fusionada a la porción carboxi terminal de un RBD heterólogo (véase la Figura 1D).

Como se usa en el presente documento, un "ácido nucleico" o una "molécula de ácido nucleico" se refiere típicamente a polímeros de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos (puros o mixtos) en forma monocatenaria o bicatenaria. El término también abarca ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos o restos modificados de la estructura principal o enlaces, que son sintéticos, de origen natural y de origen no natural, que tienen propiedades de unión, estructurales o funcionales similares a las del ácido nucleico de referencia, y que se procesan de manera similar a los nucleótidos de referencia. Los ejemplos de dichos análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforoamidatos, metil fosfonatos, metil fosfonatos quirales, 2-0-metil ribonucleótidos y ácidos nucleicos peptídicos (APN). En algunos contextos, el término ácido nucleico puede usarse indistintamente con gen, ADNc, ARNm, oligonucleótido y polinucleótido.

Una secuencia de ácido nucleico particular también abarca variantes modificadas de forma conservativa de la misma (tales como sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. En concreto, las sustituciones de codones degenerados se pueden conseguir mediante la generación de secuencias en las que la tercera posición ("oscilación") de uno o más codones seleccionados (o todos) se ha sustituido por restos de bases mixtas y/o desoxiinosina. Por tanto, una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de proteína descrita en el presente documento también abarca variantes modificadas de la misma como se describen en el presente documento. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" normalmente se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de restos de aminoácido. Los aminoácidos se pueden citar en el presente documento bien por sus símbolos habitualmente conocidos de tres letras, o mediante los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB.

El término "segmento", como se usa en el presente documento para hacer referencia a una secuencia de aminoácidos, se refiere a una secuencia de aminoácidos contiguos que puede tener 10, 12, 15, 20, 25, 50 o 100 restos de aminoácidos de longitud. Como se usa en el presente documento, el término "heterólogo", cuando se usa para hacer referencia a porciones de una secuencia de proteína o de ácido nucleico, indica que la secuencia comprende dos o más subsecuencias que generalmente no se encuentran en la naturaleza en la misma relación entre sí. En un ejemplo, las secuencias heterólogas son de diferentes especies de bacterias. En otro ejemplo, las secuencias heterólogas son de diferentes cepas de la misma especie de bacteria. En un aspecto, las secuencias heterólogas son de diferentes cepas de L. monocytogenes. En otro aspecto, las secuencias heterólogas son de una bacteria y un bacteriófago o profago, o de una bacteria y una secuencia de ADN no natural, sintética.

La RBP heteróloga puede comprender un RBD obtenido de otra cepa de L. monocytogenes, otra especie de Listeria o un género de bacterias distinto del de la especie y la cepa de la bacteria de la que se obtuvo el armazón. En algunas realizaciones, la especie de Listeria incluye L. fleischmannii, L. grayi, L. innocua, L. ivanovii, L. marthii, L. rocourtiae, L. seeligeri, L. weihenstephanensis y L. welshimeri. En otras realizaciones, el género de bacterias se selecciona de Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Enterococcus, Propionibacterium. En algunas realizaciones, el RBD heterólogo es de un genoma de L. monocytogenes, un bacteriófago, una inserción de profago o un resto de profago que está contenido dentro de un genoma de Listeria. Un "resto de fago" o elemento o porción de profago se refiere a una secuencia que codifica solo una porción de un fago o una o más proteínas de fago discretas, en lugar de una estructura completa de fago. Por tanto, en algunas realizaciones, un resto de profago puede incluir, por ejemplo, una secuencia que codifica un RBD y otras proteínas estructurales. En determinadas realizaciones, el RBD es de un profago o un resto de profago del genoma de una bacteria grampositiva o un RBD de un bacteriófago que infecta a una bacteria grampositiva. En un ejemplo, la bacteria grampositiva es una especie de Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Enterococcus, o Propionibacterium. En algunas realizaciones, La RBP natural de una monocina natural puede reemplazarse por una forma modificada de una RBP nativa. Una "RBP nativa" se refiere a una RBP que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la de una RBP aislada o clonada de otra cepa de L. monocytogenes o de un bacteriófago que infecta a L. monocytogenes o de otro género o especie de bacteria o de un bacteriófago. Las RBP nativas ejemplares de L. monocytogenes incluyen las SEQ ID NO: 17, 26, 27 de las cepas 35152, F6854 y 33090, respectivamente. En algunas realizaciones, una RBP modificada incluye un cambio en la secuencia de aminoácidos de la RBP en relación con una RBP nativa. Los ejemplos no limitantes de un cambio en la secuencia de aminoácidos incluyen la sustitución, inserción (o adición) o eliminación de uno o más aminoácidos que modifica las propiedades de unión o estabilidad de la RBP.

En realizaciones particulares, la forma modificada de una RBP nativa también proporciona como resultado una monocina que tiene una RBP heteróloga y un espectro bactericida que es diferente del de una monocina que contiene la RBP nativa o no modificada correspondiente. En realizaciones particulares, la forma modificada es al menos un 80 % idéntica a la RBP nativa. En otras realizaciones, la RBP tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 %, 88 %, 89 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o incluso 99 % idéntica a la de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 17, 26, 27 y la RBP modificada proporciona como resultado una monocina que tiene un espectro bactericida que es diferente del de una monocina que tiene la RBP nativa o no modificada correspondiente.

También se proporcionan monocinas variantes. Las monocinas variantes incluyen las monocinas que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 % idéntica a un polipéptido que contiene los ORF 130-139 (SEQ ID NO: 7-16), o los ORF 130-140 (SEQ ID NO: 7-17). En otras realizaciones, la monocina variante tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 %, 88 %, 89 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o incluso 99 % idéntica a un polipéptido que contiene los ORF 130-139 o los ORF 130-140.

También se proporcionan vectores o construcciones de expresión que contienen una molécula de ácido nucleico que codifica una monocina. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico está unida operativamente a un promotor inducible heterólogo en el vector o construcción de expresión. En realizaciones particulares, el promotor heterólogo es un promotor inducido por una molécula pequeña. Los ejemplos de tales promotores inducidos por moléculas pequeñas incluyen P^lac (lactosa, IPTG), P^tac (IPTG), P^bad (arabinosa) y P^xyl (Xilosa). En realizaciones particulares, el promotor se coloca aproximadamente 17 nucleótidos cadena arriba de un polinucleótido que codifica el ORF 128 (SEQ ID NO: 5) de la monocina.

En otras realizaciones, el vector o la construcción de expresión puede incluir una o más proteínas reguladoras codificadas por un grupo de genes o locus genético de monocina. En realizaciones particulares, dichas una o más proteínas reguladoras se codifican por un ORF seleccionado del grupo que consiste en los ORF 125, 126, 127, 128 y 129 (SEQ ID NO: 2-6, respectivamente). En un ejemplo, dichas una o más proteínas reguladoras se codifican por un ORF seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2-6.

Una monocina de la invención puede ser activa en frío, es decir, tiene actividad bactericida a bajas temperaturas, tales como de 2-10 ° C.

Una propiedad adicional común a las monocinas desveladas en el presente documento es que no contienen ácido nucleico y, por lo tanto, son deficientes en la replicación de tal manera que no pueden reproducirse por sí mismas después o durante la destrucción de una bacteria diana, como lo pueden hacer muchos bacteriófagos. Son simplemente proteínas, no organismos o virus.

Una "bacteria diana" o "bacterias diana" se refiere a una o más bacterias que se unen por una monocina de la divulgación y/o cuyo crecimiento, supervivencia o replicación se inhibe por esa razón. En algunas realizaciones, la bacteria diana es del género Listeria. En algunas realizaciones, la bacteria diana es de una especie de Listeria seleccionada del grupo que consiste en L. monocytogenes, L. innocua, y L. ivanovii. En realizaciones particulares, la bacteria es Listeria monocytogenes. En un aspecto, se establece como diana más de una cepa de L. monocytogenes. Las cepas ejemplares de Listeria monocytogenes incluyen, aunque no de forma limitativa, cepa 15313 (serovar 1/2a), cepa 19111 (serovar 1/2a), cepa 35152 (serovar 1/2a), cepa DD1144 (serovar 1/2a), cepa DD1145 (serovar 1/2a), cepa DD1152 (serovar 1/2a), cepa DD1299 (serovar 12a), cepa DD1313 (serovar 4b), cepa DD1294 (serovar 4b), cepa DP-L4056 (serovar (1/2a), cepa DP-L3633 (serovar 1/2a), cepa DP-L3293 (serovar 1/2c), cepa DP-L3817 (serovar 1/2a), cepa DP-L1171 (serovar 1/2b), cepa DP-L185 (serovar 4b), cepa DP-L186 (serovar 4b), cepa DP-L188 (serovar 3), cepa DP-L1173 (serovar 4b), cepa DP-L1174 (serovar 4b), cepa DP-L1168 (serovar 4b), cepa DP-L1169 (serovar 4b), cepa 23074 (serovar 4b) y de Listeria ivanovii la cepa 19119 (serovar 5). En algunas realizaciones, la bacteria diana es del género Clostridum, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Enterococcus o Propionibacterium. La expresión "inhibición del crecimiento" o variaciones de la misma se refiere a la ralentización o detención de la velocidad de división de una célula bacteriana o al cese de la división de la célula bacteriana, o a la muerte de la bacteria o bacterias.

Los factores de virulencia son aquellas moléculas que contribuyen a la patogenicidad de un organismo pero no necesariamente a su viabilidad general. Tras la pérdida de un factor de virulencia, el organismo es menos patógeno para un hospedador, pero no necesariamente menos viable en cultivo. Los factores de virulencia pueden tener una cualquiera de numerosas funciones, por ejemplo, regulación de la expresión génica, provisión de adherencia o movilidad, provisión de una toxina, inyección de una toxina, bombeo de agentes antibióticos o formación de recubrimientos protectores entre los que se incluyen biopelículas.

Los factores de aptitud son aquellas moléculas que contribuyen a la viabilidad general del organismo, tasa de crecimiento o competitividad en su entorno. Tras la pérdida de un factor de aptitud, el organismo es menos viable o competitivo y debido a este compromiso, indirectamente menos patogénico. Los factores de aptitud también pueden poseer una cualquiera de numerosas funciones, por ejemplo, adquisición de nutrientes, iones o agua, formación de componentes o protectores de membranas celulares o paredes celulares, replicación, reparación o mutagenización de ácidos nucleicos, provisión de defensa frente a u ofensa hacia agresiones ambientales o competitivas.

Las monocinas dirigidas a la virulencia accesible en la superficie o factores de aptitud (por ejemplo, internalinas en las superficies de especies de Listeria y proteínas de la capa S, prevalentes en muchas bacterias, las especies de Clostridium, por ejemplo) ofrecen una forma atractiva para obligar a estos patógenos a comprometer su virulencia o aptitud si emergen como resistentes a la monocina.

En realizaciones adicionales, una monocina tal como se proporciona en el presente documento se usa para tratar alimentos o áreas de almacenamiento de alimentos contaminados con bacterias diana. En realizaciones particulares, la monocina es estable al frío, activa en frío, y se utiliza para tratar la contaminación bacteriana de alimentos refrigerados o áreas de almacenamiento refrigeradas. En consecuencia, se proporcionan métodos para destruir Listeria monocytogenes mediante la puesta en contacto de L. monocytogenes con una cantidad eficaz de una monocina, con lo que la monocina se une y destruye a L. monocytogenes. En algunas realizaciones, el contacto se realiza en un animal y se administra una cantidad bactericida de la monocina al animal. En otras realizaciones, el contacto es con una superficie contaminada con L. monocytogenes. En determinadas realizaciones, el contacto se realiza en frío, por ejemplo, a 2-10 ° C.

También se proporcionan en la divulgación métodos para tratar una infección de L. monocytogenes en un animal mediante la administración a un animal que lo necesita de una cantidad de una monocina, o una célula productora de monocina para producir una cantidad bactericida de la bacteriocina, tratándose así la infección.

Tal como se describe en el presente documento, se puede usar una monocina antibacteriana para inhibir el crecimiento, supervivencia o replicación de una bacteria particular. La bacteria puede ser una cepa patógena o perjudicial para el medio ambiente, o puede tratarse de manera profiláctica. Un microorganismo patógeno generalmente causa enfermedad, algunas veces solo en circunstancias particulares.

Una monocina modificada por ingeniería genética de la divulgación puede administrarse a cualquier sujeto afectado por, con un diagnóstico de afección por o sospechoso de ser afectado por, una infección, colonización o contaminación por bacterias susceptibles a la monocina. Los ejemplos no limitantes de este sujeto incluyen especies animales (mamíferos, reptiles, anfibios, aves y peces) así como insectos, plantas y hongos. Los ejemplos representativos y no limitantes de especies de mamíferos incluyen seres humanos; primates no humanos; especies relevantes desde el punto de vista agrícola tales como vacas, cerdos, cabras y ovejas; roedores, tales como ratones y ratas; mamíferos de compañía, de exhibición o de exposición, tales como perros, gatos, cobayas, conejos y caballos; y mamíferos de trabajo, tales como perros y caballos. Los ejemplos representativos y no limitantes de especies de aves incluyen pollos, patos, gansos y pájaros de compañía o de espectáculo, tales como loros y periquitos. Un sujeto animal tratado con una monocina modificada por ingeniería genética de la divulgación también puede ser cuadrúpedo, un bípedo, un animal acuático, un vertebrado o un invertebrado, incluyendo insectos.

En algunas realizaciones, el sujeto que necesita ser tratado es un niño o feto humano u otro animal joven que aún no ha alcanzado la madurez. Por lo tanto, la divulgación incluye el tratamiento de afecciones pediátricas u obstétricas que comprenden infección con bacterias u otro microorganismo susceptible a una monocina de la divulgación.

En algunas realizaciones, se proporcionan composiciones de más de una monocina no natural, en donde las monocinas no naturales tienen espectros bactericidas diferentes. En otras realizaciones, se proporcionan composiciones de una o más monocinas no naturales y una o más monocinas naturales, en donde las monocinas tienen espectros bactericidas diferentes.

En algunas realizaciones, las monocinas, las combinaciones de monocinas o las células productoras de monocina capaces de producir monocinas se formulan con un excipiente, recubrimiento entérico o vehículo "farmacéuticamente aceptable". Este componente es uno que es adecuado para su uso con seres humanos, animales y/o plantas sin efectos secundarios adversos excesivos. Los ejemplos no limitantes de efectos secundarios adversos incluyen toxicidad, irritación y/o respuesta alérgica. El excipiente o vehículo típicamente es uno que es proporcional a una relación beneficio/riesgo razonable. Los vehículos farmacéuticamente adecuados no limitantes incluyen suspensiones, emulsiones y soluciones acuosas o no acuosas estériles. Los ejemplos incluyen, aunque no de forma limitativa, excipientes farmacéuticos convencionales tales como una solución salina tamponada con fosfato, solución de bicarbonato, agua, emulsiones tales como emulsión de aceite/agua y diversos tipos de agentes humectantes. Son ejemplos de disolventes no acuosos propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medio tamponado. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, solución de Ringer con dextrosa, dextrosa y cloruro de sodio, aceites de Ringer lactados o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reabastecedores de líquidos y nutrientes, reabastecedores de electrólitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer) y similares.

Las formulaciones y composiciones farmacéuticas adicionales desveladas en el presente documento comprenden una monocina aislada específica para un patógeno bacteriano; una mezcla de dos, tres, cinco, diez o veinte o más monocinas diferentes o células productoras capaces de producir monocinas que se dirigen al mismo patógeno bacteriano; y una mezcla de dos, tres, cinco, diez o veinte o más que se dirigen a diferentes patógenos bacterianos o diferentes cepas del mismo patógeno bacteriano.

Opcionalmente, una composición que comprende una monocina o célula productora de la divulgación también se puede secar por pulverización o liofilizar usando medios bien conocidos en la técnica. La posterior reconstitución y uso se puede poner en práctica como se conoce en este campo.

Una monocina se usa típicamente en una cantidad o concentración que es "segura y eficaz", que se refiere a una cantidad que es suficiente para producir una respuesta terapéutica o profiláctica deseada sin efectos secundarios adversos excesivos como los descritos anteriormente. Una monocina también puede usarse en una cantidad o concentración que es "terapéuticamente eficaz", que se refiere a una cantidad eficaz para producir una respuesta terapéutica deseada, tal como, pero sin limitación, una cantidad eficaz para ralentizar la tasa de división celular bacteriana, o para causar la detención de la división celular bacteriana, o para causar la muerte o disminuir la tasa de crecimiento de la población de las bacterias diana. La cantidad segura y eficaz o la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz variará con varios factores, pero el médico experto puede determinarla fácilmente sin experimentación excesiva. Los ejemplos no limitantes de factores incluyen la afección particular que se esté tratando, el estado físico del sujeto, el tipo de sujeto a tratar, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente (si la hay) y las formulaciones específicas empleadas.

Las expresiones "célula productora" y "célula productora de monocina" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una célula que es capaz de producir o expresar una molécula de ácido nucleico que codifica monocina, y que no contiene dicha molécula de ácido nucleico de forma natural. La célula productora puede ser capaz de sobrevivir y crecer en presencia de oxígeno y se transforma con un vector que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica la monocina, que puede estar integrado en el cromosoma de la célula productora o puede ser episomal. La célula productora puede ser una bacteria grampositiva. En determinadas realizaciones, la célula productora puede ser una bacteria del género Bacillus, Lactobacillus, Listeria, o Lactococcus.

En algunas realizaciones, la bacteria es una especie del género Bacillus seleccionada del grupo que consiste en subtilis, amyloliquefaciens, y megaterium. En un aspecto, la bacteria es Bacillus subtilis. En un aspecto particular, la célula productora es una cepa de B. subtilis que carece del grupo de genes de PBSX SpoA, Flag, etc. En otras realizaciones, la bacteria es una especie del género Lactobacillus seleccionada del grupo que consiste en acidophilus, casei, y bulgaricus. En otra realización particular, la célula productora es una especie de Listeria distinta de monocytogenes capaz de producir o expresar una molécula de ácido nucleico que codifica monocina y que no contiene dicha molécula de ácido nucleico de forma natural. En algunas realizaciones, una célula productora contiene un primer polinucleótido extraño que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 % idéntica a las SEQ ID NO: 7-16 y un segundo polinucleótido extraño que codifica una RBP heteróloga, en donde el primer y segundo polinucleótidos codifican una monocina que tiene la especificidad bactericida determinada por la RBP heteróloga. En realizaciones particulares, el segundo polinucleótido extraño es heterólogo al primer polinucleótido extraño. En algunas realizaciones, el primer y el segundo polinucleótidos son moléculas de ácido nucleico separadas. En otras realizaciones, el primer y el segundo polinucleótidos están contenidos en una molécula de ácido nucleico. Los siguientes ejemplos pretender ilustrar, pero no limitar, la invención.

La expresión "que comprende", que se usa indistintamente con "que incluye", "que contiene", o "caracterizado por", es inclusiva o abierta y no excluye elementos o etapas de métodos adicionales que no se hayan mencionado. La frase "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en las reivindicaciones. La frase "que consiste esencialmente en" limita el alcance de una reivindicación a los materiales o etapas especificadas y a los que no afectan materialmente a las características básicas y novedosas de la invención reivindicada. La presente divulgación contempla realizaciones de las composiciones y métodos de la invención correspondientes al alcance de cada una de estas frases. Por tanto, una composición o método que comprende elementos o etapas mencionadas contempla realizaciones particulares en las que la composición o método consiste esencialmente o consiste en esos elementos o etapas.

Ejemplo 1

IDENTIFICACIÓN DEL LOCUS GENÉTICO DE MONOCINA

Este ejemplo ilustra la identificación de los loci genéticos que codifican una monocina dentro de una cepa de Listeria monocytogenes y una cepa de Listeria innocua. Se notificó que tanto la cepa ATCC 35152 de Listeria monocytogenes como la cepa ATCC 33090 de Listeria innocua producían monocinas. (Zink et al., 1994). Estas dos cepas se indujeron con mitomicina C, y las monocinas se recogieron del lisado por centrifugación a alta velocidad a 90.000 xg. La actividad bactericida se ensayó mediante el método puntual en un panel de especies de Listeria. Se observó que las monocinas de las dos cepas tenían espectros bactericidas diferentes. Ninguna mostró actividad bactericida contra la misma cepa de la que se aisló. Las preparaciones de monocina purificadas enteras se analizaron por espectrometría de masas (MS) para identificar en la muestra proteínas que tuvieran similitud con los componentes de las estructuras similares a cola de fago. Aunque las cepas 35152 y 33090 no se encuentran entre aquellas en las que se conocen las secuencias del genoma, se habían secuenciado otros numerosos genomas de Listeria y se podían buscar. La proteína más abundante en la preparación de monocina de la cepa 35152 correspondió al gen ImaA o antígeno A codificado en numerosas cepas de Listeria. El antígeno A es una proteína que originalmente se observó que provocaba una respuesta inmunológica en seres humanos con infecciones por Listeria (Gohmann et al., 1990; Schaferkordt et al., 1997). Antes de la presente invención, no se sabía que el antígeno A fuera realmente parte de una monocina. El antígeno A de la cepa 35152 mostró secuencias peptídicas idénticas a varios homólogos de genomas de Listeria monocytogenes conocidos; como referencia se eligió el genoma secuenciado de la cepa 1/2a F6854 de L. monocytogenes, y se usó el sistema de numeración de genes (ORF) de esa cepa para este trabajo. El antígeno A corresponde al ORF 131 de la cepa 1/2a F6854. Se observaron otras diversas coincidencias de péptidos a partir de los análisis de MS que correspondían a ORF que están codificados en regiones cercanas del genoma, incluidos los ORF 130, 132, 135, 136, 138 y 140 (SEQ ID NO: 7, 9, 12, 13, 15, 17, respectivamente). Varios de estos tenían similitudes de secuencia con proteínas de la cola de fagos (Tabla 1).

Tabla 1. Marcos de lectura abiertos, longitudes de aminoácidos previstas y anotaciones de las proteínas codificadas por los ORF del grupo de genes de monocina. Las anotaciones del GenBank se correlacionan con la cepa F6854 de L. monocytogenes. Las anotaciones de AvidBiotics se basan en búsquedas bioinformáticas adicionales, espectrometría de masas y datos experimentales.

ORF Longitud (a.a.) Anotación de GenBank Anotación de AvidBiotics

125 231 Hipotético Regulador transcripcional

126 150 Hipotético T ox/Antitox, GP35 de fago A118

127 117 Supuesto Supresor Tox/Antitox, lambda C1, HTH

128 142 Antígeno D Antígeno D (función desconocida)

129 138 Antígeno C Regulador transcripcional

130 129 Antígeno B Antígeno B (función desconocida)

131 170 Antígeno A Proteína estructural principal de monocina 132 100 Hipotético Proteína estructural de monocina

133 111 Hipotético Proteína estructural de monocina

134 622 Supuesta proteína de membrana Proteína medidora de la cola

135 272 Hipotético Proteína estructural de monocina

136 378 Fago estructural Proteína estructural de monocina

137 99 Hipotético Proteína estructural de monocina

138 191 Hipotético Proteína estructural de monocina

139 159 Hipotético Proteína estructural de monocina

140 178 Hipotético RBP de monocina

141 140 Holina Holina

142 242 N-acetilmuramoil-L-alanina amidasa Lisina

Una inspección minuciosa de esta región genómica reveló que los ORF 130-140 (SEQ ID NO: 7-17, respectivamente) codificaban los componentes de un módulo de estructura de cola contráctil (Figura 1, arriba). En particular, el ORF 134 codificaba una supuesta proteína medidora de la cola y los ORF 137 y 139 codificaban supuestas proteínas que compartían al menos alguna similitud de secuencia con proteínas de cola de fago conocidas. Todos estos ORF se transcriben en una cadena con poco espacio intergénico. Inmediatamente cadena abajo, los ORF 141 y 142 (SEQ ID NO: 18-19) codificaban la supuesta holina y lisina, las proteínas que son responsables de la lisis celular programada para la liberación de monocinas desde la bacteria. Cadena arriba del ORF 130 se anotaron 5 supuestos genes reguladores. El ORF 125 (SEQ ID NO: 2) tenía similitud de secuencia con reguladores transcripcionales; los ORF 126 (SEQ ID NO: 3) y 127 (SEQ ID NO: 4) tenían similitud de secuencia con proteínas reguladoras de fagos y el ORF 128 (SEQ ID NO: 5) y ORF 129 (SEQ ID NO: 6) tenían similitudes de secuencia con el antígeno D y el antígeno C, respectivamente, teniendo también el ORF 129 cierta similitud con reguladores transcripcionales (Tabla 1). Se observó que los ORF 125-127 se transcribían en la dirección opuesta a los genes estructurales, mientras que los ORF128 y 129 se transcribían en la misma dirección que los genes estructurales con un espacio de 286 nucleótidos entre el final de ORF129 y el comienzo de ORF130. En la Figura 1 (arriba) se muestra un mapa de todo el grupo de genes de monocina. No se encontraron genes que codificaran proteínas de cápside de fago, de ensamblaje de cápsides o de portal en esta región o cerca de esta región en el genoma. Tampoco estaba presente ningún gen que codificara la maquinaria de replicación o empaquetamiento de ADN, proteínas de integración/escisión, o ningún otro ORF a menudo asociado con profagos lisogénicos. Por tanto, era coherente que esta región codificara una PTLB prevista, incluidos los componentes contráctiles de cola de fago y los genes reguladores/de lisis necesarios para regular la producción y liberación de las partículas de PTLB.

Los datos de espectrometría de masas de la preparación de lisado de Listeria innocua 33090 dio resultados similares, correspondiendo varios péptidos a un grupo de genes casi idéntico. La cepa 35152 de L. monocytogenes, que produce monocina natural 35152, se eligió como fuente de ácido nucleico que codifica un armazón para la obtención por ingeniería genética de nuevas monocinas y nuevos casetes de expresión para monocinas.

Ejemplo 2

CLONACIÓN Y EXPRESIÓN DE LA MONOCINA 35152 EN BACILLUS SUBTILIS

Este ejemplo ilustra la clonación de los genes y la expresión de una monocina en una célula productora no patógena.

El grupo de genes de monocina, desde el ORF 125 al ORF 142 (SEQ ID NO: 2-19, respectivamente), se amplificó por PCR a partir de ADN genómico aislado de la cepa 35152 de Listeria monocytogenes usando los cebadores oGL-054 y oGL-057 (Tabla 2). Se digirieron tanto el producto de PCR como el vector DG630 (Gebhart et al., 2012) con las enzimas de restricción AscI y NotI y se ligaron entre sí usando ADN ligasa de T4. Esto puso el grupo de monocina entre dos secuencias flanqueantes de amyE que permitieron la recombinación homóloga del grupo en el gen amyE de B. subtilis. Esta construcción de plásmido se denominó pGL-031 (Tabla 3).

T l 2. r li n l i iliz n l r n inv n i n.

T l . n r i n l mi r n l r n inv n i n.

pGL-031 se linealizó por digestión con la enzima de restricción SacIl y se utilizó para transformar la cepa de Bacillus subtilis, BDG9 (Gebhart et al., 2012). El protocolo de transformación fue el siguiente: La cepa BDG9 se cultivó en medio MC (Gebhart et al., 2012) complementado con MgSO43 mM final durante cuatro horas a 37 ° C. El ADN de pGL-031 linealizado se mezcló con 200 pl del cultivo de células BDG9 y se dejó incubar durante 2 horas más a 37 ° C. Las reacciones de transformación se sembraron en placas LB complementadas con 5 pg/ml de cloranfenicol y se incubaron durante la noche a 37 ° C. Se seleccionaron colonias resistentes al cloranfenicol y se ensayaron con respecto a la producción de monocina. Esta cepa de B. subtilis productora de monocina se denominó sGL-064 (Tabla 4).

La cepa sGL-064 de B. subtilis se cultivó utilizando las condiciones convencionales y la producción de monocina se indujo con peróxido de hidrógeno 5 mM cuando la DO600 alcanzó un valor de 0,2 - 0,4. La proteína se recogió como se describe y la actividad bactericida de la monocina se evaluó mediante ensayo puntual. Un ensayo puntual se realiza añadiendo 100 pl de cultivo de cepa diana a 5 ml de agar blando TSB (agar al 0,5%), vertiendo la mezcla sobre una placa de agar TSB y dejando que se endurezca el agar blando. Se realizan diluciones seriadas de cinco veces de la preparación de proteína en tampón TN50 (TrisCI 10 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM) y se aplican 3 pl de cada dilución, incluyendo una muestra de la preparación de proteína sin diluir, en la placa y se deja secar. Las placas se incuban durante la noche a 30 ° C. La destrucción se detecta como zonas claras en el césped bacteriano. Los ensayos puntuales mostraron que las monocinas producidas y purificadas a partir de cepas sGL-064 de B. subtilis, que expresaban los ORF 125 - ORF 142 de 35152 (SEQ ID NO: 2-19) tenían actividad de destrucción de la cepa 4b 23074 de L. monocytogenes.

Ejemplo 3

ELIMINACIÓN DE LOS GENES DE LISIS DEL GRUPO DE GENES DE MONOCINA

Este ejemplo ilustra la generación y expresión de una construcción que contiene un grupo de genes de monocina pero que carece de los genes responsables de la lisis.

Para eliminar los supuestos genes de holina y lisina (ORF 141-142, SEQ ID NO: 18-19) del grupo de genes de monocina, se amplificaron los ORF 125 a O^r F 140, SEQ ID NO: 2-17, por PCR a partir del ADN genómico de L. monocytogenes 35152 usando los cebadores oGL-054 y oUC-001. El producto de PCR y el vector DG630 se digirieron con las enzimas de restricción AscI y NotI y se ligaron usando ADN ligasa de T4. Esta construcción se denominó pUC-001. Después de la integración en BDG9 como se ha indicado anteriormente, la cepa integrante resultante se denominó sUC-001. Los ensayos puntuales mostraron que las monocinas producidas y purificadas a partir de la cepa sUC-001 de B. subtilis, que expresa los ORF 125-ORF 140 de 35152 (SEQ ID NO: 2-17), después de la inducción como se indica en el Ejemplo 2, tenían actividad bactericida, como lo demuestra la presencia de manchas en un césped de la cepa 4b 23074 de L. monocytogenes. Por tanto, al eliminarse los ORF 141 y 142 (SEQ ID NO: 18-19), los genes de holina y lisina, una mayor proporción de monocina permanecía en la fracción de sedimento celular en lugar de en el sobrenadante del cultivo en comparación con la producción de monocina a partir de la cepa productora sGL-064 de B. subtilis (Tabla 5).

T l . En n l m n in r i n r m in n ^ h lin li in fr n h lin li in -.

Ejemplo 4

CAMBIO DE LA RBP (SEQ ID NO: 17) DE LA MONOCINA 35152 POR LA DE LA MONOCINA 33090 (SEQ ID NO: 27)

Este ejemplo ilustra que al cambiar ("intercambio de RBP") la RBP natural (ORF 0140, SEQ ID NO: 17) de la monocina 35152 por la de la monocina 33090 (SEQ ID NO: 27), una RBP heteróloga a la monocina 35152, cambió el espectro bactericida de la monocina 35152 al de la monocina 33090, ahora una monocina no natural denominada monocina 35152-33090 (véase la Figura 1C).

Basándose tanto en la posición del ORF 140 (el último marco de lectura abierto de los genes estructurales e inmediatamente antes de los genes de lisis) como en su similitud de secuencia con el de las fibras de la cola del listeriófago, se especuló que esta podría ser la RBP que determina el espectro bactericida de la monocina. Para determinar esto, se reemplazó el ORF 140 de 35152 (SEQ ID NO: 17) por el ORF140 equivalente de Listeria innocua 33090 (SEQ ID NO: 27).

El grupo de genes de L. monocytogenes 35152 codificantes procedentes de ORF 125 a ORF 139 (SEQ ID NO: 2-16) se amplificó por PCR usando los cebadores oGL-054 y oGL-075. El gen de RBP de la cepa 33090 de L. innocua, ORF 174 (s Eq ID NO: 27), se amplificó por PCR a partir de ADN genómico usando los cebadores oGL-076 y oGL-083. Estos dos productos de PCR se usaron posteriormente como molde en una reacción de PCR solapada para fusionar ORF 125 - ORF 139 (SEQ ID NO: 2-16) de L. monocytogenes con el ORF 174 (SEQ ID NO: 27) de L innocua. Para la PCR solapada, se usaron los cebadores oGL-054 y oGL-077. Este producto de PCR se digirió con AscI y NotI y se ligó en el vector DG630 que también se había digerido con las mismas enzimas de restricción. Esta construcción se denominó pGL-033 (Tabla 3).

Los integrantes se prepararon a partir de BDG9 como se ha indicado anteriormente, dando como resultado la cepa sGL-068. Un ensayo puntual mostró que la monocina purificada de la cepa productora de monocina sGL-068 de B. subtilis, que expresaba los ORF 125 - ORF 139 de 35152 con el ORF 174 de 33090, tiene un espectro diferente al de la monocina 35152 de tipo silvestre producida por la cepa sGL-064 de B. subtilis, validando que el cambio del gen de RBP alteró el espectro bactericida de la monocina. La monocina con una RBP heteróloga, un ORF 174 nativo de L. innocua 33090, en lugar de la RBP natural, el ORF 140 de L. monocytogenes 35152, expresado con el armazón de la monocina 35152, se denomina monocina 35152-33090. La monocina 35152-33090 destruía la cepa 19111 de L. monocytogenes, (Figura 3), que es una diana para la monocina natural 33090 y no se destruye por la monocina natural 35152. Por lo tanto, el cambio de solo un ORF (ORF 174, que codifica una RBP nativa) fue suficiente para cambiar el espectro bactericida de la monocina 35152.

Ejemplo 5

EXPRESIÓN DE MONOCINAS A PARTIR DE UN PROMOTOR INDUCIBLE

Este ejemplo ilustra la generación de un polinucleótido que contiene un grupo de genes de monocina y está unido operativamente a un promotor inducible heterólogo, que es un promotor que no se encuentra de forma natural en asociación con un grupo de genes de monocina.

Para generar una versión de DG630 con un promotor inducible que regulara la expresión de los genes de monocina, el Phyper-spank de B. subtilis (derivado del sistema spac inducible por IPTG, SEQ ID NO: 28) (openwetware.org/images/a/a1/Phs.doc) junto con el gen lacI se amplificó por PCR a partir del plásmido DG481 (Gebhart et al., 2012) usando los cebadores oGL-084 y oGL-085. El producto de PCR se digirió con AscI y NotI y se ligó en el vector DG630 que también se había digerido con las mismas enzimas de restricción. Esta construcción se llamó pGL-034. El grupo de genes de monocina, desde el ORF 128 al ORF 140 (SEQ ID NO: 5-17), se amplificó por PCR usando los cebadores oGL-086 y oGL-087. El producto de PCR se clonó posteriormente en un pGL-034 digerido con HindIII usando Gibson Assembly (New England Biolabs). Se utilizó el protocolo estándar del fabricante. Esta construcción se llamó pGL-036. Después de integrarse en BDG9, la cepa de B. subtilis resultante se denominó sGL-071.

Se produjo monocina a partir de sGL-071 tras la adición de isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) al cultivo. Los cultivos iniciadores de células productoras de monocina se cultivaron en 5 ml de medio TSB con 5 pg/ml de cloranfenicol en un tubo de cultivo de 15 ml a 28 ° C con agitación a 250 RPM y se dejaron crecer durante la noche (14-20 horas). Luego se diluyó 1/200 en 200 ml de TSB, 5 pg/ml de cloranfenicol, a 28 ° C, con agitación a 250 RPM para conseguir una buena aireación. Cuando la DO600 alcanzó un valor de 0,2, se añadió IPTG a una concentración final de 50 pM para inducir la producción de monocina. La incubación continuó durante 14-20 horas más. Las células se recuperaron por centrifugación a 6000 xg durante 20 min. El sobrenadante de cultivo y las células se guardaron y procesaron, ya que hubo una "fuga" de monocinas al sobrenadante.

El sobrenadante de cultivo se procesó por ultracentrifugación a -90.000 Xg durante 3 horas. Estos sedimentos ultracentrifugados se resuspendieron en 1 ml de tampón TN50. Las células se resuspendieron en 10 ml de TN50 con 1 mg/ml de lisozima y 250 unidades de benzonase y luego se sonicaron usando un homogeneizador modelo 300 V/T de BioLogics Inc. con una micropunta. Tres pulsos de 30 segundos a la mitad de potencia fueron suficientes para liberar partículas de PTLB. El material homogeneizado después se centrifugó a 23.000 xg para eliminar los desechos. Se recuperaron las monocinas del sobrenadante por ultracentrifugación como se ha descrito anteriormente para los sobrenadantes del cultivo. En un experimento en el que no se añadió IPTG al cultivo, no se observó actividad de monocina.

También se realizó una construcción para dirigir la monocina recombinante 35152-33090 a partir de este mismo promotor inducible heterólogo. Los ORF 128 - ORF 139 de L. monocytogenes 35152 (SEQ ID NO: 5-16) completos con la RBP heteróloga del ORF 174 de L. innocua 33090 (SEQ ID NO: 28) se amplificaron por PCR a partir del plásmido pGL-033 usando los cebadores oGL-086 y oGL-089. El producto de PCR se clonó luego en un pGL-034 digerido con HindIII usando el Gibson Assembly (según las instrucciones del fabricante del kit, New England Biolabs). Esta construcción se denominó pGL-038. El integrante BDG9 resultante se denominó sGL-075. La Figura 2 muestra los datos del ensayo puntual de monocinas producidas por sGL-075 tras la inducción con IPTG.

Ejemplo 6

GENERACIÓN DE UNA MONOCINA NO NATURAL UTILIZANDO LA RBD DE UNA FIBRA DE COLA DE LISTERIÓFAGO A118

Este ejemplo ilustra la generación de una monocina no natural que tiene un espectro bactericida alterado como resultado del uso de una RBD de un fago para crear una RBP heteróloga.

Tal como se proporciona en el presente documento, se descubrió que era posible alterar el espectro bactericida de una PTLB haciendo fusiones con una porción de una RBP natural y una porción de una RBP de bacteriófago. Se requería el extremo N de la proteína RBP para la unión de una RBP a la placa de soporte afín del armazón de monocina, mientras que la porción C-terminal de la RBP, que es el RBD, interactuaba con un receptor en la superficie de la célula diana. Se diseñaron construcciones de polinucleótidos para fusionar la porción de ORF 140 (SEQ ID NO: 17) que codifica las posiciones de aminoácidos 1-40, por ejemplo, con la porción de la fibra de cola ORF 2345 (SEQ ID NO: 21) del listeriófago A118 que codifica las posiciones de aminoácidos 210-357. También se incluyeron cuatro ORF cortos (22344, 2343, 2342 y 2341, respectivamente, SEQ ID NO: 22-25) situados en una posición inmediatamente distal al gen de la fibra de la cola de A118.

El grupo de genes de monocina 35152 desde el ORF 128 hasta la porción 5' del ORF 140 se amplificó por PCR usando los cebadores oGL-086 y oGL-112. El gen de la fibra de la cola del fago A118 (SEQ ID NO: 21) se amplificó por PCR a partir del ADN genómico del fago usando los cebadores oGL-120 y oGL-103. Estos dos productos de PCR se clonaron en un conjunto de tres piezas con pGL-034 digerido con HindIII usando el Gibson Assembly. Esta construcción se denominó pGL-045 y comprendía un polinucleótido que codificaba los aminoácidos 1-40 (BPAR) de la SEC ID NO: 16 y las posiciones de aminoácidos 210-357 (RBD) de la SEC ID NO: 21 más las SEC ID No: 22-25. El integrante de B. subtilis resultante se denominó sGL-092. Todo el grupo de genes estaba bajo el control transcripcional del promotor Phyper-spank. La monocina con su RBP heteróloga recogida de esta cepa productora de monocina, sGL-092, tenía un espectro bactericida alterado en comparación con el de la monocina 35152 de tipo silvestre, demostrando que una RBD de una fibra de cola de fago fusionada a una porción amino terminal, que es una BPAR, de una RBP natural, generaba una monocina con una RBP heteróloga y poseía un espectro bactericida alterado determinado por la RBD heteróloga de la RBP heteróloga resultante.

Las monocinas producidas a partir de sGL-092 tenían un espectro bactericida distinto del de la monocina 35152 natural. (Figura 3, monocina 35152-A118), y se dirigía a varias cepas 1/2a de L. monocytogenes no susceptibles a la monocina 35152 ni a ninguna otra monocina natural ensayada.

Ejemplo 7

AUMENTO DEL NIVEL DE EXPRESIÓN DE UNA MONOCINA POR UNA CÉLULA PRODUCTORA DE MONOCINA

Este ejemplo desvela un medio para aumentar el nivel de expresión de una monocina por una célula productora de monocina.

Para mejorar el rendimiento de la monocina 35152-A118, se generaron nuevas cepas de B. subtilis productoras de monocina en las que los cuatro ORF cortos 2344, 2343, 2342, 2341 (SEQ ID NO: 22-25) que estaban localizados justo cadena abajo del gen de la fibra de la cola de A118 de la monocina 35152-A118 se habían eliminado uno por uno de la construcción de monocina 35152-A118. Se especuló que uno o más de estos ORF podrían afectar a la producción de monocinas. La cepa sGL-153 de B. subtilis incluía solo tres de los ORF cadena abajo, 2344, 2343 y 2342, respectivamente, SEQ ID NO: 22-24. La cepa sGL-154 de B. subtilis incluía solo dos de los o Rf cadena abajo (2344 y 2343, SEQ ID NO: 22-23). La cepa sGL-155 de B. subtilis incluía solo el primer ORF cadena abajo, 2344, SEQ ID NO: 22. Estas monocinas con RBP heterólogas recogidas de estas cepas de B. subtilis productoras de monocinas se aplicaron sobre un césped de la cepa diana de L. monocytogenes 19111. Los datos mostraron que la eliminación de los ORF cadena abajo 2341 y 2342 (SEQ ID NO: 24-25), pero la inclusión de los ORF 2343 y 2344 (SEQ ID NO: 22-23) en el grupo de genes de monocina 35152-A118 mejoraba enormemente el rendimiento de la actividad.

Ejemplo 8

LA DEMOSTRACIÓN DE QUE LAS MONOCINAS SON BACTERICIDAS A BAJAS TEMPERATURAS

Este ejemplo demuestra que las monocinas son bactericidas a bajas temperaturas.

Para determinar si las monocinas pueden destruir a sus cepas diana en condiciones de frío, se realizó un ensayo puntual utilizando monocina 35152 aislada de la cepa sGL-071 de B. subtilis productora de monocina y monocina 35152-A118 aislada de la cepa sGL-154 de B. subtilis productora de monocina. Una vez vertido un césped de una cepa de L. monocytogenes diana apropiada para cada monocina, las placas se enfriaron a 3-4 ° C. Se hicieron diluciones de monocina y también se enfriaron a 3-4 ° C antes de la aplicación. Las diluciones de monocina enfriadas se aplicaron en las placas de agar enfriadas. Las placas después se incubaron durante 3 días a 3-4 ° C. Los ensayos puntuales muestran que tanto la monocina 35152 como la monocina 35152-A118 pueden destruir sus respectivas cepas diana en condiciones de frío (Figura 4).

Ejemplo 9

EL PRODUCTO DEL GEN 2344 DE A118 ES UNA PROTEÍNA DE ENSAMBLAJE DE FIBRA DE LA COLA REQUERIDA PARA LA PRODUCCIÓN ÓPTIMA DE MONOCINA 35152-A118

Muchos bacteriófagos o RBP de PTLB requieren una proteína auxiliar o chaperona para el ensamblaje adecuado de la fibra de la cola para obtener una bacteriocina activa óptima. Este ejemplo demuestra que la monocina 35152-A118 requiere el producto del gen 2344 del fago A118 para este propósito.

Justo cadena abajo del gen que codifica la RBP de fibra de cola del bacteriófago A118 hay tres marcos de lectura abiertos pequeños, ORF 2344, 2343 y 2342, seguidos de los genes que codifican holina (SEQ ID NO: 025) y lisina. Para determinar si alguno de estos ORF codificaba las proteínas de ensamblaje de fibra de cola necesarias, se generaron cuatro construcciones de expresión de monocina 35152-A118, utilizando la misma metodología que se describe en el ejemplo 6, como se indica a continuación.

En resumen, el grupo de genes de monocina 35152, ORF 0128 hasta la porción 5' del ORF 0140, se amplificó por PCR usando los cebadores oGL-086 y oGL-112. El gen de la fibra de la cola del fago A118 se amplificó por PCR a partir del ADN genómico del fago utilizando el cebador directo oGL-120 y el cebador inverso oGL-162, oGL-163, oGL-164 u oGL-165 para incluir tres, dos, una o ninguna chaperona cadena abajo. El producto de PCR de monocina y cada uno de los productos de PCR de A118 se clonaron en un Gibson Assembly de tres piezas en pGL-034 digerido con HindIII. Estas construcciones se denominaron pGL-075, pGL-076, pGL-077 y pGL-078. Los plásmidos se integraron en la cepa A8. Los integrantes resultantes se denominaron sGL-364, sGL-158, sGL-365 y sGL-366, respectivamente.

Una construcción incluía las tres supuestas proteínas de ensamblaje codificadas por los ORF 2344, 2343 y 2342; SEQ ID NO: 024, 023, 022, respectivamente), otra construcción incluía solo 2344 y 2343, otra construcción incluía solo 2344, y una construcción final no tenía ninguna. Se expresaron cada una por separado en Bacillus subtilis y se ensayó la actividad de las monocinas resultantes en la cepa 19111. la construcción que no tenía supuestas proteínas de ensamblaje de fibra de cola no proporcionaba partículas de monocina activas. La construcción que incluía la expresión de ORF 2344 produjo una actividad robusta. La construcción que incluía 2344 y 2343 dio rendimientos y actividad de monocina casi idénticos a la construcción que tenía solo 2344. La construcción que incluía las tres supuestas proteínas de ensamblaje de fibra de cola produjo realmente una actividad de monocina ligeramente menor. (Véase la Figura 5). A partir de estos datos, se concluyó que el producto génico de ORF 2344 (SEQ ID NO: 022) es una chaperona de fibra de cola necesaria para la producción de monocinas y era la única proteína auxiliar o de ensamblaje de fibra de cola necesaria.

Ejemplo 10

CEPA DE PRODUCCIÓN MEJORADA DE BACILLUS SUBTILIS PARA LA EXPRESIÓN DE MONOCINAS.

Para mejorar aún más los rendimientos de monocina, se construyó una cepa de B. subtilis de producción modificada de la que se habían eliminado los genes de profago, las funciones de esporulación y la síntesis del flagelo. Se utilizó la cepa A6 de B. subtilis, que tenía una serie de eliminaciones de elementos de profago entre los que se incluyen el profago 1, profago 3, SPp, PBSX y Skin (Westers et al). La cepa A6 se modificó adicionalmente eliminando la producción de flagelos (Abruja) y la esporulación (Aspoiiga) generándose la cepa A8. El grupo de genes M35152, menos holina/lisina, se introdujo por transformación/integración en A8, regulado con Phyper-spank cadena arriba de ORF 0128, como en sGL-071. La cepa resultante sGL-157 (M35152) tenía una producción de monocina mejorada (típicamente 5-10 veces) con respecto a su homóloga basada en BDG9. (Véase la Figura 6).

Los métodos utilizados para producir esta cepa se detallan a continuación. Se realizaron eliminaciones de genes de Bacillus subtilis siguiendo los métodos descritos en Tanaka et al. (Tanaka K, Henry CS, Zinner JF, Jolivet E, Cohoon MP, Xia F, Bidnenko V, Ehrlich SD, Stevens RL, Noirot P. 2013. La construcción del repertorio de regiones cromosómicas prescindibles en Bacillus subtilis implica un mayor refinamiento del modelo metabólico relacionado a gran escala. Nucleic Acids Res. 41:687-699). La cepa A6 se describió por Westers et al. (Westers H, Dorenbos R, van Dijl JM, Kabel J, Flanagan T, Devine KM, Jude F, Seror SJ, Beekman AC, Darmon E, Eschevins C, de Jong A, Bron S, Kuipers OP, Albertini AM, Antelmann H, Hecker M, Zamboni N, Sauer U, Bruand C, Ehrlich DS, Alonso JC, Salas M, Quax WJ. 2003. La modificación del genoma por ingeniería genética revela grandes regiones prescindibles en Bacillus subtilis. Mol Biol Evol 20: 2076-2090) y es una cepa de deleción de profago. Para manipular adicionalmente la cepa A6, se eliminó el gen cat, que era un residuo de la eliminación del operón pks original. Primero se amplificó el marcador upp::kan de la cepa TF8A KPr-neor::Aupp de Bacillus subtilis con los cebadores oDG1013 y oDG1014. El producto de PCR se clonó en pETcoco1 linealizado con Not1. Este plásmido posteriormente se linealizó con Spe1 y se introdujo por transformación en A6 y se sometió a selección para kanr. Esta cepa se denominó BDG243. Para eliminar el gen cat, el casete de fleomicina se amplificó a partir del casete de fleo de pUC18 (Tanaka et al.) en una reacción de PCR de fusión (sewing PCR) con dos regiones flanqueantes de A6 usando los cebadores oDG1001 y oDG1002, (flanco izquierdo) oDG999 y oDG1000 (casete de fleomicina), oDG1003 y oDG1004 (flanco derecho) y las tres piezas se combinaron por amplificación con los dos cebadores externos oDG1001 y oDG1004. Este producto de PCR se introdujo por transformación en BDG243 y se sometió a selección en placas de fleomicina seguido de la detección de la sensibilidad a kanamicina. Esta cepa se denomina BDG247. El marcador de fleomicina se eliminó cultivando BDG247 en LB sin selección durante 4 horas, se puso en placas con kanamicina y las colonias se repicaron y se sometieron a selección por sensibilidad a fleomicina. Esta cepa, BDG252, era una cepa con eliminaciones (knockout) sin marcadores, útil para realizar más modificaciones. Para eliminar hag, la región flanqueante 5' de hag se amplificó con los cebadores oDG1019 y oDG 1020, el flanco 3' se amplificó con oDG1021 y oDG1022, y el casete de pleomicina se amplificó con oDG999 y oDG1000. Los tres productos de PCR se combinaron y se realizó una reacción de fusión con oDG1019 y oDG1022. Este producto se introdujo por transformación en BDG252, se seleccionó en fleomicina y después se examinó la sensibilidad a la kanamicina para crear BDG253. El marcador de fleomicina se eliminó de nuevo cultivando BDG253 en LB sin selección durante 4 horas, poniéndolo en placas con kanamicina y detectando en las colonias la sensibilidad a la fleomicina para crear la cepa BDG255. Para eliminar spoUga, el flanco 5' se amplificó con los cebadores oDG1023 y oDG1024, el flanco 3' se amplificó con oDG1025 y oDG1026, y el casete de fleomicina se amplificó con oDG999 y oDG1000. Los tres productos se combinaron en una reacción de fusión usando los cebadores oDG1023 y oDG1026. Tras la transformación, selección en fleomicina y detección de resistencia a fleomicina, la cepa resultante se denominó BDG256. El marcador de fleomicina se eliminó, de nuevo cultivando BDG256 en LB sin selección durante 4 horas, poniéndolo en placas con kanamicina y detectando colonias en función de la sensibilidad a la fleomicina para crear la cepa BDG257, también conocida como la cepa A8.

Ejemplo 11

EL ESPECTRO DE LA MONOCINA 35152 Y 35152-A118 ABARCA SEROTIPOS IMPORTANTES TRANSMITIDOS POR ALIMENTOS

La mayoría de las enfermedades humanas causadas por Listeria en Norteamérica se producen por dos serotipos predominantes, 1/2a y 4b (Nelson, K. E., D. E. Fouts, E. F. Mongodin, J. Ravel, R. T. DeBoy, J. F. Kolonay, D. A. Rasko, S. V. Angiuoli, S. R. Gill, I. T. Paulsen, J. Peterson, O. White, W. C. Nelson, W. Nierman, M. J. Beanan, L. M. Brinkac, S. C. Daugherty, R. J. Dodson, A. S. Durkin, R. Madupu, D. H. Haft, J. Selengut, S. Van Aken, H. Khouri, N. Fedorova, H. Forberger, B. Tran, S. Kathariou, L. D. Wonderling, G. A. Uhlich, D. O. Bayles, J. B. Luchansky y C. M. Fraser. 2004. Las comparaciones de genoma completo de cepas del serotipo 4b y 1/2a del patógeno alimentario Listeria monocytogenes revelan nuevas perspectivas sobre los componentes del genoma central de esta especie. Nucleic Acids Res. 32:2386-2395. En consecuencia, se ensayó la actividad bactericida de las monocinas 35152 y 35152-A118 contra un panel de aislados de Listeria independientes. Véase la Tabla 6. La monocina 35152 destruía cepas 4b, mientras que la monocina 35152-A118 destruía cepas 1/2a. Por tanto, puede utilizarse un agente de control biológico que incluya las monocinas 35152 y 35152-A118 para destruir estas cepas patógenas transmitidas por los alimentos.

Tabla 6. Actividad bactericida de las monocinas en un panel de cepas de Listeria.

Cepa Otra Fuente Serotipo Sensible a M35152 Sensible a M35152-denominación (recombinante) A118 15313 ATCC 1/2a No Sí 35152 ATCC 1/2a No Sí 19111 ATCC 1/2a No Sí

DP-L4056 10403s curada de Dan Portnoy 1/2a No Sí profago

DP-L3633 EGDe Dan Portnoy 1/2a No Sí

DP-L3293 L028 Dan Portnoy 1/2c No Sí

DP-L3817 1993 Halifax Dan Portnoy 1/2a No Sí

DP-L1171 Dan Portnoy 1/2b No Sí 23074 ATCC 4b Sí No

DP-L185 F2397 Dan Portnoy 4b Sí No

DP-L186 ScottA Dan Portnoy 4b Sí No

DP-L188 ATCC 19113 Dan Portnoy 3 No No

DP-L1173 Dan Portnoy 4b Sí No

DP-L1174 Dan Portnoy 4b Sí No

DP-l.l 168 Dan Portnoy 4b Sí No

DP-L1169 Dan Portnoy 4b Sí No 19119 ATCC (ivanovii) Sí No 33030 ATCC (innocua) Sí No

Ejemplo 12

LAS MONOCINAS SON BACTERIOCINAS DE ALTO PESO MOLECULAR CON ESTRUCTURAS DE COLA DE TIPO TP901-1.

Todas las bacteriocinas de alto peso molecular descritas hasta la fecha se han relacionado con estructuras contráctiles de tipo Myoviridae (tipo R) o estructuras de Siphoviridae de cola tipo Lambda (tipo F tradicional). Se demostró que las monocinas son bacteriocinas de tipo F basándose en la ausencia de una proteína de la envoltura contráctil y en la microscopía electrónica. Sin embargo, como se muestra en el presente documento, se determinó que las monocinas estaban estrecha y específicamente relacionadas con la estructura de la cola del fago A118, un fago similar a TP901-1 (Cambillau, 2015). La comparación de la proteína de la cola principal de monocina (SEQ ID NO: 8) con las de fagos de tipo TP901-1 (SEQ ID NO: 30, 31) entre los que se incluyen ^a 118 (SEQ ID NO: 32), y la comparación de proteína medidora de la cola y proteínas de la placa de soporte de monocina (respectivamente, SEC ID NO: 11, 12, 13) con las proteínas respectivas del fago A118 (SEQ ⁱD NO: 33, 34 y 35), indicaron que las monocinas descritas en el presente documento eran estructuralmente de tipo TP901-1. Además, tres proteínas reguladoras de monocina (SEQ ID NO: 3, 5 y 6) demostraron tener homólogos de A118 (SEQ ID NO: 36, 37, 38). En la Figura 7 se muestra una comparación de secuencias de proteínas codificadas por el grupo de genes de monocina con las codificadas por el genoma de A118. Por tanto, las monocinas se clasificaron en una clase única de bacteriocinas de alto peso molecular de tipo TP901-1.

Los fagos de tipo TP901-1 tienen una estructura de placa de soporte característica en la que la proteína de unión al receptor (RBP), una proteína homotrimérica, está organizada en seis grupos con tres "trípodes" cada uno (véase Bebeacua C, Tremblay D, Farenc C, Chapot-Chartier MP, Sadovskaya I, van Heel M, Veesler D, Molineau S, Cambillau C. 2013. Structure, adsorption to host, and infection mechanism of virulent lactococcal phage p2. J Virol 87:12302-12312; Collins B, Bebeacua C, Mahony J, Blangy S, Douillard FP, Veesler D, Cambillau C, van Sinderen D. 2013, Structure and functional analysis of the host recognition device of lactococcal phage tuc2009. J Virol 87:8429-8440; y Cambillau C, 2015, Bacteriophage module reshuffling results in adaptive host range as exemplified by the baseplate model of listerial phage A118. Virology 484: 86-92).

Esto da como resultado un total de 54 RBP por partícula de fago (3X3X6). Se sabe que las bacteriocinas de tipo R y F poseen solo seis copias de homotrímeros individuales (18 copias en total). Este es el primer ejemplo de una estructura relacionada con TP901-1 capaz de funcionar como una bacteriocina de alto peso molecular.

SEQ ID NO: 001

Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a 35152

Grupo de genes de monocina (tipo silvestre)

TTATCTGGTTAATAAGCCGTTTCCGGlTrGAAAACTATCTAClTGATCGAGTAGATTC TCG1GCGAGCTAATGGTGATGGGC1TTTTGGAAAGCAGTAGTCCGCTÍTCCCGTAAT TCTTCTAACACTTCAGTTACTCTAGCTCGACTCGAACGACAATAATCAGCTAAGAAC

GiTTTGCGTGAcATAGACTGGAAGCTCAATTGAGCXrrTCTGTTTGATGCAAATGAACiT AC.CTC A ATA ATTTCC ACC A A A AT ACGCGTT ACTTTG ACT ATGGGTGCTTG ATT A AT A TTCTTGT A ATTTTTTG ATGTA AATAAATATCTAACAAT A ACTTCATCAAGT ATAAGAT GGAAAAATTGTGGATTTGCATATAAATAATTGAGAAGAAACTCGCGGTCAATAAAT AG A ACGGT ACCGTTTTCT A ATGCGCG A AC ACGGTATTC AGTA AGTTCgGGCGCTGTT mGílTCGAGrAAACm'CCA'nC'CAAAAAGCGC'G'rG'rrGACCAA'rCAACGCAT'rr ATCATCCAGCGGCXrm:ATTTGTACXjACCTTCTAAAACAGCCtTTCXXTCTAAAATAG C ACCT ATTTGCGGCGCCTTTTCTTCGT AATCTCTAT ATG AATGAAT A ATTTCTCCTTTT TTAAAAGAAATTTTACTTGAATAATCACTAGAAAAAATATCIX3AAAAATCTATCGTG TGAAGCATTATCAAAACTCCTATACTAAGGTAAAATTGGTATTTACCATATTACTG i ACT GCTATTTGTG tC A A A A AG ATACCG A AT A A A A ATCGTGTTCACA ATTTAG ACATG AAAAAGTCACTnTTAGCAACAATTTTAíTrGATTTTATCAATAAAAACTrACnTTTC TTCCCTGGAGAGATATCCAACCAAAAAAAGACCCTCCgTAGATAGGAGAGTCTTTCA AAACTTCTTGTAAACATCAATGGAA1TGCCAAAATTAÁTGAAATATCCACCATAATC ATACATTGGACX:ATATlTrrcCGCGTAATGAGAAACTGTATGGCGCAAAAATTCTTC TGTTACCTCTAAAAACTCCGCTACTTCAAAATATTCTCGTAAGCCTAGATAAAAACA AGC A ATG ATGTC ATC A AGcGGT ATfAG TTCCTC AT A ACCTTTGCG ACG AGCG A A A AT TTCTTGTTTTTT ATCC ATG ATTGTTTCCTGTTTGGTG AT ATT ACCT ACAGTGT ATTTGT AATGCATCAATTCTTCTACTAAAACACAGCCTTTTTCAATGGAAGATTGATCCTTACT AATAAAAATCATCCCATTTAAATAAAGTCíXGGAAGTTTGTAAGGCATTTTCTCTTC TCTG ATTGTT ACCTC ATCTTGGT ATTTATTTACC A ATTTTTCGT A C A ATA A A ATC ACA TCCCGCGATGGAGTrrTrTCnCATCTCTATATAAGCTAAAATATCCCGCA r n C T íC CTCGGTTACGTCATCATCAATATCK3GCTGCAATTG'n'ACCAAGCGTTCATCAACAGG GGGTAAATTTCTTTCAGGAAAAAAGTCATCTAATCGTTTGTTGAAGATTTTTGCAAG TTCAAATAAAACATCT1X5ATTTGC1TTTCGATCACX:ATTTTCATAACGGCTAATAGTT TGGCG AGTTGT ATOA AGCTTTTCTGCT A ATGCTTCTTG ATTTA AGCCTCGTTCCTCGC GATATTGTTTTATTTTATTTCCTACAAATTTATTTAGCTCCATAATAATTGTCCTCCAT ATOTTTATGCiCITCAGTATAGCACmTAGCACCAAAACriGAAGTTnTCGAACATA TTTGTCGCAT A A AGTTT ACC AGT A ACC A A A ATGGTGCTATAAT ATTTGT AG AGCTAG AAAATAAAtGCGGCTGATTTTGCACcGATAGCACCGAATcGGTGACAAaaCTAcTATAT TAA1TTATGAGATGGAAGTGGGAATGGA1XX3ATAGAAAACTTTTAAAAGAAAAGCA A ATCCA ACT A ATTTTTC A ACT A C A AC A AG A AG A A A ATCG ATTT ATTCG A A AGCGTTT GATAGAAGAGTiriGAGTTTTTTGAAGCACTTGGGGATAGGGAAAAAGGACTTCTAA CGGCGG AGC A A A AGTTGCTT ATTTTAaC ACCTAGTG AGTACCG AG A AT AC A A A AG A A CCAAATCAGATGTGCAAATTAGTAGGATAATTGGAGTATCGAGATCGTCACTTGCAG AATGG AAaCG A A A A A A AGGTTTA A AT AG A A A A A AGTCGC A ACCGGTTCAGC AG G A A ATG ATTGATGT ATT AGCTTTTC ATTT AG ATA A A ACA A A AG A AG A A ATT GGCGCTTT A CCrG CnCG G CG ATI G A A'IGTC AGT ATG AGGCITn'GTG ATT A A TG A AGCC A ATA AT TAAGGAGTGATAAAATGCAGGTT1TAGTTTTACCAGAAAATAAGGATATCAATTATA TAAAAACGGTCCAtGAAGTAAAACGATTTTTTGCGGATTTCGAGAGATTTCGGATGA TTACGGGGTTATCAAAAAAGCCACATITACrrAGAAATGGTTTTCTCiGAAGAGCCGC AGTTTG AGCCGGT AGC ATTTTCTGCT AG ACATA ATA A AG AgGTC ATTTTGG AAC.CGC GATGGTTGGTAGAGAAATATACTGAAATGTTCAATCAGATGGATGATTTATATCGAA CTATTTTGATGGAATGTTACGTGGAACGAAAACAAGATGTGGOGGTAATGATGGATT T ACCGTATG A A ATTGCCC AGTTTA AACGG ATAA A A A A ACGgGC AGTGCTAG AACTTG CAACGCTAATGGGAAITTTAGTAAGGAAATGATGATACTTTCGTGATATnTGAAAC ATC ATTTTCCT ATT A AT AT AG A AGTAAGCTA ATTGTCC ACTA AGCGGATG ACA ATA A AAGCTGCATCAGAATGAAGGTGCACCGATTTTCTGATAATACATGATGTTTTACAAG AAAlTrGTTTTTATGATTGGATTTAAATCXXiTTGAGATAAACAAATATTCTATTTTGG AAAG TAA AGTTCGG AGGA ATA A ATT ATT A A ATGTGGTCTTG ACCG A ACTTTGCTTTC TGTTTT. 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CaCGTTTTATCGACTTGCATAAAAAACGTCAGAAGAAAGCCGATGTTAATTATACAG TA AATGCACTTC AAGCA ATTTCCG ATA ATGAAGCG A AGG AAGGTAA AGCGTGG ATT GATCGGATTTATGGTGCAAATGGGTTGCGAAGACCTAAAAaTAAAGAAGAAAGGGG GAAAATGAATGGCGGAgTCTAAAAGTaTTACATTTGAACTgAACGAGAGCGTTlTAA C AGCGC A AGTTGGC AGGCT AG ATG AgATGGCG ATGGTTGTAG AGCggCG gTTTTCAG AGCTC^AAATGACTATTGAAGATGTTGGAAATGCTGATCCAGGTTCGAAAATTTCCG AaTCITTAGGTGGGCTGCAGTCTGGGCTTGGCACGATTAGrrCGGCGriTGGACAGCT GGGTTCTAGTAGTGAGGCGATTACATCcGGATTCGGTACTGCGGTTGGTTCTGTTGGT GGAATCACGGATGCGTTTAAAAATCTAOGTTCAAGTGTGCAAAATGGTACGTTATTT TCAAGCTTGGCgACtGGAATTGGTGGCATGAGTACgATGCTTGGTGGAGTATCTGGCG GcGTTCAAGGAATTACAAATCTAGCTAGTGGATTTATCjGAAITGAAGAATCATTTAG GCGCnTrGATGTCTTCTAlTOGCGGCGTTCXiTGGAATTATGGGTAAACTGACTTCTCC AATGGGGTTAGTAATTATCGGGATTGTTGCGCTAGTTGCTGCTTTTACGTACTTGATG ACGACGAATGAATCGTrCCGAAATACC’GTGATGTCAGTCGTAACGCAGCiTTGCGCA GTTGTTCGGGC AACTTGTCGCTAGTTT AATGCCGATTATTATGCA AATTGTT ACTGCG GTTATGCAAATTGGTGCCGCGTTAATGCCGATgGTTATGCAGTTTATTAGCTTTTTTG CCCAGTTGTTAGCTCAATTAATGCCArn'ATTAATATGCTGATTTCrATGCXrATGCC TGTTATTATGCAGATTGTTCAAGTTGTT ATGTCGCTTGTTTCAGCGTTATT ACCA AGC ATrATGACAGTGATCCAAGGCATTATGAGTGTTATTCAATTTTTAATTCCGATAATTA TXX!AAATCXXX3ACGGTGGTTGTACAAATTGTTGTAACGATTATTTCTTATATAAGTA AAATTATGCCGATTGTtATGACGATTATTGGCGTTATTGTTTCGATTATCACaACGATT ATTAGtTAcGTcGTTATTATTGCgACGACgATTGCtAGtGTTATTGGGAAAATTATTAGC TTTATTGCg AGTGTTATTACgGCGGTT AT CGGG ATTGTGC A ACCA ATT ATTCCCTTT AT TACCAATATCTTTACGACTATCGTGACAATTATTGGTGCAGCTTTCCAAATGGTATTT ACTCTTGCATCCAAAATTTGGAATTCCATTATGTCGACTATTTCCGGAATTATTGAcG G AATC AAAGCAGTCATC ACAGGT ATTTCT ACTACAGTTTCATCAGTGTTT AAcGGAG TGAAGCX3CATTATTACAGGTGTTTTTGACGGAATCAAAAGTGCTTGGGGTGGTTTAA CrGATTTTGTgGG A A ATATTTTCG ATGGTGTTTC AAgTGGA ATICA AAC AGTGGTAG A C AATGTC A A AGGTTTTGT A AACGT gGT AATTCG AGGgATTA ATGG AGCC ATTGGTTT A A 3T A A T A A G A IT C C A G G AGTTG AAATC G G C AAAATACCG C AAT rAATT TC CG G AAC A AC AA ATTTCC AAGGTGGCTTTGCTCG AATG AATGA AGGCGGCCG AGGTG A A ATGG TTGTTTT ACCGTCTGGTT CTC A AGTA ATTCCGC ACG AT GCA ACG ATG A A ATACGC A A G AGAAAGTGCX3CGCGGAAATAAATCAATGCnTACACGAGTCAAGCíCGCr(}ATTTG GCT AG AGTTG A A A ATCTTCTCG AGCGCTT ACTAC A A A A A A ATCCTGT A ATC A A A ATG GATGACAAAGTGGTAGCTGAGGTAGTTAGCXX ^jTAATCAAGCTAACTCATTTGATCAG TACAACTATACAATGGGAGGTGCAGCTTATTCATGAGtGACTTGTTTTTAGAATTAAA TGGAAAAGTGCATTCGCTTAGTGAGACAnTCCAGGTCTTTCTGTACAAGAAGTTTC G AG ACAAAGTCCCCAG1TAAGCATGGAAACTGCTGAAATAGCTGGGACTGATGGGG TTATCCCgGGA ATG ACCC A ATTTA A ACCGTTTATCTTTTC AGC A AAATGT AATTTCCA AGCACTTGATATTCCaGATTAtCATTTGGCAGTCAGAGAAATTTATGAATTTTTATTTC A AC'GGCí AT AGTT ATT AT ATTTGG AGCG ATC A A ATGGC ACrG A ATTCCíGl'ATCi AGG TGC ATCCT A A AC C AGTTG ATTTT AGTCG AG A ATCGG ATCGTGTTGGtTT ACTCACTAT AGA ATTTGATGTATTTAAAGGCTATGCGGAGTCACGTGGCACGACiCCTTGACCCaATGAC 'H T IG A AGTGCr A1T T A1GGC'Ag ATGGCi A ATG A ATCF A 'K G A ACCCi'lCí A 1G A T IT A 11 T T ATGTTTTTAG AG AA AATACATTTCGGGTCT ATA ATGCGGGG AGCGACCGTGTT AAT CC AC I Ci A IGCG AC A IG A ATTgCi A T ATI CiC F A 1G ACGCiCG A ATGGG AC ACC A ACG A TI C AT A ATCTTACA ACGGG AG A ATCCTTCG AGTATCGG AA AG AGCTAC AA A A A AC AG A TGTTTT ACTGTTa A AC AAT ATTT ATCC ACTTGTT A AT A ACCGcCGT GTT GG A A A AG AT ACCAATCATGGGATTATCACCCTTGAAAAAG G CTGG AACG ATTTTG AAATCAAAG G TGTA ACGGATGTA ACG ATTGCTTTT A ATTTTCCGTTC ATTT ATCGGT AGGTG AT AG AT ATGG A ÍT A I GI GA TI A rrC ’A A A G TATGG AC A AAGAAGTGG AAGAGATTCTaACAG AC ATtCi ATrACGGCTTCCTÍTTCCTACG ATT ATG A A AA A A ATACA AGTCGTGCTATtTCGTT TACTGTGAAcAA AACG AAACAG A ATGC AGC A ATTTTTG ACTTGGTAGG A A ATOA AG CAATTTTAACATATCAAGGGCAGCAATTTGTTATTAAAAAATGTACGCCAAAATCTA TTGG AGG AAC AaTTTC A A AGC AG ATT ACGGCCCAGC AT ATTTGTT ATAC AGTGCA AG AIGATGTGCAGTATAACGTGAAAl'CrGGACGAAAAAAATATTCGATTCAAACGGTA TTGGAATTTGCGTTACAACATAATCTACTAGGATTTTCTTATGAAATTCAAGGGAGT TTTCCTTTAGTTGAATTAGAGGACTTAGGAAATAAAAATGGCTTAGAGCTAGTGAAT TTATCTTTCXJAAGAATTCGGAGCAATTTrATlTGCAGATAATAAAAAGCTnrATTnT ACG AT CAAA AA AGtTGGT ATGT A AgG AC AGAGA AGC A ATTTCGTT ATTT ATATA ATA CAG A AG A AGTTTCGGTGG ATACG A AC AC AG ACA ATTTG A AG ACGG AG ATA A A ATGT T ACGGCAAGCA AA AAGAGA ATGCCG AT AAGCTG ACTGG AGAT A AT AAGT ACATGGC GGTTGTC ACGT AT ACTTCGCCa A ATG AGGCT ATTTACGGG A A ACG AATGGCAA ATGCt AAAAGTGATGACAAAATCACGAACAATGATGACrTATTAATnTrGCAAAGAAGCA AATTCTAGATGTTCCgGAgACgGCGCTTACTATCGCTTACAAAGGAAAAGAACCTGTT TCAGAGCGGGATGTTTGGTATTTCATTCATGAACCGATGGGGTTTGAAACAGAAGTA AAAGTAACGAAAATTAAATCGAGTCATCCTTGGAGTAAGAAGTTTCAAGAAATTGG CTTC AGT A ATTCGCG ACGgG AT ATGGTCCG A ATTC AA ACGCA AATTGCT AATCAAGT GAAAAAAGCGAGCGTAGATACAAATAAAATtAATTCGTTTTCGAGCATCGCAATGAA TGCTTATGATTCACGAATTTTAACGGAAGTAGTAGGTGTGGTAGATGGCGACTGAAA TTAGAGTGTTAAAAAATGTAGATGATACAGTTTTCTATCCGAAGACACATGTAACGG CCGTGGAAGGTTTAGACTCGGCTACAACTACTACATCTGGATTAATGCCCGCCAGCG ACAAAACGAAATTAAATGGAATCGAAGCTAATGCAGAAAAAAACAATGTGACTGCA ATCG ATATTGCCA ATTGG AAT AA A A A ACAGG ACGC A ATTTTGGTTTCTG A A A ATGGT TCTA ATITCAA A ATAACTGTCAC A A ATGCTGGTG A A C IA A AGGC A ACA A A AGTOGA AT AGG A AGG AGGTTGCGT ATG A AGTTGG ATTT ATGG A A ATGGG AA ATGCTTCTTCA AGGTCG AG A ATTT AG A A AT A A A AC A A ATG ACA ACTGGC A A A AATTG ATGG ATTGGT CCGATTTTATnrAACAGGTTTAAGCGCGATrTATGTCTATGTAAATAAAGCGGATG CTACCTTA A ATA ACA A A ATTGAT ACCGTGG ATA AAGCACTA A ATGC A AGGGTT A AT G AGCTGATTAGCGGGAC AG AGCAGCTA AGTG A AGTGGIT GATGCGAG ATCAG ATGC GTTTGGTGCACGATATGCTGTGCTAAGAGAACGTTTAAACCAAGAACAGCTTAACTT TAGCAAAAAGAGCACGATTCAATTTGATGCGAGTACTATCATAAGTATGGAAAAAC AAGATATTGGGCrGCTAACAAGTAAAAAAATCTCAGAAGCGCAAACCGTATGTTTTT T A A AT ATATC A AGCCTCG ATG A AG A AGCaG ATATTGT tCTTG A A A A A A C AGGtG AG AC AAGCTTCTCaGAtAATTTAACgAGcCTAGTCTTTGCgAAAATTGGAACGAATGAACGC TACCAAATGGAGCCAGnGGTGCATAAAGGAGGAGTGAGCgATGACTGAAATAAAG CGAATGC raCAGAC A AA AG AAGATA ATTCAAAAG AACA ATTTTATCCAÍ }A< í ACGCA TGTTGCgGGGA'nGTCGGG'ITGACaGAATATGTGTCAGGTCAGCTTCCGACgGGtGTG GTCAGTGTgAATXKjTAAGGCaGGtCGCGTGITaCTgGATGCtGAAGACGTtCACGCTGCa AAAAAaAGCCACAcCCAtGAAGTCGCAACATACACtACGGAtGGCTTTATGAGTTCTTT IG ATAAACAA AAGATi'G A FC’AA IT AGTrrCACCgGAAGCTGGCG 1G ACAAG CA TAAA TGGT A A A ACAGGG ATTGTTG ATTT ATTCGC ATCGG ACTT AG ATGC AGCAG AGAT A A A CCACACgCATGCAGAAGCaACtACTACAGAAAGCGGTTTTTTatCAAtcGAcGACAAAG AAAAAiTAGArtjCGATaCAAgTAATCCXTGCTGGAAACTATTAAGGAGGTTATAGAATG ACTA A A ATTGTAAA A ATGTCAG AGA AgA ATG AAC ATGGA ACtcTaG AaC A ATTCTATC CAGAAACACAtGCaGAGGCTGTTAAAGGaCTrGl'GtcgGTTtCAGAgGAAGAgAAaACaAt TTGCGATCAAAAGGAAAGTACGGCGGGTGCAGAGCAAAAAGCAAACACAGCCTTA

A AT AGTGCT A A AG ATT ATGTCG AT ACG ATAGGTG AAGG A ACGGTC. ATTTTT A A AGG

CGCTAACCTTATGGGAGCTGGCCAATCATTTAAATGGGACGC1TCTAAACTGAAATT

TGGG ATG ACTTTGTT ATTT AGTCGCTATG ATGCGGC A A ATA AT ACACCGC A AG ATT A

TTATTATC A1TCTGT ATTCTT ATCr A AGGC ACA A'ITAGTTG AGCTTGC AGG AA A AGGT

ATTTTAGTTCAAATGCCATCAACGAÍ TTATGGAGATCGAAAATATCTGTATGTTTCA

ACAACTGGGTTATCTGGACATTTTGATAATTCGAATTATGCGGCTTGGGCTCTGCGC

CAAG'l AAC A A 'n ATGTAACTAAAA AGG AGG rnrC C A TG G A AGTCATACrA AAATTC

GGG ATTTT AGGTTTTGGCGCG ATATTTGG AT ACTTGTTTGGGG A AGTGG ATTT ATTG

GTAAAAGTGCTGGTGTGCTTTATTGTAGCTGACTATATTTCTGGGCTACTCGCTTCAG

GGTATCTTGGGGAACTTAGCAGCAAAATGGGTTTCAAAGGAATCGCGAAAAAAA1TC

GCTATCTT A ATTTT AGTGGCT ATTGCGC ATC A A AT AG ATTTG ATTCTGGG A ACGCAT

^{a a f a c a a c g c g c íg a i gc}’^{g g i i a} re r n i rci'A 'm 'A G CG A A r GAGCi ^{g a} r n c T A r c r TGGAAAArrrCGITCGAATGGGAATGAAGGTCCCGGAAGTATTGAAAAATÍTAA'rTT

TG ATTTTCG ATGC A A AGTCAGG AG AGG ATG AGG A A A A ACATG AC A A AG ATATGG AT

TGACGCTGGAC AcGGTGGTA AGGA ITCAGGtGCG AGTGGTA ATGGACTTGTTGAA AA

A A ATTGGGT ACTA ACTGTAGCA A A AC A ACTTC A A ACAGAGTT AGTTAA AGCCGGTTT

TGAAGTGGGAATGACAAGAACAAATGATACATTCTATGAATTAAGTGATCGTGCGA

AG A AGGCG A ATAGTTTTA A AGCI'Ci ATTT ATTT ATTTCGCITC ATTTTA ATGCTGGTGG

CGGT A A AGGAT ATG A AG ATT AT ATTTAC ACATCCGTCCCGGCTGC A ACGGT AG A A AT

ACAG A A A ATA ATTCAT A A AA ATATF ATTACT A A AGTT ACF A A ACACGGA ATG A ATG

ATCGTGGAATGAAGAAAGCTAATTTCGCTGTATTAAGAGAAACAGCAATGGATGCT

ATCTTACTTGAAGCTGGATTTTGCGATAGCACTGATGCATTAATTCTTGAGAAGAAA

GC'rTATCAAACTGA'n'ATI'G'm'AGGAATrGTAl'CAGCAGI'ACAAGAGalTTrrGGGG

CT ATGGT A ACA A A AT ATAGGGC AGGC A A ATATTTG ACA AGTG ACG ATGCTAT ATC A

GGCACA AATATTAA AGGATATTTAGAAGCAGGAACAAAGGTTTTTGTTT ATA AAGA

AACACiAAAAAACGCrTAATlTAACTACrACAAAGGG'I’GlTCCAGGAAGCrrGGGTTrr A A A A AC AG A AGTT A AT ACAGG AA A A AGATA A

SEQ ID NO: 002

Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a 35152

ORF 125 de monocina

>regulador transcripcional MLHTIDFSDIFSSDYSSKISFKKGEI1HSYRDYEEKAPQIGAILEGKA VLEGPTNEGRWMIN AUGQU A LFG MfLSLLírr KI APEiLTEY R VR ALENGTVLIT DRIIFLLN YI.Y AN PQFFHLILDE VIVRYLFTSKNYKNINQAPIVKVTRILVEIIELLHLHQTEGSIELPVYVTQTFLADYCRSSR AR VTE VLEELR ESGLLLS KKI^FISS HEN LLDQV DS FQTGNGLLTR

SEQ ID NO: 003

Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a 35152

ORF 126 de monocina

>proteína hipotética

LYEKLV N K YQDEVTIR EEKM PY KLPG LYLNGM11TS KDQSSIEKGCV LVEELMH YK YTV GNÍTKQETIMDKKQEIFARRKGYEELIPLDDIÍACFYLGLREYFEVAEFLEVTEEFLRHTVS H Y AEKYGPM Y DYGG YF1NFGN S í D V YK KF

SEQ ID NO: 004

Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a 35152

ORF 127 de monocina

>supuesta proteína represora MELNKFVGNKIKQYREERGLNQEALAEKLH'rTRQTISRYENGDRKANQDVLPELAKIFN KRLDDFFPERNLPPVDERLVT1AAHIDDDVTEEEMRDILAYIEMKKKLHRGM

SEQ ID NO: 005

Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a 35152

ORF 128 de monocina

>antígeno D

MDRKLLKEKQIQLIFQLEQEENRFIRKRLIEELEFFEALGDREKG LLTAEQKLLILTPSEYR EY KRTKSDVQISRIÍG VSR SSLAE W K RK KG LN RK KSQPVQQEMIDVLA FH LDKTKEEIGA LP AS AIECQYE AF VINE AN N

SEQ ID NO: 006

Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a 35152

ORF 129 de monocina

>antígeno C, regulador transcripcional MQVLVLPENKDINYIKTVHEVKRFFADFERFRMITGLSKKPHLLRNGFLEEPQFEPVAFS ARHNKEVILEARWLVEKYTEMLNQM DDLYRTILMECYVERKQDVAVMMDLPYEIAQF KRIKKRAVLELATLM GILVRK

SEQ ID NO: 007

Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a 35152

ORF 130 de monocina

>antígeno B LSFMRVLEAVRTMLQEKGGLDVSIVMRNQVEMPTTMIEMIDQEEEESQTAWKEKYRFA

1HHYTNEQDLAGVEKIDTLIQMGFILPEGYKLVAVRHCGKQNLVKENTL1HAKTSFEVSI CRELKVKI

SEQ ID NO: 008

Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a 35152

ORF 131 de monocina

>antígeno A, proteína similar a cola de fago

M AFEEN LYCD YTPG AAKAVAG KD VILAVFN AAG D KLLAVAG Q Q GLTVN RSKD SIEITS KD TVGG W KSKIG G M KEW SIEN D GLYVAD AESH KELAKYFESD SPVCVKIIN Q ASKKG L FGGLAIVADYSFEAPFDEAM TYSVKLDGM GALVDLTITEGGDQM PGETPVAPAE

SEQ ID NO: 009

Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a 35152

ORF 132 de monocina

>proteína hipotética

M FEVN DTTYILRFN KQKVKTVELTSGISLVAALTAN KGILSYQVIETLFVSGLVEEKGLV PVKQKEALEIFDKLVEEQGLISLNVAVIEKLQEDMGFLFR

SEQ ID NO: 010

Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a 35152

ORF 133 de monocina

>proteína hipotética, similar a fago MNHDFDLEKQFAFFVVNFQMSKHDFEELTEVEKNFIMKEWENKVIFESTMLRNAVLNA EQNLNRKRNSRFIDLHKKRQKKADVNYTVNALQAISDNEAKEGKAWIDRIYGANGLRR PKNKEERGKMNGGV

SEQ ID NO: 011

Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a 35152

ORF 134 de monocina

>proteína medidora de la cola

M AESKSITFELNESVLTAQVGRLDEMAM VVERRFSELKM TIEDVGNADPGSKISESLGG LQSGLGTISSAFGQLGSSSEAITSGFGTAVGSVGGITDAFKN LGSSVQN GTLFSSLATGIG GM STM LGGVSGGVQGITNLASGFM ELKN HLGGLM SSIGGVGGIM GKLTSPM GLVIIGIV ALVAAFTYLM TTN ESFRN TVM SVVTQVAQLFGQLVASLM PIIM QIVTAVM QIGAALM P M VM QFISFFAQLLAQLMPFINMLISM LMPVIM QIVQVVM SLVSALLPSIMTVIQGIM SVI QFLIPIIMQIATVVVQIVVTIISYISKIMPIVM TIIGVIVSIITTIISYVVIIATTIASVIGKIISFIAS VITAVIGIVQPIIAFITNIFTTIVTIIGAAFQMVFTVASKIWNSIMSTISGIIDGIKAVITGISTT VSSVFNGVKRIITGVFDGIKSAW GGLTDFVGN IFDGVSSAIQTVVDNVKGFVN VVIRGIN GAIGLINKIPGVEIGKIPQLISGTTNFQGGFARMNEGGRGEMVVLPSGSQVIPHDATMKY ARES ARGN KSM LYTSQG ADLAR VENLLERLLQKNPVIKMDDKVVAEVVSRNQANSFD Q YN YTM G G AAYS

SEQ ID NO: 012

Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a 35152

ORF 135 de monocina

>componente de la cola del fago MSDLFLELNGKVHSLSETFPGLSVQEVSRQSPQLSMETAEIAGTDGVIPGMTQFKPFIFSA KCNLQALDIPDYHLAVREIYEFLFQRDSYYIWSDQMPGIRYEVHPKPVDFSRESDRVGLL TIEFDVFKGYAESRGTSLDPMTFEVDLWQMGMNLSNRDDLFYVFRENTFRVYNAGSDR VNPLMRHELDIAMTANGTPT1HNLTTGESFEYRKELQKTDVLLLNNIYPLVNNRRVGKD TNHGIITLEKGWNDFEIKGVTDVTIAFNFPFIYR

SEQ ID NO: 013

Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a 35152

ORF 136 de monocina

>proteína de la cola del fago MDYVIIQSMDKEVEEILTDIDYGSFSYDYEKNTSRAISFTVNKTKQNAAIFDLVGNEAILT YQGQQFVIKKCTPKSIGGTISKQITAQHICYTVQDHVQYNVKSGRKKYSIQTVLEFALQD NVLGFSYEIQGSFPLVELEDLGNKNGLELVNLCLEEFGAILFADNKKLYFYDEKSWYVR TEKQFRYLYNTEEVSVDTNTDNLKTEIKCYGKQKENADKLTGDNKYMAVVTYTSPNEA IYGKRM ANAKSDDKITNNDDLLIFAKKQILDVPETALTIAYKGKEPVSERDVWYF1HEP

M GFETEVKVTKIKSSHPW SKKFQEIGFSNSRRDM VRIQTQIAN QVKKASVDTN KIN SFSS IAM N AYDSRILTEVVGVVDGD

SEQ ID NO: 014

Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a 35152

ORF 137 de monocina

>proteína hipotética, similar a fago MATEIRVLKNVDDTVFYPKTHVTAVEGLDSATTTTSGLM PASDKTKLNGIEANAEKNN VTAIDIAN W N KKQDAILVSENGSN FKITVTN AGELKATKVE

SEQ ID NO: 015

Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a 35152

ORF 138 de monocina

>proteína hipotética

MKLDLWKWEM LLQGREFRNKTNDNW QKLM DWSDFISTGLSAIYVYVNKADATLNNK IDTVDKAVNARVNELISGTEQLSEVVDARSDAFGARYPVLRERLNQEQLNFSKKSTIQFD ASTIISMEKQDIGLLTSKKISEAQTVCFLNISSLDEEADIVLEKTGETSFSDNLTSLVFAKIG TNERYQMEPVGA

SEQ ID NO: 016

Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a 35152

ORF 139 de monocina

>proteína hipotética

M TEIKRM LQTKEDNSKEQFYPETHVAGIVGLTEYVSGQLPTGVVSVNGKAGRVLLDAE DVH AAKKSH TH EVATYTTDGFM SSFDKQKIDQLVSPEAGVTSIN GKTGIVDLFASDLDA AEINHTHAEATTTESGFLSIDDKEKLDAIQVIALETIKEVIE

SEQ ID NO: 017

Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a 35152

ORF 140 de monocina

>proteína de unión al receptor

MTKIVKM SEKNEHGTLEQFYPETHAEAVKGLVSVSEEEKTIWDQKESTAGAEQKANTA LN SAKDYVDTIGEGTVIFKGAN LM GAGQSFKW DASKLKFGM TLLFSRYDAANN TPQD YYYH SVFLSKAQ LVELAGKGILVQ M PSTTYGD RKYLYVSTTGLSGH FD N SN YAAW ALR QVTIM

SEQ ID NO: 018

Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a 35152

ORF 141 de monocina

>holina

M E VILKFGILGFGAIFGYLFGEVD LLVKVLVCFIVAD YISGLLASGYLGELSSKM GFKGIA KKIAILILVAIAHQIDLILGTHNTTRDAVIFFYLANELISILENFVRMGMKVPEVLKNLILIF DAKSGEDEEKHDKDMD

SEQ ID NO: 019

Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a 35152

ORF 142 de monocina

>lisina

MR KN MTKIWIDAGHGGKDSG ASGN GLVEKN W V LTV AKQLQTELV KAGFE VGMTRTN

D1PYELSDRAKKANSFKADLFISLHFNAGGGKGYEDYIYTSVPAATVE1QKI1HKNIITKV TKHGM NDRGM KKANFAVLRETAM DAILLEAGFCDSTDALILEKKAYQTDYCLGIVSAV QEIFGAM VTKYRAGKYLTSDDAISGTN1KGYLEAGTKVFVYKETEKTLNLTTTKGVPGS WVLKTEVNTGKR

SEQ ID NO: 020

Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a 1144 (DuPont)

Fibra de la cola del profago A118 y ORF cadena abajo atgacaaatcaaatctttaaatcagctaitcttgatttttctgltagtgcacagaacgctaaagctaatgttcctcagataaaatttagtacgeaaga ctctggagggaetgcgcgattaaagtttactgcaaaaaaagatgataacaatttaccactttcaagcgcggcagaggtaacgcttgctatggt attgtctgttggcaaaaaatacgaaagtagctacattgttaatccagaaataattaacagaacagaaggtgtttttgaafactcattgactgatga gcaaataagicacgacggacaagetaatgcagaattgiacgttaaatatccaaatcaaaeaatgcaaatcaatcguttagitttguaugaaaa agcgatgattgatgataattttttgcccgttgctacctattatgttgaaaaatgggatgattacgaaaaaatatttaacgaaaaagtggaaattctt caaaatgaaaügatgautgcaaggacaagctactgaattaaaaaacacattegatagtcuaatccagaccaatuceccaaaaagcagaut tgaaaaicatataaacaacacaaacaticatgtgacgatgactgataaaacaaattggaatacaaaagaaaatactgcgggatcacaagcaa aagcggatagtgcattaaactctgctaaagcatatacagatagcaagatggatagttacggagcttggataaatgtacccctcgcctctggtta ctcaacíggcgacagtaatacacctcaatatcgactggtagcaaaacaaacttctaccggtttgaaaacUttgctgaattccgcggatcagtt gctggtacatttattagtacagcaaatagtactcttgcaacaatgcccgctggcacaagaccaattgtcacttattacggtgcfgccacttcaaa taacgggaacggtggtcgtaítgctattccagttgacggaaagctattacaagtgtcatctacagataatgctaatccttcgtacgtaagcctttc aacgatattatacgaaguggcaauaggaggagtaaacaigaactataaacagttitacgcatatgaigaaaatggcaauatctcgaaacaa tacttgtgtttgaagatgaaaaaggtttaatcaatcaaccgaaaaattctacaaatattgaacctíccataatcgaaaacggcatagcaagagc aaigtattatccgcgttggaatggggaagattgggacgaagacaagaaaagatgggaattagaaaatccaatcatacccgcagaaaaaac ggaaaiagaaaaattaagagaggaauactactcacccaagaagcgttagcggcatigttcgaaagtaatttagggtgatgaaatggcttata tgataccaatttacgtgaatttagtgatgaataatcgaaaaactattgaagaagttcctgcgaatttgcgaggtcaggtaaaagcaaaagtgga igagctaaaacaagaacaacaacgaatacagtcagaagaaaiagaagccgaataggcitauttttatgggggatgatgaaaatgtatgatg gactaacaaaagtttttgattatgctttagcgaaagaaatgttcttcgcggcgctctttgtagcgctttttataatcttactaattatcacaaaaaga atttgggatgattcgaaaattgtaagaatagaaatgaaagaagaacgcgaaaaagtggaggaagaacgagagaagcgtaataaggaatcg aaagaagagagagaiaaaittaiaagtacgatgaacgaacaacagcgattgatggataggcaaaatgacatgatgaaacagcaacaacaa tcaattgacagcttgtctaaatcagtcggaaagttagctcacaaagtagatttgttggaacacaaaataacgaagtgaaggatgatagaaatg gagtttggaaaagagttactagutaeatgacatttuagtagugtaacacctgigíttgucaggcgauaagaagacggagttagtcccgtcta agtggcítccgactguagcaiacttattggtgciattctgggcgcauagcaacgtttttggacggctctggatcgcugcaacgatgautggg caggcgctttagcaggagctggtggtactggattatttgaacaatttactaatcgaagcaaaaaatatggagaggatgataaataa

SEQ ID NO: 021

Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a 1144 (DuPont)

ORF 2345

>gen de fibra de la cola de A118

M TNQIFKSAIIJDFSVSAQNAKANVPQIKRSTQDSGGTARLKFTAKKDDNNLPLSSAAEV TLAMVIJSVGKKYESSYIVNPEirNRTEGVFEYSLTDEQISHDGQANAELYVKYPNQTMQI N RFSFVIEKAM 1DDNFLPVATYY VEKW DDY EK1FNEK VEILQN EIÜDLQGQATELK.NTFD SLPíPDQFPQKADFENHINNTN1HVTMTDKTN’W N TKEN TAGSQ AKAD SALN SAKAYTD S KM D SYGAW IN VPLASG YSTG D SN TPQ YRLVAKQ TSTGLKTFAEFRG SVAG TFISTAN ST LATM FAOTR FÍVTY YGAATSN NG NGGRIAIPVDGKLLQVSSTDN A NFS Y VS LSTILYEVG N

SEQ ID NO: 022

Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a 1144 (DuPont)

ORF 2344

>chaperona de A118 MNYKQFYAYDENGNYLETILVFEDEKGLINQPKNSTNIEPSIIENGIARAYIYYPRWNGED WDEDKK RW ELEN PIIPAEKTEIEK LR EELLLTQEALA ALFES NLG

SEQ ID NO: 023

Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a 1144 (DuPont)

ORF 2343

SEQ ID NO: 024

Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a 1144 (DuPont)

ORF 2342

>chaperona de A118

M YDGLTKVFDYALAKEMFFAALFVALFIILLIITKRIWDDSKIVRIEMKEEREKVEEEREK R NKES KEERDKFISTM NEQQRLM DRQND MM KQQQQSIDS LS K S VGKLAH K V DLLEHKI TK

SEQ ID NO: 025

Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a 1144 (DuPont)

ORF 2341

> holina de A118

M EFGKELLVYM TFLVVVTPVFVQ AIKKTELVPSKVVLPTVSIL1GAILGALATFLDGSGSL ATM 1 \V AG ALAGAGGTGLFEQFTN RSKKYGEDDK

SEQ ID NO: 026

Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a F6854

GenBank: EAL07464.1

>proteína de unión al receptor MTKiVKMSEKNEUGTLEQFYPETHAEAVKGLVSVSEEEKTNWNTKENTAGSQAKADSA LN SAKAYTDSKM DSYGAW IN VPLASGYSTGDSN TPQYRLVAKQTSTGLKTFAEFRGSV AGTFISTANSTLATMPAGTRPIVTYYGAATSNNGNGGRIAIPVDGKLLQVSSTDNANPSY VSLST.ILYEVGN

SEQ ID NO: 027

Listeria innocua cepa 6a 33090

ORF 174 de monocina

>proteína de unión al receptor MTKIVKMSEKNEHGTLEQFYPETHAEAVKGLVSVTEEEKTTWNEKETTAGAEQKANTA LN SAKEYVDTIGKGTVIFKGAN IM GAGQKYTW SSSKLKFG1TLLFSRYDSAN N TPLDYY YH SVFLSK AQL-AELAG KGLLVPMPSA1YGERKYLYVSETEVAGHNDNTNN A SW AI RQI -TVM

SEQ ID NO: 028

casete de hyperspank_MCS_lacI

G AATTcG ACTCTCT ACCTTG AGGCATC A A ATA A A ACG A A AGGCTC AGTCGA AAG ACT GGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCC GCCGC_1-Cl'AGtri'AAGCACrAAGGCCATCCTGACGGAl'GGCCTITrrGCCiTTTa'ACAA ACTCTTGTTA ACTCTAG AGCTGCCTGCCGCGTTTCGGTG ATG A AG ATCTTCCCG ATG A IT A A F IA A IT C AGA AC G CICG G IT G CCG CC’CiGCiCG iT lT T rA '1 G C A G C A A I'GGC'AA G A ACGTTGctcgaggg t A AaTGTG AGCaCTC AC A ATTe ATTTTGC. A A A ACTTGTTO ACTTT A TCTAC A AGGTGTGGC AT A ATGTGTG t A ATTGTG AGCGGAT A A C A ATT AAGCTTagtcgac agctagccgC AlG C A AG C T AAllG G G T G G AAAC G AG G T C A T C AT T T C C T T C C G AAA AAAC GGTTGCATTTAAATCTTACATATGTAATACTTTCA AAGACT ACATTTGT AAGATTTG A TGTTTG AGTCGGCTG A A AG ATCGT ACGTACC A ATT ATTGTTTCGTG ATTGTTC A AGCC ATAACACTGTACM3GATAGTGGAAAGAGTGCTTCATCrrGGTTACX3ATCAATCAAATAT TC A A ACGG AGGG AG ACG ATTTTG ATG A A ACCAGTA ACGTT AT ACG ATGTCGC AG AG TATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTCGTGAACCAGGCCAGCCACGTT TCTGCG A A A ACGCGGG A A A AAGTG GA AGCGGCG ATGGCGG AGCTG AATTACATTCC CAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCA CCTCCAGTCrGGCCCrGCACGCGCCGTCGCAAAlTG'rCGCGGCGATl'AAATCrCGCG CCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAA GCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATT AACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTT CCGGCGTT ATTTCTTG ATGTCTCTG ACC AG ACACCC ATCA ACAGT ATT ATTTT CTCCC ATG AAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCA1TGGGTCACCAGCAA ATCGCGCTGTTACJCGíiCiCCCATTAACjTrC^rCJTC'rCCiGCGCGTCTCíCGTCnTKjCTCiGC: TGGCATAAATATCTCACTCG CAATCAAATTCAG CCG ATAG CG G AACG GG AAG GCG A CTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGT TCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCAT TACCG AGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGG ATACG ACG ATAC

C(}A AG ACA(}C rC A T G I l A FATCCCGCCG FIA ACC’ACCATCAA ACAC.CÍAT F ÍT C G C C r GCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGA AGGGCAATCAGCTGTTCCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCC AATACGCAAACCGCCTCrrCCCCXjCGCG'rFGGCCGATrCAlTAATGCAGCTGGCACGA CAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGA

SEQ ID NO: 029

Listeria monocytogenes cepa 1 /2a 35152, Listeria monocytogenes cepa 1/ 2a 1144 (DuPont)

ORF 140 de monocina, Gen de fibra de la cola de A118

>fusión de monocina-proteína de unión al receptor de la cola del fago A118 MTKI\7KMSEKNEHGTLEQFYPETHAEAVKGLVSVSEEEKTNWNTKENTAGSQAKADSA LN SAKAYTDSKM DSYGAW IN VPLASGYSTGDSN TPQYRLVAKQTSTGLKTFAEFRGSV AGTFISTANSTLATMPAGTRPIVTYYGAATSNNGNGGRIAIPVDGKLLQVSSTDNANPSY VSLSTILYEVGN

SEQ ID NO: 030

Bacteriófago TP901-1

> proteína principal de la cola

M AELTAKQGKDIILLYRVLSKASTEAAW KLAFQTEH SN EKTRDYN TTATKDGPVGALA EVEYSLSATSIAAN GDPH LD EM DKAFDDAAIIEVW EIDKAEKATLGLDSGKYKAKYLRA YLTSFSYEPNSEDALELSLEFGVFGKPQKGYATLTTEQANVVQYVFKDTVRG

SEQ ID NO: 031

Fago de tipo TP901-1 de Enterococcus avium

ATCC 14025

MPEVTGFENQLYCDFSQSATKAVAGKNILLAIFNMTGDKLLAIAGQQGLTINRSKDSIEI TSKDTKGGW KSKIGGM KEW SIDN DGLYVRDDESH KVLGQYFDGDDPVCIKVLDM QSK TGM FGGLAIVTDYSLEAPYDDAM TYSIKLDGM GALVDLSDSEAN QM PEGTASIKLN KT TASIVVDAN ESLIATVQPSTDTVSW KTSDVTVATVDN TGRVTGKKVGN AIITATSTSKEV ATCLVTITAS

SEQ ID NO: 032

Listeriófago A118

> proteína principal de la cola

M RIKN AKTKYSVAEIVAGAGEPD W KRLSKW ITN VSD D GSD N TEEQ GD YD GD GN EKTV VLGYSEAYTFEGTHDREDEAQN LIVAKRRTPEN RSIM FKIEIPDTETAIGKATVSEIKGSA GGGDATEFPAFGCRIAYDETPTVTKP

SEQ ID NO: 033

Listeriófago A118

> medidora de la cola

M SD GSVVIEISLD D KKAD KQ LD AFEKD LAKAG TN AG AALD KAYREAVSD IASQ SKRLK D TFVN AFKSM GN AGSN ALKASLN FIRELPSN VQ AALSKLASTVKTGFVN AAKASITAVK N LG TSIKN TAVN IKN GFFSIAKTVQ SSIM SAVKISIN VIKSIPSAIKSAGSSIKSALVSSLQ A A K M A A ISFA Q T T V K V IK SIP G A A K T A A T A V K N SF V V A Y K A V V V A A Y M SV K G T ISA V K A IPSA T K SA ALAV SSAM K T AFSA VVSA AK T T G T T VK T A LT N G FSAIK SG A K T AG Q VG ISA LKGLG N AAKSTGSLIKN GLVSGFN AARSAAKGAGAGM REALKN SVEKPAEQ ARFSILR LAAAFGLIAATKN VVGSAIGRVDTIDTATKSLTVLTGSAKD AQLVM TD LTAAIDGTPIAL D AVALG AK KM VAAG M Q AAN VK PVFTAIAD AAYG VG N G SE SID Q M T D AISALQ ASG VA YSDDIN RLVDAGVPAW QILAN STGKSVGEM KKYVSEGSLESTKAIAM LTKGIEEGTTGM AGN TAKM AGLAKTAGN TISGSFAN M KTAAVKSLAN IAEN LKGPIIQALDVAKN AFKQ F AAVTASPEFQ KKLSD M IQ KIKELIPVM VKLAPTILKVVSAM LALQ AVSSVYVAFSN IG K M FVPLKN GLFVIATGFM KLAKTIRH PITAIKN LAFAIKYFIVTSGAVIAIVGAVIAVLYGM YAAFKEN TAN IKG FLSGM FD AVKN SFGKIVD VFKQ IVSALKPVG SG FKD ILKYIGVG VW VA FG IVLAT VVD IIQ VLARIVLVAIKG LQ G LYYAIKAAFQ ALSG D LKG AKKSLE Q SKD AF VDAGSAIKDAFN KDN YALTGTIESLKEM GGEAEKTGTKAETSN KKISSSLKLVESTAKQ TEATVTKSN QAIDTM LSGGVDQYGN KLSEKTKSFLN AAKELYGQ YQESAKKSQD KYSV AM EKAQSLEGDKRKKAIADAN ATLVAEIDKN NGTLLTLQADYAKLLKDN KW VDGTEL TAQQKKFLQQQTADIQAELAKQNQLYVEGNLLKLANGKTLNEKERATSIEVQKSLYGD RKKAVEIGEKELADLKRKKSDATTETEKANYQIQIDEQTKKNKTLAGNLQKWASEM NA IIANGGTLNAETFAKGLSEM GNISDEQLGAVW QDFVKVSGSIDNTLAGLAAVM SQRGG EGVQAFVTALQSGDYTTAALKINDDVLNTISGLPNSMFLNGQSGKDQFLLAIKSGDFQG AGKFLLD GVKM GAD PLPGEM EKN GKKSGD AQ AKGVKSTAEAN KSAGKEIKN N AKSG AFD PN LFKM TG SKN SSGFN N G ILG GKD G AFSAG TSVG G SAKSGAASVD SSGVGSD FAA G FA N G IR SG AG AV G E A AASIA AK AL AAV Q K K Q D SH SPSK K SK K LG G D FG SG Y SLG IASK TKAVTKAASN LVAG ALG TEKQ IKKLSSTLKD KVSSAID AGLH SKN KSRGQ LKQ AKALN SIEGYIAQ Q TN RLAATAKKRD KVVAQ LKAAN TKM AD LTKQ SKEYAASITEKM Q SYGSI SN VDAENPQSIQQEM QKRLKEIKAFQANVEKLRKKGVSKDIISDILESGVENGSSYAQAL AKSDAKTIKAIN STQN QIN SASKSM GN TAAN AM YSAGIN AAKGLIN GLN SQKKQLEKTA KSIASTITN SVKKALK1H SPSRVAIELGKFFTGGLGN GVLAGAKGAVQ STN KM VDKVVN AASNM TVPTITLPKVSAEKALGLKSSDLNRTITVKAIVENESKNNSNSDLINAIEKSGGRP IILNVDGKVIADSTNNHLGNSTSLAFYGKGL

SEQ ID NO: 034

Listeriófago A118

>gpi7

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una monocina, en donde la molécula de ácido nucleico comprende un primer polinucleótido que codifica las proteínas estructurales de una monocina funcional excepto la proteína de unión al receptor (RBP) natural correspondiente, en donde las proteínas estructurales codificadas por el primer polinucleótido son al menos un 80 % idénticas a las SEC ID NO: 7-16, en donde la molécula de ácido nucleico comprende además una segunda secuencia polinucleotídica heteróloga que codifica una RBP heteróloga, en donde la RBP comprende una región de unión a la placa de soporte (BPAR) y un dominio de unión al receptor (RBD), y en donde la monocina tiene la especificidad bactericida contra al menos una cepa de Listeria monocytogenes, u otras especies de Listeria, u otro género de bacterias, determinada por la RBP heteróloga y diferente de la determinada por la RBP natural.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde la segunda secuencia polinucleotídica heteróloga codifica una RBP heteróloga que comprende un dominio de unión al receptor (RBD) heterólogo fusionado a una BPAR nativa para las proteínas estructurales codificadas por el primer polinucleótido.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2, en donde la BPAR comprende aminoácidos en las posiciones 1-20 o 1-30 o 1-40 o 1-60 de la SEQ ID NO: 17.

4. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2, en donde el RBD es de un profago o un resto de profago del genoma de una bacteria grampositiva o un RBD de un bacteriófago que infecta a una bacteria grampositiva.

5. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la molécula de ácido nucleico está unida operativamente a un promotor inducido de molécula pequeña.

6. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una monocina, en donde la molécula de ácido nucleico comprende un primer polinucleótido que codifica secuencias de aminoácidos que son al menos un 80 % idénticas a las SEQ ID ⁿO: 7-17 y un promotor heterólogo inducible por una molécula pequeña, en donde la monocina tiene actividad bactericida contra al menos una cepa de Listeria monocytogenes y en donde el primer polinucleótido está unido operativamente al promotor heterólogo.

7. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6, en donde el promotor está situado 11, 14, 17, 20 o 23 nucleótidos cadena arriba de la porción de un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 5.

8. Una célula productora de monocina que comprende un primer polinucleótido extraño que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 % idéntica a las ^s E^c ID NO: 7-16 y un segundo polinucleótido extraño que codifica una proteína de unión al receptor (RBP), en donde el primer y segundo polinucleótidos codifican una monocina que tiene la especificidad bactericida determinada por la RBP;

y en donde la primera y la segunda secuencia de polinucleótidos extraños están situadas en la misma molécula de ácido nucleico o situadas en moléculas de ácido nucleico distintas.

9. Una célula productora de la reivindicación 8, en donde el primer y segundo polinucleótidos son moléculas de ácido nucleico distintas.

10. Una monocina codificada por la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

11. Un método para destruir una Listeria monocytogenes in vitro, que comprende poner en contacto la L. monocytogenes con una cantidad eficaz de la monocina de la reivindicación 10, con lo que la monocina se une y destruye a L. monocytogenes.

12. El método de la reivindicación 11, en donde el contacto es con una superficie contaminada con L. monocytogenes.

13. El método de la reivindicación 12, en donde el contacto es a 4 ° - 10 ° C.

14. La monocina de la reivindicación 10, o la célula productora de la reivindicación 8, para su uso en un método de tratamiento de una infección por L. monocytogenes en un animal.