ES2777936T3 - Tratamiento del cáncer de próstata con inhibidores de la quinasa tor - Google Patents

Tratamiento del cáncer de próstata con inhibidores de la quinasa tor Download PDF

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Abstract

Compuesto 1-etil-7-(2-metil-6-(1H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazina-2(1H)- ona para usar en un procedimiento para tratar el cáncer de próstata, donde el procedimiento comprende la administración a un paciente que tiene cáncer de próstata de 0,5 mg/día a 128 mg/día de dicho compuesto, y donde el cáncer de próstata no es cáncer de próstata resistente a la castración que sobreexpresa ETS.

Description

DESCRIPCIÓN
T ratamiento del cáncer de próstata con inhibidores de la quinasa tor
CAMPO
En esta invención se describen procedimientos para tratar o prevenir el cáncer de próstata, que comprenden administrar una cantidad eficaz de un inhibidor de la quinasa TOR a un paciente que tiene cáncer de próstata.
ANTECEDENTES
La conexión entre la fosforilación anormal de proteínas y la causa o consecuencia de enfermedades se conoce desde hace más de 20 años. Por consiguiente, las proteínas quinasas se han vuelto un grupo muy importante de dianas para los fármacos. Véase, Cohen, Nature, 1:309-315 (2002). Se han utilizado diversos inhibidores de proteína quinasa a nivel clínico en el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades, tales como el cáncer y enfermedades inflamatorias crónicas, incluidas la diabetes y el derrame cerebral. Véase, Cohen, Eur. J. Biochem., 268:5001-5010 (2001), Inhibidores de la proteína quinasa para el tratamiento de enfermedades: The Promise and the Problems (La promesa y los problemas), Manual de farmacología experimental, Springer Berlin Heidelberg, 167 (2005).
Las proteínas quinasas son una familia grande y diversa de enzimas que catalizan la fosforilación de proteínas y desempeñan un papel crítico en la señalización celular. Las proteínas quinasas pueden ejercer efectos positivos o negativos, dependiendo de su proteína diana. Las proteínas quinasas están implicadas en vías de señalización específicas que regulan funciones celulares tales como, pero no limitadas a, metabolismo, progresión del ciclo celular, adhesión celular, función vascular, apoptosis, y angiogénesis. Las funciones alteradas de la señalización celular se han asociado con muchas enfermedades, de las cuales las mejores caracterizadas incluyen cáncer y diabetes. La regulación de la transducción de la señal por citoquinas y la asociación de moléculas señalizadoras con protooncogenes y genes supresores de tumores está bien documentada. De forma similar, se ha demostrado la conexión entre la diabetes y afecciones relacionadas, y los niveles desregulados de proteínas quinasas. Véase, por ejemplo, Sridhar y col. Investigación farmacéutica, 17(11):1345-1353 (2000). Las infecciones virales y las afecciones relacionadas con las mismas también se han asociado con la regulación de proteínas quinasas. Park y col. Cell 101 (7): 777-787 (2000).
Como las proteínas quinasas regulan casi cada procedimiento celular, incluyendo el metabolismo, proliferación celular, diferenciación celular, y supervivencia celular, son dianas atractivas para la intervención terapéutica para varios estados de enfermedad. Por ejemplo, el control del ciclo celular y la angiogénesis, en los que las proteínas quinasas desempeñan un papel central son procesos celulares asociados con numerosas afecciones patológicas tales como, pero no limitadas a, cáncer, enfermedades inflamatorias, angiogénesis anormal y enfermedades relacionadas con la misma, aterosclerosis, degeneración macular, diabetes, obesidad y dolor.
Las proteínas quinasas se han convertido en dianas atractivas para el tratamiento de los cánceres. Fabbro y col., Pharmacology & Therapeutics (Farmacología y terapéutica) 93:79-98 (2002). Se ha propuesto que la implicación de las proteínas quinasas en el desarrollo de malignidades humanas puede ocurrir por: (1) reordenamientos genómicos (por ejemplo, BCR-ABL en leucemia mielógena crónica), (2) mutaciones que conducen a una actividad quinasa constitutivamente activa, como leucemia mielógena aguda y tumores gastrointestinales, (3) desregulación de la actividad quinasa por activación de oncogenes o pérdida de funciones supresoras de tumores, como en cánceres con RAS oncogénico, (4) desregulación de la actividad quinasa por sobreexpresión, como en el caso de EGFR y (5) expresión ectópica de factores de crecimiento que pueden contribuir al desarrollo y mantenimiento del fenotipo neoplásico. Fabbro y col., Pharmacology & Therapeutics (Farmacología y terapéutica) 93:79-98 (2002).El documento US 8.110.578 se refiere a ciertos inhibidores de quinasa mTOR de la pirazino [2,3-b] pirazina para tratar o prevenir el cáncer, afecciones inflamatorias, afecciones inmunológicas, enfermedades neurodegenerativas, diabetes, obesidad, trastornos neurológicos, enfermedades relacionadas con la edad o afecciones cardiovasculares.
La elucidación de la complejidad de las vías de proteína quinasa y la complejidad de la relación e interacción entre las diversas proteínas quinasas y las vías de la quinasa resalta la importancia de desarrollar agentes farmacéuticos que puedan actuar como moduladores, reguladores o inhibidores de la proteína quinasa que tengan actividad beneficiosa sobre múltiples quinasas o múltiples vías de la quinasa. Por consiguiente, sigue habiendo una necesidad de nuevos moduladores de quinasa.
La proteína denominada mTOR (diana de la rapamicina en mamíferos), que también se denomina FRAP, RAFTI o RAPT1), es una proteína quinasa Ser/Thr de 2549 aminoácidos, que se ha demostrado que es una de las proteínas más críticas en la vía de mTOR/PI3K/Akt que regula el crecimiento y la proliferación celular. Georgakis y Younes Expert Rev. Anticancer Ther. 6(1 ):131-140 (2006). mTOR existe en dos complejos, mTORC1 y mTORC2. Mientras mTORC1 es sensible a análogos de rapamicina (tales como temsirolimus o everolimus), mTORC2 es en gran medida insensible a la rapamicina. Notablemente, la rapamicina no es un inhibidor de la quinasa TOR. Varios inhibidores de mTOR han sido o están siendo evaluados en ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer. El temsirolimus se aprobó para uso en carcinoma de células renales en 2007 y el sirolimus se aprobó en 1999 para la profilaxis del rechazo del trasplante renal. El everolimus se aprobó en 2009 para pacientes con carcinoma de células renales que habían progresado a inhibidores del receptor del factor de crecimiento endotelial, en 2010 para astrocitoma de células gigantes subependimal (SEGA) asociado con esclerosis tuberosa (TS) en pacientes que requieren terapia pero no candidatos para resección quirúrgica, y en 2011 para tumores neuroendocrinos progresivos de origen pancreático (PNET) en pacientes con enfermedad no reseccionable, localmente avanzada o metastásica. Sigue existiendo la necesidad de inhibidores de quinasa TOR adicionales.
La cita o identificación de cualquier referencia en esta solicitud no debe interpretarse como una admisión de que la referencia es técnica anterior a la presente solicitud.
RESUMEN
En esta invención se proporciona un inhibidor de la quinasa TOR para su uso en procedimientos para tratar el cáncer de próstata como se define en las reivindicaciones.
En ciertos ejemplos, existen procedimientos para mejorar los Criterios del Grupo de trabajo de antígeno prostático específico 2 (PSAWG2) para el cáncer de próstata de un paciente, que comprenden administrar una cantidad efectiva de un inhibidor de la quinasa TOR a un paciente con cáncer de próstata.
El inhibidor de la quinasa TOR para los usos de la presente invención es 1 -etil-7- (2-metil-6- (1H-1,2,4-triazol-3-il) piridin-3-il) -3,4- dihidropirazino [2,3-b] pirazin-2 (1H) -ona, el cáncer de próstata para el propósito de la invención no es cáncer de próstata cáncer de próstata resistente a la castración que sobreexpresa ETS y la dosis para la administración para el propósito de la invención es de 0,5 mg/día a 128 mg/día.
Las presentes realizaciones pueden comprenderse de manera más completa por referencia a la descripción detallada y los ejemplos, que pretenden ejemplificar realizaciones no limitativas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra la distribución del ciclo celular de células HeLa y PC3 no tratadas. (como referencia)
La figura 2 muestra los efectos del tratamiento del Compuesto 1 sobre la distribución del ciclo celular en células PC3. (como referencia)
La figura 3 muestra curvas de inhibición del crecimiento para la línea celular PC3 en respuesta a rapamicina o al Compuesto 1 (como referencia)
La figura 4 muestra la curva de inhibición de biomarcadores de fosfo para la línea celular PC3 en respuesta al tratamiento con rapamicina o con el compuesto 1. (como referencia)
La figura 5A muestra la actividad antitumoral del Compuesto 6 en el modelo de xenoinjerto PC3 con diversos esquemas de dosificación. (como referencia)
La figura 5B muestra la actividad antitumoral del Compuesto 6 en el modelo de xenoinjerto PC3 con una dosis diaria a diversos niveles de dosis. (como referencia)
La figura 6 muestra la relación PK/PD del Compuesto 6 en ratones con tumores PC3 con una dosis oral única de 30 mg/kg. La inhibición de pS6 y pAkt se correlacionó con los niveles de compuestos tanto en plasma como en tumores. (como referencia)
La figura 7 muestra una curva de inhibición del crecimiento para PC-3 en respuesta al Compuesto 2.
La figura 8 muestra curvas de inhibición de la fosforilación del sustrato en PC-3 en respuesta al tratamiento con el Compuesto 2.
La figura 9 muestra la actividad antitumoral del Compuesto 1 en el modelo de xenoinjerto PC3 con una dosis diaria. (como referencia)
La figura 10 muestra la comparación de la exposición del Compuesto 1 (10 mg/kg) y la rapamicina (4 mg/kg) y la relación con los niveles de pS6 y pAkt en el modelo de xenoinjerto de PC3 después de 21 días de dosificación. (como referencia)
La figura 11 muestra la actividad antitumoral del Compuesto 1 en el modelo de xenoinjerto PC3 con dosificación intermitente. (como referencia)
La figura 12 muestra la actividad antitumoral del Compuesto 1 en el modelo de xenoinjerto PC3 con dosificación dos veces al día. (como referencia)
La figura 13 muestra la regresión tumoral PC3 con el Compuesto 1 en el modelo de xenoinjerto PC3 con diversos esquemas de dosificación. (como referencia)
La figura 14 muestra la exposición al Compuesto 1 en ratones portadores de tumor PC3 después de una dosis oral única de 25 mg/kg y la relación con los niveles de pS6 y pAkt. (como referencia)
La figura 15 muestra la exposición al Compuesto 1 en ratones portadores de tumor PC3 después de una dosis oral única de 10 mg/kg y la relación con los niveles de pS6 y pAkt. (como referencia)
La figura 16 muestra la exposición al Compuesto 1 en ratones con tumor PC3 después de una dosis oral única de 1 mg/kg y la relación con los niveles de pS6 y pAkt. (como referencia)
La figura 17 muestra la cuantificación de la tinción de apopotosis en tumores PC3 en respuesta al tratamiento con rapamicina o con el compuesto 1. (como referencia)
La figura 18 muestra los efectos antiproliferativos y antiangiogénicos medidos por cuantificación de la tinción de Ki-67 y CD-31 en tumores PC3 en respuesta al tratamiento con rapamicina o con el Compuesto 1. (como referencia)
La figura 19 muestra la actividad antitumoral del Compuesto 2 en el modelo de xenoinjerto PC3 con dosificación dos veces al día.
La figura 20 muestra la actividad antitumoral del Compuesto 2 en el modelo de xenoinjerto PC3 con dosificación diaria a diversos niveles de dosis.
La figura 21 muestra la exposición al Compuesto 2 en ratones portadores de tumor PC3 después de una dosis oral única de 1 y 10 mg/kg y la relación con los niveles de pS6 y pAkt.
La figura 22 muestra el efecto sobre los niveles de p-ADN PK en respuesta al Compuesto 2 en ratones portadores de tumor PC3 después de la dosificación diaria a 5 mg/kg durante 6 días.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
DEFINICIONES
Un grupo "alquilo" es un es un hidrocarburo no cíclico ramificado o de cadena lineal saturada, parcialmente saturada o insaturada que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, típicamente de 1 a 8 carbonos o, en algunas realizaciones, de 1 a 6, 1 a 4 , o de 2 a 6 o átomos de carbono. Los grupos alquilo representativos incluyen -metil, -etil, -n-propil, -n-butil, -n-pentil y -n-hexil; mientras los alquilos saturados ramificados incluyen -isopropil, -sec-butil, -isobutil, -ferc-butil, -isopentil, 2-metilpentil, 3-metilpentil, 4-metilpentil, 2,3-dimetilbutil y similares. Los ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen, pero no se limitan a, vinilo, alilo, -CH = CH (CH 3), -CH = C (CH 3) 2 , -C (CH 3) = CH 2 , -C (CH 3) = CH (CH 3), -C (CH 2 CH 3) = CH 2 , -CeCH, -CeC (CH 3), -CeC (CH 2 CH 3), -CH 2 CeCH, -CH 2 CeC (CH 3) y -CH 2 CeC (CH 7 CH 3), entre otros. Un grupo alquilo puede estar sustituido o no sustituido. En determinadas realizaciones, cuando se dice que los grupos alquilo descritos en esta invención están "sustituidos", pueden estar sustituidos con cualquier sustituyente o sustituyentes como los encontrados en los compuestos ejemplares y realizaciones descritas en esta invención, así como halógeno (cloro, yodo, bromo, o flúor); hidroxilo; alcoxi; alcoxialquilo; amino; alquilamino; carboxi; nitro; ciano; tiol; tioéter; imina; imida; amidina; guanidina; enamina; aminocarbonilo; acilamino; fosfonato; fosfina; tiocarbonilo; sulfonilo; sulfona; sulfonamida; cetona; aldehído; éster; urea; uretano; oxima; hidroxil amina; alcoxiamina; aralcoxiamina; N-óxido; hidrazina; hidrazida; hidrazona; azida; isocianato; isotiocianato; cianato; tiocianato; B(OH)2 , u O(alquil)aminocarbonilo.
Un grupo "alquenilo" es un hidrocarburo no cíclico ramificado o de cadena lineal que tiene de 2 a 10 átomos de carbono, típicamente de 2 a 8 átomos de carbono, e incluye al menos un doble enlace carbono-carbono. Los alquenilos ramificados y de cadena lineal (C2-C8) representativos incluyen -vinil, -alil, -1 -butenil, -2-butenil, -isobutilenil, -1 -pentenil, -2-pentenil, -3-metil-1 -butenil, -2-metil-2-butenil, -2,3-dimetil-2-butenil, -1-hexenil, -2-hexenil, -3-hexenil, -1 -heptenil, -2-heptenil, -3-heptenil, -1 -octenil, -2-octenil, -3-octenil y similares. El doble enlace de un grupo alquenilo puede no estar conjugado o estar conjugado con otro grupo insaturado. Un grupo alquenilo puede no estar sustituido o estar sustituido.
Un grupo "cicloalquilo" es un grupo alquilo cíclico saturado, parcialmente saturado, o insaturado de 3 a 10 átomos de carbono que tiene un único anillo cíclico o múltiples anillos condensados o con puente que puede estar sustituido opcionalmente con de 1 a 3 grupos alquilo. En algunas realizaciones, el grupo cicloalquilo tiene de 3 a 8 miembros en el anillo, mientras que en otras realizaciones, el número de átomos de carbono en el anillo varía de 3 a 5, 3 a 6, o 3 a 7. Dichos grupos cicloalquilo incluyen, como ejemplo, estructuras de anillo único tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo, 1 -metilciclopropilo, 2-metilciclopentilo, 2-metilciclooctilo, y similares, o estructuras con múltiples anillos o con puente tales como adamantilo y similares. Los ejemplos de grupos cicloalquilo insaturados incluyen ciclohexenilo, ciclopentenilo, ciclohexadienilo, butadienilo, pentadienilo, hexadienilo, entre otros. Un grupo cicloalquilo puede estar sustituido o no sustituido. Tales grupos cicloalquilo sustituidos incluyen, como ejemplo ciclohexanona y similares.
Un grupo "arilo" es un grupo carbocíclico aromático de 6 a 14 átomos de carbono que tiene un único anillo (por ejemplo, fenilo) o múltiples anillos condensados (por ejemplo, naftilo o antrilo). En algunas realizaciones, los grupos arilo contienen 6-14 carbonos, y en otras de 6 a 12 o incluso 6 a 10 átomos de carbono en las partes de anillo de los grupos. Los arilos particulares incluyen fenilo, bifenilo, naftilo y similares. Un grupo arilo puede estar sustituido o no sustituido. La expresión "grupos arilo" también incluye grupos que contienen anillos fusionados, tales como sistemas de anillos aromáticos-alifáticos fusionados (por ejemplo, indanilo, tetrahidronaftilo y similares).
Un grupo "heteroarilo" es un sistema de anillos arilo que tiene uno a cuatro heteroátomos como átomos del anillo en un sistema de anillos heteroaromáticos, donde el resto de los átomos son átomos de carbono. En algunas realizaciones, los grupos heteroarilo contienen 5 a 6 átomos del anillo, y en otras de 6 a 9 o incluso 6 a 10 átomos en las partes de anillo de los grupos. Los heteroátomos adecuados incluyen oxígeno, azufre y nitrógeno. En algunas realizaciones, el sistema de anillos heteroarilo es monocíclico o bicíclico. Los ejemplos no limitativos incluyen, pero no están limitados a, grupos tales como los grupos pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, triazolilo, tetrazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, pirolilo, piridilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, tiofenilo, benzotiofenilo, furanilo, benzofuranilo (por ejemplo, isobenzofuran-1,3-diimina), indolilo, azaindolilo (por ejemplo, pirrolopiridilo o 1H-pirrolo[2,3-b]piridilo), indazolilo, bencimidazolilo (por ejemplo, 1H-benzo[d]imidazolilo), imidazopiridilo (por ejemplo, azabencimidazolilo, 3H-imidazo[4,5-b]piridilo o 1H-imidazo[4,5-b]piridilo), pirazolopiridilo, triazolopiridilo, benzotriazolilo, benzoxazolilo, benzotiazolilo, benzotiadiazolilo, isoxazolopiridilo, tianaftalenilo, purinilo, xantinilo, adeninilo, guaninilo, quinolinilo, isoquinolinilo, tetrahidroquinolinilo, quinoxalinilo, y quinazolinilo.
Un "heterociclilo" es un cicloalquilo aromático (también referido como heteroarilo) o no aromático en el que uno a cuatro átomos de carbono del anillo están reemplazados independientemente con un heteroátomo del grupo que consiste en O, S y N. En algunas realizaciones, el grupo heterociclilo incluye 3 a 10 miembros en el anillo, mientras que en otras dichos grupos tienen 3 a 5, 3 a 6, o 3 a 8 miembros en el anillo. Los heterociclilos también pueden estar unidos a otros grupos en cualquier átomo del anillo (es decir, en cualquier átomo de carbono o heteroátomo del anillo heterocíclico). Un grupo heterocicloalquilo puede estar sustituido o no sustituido. Los grupos heterociclilo engloban sistemas de anillos insaturados, parcialmente saturados y saturados, tales como, por ejemplo, los grupos imidazolilo, imidazolinilo e imidazolidinilo. La expresión heterociclilo incluye especies de anillos fusionados, incluyendo aquellos que comprenden grupos aromáticos y no aromáticos fusionados, tales como, por ejemplo, benzotriazolilo, 2,3-dihidrobenzo[1,4]dioxinilo, y benzo[1,3]dioxolilo. La expresión también incluye sistemas de anillos policíclicos con puente que contienen un heteroátomo, tal como, pero no limitado a, quinuclidilo. Los ejemplos representativos de un grupo heterociclilo incluyen, pero no están limitados a, los grupos aziridinilo, azetidinilo, pirrolidilo, imidazolidinilo, pirazolidinilo, tiazolidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrofuranilo, dioxolilo, furanilo, tiofenilo, pirrolilo, pirrolinilo, imidazolilo, imidazolinilo, pirazolilo, pirazolinilo, triazolilo, tetrazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, tiazolinilo, isotiazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, piperidilo, piperazinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, tetrahidropiranilo (por ejemplo, tetrahidro-2H-piranilo), tetrahidrotiopiranilo, oxatiano, dioxilo, ditianilo, piranilo, piridilo, pirimidinilo, piridazinilo, pirazinilo, triazinilo, dihidropiridilo, dihidroditiinilo, dihidroditionilo, homopiperazinilo, quinuclidilo, indolilo, indolinilo, isoindolilo, azaindolilo (pirrolopiridilo), indazolilo, indolizinilo, benzotriazolilo, bencimidazolilo, benzofuranilo, benzotiofenilo, benztiazolilo, benzoxadiazolilo, benzoxazinilo, benzoditiinilo, benzoxatiinilo, benzotiazinilol, benzoxazolilo, benzotiazolilo, benzotiadiazolilo, benzo[1,3]dioxolilo, pirazolopiridilo, imidazopiridilo (azabencimidazolilo; por ejemplo, 1H-imidazo[4,5-b]piridilo, o 1H-imidazo[4,5-b]piridin-2(3H)-onilo), triazolopiridilo, isoxazolopiridilo, purinilo, xantinilo, adeninilo, guaninilo, quinolinilo, isoquinolinilo, quinolizinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinolinilo, ftalazinilo, naftiridinilo, pteridinilo, tianaftalenilo, dihidrobenzotiazinilo, dihidrobenzofuranilo, dihidroindolilo, dihidrobenzodioxinilo, tetrahidroindolilo, tetrahidroindazolilo, tetrahidrobencimidazolilo, tetrahidrobenzotriazolilo, tetrahidropirrolopiridilo, tetrahidropirazolopiridilo, tetrahidroimidazopiridilo, tetrahidrotriazolopiridilo, y tetrahidroquinolinilo. Los grupos heterociclilo sustituidos representativos pueden estar monosustituidos o sustituidos más de una vez, tal como, pero no limitado a, los grupos piridilo o morfolinilo, que están sustituidos en 2, 3, 4, 5, o 6, o disustituidos con varios sustituyentes tales como los enumerados más adelante.
Un grupo "heterociclilalquilo" es un radical de la fórmula: -alquil-cicloalquilo, donde alquilo y cicloalquilo se han definido anteriormente. Los grupos cicloalquilalquilo sustituidos pueden estar sustituidos en el alquilo, el cicloalquilo, o tanto en la parte alquilo como cicloalquilo del grupo. Los grupos cicloalquilalquilo representativos incluyen, pero no están limitados a, ciclopentilmetilo, ciclopentiletilo, ciclohexilmetilo, ciclohexiletilo, y ciclohexilpropilo. Los grupos cicloalquilalquilo sustituidos representativos pueden estar monosustituidos o sustituidos más de una vez.
Un grupo "aralquilo" es un radical de la fórmula: -alquil-arilo, donde alquilo y arilo se han definido anteriormente. Los grupos aralquilo sustituidos pueden estar sustituidos en el alquilo, el arilo, o tanto en la parte alquilo como arilo del grupo. Los grupos aralquilo representativos incluyen, pero no están limitados a, los grupos bencilo y feniletilo y grupos (cicloalquiaril)alquilo fusionados, tal como 4-etil-indanilo.
Un grupo "heterociclilalquilo" es un radical de la fórmula: -alquil-heterociclilo, donde alquilo y heterociclilo se han definido anteriormente. Los grupos heterociclilalquilo sustituidos pueden estar sustituidos en el alquilo, el heterociclilo, o tanto en la parte alquilo como heterociclilo del grupo. Los grupos heterocililalquilo representativos incluyen, pero no están limitados a, 4-etil-morfolinilo, 4-propilmorfolinilo, furan-2-il metilo, furan-3-il metilo, piridin-3-il metilo, (tetrahidro-2H-piran-4-il)metilo, (tetrahidro-2H-piran-4-il)octilo, tetrahidrofuran-2-il metilo, tetrahidrofuran-2-il etilo, e indol-2-il propilo.
Un "halógeno" es flúor, cloro, bromo o yodo.
Un grupo "hidroxialquilo" es un grupo alquilo como se ha descrito anteriormente sustituido con uno o más grupos hidroxi.
Un grupo "alcoxi" es -O-(alquilo), donde alquilo se ha definido anteriormente.
Un grupo "alcoxialquilo" es -(alquil)-O-(alquil), donde alquilo es como se ha definido anteriormente.
Un grupo "amino" es un radical de la fórmula: -NH2.
Un grupo "alquilamino" es un radical de la fórmula: -NH-alquil o -N(alquil)2 , donde cada alquilo es independientemente como se ha definido anteriormente.
Un grupo "carboxi" es un radical de la fórmula: -C(O)OH.
Un grupo "aminocarbonilo" es un radical de la fórmula: -C(O)N(R#)2 , -C(O)NH(R#) o -C(O)NH2 , donde cada R# es independientemente un grupo alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heterociclilo o heterociclilo sustituido o no sustituido como se define en esta invención.
Un grupo "acilamino" es un radical de la fórmula: -NHC(O)(R#) o -N(alquil)C(O)(R#), donde cada alquilo y R# son independientemente como se ha definido anteriormente.
Un grupo "alquilsulfonilamino" es un radical de la fórmula: -NHSO2(R#) o -N(alquil)SO2(R#), donde cada alquilo y R# se han definido anteriormente.
Un grupo "urea" es un radical de la fórmula: -N(alquil)C(O)N(R#)2 , -N(alquil)C(O)NH(R#),-N(alquil)C(O)NH2 , -NHC(O)N(R#)2 , -NHC(O)NH(R#), o -NH(CO)NHR#, donde cada alquilo y R# son independientemente como se ha definido anteriormente.
Cuando se dice que los grupos descritos en esta invención, con la excepción del grupo alquilo, están "sustituidos", pueden estar sustituidos con cualquier sustituyente o sustituyentes apropiados. Ejemplos ilustrativos de sustituyentes son los encontrados en los ejemplos de compuestos y realizaciones descritos en esta invención, así como halógeno (cloro, yodo, bromo o flúor); alquilo; hidroxilo; alcoxi; alcoxialquilo; amino; alquilamino; carboxi; nitro; ciano; tiol; tioéter; imina; imida; amidina; guanidina; enamina; aminocarbonilo; acilamino; fosfonato; fosfina; tiocarbonilo; sulfonilo; sulfona; sulfonamida; cetona; aldehído; ester; urea; uretano; oxima; hidroxilamina; alcoxiamina; aralcoxiamina; N-óxido; hidrazina; hidrazida; hidrazona; azida; isocianato; isotiocianato; cianato; tiocianato; oxígeno (=O); B(OH) 2 , O(alquil)aminocarbonilo; cicloalquilo, que puede ser monocíclico o policíclico fusionado o no fusionado (por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo), o un heterociclilo, que puede ser monocíclico o policíclico fusionado o no fusionado (por ejemplo, pirrolidilo, piperidilo, piperazinilo morfolinilo o tiazinilo); arilo o heteroarilo policíclico fusionado o no fusionado o monocíclico (por ejemplo, fenilo, naftilo, pirrolilo, indolilo, furanilo, tiofenilo, imidazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, triazolilo, tetrazolilo, pirazolilo, piridinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, acridinilo, pirazinilo, piridazinilo, pirimidinilo, bencimidazolilo, benzotiofenilo o benzofuranilo) ariloxi; aralquiloxi; heterocicliloxi; y heterociclil alcoxi.
Como se utiliza en esta invención, el término "sal(es) farmacéuticamente aceptable(s)" se refiere a una sal preparada a partir de un ácido o base no tóxico farmacéuticamente aceptable que incluye un ácido y una base inorgánicos y un ácido y una base orgánicos. Las sales de adición de base farmacéuticamente aceptables adecuadas de los inhibidores de la quinasa TOR incluyen, pero o están limitadas a, sales metálicas de aluminio, calcio, litio, magnesio, potasio, sodio y cinc o sales orgánicas de lisina, N,N’-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, meglumina (N-metilglucamina) y procaína. Los ácidos no tóxicos adecuados incluyen, pero no están limitados a, ácidos orgánicos e inorgánicos tales como ácido acético, algínico, antranílico, bencenosulfónico, benzoico, canforsulfónico, cítrico, etenosulfónico, fórmico, fumárico, furoico, galacturónico, glucónico, glucurónico, glutámico, glicólico, bromhídrico, clorhídrico, isetiónico, láctico, maleico, málico, mandélico, metanosulfónico, múcico, nítrico, pamoico, pantoténico, fenilacético, fosfórico, propiónico, salicílico, esteárico, succínico, sulfanílico, sulfúrico, tartárico y ptoluenosulfónico. Los ácidos no tóxicos específicos incluyen ácidos clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, sulfúrico y metansulfónico. Los ejemplos de sales específicas incluyen, por lo tanto, sales de hidrocloruro y mesilato. En la técnica se conocen otras, véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a eds., Mack Publishing, Easton PA (1990) o Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 1 9 a eds., Mack Publishing, Easton PA (1995).
Tal y como se usa en esta invención, y a no ser que se indique otra cosa, el término "clatrato" significa un inhibidor de la quinasa TOR, o una sal del mismo, en la forma de una red cristalina que contiene espacios (por ejemplo, canales) que tienen una molécula huésped (por ejemplo, un disolvente o agua) atrapada en ella o una red cristalina donde un inhibidor de la quinasa TOR es una molécula huésped.
Tal y como se usa en esta invención, y a no ser que se indique otra cosa, el término "solvato" significa un inhibidor de la quinasa TOR, o una sal del mismo, que incluye además una cantidad estequiométrica o no estequiométrica de un disolvente unido por fuerzas intermoleculares no covalentes. En una realización, el solvato es un hidrato.
Tal y como se usa en esta invención, y a no ser que se indique otra cosa, el término "hidrato" significa un inhibidor de la quinasa TOR, o una sal del mismo, que incluye además una cantidad estequiométrica o no estequiométrica de agua unida por fuerzas intermoleculares no covalentes.
Tal y como se usa en esta invención, y a no ser que se indique otra cosa, el término "profármaco" significa un derivado de un inhibidor de la quinasa TOR que puede hidrolizarse, oxidarse, o reaccionar de otra forma en condiciones biológicas (in vitro o in vivo) para proporcionar un compuesto activo, particularmente un inhibidor de la quinasa TOR. Los ejemplos de profármacos incluyen, pero no están limitados a, derivados y metabolitos de un inhibidor de la quinasa TOR que incluyen restos biohidrolizables tales como amidas biohidrolizables, ésteres biohidrolizables, carbamatos biohidrolizables, carbonatos biohidrolizables, ureidas biohidrolizables y análogos de fosfato biohidrolizables. En determinadas realizaciones, los profármacos de compuestos con grupos funcionales carboxilo son los ésteres de alquilo inferior del ácido carboxílico. Los ésteres carboxilato se forman convenientemente mediante la esterificación de cualquiera de los restos de ácido carboxílico de la molécula. Los profármacos pueden prepararse típicamente usando procedimientos muy conocidos, tales como los descritos por Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery 6§ ed. (Donald J. Abraham ed., 2001, Wiley) y Design and Application of Prodrugs (H. Bundgaard ed., 1985, Harwood Academic Publishers Gmfh).
Tal y como se usa en esta invención, y a no ser que se indique otra cosa, el término "estereoisómero" o "estereoméricamente puro" significa un estereoisómero de un inhibidor de la quinasa TOR que carece sustancialmente de otros estereoisómeros de ese compuesto. Por ejemplo, una compuesto estereoméricamente puro que tiene un centro quiral carecerá sustancialmente del enantiómero opuesto del compuesto. Un compuesto estereoméricamente puro que tiene dos centros quirales carecerá sustancialmente de los otros diastereómeros del compuesto. Un compuesto estereoméricamente puro típico comprende más de aproximadamente el 80% en peso de un estereoisómero del compuesto y menos de aproximadamente el 20% en peso de otros estereoisómeros del compuesto, más de aproximadamente el 90% en peso de un estereoisómero del compuesto y menos de aproximadamente el 10% en peso de otros estereoisómeros del compuesto, más de aproximadamente el 95% en peso de un estereoisómero del compuesto y menos de aproximadamente el 5% en peso de otros estereoisómeros del compuesto, o más de aproximadamente el 97% en peso de un estereoisómero del compuesto y menos de aproximadamente el 3% en peso de otros estereoisómeros del compuesto. Los inhibidores de la quinasa TOR pueden tener centros quirales y pueden aparecer como racematos, enantiómeros individuales o diastereómeros, y mezclas de los mismos. Todas dichas formas isoméricas se encuentran incluidas en las realizaciones descritas en esta invención, incluyendo las mezclas de las mismas. El uso de formas estereoméricamente puras de dichos inhibidores de la quinasa TOR, así como el uso de mezclas de estas formas, se encuentra englobado por las realizaciones descritas en esta invención. Por ejemplo, pueden utilizarse mezclas que comprendan cantidades iguales o dispares de los enantiómeros de un inhibidor de la quinasa TOR particular en los procedimientos y las composiciones descritos en esta invención. Estos isómeros pueden resolverse o sintetizarse de manera asimétrica mediante el uso de técnicas estándar tales como columnas quirales o agentes de resolución quirales. Véase, por ejemplo, Jacques, J., y col., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley-Interscience, Nueva York, 1981); Wilen, S. H., y col., Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel, E. L., Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962); y Wilen, S. H., Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972).
Debería indicarse que los inhibidores de la quinasa TOR pueden incluir isómeros E y Z, o una mezcla de los mismos, e isómeros cis y trans o una mezcla de los mismos. En determinadas realizaciones, los inhibidores de la quinasa TOR se aíslan como el isómero cis o trans. En otras realizaciones, los inhibidores de la quinasa TOR son una mezcla de los isómeros cis y trans.
"Tautómeros" se refiere a las formas isoméricas de un compuesto que están en equilibrio entre sí. Las concentraciones de las formas isoméricas dependerán del entorno en el que se encuentre el compuesto y pueden diferir dependiendo, por ejemplo, de si el compuesto es un sólido o se encuentra en una disolución orgánica o acuosa. Por ejemplo, en disolución acuosa, los pirazoles pueden presentar las siguientes formas isoméricas, que se refieren como tautómeros una de otra:
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Como entenderá fácilmente un experto en la materia, una amplia variedad de grupos funcionales y otras estructuras pueden presentar tautomerismo y todos los tautómeros de los inhibidores de la quinasa TOR están dentro del alcance de la presente invención.
También debería indicarse que los inhibidores de la quinasa TOR pueden contener proporciones no naturales de isótopos atómicos en uno o más de los átomos. Por ejemplo, los compuestos pueden radiomarcarse con isótopos radiactivos, tales como, por ejemplo, tritio (3H), yodo-125 (125I), azufre-35 (35S), o carbono-14 (14C), o pueden enriquecerse isotópicamente, tal como con deuterio (2H), carbono-13 (13C), o nitrógeno-15 (15N). Tal y como se usa en esta invención, un “isotopólogo” es un compuesto enriquecido isotópicamente. La expresión "enriquecido isotópicamente" se refiere a un átomo que tiene una composición isotópica diferente a la composición isotópica natural de ese átomo. "Enriquecido isotópicamente" también puede referirse a un compuesto que contiene al menos un átomo que tiene una composición isotópica diferente a la composición isotópica natural de ese átomo. La expresión "composición isotópica" se refiere a la cantidad de cada isótopo presente para un átomo dado. Los compuestos radiomarcados y enriquecidos isotópicamente son útiles como agentes terapéuticos, por ejemplo, agentes terapéuticos para el cáncer y la inflamación, reactivos de investigación, por ejemplo, reactivos de ensayo de unión y agentes de diagnóstico, por ejemplo, agentes de imagen in vivo. Se pretende que todas las variaciones isotópicas del inhibidor de la quinasa TOR para los usos de la presente invención, sean radiactivas o no, estén incluidas dentro del alcance de las realizaciones proporcionadas en esta invención. En algunas realizaciones, se proporcionan isotopólogos de los inhibidores de la quinasa TOR, por ejemplo, los isotopólogos son inhibidores de la quinasa TOR enriquecidos con deuterio, carbono-13 o nitrógeno-15.
"Tratar" como se usa en esta invención, significa un alivio, total o parcial, del cáncer de próstata, o un síntoma del mismo, o ralentizar o detener la progresión o empeoramiento del cáncer de próstata.
"Prevenir", como se usa en esta invención, significa la prevención de la aparición, recurrencia o diseminación, total o parcial, del cáncer de próstata, o un síntoma del mismo.
El término "cantidad efectiva" en relación con un inhibidor de la quinasa TOR significa una cantidad capaz de aliviar, en su totalidad o en parte, los síntomas asociados con el cáncer de próstata, o ralentizar o detener la progresión o empeoramiento de esos síntomas, o tratar o prevenir el cáncer de próstata. La cantidad efectiva del inhibidor de la quinasa TOR, por ejemplo, en una composición farmacéutica, puede encontrarse en un nivel que ejercerá el efecto deseado; por ejemplo, aproximadamente 0,005 mg/kg del peso corporal de un sujeto a aproximadamente 100 mg/kg del peso corporal de un paciente en una dosificación unitaria tanto para administración oral como parenteral. Como será evidente para los expertos en la materia, se espera que la cantidad efectiva de un inhibidor de la quinasa TOR descrito en esta invención puede variar dependiendo de la gravedad de la indicación que se está tratando.
En el contexto del cáncer de próstata, el tratamiento puede evaluarse mediante la inhibición de la progresión de la enfermedad, la inhibición del crecimiento tumoral, la reducción de los tumores primarios y/o secundarios, el alivio de los síntomas relacionados con el tumor, la mejora de la calidad de vida, la inhibición de los factores secretados del tumor (incluido el antígeno prostático específico o PSA), la reducción de las células tumorales circulantes, la aparición tardía de tumor(es) primarios y/o secundarios, el desarrollo lento de tumor(es) primario(s) y/o secundario(s), la disminución de la aparición de tumor(es) primario(s) y/o secundario(s), la disminución o ralentización de la gravedad de los efectos secundarios de la enfermedad, la detención del crecimiento tumoral y/o la regresión de tumores, entre otros.
Los términos "paciente" y "sujeto", tal y como se usan en esta invención, incluyen un animal, incluyendo, pero no limitado a, un animal tal como una vaca, mono, caballo, oveja, cerdo, pollo, pavo, codorniz, gato, perro, ratón, rata, conejo o cobaya, en una realización un mamífero, en otra realización un ser humano. En una realización, un "paciente" o "sujeto" es un humano que tiene cáncer de próstata. En una realización, un paciente es un ser humano que tiene cáncer de próstata, incluidos los sujetos que han progresado en (o no han podido tolerar) la terapia anticancerígena estándar o para quienes no existe una terapia anticancerígena estándar.
En el contexto del cáncer de próstata, el tratamiento puede evaluarse mediante la inhibición de la progresión de la enfermedad, la inhibición del crecimiento tumoral, la reducción de tumores primarios y/o secundarios, el alivio de los síntomas relacionados con el tumor, la mejora de la calidad de vida, la inhibición de los factores secretados del tumor (incluyendo el antígeno prostático específico o PSA), la aparición tardía de tumor(es) primario(s) y/o secundario(s), el desarrollo lento de tumor(es) primario(s) y/o secundario(s), la disminución de la aparición de tumor(es) primario(s) y/o secundario(s), la disminución o ralentización de la gravedad de los efectos secundarios de la enfermedad, la detención del crecimiento tumoral y/o la regresión de tumores, entre otros. En ciertas realizaciones, el tratamiento del cáncer de próstata puede evaluarse mediante la inhibición de la fosforilación de S6RP, 4E-BP1 y/o AKT en sangre circulante y/o células tumorales y/o biopsias de piel o biopsias/aspirados tumorales, antes, durante y/o después del tratamiento con un inhibidor de la quinasa TOR. En otras realizaciones, el tratamiento del cáncer de próstata puede evaluarse por la inhibición de la actividad de la proteína quinasa dependiente de ADN (ADN-PK) en muestras de piel y/o biopsias/aspirados tumorales, tal como por la evaluación de la cantidad de pADN-PK S2056 como un biomarcador para vías de daño en el ADN, antes, durante y/o después del tratamiento con un inhibidor de la quinasa TOR. En una realización, la muestra de piel se irradia con luz UV. En el extremo, a la inhibición completa se hace referencia en esta invención como prevención o quimioprevención. En este contexto, el término "prevención" incluye prevenir la aparición de cáncer de próstata clínicamente evidente por completo o prevenir la aparición de una etapa preclínica evidente de cáncer de próstata. También se pretende que esté englobada por esta definición la prevención de la transformación en células malignas o parar o revertir la progresión de células premalignas a células malignas. Esto incluye el tratamiento profiláctico de las personas en riesgo de desarrollar cáncer de próstata.
INHIBIDORES DE LA QUINASA TOR
Los compuestos descritos en esta invención se denominan generalmente "inhibidor(es) de la quinasa TOR". En un ejemplo específico, los inhibidores de la quinasa TOR no incluyen rapamicina o análogos de rapamicina (rapalogs).
Como se describe en esta invención, los inhibidores de la quinasa TOR incluyen compuestos que tienen la siguiente fórmula (I):
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y sales, clatratos, solvatos, estereoisómeros, tautómeros, y profármacos farmacéuticamente aceptables de los mismos, donde:
X, Y y Z son en cada aparición independientemente N o CR3, donde al menos uno de X, Y y Z es N y al menos uno de X, Y y Z es CR3;
-A-B-Q- tomados conjuntamente forman -CHR4C(O)NH-, -C(O)CHR4NH-, -C(O)NH-, -CH2C(O)O-, -C(O)CH2O-, -C(O)O- o C(O)NR3;
L es un enlace directo, NH u O;
R1 es H, alquilo C1-8 sustituido o no sustituido, alquenilo C2-8 sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido o heterociclilalquilo sustituido o no sustituido; R2 es H, alquilo C 1-8 sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, o heterociclilalquilo sustituido o no sustituido;
R3 es H, alquilo C1-8 sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterociclilalquilo sustituido o no sustituido, -NHR4 o -N(R4)2 ; y
R4 es, en cada aparición, independientemente alquilo C1-8 sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido o heterociclilalquilo sustituido o no sustituido.
Los inhibidores de la quinasa TOR representativos de la fórmula (I) como se describen en esta invención incluyen: (S)-1 -(1 -hidroxi-3-metilbutan-2-il)-6-fenil-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-6-(3,4,5-trimetoxifenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(R) -6-(naftalen-1 -il)-1 -(1 -feniletil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(3-metoxibencil)-6-(4-(metilsulfonil)fenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(S) -1 -(1 -feniletil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-hidroxifenil)-1-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(S)-6-(naftalen-1 -il)-1 -(1 -feniletil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(S)-1-(1-hidroxi-3-metilbutan-2-il)-6-(5-isopropil-2-metoxifenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(r )-1 - (1 -hidroxi-3-metilbutan-2-il)-6-fenil-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(r ) -1 - (1 -feniletil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(s ) -1 -(1 -hidroxi-3-metilbutan-2-il)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(r ) -1 - (1 -hidroxi-3-metilbutan-2-il)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(R)-1-(1-hidroxi-3-metilbutan-2-il)-6-(5-isopropil-2-metoxifenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-bencil-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(4-metoxibencil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(R)-1 -(1 -feniletil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(s ) -1 -(1 -feniletil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-isopropil-6-(5-isopropil-2-metoxifenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-ciclohexil-6-(5-isopropil-2-metoxifenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
5- (quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-isobutil-6-(5-isopropil-2-metoxifenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(2-hidroxietil)-6-(5-isopropil-2-metoxifenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6- (5-isopropil-2-metoxifenil)-1-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(R)-1 -(1 -feniletil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-c]piridin-2(3H)-ona;
(s )-1 -(1 -feniletil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-c]piridin-2(3H)-ona;
3-(1-feniletil)-5-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]piridin-2(3H)-ona;
(R)-3-(1-feniletil)-5-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]piridin-2(3H)-ona;
(R) -6-(5-isopropil-2-metoxifenil)-1-(3-metilbutan-2-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(S) -6-(5-isopropil-2-metoxifenil)-1-(tetrahidrofuran-3-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona; (S)-6-(5-isopropil-2-metoxifenil)-1-(3-metilbutan-2-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-ciclopentil-6-(5-isopropil-2-metoxifenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(R) -6-(5-isopropil-2-metoxifenil)-1-(tetrahidrofuran-3-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona; 1-(ciclopropilmetil)-6-(5-isopropil-2-metoxifenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(ciclopentilmetil)-6-(5-isopropil-2-metoxifenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(ciclohexilmetil)-6-(5-isopropil-2-metoxifenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(S-isopropil-2-metoxifenil)-1-neopentil-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-isopropil-6-(3-isopropilfenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-isopropil-6-(2-metoxifenil)-1H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(S) -3-(1-hidroxi-3-metilbutan-2-il)-5-(5-isopropil-2-metoxifenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona; (R) -1 -(2-hidroxi-1 -feniletil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(s )-1 -(2-hidroxi-1 -feniletil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1 -(1 -feniletil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-benzhidril-6-(quinolin-5-il)-1H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(S) -1 -(1 -fenilpropil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(R)-1 - (1 -fenilpropil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(5-isopropil-2-metoxifenil)-1-(tetrahidro-2H-piran-3-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(3-metoxibencil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(R)-1-metil-3-(1-feniletil)-5-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(s )-1 -metil-3-(1 -feniletil)-5-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(ciclopentilmetil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1 - (1 -(2-fluorofenil)etil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1 -(1 -(4-fluorofenil)etil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-ciclopentil-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1 -(1 -(3-fluorofenil)etil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1 -(1 -(3-metoxifenil)etil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1 -(1 -(4-metoxifenil)etil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(quinolin-5-il)-1-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(quinolin-5-il)-1-(tetrahidro-2H-piran-3-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1 -((1 s,4s)-4-hidroxiciclohexil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1 -((1 r,4r)-4-hidroxiciclohexil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(isoquinolin-5-il)-1 -(1 -feniletil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(R)-1 -(1 -feniletil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]piridin-2(3H)-ona;
1 -(1 -feniletil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]piridin-2(3H)-ona;
1-isopropil-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1 -(1 -(4-clorofenil)etil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1 -(1 -(4-metilsulfonil)fenil)etil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1 -(1 -(piridin-4-il)etil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
5-metil-1 -((S)-1 -feniletil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
5- metil-1 -((R)-1 -feniletil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1 -(1 -feniletil)-6-(quinolin-4-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6- (3-fluorofenil)-1 -(1 -feniletil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(2-fluorofenil)-1 - (1 -feniletil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1 - (1 -feniletil)-6-(quinolin-6-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(piperidin-4-ilmetil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1 -(1 -(piridin-2-il)etil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1 -(1 -(piridin-3-il)etil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-((1s,4s)-4-(hidroximetil)ciclohexil)-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
N-(4-(2-oxo-3-(1-feniletil)-2,3-dihidro-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-5-il)fenil)metanosulfonamida;
6-(3-metilsulfonil)fenil)-1 -(1 -feniletil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(3-aminofenil)-1 -(1 -feniletil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(3-(dimetilamino)fenil)-1 -(1 -feniletil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1 -fenil-6-(quinolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1 -(1 -feniletil)-6-(4-(trifluorometil)fenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
N-(3-(2-oxo-3-(1-feniletil)-2,3-dihidro-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-5-il)fenil)metanosulfonamida;
6-(4-metilsulfonil)fenil)-1 -(1 -feniletil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
3-(1-feniletil)-5-(quinolin-5-il)oxazolo[5,4-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(ciclopentilmetil)-6-(4-hidroxifenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona
6-(4-hidroxifenil)-1-isopropil-1H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-hidroxifenil)-1 -isobutil-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-hidroxifenil)-1-((tetrahidro-2H-piran-3-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(ciclohexilmetil)-6-(4-hidroxifenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona
5- (3-Hidroxifenil)-3-(2-metoxifenil)-1 H-imidazo[4,5-b]piridin-2(3H)-ona;
4-(3-(3-Metoxibencil)-2-oxo-2,3-dihidrooxazolo[5,4-b]pirazin-5-il)-N-metil benzamida;
1 -Ciclopentil-6-(4-hidroxifenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1 -Ciclohexil-6-(4-hidroxifenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
4-(3-(Ciclohexilmetil)-2-oxo-2,3-dihidro-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-5-il)benzamida;
Benzoato de metilo 4-(3-(Ciclohexilmetil)-2-oxo-2,3-dihidro-1H-imidazo[4,5-b]pirazin-5-il);
1-(Ciclohexilmetil)-6-(piridin-4-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
4-(3-(Ciclohexilmetil)-2-oxo-2,3-dihidro-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-5-il)-N-metilbenzamida;
1-(Ciclohexilmetil)-6-(4-hidroximetil)fenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(Ciclohexilmetil)-6-(piridin-3-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
3- (Ciclohexilmetil)-2-oxo-2,3-dihidro-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-5-il)benzonitrilo;
1 -(Ciclohexilmetil)-6-(1 H-indol-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
4- (3-(Ciclohexilmetil)-2-oxo-2,3-dihidro-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-5-il)-N-isopropilbenzamida;
1-(2-Hidroxietil)-6-(4-hidroxifenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1 -(Ciclohexilmetil)-6-(1 H-indol-6-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
3- (3-(Ciclohexilmetil)-2-oxo-2,3-dihidro-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-5-il)benzamida;
6- (4-(Aminometil)fenil)-1-(ciclohexilmetil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-Hidroxifenil)-1-((1-metilpiperidin-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;;
4- (3-(Ciclohexilmetil)-2-oxo-2,3-dihidro-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-5-il)benzonitrilo;
1 -((1 s,4s)-4-Hidroxiciclohexil)-6-(4-hidroxifenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(Ciclohexilmetil)-6-(piridin-2-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
4-(3-(Ciclohexilmetil)-2-oxo-2,3-dihidro-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-5-il)-N-etilbenzamida;
1-(Ciclohexilmetil)-6-(4-(2-hidroxipropan-2-il)fenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(Ciclohexilmetil)-6-(4-hidroxi-2-metilfenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
Ácido 4-(3-(ciclohexilmetil)-2-oxo-2,3-dihidro-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-5-il)benzoico;
6-(4-Hidroxifenil)-1-(2-metoxietil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-Hidroxifenil)-1-(3-metoxipropil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-Hidroxifenil)-4-(3-metoxibencil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(4-Hidroxifenil)-1 -(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-Hidroxifenil)-1 -fenetil-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1 -((1 r,4r)-4-Hidroxiciclohexil)-6-(4-hidroxifenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(1 H-1,2,4-T riazol-3-il)fenil)-1 -(ciclohexilmetil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(Ciclohexilmetil)-6-fenil-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1 -(Ciclohexilmetil)-6-(1 H-pirazol-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1 -(Ciclohexilmetil)-6-(1 H-pirazol-4-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1 -(Ciclohexilmetil)-6-(1 -oxoisoindolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(3-(1 H-Tetrazol-5-il)fenil)-1 -(ciclohexilmetil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(Ciclohexilmetil)-6-(2-oxoindolin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1 -(Ciclohexilmetil)-6-(1 H-indazol-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(Ciclohexilmetil)-6-(6-metoxipiridin-3-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-Hidroxifenil)-1-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6- (4-Hidroxifenil)-1-(piperidin-4-ilmetil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1 -(((1 r,4r)-4-Aminociclohexil)metil)-6-(4-hidroxifenil)-1 H-imidazo [4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(Ciclohexilmetil)-6-(6-hidroxipiridin-3-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(Ciclohexilmetil)-6-(2-metoxipiridin-4-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
4-(3-((1 r,4r)-4-Hidroxiciclohexil)-2-oxo-2,3-dihidro-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-5-il)benzamida;
Ácido acético 2-(4-(3-(ciclohexilmetil)-2-oxo-2,3-dihidro-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-5-il)fenil);
Acetamida 2-(4-(3-(ciclohexilmetil)-2-oxo-2,3-dihidro-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-5-il)fenil);
1-(Ciclohexilmetil)-6-(2-oxoindolin-6-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
Ácido 4-(3-(ciclohexilmetil)-2-oxo-2,3-dihidro-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-5-il)-3-metil benzoico;
N-Metil-4-(2-oxo-3-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-2,3-dihidro-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-5-il)benzamida; 4-(2-oxo-3-((Tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-2,3-dihidro-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-5-il)benzamida; 7- (4-Hidroxifenil)-1-(3-metoxibencil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(4-(2-Hidroxipropan-2-il)fenil)-1-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona; 6-(1 H-indol-5-il)-1 -((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(4H-1,2,4-T riazol-3-il)fenil)-1 -((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo [4,5-b]pirazin-2(3H)-ona; 6-(1 H-Benzo[d]imidazol-5-il)-1 -(ciclohexilmetil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
4-(2-oxo-3-(2-(Tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-2,3-dihidro-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-5-il)benzamida; 6-(3-(2H-1,2,3-T riazol-4-il)fenil)-1 -(ciclohexilmetil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(1 H-imidazol-1 -il)fenil)-1 -(ciclohexilmetil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(1 H-1,2,4-T riazol-3-il)fenil)-1 -((1 r,4r)-4-hidroxiciclohexil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona; 6-(4-(2H-tetrazol-5-il)fenil)-1-(ciclohexilmetil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(Ciclohexilmetil)-6-(2-hidroxipiridin-4-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(1 H-1,2,4-T riazol-3-il)fenil)-1 -(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-1 H-imidazo [4,5-b]pirazin-2(3H)-ona; 6-(4-(1 H-imidazol-2-il)fenil)-1 -(ciclohexilmetil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(1 H-1,2,3-T riazol-1 -il)fenil)-1 -(ciclohexilmetil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona; 6-(4-(2-Hidroxipropan-2-il)fenil)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1 -(Ciclohexilmetil)-6-(4-(5-metil-1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(1 H-Pirazol-3-il)fenil)-1 -(ciclohexilmetil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(1 H-Pirazol-4-il)fenil)-1 -(ciclohexilmetil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
Hidrocloruro de 6-(4-(5-(aminometil)-1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 -(ciclohexilmetil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona; 1 -(Ciclohexilmetil)-6-(4-(5-trifluorometil)-1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-Hidroxifenil)-1 -((1 r,4r)-4-metoxiciclohexil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-Hidroxifenil)-1-((tetrahidrofuran-2-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(3-(1 H-1,2,4-T riazol-3-il)fenil)-1 -(ciclohexilmetil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-((1 r,4r)-4-(Hidroximetil)ciclohexil)-6-(4-hidroxifenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-Hidroxifenil)-1 -((1s,4s)-4-metoxiciclohexil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-Hidroxifenil)-1 -((1 r,4r)-4-metoximetil)ciclohexil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(1 -Metil-1 H-piraxol-4-il)-1 -((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(((1s,4s)-4-Hidroxiciclohexil)metil)-6-(4-hidroxifenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-Hidroxifenil)-1-((tetrahidrofuran-3-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(((1s,4s)-4-Hidroxiciclohexil)metil)-6-(4-hidroxifenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
Hidrocloruro de 6-(1 H-benzo[d]imidazol-5-il)-1 -((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona; 6-(4-(5-(Morfolinometil)-1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 -((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-Hidroxifenil)-1 -(3-(2-oxopirrolidin-1 -il)propil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
Hidrocloruro de 6-(4-hidroxifenil)-1 -(2-morfolinoetil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(Ciclohexilmetil)-6-(4-(oxazol-5-il)fenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
Hidrocloruro de 6-(2-metil-1 H-benzo[d]imidazol-5-il)-1 -((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(5-(Metoximetil)-1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona; 1-((1s,4s)-4-(Hidroximetil)ciclohexil)-6-(4-hidroxifenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(3-Metil-1 H-piraxol-4-il)-1-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(1 H-Pirazol-4-il)-1 -((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
Dihidrocloruro de 6-(2-amino-1 H-benzo[d]imidazol-5-il)-1 -((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(5-(2-Hidroxipropan-2-il)-1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 -((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(5-(Isopropil-1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 -((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona; Hidrocloruro de 4-(2-metoxi-1 -(2-morfolinoetil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin--6-il)benzamida;
4-(1 -((1 s,4s)-4-Hidroxiciclohexil)-2-metoxi-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-6-il)benzamida;
6-(4-Hidroxifenil)-1-((1s,4s)-4-(metoximetil)ciclohexil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(3H-imidazo[4,5-b]piridin-6-il)-1 -((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(2-(2,2-Dimetiltetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-6-(4-hidroxifenil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(1 H-Pirazol-1 -il)fenil)-1 -((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(4H-1,2,4-T riazol-3-il)fenil)-1 -(2-morfolinoetil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(1 H-Benzo[d]imidazol-2-il)fenil)-1-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
Hidrocloruro de 6-(4-(1 H-imidazol-2-il)fenil)-1 -((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona; 6-(4-(5-(Hidroximetil)-1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona; Hidrocloruro de 6-(4-(1 H-imidazol-5-il)fenil)-1 -((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona; 6-(4-Hidroxifenil)-1-((5-oxopirrolidin-2-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(4,5-Dimetil-1 H-imidazol-2-il)fenil)-1-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(1 H-1,2,4-T riazol-5-il)fenil)-1 -(((1 s,4s)-4-metoxiciclohexil)metil)-1 H-imidazo [4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(1 H-1,2,4-T riazol-5-il)fenil)-1 - ( ( ( 1 r,4r)-4-metoxiciclohexil)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(6-(1 H-1,2,4-T riazol-3-il)piridin-3-il)-1 -((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(1 H-1,2,4-T riazol-3-il)fenil)-1 -(2-(2-oxopirrolidin-1 -il)etil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(5-((dimetilamino)metil)-1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 -((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
Hidrocloruro de 6-(4-hidroxifenil)-1 -(pirrolidin-2-ilmetil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
Dihidrocloruro de 6-(2-aminobencimidazol-5-il)-1-(ciclohexilmetil)-4-imidazolino[4,5-b]pirazin-2-ona;
6-(2-(Dimetilamino)-1 H-benzo[d]imidazol-5-il)-1-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona; 6-(4-Hidroxifenil)-1-(piperidin-3-ilmetil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
Hidrocloruro de 6-(4-(4h -1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 -(2-(piperidin-1 -il)etil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(Ciclohexilmetil)-6-(2-(metilamino)pirimidin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(3-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 -((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(Ciclohexilmetil)-6-(2-(2-metoxietilamino)pirimidin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(5-((metilamino)metil)-1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 -((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(5-Oxopirrolidin-2-il)fenil)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(5-metil-1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 -(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(1 H-imidazol-2-il)fenil)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1-(2-metil-2-morfolinopropil)-1H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona; 6-(4-(4H-1,2,4-T riazol-3-il)fenil)-1 -(1 -morfolinopropan-2-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(Pirrolidin-2-il)fenil)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(5-(aminometil)-1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 -(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona; 6-(5-(Hidroximetil)tiofen-2-il)-1 -((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(1 r,4r)-4-(6-(4-Hidroxifenil)-2-oxo-2,3-dihidro-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-1-il)ciclohexanocarboxamida;
(1s,4s)-4-(6-(4-Hidroxifenil)-2-oxo-2,3-dihidro-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-1-il)ciclohexanocarboxamida;
6-(4-(5-metil-1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 -(2-morfolinoetil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(5-Oxopirrolidin-3-il)fenil)-1 -(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(Pirrolidin-3-il)fenil)-1 -(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(1 H-benzo[d]imidazol-5-il)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(3-(Hidroximetil)tiofen-2-il)-1-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(5-(2-Hidroxietil)tiofen-2-il)-1-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(Ciclohexilmetil)-6-(pirimidin-5-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(6-Fluoropiridin-3-il)-1-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(6-(piridin-3-il)-1 -((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(5-metil-1 H-imidazol-2-il)fenil)-1-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(5-Metil-1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 -(2-(2-oxopirrolidin-1 -il)etil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(6-(Metilamino)piridin-3-il)-1 -((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(2-aminopirimidin-5-il)-1-(ciclohexilmetil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(2-hidroxipropan-2-il)fenil)-1-(((1 r,4r)-4-metoxiciclohexil)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-hidroxifenil)-1 -((1 -metilpiperidin-3-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 -(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
1-(ciclohexilmetil)-6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(hidroximetil)tiofen-2-il)-1-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(1 H-benzo[d]imidazol-6-il)-1 -(((1 r,4r)-4-metoxiciclohexil)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(4,5-dimetil-1 H-imidazol-2-il)fenil)-1-(2-morfolinoetil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-1-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-1 -(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 -(2-morfolino-2-oxoetil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-3-(ciclohexilmetil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 -(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-1 H-imidazo[4,5-b]piridin-2(3H)-ona;
(R)-6-(4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 -(1 -feniletil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(s )-6-(4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 -(1 -feniletil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(1 r,4r)-4-(6-(4-(2-hidroxipropan-2-il)fenil)-2-oxo-2,3-dihidro-1H-imidazo[4,5-b]pirazin-1-il)ciclohexanocarboxamida; 6-(3-Metil-4-(1 H-1,2,4-T riazol-3-il)fenil)-1 -((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-B]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(1 H-imidazol-2-il)fenil)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(5-(aminometil)-1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 -(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona; 6-(1 H-benzo[d]imidazol-5-il)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(2-aminopirimidin-5-il)-1-(ciclohexilmetil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
Hidrocloruro de 6-(4-hidroxifenil)-1 -((1 -metilpiperidin-2-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(3-Metil-4-(1 H-1,2,4-T riazol-3-il)fenil)-1 -((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-B]pirazin-2(3H)-ona;
1-(Ciclohexilmetil)-6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(6-(2-Hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-1-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(6-(2-Hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-1 -(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
6-(4-(4H-1,2,4-T riazol-3-il)fenil)-1 -(2-morfolino-2-oxoetil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(R)-6-(4-(4H-1,2,4-T riazol-3-il)fenil)-3-(ciclohexilmetil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
(r ) -6-(4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 -(1 -feniletil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(s ) -6-(4-(4H-1 ,2,4-T riazol-3-il)fenil)-1 -(1 -feniletil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona;
(1 r,4r)-4-(6-(4-(2-Hidroxipropan-2-il)fenil)-2-oxo-2,3-dihidro-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-1 -il)ciclohexanocarboxamida; y 6-(4-(5-Metil-1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 -(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-1 H-imidazo[4,5-b]pirazin-2(3H)-ona, y sales, clatratos, solvatos, estereoisómeros, tautómeros, y profármacos farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Como se describe también en esta invención, los inhibidores de la quinasa TOR incluyen compuestos que tienen la siguiente fórmula (II):
Figure imgf000014_0001
y sales, clatratos, solvatos, estereoisómeros, tautómeros, y profármacos farmacéuticamente aceptables de los mismos, donde:
R 1 es alquilo C 1-8 sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, o heterociclilalquilo sustituido o no sustituido;
-X-A-B-Y- tomados conjuntamente forman -N(R2)CH2C(O)NH-, -N(R2)C(O)CH2NH-, -N(R2)C(O)NH-, -N(R2)C=N-, o -C(R2)=CHNH-;
L es un enlace directo, NH u O;
R 2 es alquilo C 1-8 sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, o heterociclilalquilo sustituido o no sustituido; y
R3 y R4 son independientemente H o alquilo C1-8.
Los inhibidores de la quinasa TOR representativos de la fórmula (II) como se describen en esta invención incluyen: 9-bencil-8-oxo-2-(piridin-3-il)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
N-metil-8-oxo-9-fenil-2-(piridin-3-il)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
8- oxo-9-fenil-2-(piridin-2-il)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(2-cloropiridin-3-il)-8-oxo-9-fenil-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(2-metoxipiridin-3-il)-8-oxo-9-fenil-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
N,N-dimetil-8-oxo-9-fenil-2-(piridin-3-il)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9- metil-8-oxo-2-(piridin-3-il)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(4-hidroxifenil)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-9-o-tolil-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(1 H-indol-4-il)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(1 H-indol-6-il)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(3-hidroxifenil)-9-(4-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(2-hidroxipiridin-4-il)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(2-clorofenil)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(2-fluorofenil)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(2,6-difluorofenil)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-cicloheptil-8-oxo-2-(piridin-3-il)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(2-metoxifenil)-8-oxo-2-(quinolin-5-il)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-ciclopentil-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(2-metoxifenil)-8-oxo-2-(3-(trifluorometil)fenil)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(2-metoxifenil)-2-(6-metoxipiridin-3-il)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-9-(4-(trifluorometil)fenil)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-bencil-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-9-(2-(trifluorometoxi)fenil)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(2,4-diclorofenil)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(2-metoxifenil)-2-(3-nitrofenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(3-cianofenil)-8-oxo-9-fenil-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(3-fluorofenil)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(2-metoxifenil)-8-oxo-2-(2-(trifluorometil)fenil)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(5-fluoropiridin-3-il)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(1-bencilpiperidin-4-il)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
4-(6-carbamoil-8-oxo-2-(piridin-3-il)-7H-purin-9(8H)-il)piperidina-1 -carboxilato de bencilo;
9-ciclohexil-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(2-metoxifenil)-8-oxo-2-(3-(trifluorometoxi)fenil)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-fenil-2-(piridin-3-il)-9H-purina-6-carboxamida;
6-oxo-8-fenil-2-(piridin-3-il)-5,6,7,8-tetrahidropteridina-4-carboxamida;
6-oxo-8-fenil-2-(piridin-4-il)-5,6,7,8-tetrahidropteridina-4-carboxamida;
2-(3-aminofenil)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(3-hidroxifenil)-9-(2-metoxifenil)-9H-purina-6-carboxamida;
9-Ciclopentil-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-terc-Butil-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
[2-(3-hidroxifenil) -9-(2-metoxifenil) -8-oxo (7-hidropurin-6-il)] -N-metilcarbox-amida;
2-fenil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-4-carboxamida;
[2-(3-Hidroxifenil)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo(7-hidropurin-6-il)]-N,N-dimetil carboxamida;
2-(3-Hidroxifenilamino)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(4-Hidroxifenilamino)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(trans-4-Hidroxiciclohexil)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(trans-4-Hidroxiciclohexil)-8-oxo-2-(piridin-3-il)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(trans-4-Hidroxiciclohexil)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(trans-4-Hidroxiciclohexil)-8-oxo-2-(piridin-3-il)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(3-Hidroxifenilamino)-9-(2-metoxifenil)-9H-purina-6-carboxamida;
9-Isopropil-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
Benzoato 4-(6-Carbamoil-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purin-2-il) de metilo;
2-(2-Cloro-3-hidroxifenil)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
2-(3-Cianofenil)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(2-Hidroxifenilamino)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(3-Hidroxifenil)-9-(4-metoxi-2-metilfenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(3-Hidroxifenil)-8-oxo-9-(2-(trifluorometil)fenil)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2- (4-Cianofenil)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
Ácido 4-[6-carbamoil-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purin-2-il]-benzoico;
3- (6-Carbamoil-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purin-2-il)benzoato de metilo;
Ácido 3-(6-carbamoil-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purin-2-il)benzoico;
2-(3-Hidroxifenil)-9-(2-isopropilfenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(1 H-indazol-6-il)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
2-(4-Carbamoilfenil)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(2-Etilfenil)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(2,5-Diclorofenil)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
2-(3-Carbamoilfenil)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(2,6-Diclorofenil)-2-(3-metoxifenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
2-(2-Hidroxifenil)-9-(2-metoxifenil)purina-6-carboxamida;
2-(1 H-indazol-5-il)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
9-(2,3-Diclorofenil)-2-(3-metoxifenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
2-[4-(Hidroximetil)fenil]-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
2-[3-(Hidroximetil)fenil]-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
9-(2-Metoxifenil)-8-oxo-2-(piridin-4-il)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(4-Fluoro-3-hidroxifenil)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
2-(2-Fluoro-3-hidroxifenil)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
2-[4-(1-Hidroxi-isopropil)fenil]-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
2-[3-(1-Hidroxi-isopropil)fenil]-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
9-(2-Metoxifenil)-2-(2-nitrofenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
9-(2-Metoxifenil)-2-(4-nitrofenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
9-(2-Metoxifenil)-2-(2-nitrofenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
9-(2,4-Difluorofenil)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
9-(2-Metoxifenil)-2-{3-[(metilsulfonil)amino]fenil}-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
9-(4-Cloro-2-fluorofenil)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
9-(2-Clorofenil)-8-oxo-2-(3-piridil)-7-hidropurina-6-carboxamida;
8- Oxo-2-(3-piridil)-9-[2-(trifluorometil)fenil]-7-hidropurina-6-carboxamida;
9- (3-Cloro-2-fluorofenil)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
9-(2-Fluoro-3-trifluorometilfenil)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
9-(2,3,4-Trifluorofenil)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
2-(1 H-Benzo[d]imidazol-6-il)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-[3-(Acetilamino)fenil]-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
2-(3-hidroxifenil)-8-(2-metoxifenil)-6-oxo-5,6,7,8-tetrahidropteridina-4-carboxamida;
9-(2-Metoxifenil)-8-oxo-2-pirazol-4-il-7-hidropurina-6-carboxamida;
9-(2-Metoxifenil)-8-oxo-2-pirazol-3-il-7-hidropurina-6-carboxamida;
9-(4-Aminociclohexil)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
2-[3-(Difluorometil)fenil]-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
2-[5-(Difluorometil)-2-fluorofenil]-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
2-(1 H-benzo[d]imidazol-4-il)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(6-Hidroxipiridin-3-il)-8-oxo-9-(2-(trifluorometil)fenil)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(1 H-benzo[d]imidazol-6-il)-9-(2-fluorofenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-Bencimidazol-6-il-8-oxo-9-[2-(trifluorometil)fenil]-7-hidropurina-6-carboxamida;
2-(5-Cloropiridin-3-il)-8-oxo-9-(2-(trifluorometil)fenil)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
Carbamato de trans-4-(6-Carbamoil-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purin-2-ilamino) ciclohexilo; (R) -9-(2-Metoxifenil)-8-oxo-2-(pirrolidin-3-ilamino)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
(S) -9-(2-Metoxifenil)-8-oxo-2-(pirrolidin-3-ilamino)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
Carbamato de (cis)-4-(6-Carbamoil-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purin-2-ilamino) ciclohexilo; 2-(trans-4-Hidroxiciclohexilamino)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(4-Cloropiridin-3-il)-8-oxo-9-(2-(trifluorometil)fenil)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(cis-4-Hidroxiciclohexilamino)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(4-((1 H-Imidazol-1-il)metil)fenilamino)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(4-Hidroxipiridin-3-il)-8-oxo-9-(2-(trifluorometil)fenil)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
(R) -9-(2-Metoxifenil)-8-oxo-2-(pirrolidin-2-ilmetilamino)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
(S) -9-(2-Metoxifenil)-8-oxo-2-(pirrolidin-2-ilmetilamino)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(4-(1 H-1,2,4-T riazol-3-il)fenil)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
2-(2-Hidroxietilamino)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(2-Metoxifenil)-8-oxo-2-(2-(trifluorometil)-1 H-benzo[d]imidazol-6-il)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(3-(1 H-1,2,4-T riazol-3-il)fenil)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
9-(Bifenil-2-il)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(4-(1 H-1,2,4-Triazol-3-il)fenil)-9-(2-fluorofenil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
2-(4-(1 H-1,2,4-Triazol-3-il)fenil)-9-(2-isopropilfenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(2-Metoxifenil)-2-(2-metil-1 H-benzo[d]imidazol-6-il)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(3-Hidroximetil)fenilamino)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(2-Hidroximetil)fenilamino)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(2-terc-Butilfenil)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(3-Hidroxifenil)-8-oxo-9-(2-fenoxifenil)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(1 H-benzo[d]imidazol-6-il)-9-(2-isopropilfenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(1 H-indazol-4-il)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(2-Hidroxipiridin-3-il)-8-oxo-9-(2-(trifluorometil)fenil)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(1 H-Imidazo[4,5-b]piridin-6-il)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(4-(1 H-Imidazol-1-il)fenil)-9-(2-isopropilfenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(2-Ciclohexilfenil)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(4-(1 H-Imidazol-2-il)fenil)-9-(2-isopropilfenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(1 H-benzo[d]imidazol-1-il)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(1 H-Imidazo[4,5-b]piridin-6-il)-9-(2-isopropilfenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(2-Isopropilfenil)-8-oxo-2-(1 H-pirrolo[2,3-b]piridin-5-il)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(1 H-Imidazo[4,5-b]piridin-6-il)-8-oxo-9-(2-(trifluorometil)fenil)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(2-Metoxifenil)-2-(2-metiltio)-1 H-benzo[d]imidazol-5-il)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(1 H-indol-5-il)-9-(2-isopropilfenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(Ciclohexilmetil)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(2,3-Dihidro-1 H-inden-1-il)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(3-Hidroxifenil)-9-isobutil-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(trans-4-Metoxiciclohexil)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(cis-4-Metoxiciclohexil)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(3-Hidroxifenil)-8-oxo-9-(5,6,7,8-tetrahidronaftalen-1-il)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(4-(1 H-1,2,4-T riazol-3-il)fenil)-9-ciclohexil-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(3-Hidroxifenil)-9-(1 H-indol-4-il)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(2-Fluoro-3-metoxifenil)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(2-Fluoro-5-metoxifenil)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-Ciclohexil-2-(1 H-imidazo[4,5-b]piridin-6-il)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(3-Hidroxifenil)-8-oxo-9-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(3-Hidroxifenil)-8-oxo-9-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(2-Ciclopentilfenil)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(3-Hidroxifenil)-8-oxo-9-(piperidin-4-il)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(2-Fluoro-4-metoxifenil)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(1 H-benzo[d]imidazol-6-il)-9-ciclohexil-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-Bencimidazol-6-il-9-(trans-4-metoxiciclohexil)-8-oxo-7-hidropurina-6-carboxamida;
2-(4-(Aminometil)fenil)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(3-Hidroxifenil)-9-(cis-4-(metoximetil)ciclohexil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
9-(trans-4-Aminociclohexil)-2-(3-hidroxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(3-Hidroxifenil)-9-(2-isobutilfenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
(R) -2-(3-Hidroxifenil)-8-oxo-9-(tetrahidrofuran-3-il)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
(S) -2-(3-Hidroxifenil)-8-oxo-9-(tetrahidrofuran-3-il)-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(3-(Aminometil)fenil)-9-(2-metoxifenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(4-(1 H-1,2,3-Triazol-5-il)fenil)-9-(2-isopropilfenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(4-(1 H-1,2,4-Triazol-3-il)fenil)-9-(cis-4-metoxiciclohexil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(1 H-Benzo[d]imidazol-6-il)-9-(cis-4-metoxiciclohexil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(1 H-Imidazo[4,5-b]piridin-6-il)-9-(cis-4-metoxiciclohexil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida;
2-(3-Hidroxifenil)-9-((1 r,4r)-4-(metoximetil)ciclohexil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida; y
9-(2-Isopropilfenil)-2-(4-(5-metil-4H-1,2,4-triazo1-3-il)fenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida,
y sales, clatratos, solvatos, estereoisómeros, tautómeros, y profármacos farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Como se describe también en esta invención, los inhibidores de la quinasa TOR incluyen compuestos que tienen la siguiente fórmula (III):
Figure imgf000017_0001
y sales, clatratos, solvatos, estereoisómeros, tautómeros, y profármacos farmacéuticamente aceptables de los mismos, donde:
R 1 es alquilo C 1-8 sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterociclilo sustituido o no sustituido, o heterociclilalquilo sustituido o no sustituido;
R 2 es H, alquilo C 1-8 sustituido o no sustituido , cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterociclilo sustituido o no sustituido, heterociclilalquilo sustituido o no sustituido, aralquilo sustituido o no sustituido, o cicloalquilalquilo sustituido o no sustituido;
R3 y R4 son cada uno independientemente H, alquilo C1-8 sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterociclilo sustituido o no sustituido, heterociclilalquilo sustituido o no sustituido, aralquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilalquilo sustituido o no sustituido, o R3 y R4, junto con los átomos a los que están unidos, forman un cicloalquilo sustituido o no sustituido o heterociclilo sustituido o no sustituido;
o R2 y uno de R3 y R4, junto con los átomos a los que están unidos, forman un heterociclilo sustituido o no sustituido, donde los inhibidores de la quinasa TOR pueden no incluir los compuestos representados más adelante, concretamente:
Figure imgf000017_0002
6-(4-hidroxifenil)-4-(3-metoxibencil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
Figure imgf000017_0003
6-(4-(1 H-1,2,4-triazol-5-il)fenil)-3-(ciclohexilmetil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
o
Figure imgf000017_0004
(R)-6-(4-(1 H-1,2,4-triazol-5-il)fenil)-3-(ciclohexilmetil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona.
En algunos ejemplos de compuestos de la fórmula (III), el compuesto a una concentración de 10 pM puede inhibir mTOR, ADN-PK, o PI3K o una combinación de los mismos, al menos aproximadamente un 50%. Puede mostrarse que los compuestos de fórmula (III) son inhibidores de las quinasas anteriores en cualquier sistema de ensayo adecuado.
Los inhibidores de la quinasa TOR representativos de fórmula (III) como se describen en esta invención incluyen: 6-(1H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il)-4-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona;
6-(4-metil-6-(1H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-4-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona;
6-(5-fluoro-2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-((frans-4-metoxiciclohexil)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(5-fluoro-2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-((c/'s-4-metoxiciclohexil)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-4-((frans-4-metoxiciclohexil)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 6-(5-fluoro-2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-((frans-4-hidroxiciclohexil)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-4-((c/'s-4-metoxiciclohexil)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 6-(6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-4-((frans-4-hidroxiciclohexil)methil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 6-(6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-4-(c/'s-4-hidroxiciclohexil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-4-((c/s-4-hidroxiciclohexil)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 6-(5-fluoro-2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-(frans-4-metoxiciclohexil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-4-(frans-4-metoxiciclohexil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-4-(frans-4-hidroxiciclohexil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(5-fluoro-2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-((c/'s-4-hidroxiciclohexil)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-4-(c/'s-4-metoxiciclohexil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-4-(2-metoxietil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-4-isopropil-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(5-fluoro-2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-(c/'s-4-hidroxiciclohexil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 6-(5-fluoro-2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-(c/'s-4-metoxiciclohexil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 6-(5-fluoro-2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-(2-metoxietil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(6-(1H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-4-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona;
6-(6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-4-etil-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(5-fluoro-2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-(frans-4-hidroxiciclohexil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(5-fluoro-2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 6-(5-fluoro-2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-isopropil-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
4-etil-6-(5-fluoro-2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(3-fluoro-2-metil-4-(1H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona; 6-(3-fluoro-2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-(c/'s-4-metoxiciclohexil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 6-(3-fluoro-2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-(frans-4-metoxiciclohexil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
4- (2-metoxietil)-6-(4-metil-6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(3-(1 H-1,2,4-triazol-5-il)fenil)-4-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
5- (8-(2-metoxietil)-6-oxo-5,6,7,8-tetrahidropirazino[2,3-b]pirazin-2-il)-4-metilpicolinamida;
3-(6-oxo-8-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-5,6,7,8-tetrahidropirazino[2,3-b]pirazin-2-il)benzamida;
3- (6-oxo-8-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-5,6,7,8-tetrahidropirazino[2,3-b]pirazin-2-il)benzonitrilo;
5- (8-(frans-4-metoxiciclohexil)-6-oxo-5,6,7,8-tetrahidropirazino[2,3-b]pirazin-2-il)-4-metilpicolinamida;
6- (1 H-imidazo[4,5-b]piridin-6-il)-4-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 6-(1 H-indazol-6-il)-4-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
4- ((1 R,3S)-3-metoxiciclopentil)-6-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
4-((1S,3R)-3-metoxiciclopentil)-6-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
4-((1 R,3R)-3-metoxiciclopentil)-6-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
4-((1S,3S)-3-metoxiciclopentil)-6-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
4-etil-6-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona;
6-(1H-pirrolo[2,3-b]piridin-5-il)-4-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona;
6-(1 H-indol-6-il)-4-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(1 H-indol-5-il)-4-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
4-((1 R,3S)-3-metoxiciclopentil)metil)-6-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
4-((1S,3R)-3-metoxiciclopentil)metil)-6-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(3-fluoro-2-metil-4-(1H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-(2-tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(3-fluoro-2-metil-4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-(2-metoxietil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
3.3- dimetil-6-(4-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-4-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-((1 R,3S)-3-metoxiciclopentil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-((1S,3R)-3-metoxiciclopentil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-(((1S,3R)-3-metoxiciclopentil)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-(((1 R,3R)-3-metoxiciclopentil)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-((1S,3R)-3-metoxiciclopentil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-((1 R,3R)-3-metoxiciclopentil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-(((1 R,3S)-3-metoxiciclopentil)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-(((1S,3R)-3-metoxiciclopentil)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 6-(3-fluoro-4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-(2-metoxietil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona;
6-(3-fluoro-4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-(2-tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona; 7'-(2-metil-4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1'-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1'H-espiro[ciclopentano-1,2'-pirazino[2,3-b]pirazin]-3'(4'H)-ona;
7'-(2-metil-4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1'-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-1'H-espiro[ciclobutano-1,2'-pirazino[2,3-b]pirazin]-3'(4'H)-ona;
4-(ciclopropilmetil)-6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7'-(2-metil-4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 'H-espiro[ciclopentano-1,2'-pirazino[2,3-b]pirazin] -3 '(4'H)-ona;
7'-(2-metil-4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 'H-espiro[ciclobutano-1,2'-pirazino[2,3-b]pirazin] -3 '(4'H)-ona;
7'-(2-metil-4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1'H-espiro[ciclopropano-1,2'-pirazino[2,3-b]pirazin]-3'(4'H)-ona;
(R)-6-(4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-((tetrahidrofuran-2-il)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
(s )-6-(4-(4H-1 ,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-((tetrahidrofuran-2-il)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(1 H-indazol-5-il)-4-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
4-(6-oxo-8-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-5,6,7,8-tetrahidropirazino[2,3-b]pirazin-2-il)benzamida;
4-(2-metoxietil)-3,3-dimetil-6-(2-metil-4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
4-etil-3,3-dimetil-6-(2-metil-4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona;
6-(2-metil-4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona;
3.3- dimetil-6-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-4-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
(R) -6-(6-(1-hidroxietil)piridin-3-il)-4-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona; 3.3- dimetil-6-(2-metil-4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)-4-metilpiridin-3-il)-4-(frans-4-metoxiciclohexil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)-4-metilpiridin-3-il)-4-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
3.3- dimetil-6-(2-metil-4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona;
3.3- dimetil-6-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-4-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)-2-metilpiridin-3-il)-4-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)-2-metilpiridin-3-il)-4-(frans-4-metoxiciclohexil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; (S) -6-(6-(1-hidroxietil)piridin-3-il)-4-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 3.3- dimetil-6-(2-metil-4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-3,3-dimetil-4-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(4-(2-hidroxipropan-2-il)fenil)-4-(frans-4-metoxiciclohexil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(4-(2-hidroxipropan-2-il)fenil)-4-((frans-4-metoxiciclohexil)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
4-(c/s-4-metoxiciclohexil)-6-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 4-(frans-4-metoxiciclohexil)-6-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 6-(4-(2-hidroxipropan-2-il)fenil)-4-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
4- (2-metoxietil)-6-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona;
9-(6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)-3-piridil)-6,11,4a-trihidromorfolino[4,3-e]pirazino[2,3-b]pirazin-5-ona;
6-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-4-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona;
5- (8-(c/s-4-metoxiciclohexil)-6-oxo-5,6,7,8-tetrahidropirazino[2,3-b]pirazin-2-il)-6-metilpicolinonitrilo;
6- (6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-4-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona; 9-(4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)-2-metilfenil)-3-(2-metoxiacetil)-6,11,4a-trihidropiperazino[1,2-e]pirazino[2,3-b]pirazin-5-ona; 9-(4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)-2-metilfenil)-6,11,4a-trihidropiperazino[1,2-e]pirazino [2,3 -b]pirazin-5 -ona;
9-(4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)-2-metilfenil)-3-(2-metoxietil)-6,11,4a-trihidropiperazino[1 ,2-e]pirazino[2,3-b]pirazin-5-ona; 4-(ciclopentilmetil)-6-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
9-(6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)-2-metil-3-piridil)-6,11,4a-trihidromorfolino[4,3-e]pirazino[2,3-b]pirazin-5-ona;
4-(frans-4-hidroxiciclohexil)-6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
4-(c/s-4-hidroxiciclohexil)-6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-((tetrahidrofuran-3-il)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 4-(ciclopentilmetil)-6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-neopentil-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-isobutil-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
3- metil-6-(2-metil-4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-(piperidin-4-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-(2-(tetrahidro-2H-piran-3-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 8-(4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)-2-metilfenil)(3aS,2R)-2-metoxi-5,10,3a-trihidropirazino[2,3-b]pirrolidino[1,2-e]pirazin-4-ona; 8-(4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)-2-metilfenil)(2S,3aR)-2-metoxi-5,10,3a-trihidropirazino[2,3-b]pirrolidino[1,2-e]pirazin-4-ona; 8-(4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)-2-metilfenil)(2S,3aR)-2-metoxi-5,10,3a-trihidropirazino[2,3-b]pirrolidino[1,2-e]pirazin-4-ona; 8- (4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)-2-metilfenil)(2S,3aS)-2-metoxi-5,10,3a-trihidropirazino[2,3-b]pirrolidino[1,2-e]pirazin-4-ona; 6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-(3-metoxipropil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
(S)-6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-((tetrahidrofuran-2-il)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; (R)-6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-((tetrahidrofuran-2-il)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 6-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-4-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
9- (4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)-2-metilfenil)-3-metil-6,11,4a-trihidropiperazino[1,2-e]pirazino [2,3 -b]pirazin-5-ona;
9-(4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-6,11,4a-trihidromorfolino[4,3-e]pirazino[2,3-b]pirazin-5-ona;
9-(4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)-2-metilfenil)-6,11,4a-trihidropiperidino[1,2-e]pirazino [2,3 -b]pirazin-5 -ona;
6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-(f/ans-4-metoxiciclohexil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-(c/s-4-metoxiciclohexil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-(2-morfolinoetil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-fenetil-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
4- (ciclohexilmetil)-6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-((f/ans-4-metoxiciclohexil)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-((c/s-4-metoxiciclohexil)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; (R) -6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-(tetrahidrofuran-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
(S) -6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-(tetrahidrofuran-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-fenil-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
(S)-6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-3-metil-4-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
9-[6-(1-hidroxi-isopropil)-3-piridil]-6,11,4a-trihidromorfolino[4,3-e]pirazino[2,3-b]pirazin-5-ona;
6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-(2-metoxietil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(2-amino-7-metil-1 H-benzo[d]imidazol-5-il)-4-(3-(trifluorometil)bencil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-(3-(trifluorometil)bencil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
9-(4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)-2-metilfenil)-6,11,4a-trihidromorfolino[4,3-e]pirazino[2,3-b]pirazin-5-ona;
6-(4-metil-2-(metilamino)-1 H-benzo[d]imidazol-6-il)-4-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
8-(4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)-2-metilfenil)-5,1 0,3 a-trihidropirazino [2,3-b]pirrolidino[1,2-e]pirazin-4-ona;
6-(4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-etil-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-4-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 6-(-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-(2-metoxietil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-(3-(trifluorometil)bencil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(2-metil-4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-4-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 6-(4-metil-1 H-benzo[d]imidazol-6-il)-4-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 6-(4-(2-hidroxipropan-2-il)fenil)-4-(2-tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
6-(4-(1 H-1,2,4-triazol-5-il)fenil)-4-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona, y sales, clatratos, solvatos, estereoisómeros, tautómeros, y profármacos farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Como se describe también en esta invención, los inhibidores de la quinasa TOR incluyen compuestos que tienen la siguiente fórmula (IV):
y sales, clatratos, solvatos, estereoisómeros, tautómeros, y profármacos farmacéuticamente aceptables de los mismos, donde:
R 1 es alquilo C 1-8 sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterociclilo sustituido o no sustituido, o heterociclilalquilo sustituido o no sustituido;
R 2 es H, alquilo C 1-8 sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterociclilo sustituido o no sustituido, heterociclilalquilo sustituido o no sustituido, aralquilo sustituido o no sustituido, o cicloalquilalquilo sustituido o no sustituido;
R3 es H, o un alquilo C1-8 sustituido o no sustituido,
donde en ciertos ejemplos, los inhibidores de la quinasa TOR no incluyen 7-(4-hidroxifenil)-1-(3 -metoxibencil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona, representados a continuación:
Figure imgf000021_0001
En algunos compuestos de la fórmula (IV), el compuesto a una concentración de 10 pM puede inhibir mTOR, ADN-PK, o PI3K o una combinación de los mismos, al menos aproximadamente un 50%. Puede mostrarse que los compuestos de la fórmula (IV) son inhibidores de las quinasas anteriores en cualquier sistema de ensayo adecuado. El inhibidor de la quinasa TOR de la fórmula (IV) para los usos de la presente invención es 1 -etil-7- (2-metil-6- (1H-1,2,4-triazol-3-il) piridin-3-il) - 3,4-dihidropirazino [2,3-b] pirazin-2 (1 H)-ona.
Los inhibidores de la quinasa TOR representativos de la fórmula (IV) como se describen en esta invención incluyen: 7-(5-fluoro-2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1-((frans-4-metoxiciclohexil)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-1 -(c/s-4-metoxiciclohexil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(1 H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(5-fluoro-2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1-((c/s-4-metoxiciclohexil)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
1 -etil-7-(1 H-pirrolo[3,2-b]piridin-5-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-1 -((c/s-4-metoxiciclohexil)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 7-(1 H-benzo[d]imidazol-4-il)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(1 H-pirrolo[2,3-b]piridin-4-il)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona;
7-(6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-1-((frans-4-metoxiciclohexil)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 7-(6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-1-((frans-4-hidroxiciclohexil)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 7-(6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-1 -(c/s-4-hidroxiciclohexil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(5-fluoro-2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1-(c/s-4-hidroxiciclohexil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 7-(6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-1 -(tetrahidro-2H-piran-4-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-1 -(2-metoxietil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-1 -etil-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(5-fluoro-2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1-((c/s-4-hidroxiciclohexil)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(5-fluoro-2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 7-(1 H-indol-4-il)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(5-fluoro-2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1-((frans-4-hidroxiciclohexil)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-1-((c/s-4-hidroxiciclohexil)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 7-(6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-1 -(frans-4-hidroxiciclohexil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-1 -((frans-4-metoxiciclohexil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-1 -isopropil-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(5-fluoro-2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 -(frans-4-metoxiciclohexil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(5-fluoro-2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1-(frans-4-hidroxiciclohexil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(5-fluoro-2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 -(2-metoxietil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(5-fluoro-2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 -isopropil-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
1 -etil-7-(5-fluoro-2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(2-hidroxipiridin-4-il)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
1 -isopropil-7-(4-metil-6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
5-(8-isopropil-7-oxo-5,6,7,8-tetrahidropirazino[2,3-b]pirazin-2-il)-4-metilpicolinamida;
7-(1 H-indazol-4-il)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(2-aminopirimidin-5-il)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(2-aminopiridin-4-il)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona;
7-(6-(metilamino)piridin-3-il)-1 -(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(6-hidroxipiridin-3-il)-1 -(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(4-(1 H-pirazol-3-il)fenil)-1 -(2-metoxietil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(piridin-3-il)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona;
7-(1 H-indazol-4-il)-1 -(2-metoxietil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(1 H-indazol-6-il)-1 -(2-metoxietil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(pirimidin-5-il)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(6-metoxipiridin-3-il)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
1-(2-metoxietil)-7-(1 H-pirrolo[2,3-b]piridin-5-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
1 -etil-7-(1 H-pirrolo[2,3-b]piridin-5-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
1 -etil-7-(1 H-indazol-4-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(piridin-4-il)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(6-aminopiridin-3-il)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona;
1-metil-7-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona;
1-óxido de 2-(2-hidroxipropan-2-il)-5-(8-(frans-4-metoxiciclohexil)-7-oxo-5,6,7,8-tetrahidropirazino[2,3-b]pirazin-2-il)piridina;
4- metil-5-(7-oxo-8-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-5,6,7,8-tetrahidropirazino[2,3-b]pirazin-2-il)picolinamida;
5- (8-((c/'s-4-metoxiciclohexil)metil)-7-oxo-5,6,7,8-tetrahidropirazino[2,3-b]pirazin-2-il)-4-metilpicolinamida;
7-(1H-pirazol-4-il)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona;
1-((frans-4-metoxiciclohexil)metil)-7-(4-metil-6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
3-((7-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-2-oxo-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-1(2H)-il)metil)benzonitrilo; 1-((frans-4-metoxiciclohexil)metil)-7-(4-metil-6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
3-(7-oxo-8-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-5,6,7,8-tetrahidropirazino[2,3-b]pirazin-2-il)benzamida;
5-(8-((frans-4-metoxiciclohexil)metil)-7-oxo-5,6,7,8-tetrahidropirazino[2,3-b]pirazin-2-il)-4-metilpicolinamida;
3- ((7-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-2-oxo-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-1 (2H)-il)metil)benzonitrilo;
7-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-1-((1 R,3R)-3-metoxiciclopentil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 7-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-1 -((1 S,3R)-3-metoxiciclopentil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 7-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-1 -((1 S,3S)-3-metoxiciclopentil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 7-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-1-((1 R,3S)-3-metoxiciclopentil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 7-(1 H-indazol-6-il)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-1-(2-morfolinoetil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
1-(frans-4-hidroxiciclohexil)-7-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 1-(c/s-4-hidroxiciclohexil)-7-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 7-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-1-(2-morfolinoetil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona;
1-isopropil-7-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona;
7-(1 H-imidazo[4,5-b]piridin-6-il)-1 -(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
1-((c/'s-4-metoxiciclohexil)metil)-7-(2-metil-6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
1-(frans-4-hidroxiciclohexil)-7-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
1-(c/'s-4-hidroxiciclohexil)-7-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
4- (7-oxo-8-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-5,6,7,8-tetrahidropirazino[2,3-b]pirazin-2-il)benzamida;
7-(1 H-indazol-5-il)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(1H-pirrolo[2,3-b]piridin-5-il)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona;
7-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-1-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona; 1-((1S,3R)-3-metoxiciclopentil)-7-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
1-((1 R,3R)-3-metoxiciclopentil)-7-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
1-((1 R,3S)-3-metoxiciclopentil)-7-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
1-((1S,3S)-3-metoxiciclopentil)-7-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(1 H-indol-5-il)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(1 H-indol-6-il)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(4-(2-hidroxipropan-2-il)fenil)-1-(frans-4-metoxiciclohexil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-1-(tetrahidro-2H-piran-4-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
1-((frans-4-metoxiciclohexil)metil)-7-(2-metil-6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-1-((c/'s-4-metoxiciclohexil)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 1-(2-metoxietil)-7-(4-metil-2-(metilamino)-1 H-benzo[d]imidazol-6-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 7-(7-metil-2-oxo-2,3-dihidro-1 H-benzo[d]imidazol-5-il)-1-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3 b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(2-metil-4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona;
1 -(2-metoxietil)-7-(4-metil-6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
1-bencil-7-(2-metil-4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(3-fluoro-4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1-(2-metoxietil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(3-fluoro-4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1-(2-tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona; 7-(3-fluoro-2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 -(2-metoxietil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
1-(frans-4-metoxiciclohexil)-7-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 7-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-1-(frans-4-metoxiciclohexil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(5-fluoro-2-metil-4-(4H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1-(2-tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(3-fluoro-2-metil-4-(1H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1-(2-tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
1-(2-metoxietil)-7-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona;
7-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-1-(frans-4-metoxiciclohexil)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 1-(ciclopentilmetil)-7-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(4-(2-hidroxipropan-2-il)fenil)-1-(2-metoxietil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
(S)-7-(6-(1 -hidroxietil)piridin-3-il)-1 -(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
(R)-7-(6-(1-hidroxietil)piridin-3-il)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona;
7-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-1-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona;
7-(4-(2-hidroxipropan-2-il)fenil)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-1-(4-(trifluorometil)bencil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-1-(3-(trifluorometil)bencil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-1-(3-morfolinopropil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(4-metil-6-(1H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona;
7-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-1-(2-metoxietil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-1-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 7-(4-metil-2-(metilamino)-1 H-benzo[d]imidazol-6-il)-1-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(2-amino-4-metil-1 H-benzo[d]imidazol-6-il)-1-((tetrahidro-2H-piran-4-il)metil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(2-metil-6-(4H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona;
(R) -7-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-3-metil-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
(S) -7-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-3-metil-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-3,3-dimetil-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(2-amino-4-metil-1 H-benzo[d]imidazol-6-il)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
7-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 7-(2-metil-4-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1 -(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; 7-(4-(1 H-1,2,4-triazol-5-il)fenil)-1 -(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona;
1 - (1 -hidroxipropan-2-il)-7-(2-metil-6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona; y 1 -(2-hidroxietil)-7-(2-metil-6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1 H)-ona,
y sales, clatratos, solvatos, estereoisómeros, tautómeros, y profármacos farmacéuticamente aceptables de los mismos.
PROCEDIMIENTOS PARA REALIZAR INHIBIDORES DE LA QUINASA TOR
Los inhibidores de la quinasa TOR pueden obtenerse mediante metodología sintética estándar muy conocida, véase, por ejemplo, March, J. Advanced Organic Chemistry; Reactions Mechanisms, and Structure, 4a ed., 1992. Los materiales de partida para preparar los compuestos de la fórmula (III) y, por lo tanto, los intermedios, están disponibles comercialmente o pueden prepararse a partir de materiales disponibles comercialmente usando procedimientos y reactivos sintéticos conocidos.
Se pueden encontrar procedimientos particulares para preparar los compuestos descritos en esta invención, por ejemplo en los documentos de patente de EE.UU. N. ° 7.981.893, presentado el 18 de octubre de 2007 , 7.968.556, presentado el 18 de octubre de 2007 y 8.110.578, presentado el 26 de octubre de 2009 .
PROCEDIMIENTOS DE USO
En esta invención se proporciona un inhibidor de la quinasa TOR para usar en procedimientos para tratar o prevenir el cáncer de próstata como se define en las reivindicaciones. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la quinasa TOR se administra a un paciente que tiene cáncer de próstata localmente avanzado, recurrente o metastásico que no es susceptible de resección quirúrgica curativa. En otra realización, el inhibidor de la quinasa TOR se administra a un paciente que ha recibido al menos una línea previa de quimioterapia basada en platino. En algunas realizaciones, el inhibidor de la quinasa TOR se administra a un paciente que tiene un tumor que muestra una sobreexpresión de ADN-PK.
Para el objeto de la invención, el cáncer de próstata no es cáncer de próstata resistente a la castración que sobreexpresa ETS.
En ciertas realizaciones, el cáncer de próstata es cáncer de próstata sensible a la rapamicina. En ciertas realizaciones, el cáncer de próstata es cáncer de próstata insensible a la rapamicina.
En ciertas realizaciones, en esta invención se proporciona un inhibidor de la quinasa TOR para usar en procedimientos para tratar el cáncer de próstata como se define en las reivindicaciones, donde el inhibidor de la quinasa TOR inhibe la proliferación de células tumorales.
En ciertas realizaciones, el inhibidor de la quinasa TOR induce la apoptosis en las células tumorales.
En ciertas realizaciones, el inhibidor de la quinasa TOR inhibe la angiogénesis en las células tumorales.
En ciertas realizaciones, el inhibidor de la quinasa TOR inhibe la proliferación de células tumorales, induce la apoptosis de las células tumorales e inhibe la angiogénesis.
En ciertos ejemplos, existen procedimientos para mejorar los Criterios del Grupo de trabajo de antígeno prostático específico 2 (PSAWG2) para el cáncer de próstata (véase Scher, H., Halab, S., Tannock, S., Morris, M., Sternberg, CN, y col. Diseño y puntos finales de ensayos clínicos para pacientes con cáncer de próstata progresivo y niveles castrados de testosterona: Recomendaciones del Grupo de trabajo de ensayos clínicos sobre el cáncer de próstata. J Clin Oncol. 2008; (26) 1148-1159) de un paciente, que comprende la administración de una cantidad eficaz de un inhibidor de la quinasa TOR a un paciente con cáncer de próstata.
En un ejemplo, se describen en esta invención procedimientos para inhibir la fosforilación de S6RP, 4E-BP1 y/o AKT en un paciente que tiene cáncer de próstata, que comprende la administración de una cantidad eficaz de un inhibidor de la quinasa TOR a dicho paciente. La inhibición de la fosforilación puede evaluarse en una muestra biológica del paciente, tal como como en sangre circulante y/o células tumorales, biopsias de la piel y/o biopsias o aspirado tumoral. En tales realizaciones, la cantidad de inhibición de la fosforilación se evalúa por comparación de la cantidad de fosfo-S6RP, 4E-BP1 y/o AKT antes y después de la administración del inhibidor de la quinasa TOR. En ciertas realizaciones, en esta invención se proporciona el inhibidor de la quinasa TOR para uso de la invención, donde el procedimiento comprende además medir la inhibición de la fosforilación de S6RP, 4E-BP1 o AKT en una muestra biológica de un paciente con cáncer de próstata, que comprende medir la cantidad de S6RP fosforilada, 4E BP1 y/o AKT en dicho paciente después de la administración del inhibidor de la quinasa TOR como se define en las reivindicaciones, y comparando dicha cantidad de S6RP fosforilada, 4E BP1 y/o AKT con la de dicho paciente antes de dicha administración.
En ciertas realizaciones, se proporciona en esta invención el inhibidor de la quinasa TOR para uso de la invención, donde el procedimiento comprende además evaluar la inhibición de la fosforilación de S6RP, 4E-BP1 y/o AKT en una muestra biológica de un paciente con cáncer de próstata, que comprende comparar la cantidad de S6RP fosforilada, 4E-BP1 y/o AKT en una muestra biológica de un paciente obtenida antes y después de la administración de dicho inhibidor de la quinasa TOR como se define en las reivindicaciones, donde menos S6RP, 4E-BP1 y/o AKT fosforilada en dicha muestra biológica obtenida después de la administración de dicho inhibidor de la quinasa TOR en relación con la cantidad de S6RP, 4E-BP1 y/o AKT fosforilada en dicha muestra biológica obtenida antes de la administración de dicho inhibidor de la quinasa TOR indica inhibición.
En una realización, se proporciona en esta invención el inhibidor de la quinasa TOR para uso de la invención, donde el procedimiento comprende además evaluar la inhibición de la actividad de la proteína quinasa dependiente de ADN (ADN-PK) en una muestra de piel de un paciente que tiene cáncer de próstata como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la inhibición de ADN-PK se evalúa en una muestra de piel irradiada con luz ultravioleta de dicho paciente. En otro ejemplo, la inhibición de ADN-PK se evalúa en un aspirado o biopsia tumoral de un paciente con cáncer de próstata. En una realización, la inhibición puede evaluarse midiendo la cantidad de ADN-PK S2056 fosforilado (también conocido como pADN-PK S2056) antes y después de la administración del inhibidor de la quinasa TOR. En ciertas realizaciones, se proporciona en esta invención el inhibidor de la quinasa TOR para uso de la invención, donde el procedimiento comprende además medir la inhibición de la fosforilación de ADN-PK S2056 en una muestra de piel de un paciente con cáncer de próstata, que comprende medir la cantidad de ADN-PK S2056 fosforilado presente en la muestra de piel después de la administración del inhibidor de la quinasa TOR como se define en las reivindicaciones, y comparando dicha cantidad de ADN-PK S2056 fosforilado con la de una muestra de piel de dicho paciente antes de dicha administración. En una realización, la muestra de piel se irradia con luz UV.
En ciertos ejemplos, existen procedimientos para inhibir la actividad de la proteína quinasa dependiente del ADN (ADN-PK) en una muestra de piel de un paciente que tiene cáncer de próstata, que comprende administrar una cantidad efectiva de un inhibidor de la quinasa TOR a dicho paciente y comparar la cantidad de ADN-PK fosforilado en una muestra biológica de un paciente obtenida antes y después de la administración de dicho inhibidor de la quinasa TOR , donde menos ADN-PK fosforilado en dicha muestra biológica obtenida después de la administración de dicho inhibidor de la quinasa TOR en relación con la cantidad de ADN-PK fosforilado en dicha muestra biológica obtenida antes de la administración de dicho inhibidor de la quinasa TOR indica inhibición.
En ciertas realizaciones, se detiene la detención de G1 en un paciente. En ciertos ejemplos, existen procedimientos para inducir la detención de G1 en una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer de próstata, que comprende administrar una cantidad efectiva de un inhibidor de la quinasa TOR a dicho paciente.
En ciertas realizaciones, se inhibe el crecimiento de cáncer de próstata sensible a la rapamicina en un paciente. En ciertos ejemplos, existen procedimientos para inhibir el crecimiento del cáncer de próstata sensible a la rapamicina en una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer de próstata, que comprende administrar una cantidad efectiva de un inhibidor de la quinasa TOR a dicho paciente.
En ciertas realizaciones, se inhibe el crecimiento de cáncer de próstata insensible a la rapamicina en un paciente. En ciertos ejemplos, existen procedimientos para inhibir el crecimiento de cáncer de próstata insensible a la rapamicina en una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer de próstata, que comprende administrar una cantidad efectiva de un inhibidor de la quinasa TOR a dicho paciente.
En ciertas realizaciones, se inhibe pS6 en un paciente. En ciertas realizaciones, pS6 se inhibe en una muestra biológica de dicho paciente.
En ciertas realizaciones, pAkt se inhibe en al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70% o al menos el 80% en un paciente. En ciertas realizaciones, pAkt se inhibe en al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70% o al menos el 80% en una muestra biológica de dicho paciente.
En algunos ejemplos, el inhibidor de la quinasa TOR es un compuesto como se describe en esta invención. En un ejemplo, el inhibidor de la quinasa TOR es el Compuesto 1 (un inhibidor de la quinasa TOR expuesto en esta invención que tiene la fórmula molecular C 21 H 27 N5O3). En una realización, el Compuesto 1 es 7-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-1-((1r,4r)-4-metoxiciclohexil)-3,4-dihidropirazino-[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona. La quinasa TOR para usos de la presente invención es el Compuesto 2, a saber, 1 -etil-7- (2-metil-6- (1H-1,2,4-triazol-3-il) piridin-3-il) -3 , 4-dihidropirazino [2,3-b] pirazin-2 (1 H)-ona que tiene una fórmula molecular C 16 H 16 N 8 O.
Un inhibidor de la quinasa TOR puede combinarse con radioterapia y/o cirugía. En determinadas realizaciones, un inhibidor de la quinasa TOR se administra a un paciente que está siendo sometido a radioterapia, ha sido sometido previamente a radioterapia o se someterá a radioterapia. En determinadas realizaciones, un inhibidor de la quinasa TOR se administra a un paciente que ha sido sometido a cirugía para eliminar el tumor.
En realizaciones adicionales, los pacientes incluyen pacientes que han sido tratados previamente para cáncer de próstata, pero que no responden a terapias estándar, así como aquellos que no han sido tratados previamente. En realizaciones adicionales, los pacientes incluyen pacientes que se han sometido a cirugía en un intento de tratar la afección en cuestión, así como aquellos que no lo han hecho. Debido a que los pacientes con cáncer de próstata pueden tener manifestaciones clínicas heterogéneas y resultados clínicos variables, el tratamiento que se administra a un paciente puede variar dependiendo de su pronóstico. Los expertos en medicina podrán determinar fácilmente, sin experimentación innecesaria, los agentes secundarios específicos, los tipos de cirugía y los tipos de tratamiento estándar no basados en fármacos que se pueden usar de forma eficaz para tratar un paciente individual con cáncer de próstata.
En una realización, el cáncer de próstata es uno en el que se activa la vía PI3K/mTOR. En ciertas realizaciones, el cáncer de próstata es uno en el que la vía PI3K/mTOR se activa debido a la pérdida de PTEN, una mutación PIK3Ca o sobreexpresión de EGFR, o una combinación de las mismas.
COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y VÍAS DE ADMINISTRACIÓN
En esta invención se proporcionan composiciones que comprenden una cantidad efectiva del inhibidor de la quinasa TOR y composiciones que comprenden una cantidad efectiva del inhibidor de la quinasa TOR y un transportador o vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica descrita en esta invención es adecuada para administración oral, parenteral, mucosa, transdérmica o tópica.
Los inhibidores de la quinasa TOR pueden administrarse a un paciente oralmente o parenteralmente en la forma convencional de preparaciones, tales como cápsulas, microcápsulas, comprimidos, gránulos, polvo, tabletas, píldoras, supositorios, inyecciones, suspensiones y jarabes. Las formulaciones adecuadas se pueden preparar por procedimientos comúnmente empleados usando aditivos convencionales, orgánicos o inorgánicos, como un excipiente (por ejemplo, sacarosa, almidón, manitol, sorbitol, lactosa, glucosa, celulosa, talco, fosfato de calcio o carbonato de calcio), un aglutinante (por ejemplo, celulosa, metilcelulosa, hidroximetilcelulosa, polipropilpirrolidona, polivinilpirrolidona, gelatina, goma arábiga, polietilenglicol, sacarosa o almidón), un desintegrador (por ejemplo, almidón, carboximetilcelulosa, hidroxipropil almidón, hidroxipropilcelulosa de baja sustitución, bicarbonato de sodio, fosfato de calcio o citrato de calcio), un lubricante (por ejemplo, estearato de magnesio, ácido silícico anhidro ligero, talco o laurilsulfato de sodio), un agente aromatizante (por ejemplo, ácido cítrico, mentol, glicina o polvo de naranja), un conservante (por ejemplo, benzoato de sodio, bisulfito de sodio, metilparabeno o propilparabeno), un estabilizador (por ejemplo, ácido cítrico, citrato de sodio o ácido acético), un agente de suspensión (por ejemplo, metilcelulosa, polivinilpirrololiclona o estearato de aluminio), un agente dispersante (por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa), un diluyente (por ejemplo, agua) y cera base (por ejemplo, manteca de cacao, vaselina blanca o polietilenglicol). La cantidad efectiva del inhibidor de la quinasa TOR en la composición farmacéutica, puede encontrarse en un nivel que ejercerá el efecto deseado; por ejemplo, aproximadamente 0,005 mg/kg del peso corporal de un paciente a aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal de un paciente en una dosificación unitaria tanto para administración oral como parenteral.
La dosis de un inhibidor de la quinasa TOR que se va a administrar a un paciente es bastante ampliamente variable y puede estar sujeta al criterio de un profesional sanitario. La dosis para los usos de la presente invención es de 0,5 mg/día a 128 mg/día. En general, los inhibidores de la quinasa TOR pueden administrarse de una a cuatro veces al día en una dosis de aproximadamente 0,005 mg/kg del peso corporal de un paciente a aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal de un paciente, pero la dosificación anterior puede variar adecuadamente dependiendo de la edad, el peso corporal y la afección médica del paciente y el tipo de administración. En un ejemplo, la dosis es aproximadamente 0,01 mg/kg del peso corporal de un paciente a aproximadamente 5 mg/kg del peso corporal de un paciente , aproximadamente 0,05 mg/kg del peso corporal de un paciente a aproximadamente 1 mg/kg del peso corporal de un paciente , aproximadamente 0,1 mg/kg del peso corporal de un paciente a aproximadamente 0,75 mg/kg del peso corporal de un paciente o aproximadamente 0,25 mg/kg del peso corporal de un paciente a aproximadamente 0,5 mg/kg del peso corporal de un paciente. En un ejemplo, se administra una dosis por día En otro ejemplo, se administran dos dosis por día. En cualquier caso dado, la cantidad del inhibidor de la quinasa TOR que se administre dependerá de factores tales como la solubilidad del componente activo, la formulación usada y la vía de administración.
En otro ejemplo, existen procedimientos para el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno que comprenden la administración de aproximadamente 0,375 mg/día a aproximadamente 750 mg/día, aproximadamente 0,75 mg/día a aproximadamente 375 mg/día, aproximadamente 3,75 mg/día día a aproximadamente 75 mg/día, aproximadamente 7,5 mg/día a aproximadamente 55 mg/día o aproximadamente 18 mg/día a aproximadamente 37 mg/día de un inhibidor de la quinasa TOR para un paciente que lo necesite. En una realización particular, la dosis para administración es de 15 mg/día, 30 mg/día, 45 mg/día o 60 mg/día. En otra realización, la dosis para administración es de 0,5 mg/día, 1 mg/día, 2 mg/día, 4 mg/día, 8 mg/día, 16 mg/día, 20 mg/día, 25 mg/día, 30 mg/día o 40 mg/día.
En otro ejemplo, hay procedimientos para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o trastorno que comprenden la administración de aproximadamente 0,1 mg/día a aproximadamente 1.200 mg/día, aproximadamente 1 mg/día a aproximadamente 100 mg/día, aproximadamente 10 mg/día a aproximadamente 1.200 mg/día, aproximadamente 10 mg/día a aproximadamente 100 mg/día, aproximadamente 100 mg/día a aproximadamente 1.200 mg/día, aproximadamente 400 mg/día a aproximadamente 1.200 mg/día, aproximadamente 600 mg/día a aproximadamente 1.200 mg/día, aproximadamente 400 mg/día a aproximadamente 800 mg/día o aproximadamente 600 mg/día a aproximadamente 800 mg/día de un inhibidor de la quinasa TOR a un paciente que lo necesita. En una realización particular, las dosis para administración son de 0,5 mg/día, 1 mg/día, 10 mg/día, 15 mg/día, 20 mg/día, 30 mg/día, 40 mg/día, 45 mg/día, 50 mg/día, 60 mg/día, 75 mg/día, 100 mg/día o 125 mg/día.
En otro ejemplo, se proporcionan formulaciones de dosificación unitaria que comprenden entre aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente 2.000 mg, aproximadamente 1 mg y 200 mg, aproximadamente 35 mg y aproximadamente 1.400 mg, aproximadamente 125 mg y aproximadamente 1.000 mg, aproximadamente 250 mg y aproximadamente 1.000 mg, o aproximadamente 500 mg y aproximadamente 1.000 mg del inhibidor de la quinasa TOR.
En un ejemplo particular, se proporcionan formulaciones de dosificación unitaria que comprenden aproximadamente 0,1 mg, 0,25 mg, 0,5 mg, 1 mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 30 mg, 45 mg, 50 mg, 60 mg, 75 mg, 100 mg, 125 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 400 mg, 600 mg o 800 mg del inhibidor de la quinasa t Or .
En otro ejemplo, se proporcionan formulaciones de dosificación unitaria que comprenden 0,1 mg, 0,25 mg, 0,5 mg, 1 mg, 2.5 mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 30 mg, 35 mg, 50 mg, 70 mg, 100 mg, 125 mg, 140 mg, 175 mg, 200 mg, 250 mg, 280 mg, 350 mg, 500 mg, 560 mg, 700 mg, 750 mg, 1.000 mg o 1.400 mg del inhibidor de la quinasa TOR. En un ejemplo particular, se proporcionan formulaciones de dosificación unitaria que comprenden 10 mg, 15 mg, 20 mg, 30 mg, 45 mg o 60 mg de un inhibidor de la quinasa TOR.
Un inhibidor de la quinasa TOR puede administrarse una, dos, tres, cuatro o más veces diariamente.
Un inhibidor de la quinasa TOR puede administrarse oralmente por razones de conveniencia. En una realización, cuando se administra oralmente, el inhibidor de la quinasa TOR se administra con una comida y agua. En otra realización, el inhibidor de la quinasa TOR se dispersa en agua o zumo (por ejemplo, zumo de manzana o zumo de naranja) y se administra oralmente como una suspensión. En otra realización, cuando se administra oralmente, el inhibidor de la quinasa TOR se administra en un estado de ayuno.
El inhibidor de la quinasa TOR también puede administrarse intradérmicamente, intramuscularmente, intraperitonealmente, percutáneamente, intravenosamente, subcutáneamente, intranasalmente, epiduralmente, sublingualmente, intracerebralmente, intravaginalmente, transdérmicamente, rectalmente, mucosalmente, por inhalación, o tópicamente en los oídos, nariz, ojos, o piel. El modo de administración se deja a criterio del profesional sanitario y puede depender en parte del lugar de la afección médica.
En una realización, se proporcionan en esta invención cápsulas que contienen el inhibidor de la quinasa TOR para usos de la presente invención sin un vehículo, excipiente o transportador adicional.
En otra realización, se proporcionan en esta invención composiciones que comprenden una cantidad eficaz del inhibidor de la quinasa TOR para usos de la presente invención y un vehículo o transportador farmacéuticamente aceptable, donde un vehículo o transportador farmacéuticamente aceptable puede comprender un excipiente, diluyente o una mezcla de los mismos. En una realización, la composición es una composición farmacéutica.
La composición puede estar en la forma de comprimidos, comprimidos masticables, cápsulas, disoluciones, disoluciones parenterales, tabletas, supositorios y suspensiones y similares. Las composiciones pueden formularse para contener una dosis diaria, o una fracción conveniente de una dosis diaria, en una unidad de dosificación, que puede ser un único comprimido o cápsula o un volumen conveniente de un líquido. En una realización, las disoluciones se preparan a partir de sales solubles en agua, tales como la sal hidrocloruro. En general, todas las composiciones se preparan según procedimientos conocidos en la química farmacéutica. Las cápsulas pueden prepararse mezclando un inhibidor de la quinasa TOR con un transportador o diluyente adecuado y usarse la cantidad apropiada de la mezcla para rellenar cápsulas. Los transportadores y diluyentes habituales incluyen, pero no están limitados a, sustancias en polvo inertes tales como almidón de muchas clases diferentes, celulosa en polvo, especialmente celulosa cristalina y microcristalina, azúcares tales como fructosa, manitol y sacarosa, harinas de grano y polvos comestibles similares.
Los comprimidos pueden prepararse por compresión directa, por granulación húmeda, o por granulación seca. Sus formulaciones incorporan habitualmente diluyentes, aglutinantes, lubricantes y disgregantes, así como el compuesto. Los diluyentes típicos incluyen, por ejemplo, varios tipos de almidón, lactosa, manitol, caolín, fosfato o sulfato de calcio, sales inorgánicas tales como cloruro de sodio y azúcar en polvo. También son útiles los derivados de celulosa en polvo. En una realización, la composición farmacéutica está libre de lactosa. Los aglutinantes de comprimidos típicos son sustancias tales como almidón, gelatina y azúcares tales como lactosa, fructosa, glucosa y similares. También son convenientes las gomas naturales y sintéticas, incluyendo goma arábiga, alginatos, metilcelulosa, polivinilpirrolidina y similares. También pueden servir como aglutinantes el polietilen glicol, etilcelulosa y ceras.
Podría ser necesario un lubricante en una formulación de comprimido para evitar que el comprimido y los punzones se peguen en el troquel. El lubricante puede elegirse de sólidos deslizantes tales como talco, estearato de magnesio y de calcio, ácido esteárico y aceites vegetales hidrogenados. Los disgregantes de comprimidos son sustancias que se hinchan cuando se humedecen para romper el comprimido y liberar el compuesto. Incluye almidones, arcillas, celulosas, alginas y gomas. Más particularmente, pueden usarse almidones de maíz y de patata, metilcelulosa, agar, bentonita, celulosa de madera, esponja natural en polvo, resinas de intercambio catiónico, ácido algínico, goma guar, pulpa de cítricos y carboximetil celulosa, por ejemplo, así como lauril sulfato de sodio. Los comprimidos pueden estar recubiertos con azúcar como un sabor y sellante, o con agentes protectores que forman una película para modificar las propiedades de disolución del comprimido. Las composiciones también pueden formularse como comprimidos masticables, por ejemplo, usando sustancias tales como manitol en la formulación.
Cuando se desea administrar un inhibidor de la quinasa TOR como un supositorio, pueden usarse las bases típicas. La manteca de cacao es una base tradicional para supositorios, pero se puede modificar por la adición de ceras para elevar su punto de fusión ligeramente. Se usan ampliamente las bases de supositorio miscibles con agua que comprenden, particularmente, polietilen glicoles de varios pesos moleculares.
El efecto del inhibidor de la quinasa TOR puede retrasarse o prolongarse mediante la formulación apropiada. Por ejemplo, puede prepararse un gránulo lentamente soluble del inhibidor de la quinasa TOR e incorporarse en un comprimido o cápsula, o como un dispositivo implantable de liberación lenta. La técnica también incluye mezclar gránulos con varias tasas de disolución diferentes y rellenar cápsulas con una mezcla de los gránulos. Los comprimidos o cápsulas pueden recubrirse con una película que resista la disolución durante un periodo de tiempo predecible. Incluso las preparaciones parenterales pueden hacerse de acción duradera, disolviendo o suspendiendo el inhibidor de la quinasa TOR en aceite o vehículos emulsionados que le permiten dispersarse lentamente en el suero.
KITS
En ciertas realizaciones, en esta invención se proporcionan kits que comprenden el inhibidor de la quinasa TOR para usos de la presente invención.
En otras realizaciones, se proporcionan en esta invención kits que comprenden el inhibidor de la quinasa TOR para usos de la presente invención y medios para controlar la respuesta del paciente a la administración de dicho inhibidor de la quinasa TOR. En realizaciones particulares, la respuesta del paciente medida es la inhibición de la progresión de la enfermedad, la inhibición del crecimiento tumoral, la reducción del tumor o tumores primarios y/o secundarios, el alivio de los síntomas relacionados con el tumor, la mejora de la calidad de vida, la aparición tardía de tumores primarios y/o secundarios, el desarrollo lento de tumores primarios y/o secundarios, la disminución de la aparición de tumores primarios y/o secundarios, la disminución o ralentización de la gravedad de los efectos secundarios de la enfermedad, el crecimiento tumoral detenido o la regresión del tumor.
En otras realizaciones, se proporcionan en esta invención kits que comprenden el inhibidor de la quinasa TOR para usos de la presente invención y medios para medir la cantidad de inhibición de la fosforilación de S6RP, 4F-BP1 y/o AKT. Los kits pueden comprender medios para medir la inhibición de la fosforilación de S6RP, 4E-BP1 y/o AKT en sangre circulante o células tumorales, y/o biopsias de la piel o biopsias/aspirados tumorales de un paciente. En ciertas realizaciones, en esta invención se proporcionan kits que comprenden un inhibidor de la quinasa TOR para usos de la presente invención y medios para medir la cantidad de inhibición de la fosforilación como se evalúa por comparación de la cantidad de fosfo- S6RP, 4E-BP1 y/o AKT antes, durante y/o después de la administración del inhibidor de la quinasa TOR.
En otras realizaciones, en esta invención se proporcionan kits que comprenden el inhibidor de la quinasa TOR para los usos de la presente invención y medios para medir la cantidad de inhibición de la actividad de la proteína quinasa dependiente de ADN (ADN-PK). Los kits pueden comprender medios para medir la cantidad de inhibición de la actividad de la proteína quinasa dependiente de ADN (ADN-PK) en una muestra de piel y/o una biopsia/aspirado tumoral de un paciente. Los kits pueden comprender un medio para medir la cantidad de pADN-PK S2056 en una muestra de piel y/o una biopsia/aspirado tumoral de un paciente. En una realización, la muestra de piel se irradia con luz UV. En ciertas realizaciones, se proporcionan en esta invención kits que comprenden el inhibidor de la quinasa TOR para los usos de la presente invención y medios para medir la cantidad de inhibición de la actividad de la proteína quinasa dependiente de ADN (ADN-PK) antes, durante y/o después de la administración del inhibidor de la quinasa TOR. En ciertas realizaciones, en esta invención se proporcionan kits que comprenden un inhibidor de la quinasa TOR y medios para medir la cantidad de ADN-PK S2056 fosforilado antes, durante y/o después de la administración del inhibidor de la quinasa TOR.
En ciertos ejemplos, los kits descritos en esta invención comprenden una cantidad de un inhibidor de la quinasa TOR eficaz para tratar o prevenir el cáncer de próstata. En ciertos ejemplos, los kits descritos en esta invención comprenden un inhibidor de la quinasa TOR que tiene la fórmula molecular C 21 H 27 norte 5 O 3 . En ciertos ejemplos, los kits descritos en esta invención comprenden el Compuesto 1. Los kits proporcionados en esta invención comprenden el Compuesto 2 que tiene la fórmula molecular C 16 H 16 N 8 O.
En ciertas realizaciones, los kits proporcionados en esta invención comprenden además instrucciones de uso, tales como para administrar el inhibidor de la quinasa TOR para usos de la presente invención y/o monitorizar la respuesta del paciente a la administración de dicho inhibidor de la quinasa TOR.
EJEMPLOS
ESTUDIOS IN VITRO. (descrito como referencia)
Las líneas celulares PC3 y HeLa descritas en esta invención se adquirieron de American Tissue Culture Collection (ATCC). Las células se cultivaron en medios de crecimiento según lo recomendado por el vendedor.
Las células tumorales PC3 se sembraron a 250.000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos y se dejaron equilibrar durante la noche en 5% de CO 2 a 37 °C. Para el tratamiento, se aspiraron los medios para eliminar las células muertas/flotantes antes de la adición de 3 ml de medios con o sin compuesto. Las células se incubaron en presencia de control de vehículo (DMSO, 0,2%) o Compuesto 1 (0,5, 1 o 5 pM) durante 24 horas. Las células fueron procesadas para el análisis del ciclo celular. Los medios se transfirieron en un tubo de 15 ml. Las células se tripsinizaron y se transfirieron al mismo tubo. Las células se centrifugaron a 12.000 rpm, se re-suspendieron en 500 pL de tampón de tinción con yoduro de propidio (PI), y se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos. La muestra se analizó a continuación en un instrumento FACSCaliber. Los experimentos del ciclo celular se realizaron en dos ocasiones independientes.
Los datos sin procesar recopilados de BD FACS Calibur fueron analizados por el software de ciclo celular ModFit LT (Verity Software House, Inc). El histograma se generó utilizando la configuración de análisis automático. Todos los números generados por ModFit LT fueron transferidos a Microsoft Excel y graficados.
Los efectos del Compuesto 1 sobre la distribución del ciclo celular se evaluaron usando tinción de PI basada en citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 1, se muestra una comparación de los histogramas de ADN para células HeLa y PC3 no tratadas. Las células PC3 muestran un fenotipo aneuploide que es evidente en la comparación con las células HeLa.
La Figura 2 muestra la redistribución de las células PC3 a través del ciclo celular en respuesta a la exposición al Compuesto 1 a 0,5 y 5 pM en comparación con el control DMSO. No parece que en este experimento haya un pico sub-Gl indicativo de apoptosis a ninguna concentración del Compuesto 1. Ambas concentraciones del Compuesto 1 tuvieron un efecto marcado en el ciclo celular, lo que indica una detención de G1. La cuantificación de los datos de los experimentos se muestra a continuación en la Tabla 1.
TABLA 1
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(continuación)
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El compuesto 1 se evaluó por su efecto sobre la distribución del ciclo celular en células PC3. A concentraciones relevantes para las requeridas para producir inhibición del crecimiento en esta línea celular, el Compuesto 1 fue capaz de inducir una detención de G1. No parecía haber inducción de apoptosis.
PERFIL CELULAR DEL COMPUESTO 1 EN LÍNEAS DE CELULAS SENSIBLES E INSENSIBLES A LA RAPAMICINA (descrito como referencia)
Diseño del estudio. La actividad antiproliferativa del Compuesto 1 se evaluó en la línea celular de tumor de próstata. Las células se colocaron en placas de 96 pocillos y después de un período de equilibrio nocturno se expusieron durante 3 días a concentraciones de 0,05, 0,15, 0,5, 1,5 y 5 pM del Compuesto 1. Cuando fue necesario, las concentraciones del Compuesto 1 se incrementaron a 20 pM. La inhibición del crecimiento de rapamicina se determinó en las mismas condiciones en un intervalo de concentración de 0,01-1 pM o 0,1-10 pM, dependiendo de la línea celular. Todos los pocillos de prueba estaban por triplicado en la placa y en un volumen final de 200 pL. La concentración final de DMSO en todos los pocillos fue del 0,2%. La inhibición del crecimiento se determinó a partir de la comparación del Compuesto 1 con el control DMSO y el grado de proliferación celular medido con WST-1. Todos los experimentos de inhibición del crecimiento se repitieron en diferentes ocasiones al menos dos veces. La potencia se determinó calculando el valor IC 50 de los datos que describen la curva de inhibición del crecimiento. Se incluyó un compuesto de referencia en cada ensayo de placa para controlar la variación entre ensayos y el IC 50 de la referencia se utilizó como parte de los criterios de aceptación para el ensayo.
La inhibición intracelular de la vía mTOR por el Compuesto 1 o la rapamicina en un intervalo de concentraciones se controló a partir de sustratos directos y aguas abajo de los complejos TORC1 y TORC2 que contienen actividad de la quinasa mTOR. Las células se sembraron en placa como para el ensayo de proliferación y se expusieron al Compuesto 1 o rapamicina durante 1 hora antes del ensayo para las diferentes fosfoproteínas. El sustrato directo para TORC1 fue 4E-BP1 (T46) y el sustrato indirecto aguas abajo fue S6RP (S235/S236). El sustrato directo para TORC2 fue Akt (S473) y los sustratos indirectos medidos aguas abajo fueron GSK3B (S9) y PRAS40 (T246). Además, se monitorizó el estado de fosforilación de Akt (T308), un sitio de fosforilación para PDK1.
Ensayo de proliferación celular. El efecto de inhibición del crecimiento del Compuesto 1 y la rapamicina se determinó de la siguiente manera: las células se sembraron en placas en 180 pL de medio de crecimiento en una placa de fondo plano de 96 pocillos (número de catálogo Costar 33595; la densidad de siembra óptima se había determinado previamente) y se dejó equilibrar a 37 °C, 5% de CO 2 durante la noche. Al día siguiente, se prepararon diluciones del Compuesto 1 o del compuesto de rapamicina a partir de un stock 10 mM diluyéndolo primero a la concentración apropiada en DMSO al 100% y, a continuación, diluido 1:50 en medio de crecimiento. A continuación, se añadió compuesto al pocillo designado a una dilución de 1:10 (es decir, se añadieron 20 pl del compuesto diluido a 180 pl de medio de cultivo en cada pocillo). La dilución final del compuesto fue 1:500, lo que produjo una concentración final de DMSO del 0,2% en cada pocillo. Todas las concentraciones se realizaron por triplicado. Además, cada placa analizada contenía células tratadas con un compuesto de referencia para evaluar la variación entre ensayos y el IC 50 generado se utilizó como criterio para aceptar los datos de la prueba. El coeficiente de variación para el ensayo de proliferación celular con el compuesto de referencia en células PC3 fue del 21,5% (n = 100). Las concentraciones típicas probadas para el Compuesto 1 fueron: 5, 1,5, 0,5, 0,15, 0,05 y 0,015 pM y para la rapamicina fueron: 1,5, 0,5, 0,15, 0,05, 0,015 y 0,005 pM. Las células fueron expuestas a los compuestos de prueba durante 3 días en 5% de CO 2 a 37 °C. El ensayo WST-1 se utilizó para medir la proliferación celular en función de la medición de la actividad metabólica mediante la reducción de las sales de tetrazolio a sales de formazán. El ensayo WST-1 es un ensayo de una sola etapa que no requiere etapas de lavado. Al final de la incubación de 3 días, se agregaron 20 pL de WST-1 a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a 5% de CO 2 a 37 °C. La absorbancia se midió a 450 nm en el lector de placa multilabel VICTOR ™ X2 (PerkinElmer).
Los datos sin procesar se guardaron como un archivo de texto y, a continuación,se introdujeron en la Base de actividades (sA r basado en células; Prolif-MTT, MTT-6pt-5placas sin fijar. Versión2). El software (XLfit de IDBS) calculó el porcentaje de inhibición en cada concentración de compuesto mediante la normalización de los valores de control DMSO para cada conjunto de pocillos por triplicado. Se trazaron curvas de inhibición porcentual y se calcularon valores de IC 50 .
Determinación de fosfo-Akt (S473), fosfo-Akt (T308) y fosfo-S6RP (S235 / 5236) de Usados celulares y el efecto del compuesto 1 o rapamicina (descrito como referencia). Los ensayos de detección de biomarcadores MSD® proporcionan un procedimiento rápido y conveniente para medir los niveles totales y fosforilados de dianas proteicas dentro de una sola muestra de pequeño volumen. Estos ensayos están disponibles en formatos de un solo plex y multiplex. En un ensayo de un solo plex, un anticuerpo para un objetivo de proteína específico se recubre en un electrodo (o punto) por pocillo. En un ensayo multiplex, una matriz de anticuerpos de captura contra diferentes objetivos se modela en distintos puntos en el mismo pocillo. El ensayo de un solo plex para fosfo-Akt o fosfo-S6RP es un inmunoensayo tipo sándwich. MSD proporciona una placa que ha sido recubierta previamente con el anticuerpo de captura. Las muestras (lisados celulares) se agregan al pocillo con una solución que contiene el anticuerpo de detección marcado marcado con un compuesto electroquimioluminiscente (ECL), etiqueta MSD SULFO-TAG ™ , en el transcurso de uno o más períodos de incubación. El Akt total o S6RP presente en la muestra se une a los anticuerpos de captura inmovilizados en la superficie del electrodo de trabajo; el reclutamiento del anticuerpo de detección marcado por fosfo-Akt o fosfo-S6RP unido completa el sándwich. Se agrega MSD Read Buffer que proporciona el ambiente químico apropiado para ECL y la placa se lee usando un MSD SECTOR ™ Imager. Dentro del SECTOR Imager, se aplica un voltaje a los electrodos de la placa que hace que las etiquetas unidas a la superficie del electrodo emitan luz. El instrumento mide la intensidad de la luz emitida para proporcionar una medida cuantitativa de la cantidad de Akt fosforilado o S6RP presente en la muestra.
Las células se sembraron a la densidad requerida y se trataron con Compuesto 1 o rapamicina en un intervalo de concentraciones durante 1 hora en 5% de CO 2 a 37 °C. El compuesto 1 se usó en las mismas concentraciones que para el ensayo de proliferación. La rapamicina se usó en concentraciones de 0,001 nM a 100 nM en el ensayo para p-S6RP (S235/S236) debido a su potente actividad en este ensayo particular. Después del período de incubación, los medios de cultivo se eliminaron cuidadosamente con un aspirador. La placa se colocó en hielo y se añadieron 50 pL de tampón de lisis 1X Tris a cada pocillo. La placa se colocó en un agitador a 4 °C durante 1 hora para lisar las células. En ese punto, la placa se congeló a -80 °C para su uso posterior o se analizó la presencia de fosfoproteínas. En cuanto al ensayo de proliferación celular, se incluyó un estándar de referencia en el ensayo para células PC3 y el coeficiente de variación para el ensayo de p-S6RP (S235/S236) fue del 9,3% (n = 50) y para el ensayo de p-Akt (S473) fue del 28,6% (n = 50).
La placa de ensayo se incubó con 150 pL de MSD Blocker A Solution durante 1 hora con agitación a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con T ris Wash Buffer. A continuación, se añadieron 35 pL de lisado celular a los pocillos y se incubaron durante 1 hora con agitación a temperatura ambiente. La solución se retiró de los pocillos y la placa se lavó tres veces con tampón de lavado. A continuación, se añadieron 150 pL de IX MSD Read Buffer T a cada pocillo. Se leyó la placa en el lector de placas Sector Imager. Los datos de Excel se transfirieron a Activity Base y se calcularon los valores de IC 50 .
Determinación de fosfo-GSKB (S9), fosfo-PRAS40 (T246) y fosfo-4E-BP1 (T46) y el efecto del Compuesto 1 o Rapamicina (descrito como referencia). El formato del ensayo multiplex Luminex difiere del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) convencional en que el anticuerpo de captura multiplex está unido a un cordón de poliestireno mientras que el anticuerpo de captura ELISA está unido al pocillo de la microplaca. El uso de la tecnología basada en cuentas de suspensión permite las capacidades de multiplexación de los ensayos Luminex. La tecnología xMAP® utiliza microesferas de poliestireno de 5,6 micras, que se tiñen internamente con fluoróforos rojos e infrarrojos de diferentes intensidades. A cada cuenta se le asigna un número único, o región de cuentas, que permite la diferenciación de una cuenta de otra. Las cuentas unidas covalentemente a diferentes anticuerpos específicos se pueden mezclar en el mismo ensayo, utilizando un formato de microplaca de 96 pocillos. Al finalizar el inmunoensayo tipo sándwich, las cuentas se pueden leer, utilizando el sistema de detección Luminex 100™ o Luminex 200, en un solo archivo con láser doble para la clasificación y cuantificación de cada analito. El kit Akt-Pathway Phospho 5-plex utilizado incluye la capacidad de medir simultáneamente varios marcadores, incluidos p-GSK3p (S9), p-PRAS40 (T246) y p-4E-BP1 (T46).
Las células se sembraron a la densidad requerida y se trataron con Compuesto 1 o rapamicina en un intervalo de concentraciones durante 1 hora en 5% de Co 2 a 37 °C. El compuesto 1 y la rapamicina se usaron en las mismas concentraciones que para el ensayo de proliferación. En cuanto al ensayo de proliferación celular, se incluyó un estándar de referencia en el ensayo para células PC3 y el coeficiente de variación para el ensayo de p-GSK3p (S9) fue del 37,8% (n = 30), p-PRAS40 (t 246) fue del 27,8% (n = 30) y para p4E-BP1 (T46) fue del 13,5% (n = 4). El medio se aspiró de los pocillos y la placa se colocó en hielo. A continuación, se añadieron 35 pl de tampón de lisis a cada pocillo y se incubaron en hielo durante al menos 30 minutos. Durante la incubación, se preparó la curva estándar para cada fosfoproteína. Los estándares proporcionados se reconstituyeron y las diluciones en serie se prepararon según las instrucciones del fabricante. Al final de la etapa de lisis celular, 36 pL del lisado se transfirieron a una placa de fondo en V y se centrifugaron a 4 °C a 2.000 rpm durante 5 minutos. Durante este tiempo se prepararon las soluciones de anticuerpos de detector IX y de cuentas IX Luminex. La solución de cuentas IX se agitó en vórtex y se añadieron 25 pl a cada pocillo de una placa de fondo redondo negro. A continuación, se añadieron 50 pL del anticuerpo detector IX a cada pocillo. Cincuenta microlitros (50 pL) de los estándares preparados se agregaron a los pocillos designados. A continuación, se añadieron 25 pl del diluyente de ensayo a cada pocillo designado para los lisados celulares tratados con el compuesto. Al final del giro, se añadieron 25 pL de lisado celular a los pocillos correspondientes de la placa de ensayo negra. La placa de ensayo se cubrió con la tapa de la placa blanca y se incubó durante 3 horas a temperatura ambiente en un agitador orbital.
Aproximadamente 10-15 minutos antes del final de la primera incubación, la solución de anticuerpo secundario se preparó según el protocolo del proveedor. La proteína fluorescente roja R-ficoeritrina anti-conejo de cabra (RPE) suministrada como un concentrado 10X se diluyó para generar un stock de RPE anti-conejo de cabra IX. La placa de filtro de 96 pocillos se humedeció previamente con 200 pl de solución de lavado de trabajo IX. Al final de la incubación de 3 horas, se usó una pipeta multicanal para transferir todo el contenido de cada pocillo de ensayo a los pocillos de la placa de filtro. El líquido de los pocillos se eliminó por aspiración con el colector de vacío. A continuación, se agregaron 200 pL de solución de lavado de trabajo IX en cada pocillo. La solución de lavado se aspiró usando el colector de vacío después de 15-30 segundos. Esta etapa de lavado se repitió una vez. El fondo de la placa se secó sobre toallas de papel limpias para eliminar el líquido residual. Se añadieron cien microlitros (100 pL) de RPE anti­ conejo diluido a cada pocillo y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador orbital. El líquido se aspiró a continuación con el colector de vacío. A continuación, se agregaron 200 pL de solución de lavado de trabajo IX en cada pocillo. Las placas se lavaron tres veces con la solución de lavado. La placa se secó sobre toallas de papel limpias para eliminar el líquido residual. A continuación, se agregaron 100 pL de solución de lavado de trabajo IX a cada pocillo para re-suspender las cuentas. Las placas se leyeron en el sistema de detección Luminex 200. Los datos de Excel se transfirieron a la Base de actividades y se calcularon los valores de IC 50 .
Todos los datos se analizaron utilizando XLfit de IDBS. La fórmula usada para determinar los IC50 en XLfit fue el número de modelo 205, que utiliza un modelo logístico de 4 parámetros o modelo de respuesta a la dosis sigmoidal para calcular los valores de IC50. Los valores de IC 50 se informan como un promedio, excepto los ensayos que solo se realizaron una vez. Los valores de IC 50 obtenidos de múltiples experimentos tenían que estar dentro de 2,5 veces entre sí para ser aceptados (para n = 2) o dentro de 2,5 veces del promedio para (n> 2) para ser aceptados como un IC50 válido.
Resultados. La potencia para la inhibición del crecimiento se determinó para la línea celular PC-3 mediante el Compuesto 1 o la rapamicina. Sobre el intervalo de concentración utilizado para la rapamicina, se observó un efecto de "meseta" relativamente constante. Como estos datos no facilitaron la determinación de un valor CI 50 de la curva de inhibición del crecimiento, las sensibilidades relativas basadas en la potencia de la rapamicina se definieron como 0-45% restante = sensible, 46-69% restante = parcial y 70-100% restante = resistente.
La actividad del complejo TORC1 se puede seguir desde el estado de fosforilación de 4E-BP1 (T46), un sustrato directo de la quinasa mTOR y S6RP (S235/S236), un sustrato aguas abajo de mTOR. La actividad del complejo TORC2 puede seguirse directamente desde el estado de fosforilación de Akt (S473) e indirectamente desde el estado de fosforilación de sustratos AKT, GSK3p (S9) y PRAS40 (T246). En la Tabla 2 se muestran las potencias para la inhibición del Compuesto 1 de los fosfo-biomarcadores moleculares de la vía mTOR analizados a nivel molecular en células de cáncer de próstata PC-3. La potencia para la inhibición del Compuesto 1 de los biomarcadores particulares 4E-BP1 (T46), S6RP (S235/S236) y Akt (S473) para la vía mTOR se ha comparado con la rapamicina. Los datos que se muestran en la Figura 4 ilustran las curvas de respuesta a la dosis típicas para el Compuesto 1 y la rapamicina para 4EBP1. La rapamicina demostró una potencia notable en el intervalo picomolar para la inhibición del sustrato indirecto, S6RP (S235/S236), un sustrato de la quinasa p70S6 que se activa directamente por el complejo TORC1. Los valores IC 50 para la rapamicina fueron 19 y 29 pM para la inhibición de la fosforilación de S6RP (S235/S236) en células PC3. Sin embargo, uno de los sustratos directos de TORC1 4E-BP1 (T46) no fue inhibido por la rapamicina hasta concentraciones de 10 pM. El compuesto 1 inhibió la fosforilación tanto del sustrato directo como del sustrato aguas abajo a concentraciones submicromolares. Como se esperaba, la rapamicina no inhibió la fosforilación de Akt (S473) (datos no mostrados), un sustrato directo del complejo TORC2, para el cual se sabe que la rapamicina no afecta. Como se muestra a continuación en la Tabla 2, el Compuesto 1 pudo producir valores IC 50 submicromolares para la inhibición de sustratos directos e indirectos TORC1 y TORC2 y exhibieron un valor IC 50 submicromolar para la inhibición del crecimiento en la línea celular de cáncer de próstata PC-3.
TABLA 2
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Las lecturas indirectas de la inhibición de TORC2, GSK3p (S9) y PRAS40 (T246) se inhibieron con menos potencia como consecuencia del tratamiento con el Compuesto 1 en comparación con el efecto sobre Akt (S473). La activación completa de Akt requiere una fosforilación adicional en T308 que se realiza por PDK1 y se especula que es codependiente con la fosforilación TORC2 de Akt (S473). Los datos sugieren una indicación de esto, pero se requiere confirmación adicional.
Conclusiones. El potencial de inhibición del crecimiento se determinó para el Compuesto 1 en células PC3. Utilizando fosfo-biomarcadores moleculares específicos de la actividad TORC1 (4E-BP1 (T46) directa e indirectamente S6RP (S235/S236) y TORC2 (Akt (S473) directa e indirectamente GSK3p (S9) y PRAS40 (t 246)), se demostró el Compuesto 1 para inhibir el objetivo de la quinasa mTOR dentro de la célula en ambos complejos. Curiosamente, la rapamicina solo fue capaz de inhibir el marcador indirecto de la actividad TORC1 y no afectó a la fosforilación del sustrato directo 4E-BP1 (T46) y la rapamicina no inhibió la actividad quinasa del complejo TORC2, según los informes anteriores. En comparación con la actividad inhibidora del crecimiento de la rapamicina, el Compuesto 1 tenía la capacidad de producir, basándose en la forma de las curvas de dosis-respuesta, un tipo diferente de actividad antiproliferativa in vitro.
ESTUDIO IN VITRO DE COMPUESTOS DE LA FÓRMULA (III). (descrito como referencia)
Los compuestos de la Fórmula (III) proporcionaron una potencia similar con respecto a los compuestos de la fórmula (I) (Tabla 3). Estos análogos mantuvieron la selectividad para mTOR sobre la lípido quinasa PI3K-a relacionada, manteniendo una selectividad de 65 a> 500 veces para mTOR. En las líneas celulares de cáncer de próstata PC3, los compuestos demostraron ser inhibidores de ambos complejos mTOR medidos por la inhibición de pS6 (mTORC1) y pAktS473 (mTORC2). También se observó la inhibición de la proliferación celular como efecto funcional de la inhibición de la vía mTOR en estas células.
TABLA 3
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b: promedio de 2 o más experimentos
Aunque los análogos como el Compuesto 3 y el Compuesto 4 demostraron una baja potencia nanomolar en el objetivo y la eficacia celular correspondiente, estos generalmente sufrieron una pobre biodisponibilidad oral. La comparación del Compuesto 5 y el Compuesto 6 de pares coincidentes muestra que el núcleo expandido en anillo proporciona una eficacia celular mejorada, según lo evaluado por los ensayos de biomarcadores y proliferación, en relación con el imidazo [4,5-b] pirazina-2-ona original. El compuesto 6 también mostró una excelente biodisponibilidad oral en roedores, lo que permitió la exploración de la quinasa mTOR en sistemas in vivo.
El compuesto 6, se perfiló adicionalmente para la selectividad de quinasa global. Cuando se probó en un ensayo de un solo punto frente a 249 quinasas, solo se inhibió una quinasa distinta de mTOR> 80% a 10 pM. La generación de curvas de concentración-respuesta para una quinasa, FMS, produjo un valor IC 50 de 2,70 pM. La actividad antitumoral del Compuesto 6 en el modelo de xenoinjerto de PC3 se determinó inicialmente usando varios paradigmas de dosificación oral; una o dos veces al día o cada dos días. El compuesto 6 inhibió significativamente el crecimiento tumoral de PC3 bajo estos regímenes de dosificación (Figura 5A). La actividad se exploró aún más utilizando varios niveles de dosis con un régimen de dosificación de una vez al día. En este estudio, el Compuesto 6 inhibió significativamente el crecimiento tumoral de una manera dependiente de la dosis, demostrando una inhibición del volumen tumoral del 18%, 63% y 84% en comparación con el control del vehículo a 10, 25 y 50 mg/kg, respectivamente (Figura 5B). El compuesto fue bien tolerado en todos los niveles y horarios de dosis después de 3 semanas de tratamiento.
Para determinar el alcance de la inhibición de la vía mTOR y la relación PK/PD, se administraron ratones portadores de tumor PC3 con una dosis única del Compuesto 6, y se recogieron muestras de plasma y tumor en diversos puntos de tiempo para el análisis. Se observó una inhibición significativa de los marcadores de la vía mTOR pS6 y pAktS473, lo que indica que la actividad antitumoral estaba mediada por la inhibición de mTORC1 (pS6) y mTORC2 (pAktS473). Cuando se dosificó a 100 mg/kg, el Compuesto 6 logró la inhibición completa de biomarcadores en el modelo tumoral PC3 durante 24 horas y los niveles de compuestos tanto en el tumor como en el plasma fueron más de 10 veces superiores a los valores de IC 50 del biomarcador celular a las 24 horas. Cuando el Compuesto 6 se dosificó a 30 mg/kg, la inhibición de pS6 se mantuvo al 87-93% de 2-8 h, con el 43% de inhibición a las 24 h (Figura 5A). Del mismo modo, la inhibición de pAktS473 de 2-8 h fue del 53-77% y descendió al 28% a las 24 h (Figura 5B). Estos niveles de inhibición de biomarcadores se correlacionaron bien con el nivel plasmático y tumoral del compuesto, que se eliminó casi por completo a las 24h (Figura 6).
ESTUDIO IN VITRO DEL Compuesto 2
Actividad antiproliferativa. La actividad antiproliferativa del Compuesto 2 se evaluó en una línea celular de tumor de próstata. Las células se colocaron en placas en placas de 96 pocillos y, después de un período de equilibrio nocturno, se expusieron durante 3 días a concentraciones de 0,05, 0,15, 0,5, 1,5 y 5 pM del Compuesto 2. El grado de proliferación celular se midió usando el ensayo WST-1 y la inhibición del crecimiento se determinó a partir de la comparación de las muestras tratadas con el Compuesto 2 con el control DMSO. Todos los experimentos de inhibición del crecimiento se repitieron en diferentes ocasiones al menos dos veces. La potencia se determinó calculando el valor de IC 50 utilizando los datos que describen la curva de inhibición del crecimiento. Se incluyó un compuesto de referencia en cada ensayo de placa para controlar la variación entre ensayos y el valor de IC 50 para el compuesto de referencia se utilizó como parte de los criterios de aceptación para el ensayo.
Inhibición intracelular de la vía mTOR. La inhibición intracelular de la vía mTOR por el Compuesto 2 en un intervalo de concentraciones se evaluó en células PC3 mediante el monitoreo de los sustratos directos y aguas abajo de los complejos mTORC1 y mTORC2, que contienen actividad de la quinasa mTOR. Las células se sembraron en placa como para el ensayo de proliferación y se expusieron al Compuesto 2 durante 1 hora antes del ensayo para las diferentes fosfoproteínas. El sustrato directo para mTORC1 fue 4E-BP1 (T46) y el sustrato indirecto aguas abajo fue S6RP (S235/S236). El sustrato directo para mTORC2 fue AKT (S473) y los sustratos indirectos medidos aguas abajo fueron GSK3p (S9) y PRAS40 (T246). Además, se monitorizó el estado de fosforilación de AKT (T308), un sitio de fosforilación para PDK1. Se trazaron curvas de concentración-respuesta y valores de IC 50 determinados
Ensayo de proliferación celular - WST-1. El efecto de inhibición del crecimiento del Compuesto 2 se determinó de la siguiente manera: las células se sembraron en placas en 180 pL de medio de crecimiento en una placa de fondo plano de 96 pocillos (número de catálogo Costar 33595) a una densidad predeterminada (PC-3: 3.000 células/pocillo) y se dejó equilibrar a 37 °C, 5% de CO 2 durante la noche.
Al día siguiente, las diluciones del compuesto del Compuesto 2 se prepararon a partir de una reserva de 10 mM diluyéndolas primero a la concentración apropiada en DMSO al 100% y diluidas a continuación 1:50 en medio de crecimiento. A continuación, se añadió compuesto al pocillo designado a una dilución de 1:10 (es decir, se añadieron 20 pl del compuesto diluido a 180 pl de medio de cultivo en cada pocillo). La dilución final del compuesto fue 1:500, lo que produjo una concentración final de DMSO del 0,2% en cada pocillo. Todas las concentraciones se realizaron por triplicado. Además, cada placa analizada contenía células tratadas con un compuesto de referencia para evaluar la variación entre ensayos y el valor de IC 50 generado se utilizó como criterio para aceptar los datos de la prueba. El coeficiente de variación para el ensayo de proliferación celular con el compuesto de referencia en células PC-3 fue del 21,5% (n = 100). Las concentraciones típicas probadas para el Compuesto 2 fueron: 5, 1,5, 0,5, 0,15 y 0,05 pM.
Las células fueron expuestas a los compuestos de prueba durante 3 días en 5% de CO 2 a 37 °C. La proliferación celular se evaluó utilizando el ensayo WST-1, que se basa en la medición de la actividad metabólica mediante la reducción de sales de tetrazolio a sales de formazán. El ensayo WST-1 es un ensayo de una sola etapa que no requiere etapas de lavado. Al final de la incubación de 3 días, se agregaron 20 pL de WST-1 (Roche, Catálogo # 11 644 807 001) a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a 5% de CO 2 a 37 °C. La absorbancia se midió a 450 nm en el lector de placa multilabel VICTOR™ X2 (PerkinElmer). Los datos sin procesar se guardaron como un archivo de texto y se introdujeron a continuación en la Base de actividades (SAR basado en células; Prolif-MTT, MTT-6pt-5 placas sin fijar ajustadas Versión2). El software (XLfit de IDBS) calculó el porcentaje de inhibición en cada concentración de compuesto mediante la normalización de los valores de control DMSO. El porcentaje de inhibición se determinó para cada replicado y después se promediaron 3 valores para conjunto de pocillos en triplicado. Curvas de inhibición de porcentaje se trazaron y se calcularon los valores IC 50 .
Determinación de fosfo-AKT (S473), fosfo-AKT (T308), fosfo-S6RP (S235 // S236) , fosfo-GSK3beta (S9) y fosfo-PRAS40 (T246) en lisados celulares. Las células se sembraron en placas de fondo plano de 96 pocillos a la densidad requerida (células PC-3/pocillo) y se permitió que las células se equilibraran a 37 °C, 5% de CO 2 durante la noche. Al día siguiente, las células fueron tratadas con el Compuesto 2 en un intervalo de concentraciones durante 1 hora en 5% de CO 2 a 37 °C. El compuesto 2 se probó a las siguientes concentraciones: 10, 3, 1,0,3, 0,1,0,03 y 0,01 pM. Después del período de incubación, los medios de cultivo se eliminaron cuidadosamente con un aspirador. La placa se colocó en hielo y se añadieron 50 pL de tampón de lisis Tris 1X a cada pocillo. La placa se colocó en un agitador a 4 °C durante 1 hora para lisar las células. En ese momento, la placa se congeló a -80 °C para su posterior análisis o se analizó inmediatamente para detectar fosfoproteínas como se describe a continuación. Para controlar la variabilidad entre ensayos, se incluyó un estándar de referencia en el ensayo para células PC-3 y el coeficiente de variación para el ensayo de p-S6RP (S235/S236) fue del 9,3% (n = 50) y para el ensayo de p-AKT (S473) fue del 28,6% (n = 50).
La placa de ensayo se incubó con 150 pL de tampón de bloqueo MSD durante 1 hora con agitación a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con Tris Wash Buffer. A continuación se añadieron 35 pL de lisado celular a los pocillos y se incubaron durante 1 hora con agitación a temperatura ambiente. La solución se retiró de los pocillos y la placa se lavó 3 veces con tampón de lavado. Veinticinco pL de la solución de anticuerpo apropiada se incubaron a continuación durante 1 hora con agitación a temperatura ambiente. La solución se retiró de los pocillos y la placa se lavó 3 veces con tampón de lavado. A continuación se añadieron 150 pL de IX MSD Read Buffer T a cada pocillo. Se leyó la placa en el lector de placas MSD Imager.
Determinación de p-4E-BP1 (T46) en lisados celulares. Las células se colocaron en placas a la densidad requerida como se describe en la sección anterior que detalla los ensayos de Meso Scale. Las células fueron tratadas con el Compuesto 2 en un intervalo de concentraciones durante 1 hora en 5% de CO 2 a 37 °C. El compuesto 2 se probó en las siguientes concentraciones: 10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03 y 0,01 pM. Después de la incubación con el compuesto, el medio de cultivo se eliminó por aspiración. A continuación, la placa se colocó en hielo y se añadieron a cada pocillo 35 pL del tampón de extracción de células Invitrogen (que contiene PMSF reciente y cóctel inhibidor de proteasa). Se dejó que las células tratadas se sometieran a lisis durante un total de 30 minutos en hielo y, a continuación, se agitaron durante 2 minutos a 4 °C. En este punto, la placa podría congelarse a -80 °C para su posterior análisis o analizarse inmediatamente con el kit de ensayo Invitrogen 4E-BP1 [pT46].
Los estándares se prepararon según el protocolo suministrado y se agregaron 100 pL de cada estándar a los pocillos apropiados. También se incluyeron muestras que contenían tampón de extracción celular o tampones diluyentes solamente para los controles de fondo. A continuación, se agregaron 85 pL de tampón diluyente estándar a cada pocillo para los lisados de prueba. Una vez completada la lisis celular, se agregaron 15 pL de cada lisado de prueba a los pocillos apropiados de la placa ELISA para un volumen final de 100 pL. La placa se golpeó suavemente para distribuir los lisados de prueba y, a continuación, se dejó incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 2 horas, después de lo cual se decantó el contenido y se lavó 4 veces con tampón de lavado IX. A continuación, se agregaron 100 pL de anticuerpo de detección (anti-4E-BP1 [pT46]) a cada pocillo y se golpearon suavemente para su distribución. La incubación con el anticuerpo de detección durante 1 hora se produjo a temperatura ambiente en la oscuridad (sin agitación). A continuación, los contenidos de la placa se decantaron y la placa se lavó 4 veces con tampón de lavado 1X. A continuación, se añadieron 100 pL de IgG-HRP anti-conejo a cada pocillo, se golpearon suavemente para su distribución y se dejaron incubar durante 45 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad (sin agitación). El contenido de la placa se decantó y la placa se lavó 4 veces con de tampón de lavado 1X. A continuación, se añadieron 100 pL de cromógeno estabilizado a cada pocillo, se golpearon suavemente y se dejaron reaccionar durante 20 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente (sin agitación). Después de 20 minutos, se añadieron 100 pl de solución de parada para interrumpir la reacción, como lo confirma un cambio de color de azul a amarillo. La absorbancia se midió a 450 nm en el lector de placa multilabel VICTOR™ X2 (Perkin Elmer).
Determinación de fosfo-ADN-PK (S2056) en lisados celulares. Se colocaron un millón de células en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Las células fueron tratadas con el Compuesto 2 en las siguientes concentraciones: 10, 3, 1 y 0,3 pM durante 4 horas en 5% de CO 2 a 37 °C. Después de la incubación con el compuesto, el medio de cultivo se eliminó por aspiración y las células se enjuagaron con PBS. A continuación, la placa se colocó en hielo y se añadieron a cada pocillo 100 pL de tampón RIPA (que contenía PhoSTOP y cóctel inhibidor de proteasa). Las células se rasparon y la suspensión se transfirió a tubos Eppendorf fríos y se dejó lisar durante un total de 30 minutos en hielo. Los lisados se centrifugaron a 14.000 rpm durante 20 minutos a 4 °C para eliminar los restos celulares. El lisado depurado se transfirió a continuación a un nuevo tubo Eppendorf enfriado.
La concentración de proteínas de los lisados se determinó mediante el ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad: número de catálogo 500-0001). A continuación, se combinaron cuarenta pg de proteína de cada lisado con tampón de carga LDS y agente reductor (ambos a concentración final IX) y se calentaron durante 10 minutos a 70 °C. Las muestras se cargaron a continuación en geles NuPAGE Novex 3-8% Tris-Acetate y se procesaron en tampón de migración Trisacetato SDS 1X durante 1 hora a 150V. El antioxidante (500 pL) se cargó en la cámara de tampón superior de la minicélula XCell SureLock ™ como se describe en el protocolo para el gel. A continuación, se transfirió la proteína a una membrana de nitrocelulosa usando un tampón de transferencia NuPAGE 1X/solución de metanol al 20% a 4 °C (100 V durante 1,5 horas). La membrana se enjuagó con PBS y se bloqueó durante 1 hora a temperatura ambiente en una solución 1:1 de Odyssey Blocking Buffer y PBS. El anticuerpo primario para detectar el ADN-PK fosforilado en la Serina 2056 se diluyó a continuación 1:1000 en Tampón de bloqueo/Tween-20 al 0,1%. La p-actina se usó como control de carga y se diluyó 1:20.000. La membrana se incubó a 4 °C durante la noche con balanceo. Al día siguiente, la membrana se enjuagó 4 veces con PBS/Tween-20 al 0,1% durante 5 minutos por lavado. Los anticuerpos secundarios (AlexaFluor 680 anti-conejo de cabra e IRDye 800 anti-ratón de cabra) se diluyeron 1:10.000 en tampón de bloqueo/0,1% Tween-20/0,01% SDS y se agregaron a la membrana en una caja de incubación negra. Esta incubación tuvo lugar durante 1 hora a temperatura ambiente con balanceo. La solución de anticuerpo secundario se retiró y la membrana se enjuagó 4 veces con PBS/Tween-20 al 0,1% durante 5 minutos por lavado. Se realizó un lavado final con PBS solamente para reducir la señal de fondo. A continuación, se escanearon las membranas utilizando el sistema de imágenes infrarrojas Odyssey (LI-COR Biosciences).
Resultados. La potencia del Compuesto 2 para la inhibición del crecimiento se determinó en la línea celular de cáncer PC3. La Figura 7 proporciona un ejemplo típico de las curvas de respuesta a la dosis para el Compuesto 2 en la línea celular PC-3. En promedio, la potencia para la inhibición del crecimiento por el Compuesto 2 como se representa por el valor de IC 50 en la línea celular PC3 se determinó para que fuese 0,14 pM ± 0,019
La actividad del complejo mTORC1 fue seguida por la evaluación del estado de fosforilación de 4EBP1 (T46), un sustrato directo de la quinasa mTOR (Figura 8 B) y S6RP (S235/S236), un sustrato de la quinasa p70S6 que se activa directamente por el complejo TORC1 (Figura 8 A). La actividad del complejo mTORC2 fue seguida directamente evaluando el estado de fosforilación de AKT (S473) (Figura 8 C) e indirectamente evaluando el estado de fosforilación de los sustratos AKT GSK3p (S9) y PRAS40 (T246). Adicionalmente, se monitorizó el estado de fosforilación de AKT (T308), un sitio de fosforilación para PDK1.
Se demostró que el compuesto 2 inhibe el objetivo de la quinasa mTOR en ambos complejos en células intactas (Tabla 4). Las curvas típicas de respuesta a la dosis para la inhibición del Compuesto 2 de estos sustratos se muestran en la Figura 8. La inhibición de los sustratos directos mTORC1 y mTORC2 4E-BP1 y AKT fue submicromolar. La inhibición de los sustratos aguas abajo p-S6RP (S235/S236) y p-PRAS40 (T246) también fue submicromolar. La inhibición de p-GSK3p por el Compuesto 2 fue menos potente que la inhibición del sustrato directo p-AKT (S473) o el otro sustrato indirecto p-PRAS40 (T246). La activación completa de AKT requiere una fosforilación adicional en T308 por PDK1 y se especula que es co-dependiente con la fosforilación de mTORC2 de AKT (S473).
La potente inhibición intracelular de la vía mTOR y la potente actividad antiproliferativa se demostraron con el Compuesto 2 en PC3.
TABLA 4
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Conclusiones. El compuesto 2 demostró una potente inhibición del crecimiento (valores de IC 50 : 0,14 a 1,31 pM) en células tumorales de próstata. Utilizando fosfobiomarcadores moleculares específicos de la actividad mTORC1 (4E-BP1 (T46) directamente y S6RP (S235/S236) indirectamente) y la actividad mTORC2 (AKT (S473) directamente y GSK3p (S9) y PRAS40 (T246) indirectamente), se demostró el Compuesto 2 para inhibir el objetivo de la quinasa mTOR en ambos complejos en la célula intacta. Inhibición submicromolar de los sustratos directos mTORC1 y mTORC2 4E-BP1 y AKT (S473) y los sustratos aguas abajo
ACTIVIDAD DEL ANTITUMOR DEL COMPUESTO 1 EN EL MODELO XENOGRAFT DE CÁNCER DE PRÓSTATA HUMANO PC3 (descrito como referencia)
Estudios de tolerabilidad. Cuatro grupos de ratones SCID hembra con tumores PC3 (n = 4 por grupo) se dosificaron por vía oral con vehículo o Compuesto 1 (10, 25 ó 50 mg/kg) diariamente durante 5 días. Se recogieron muestras de plasma y tumor 24 horas después de la última dosis en cada grupo de dosis.
Estudios de eficacia. Grupos de ratones SCID hembra con tumores PC3 (n = 5 a 10/grupo) se dosificaron por vía oral con vehículo o Compuesto 1 (0,3 mg/kg a 50 mg/kg) ya sea BID, QD, Q2D, Q3D, Q5D o Q7D a lo largo del estudio comenzando cuando los volúmenes tumorales alcanzaron aproximadamente 100 mm 3 o 500 mm 3 (estudio de regresión). Los grupos con la dosis de BID se dosificaron con una separación de 10 horas entre las dosis de la mañana y de la tarde. En el grupo de control positivo, se administró rapamicina Q3D a través de la ruta intraperitoneal (IP). Al final de cada estudio, se recogieron muestras de plasma y/o tumor.
El diseño de los experimentos se muestra en la Tabla 5 a continuación.
TABLA 5
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(continuación)
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Farmacocinética / Estudios farmacodinámicos. Grupos de ratones SCID hembra con tumores PC3 (n = 4 por grupo) se dosificaron por vía oral con una dosis única de vehículo o Compuesto 1. Las muestras de plasma y tumor se recogieron en varios puntos de tiempo después de la administración del compuesto como se describe.
Los puntos de tiempo de recogida de plasma y tumor fueron puntos de tiempo terminales para estudios de PK/PD. Compuesto 1 a las 4, 8 y 24 horas; control de vehículos a las 24 horas. Compuesto 1 a las 1, 3, 8, 16, 24, 48 y 72 horas; control del vehículo a las 72 horas. Compuesto 1 a las 1, 3, 8, 16, 24, 48 y 72 horas; control del vehículo a las 72 horas. Compuesto 1 a las 0,5, 2, 4, 6, 10 y 24 horas; control de vehículos a las 24 horas.
Procedimientos experimentales - Estudios de tolerabilidad y eficacia.
Línea celular y cultivo - Se obtuvo la línea celular PC3 de American Tissue Culture Collection (ATCC) (Gaithersberg, MD) y se cultivó en medio de crecimiento que contenía medio Ham's F12K con L-glutamina 2 mM ajustada para contener 1,5 g/L de bicarbonato de sodio y 10% de suero fetal bovino. . Las células se despegaron de los frascos de cultivo tisular usando tripsina-EDTA. Después de centrifugar, los sedimentos celulares se suspendieron en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) y se contaron usando un hemocitómetro. Se añadió Matrigel a la suspensión celular para ajustar el volumen final a 2x106 células/0,1 ml de una mezcla 1:1 de Matrigel:PBS.
Inoculación de células tumorales - Los ratones se anestesiaron con isoflurano inhalado y luego se inocularon con células tumorales PC3 por vía subcutánea en la pata trasera derecha con 0,1 ml de suspensiones de células individuales en Matrigel usando una jeringa estéril de 1 ml con una aguja de calibre 26. Después de la inoculación, los ratones se devolvieron a las jaulas de microaislador.
Aleatorización de animales - Después de la inoculación, se permitió que los tumores crecieran hasta aproximadamente 100 mm. 3 o 500 mm 3 antes de la aleatorización. Para estudios de eficacia, animales con tumores de aproximadamente 100 mm. 3 fueron usados. El número de días típico requerido para que los tumores alcancen 100 mm3 fue 9 a 11 días. El tumor de cada animal se midió y los animales con tumores que variaban entre 100 y 200 mm3 se incluyeron en el estudio. Para estudios de tolerabilidad y regresión, se utilizaron animales con tumores de aproximadamente 500 mm.
3 (intervalo 300-500 mm 3). El número típico de días necesarios para que los tumores alcancen los 500 mm. 3 fue de 20 a 22 días. Los animales se distribuyeron aleatoriamente en varias jaulas y las jaulas se asignaron aleatoriamente a grupos de vehículo, control positivo, o artículos de ensayo. Todos los ratones se etiquetaron con etiquetas metálicas en la oreja en la oreja derecha. Cada grupo típico consistió en 8 a 10 animales. El grupo de estudio de tolerabilidad consistió en 4-6 animales.
Preparación y administración de artículos de prueba - Se prepararon suspensiones del Compuesto 1 en CMC acuoso al 0,5% y Tween-80 al 0,25%. Las formulaciones se homogeneizaron usando una mano y mortero Teflon™ (triturador de tejido Potter-Elvehjem). Entre las dosis, el compuesto formulado se almacenó con agitación constante usando un agitador magnético a 4 °C en oscuridad. El artículo de ensayo se administró por sonda oral. El control positivo (rapamicina) se preparó como una disolución en etanol al 2%, polietilenglicol 400 al 45%, y disolución salina al 53% y se administró por inyección IP. Para la administración de los compuestos se usaron jeringas y agujas de sonda estériles. Todos los procedimientos incluyendo las inyecciones se hicieron en cabinas de bioseguridad pulverizadas con etanol al 70% antes de su uso.
Estudio de tolerabilidad - Los ratones fueron dosificados con vehículo o Compuesto 1 una vez al día durante la duración del estudio. Los ratones fueron monitoreados diariamente para detectar signos clínicos y cambios en el peso corporal. Al final del estudio, los ratones fueron sacrificados y se recogieron muestras de plasma y tumor para la determinación de PK/PD. Los marcadores PD, pS6 y pAkt, se midieron usando tecnología MSD.
Mediciones del tumor - Los volúmenes tumorales se determinaron antes del inicio del tratamiento y se consideraron como los volúmenes iniciales. Posteriormente, los tumores se midieron dos veces a la semana durante la duración del estudio. Los ejes largo y corto de cada tumor se midieron usando un calibrador digital en milímetros. Los volúmenes tumorales se calcularon usando la fórmula: ancho2 x longitud/2. Los volúmenes tumorales se expresaron en milímetros cúbicos (mm3).
Mediciones de peso corporal - Los pesos corporales iniciales se registraron antes del inicio del tratamiento utilizando una balanza digital. El porcentaje del cambio en el peso corporal durante el curso del estudio se calculó usando las mediciones iniciales del peso corporal. Los pesos corporales de cada animal se midieron dos veces a la semana al mismo tiempo que se tomaron las mediciones del tumor. Los pesos corporales se midieron más frecuentemente si se observaron disminuciones significativas durante el curso del estudio.
Terminación de Experimentos - Después de la última medición, el experimento se terminó tomando muestras de plasma y tumor para mediciones de PK y PD. Las concentraciones de compuesto en plasma y tumor se determinaron por LC-Ms /MS. Los marcadores PD, pS6 y pAkt, se midieron usando tecnología MSD.
Recogida de muestras de plasma - Después de la última dosis del artículo de prueba, se recogieron muestras de sangre a través de hemorragias retro-orbitales en puntos de tiempo predeterminados. Se tomaron muestras de plasma durante el período de dosificación (por ejemplo, para el grupo dosificado Q2D, se tomaron muestras de plasma durante 48 horas después de la dosis). Las muestras de sangre se procesaron en plasma usando tubos de separación de plasma con heparina.
Recogida de muestras de tejido - Después del último sangrado, los animales fueron sacrificados a través de asfixia por CO 2 y los tumores fueron disecados. Se colocó una pequeña sección de tumor (aproximadamente 100 mg) en un vial previamente pesado y se congeló en nitrógeno líquido para la determinación del compuesto. Los tejidos restantes se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y/o se fijaron en formalina tamponada para mediciones de PD.
Procedimientos experimentales - Estudios farmacocinéticos y farmacodinámicos.
Ratones SCID hembra con tumor PC3 que oscila entre 300 y 500 mm 3 se agruparon y se distribuyeron aleatoriamente a los grupos de tratamiento con vehículo o Compuesto 1. En puntos de tiempo predeterminados después de la dosificación, se sacrificaron ratones y se recogieron muestras de plasma y tumor para la determinación de PK/PD. Las concentraciones de compuesto en plasma y tumor se determinaron por LC-MS/MS. Los marcadores PD, pS6 y pAkt, se midieron utilizando la tecnología de mesoescala.
Para los ensayos de descubrimiento de mesoescala, las muestras de tejido se homogeneizaron en tampón de lisis que contenía inhibidores de proteasa y fosfatasa y se centrifugaron durante 10 minutos a 1.200 rpm a 4 °C. Los sobrenadantes se sonicaron durante 1 minuto a 4 °C, se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80 °C. Las concentraciones de proteína en las muestras se determinaron usando el kit de reactivo de ensayo de proteína BCA (Thermo Scientific). Se usaron kits de Meso Scale Discovery y protocolo para medir los kits pS6 y pAkt/Total Akt. Las placas MSD de 96 pocillos manchadas con pS6, pAkt/Akt total se bloquearon con solución de bloqueo durante 5 minutos seguido de un lavado con tampón de lavado. Se añadieron veinticinco miligramos de lisados tumorales a cada pocillo y se incubaron durante 2 horas seguido de un lavado 4X con un tampón de lavado. Se añadió anticuerpo de detección a cada pocillo y se incubó en la oscuridad durante 1 hora a 4 °C. A continuación, se lavaron las placas y se leyó el antígeno unido usando un instrumento MSD SECTOR™.
Procedimientos experimentales - Mecanismo de estudios de acción
Para determinar el mecanismo de acción del Compuesto 1, a los ratones que portaban tumores PC3 se les dosificó por vía oral con vehículo o Compuesto 1 a 25 mg/kg QD durante 6 días. El control positivo, rapamicina, se dosificó a 4 mg/kg Q3D durante 6 días. Dos horas después de la última dosis de cualquier vehículo, Compuesto 1 o rapamicina, los ratones fueron sacrificados y los tumores fueron disecados. Los tumores se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se procesaron para inmunohistoquímica (IHC) y TUNEL.
Inmunohistoquímica - Se utilizaron secciones de criostato de cinco a diez micras de espesor de muestras tumorales para IHC. La expresión de un marcador de proliferación celular Ki-67 se evaluó mediante IHC usando anticuerpo anti-Ki-67. El anticuerpo anti-CD-31 se usó para determinar la densidad de los vasos sanguíneos y es una medición de la angiogénesis tumoral. Se fijaron secciones congeladas en paraformaldehído al 4% durante 10 minutos a temperatura ambiente, se lavaron en PBS, se bloquearon y se permeabilizaron con suero de cabra normal y tritón X-100. Las secciones se incubaron entonces con anticuerpo primario (toda la noche) seguido de incubación con anticuerpo secundario (60 minutos). Las secciones se lavaron, se contratiñeron con tinción de Hoechst y se montaron con reactivo antidecoloración. Para los procedimientos de doble marcado (Ki-67 y CD-31), se usaron cócteles de anticuerpos primarios y secundarios para la incubación. En cada ensayo se incluyeron controles positivos y negativos. Los controles positivos incluyeron secciones que se sabía que eran reactivas con el anticuerpo. Los controles negativos incluyeron la omisión de anticuerpo primario o secundario. Las secciones se visualizaron con un microscopio Nikon E800 equipado con un equipo de detección de la fluorescencia y una cámara digital conectada a un ordenador.
Ensayo TUNEL de apoptosis - Para detectar las células apoptóticas, se utilizó el kit de detección de muerte celular in situ por fluorescencia (Roche Biosciences). Se fijaron secciones de criostato con un espesor de cinco a diez micrómetros (5-10 gm) en paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente, se lavaron, se permeabilizaron con tritón X-100 al 0,3% y citrato de sodio al 0,1% en PBS durante 10 minutos. Las secciones se lavaron entonces en PBS y se incubaron con una disolución de marcaje que contenía la enzima TdT durante 1 hora a 37 °C en la oscuridad. Las secciones se lavaron en PBS, se contratiñeron con colorante Hoechst (0,4 gg/mL) a temperatura ambiente durante 10 minutos y se montaron en reactivo antidecoloración Prolong Gold.
Cuantificación de inmunohistoquímica - Las secciones de tejidos procesadas para apoptosis o inmunotinción para células en proliferación (Ki-67) o vasos sanguíneos se cuantificaron utilizando el software Metamorph. Usando un objetivo 20X, se usaron para la cuantificación 5 campos diferentes de cada sección, 2-4 secciones de cada tumor, y 3-4 tumores de cada grupo de tratamiento o control. El área de interés se expresó como el porcentaje del área de umbral del área total.
Resultados - Tolerabilidad del Compuesto 1 en ratones portadores de tumor PC3. En preparación para los estudios de xenoinjerto, se realizó un estudio de tolerabilidad de 5 días. El compuesto 1 se dosificó por vía oral a 10, 25 o 50 mg/kg, QD en ratones SCID con tumor PC3. Los animales en el grupo de dosis de 50 mg/kg perdieron> 17% del peso corporal inicial para el día 5 (24 horas después de la cuarta dosis). Los animales de este grupo fueron sacrificados. Para el día 6 (24 horas después de la quinta dosis), los animales en los grupos de 25 mg/kg y 10 mg/kg perdieron 9% y 4%, respectivamente, del peso corporal inicial. En base a estos datos, se seleccionaron dosis de 10 y 25 mg/kg para el estudio de xenoinjerto.
Al final del estudio de tolerabilidad, se recogieron muestras de plasma y tumor y se procesaron para el análisis PK/PD. Se observó una alta concentración del Compuesto 1 en el plasma (7,3 ± 2,4 pM) y el tumor (4,7 ± 1,3 pM) de ratones a los que se les administró 50 mg/kg el día 5, en comparación con los grupos de 10 y 25 mg/kg (niveles plasmáticos: 0,08 ± 0,06 y 0,84 ± 0,41 pM, respectivamente). Esta concentración de Compuesto 1 más alta de lo esperado en plasma y tumor probablemente se deba a la acumulación del compuesto con dosis repetidas. Con un nivel de dosis de 10 mg/kg, hubo una inhibición moderada de pS6 (22%) y pAKT (28%) en los tumores recogidos 24 horas después de la última dosis; sin embargo, ambos marcadores PD se inhibieron significativamente en los tumores de animales a los que se les administró dosis de 25 y 50 mg/kg (datos no mostrados) en el punto de tiempo de 24 horas.
Resultados - Actividad antitumoral del Compuesto 1 en el modelo de xenoinjerto PC3. La actividad antitumoral del Compuesto 1 se probó inicialmente a 10 y 25 mg/kg en un paradigma de dosificación de una vez al día. La dosificación comenzó el día 11 cuando los volúmenes tumorales oscilaron entre 158 y 172 mm. 3. Para el día 31, los tumores en el grupo tratado con vehículo midieron 712 ± 68 mm 3. Todos los animales en el grupo de control positivo que recibieron rapamicina (4 mg/kg, Q3D) mostraron tumores significativamente más pequeños (p < 0,001) cuando se compara con el vehículo el día 31. El % de inhibición tumoral expresado en la Figura 9 para cada grupo de tratamiento es la reducción del volumen tumoral en el día 31 en comparación con el control del vehículo. Los grupos tratados con el Compuesto 1 mostraron inhibición tumoral dependiente de la dosis (Figura 9). La regresión tumoral con el Compuesto 1 a 25 mg/kg se evidenció por un volumen tumoral promedio menor en el día 31 en comparación con el volumen tumoral inicial promedio en el día 11 (123 mm 3 en el día 31 vs. 158 mm 3 en el día 11). El día 31, los volúmenes tumorales de los animales tratados con Compuesto 1 de 10 y 25 mg/kg se redujeron en un 46,1% y un 86,7%, respectivamente, en comparación con el grupo de control del vehículo. Ambos niveles de dosis fueron significativamente diferentes (p <0,001) del control (712 mm 3 vs. 383 mm 3 , 10 mg/kg y 123 mm 3,25 mg/kg).
El día 31, todos los grupos de estudio fueron sacrificados con la excepción del grupo de Compuesto 1 de 25 mg/kg. A los animales en el grupo de dosis de 25 mg/kg de Compuesto 1 se les permitió sobrevivir sin dosificación durante 3 semanas adicionales (las barras en la Figura 9 indican la duración del tratamiento compuesto). Durante la ausencia de dosificación, se reanudó el crecimiento tumoral. En el día 52, cuando el crecimiento tumoral promedio alcanzó aproximadamente 427 mm 3 , se administró un segundo ciclo de dosificación diario del Compuesto 1 (25 mg/kg) durante 3 semanas adicionales. Durante el segundo ciclo de dosificación, se observó estasis tumoral durante aproximadamente 11 días. Los volúmenes tumorales promedio permanecieron entre 427 mm. 3 y 397 mm 3 . Posteriormente, se observó un nuevo crecimiento tumoral. Al final del segundo ciclo, los volúmenes tumorales eran de aproximadamente 729 mm. 3.
No se observaron cambios significativos en el peso corporal en los grupos a los que se les administró vehículo, Compuesto 1 a 10 mg/kg o control positivo (datos no mostrados). Los ratones en el grupo de dosis de 25 mg/kg perdieron aproximadamente el 10% de su masa corporal inicial al final del primer ciclo. Tan pronto como cesó la dosificación, los animales ganaron inmediatamente peso. Durante el segundo ciclo de dosificación, el cambio de peso corporal fue de aproximadamente un 5%.
Al final del primer ciclo de dosificación, se recogieron muestras de plasma y tumor a las 2 y 24 horas después de la última dosis en el grupo de 10 mg/kg y se analizaron los niveles de compuesto y los marcadores de PD. Se detectaron aproximadamente 2 pM de Compuesto 1 a las 2 horas después de la última dosis, mientras que a las 24 horas, la cantidad de compuesto era insignificante en el plasma. Al mismo tiempo, ambos marcadores PD, pS6 y pAkt, se inhibieron a las 2 horas pero aumentaron a niveles de control en 24 horas (Figura 10).
Otro estudio fue diseñado para determinar la actividad antitumoral del Compuesto 1 en el modelo de xenoinjerto PC3 con dosificación intermitente (es decir, Q2D, Q3D, Q5D y Q7D) a niveles de dosis de 25 y 50 mg/kg (Figura 11). La dosificación se inició el día 10 cuando los volúmenes tumorales promedio oscilaron entre 116 y 146 mm 3. Al final del periodo de dosificación de 3 semanas en el Día 31, los tumores tratados con vehículo alcanzaron un volumen promedio de 813 ± 60 mm3. El control positivo de rapamicina inhibió significativamente los tumores (p <0,001) el día 31. El % de inhibición tumoral expresado en la Figura 11 para cada grupo de tratamiento representa la reducción del volumen tumoral en el día 31 en comparación con el control del vehículo. Al nivel de dosis de 50 mg/kg, la mayor eficacia (82% de inhibición) se logró en el programa Q3D, mientras que la dosificación menos frecuente en los programas Q5D y Q7D produjo una inhibición tumoral menos robusta (61% y 49%, respectivamente) pero estadísticamente significativa (p <0,001) en comparación con el control del vehículo. El nivel de dosis de 25 mg/kg se probó en los programas de dosificación QD, Q2D y Q3D. Se observó regresión tumoral con el Compuesto 1 a 25 mg/kg QD. Se observó una inhibición tumoral significativa (p <0,001) del 72% y 61% con la dosificación de Q2D y Q3D, respectivamente.
Con la excepción del Compuesto 1 a 25 mg/kg del grupo QD, no se observó ningún cambio significativo en el peso corporal en ninguno de los grupos de tratamiento. Los animales en el grupo de dosis de 25 mg/kg QD perdieron aproximadamente un 10% de peso corporal durante el período de estudio (datos no mostrados).
Después de la última administración del Compuesto 1, se recogieron muestras de plasma en varios puntos de tiempo y se analizaron para determinar el compuesto. El valor calculado de AUC en plasma para cada grupo de dosis fue: 25 mg/kg QD: 122 pM • h (AUC0-24h)
25 mg/kg Q2D: 99 gM • h (AUC0-48h)
25 mg/kg Q3D: 77 gM • h (AUC0-72h)
50 mg/kg Q3D: 228 gM • h (AUC0-72h)
50 mg/kg Q5D: 359 gM • h (AUC0-120h)
Se diseñó otro estudio para evaluar la actividad antitumoral del Compuesto 1 con dosificación BID a 5 y 10 mg/kg en el modelo de xenoinjerto PC3 (Figura 12). La dosificación se inició el día 10 cuando el volumen tumoral promedio osciló entre 123 y 131 mm3. Al final del período de dosificación de 3 semanas el día 31, los tumores tratados con vehículo alcanzaron un volumen promedio de 875 ± 80 mm3. Se observó una inhibición significativa (p <0,001) del crecimiento tumoral con rapamicina. La inhibición tumoral dependiente de la dosis se observó con el tratamiento del Compuesto 1. La reducción del volumen tumoral en los grupos tratados con el Compuesto 1 a 5 y 10 mg/kg fue del 64,9% y 79,9%, respectivamente, en comparación con el control del vehículo (Figura 12). La dosis eficaz más baja como se determina por una inhibición de aproximadamente el 65% del volumen tumoral se observó al nivel de dosis de 0,5 mg/kg del Compuesto 1.
No se observaron cambios estadísticamente significativos en el peso corporal en ninguno de los grupos en el estudio (datos no mostrados).
Después de la última dosis del Compuesto 1, se recogieron muestras de plasma en varios puntos de tiempo y se analizaron los niveles de compuesto. La exposición al compuesto fue aproximadamente proporcional a la dosis. Los valores totales de AUC0-10 h en plasma para los niveles de dosis de 5 y 10 mg/kg fueron 8,6 y 23,7 gM • h, respectivamente, como se muestra a continuación en la Tabla 6. Los valores calculados de la fracción libre de plasma AUC0-10 h para 5 y 10 mg/kg fueron 1,0 y 2,8 gM • h, respectivamente, (la unión a la proteína plasmática del ratón del Compuesto 1 es del 88%).
TABLA 6
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Otro estudio fue diseñado para evaluar la actividad antitumoral del Compuesto 1 en tumores PC3 grandes y establecidos para determinar si el compuesto causa regresión tumoral (Figura 13). La dosificación se inició el día 20 cuando los volúmenes tumorales promedio oscilaron entre 450 y 486 mm3. Al final del período de dosificación en el día 43, los tumores tratados con vehículo alcanzaron un volumen promedio de 1773 ± 113 mm. 3. El control positivo de rapamicina causó estasis de crecimiento tumoral. Los volúmenes tumorales del grupo tratado con rapamicina fueron significativamente (p <0,001) más pequeños que el grupo de control del vehículo.
El compuesto 1 se probó a 3 niveles de dosis (1,5 y 10 mg/kg) BID. El % de inhibición tumoral expresado en la Figura 13 para cada grupo de tratamiento representa la reducción del volumen tumoral en el día 43 en comparación con el control del vehículo. A 10 mg/kg BID, la inhibición del tumor fue mejor que el control positivo. A este nivel de dosis, el Compuesto 1 causó la regresión de los tumores PC3. El volumen tumoral promedio al final del período de dosificación en el día 43 fue significativamente (p <0,01) menor que el volumen inicial promedio en el día 20 al comienzo de la dosificación (343,6 ± 32,6 mm 3 en el día 43 frente a 482,2 ± 12,6 mm 3 en el día 20). El compuesto 1 a 5 mg/kg BID causó estasis de crecimiento tumoral, mientras que 1 mg/kg BID redujo significativamente (p <0,01) el crecimiento tumoral en comparación con los animales tratados con vehículo. El compuesto 1 a 25 mg/kg Q2D causó la regresión de los tumores inicialmente durante las primeras 2 semanas de dosificación. Al final del período de dosificación en el día 43, los volúmenes tumorales fueron similares a los volúmenes iniciales en el día 20 (549,4 ± 45,7 mm 3 en el día 43 frente a 475,1 ± 19,6 mm 3 en el día 20). Los animales del grupo de 25 mg/kg QD del Compuesto 1 fueron sacrificados el día 26 debido a una pérdida de peso excesiva (Figura 13).
Con la excepción del grupo de dosis 25 mg/kg QD del Compuesto 1, no se observó ningún cambio estadísticamente significativo en el peso corporal en ninguno de los grupos en el estudio (Figura 9). Los animales en el grupo QD de 25 mg/kg perdieron más del 19% de su peso corporal inicial para el día 26 y fueron sacrificados.
Después de la última dosis del Compuesto 1, se recogieron muestras de plasma en varios puntos de tiempo y se analizaron los niveles de compuesto. Se observó una exposición aproximada del compuesto proporcional a la dosis en el plasma entre los grupos de dosis de 1 y 5 mg/kg, pero se observó un aumento proporcional a la dosis mayor con el tratamiento de 10 mg/kg. El valor total calculado de AUC0-10 h en plasma con dosificación BID para los grupos de 1,5 y 10 mg/kg fue de 1,5 pM • h, 8,7 pM • h y 26 pM • h, respectivamente. La fracción libre calculada AUC0-10 h fue de 0,18 pM • h, 1,0 pM • h y 3,1 pM • h, respectivamente (la unión a la proteína plasmática de ratón del Compuesto 1 es del 88%). El valor total calculado de AUCO-48 h en plasma para el grupo de dosis Q2D de 25 mg/kg fue de 112 pM • h. El valor calculado de la fracción libre de plasma AUC0-48 h para el grupo de dosis de Q2D de 25 mg/kg fue de 13,4 pM • h.
Resultados - Farmacocinética / Farmacodinámica del Compuesto 1 en ratones portadores de tumor PC3. La relación PK/PD entre la exposición al Compuesto 1 en plasma y tumor y la inhibición de los marcadores de PD relacionados con la vía mTOR tumoral se determinó después de la administración de una dosis única de compuesto. Los niveles de pS6 (un marcador PD para mTORC1) y pAkt (un marcador PD para mTORC2) se midieron en el tumor y se correlacionaron con la exposición del compuesto en plasma y/o tumor. La relación PK/PD se estudió a varios niveles de dosis (0,3, 1, 10, 25, 30, 50 y 100 mg/kg). A 30 y 100 mg/kg, se recogieron muestras de plasma y tumor a las 4, 8 y 24 horas después de la dosis. Hubo una relación dependiente de la dosis y el tiempo entre los niveles de plasma y compuestos tumorales y los niveles de pS6 y pAkt en el tumor (datos no mostrados). En ambos niveles de dosis, pS6 y pAkt se inhibieron significativamente (p <0,001) durante 24 horas (pS6: 78% y 91% de inhibición a 30 y 100 mg/kg, respectivamente; pAkt: 78% y 86% de inhibición a 30 y 100 mg/kg, respectivamente). A ambos niveles de dosis> 1 pM, el Compuesto 1 se detectó en plasma 24 horas después de la dosis (1,15 ± 0,62 y 2,55 ± 0,60 pM, para 30 y 100 mg/kg, respectivamente).
En otro estudio, los puntos de tiempo se extendieron más de 72 horas después de la administración del Compuesto 1 a 25 y 50 mg/kg. La concentración del compuesto en tumores reflejó las concentraciones plasmáticas en la mayoría de los puntos de tiempo. Se observó una relación PK/PD dependiente del tiempo y la dosis a 25 (Figura 14 y Tabla 7) y 50 mg/kg (datos no mostrados). A 25 mg/kg,> 80% de inhibición de los niveles de pS6 persistió hasta 24 horas, mientras que> 60% de inhibición de pAkt se observó hasta 16 horas. A las 48 y 72 horas, cuando la concentración del compuesto en plasma y tumores fue significativamente menor (<0,03 pM tanto en plasma como en tumor a las 48 y 72 horas), la inhibición del marcador PD disminuyó.
TABLA 7
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Leyenda: BLQ = Por debajo de los límites de cuantificación.
La relación PK/PD se determinó adicionalmente a 10 mg/kg (Figura 15; Tabla 6). Se observó una inhibición significativa (p <0,001) de pS6 (> 80%) y pAkt (> 60%) hasta 8 horas después de la administración del Compuesto 1 a concentraciones plasmáticas superiores a 1 qM. Más allá de las 8 horas, cuando las concentraciones de compuestos en el plasma y los tumores fueron más bajas (concentración plasmática de 0.17 qM), la inhibición del marcador PD disminuyó pero aún significativamente más baja (P <0,01) que los controles del vehículo.
La relación PK/PD se examinó a dosis bajas de 1 mg/kg (Figura 16) y 0,3 mg/kg (Tabla 8). Aproximadamente el 80% de inhibición de pS6 se observó hasta 2 horas (datos no mostrados) y 4 horas a 0,3 mg/kg y 1 mg/kg, respectivamente. La inhibición significativa (p <0,01) de pAkt se observó solo a 1 mg/kg. La concentración plasmática asociada con> 80% de inhibición de pS6 y > 60% de inhibición de pAkt fue de 0,19 ± 0,1 qM a un nivel de dosis de 1 mg/kg. A un nivel de dosis de 0,3 mg/kg, la concentración plasmática máxima del Compuesto 1 fue de 0,23 ± 0,03 qM en el punto de tiempo de 0,5 h. En este punto de tiempo, se observó un 81% de inhibición de pS6 pero no se observó inhibición de pAkt (datos no mostrados).
Los datos de los estudios del Compuesto 1 PK/PD indican que se necesitan concentraciones plasmáticas > 0,2 qM para inhibir > 80% pS6 y > 60% pAkt. Las concentraciones plasmáticas al nivel de dosis de 5 mg/kg BID (la dosis eficaz mínima) se mantuvieron por encima de 0,2 qM durante 8 horas y esto condujo a una reducción del volumen tumoral del 65% en un estudio de eficacia y estasis tumoral en un estudio de regresión. Basado en la relación PK/PD de la concentración plasmática del Compuesto 1 y la inhibición de biomarcadores PD, así como la relación de la concentración plasmática del Compuesto 1 y los datos de reducción del volumen tumoral en xenoinjertos de PC3, el mantenimiento de este nivel de exposición y el grado de inhibición de biomarcadores durante 8 horas dos veces diariamente confiere buena eficacia antitumoral en tumores PC-3.
Resultados - Mecanismo de estudios de acción en tumores PC3. Para determinar si el Compuesto 1 indujo apoptosis en xenoinjertos de PC3, tumores del vehículo (oral, QD durante 6 días), Compuesto 1, (25 mg/kg, oral, QD durante 6 días) y tratado con rapamicina (4 mg/kg, IP , Q3D durante 6 días) los animales fueron recogidos 2 horas después de la última dosis en el día 6 y procesados para TUNEL que marca las células apoptóticas. En este ensayo, la transferasa desoxinucleotidil terminal (TdT) incorpora los nucleótidos marcados con FITC en los extremos de las roturas de la cadena de ADN in situ. Los nucleótidos marcados con FITC (que representan a las células con roturas de hebra de ADN, una característica de la apoptosis) pueden detectarse usando un microscopio equipado con un accesorio de fluorescencia. Se observaron relativamente pocas células TUNEL positivas (0,2%) en tumores PC3 tratados con vehículo (Figura 17). El número de células positivas para TUNEL en los tumores tratados con el Compuesto 1 y rapamicina fueron comparables (FIG. 17). Se observó un aumento de aproximadamente dos veces en las células TUNEL positivas en el Compuesto 1 y los tumores tratados con rapamicina en comparación con el control del vehículo. Estos datos sugieren que la apoptosis parece tener alguna contribución a la actividad antitumoral observada del Compuesto 1 in vivo.
Los tumores de animales tratados con vehículo (oral, QD durante 6 días), Compuesto 1 (25 mg/kg, oral, QD durante 6 días) o rapamicina (4 mg/kg, IP, Q3D durante 6 días) se cosecharon 2 horas después de la última dosis el día 6 y se procesaron para inmunohistoquímica. Se utilizó inmunohistoquímica con el anticuerpo anti-Ki-67 para determinar si el Compuesto 1 inhibía el crecimiento tumoral por el bloqueo de la proliferación de las células tumorales in vivo. Ki-67 es un antígeno nuclear expresado en células. Se ha demostrado una fuerte correlación entre la fracción de células proliferantes en fase S y el índice Ki67. Se cotiñeron secciones de tumor con anticuerpo anti-CD31 para determinar la actividad antiangiogénica del compuesto. El anticuerpo CD-31 (también llamado PECAM-1) reconoce una molécula CD-31 expresada en las membranas de las células endoteliales y participa en sus interacciones adhesivas. Los núcleos se contratiñeron con tinción de Hoechst. Las células proliferantes y los microvasos se cuantificaron usando software Metamorph y se expresaron como un porcentaje del área de umbral.
En los tumores PC3 tratados con vehículo, proliferaba un número significativo de células (aproximadamente 8,5%, expresado como el área de umbral positiva de Ki-67) (Figura 18). Hubo una reducción del 84% (p < 0,001) en el número de células proliferantes en los tumores tratados con el Compuesto 1 comparado con los tumores tratados con vehículo. Aproximadamente el 3% del área de umbral comprendía vasos CD-31 positivos en las secciones de tumor PC3 de control del vehículo según lo determinado por inmunohistoquímica de CD-31. Hubo significativamente (p <0.01) menos vasos sanguíneos positivos para CD-31 en los tumores PC3 tratados con el Compuesto 1 en comparación con los tumores tratados con vehículo (Figura 18). Estos datos sugieren que la actividad antiproliferativa, la actividad apoptótica y la actividad antiangiogénica del Compuesto 1 son los mecanismos potenciales subyacentes a la actividad antitumoral del Compuesto 1. Conclusiones. Estos estudios demostraron lo siguiente:
El tratamiento con el Compuesto 1 inhibidor de la quinasa mTOR inhibió significativamente el crecimiento del tumor de próstata PC3 de una manera dependiente de la dosis y el horario.
La dosis eficaz mínima requerida para inhibir el crecimiento tumoral de PC3 fue de 5 mg/kg BID. El AUC plasmático total (0-10 h) a la dosis eficaz mínima fue de 8,6 pM • h. El AUC (0-10 h) de la facción libre en el plasma a la dosis eficaz mínima fue de 1,0 pM • h.
La inhibición significativa de los marcadores de la vía mTOR pS6 y pAkt en los tumores PC3 tratados con el Compuesto 1 sugiere que la actividad antitumoral observada del Compuesto 1 estuvo mediada por la inhibición de los complejos mTORC1 y mTORC2 de la vía mTOR.
En los tumores PC-3, la relación PK-PD indica que se obtuvo > 80% de inhibición de pS6 y > 60% de inhibición de pAKT para concentraciones plasmáticas totales del fármaco superiores a 0,2 pM. El mantenimiento de los niveles plasmáticos > 0,2 pM y este grado de inhibición de biomarcadores durante 8 horas dos veces al día confiere una buena eficacia antitumoral en los tumores PC-3.
Los datos inmunohistoquímicos demuestran que la actividad antitumoral observada del Compuesto 1 no solo se debió a la inhibición de la proliferación de células tumorales sino también al aumento de las actividades apoptóticas y antiangiogénicas del Compuesto 1 in vivo.
ACTIVIDAD ANTITUMOR DEL COMPUESTO 2 EN EL MODELO DE XENOINJERTO DE CÁNCER DE PRÓSTATA HUMANO PC3
Se prepararon suspensiones del Compuesto 2 en CMC acuoso al 0,5% y Tween-80 al 0,25%. El vehículo y el artículo de prueba se dosificaron a un volumen de 5 ml/kg. El control positivo de rapamicina se dosificó a un volumen de 10 ml/kg.
Eficacia y mecanismo de estudios de acción. Se dosificaron grupos de ratones SCID hembras que portaban tumores PC3 (n = 8-10/grupo) oralmente con vehículo o Compuesto 2 (las dosis variaron entre 0,25 y 5 mg/kg) a lo largo del estudio, empezando cuando los volúmenes tumorales alcanzaron aproximadamente 150 mm3. Los grupos con la dosis de dos veces al día (BID) se dosificaron con una separación de 10 horas entre las dosis de la mañana y de la tarde. En el grupo de control positivo, se administró rapamicina Q3D (cada tercer día) a través de la ruta intraperitoneal (IP). Al final de cada estudio, se recogieron muestras de plasma y/o tumor.
El diseño de los experimentos se muestra en la (Tabla 8) a continuación.
TABLA 8
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(continuación)
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Farmacocinética / Estudios farmacodinámicos. Grupos de ratones SCID hembra con tumores PC3 (n = 4 por grupo) se dosificaron por vía oral con una dosis única de vehículo o Compuesto 2. Las muestras de plasma y tumor se recogieron en varios puntos de tiempo después de la administración del compuesto como se describe.
Los puntos de tiempo de recogida de plasma y tumor fueron puntos de tiempo terminales para estudios de PK/PD.
Compuesto 2 (1 y 10 mg/kg) a las 1,3, 6, 10 y 24 horas; control de vehículos a las 24 horas.
Compuesto 2 (0,1, y 0,3 mg/kg) a las 0,5, 1,3, 6, 10 y 24 horas; control de vehículos a las 24 horas.
Cinética de la inhibición de ADN-PK. Los grupos de ratones SCID con tumor PC3 (n = 4 por grupo) se dosificaron por vía oral con 5 mg/kg de Compuesto 2 o vehículo diariamente durante 6 días (QDx6). Los tumores se recogieron a las 3, 6, 10, 24, 36 y 48 h después de la última dosis y se procesaron para inmunohistoquímica.
Procedimientos experimentales. La línea celular PC3 se obtuvo de American Tissue Culture Collection (ATCC) (Gaithersburg, MD) y se cultivó en medio de crecimiento que contenía medio Ham's F12K con L-glutamina 2 mM ajustada para contener 1,5 g/L de bicarbonato de sodio y 10% de suero fetal bovino. Las células se despegaron de los frascos de cultivo tisular usando tripsina-EDTA. Después de centrifugar, las pastillas celulares se suspendieron en PBS y se contaron las células usando un hemocitómetro. Se añadió Matrigel a la suspensión celular para ajustar el volumen final a 2 x 106 células/0,1 ml de una mezcla 1:1 de Matrigel: PBS.
Los ratones se anestesiaron con isoflurano inhalado y, a continuación, se inocularon con células tumorales PC3 por vía subcutánea por encima de la pata trasera derecha con 0,1 ml de una suspensión de células individuales en Matrigel usando una jeringa estéril de 1 ml con una aguja de calibre 26. Después de la inoculación, los ratones se devolvieron a las jaulas de microaislador.
Después de la inoculación de animales, se permitió que los tumores crecieran hasta aproximadamente 150 mm3 antes de la aleatorización de los ratones. El número de días típico requerido para que los tumores alcancen 150 mm3 fue de 8 a 9 días. Se midió el tumor de cada animal y los animales con tumores que variaban entre 130 y 155 mm3 se incluyeron en el estudio. Los animales del grupo se distribuyeron entonces aleatoriamente en varias jaulas y las jaulas se asignaron aleatoriamente a grupos de vehículo, control positivo, o artículos de ensayo. Todos los ratones se etiquetaron con etiquetas metálicas en la oreja en la oreja derecha. Cada grupo típico consistió en 9-10 animales.
El compuesto 2 se formuló a 5 mg/kg en CMC al 0,5% y Tween 80 al 0,25% en agua (como una suspensión). Las formulaciones se homogeneizaron usando una mano y mortero de Teflon™ (triturador de tejido Potter-Elvehjem). Las diluciones para acomodar dosis más bajas se hicieron directamente del stock de 5 mg/kg (1 mg/ml). Entre las dosis, el compuesto formulado se almacenó en la oscuridad bajo agitación constante usando un agitador magnético a 4 °C. El compuesto se formuló cada 3 días. El artículo de ensayo se administró por sonda oral. El control positivo (rapamicina) se preparó como una disolución en etanol al 2%, polietilenglicol 400 al 45%, y disolución salina al 53% y se administró por inyección IP. Para la administración de los compuestos se usaron jeringas y agujas de sonda estériles. Todos los procedimientos incluyendo las inyecciones se hicieron en cabinas de bioseguridad pulverizadas con etanol al 70% antes de su uso.
Los volúmenes tumorales se determinaron antes del inicio del tratamiento y se consideraron como los volúmenes de partida. Posteriormente, los tumores se midieron dos veces a la semana durante la duración del estudio. Los ejes largo y corto de cada tumor se midieron usando un calibrador digital en milímetros. Los volúmenes tumorales se calcularon usando la fórmula: ancho2 x longitud/2. Los volúmenes tumorales se expresaron en milímetros cúbicos (mm3).
Los pesos corporales iniciales se registraron antes del inicio del tratamiento usando una balanza digital. El porcentaje del cambio en el peso corporal durante el curso del estudio se calculó usando las mediciones iniciales del peso corporal. Los pesos corporales de cada animal se midieron dos veces a la semana al mismo tiempo que las mediciones del tumor. Los pesos corporales se midieron más frecuentemente si se observaron disminuciones significativas durante el curso del estudio.
Después de la última medición, el experimento se terminó tomando muestras de plasma y tumor para mediciones de PK y PD. Las concentraciones compuestas en plasma se determinaron mediante tecnología LC-MS/MS. Los marcadores PD, pS6RP y pAKT (S473), se midieron usando tecnología MSD.
Después de la última dosis del artículo de prueba, se recogieron muestras de sangre mediante hemorragias retroorbitales en puntos de tiempo predeterminados durante 24 horas. Las muestras de sangre se procesaron en plasma utilizando tubos de separación de plasma que contienen heparina.
Después del último sangrado, los animales fueron sacrificados a través de asfixia por CO 2 y los tumores fueron disecados. Se colocó una pequeña pieza tumoral (aproximadamente 100 mg) en un vial previamente pesado y se congeló en nitrógeno líquido para la determinación del compuesto. Los tejidos restantes se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y/o se fijaron en formalina tamponada para mediciones de PD.
Ratones SCID hembra con tumor PC3 que oscila entre 300 y 500 mm 3 se agruparon y se distribuyeron aleatoriamente a los grupos de tratamiento con vehículo o Compuesto 2. En puntos de tiempo predeterminados después de la dosificación, se sacrificaron ratones y se recogieron muestras de plasma y tumor para la determinación de PK/PD. Las concentraciones de compuesto en plasma y tumor se determinaron por LC-MS/MS. Los marcadores PD, pS6RP y pAKT (S473), se midieron usando tecnología MSD. La modulación de los niveles totales de ADN-PKcs y fosfo-ADN-PK (pADN-PK (S2056)) se midió usando IHC.
Ensayo de descubrimiento a escala meso. Las muestras de tejido se homogeneizaron en tampón de lisis (0,5 g/ml) que contenía fosfato de para-nitrofenilo (pNPP), metavanadato de sodio (NaVO 3), dititreitol (DTT) e inhibidores de proteasa y fosfatasa, y se centrifugó durante 10 minutos a 1.200 rpm a 4 °C. Los sobrenadantes se sonicaron durante 1 minuto a 4 °C, se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80 °C.
Las concentraciones de proteína en las muestras se determinaron usando el kit de reactivo de ensayo de proteína BCA.
Se utilizaron kits y protocolo de inmunoensayo electroquimioluminiscente MSD para medir el pS6RP y pAKT (S473)/AKT total. Las placas MSD de 96 pocillos manchadas con anticuerpos contra pS6RP (S235/236), pAKT (S473) y AKT total se bloquearon con solución de bloqueo durante 5-60 minutos seguido de un lavado con tampón de lavado. A continuación, se añadieron 25 pg de lisados tumorales a cada pocillo y se incubaron durante 2 horas seguido de un lavado 4 veces con tampón de lavado. Se añadió anticuerpo de detección a cada pocillo y se incubó en la oscuridad durante 1 hora a 4 °C. A continuación, se lavaron los lugares y se leyó el antígeno unido usando un instrumento MSD SECTOR™.
Mecanismos de estudios de acción. Para determinar el posible mecanismo de acción del Compuesto 2, a los ratones con tumores PC3 se les dosificó por vía oral con vehículo o Compuesto 2 a 5 mg/kg QD durante 6 días. El control positivo, rapamicina, se dosificó IP a 4 mg/kg en los días 1,4 y 6. Dos horas después de la última dosis del vehículo, Compuesto 2 o rapamicina, los ratones fueron sacrificados y los tumores fueron disecados. Los tumores se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se procesaron para inmunohistoquímica (IHC) y TUNEL.
Inmunohistoquímica - Se utilizaron secciones de criostato de cinco a 10 micras (pm) de espesor para IHC. La modulación de los niveles totales de ADN-PKcs y fosfo-ADN-PK (pADN-PK (S2056)) se evaluó utilizando los respectivos anticuerpos específicos para la proteína total o el sitio de fosforilación en S2056. La expresión del marcador de la proliferación celular Ki67 se evaluó por IHC usando anticuerpo anti-Ki67. El anticuerpo anti-CD31 se usó para determinar la densidad de los vasos sanguíneos, que es una medición de la angiogénesis tumoral. Se fijaron secciones congeladas en paraformaldehído al 4% durante 10 minutos a temperatura ambiente, se lavaron en PBS, se bloquearon y se permeabilizaron con suero de cabra normal al 5% y tritón X-100 al 0,3%. Las secciones fueron incubadas con anticuerpos primarios (anti-ADN-PK y anti-pADN-PK (S2056) [1 pg/mL para ambos] durante 2 horas y durante la noche para anti-Ki67 [0,8 pg/mL] y anti-CD31 [15,6 pg/ml]) seguido de incubación con dilución 1:500 de anticuerpos secundarios (60 minutos). Las secciones se lavaron, se contratiñeron con colorante Hoechst (0,4 pg/ml) y se montaron con reactivo antidecoloración (antifade). Se usó un procedimiento de doble marcado para detectar ADN-PKcs y pADN-PK (S2056) o Ki67 y CD31 en la misma sección de tejido. Para los procedimientos de doble marcado, se usaron cócteles de anticuerpos primarios seguidos de un cóctel de anticuerpos secundarios para la incubación. En cada ensayo se incluyeron controles positivos y negativos. Los controles positivos incluyeron secciones que se sabía que eran reactivas con el anticuerpo. Los controles negativos incluyeron la omisión de anticuerpo primario o secundario. Los siguientes controles de especificidad se realizaron para los anticuerpos pADN-PK (S2056):
• Omisión de anticuerpos primarios o secundarios
• Control del péptido de bloqueo: el anticuerpo primario pADN-PK (S2056) se pre-incubó con un exceso de 50 veces del péptido de bloqueo antes de la adición a las secciones de tejido
• Digestión de fosfatasa: Para determinar la especificidad del fosfoanticuerpo pADN-PK (S2056), se incubaron secciones de tejido con 1.000 unidades de proteína fosfatasa A (para digerir los grupos fosfato en las proteínas en la sección de tejido) antes de la adición del anticuerpo primario
Las secciones se visualizaron con un microscopio Nikon E800 equipado con equipo de detección de fluorescencia y una cámara digital conectada a un ordenador.
Ensayo TUNEL de apoptosis - Para detectar las células apoptóticas, se utilizó el kit de detección de muerte celular in situ de fluorescencia (Roche Biosciences). Se fijaron secciones de criostato con un espesor de 5 a 10 gm en paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente, se lavaron, se permeabilizaron con tritón X-100 al 0,3% y citrato de sodio al 0,1% en PBS durante 10 minutos. Las secciones se lavaron entonces en PBS y se incubaron con una disolución de marcaje que contenía la enzima TdT durante 1 hora a 37 °C en oscuridad. Las secciones se lavaron en PBS, se contratiñeron con colorante Hoechst (0,4 gg/mL) a temperatura ambiente durante 10 minutos y se montaron en reactivo antidecoloración Prolong Gold.
Cuantificación de inmunohistoquímica - Las secciones de tejido procesadas para apoptosis o inmunotinción para ADN-PK, células proliferantes (Ki67) o vasos sanguíneos se cuantificaron usando el software Metamorph. Usando el objetivo 20X, se usaron para la cuantificación 5 campos diferentes de cada sección, 1 a 2 secciones de cada tumor, y 3 a 4 tumores de cada grupo de tratamiento o control. El área de interés se expresó como el porcentaje del área de umbral del área total. Los datos de cada animal individuo se agruparon y se calculó la media ± SEM para cada grupo. Para el estudio de inhibición cinética de ADN-PK, la expresión de pADN-PK (S2056) se normalizó a ADN-PKcs.
Resultados
Actividad antitumoral, cambio de peso corporal y farmacocinética con dosificación dos veces al día y una vez al día.
Actividad antitumoral - La actividad antitumoral del Compuesto 2 se probó con dosificación BID (0,25, 0,5 y 1 mg/kg) y QD (1 mg/kg) (Figura 19). La dosis comenzó el día 9 cuando los volúmenes tumorales oscilaron entre 140 y 155 mm 3 y continuó hasta el día 30. Para el día 30, el grupo tratado con vehículo midió 947,6 ± 75,4 mm 3. Todos los animales en el grupo de control positivo que recibieron rapamicina (4 mg/kg, Q3D) tuvieron tumores significativamente (p < 0,001) más pequeños en comparación con el grupo de vehículo en el Día 30. La inhibición tumoral se muestra como un porcentaje en la Figura 1 para cada grupo de tratamiento y representa la diferencia en el volumen tumoral promedio entre los ratones tratados con Compuesto 2 y los ratones tratados con vehículo en el Día 30. La inhibición tumoral dependiente de la dosis se logró con el Compuesto 2 con dosificación BID (46%, 57% y 66% de reducción del volumen tumoral a 0,25, 0,5 y 1 mg/kg BID, respectivamente). Los volúmenes tumorales promedio de todos los grupos tratados con el Compuesto 2 fueron significativamente menores (p < 0,001) que en los ratones control tratados con vehículo en el Día 30. La dosis eficaz más baja como se determina por una inhibición de aproximadamente el 65% del volumen tumoral se observó al nivel de dosis de 1 mg/kg. En este estudio, el Compuesto 2 también se probó con dosificación QD a 1 mg/kg. Los volúmenes tumorales promedio de los grupos dosificados QD de 1 mg/kg fueron significativamente más pequeños (p <0,001) que en los ratones de control tratados con vehículo el día 30. La inhibición tumoral observada con el Compuesto 2 dosificado a 1 mg/kg QD fue igual a 0,5 mg/kg BID.
Farmacocinética - Para determinar las concentraciones plasmáticas del Compuesto 2 a la dosis eficaz, se recogieron muestras de plasma a las 1,3, 6, 10 y 24 horas después de la última dosis y se analizaron (Tabla 9). Se observó una exposición aproximada del compuesto proporcional a la dosis. Los valores calculados de AUC0-10 h en plasma total para cada grupo de dosis BID fueron 0,60, 1,42 y 3,27 gM • h para 0,25, 0,5 y 1 mg/kg, respectivamente. El valor total calculado de AUC0-24 h en plasma para 1 mg/kg QD fue de 2,95 gM • h. Los valores calculados de AUC0-10 h en plasma de las fracciones no unidas para cada grupo de dosis BID fueron de 0,2, 0,48 y 1,1 gM • h para 0,25, 0,5 y 1 mg/kg, respectivamente (la unión a la proteína plasmática del ratón del Compuesto 2 es del 66% (PD1604)). El valor calculado de AUC0-24 h en plasma de la fracción no unida a 1 mg/kg QD fue de 1,0 gM • h.
Actividad antitumoral, cambio de peso corporal y farmacocinética con una dosis diaria
Actividad antitumoral - El estudio fue diseñado para determinar la actividad antitumoral de respuesta a la dosis del Compuesto 2 con dosificación QD en el modelo de xenoinjerto tumoral PC3. La dosis se inició el día 8 cuando los volúmenes tumorales promedio oscilaron entre 130 mm3 y 140 mm3. Al final del periodo de dosificación de 3 semanas en el Día 30, los tumores tratados con vehículo alcanzaron un volumen promedio de 919,7 ± 32,4 mm3. El control positivo de rapamicina inhibió significativamente los tumores (p < 0,001) el día 30. La inhibición del tumor dependiente de la dosis se logró con el Compuesto 2 (45%, 55%, 63% y 76% de reducción del volumen tumoral a 0,25, 1, 2 y 5 mg/kg, respectivamente; Figura 20). Los volúmenes tumorales promedio de todos los grupos tratados con el Compuesto 2 fueron significativamente menores (p < 0,001) que en los ratones de control tratados con vehículo el Día 30. La dosis eficaz más baja como se determina por una inhibición de aproximadamente el 65% del volumen tumoral se observó al nivel de dosis de 2 mg/kg QD.
Farmacocinética - Para determinar las concentraciones plasmáticas del Compuesto 2 a la dosis eficaz, se recogieron muestras de plasma a las 1, 3, 6, 10 y 24 horas del último día y se analizaron (Tabla 11). Se observó una exposición aproximada del compuesto proporcional a la dosis. Los valores de AUC0-24 h plasmático total calculado para cada grupo de dosis fueron de 0,88, 2,33, 5,93 y 17,0 pM • h para 0,25, 1,2 y 5 mg/kg, respectivamente. Los valores de AUC0-24 h plasmático calculado de las fracciones no unidas para cada grupo de dosis fueron de 0,30, 0,79, 2,0 y 5,7 pM • h para 0,25, 1,2 y 5 mg/kg, respectivamente (la unión a la proteína plasmática del ratón del Compuesto 2 es del 66%).
TABLA 9
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Farmacocinética / Farmacodinámica del Compuesto 2 en ratones portadores de tumor PC3
Marcadores de PD relacionados con la vía mTOR - La relación PK/PD entre las exposiciones del Compuesto 2 en plasma y la inhibición de los marcadores de PD relacionados con la vía mTOR tumoral se determinó después de la administración de una dosis única de compuesto. Los niveles de pS6RP (un marcador PD para mTORC1) y pAKT (S473) (un marcador PD para mTORC2) se midieron en el tumor y se correlacionaron con la exposición del compuesto en el plasma. La relación PK/PD se estudió a varios niveles de dosis (0,1,0,3, 1 y 10 mg/kg). En el estudio, la relación PK/PD se estudió a 1 y 10 mg/kg. Hubo una relación dependiente de la dosis y el tiempo entre la exposición plasmática del Compuesto 2 y los niveles de pS6RP y pAKT (S473) en el tumor (Figura 21). Al nivel de dosis de 1 mg/kg, pS6RP y pAKT (S473) se inhibieron significativamente (p <0.001) durante 10 horas (aproximadamente 80% y 65% de inhibición para pS6RP y pAKT (S473), respectivamente) a una concentración plasmática de 0,12 ± 0,003 pM. En el nivel de dosis de 10 mg/kg, la inhibición > 80% de ambos marcadores PD persistió durante 24 horas (Figura 21; Tabla 10).
TABLA 10
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En el estudio, se examinó la relación PK/PD a dosis bajas de 0,3 y 0,1 mg/kg (Tabla 10). A 0,3 mg/kg, se observó una inhibición significativa de pS6RP (p < 0,001) y pAKT (S473) (p < 0,05) hasta 10 horas y 6 horas, respectivamente; sin embargo, la inhibición significativa (p < 0,05) de ambos marcadores PD se observó solo en el punto de tiempo de 0,5 horas para el nivel de dosis de 0,1 mg/kg.
Los datos de los estudios del Compuesto 2 PK/PD indican que, en general, se necesitan concentraciones plasmáticas > 0,12 gM para inhibir > 80% pS6RP y > 65% pAKT (S473). Al nivel de dosis de 1 mg/kg BID (la dosis eficaz mínima), las concentraciones plasmáticas superiores a 0,12 gM se mantuvieron durante 6 horas dos veces al día y esto condujo a una reducción del volumen tumoral del 65%. Con la dosificación de QD, las concentraciones plasmáticas> 0,12 gM se mantuvieron durante al menos 10 horas (0,21 gM a las 10 horas) a 2 mg/kg que condujeron a una reducción del volumen tumoral de aproximadamente el 65%. Basado en la relación PK/PD entre la concentración plasmática del Compuesto 2 y la inhibición del biomarcador PD, así como la relación entre la concentración plasmática del Compuesto 2 y los datos de reducción del volumen tumoral en xenoinjertos de PC3, el mantenimiento de este nivel de exposición (> 0,12 gM) y el grado de inhibición del biomarcador durante 10 horas con una dosis diaria o al menos 6 horas dos veces al día (dosificación BID) confiere una buena eficacia antitumoral en los tumores PC-3.
pADN-PK (S2056) - Este estudio fue diseñado para demostrar la inhibición de pADN-PK (S2056) en tumores PC3 tratados con el Compuesto 2. Para determinar el alcance de la inhibición de pADN-PK (S2056) en tumores PC3, se administró a los ratones portadores de tumor vehículo o Compuesto 2 a 5 mg/kg (QD durante 6 días); los tumores se cosecharon 2 horas después de la última dosis el día 6 y se procesaron para inmunohistoquímica para detectar proteínas totales (ADN-PKcs) y fosfo (pADN-PK (S2056)). En los tumores PC3 tratados con vehículo, había numerosas células que exhibían una fuerte señal inmunofluorescente para ADN-PKcs y pADN-PK (S2056). Hubo una reducción del 98% (p < 0,0001) en el área del umbral que fue positiva para pADN-PK (S2056) en los tumores tratados con el Compuesto 2 en comparación con los tumores tratados con vehículo. No hubo diferencias significativas en el área del umbral positivo teñido con un anticuerpo para ADN-PKcs en tumores tratados con vehículo y compuesto 2. Estos datos sugieren que el Compuesto 2 inhibe pADN-PK (S2056) en tumores PC3.
Para determinar la cinética de inhibición para pADN-PK (S2056) después del tratamiento con el Compuesto 2 en tumores PC3, los ratones portadores de tumor se dosificaron con vehículo o Compuesto 2 (5 mg/kg, QD) durante 6 días y los tumores se recogieron a 3 , 6, 10, 24, 36 y 48 horas después de la última dosis y se procesaron para inmunohistoquímica para detectar ADN-PKcs y pADN-PK (S2056). La expresión de pADN-PK (S2056) se normalizó a la expresión de ADN-PKcs totales (Figura 22). Se observó una inhibición significativa (p < 0,001) de pADN-PK (S2056) (aproximadamente 90%) durante 24 horas después de la última dosis del Compuesto 2. Posteriormente, la inmunofluorescencia de pADN-PK (S2056) volvió gradualmente a los niveles de control en 48 horas (Figura 22). Como las muestras de plasma no se obtuvieron de este estudio, no se pudo determinar una relación directa de PK/PD entre la inhibición de pADN-PK (S2056) y la exposición al Compuesto 2 en plasma. Sin embargo, los datos de exposición al plasma del estudio de eficacia anterior dosificado a 5 mg/kg mostraron que había 0,13 gM de Compuesto 2 en el plasma a las 24 horas después de la última dosis. Estos datos juntos indican que se puede lograr aproximadamente un 90% de inhibición de pADN-PK (S2056) con concentraciones plasmáticas del Compuesto 2 > 0,13 gM.
Mecanismo de estudios de acción
Actividad antiproliferativa y antiangiogénica del compuesto 2 - Para determinar el posible mecanismo de acción del Compuesto 2, se extrajeron tumores de animales tratados con vehículo (oral, QD durante 6 días) o Compuesto 2 (oral 5 mg/kg, QD durante 6 días) 2 horas después de la última dosis en Día 6 y procesado para inmunohistoquímica. Se utilizó inmunohistoquímica con el anticuerpo anti-Ki67 para determinar si el Compuesto 2 inhibía el crecimiento tumoral por el bloqueo de la proliferación de las células tumorales in vivo. Ki67 es un antígeno nuclear expresado en células. Se ha demostrado una fuerte correlación entre la fracción de células proliferantes en fase S y el índice Ki67. Se cotiñeron secciones de tumor con anticuerpo anti-CD31 para determinar la actividad antiangiogénica del compuesto. El anticuerpo CD31 (también llamado PECAM-1) reconoce una molécula CD31 expresada en las membranas de las células endoteliales y participa en sus interacciones adhesivas. Los núcleos se contratiñeron con colorante Hoechst. Las células proliferantes y los microvasos se cuantificaron usando software Metamorph y se expresaron como un porcentaje del área de umbral.
En los tumores PC3 tratados con vehículo, aproximadamente el 35% del área de umbral fue positiva para Ki67. Hubo una reducción del 93% (p < 0,001) en el número de células proliferantes en los tumores tratados con el Compuesto 2 comparado con los tumores tratados con vehículo. Aproximadamente el 3% del área de umbral comprendía vasos positivos para CD31 en las secciones de tumor PC3 de vehículo control como se determina por inmunohistoquímica de CD31. Hubo significativamente (reducción del 50%, p < 0,05) menos vasos sanguíneos positivos para CD31 en los tumores PC3 tratados con el Compuesto 2 en comparación con los tumores tratados con vehículo. Estos datos sugieren que la actividad antiproliferativa y la actividad antiangiogénica del Compuesto 2 son los mecanismos potenciales subyacentes a la actividad antitumoral del Compuesto 2.
Actividad apoptótica del compuesto 2 - Para determinar si el Compuesto 2 indujo la apoptosis en xenoinjertos de PC3, los tumores de animales tratados con vehículo (oral, QD durante 6 días) y tratados con Compuesto 2 (5 mg/kg, oral, QD durante 6 días) se cosecharon 2 horas después de la última dosis el día 6 y se procesaron para TUNEL, que etiqueta las células apoptóticas. En este ensayo, la transferasa desoxinucleotidil terminal (TdT) incorpora los nucleótidos marcados con FITC en los extremos de las roturas de la cadena de ADN in situ (Gavrieli, 1992). Los nucleótidos marcados con FITC (que representan a las células con roturas de hebra de ADN, una característica de la apoptosis) pueden detectarse usando un microscopio equipado con un accesorio de fluorescencia. Se observaron relativamente pocas células TUNEL positivas (0,2%) en tumores PC3 tratados con vehículo. No se observó ningún cambio significativo en el número de células TUNEL positivas entre los tumores tratados con vehículo y compuesto 2 a un nivel de dosis de 5 mg/kg (datos no mostrados).
Conclusiones. Estos estudios demostraron lo siguiente:
El tratamiento con el Compuesto 2, un doble ADN-PKi/TORKi, inhibió significativamente el crecimiento del tumor de próstata PC3 de una manera dependiente de la dosis.
La dosis eficaz mínima requerida para inhibir el crecimiento tumoral de PC3 fue de 2 mg/kg QD. El AUC0-24 h plasmático total a la dosis eficaz mínima fue de 5,93 pM • h. El AUC0-24 h de facción libre en el plasma a la dosis mínima eficaz fue de 2,0 pM • h.
La inhibición significativa de los marcadores de la vía mTOR pS6RP y pAKT (S473) en los tumores PC3 tratados con el Compuesto 2 sugiere que la actividad antitumoral observada del Compuesto 2 estuvo mediada por la inhibición tanto de mTORC1 como de mTORC2. También se observó una inhibición significativa de pADN-PK (S2056) en tumores PC3 tratados con el Compuesto 2. Como el modelo de xenoinjerto de PC3 es sensible a la inhibición de mTOR, la contribución de la inhibición de pADN-PK (S2056) con el Compuesto 2 en la actividad antitumoral observada no se pudo determinar en este modelo.
En los tumores PC3, la relación PK/PD indica que se obtuvo > 80% de inhibición de pS6RP y > 65% de inhibición de pAKT (S473) para concentraciones plasmáticas totales del fármaco superiores a 0,12 pM. El mantenimiento de los niveles plasmáticos > 0,12 pM y este grado de inhibición del biomarcador durante 10 horas con una dosis diaria o hasta 6 horas dos veces al día (dosificación BID) confiere una buena eficacia antitumoral en tumores PC3.
Los datos inmunohistoquímicos demuestran que la actividad antitumoral observada del Compuesto 2 no solo se debió a la inhibición de la proliferación de células tumorales sino también a las actividades antiangiogénicas del Compuesto 2 in vivo.
ACTIVIDAD ANTI-TUMOR DEL COMPUESTO 1 EN EL MODELO DE CÁNCER DE PRÓSTATA LNCAP RESISTENTE A LA CASTRACIÓN (LNCAP-HR) (descrito como referencia)
El estudio de xenoinjerto se lleva a cabo con ratones portadores de tumor LNCaP-HR resistentes a la castración. Los ratones SCID machos castrados se inoculan subcutáneamente con células LNCaP-HR en la región del flanco sobre la pata trasera derecha. Después de la inoculación de los animales, se dejó que los tumores crecieran hasta aproximadamente 300 mm3 antes de la aleatorización. Tres semanas después de la inoculación de células tumorales, los ratones con tumores LNCaP-HR que oscilan entre 100 y 400 mm3 se agrupan y se asignan al azar en varios grupos de tratamiento. El Compuesto 1 se formuló en CMC al 0,5% y Tween 80 al 0,25% en agua (como una suspensión). Se administró oralmente a los animales vehículo (CMC-Tween) o Compuesto 1 una vez al día (QD) durante hasta 15 semanas. Las dosis del Compuesto 1 oscilan entre 5 y 20 mg/kg. El control positivo MDV-3100 (50 mg/kg, Q4D) se administra por vía oral. MDV-3100 está formulado en 1% de CMC, 0,1% de Tween 80 y 5% de sulfóxido de dimetil (DMSO) en agua (como suspensión). Los tumores se miden dos veces a la semana usando calibradores y los volúmenes tumorales se calculan usando la fórmula de W2 x L / 2. Se llevó a cabo un análisis estadístico usando un análisis de varianza de una vía (ANOVA) seguido por una comparación post hoc de Dunnett con el grupo de control tratado con vehículo.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Compuesto 1 -etil-7-(2-metil-6-(1 H-1,2,4-triazol-3-il)piridin-3-il)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazina-2(1 H)-ona para usar en un procedimiento para tratar el cáncer de próstata, donde el procedimiento comprende la administración a un paciente que tiene cáncer de próstata de 0,5 mg/día a 128 mg/día de dicho compuesto, y donde el cáncer de próstata no es cáncer de próstata resistente a la castración que sobreexpresa ETS.
2. El compuesto para uso de la reivindicación 1, donde el procedimiento comprende además la evaluación de la inhibición de la fosforilación de S6RP, 4E-BP1 y/o AKT en una muestra biológica del paciente, y donde la evaluación comprende la comparación de la cantidad de S6RP fosforilada, 4E-BP1 y/o AKT en una muestra biológica de dicho paciente obtenida antes y después de la administración de dicho compuesto, donde S6RP, 4E-BP1 y/o AKT menos fosforilados en dicha muestra biológica obtenidos después de dicha administración en relación con la cantidad de S6RP fosforilada, 4E-BP1 y/o AKT en dicha muestra biológica obtenida antes de dicha administración indica inhibición.
3. El compuesto para uso de la reivindicación 1, donde el procedimiento comprende además la evaluación de la inhibición de la actividad de la proteína quinasa dependiente de ADN (ADN-PK) en una muestra de piel del paciente, y donde la evaluación comprende la comparación de la cantidad de ADN-PK fosforilada en un muestra de piel de dicho paciente obtenida antes y después de la administración de dicho compuesto, donde menos ADN-PK fosforilado en dicha muestra de piel obtenida después de dicha administración en relación con la cantidad de ADN-PK fosforilado en dicha muestra de piel obtenida antes de dicha administración indica inhibición.
4. El compuesto para uso de la reivindicación 1, donde el procedimiento comprende además la medición de la inhibición de la fosforilación de S6RP, 4E-BP1 o AKT en una muestra biológica del paciente, y donde la medición comprende medir la cantidad de S6RP fosforilada, 4E-BP1 o AKT en dicho paciente después de la administración de dicho compuesto y la comparación de dicha cantidad de S6RP fosforilada, 4E-BP1 o AKT con la de dicho paciente antes de dicha administración.
5. El compuesto para uso de la reivindicación 1, donde el procedimiento comprende además la medición de la inhibición de la fosforilación de ADN-PK S2056 en una muestra de piel del paciente, donde la medición comprende medir la cantidad de ADN-PK S2056 fosforilada presente en la muestra de piel después de la administración de dicho compuesto y la comparación de dicha cantidad de ADN-PK S2056 fosforilado con el de una muestra de piel de dicho paciente antes de dicha administración.
6. El compuesto para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el cáncer de próstata es aquel en el que se activa la vía PI3K/mTOR.
7. El compuesto para uso de la reivindicación 6, donde el cáncer de próstata es aquel en el cual la vía PI3K/mTOR se activa debido a la pérdida de PTEN, una mutación PIK3Ca o sobreexpresión de EGFR, o una combinación de las mismas.
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