ES2751915T3 - Proteínas de fusión de inmunoglobulina con SIRP alfa - Google Patents

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Abstract

Una proteína de fusión de inmunoglobulina con SIRPα que comprende: (i) un dominio extracelular de IgV de la proteína alfa reguladora de señal (SIRPα) o una variante de SIRPα que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80 % idéntica (a) a los restos 3-115 de la SEQ ID NO: 6, (b) a los restos 3-114 de la SEQ ID NO: 8 o (c) a los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 190, en donde la variante de SIRPα comprende una modificación en un aminoácido en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 6, 27, 31, 37, 54, 56, 66 o 72 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 190, en donde la modificación es una sustitución seleccionada del grupo que consiste en: V6I; V27I; A27I; 131R; I31T; Q37W; Q37H; E54P; H56P; S66Q; L66Q; y M72R; y (ii) una molécula de inmunoglobulina o parte de la misma que se une con un antígeno de superficie en una célula promotora de enfermedad.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas de fusión de inmunoglobulina con SIRP alfa
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica la prioridad y el beneficio de la solicitud provisional de patente de los Estados Unidos n.° 62/038.196, presentada el 15 de agosto de 2014.
Campo de la invención
Esta invención se refiere en general a proteínas de fusión que tienen la capacidad de unirse a CD47 y un antígeno de superficie en una célula promotora de enfermedad, tal como una célula tumoral.
Antecedentes de la invención
Los macrófagos son los principales fagocitos que eliminan células enfermas, tales como células cancerosas, mediante fagocitosis. Si un macrófago fagocita o no una célula diana depende de las concentraciones relativas de las señales profagocíticas y antifagocíticas.
Las células normales, sanas, evitan la fagocitosis porque el CD47 expresado de manera ubicua en células normales interactúa con la proteína reguladora de señal alfa (SlRPa) en el macrófago, lo que desencadena una señal propia "no me comas".
Sin embargo, a medida que las células cancerosas se adaptan para potenciar su supervivencia, subvierten los mecanismos normales de control inmunitario para escapar de la vigilancia inmunitaria mediante la sobreexpresión de CD47, lo que las hace resistentes a macrófagos. Por ejemplo, se ha mostrado que CD47 está regulado positivamente en células de leucemia humana para evitar la fagocitosis (Jaiswal et al., Cell, 138:271-285, 2009). Asimismo, CD47 está altamente expresado en células madre de leucemia mieloide aguda humana (LMA) y es un factor de pronóstico adverso (Majeti et al., Cell, 138:266-299, 2009). La sobreexpresión de CD47 como mecanismo de supervivencia explica en parte por qué muchos anticuerpos terapéuticos tienen una eficacia antitumoral limitada a pesar del hecho de que se espera que las células tumorales opsonizadas por anticuerpos interactúen con los receptores de Fc activadores (FcR) en células inmunitarias para inducir fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
El documento WO 2014/121093 A1 desvela una proteína de fusión que comprende un componente polipeptídico que bloquea la unión de CD47 con SIRP alfa y un polipéptido que se une con y desencadena un receptor de TRAlL o Fas. También se proporciona un método para tratar el cáncer en un paciente que comprende administrar la proteína de fusión de la invención a un paciente que necesite dicho tratamiento.
Weiskopf et al. desvelan la modificación del dominio de unión de SlRPa humano, el receptor para CD47, para su uso como un antagonista de CD47. Como monómeros de SlRPa de alta afinidad, antagonizaron de manera potente CD47 en células cancerosas pero no indujeron la fagocitosis de macrófagos por sí mismos. En cambio, presentaron sinergia con todos los anticuerpos monoclonales específicos de tumor probados mediante el aumento de la fagocitosis in vitro y mejora de las respuestas antitumorales in vivo (K. MElSKOPF ET AL: "Engineered SIRP 9-19, Variants as lmmunotherapeutic Adjuvants to 21-28, Anticancer Antibodies", 37-40, SClENCE, 45-54, vol. 341, n.° 6141,58-61 30, Mayo 2013, páginas 88-91).
En su revisión, Chao et al. destacan el papel de la evasión inmunitaria del tumor a través de la inhibición de la fagocitosis, específicamente a través de la ruta de proteína a reguladora de la señal de CD47, y analizan cómo dirigirse a esta ruta podría conducir a inmunoterapias contra el cáncer más eficaces (MARK P CHAO ET AL: "The CD47-SlRP[alpha] 24-28, pathway in cancer immune evasion and 37-40, potential therapeutic implications", 46-54, CURRENT OPlNlON lN lMMUNOLOGY, 58-61, vol. 24, n.22, 1 de abril de 2012, páginas 225-232).
Kershaw et al. describen inmunoterapias mediadas por anticuerpos tienen el potencial de tratar una gran proporción de cánceres. Weiskopf et al. describen una inmunoterapia tumoral mediada por anticuerpos en ratones que supera la resistencia de las células cancerosas a anticuerpos. Este enfoque también podría usarse en combinación con inmunoterapias que refuerzan la actividad de células inmunitarias distintas de macrófagos (MlCHAEL H KERSHAM ET AL: "Making 24-28, Macrophages Eat Cancer", 37-40, SClENCE, 46-54, vol. 341, n.° 6141, 58-61, 5 de julio de 2013, páginas 41-41).
En consecuencia, existe la necesidad en la técnica de terapias que interfieran con la capacidad de las células tumorales para evitar la fagocitosis a través de la expresión de CD47.
Sumario de la invención
Se describen en el presente documento métodos y composiciones para dirigir a células tumorales una proteína de fusión de inmunoglobulina específica tanto para un antígeno de células tumorales como para CD47. De manera específica, la proteína de fusión de inmunoglobulina incluye un resto de inmunoglobulina que es específico para un antígeno de células tumorales y tiene un segundo resto que es específico para CD47.
En un aspecto, la invención está dirigida a proteínas de fusión de inmunoglobulina con SIRPa. La proteína de fusión incluye un dominio extracelular IgV de SIRPa o una variante de SIRPa que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 80 % idéntica (a) a los restos 3-115 de la SEQ ID NO: 6, (b) a los restos 3-114 de la SEQ ID NO: 8 o (c) a los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 190, en donde la variante de SIRPa comprende una modificación en un aminoácido en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 6, 27, 31, 37, 54, 56, 66 o 72 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 190, en donde la modificación es una sustitución seleccionada del grupo que consiste en: V6I; V27I; A27I; I31R; I31T; Q37W; Q37H; E54P; H56P; S66Q; L66Q; y M72R.
La proteína de fusión también incluye una molécula de inmunoglobulina o parte de la misma que se une con un antígeno de superficie en una célula promotora de enfermedad. En una realización, la célula promotora de enfermedad es una célula tumoral y el antígeno de superficie es un antígeno tumoral.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una proteína de fusión de inmunoglobulina con SIRPa que comprende un anticuerpo anti-EGFR o parte de unión a antígeno del mismo; y un dominio extracelular de IgV de SIRPa o de una variante de SIRPa que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80 % idéntica a los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 6 o a los restos 1-114 de la SEQ ID NO: 8, en donde (i) la variante de SIRPa comprende una modificación en un aminoácido en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 6, 27, 31, 37, 54, 56, 66 o 72 de la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8, en donde la modificación es una sustitución seleccionada del grupo que consiste en: V6I; V27I; A27I; I31R; I31T; Q37W; Q37H; E54P; H56P; S66Q; L66Q; y M72R, y/o (ii) la variante de SIRPa comprende una modificación a un aminoácido en una posición correspondiente a la posición 37 de la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8 donde la sustitución es Q37W.
En determinadas realizaciones, la proteína de fusión de inmunoglobulina incluye una variante de SIRPa con una secuencia de aminoácidos al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % idéntica a los restos 3-115 de la SEQ ID NO: 6 o 3-114 de la SEQ ID NO: 8.
En determinadas realizaciones, la proteína de fusión de inmunoglobulina incluye una variante de SIRPa con una secuencia de aminoácidos al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % idéntica a los restos 1­ 115 de la SEQ ID NO: 6 o 1-114 de la SEQ ID NO: 8.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular de IgV es los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 6, mientras que, en otras realizaciones, el dominio extracelular de IgV es los restos 1-114 de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, el dominio extracelular de IgV es los restos 3-115 de la SEQ ID NO: 6 mientras que, en otras realizaciones, el dominio extracelular de IgV es los restos 3-114 de la SEQ ID NO: 8. En otras realizaciones más, el dominio extracelular de IgV es los restos 1-114 de la SEQ ID NO: 193 o los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 194 o los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 195 o los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 196 o los restos 1-114 de la SEQ ID NO: 197 o los restos 1-114 de la SEQ ID NO: 198 o los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 199 o los restos 1-114 de la SEQ ID NO: 200 o los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 190.
En otras realizaciones, la variante de SIRPa tiene una secuencia de aminoácidos al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % idéntica a los restos 1-343 de la SEQ ID NO: 6. En otras realizaciones, el dominio extracelular de IgV de SIRPa es un dominio extracelular de IgV de SIRPa humano de tipo silvestre.
Como se describe en el presente documento, la variante de SIRPa tiene una secuencia de aminoácidos al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % idéntica a los restos 1-114 de la SEQ ID NO: 193 o los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 194 o los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 195 o los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 196 o los restos 1-114 de la SEQ ID NO: 197 o los restos 1-114 de la SEQ ID NO: 198 o los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 199 o los restos 1-114 de la SEQ ID NO: 200 o los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 190.
La variante de SIRPa de la proteína de fusión de inmunoglobulina puede tener una modificación en un aminoácido en una o más de las posiciones 6, 27, 31,37, 54, 56, 66 o 72 correspondientes a la SEQ ID NO: 6 o a la SEQ ID NO: 8. La modificación puede ser una sustitución, supresión o inserción de un aminoácido. En una realización preferida, la modificación es una sustitución.
En la proteína de fusión de SIRPa de la invención, la variante de SIRPa de la proteína de fusión de inmunoglobulina incluye una o más sustituciones en posiciones correspondientes a las posiciones 6, 27, 31, 37, 54, 56, 66 o 72 de la SEQ ID NO: 6 o de la SEQ ID NO: 8 seleccionadas del grupo que consiste en: V6I, V27I, A27I, 131R, I31T, Q37W, Q37H, E54P, H56P, S66Q, L66A y M72R. En una realización, la sustitución corresponde a V6I. En otra realización, la sustitución corresponde a V27I o A27I. En otra realización, la sustitución corresponde a I31R. En otra realización, la sustitución corresponde a I31T. En otra realización, la sustitución corresponde a Q37W. En otra realización, la sustitución corresponde a Q37H. En otra realización, la sustitución corresponde a E54P. En otra realización, la sustitución corresponde a H56P. En otra realización, la sustitución corresponde a S66Q o L66Q. En otra realización, la sustitución corresponde a M72R.
La variante de SIRPa de la proteína de fusión de inmunoglobulina puede tener una modificación en un aminoácido en una o más de las posiciones correspondientes a las posiciones 4, 6, 27, 31, 35, 37, 47, 52, 53, 54, 56, 66, 67, 68, 72, 92 o 94 de la s Eq ID NO: 6 o de la SEQ ID NO: 8. La modificación puede ser una sustitución, supresión o inserción de un aminoácido. En una realización preferida, la modificación es una sustitución.
Como se reivindica o describe en el presente documento, la variante de SIRPa de la proteína de fusión de inmunoglobulina puede incluir una o más de las siguientes sustituciones:
a. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 4 en donde la sustitución es L4V;
b. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 6 seleccionada de V6A, V6C, V6D, V6E, V6G, V6I, V6L, V6M, V6N, V6Q, V6S o V6T;
c. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 27 seleccionada de A27C, A27D, A27G, A27H, A27I, A27K, A27L, A27N, A27Q, A27R, A27S, A27T o A27V; o V27A, V27C, V27D, V27G, V27H, V27I, V27K, V27L, V27N, V27Q, V27R, V27S o V27T;
d. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 31 seleccionada de I31A, I31C, I31E, I31K, I31Q, I31R, I31T o 131V;
e. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 35 seleccionada de P35A, P35C, P35E, P35G, P35N, P35Q o P35S;
f. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 37 seleccionada de Q37A, Q37C, Q37E, Q37G, Q37H, Q37K, Q37L, Q37M, Q37N, Q37R, Q37S, Q37T o Q37W;
g. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 47 seleccionada de E47A, E47C, E47D, E47F, E47G, E47H, E47I, E47K, E47L, E47M, E47N, E47Q, E47R, E47S, E47T, E47V, E47W o E47Y;
h. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 52 seleccionada de Q52A, Q52C, Q52E, Q52H o Q52M;
i. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 53 en donde la sustitución es K53R;
j. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 54 seleccionada de E54D o E54P;
k. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 56 seleccionada de H56A, H56C, H56D, H56E, H56F, H56G, H56I, H56K, H56L, H56M, H56N, H56P, H56Q, H56R, H56S, H56T, H56V, H56W o H56Y;
l. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 66 seleccionada de L66A, L66C, L66D, L66E, L66F, L66G, L66H, L66I, L66K, L66M, L66N, L66P, L66Q, L66S, L66T, L66V, L66W o L66Y; o S66A, S66C, S66D, S66E, S66F, S66G, S66H, S66I, S66K, S66L, S66M, S66N, S66P, S66Q, S66T, S66V, S66W o S66Y; m. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 67 seleccionada de T67A, T67C, T67D, T67E, T67F, T67G, T67H, T67I, T67L, T67M, T67N, T67Q, T67R, T67S, T67V, T67W o T67Y;
n. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 68 en donde la sustitución es K68R
o. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 72 seleccionada de M72A, M72C, M72D, M72E, M72F, M72G, M72H, M72I, M72K, M72L, M72N, M72Q, M72R, M72S, M72T, M72V, M72W o M72Y;
p. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 92 seleccionada de V92A, V92C, V92D, V92E, V92G, V92I, V92M, V92N, V92Q, V92R, V92S o V92T; y/o
q. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 94 en la que la sustitución es F94L.
La variante de SIRPa puede tener una modificación, preferentemente una sustitución, que reduce la afinidad de unión de la variante de SIRPa por CD47 en comparación con SIRPa de tipo silvestre. La variante de SIRPa puede tener una modificación, que puede ser una sustitución, que aumenta la afinidad de unión de la variante de SIRPa por CD47 en comparación con SIRPa de tipo silvestre.
En determinadas realizaciones, la molécula de inmunoglobulina es un anticuerpo intacto, mientras que, en otras realizaciones, la molécula de inmunoglobulina es una parte de unión a antígeno de un anticuerpo. En otra realización más, la molécula de inmunoglobulina es una parte de un anticuerpo que es un dominio variable de anticuerpo. En algunas realizaciones, el dominio variable de anticuerpo es un fragmento de unión a antígeno tal como un Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, scFv, anticuerpo monocatenario, minicuerpo, diacuerpo o anticuerpo de dominio único (nanocuerpo). En una realización, el anticuerpo intacto es un anticuerpo anti EGFR, tal como cetuximab.
En otras realizaciones, la molécula de inmunoglobulina es una parte de unión a antígeno de un anticuerpo que es una región Fc, en donde la región Fc está modificadas por ingeniería genética para contener un sitio de unión a antígeno, por ejemplo, un resto Fcab. En algunas realizaciones, cuando la molécula de inmunoglobulina es un Fcab, la SIRPa o variante de SIRPa está conectada por su extremo N a la molécula de inmunoglobulina, mientras que, en otras realizaciones, la SIRPa o variante de SlRPa está conectada a la molécula de inmunoglobulina a través de su extremo C.
En algunas realizaciones, la SIRPa o variante de SIRPa está conectada por su extremo N a la molécula de inmunoglobulina, mientras que, en otras realizaciones, la SIRPa o variante de SIRPa está conectada a través de su extremo C a la molécula de inmunoglobulina. En otras realizaciones, cuando la molécula de inmunoglobulina es un anticuerpo intacto, la SIRPa o variante de SIRPa está conectada al extremo C de la cadena pesada o al extremo C de la cadena ligera y, opcionalmente, a través de un conector. En otras realizaciones, cuando la molécula de inmunoglobulina es un anticuerpo intacto, la SIRPa o variante de SIRPa está conectada al extremo N de la cadena pesada o al extremo N de la cadena ligera y, opcionalmente, a través de un conector.
En otras realizaciones más, la molécula de inmunoglobulina o parte de la misma está conectada a la SIRPa o variante de SIRPa a través de un resto conector. El resto conector puede fusionarse con la SIRPa o variante de SIRPa en el extremo N o extremo C del resto de SIRPa.
En otras realizaciones más, la molécula de inmunoglobulina o parte de la misma está conectada a través de su extremo N a la SIRPa o variante de SIRPa, opcionalmente a través de un resto conector, mientras que, en otras realizaciones, la molécula de inmunoglobulina o parte de la misma está conectada a través de su extremo C a la SIRPa o variante de SIRPa, opcionalmente a través de un resto conector. En otras realizaciones, la SIRPa o variante de SIRPa está conectada al extremo N de una cadena ligera de anticuerpo o una parte de la misma, mientras que, en otra realización, la SIRPa o variante de SIRPa está conectada al extremo C de una cadena ligera de anticuerpo o una parte de la misma. En otras realizaciones, la SIRPa o variante de SIRPa está conectada al extremo N de una cadena pesada de anticuerpo o una parte de la misma, mientras que, en otra realización, la SIRPa o variante de SIRPa está conectada al extremo C de una cadena pesada de anticuerpo o una parte de la misma. Se puede contemplar un conector entre SIRPa o una variante de SIRPa y una molécula de inmunoglobulina o parte de la misma.
En determinadas realizaciones, el antígeno tumoral al que se une la molécula de inmunoglobulina o parte de la misma se selecciona de HER2, HER3, EGFR, CD20, Gd2, PD-L1 y CD19.
En otra realización, la invención está dirigida a una proteína de fusión de inmunoglobulina con SIRPa que incluye un dominio extracelular de IgV de SIRPa o de una variante de SIRPa que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 80 % idéntica a los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 190; y una molécula de inmunoglobulina o parte de la misma que se une con un antígeno de superficie en una célula promotora de enfermedad. La célula promotora de enfermedad puede ser una célula tumoral y el antígeno de superficie puede ser un antígeno tumoral.
En una realización, la variante de SIRPa tiene una secuencia de aminoácidos al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % idéntica a los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 190.
En otra realización, la variante de SIRPa tiene una modificación en un aminoácido en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 6, 27, 31,37, 54, 56, 66 o 72 de la SEQ ID NO: 190. En una realización adicional, la modificación se selecciona del grupo que consiste en: V6I; V27I; A27I; I31R; I31T; Q37W; Q37H; E54P; H56P; S66Q; L66Q; y M72R.
La invención se refiere a una proteína de fusión de inmunoglobulina con SIRPa que incluye un anticuerpo anti-EGFR o una parte de unión a antígeno del mismo y un dominio extracelular de IgV de SIRPa o de una variante de SIRPa que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 80 % idéntica a los restos 3-115 de la SEQ ID NO: 6 o 3-114 de la SEQ ID NO: 8.
En una realización adicional, la SIRPa o una variante de SIRPa tiene una secuencia de aminoácidos al menos 85 % idéntica, al menos 90 % idéntica o al menos 95 % idéntica a los restos 3-115 de la SEQ ID NO: 6 o 3-114 de la SEQ ID NO: 8.
En otra realización más, la SIRPa o una variante de SIRPa tiene una secuencia de aminoácidos al menos 80 % idéntica, al menos 85 % idéntica, al menos 90 % idéntica o al menos 95 % idéntica a los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 6 o 1-114 de la SEQ ID NO: 8.
En una realización adicional, el anticuerpo anti-EGFR o parte de unión a antígeno del mismo contiene la región variable de cadena pesada y región variable de cadena ligera de un anticuerpo seleccionado de cetuximab, panitumumab, nimotuzumumab, matuzumab, futuximab, imgatuzumab o necitumumab. En otra realización más, el anticuerpo anti-EGFR o parte de unión a antígeno del mismo contiene las regiones determinantes de complementariedad de un anticuerpo seleccionado de cetuximab, panitumumab, nimotuzumumab, matuzumab, futuximab, imgatuzumab o necitumumab. En otra realización más, el anticuerpo anti-EGFR o parte de unión a antígeno del mismo contiene la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera de un anticuerpo seleccionado de cetuximab, panitumumab, nimotuzumumab, matuzumab, futuximab, imgatuzumab o necitumumab. En una realización adicional más, el anticuerpo anti-EGFR se selecciona de cetuximab, panitumumab, nimotuzumumab, matuzumab, futuximab, imgatuzumab o necitumumab. En otra realización, el anticuerpo anti-EGFR es cetuximab.
En otra realización, la SIRPa o variante de SIRPa está conectada al extremo N de la cadena pesada o ligera del anticuerpo anti-EGFR o parte de unión a antígeno del mismo, opcionalmente, mediante un conector. En otra realización, la SIRPa o variante de SIRPa está conectada al extremo C de la cadena pesada o ligera del anticuerpo anti-EGFR o parte de unión a antígeno del mismo, opcionalmente, mediante un conector.
En una realización adicional, la proteína de fusión de inmunoglobulina anti-EGFR-SIRPa incluye un dominio extracelular de IgV de SIRPa o de una variante de SIRPa que tiene una modificación en una o más de las posiciones correspondientes a las posiciones 6, 27, 31, 37, 54, 56, 66 o 72 de la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8. En una realización, la modificación es una sustitución correspondiente a Q37W. En otra realización, la modificación es una o más sustituciones correspondientes a sustituciones seleccionadas de V6I, V27I, A27I, 131R, Q37W, Q37H, E54P, H56P, S66Q, L66Q y M72R.
También se describe en el presente documento una proteína de fusión de inmunoglobulina que tiene una molécula de inmunoglobulina o parte de la misma que se une con un antígeno de células tumorales y un resto de unión a CD47 que comprende un dominio extracelular de IgV de SIRPa o una variante de SIRPa que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 80 % idéntica a los restos 3-115 de la SEQ ID NO: 6 o 3-114 de la SEQ ID NO: 8. La proteína de fusión puede tener un % de intensidad de fluorescencia media (IFM) de unión a glóbulos rojos (RBC) de 35 % o menos cuando el % de IFM de unión a RBC para un anticuerpo anti-CD47 está calibrado al 100 %. El anticuerpo anti-CD47 es B6H12/huIgG1. La proteína de fusión también se une a CD47 en una célula distinta de glóbulo rojo. La célula distinta de glóbulo rojo, en una realización, es una célula tumoral.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión de inmunoglobulina tiene un dominio extracelular de IgV de SIRPa o una variante de SIRPa que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % idéntica a los restos 3-115 de la SEQ ID NO: 6 o 3-114 de la SEQ ID NO: 8.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión de inmunoglobulina tiene un dominio extracelular de IgV de SIRPa o una variante de SIRPa que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % idéntica a los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 6 o 1-114 de la SEQ ID NO: 8.
En algunas realizaciones, el antígeno de células tumorales es EGFR. En algunas realizaciones, la molécula de inmunoglobulina es un anticuerpo intacto. Por ejemplo, el anticuerpo intacto es un anticuerpo anti-EGFR en algunas realizaciones, mientras que, en determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-EGFR es cetuximab.
Como se reivindica o desvela en el presente documento, la proteína de fusión tiene un % de IFM de unión a RBC de menos del 30 %, menos del 25 %, menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 4 %, menos del 3 %, menos del 2 % o menos del 1 %. En una realización, el % de IFM de unión a RBC es menor del 10 %.
En otra realización más, la proteína de fusión tiene un % de IFM de unión a RBC entre 0-1 %, 0-2 %, 0-3 %, 0-4 %, 1 -2 %, 1 -3 %, 1 -4 %, 2-3 %, 2-4 %, 3-4 %, 3-7 %, 3-10 % o 5-10 %.
En otra realización más, la proteína de fusión tiene un % de IFM de unión a RBC de 5 % o menos, 4 % o menos, 3 % o menos, 2 % o menos o 1 % o menos.
En una realización adicional, el resto de anticuerpo es un anticuerpo anti-EGFR. Por ejemplo, el anticuerpo anti-EGFR es cetuximab, mientras que, en otra realización, el anticuerpo anti-EGFR es panitumumab, nimotuzumumab, matuzumab, futuximab, imgatuzumab o necitumumab.
En otro aspecto, la invención incluye ácidos nucleicos que codifican las proteínas de fusión de inmunoglobulina con SIRPa descritas en el presente documento. Debido a que las proteínas de fusión de inmunoglobulina descritas en el presente documento pueden requerir el ensamblaje de dos o más cadenas peptídicas, la invención contempla los ácidos nucleicos necesarios para codificar las cadenas peptídicas individuales que, tras la expresión, se ensamblan para formar la proteína de fusión. En otro aspecto, la invención incluye una célula que comprende un ácido nucleico o los ácidos nucleicos que codifican una proteína de fusión de inmunoglobulina como se describe en el presente documento. En otro aspecto más, la invención incluye un método para producir una proteína de fusión de inmunoglobulina manteniendo dicha célula en condiciones que permitan la expresión del ácido nucleico o ácidos nucleicos que codifican una proteína de fusión de inmunoglobulina de la invención.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que incluyen cantidades farmacéuticamente eficaces de una proteína de fusión de inmunoglobulina descrita en el presente documento que incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto adicional más, la invención se refiere a una proteína de fusión de inmunoglobulina de la invención para su uso en un método de tratamiento de cáncer en un mamífero. Los cánceres que pueden tratarse incluyen cáncer de mama, colorrectal, de pulmón, pancreático, endometrial, ovárico, gástrico, de próstata, renal, del cuello uterino, mieloma, linfoma, leucemia, de tiroides, uterino, de vejiga, neuroendocrino, de cabeza y cuello, de hígado, nasofaríngeo, testicular, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, melanoma, cáncer de piel de células basales, cáncer de piel de células escamosas, dermatofibrosarcoma protuberante, carcinoma de células de Merkel, glioblastoma, glioma, sarcoma, mesotelioma o síndromes mielodisplásicos.
Breve descripción de los dibujos
Las figs. 1A-O ilustran esquemáticamente las diferentes construcciones de ADN y proteínas de las proteínas de fusión de la invención.
La fig. 1A muestra dos diagramas esquemáticos de construcciones de ADN para la expresión de una proteína de fusión de anticuerpo-SIRPa. La construcción de ADN 1 (parte superior) codifica el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo (VH) seguido de dominios constantes de cadena pesada (CH1, bisagra (H)-CH2-CH3) genéticamente fusionados a través de un conector opcional (L) con SIRPa. La construcción de ADN 2 (parte inferior) codifica el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo (VL) seguido del dominio constante de cadena ligera (CL).
La fig. 1B es un dibujo esquemático de una proteína de fusión de anticuerpo-SIRPa que tiene una estructura tetramérica donde cada uno de los dos componentes polipeptídicos (es decir, cadena ligera y cadena pesada) están codificados por una construcción de ADN mostrada en la fig. 1 A.
La fig. 1C muestra dos dibujos esquemáticos de proteínas de fusión de Fc. Son de izquierda a derecha (1) SIRPa-Fc y (2) Fc-SIRPa.
La fig. 1D muestra tres construcciones de ADN para la expresión de anticuerpos biespecíficos tetravalentes. La construcción de ADN 1 (parte superior) codifica el dominio variable de cadena pesada de un primer anticuerpo (VH(1)) seguido de los dominios constantes de cadena pesada (CH1, bisagra (H)-CH2-CH3) fusionados genéticamente a través de un conector opcional (L) con el dominio variable de cadena ligera del segundo anticuerpo (VL(2)) seguido del dominio constante de cadena ligera (CL). La construcción de ADN 2 (parte media) codifica el dominio variable de cadena ligera del primer anticuerpo (VL(1)) seguido del dominio constante de cadena ligera (CL). La construcción de ADN 3 (parte inferior) codifica el dominio variable de cadena pesada del segundo anticuerpo (VH(2)) seguido del dominio constante de cadena pesada 1 (CHI) y una región de bisagra superior (H*).
La fig. 1E es un dibujo esquemático de un anticuerpo biespecífico tetravalente (TetBiAb) que tiene una estructura hexamérica donde los tres componentes polipeptídicos están codificados por las construcciones de ADN mostradas en la fig. 1D.
La fig. 1F es un dibujo esquemático de construcciones de ADN para la expresión de un anticuerpo-SIRPa. La construcción de ADN 1 (parte superior) codifica el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo (VH) seguido de dominios constantes de cadena pesada (CHI, bisagra (H)-CH2-CH3). La construcción de ADN 2 (parte inferior) codifica el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo (VL) seguido del dominio constante de cadena ligera (CL) fusionado genéticamente a través de un conector opcional (L) con SIRPa.
La fig. 1G es un dibujo esquemático de un anticuerpo-SIRPa que muestra la estructura tetramérica que comprende los dos componentes polipeptídicos codificados por la construcción de ADN mostrada en la fig. 1F. La fig. 1H es un dibujo esquemático de construcciones de ADN para la expresión de un SIRPa-anticuerpo. La construcción de ADN 1 (parte superior) codifica SIRPa fusionada genéticamente a través de un conector opcional (L) con dominios constantes de cadena pesada (bisagra (H)-CH2-CH3) fusionados genéticamente a través de un conector opcional (L) con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo (VH) seguido por el dominio constante de cadena pesada 1 (CHI) y una región de bisagra superior (H). La construcción de ADN 2 (parte inferior) codifica el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo (VL) seguido del dominio constante de cadena ligera (CL).
La fig. 1I es un dibujo esquemático de un SIRPa-anticuerpo que muestra la estructura tetramérica que comprende los dos componentes polipeptídicos codificados por la construcción de ADN mostrada en la fig. 1H. La fig. 1J es un dibujo esquemático en el que se muestra una construcción de ADN para la expresión de un SIRPa-Fc-scFv. La construcción de ADN codifica SIRPa fusionada genéticamente a través de un conector opcional (L) con dominios constantes de cadena pesada (bisagra (H)-CH2-CH3) fusionados genéticamente a través de un conector opcional (L) con el dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) fusionado genéticamente a través de un conector opcional (L) al dominio variable de cadena ligera del anticuerpo (VL). La fig. 1K es un dibujo esquemático de un SIRPa-Fc-scFv que muestra la estructura dimérica que comprende el componente polipeptídico codificado por la construcción de ADN mostrada en la fig. 1J.
La fig. 1L es un dibujo esquemático que muestra una construcción de ADN para la expresión de un scFv-Fc-SIRPa. La construcción de ADN codifica el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo (VH) fusionado genéticamente a través de un conector opcional (L) con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo (VL) fusionado genéticamente a través de un conector opcional (L) con dominios constantes de cadena pesada (bisagra (H)-CH2-CH3) fusionados genéticamente a través de un conector opcional (L) con SIRPa.
La fig. 1M es un dibujo esquemático de un scFv-Fc-SIRPa que muestra la estructura dimérica que comprende el componente polipeptídico codificado por la construcción de ADN mostrada en la fig. 1L.
La fig. 1N es un dibujo esquemático que muestra una construcción de ADN para la expresión de un SIRPa-Fcab. La construcción de ADN codifica SIRPa fusionada genéticamente a través de un conector opcional (L) con dominios constantes de cadena pesada (bisagra (H)-CH2-CH3) con dominio constante 3 modificado para unirse al antígeno.
La fig. 1O es un dibujo esquemático de un SIRPa-Fcab que muestra la estructura dimérica que comprende el componente polipeptídico codificado por la construcción de ADN mostrada en la fig. 1N. Los enlaces disulfuro intercatenarios se representan como barras cortas entre dos cadenas polipeptídicas. El conector es opcional. Las figs. 2A-B son gráficos de líneas que muestran el efecto de B6H12 anti-CD47 sobre los recuentos de glóbulos rojos (fig. 2A) y los niveles de hematocrito (fig. 2B) en monos cynomolgus.
Las figs. 3A-B muestran el análisis de la expresión de los dos polipéptidos de anti-CD20-huIgG1-SIRPaV2 mediante SDS-PAGE (fig. 3A) y el ensamblaje de la molécula tetramérica completa mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (fig. 3B) como se describe en el ejemplo 2.
Las figs. 4A-D muestran la unión de anti-CD20-huIgG1-SIRPaV2 con células que expresan CD47 (células CHO transfectadas con CD47, fig. 4A; sangre completa enriquecida en leucocitos, fig. 4B) o que expresa tanto CD20 como CD47 (células Raji, fig. 4C; células Namalwa, fig. 4D).
Las figs. 5A-B muestran la supervivencia de ratones después de inyección con células Daudi (fig. 5A) o con células Raji (fig. 5B) y tratamiento con el anti-CD20/anti-CD47 biespecífico tetravalente.
Las figs. 6A-B muestran el análisis de la expresión de los dos polipéptidos de anti-EGFR-huIgG1-SIRPa mediante SDS-PAGE (fig. 6A) y el ensamblaje de la molécula tetramérica completa mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (fig. 6B) como se describe en el ejemplo 4.
Las figs. 7A-C muestran la unión de proteínas anti-EGFR-huIgG1-SIRPa con células que expresan CD47 (células CHO transfectadas con CD47, fig. 7A; sangre completa enriquecida en leucocitos, fig. 7B) o que expresa tanto EGFR como CD47 (células A549, fig. 7C).
La fig. 8 muestra la actividad in vitro de anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 en un ensayo de ADCC usando células diana A549 y células efectoras Jurkat modificadas por ingeniería genética.
Las figs. 9A-B muestran el análisis farmacocinético de anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 en ratones (fig. 9A) y la supervivencia de ratones después del tratamiento con anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 en un modelo de tumor de pulmón ortotópico A549 (fig. 9B; triángulo relleno invertido: control de isotipo; círculo relleno: anti-EGFR; triángulo relleno: SIRPa-Fc; rombo relleno: anti-EGFR y SIRPa-Fc; círculo vacío: anti-EGFR-huIgGI-SIRPaV2).
Las figs. 10A-B muestran el análisis de la expresión de los dos polipéptidos de anti-HER2-huIgG1-SIRPaV2 mediante SDS-PAGE (fig. 10A) y el ensamblaje de la molécula tetramérica completa mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (fig. 10B) como se describe en el ejemplo 5.
Las figs. 11A-C muestran la unión de anti-HER2-huIgG1-SIRPaV2 con células que expresan CD47 (células CHO transfectadas con CD47, fig. 11A; sangre completa enriquecida en leucocitos, fig. 11B) o que expresan tanto HER2 como CD47 (células BT474, fig. 11C).
Las figs. 12A-B muestran el análisis de la expresión de los dos polipéptidos de anti-PD-L1-huIgG1-muSIRPa mediante SDS-PAGE (fig. 12A) y el ensamblaje de la molécula tetramérica completa mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (fig. 12B) como se describe en el ejemplo 7.
La fig. 13 muestra la unión de anti-PD-L1-huIgG1-muSIRPa con células A20 que expresan PD-L1 y CD47.
Las figs. 14A-B muestran el análisis de la expresión de los dos polipéptidos de anti-EGFR-huIgG1-SIRPa (N110Q) mediante SDS-PAGE (fig. 14A) y el ensamblaje de la molécula tetramérica completa mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (fig. 14B) como se describe en el ejemplo 8.
La fig. 15 muestra la unión de anti-EGFR-huIgG1-SIRPa (N110Q) con células que expresan CD47 (células CHO transfectadas con CD47).
Las figs. 16A-B muestran el análisis de la expresión de los dos polipéptidos de SIRPaV2-Fc(huIgG1)-anti-EGFR(Fab) mediante SDS-PAGE (fig. 16A) y el ensamblaje de la molécula tetramérica completa por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (fig. 16B) como se describe en el ejemplo 10.
Las figs. 17A-B muestran la unión de SIRPaV2-Fc(huIgG1)-anti-EGFR (Fab) con células que expresan CD47 (células CHO transfectadas con CD47, fig. 17A) y la actividad in vitro de SIRPaV2-Fc(huIgG1)-anti-EGFR(Fab) en un ensayo de ADCC usando células diana A549 y células efectoras Jurkat modificadas por ingeniería genética (fig. 17B), como se describe en el ejemplo 10.
La fig. 18 muestra la supervivencia de ratones después del tratamiento con SIRPaV2-Fc(huIgG1)-anti-EGFR(Fab) en un modelo de tumor de pulmón ortotópico A549 (triángulo relleno invertido: control de isotipo; círculo relleno: anti-EGFR; cruce: anti-EGFR y SIRPa-Fc; círculo vacío: anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2; rombo relleno: SIRPaV2-Fc(huIgG1 )-anti-EGFR(Fab)).
Las figs. 19A-B muestran el análisis de la expresión del polipéptido de SIRPaV2-Fcab(HER2) mediante SDS-PAGE (fig. 19A) y el ensamblaje de la molécula dimérica completa mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (fig. 19B) como se describe en el ejemplo 15.
Las figs. 20A-B muestran la unión de SIRPaV2-Fcab(HER2) con células que expresan CD47 (células CHO transfectadas con CD47, fig. 20A) o que expresan tanto HER2 como CD47 (células BT474, fig. 20B).
Las figs. 21A-C muestran el análisis de la expresión de los dos polipéptidos de anti-EGFR-huIgG1/anti-EGFR-LC-SIRPaV2 mediante SDS-PAGE (fig. 21 A) y el ensamblaje de la molécula tetramérica completa por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (fig. 21B) como se describe en el ejemplo 9, y la unión de anti-EGFR-huIgG1/anti-EGFR-LC-SIRPaV2 con células que expresan CD47 (células c Ho transfectadas con CD47, fig. 21C).
Las figs. 22A-B muestran el análisis de la expresión de los dos polipéptidos de anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 (Q37W) mediante SDS-PAGE (fig. 22A) y el ensamblaje de la molécula tetramérica completa mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (fig. 22B) como se describe en el ejemplo 18.
La fig. 23 muestra la supervivencia de ratones después del tratamiento con anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 o anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 (Q37W) en un modelo de tumor pulmonar ortotópico A549.
Las figs. 24A-B muestran el análisis de la expresión de los dos polipéptidos de anti-CD20-huIgG1-SIRPaV2(Q37W) mediante SDS-PAGE (fig. 24A) y el ensamblaje de la molécula tetramérica completa mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (fig. 24B) como se describe en el ejemplo 19.
La fig. 25 muestra la supervivencia de ratones después del tratamiento con la combinación de anti-CD20 y Fc-SIRPaV2 o Fc-SIRPaV2(Q37W) en un modelo de linfoma diseminado Daudi.
La fig. 26 muestra una alineación del dominio de IgV de alelos SIRPa humanos conocidos: IgV (V1) (restos 1-115 de la SEQ ID NO: 6), IgV (V2) (SEQ ID NO: 8), IgV (V3) (SEQ ID NO: 193), IgV (V4) (SEQ ID NO: 194), IgV (V5) (SEQ ID NO: 195), IgV (V6) (SEQ ID NO: 196), IgV (V7) (SEQ ID NO: 197), IgV (V8) (SEQ ID NO: 198), IgV (V9) (SEQ ID NO: 199) e IgV (V10) (SEQ ID NO: 200).
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a proteínas de fusión de inmunoglobulina con dirección a tumor y funciones efectoras mejoradas. En general, las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención incluyen un resto de agente de unión a CD47 y un resto de inmunoglobulina. El resto de inmunoglobulina se une con un antígeno de superficie en una célula promotora de enfermedad, mientras que el resto del agente de unión a CD47 se une con CD47 en la misma célula. Como se describe en el presente documento, la invención implica unir genéticamente un resto de inmunoglobulina específico de tumor a un resto que se une a CD47. El agente de unión a CD47 es SIRPa o una variante de SIRPa. En consecuencia, la invención se refiere a proteínas de fusión de inmunoglobulina que se unen con células tumorales que expresan CD47.
CD47 se expresa de forma ubicua en todas las células humanas. Aunque las células tumorales, especialmente células madre cancerosas, expresan niveles mayores de CD47, las células madre hematopoyéticas también sobreexpresan CD47. Por lo tanto, es poco probable que SIRPa, una variante de SIRPa u otro agente de unión a CD47 con suficiente afinidad de unión por CD47 diferencie entre células cancerosas y células normales, incluyendo glóbulos rojos, que están presentes en circulación a 5 mil millones de células/ml y ocupan aproximadamente la mitad del volumen sanguíneo. En consecuencia, las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la presente invención están diseñadas para tener alta afinidad de unión con un antígeno tumoral en células tumorales y baja afinidad de unión por CD47. Esto da como resultado unión débil de la proteína de fusión de inmunoglobulina con CD47 en células normales. De esta forma, las proteínas de fusión de inmunoglobulina están diseñadas para no dirigirse a células normales, evitando de este modo la toxicidad para células normales resultante de la expresión ubicua de CD47 y evitando también que el CD47 expresado de manera ubicua en células normales se convierta en un sumidero farmacológico para terapia anti-CD47 que de lo contrario daría como resultado farmacocinética desfavorable que sería incompatible con el régimen de una vez a la semana o una vez cada dos semanas típico para la terapia de anticuerpos. Por este motivo, el resto de fusión se une a CD47 con baja afinidad, bloqueando al mismo tiempo la capacidad de CD47 para interactuar con SIRPa.
Las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención (1) tienen alta afinidad de unión por un antígeno específico de tumor en una célula tumoral; (2) consiguen mejor dirección al tumor mediante avidez adicional proporcionada por la unión de baja afinidad del resto de fusión a CD47 en la misma célula tumoral; (3) provocan ADCP y ADCC potentes mediante una combinación de bloqueo de la señal de "no me comas" de CD47 y la activación dependiente de Fc de células efectoras inmunitarias; y (4) evitar la toxicidad mediante unión de baja afinidad con CD47 en células normales, incluyendo glóbulos rojos. Es importante destacar que la toxicidad inducida por ADCC/ADCP por células normales se reduce adicionalmente cuando la molécula que se une a CD47, por ejemplo, SIRPa o una variante de SIRPa, se une a la región Fc del resto de anticuerpo en una configuración que no es óptima para la interacción con FcR, por ejemplo, la configuración X-Fc, que tiene una orientación de amino a carboxilo similar a la de un anticuerpo nativo, induce mayor actividad de ADCC que la configuración Fc-X.
Según la presente invención, la especificidad de direccionamiento de la proteína de fusión de inmunoglobulina está impulsada principalmente por la unión de un resto de anticuerpo con su antígeno específico de tumor afín en lugar de CD47, un antígeno expresado de manera ubicua. Por otra parte, la especificidad de dirección está potenciada adicionalmente por un efecto de avidez proporcionado por la unión en cis del compañero de fusión con CD47 sobreexpresado en la célula tumoral. El direccionamiento biespecífico exitoso en cis depende críticamente de la densidad relativa del receptor y la ubicación física de las dos dianas en la superficie celular. Dicho direccionamiento tumoral potenciado debería ofrecer un mejor índice terapéutico con respecto a eficacia y seguridad superiores, en comparación con anticuerpos anti-CD47 y otros agentes de bloqueo de CD47.
Agentes de unión de CD47
Las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención incluyen un resto que es capaz de unirse con CD47. Los agentes de unión a CD47 incluyen anticuerpos contra CD47. Los agentes de unión a CD47 pueden ser proteínas o moléculas distintas de anticuerpos que tienen afinidad de unión por CD47, por ejemplo, ligandos que se unen con el receptor de CD47. Por ejemplo, la parte del agente de unión a CD47 de la proteína de fusión puede ser un anticuerpo anti-CD47. El agente de unión a CD47 es SIRPa, variante de SIRPa o una variante de SIRPa con afinidad optimizada.
"SIRPa" se refiere a la proteína alfa reguladora de señal de tipo silvestre o una secuencia de aminoácidos de un polipéptido recombinante o no recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos de la proteína alfa reguladora de señal de tipo silvestre o una variante alélica nativa o de origen natural de la proteína alfa reguladora de señal. En una realización, SIRPa es una SIRPa de mamífero de tipo silvestre, mientras que, en una realización preferida, SIRPa es una SIRPa humana de tipo silvestre. La secuencia de aminoácidos para la forma madura de la SIRPa humana de tipo silvestre predominante (SIRPaV1) se proporciona en la Tabla 4 como la SEQ ID NO: 6. En una realización, SIRPa incluye una secuencia señal, mientras que, en otra realización, SIRPa se refiere a la forma madura de la proteína.
Como se describe en el presente documento, una SIRPa es un dominio extracelular SIRPa, es decir, una proteína SIRPa modificada por ingeniería genética para excluir el dominio transmembrana y celular. Una SIRPa puede incluir al menos el dominio extracelular. La proteína SIRPa puede ser un dominio extracelular SIRPa humano. La secuencia del dominio extracelular de SIRPaV1 de tipo silvestre es los restos 1-343 de la SEQ ID NO: 6.
En la invención, una SIRPa es un dominio IgV de SIRPa del dominio extracelular. En una realización, un dominio IgV de SIRPa puede ser un dominio IgV de SIRPa humano. Como se reivindica o desvela en el presente documento, un dominio IgV de SIRPa es los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 6, un IgV de SIRPa es los restos 1-114 de la SEQ ID NO: 8, un IgV de SIRPa es los restos 3-115 de la SEQ ID NO: 6, un IgV de SIRPa es los restos 3-114 de la SEQ ID NO: 8. un dominio IgV de SIRPa es los restos 1-114 de la SEQ ID NO: 193, un dominio IgV de SIRPa es los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 194, un dominio IgV de SIRPa es los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 195, un dominio IgV de SIRPa es los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 196, un dominio IgV de SIRPa es los restos 1-114 de la SEQ ID NO: 197, un dominio IgV de SIRPa es los restos 1-114 de la SEQ ID NO: 198, un IgV de SIRPa es los restos 1-115 de la SeQ ID NO: 199 o un dominio IgV de SIRPa es los restos 1-114 de la SEQ ID NO: 200. Una SIRPa incluye al menos el dominio IgV de SIRPa del dominio extracelular.
La invención también incluye "variantes" de SIRPa. Una "variante" de SIRPa se define como una secuencia de aminoácidos de SIRPa que está alterada por uno o más aminoácidos en comparación con SIRPa de tipo silvestre. La variante puede tener cambios "conservativos", en donde un aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o químicas similares, por ejemplo, reemplazo de leucina con isoleucina. Menos habitualmente, una variante puede tener cambios "no conservativos", por ejemplo, reemplazo de una glicina con un triptófano. Las variaciones menores similares también pueden incluir supresiones o inserciones de aminoácidos, o ambas.
Las variantes de SIRPa pueden incluir polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con SIRPa de tipo silvestre.
Las variantes de SIRPa pueden incluir polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con un dominio extracelular de SIRPa de tipo silvestre. Las variantes de SIRPa pueden incluir polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con los restos 1-343 de la SEQ ID NO: 6.
Como se reivindica o desvela en el presente documento, las variantes de SIRPa pueden incluir polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con el dominio IgV de un dominio extracelular de SIRPa de tipo silvestre, por ejemplo, restos 1-115 de la SEQ ID NO: 6, restos 1-114 de la SEQ ID NO: 8, restos 1-114 de la SEQ ID NO: 193, 1-115 de la SEQ ID NO: 194, 1-115 de la SEQ ID NO: 195, 1­ 115 de la SEQ ID NO: 196, 1-114 de la SEQ ID NO: 197, 1-114 de la SEQ ID NO: 198, 1-115 de la SEQ ID NO: 199 o 1-114 de la SEQ ID NO: 200; o polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con el dominio IgV de los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 6; o polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con el dominio IgV de los restos 1­ 114 de la SEQ ID NO: 8; o polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con el dominio IgV de los restos 1-114 de la SEQ ID NO: 193; o polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con el dominio IgV de los restos 1­ 115 de la SEQ ID NO: 194; o polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con el dominio IgV de los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 195; o polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con el dominio IgV de los restos 1­ 115 de la SEQ ID NO: 196; o polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con el dominio IgV de los restos 1-114 de la SEQ ID NO: 197; o polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con el dominio IgV de los restos 1­ 114 de la SEQ ID NO: 198; o polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con el dominio IgV de los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 199; o polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con el dominio IgV de los restos 1­ 114 de la SEQ ID NO: 200; o polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con el dominio IgV de los restos 1-114 de la SEQ ID NO: 190. La SEQ ID NO: 190 es una secuencia consenso de diez dominios IgV de SIRPa humanos conocidos.
Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean con fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para alineamiento óptimo con una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico). El porcentaje identidad entre las dos secuencias está en función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología=(n.2 de posiciones idénticas/n.2 de posiciones total) x 100). La determinación del porcentaje de homología entre dos secuencias se puede realizar usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-68, modificado como en Karlin y Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-77. Dicho algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLa St de Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol., 215:403-10. Pueden realizarse búsquedas de nucleótidos BLAST con el programa NBLAST, puntuación=100, longitud de palabra=12. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuación=50, longitud de palabra=3. Para obtener alineaciones con huecos con fines de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Research, 25(17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST).
Una variante de SIRPa puede incluir una o más mutaciones en el dominio variable del dominio extracelular en comparación con SIRPa de tipo silvestre. Se describen posteriormente mutaciones contempladas por la invención y también se proporcionan en las tablas 1 y 2 que se encuentran en el ejemplo 16 posterior, así como en la tabla 3 que se encuentra en el ejemplo 17 posterior.
Una variante de SIRPa de la invención tiene una modificación en un aminoácido en una posición correspondiente a una o más de las posiciones 6, 27, 31, 37, 54, 56, 66 o 72 correspondientes a la SEQ ID NO: 6 o a la SEQ ID NO: 8 o a la SEQ ID NO: 190. La modificación puede ser una supresión, sustitución o inserción. En la invención, la modificación es una sustitución. En otras realizaciones, la variante de SIRPa tiene una modificación en un aminoácido en dos o más, en tres o más, en cuatro o más, en cinco o más, en seis o más, en siete o más o en ocho posiciones correspondientes a las posiciones 6, 27, 31, 37, 54, 56, 66 o 72 correspondientes a la SEQ ID NO: 6 o a la SEQ ID NO: 8 o a la SEQ ID NO: 190.
En una realización adicional, una variante de SIRPa de la invención tiene una o más de las siguientes sustituciones: V6I, V27I, A27I, I31R, I3IT, Q37W, Q37H, E54P, H56P, S66Q, L66A y M72R. En una realización, la sustitución corresponde a V6I. En otra realización, la sustitución corresponde a V27i o A27I. En otra realización, la sustitución corresponde a I31R. En otra realización, la sustitución corresponde a I31T. En otra realización, la sustitución corresponde a Q37W. En otra realización, la sustitución corresponde a Q37H. En otra realización, la sustitución corresponde a E54P. En otra realización, la sustitución corresponde a H56P. En otra realización, la sustitución corresponde a S66Q o L66Q. En otra realización, la sustitución corresponde a M72R.
Como se desvela en el presente documento, una variante de SIRPa de la invención tiene una modificación en un aminoácido en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 4, 6, 27, 31, 35, 37, 47, 52, 53, 54, 56, 66, 67, 68, 72, 92 o 94 de la SEQ ID NO: 6 o de la SEQ ID NO: 8 o de la SEQ ID NO: 190. La modificación puede ser una supresión, sustitución o inserción. La modificación puede ser una sustitución. La variante de SIRPa puede tener una modificación en un aminoácido en dos o más, en tres o más, en cuatro o más, en cinco o más, en seis o más, en siete o más, en ocho o más, en nueve o más, en diez o más, en once o más, en doce o más, en trece o más, en catorce o más, en quince o más, en dieciséis o más o en diecisiete posiciones correspondientes a las posiciones 4, 6, 27, 31,35, 37, 47, 52, 53, 54, 56, 66, 67, 68, 72, 92 o 94 de la SEQ ID NO: 6 o de la SEQ ID NO: 8 o de la SEQ ID NO: 190.
Como se reivindica o desvela en el presente documento, una variante de SIRPa de la invención tiene una o más de las siguientes sustituciones:
a. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 4 en donde la sustitución es L4V;
b. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 6 seleccionada de V6A, V6C, V6D, V6E, V6G, V6I, V6L, V6M, V6N, V6Q, V6S o V6T;
c. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 27 seleccionada de A27C, A27D, A27G, A27H, A27I, A27K, A27L, A27N, A27Q, A27R, A27S, A27T o A27V; o V27A, V27C, V27D, V27G, V27H, V27I, V27K, V27L, V27N, V27Q, V27R, V27S o V27T;
d. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 31 seleccionada de I31A, I31C, I31E, I31K, I31Q, I31R, I31T o I31V;
e. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 35 seleccionada de P35A, P35C, P35E, P35G, P35N, P35Q o P35S;
f. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 37 seleccionada de Q37A, Q37C, Q37E, Q37G, Q37H, Q37K, Q37L, Q37M, Q37N, Q37R, Q37S, Q37T o Q37W;
g. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 47 seleccionada de E47A, E47C, E47D, E47F, E47G, E47H, E47I, E47K, E47L, E47M, E47N, E47Q, E47R, E47S, E47T, E47V, E47W o E47Y;
h. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 52 seleccionada de Q52A, Q52C, Q52E, Q52H o Q52M;
i. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 53 en donde la sustitución es K53R;
j. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 54 seleccionada de E54D o E54P;
k. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 56 seleccionada de H56A, H56C, H56D, H56E, H56F, H56G, H56I, H56K, H56L, H56M, H56N, H56P, H56Q, H56R, H56S, H56T, H56V, H56W o H56Y;
l. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 66 seleccionada de L66A, L66C, L66D, L66E, L66F, L66G, L66H, L66I, L66K, L66M, L66N, L66P, L66Q, L66S, L66T, L66V, L66W o L66Y; o S66A, S66C, S66D, S66E, S66F, S66G, S66H, S66I, S66K, S66L, S66M, S66N, S66P, S66Q, S66T, S66V, S66W o S66Y; m. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 67 seleccionada de T67A, T67C, T67D, T67E, T67F, T67G, T67H, T67I, T67L, T67M, T67N, T67Q, T67R, T67S, T67V, T67W o T67Y;
n. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 68 en donde la sustitución es K68R
o. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 72 seleccionada de M72A, M72C, M72D, M72E, M72F, M72G, M72H, M72I, M72K, M72L, M72N, M72Q, M72R, M72S, M72T, M72V, M72W o M72Y;
p. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 92 seleccionada de V92A, V92C, V92D, V92E, V92G, V92I, V92M, V92N, V92Q, V92R, V92S o V92T; y/o
q. una sustitución en una posición correspondiente a la posición 94 en la que la sustitución es F94L.
Para determinar la afinidad de una variante de SIRPa para unirse con CD47, se puede utilizar resonancia de plasmón superficial (RPS). En un protocolo ejemplar, se inmoviliza Fc anti IgG humana de cabra purificada (Jackson Immuno Research Laboratories) en el chip CM5 usando química de acoplamiento de amina usando un instrumento Biacore 4000 (GE Healthcare). Los chips CM-5 Biacore, etanolamina, reactivos de acoplamiento de NHS/EDC y tampones se obtienen de Biacore (GE Healthcare). Las etapas de inmovilización se llevan a cabo a un caudal de 30 pl/min en tampón HEPES (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM y tensioactivo P20 al 0,005 %). Las superficies del sensor se activan durante 7 min con una mezcla de NHS (0,05 M) y EDC (0,2 M). El Fc anti-IgG humana de cabra se inyecta a una concentración de ~30 pg/ml en acetato de sodio 10 mM, pH 5,0, durante 7 min. Se inyecta etanolamina (1 M, pH 8,5) durante 7 minutos para bloquear cualquier grupo activado restante. Se inmoviliza un promedio de 12.000 unidades de respuesta (UR) de anticuerpo de captura en cada celda de flujo. Se realizan experimentos de unión cinética usando el mismo tampón de HEPES (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM y tensioactivo P20 al 0,005 %) y se equilibran a 25 0C. Se recogen datos cinéticos inyectando variantes de SIRPa a 0,5 y 1 pg/ml durante dos minutos a un caudal de 30 pl/min, seguido de un lavado de tampón durante 30 s al mismo caudal. El CD47-His humano se une a diferentes concentraciones durante 3 min seguido de una etapa de disociación durante 10 min a un caudal de 30 pl/min. Los datos se ajustan usando un modelo de unión de Langmuir 1:1 con el software de evaluación BIA. Las constantes de velocidad cinética se determinan a partir de los ajustes de las fases de asociación y disociación y la Kd se obtiene de la relación de estas constantes.
En un método alternativo para determinar la avidez de una variante de SIRPa para unión con CD47, se puede usar un ensayo de unión celular. En un protocolo ejemplar, se incuban 2 x 105 células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas con CD47 por pocillo con diversas concentraciones de anticuerpos diluidos en PBS FBS al 1 % en una placa de 96 pocillos durante 60 min en hielo. Después de lavar con PBS FBS al 1 %, las células se incuban con FITC F(ab')2 anti IgG humana de cabra, Fcy (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) diluido 1:200 en PBS FBS al 1 % durante 60 min en hielo. Después de lavar de nuevo, las células se fijan con formaldehído al 1 % en PBS. Las células se analizan por citometría de flujo (MACSQuant, Miltenyi Biotec, Colonia, Alemania). Se calcula una CE50 ajustando los datos a una curva sigmoidea (log(agonista) frente a respuesta -- Pendiente variable (cuatro parámetros)) con Graph Pad Prism.
Cuando estas mutaciones se introducen en SIRPa o una proteína de fusión que comprende SIRPa, la variante resultante generalmente tiene suficiente actividad biológica de SIRPa para ser útil como proteína terapéutica. En algunas realizaciones, la actividad biológica de la variante de SIRPa es al menos 0,01 veces, 0,03 veces, 0,06 veces, 0,1 veces, 0,3 veces, 0,6 veces, 1 vez, 3 veces, 5 veces, 6 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces o 100 veces la actividad biológica de SIRPa de tipo silvestre o una proteína de fusión que contiene SIRPa de tipo silvestre. La actividad biológica de las variantes de SIRPa de la invención se puede probar en un ensayo in vitro o in vivo. Están bien establecidos en la técnica ensayos in vitro para determinar la actividad biológica de SIRPa en una célula que expresa CD47. Por ejemplo, la actividad biológica puede determinarse en un ensayo de transmigración de leucocitos, como se describe en Wutz et al. (J. Mol. Bio., 365:680, 2007).
Restos de inmunoalobulina
Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" significa un anticuerpo intacto (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal intacto). En algunas realizaciones, un "anticuerpo" incluye un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo. Los fragmentos de unión a antígeno incluyen Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, anticuerpos monocatenarios (por ejemplo, scFv), minicuerpos, diacuerpos y anticuerpos de dominio único ("sdAb" o "nanocuerpos" o "camélidos"). En otras realizaciones más, un anticuerpo incluye un anticuerpo intacto o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de presentación en fago incluyendo un anticuerpo completamente humano, un anticuerpo semisintético o un anticuerpo completamente sintético) que se ha optimizado, modificado por ingeniería genética o conjugado químicamente. Son ejemplos de anticuerpos que se han optimizado anticuerpos madurados por afinidad. Son ejemplos de anticuerpos que se han modificado por ingeniería genética anticuerpos optimizados para Fc y anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos). Un anticuerpo conjugado con un resto de toxina es un ejemplo de un anticuerpo conjugado químicamente. En algunas realizaciones, los anticuerpos pueden ser IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE, IgD o IgA.
Como se usa en el presente documento, la expresión "inmunoglobulina" o "molécula de inmunoglobulina" significa un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo como se define en el presente documento, pero también incluye partes de un anticuerpo, tales como una región variable o constante de cadena pesada o cadena ligera. Los ejemplos de partes de una inmunoglobulina incluyen dominios CH1, CH2, CH3, bisagra, VH1, CL y VL, así como una región Fc. Además, la "inmunoglobulina" incluye un fragmento Fc o región que se ha modificado por ingeniería genética para incluir un sitio de unión a antígeno ("Fcab"). Por ejemplo, en una realización, la proteína de fusión de inmunoglobulina de la invención incluye un resto "Fcab" con especificidad de unión por un antígeno tumoral. Los "Fcabs" se analizan en la técnica, por ejemplo, en los documentos W02008/003103 y WO2012/007167. Además, el ejemplo 15 proporciona un ejemplo de una proteína de fusión de inmunoglobulina de la invención donde el resto de inmunoglobulina es un Fcab para HER2. En algunas realizaciones, "inmunoglobulina" incluye anticuerpos modificados genéticamente donde se añaden regiones variables o constantes de cadena pesada o ligera adicionales a un anticuerpo por lo demás intacto o donde las regiones variables o constantes se reubican o reorganizan desde una posición original a una nueva posición dentro de un anticuerpo. Por ejemplo, La fig. 1E muestra una inmunoglobulina que es un anticuerpo biespecífico tetravalente, es decir, un anticuerpo modificado por ingeniería genética para incluir una segunda región variable. Se muestra un ejemplo de reubicación o reordenamiento en la fig.
1I donde la parte de inmunoglobulina es una región Fc fusionada con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo (VH) seguido del dominio constante de cadena pesada 1 (CH1) y una región de bisagra superior (H).
Según la presente invención, el resto de fusión, por ejemplo, SIRPa, puede unirse genéticamente a la inmunoglobulina de manera que no afecte de manera adversa a la unión del anticuerpo con el antígeno tumoral. Preferentemente, el resto de fusión se une al Fc en una configuración que no es óptima para la interacción con FcR, lo que da como resultado actividades disminuidas de ADCC/ADCP en células normales. En algunas realizaciones, la región Fc conserva o tiene capacidad de unión a FcR modificada. Los fragmentos de anticuerpos humanos (por ejemplo, variantes parentales y optimizadas) pueden modificarse por ingeniería genética para contener determinadas regiones constantes (es decir, Fc) con una función efectora especificada (por ejemplo, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC)). Se conocen en la técnica regiones constantes humanas.
También pueden estar presentes fragmentos de anticuerpos que tienen las mismas o similares características de unión a las del anticuerpo completo. Dichos fragmentos pueden contener uno o ambos fragmentos Fab o el fragmento F(ab')2. Los fragmentos de anticuerpos pueden contener las seis CDR del anticuerpo completo, aunque fragmentos que contienen menos que todas estas regiones, tales como tres, cuatro o cinco CDR, también son funcionales.
Según la presente invención, el resto de inmunoglobulina de la proteína de fusión de inmunoglobulina en una realización es un anticuerpo intacto. En otra realización más, el resto de inmunoglobulina es un anticuerpo biespecífico tetravalente. Esta realización se ejemplifica, por ejemplo, en la fig. 1E. En determinadas realizaciones, el resto de SIRPa se fusiona con el extremo C de la cadena pesada, por ejemplo, en la fig. 1B o la fig. 1M, mientras que, en otras realizaciones, el resto de SIRPa se fusiona con el extremo C de la cadena ligera, por ejemplo, en la fig.
1G. El resto de SIRPa puede fusionarse con el resto de inmunoglobulina mediante un conector opcional.
En otra realización adicional más, el resto de inmunoglobulina es un Fc modificado por ingeniería genética para incluir en su extremo C dominios VH y CH1, con la unión de cadena ligera con la región variable de la cadena pesada, por ejemplo, en la fig. 1I. En algunas realizaciones, el resto de SIRPa se fusiona con el extremo N de la parte Fc, opcionalmente, mediante un conector. En otras realizaciones, el resto de SIRPa se fusiona con el extremo C de la cadena ligera o el extremo C de la cadena pesada, opcionalmente, mediante un conector.
En otra realización más, el resto de inmunoglobulina es un Fc unido en su extremo C con un scFv. Esta realización se ejemplifica, por ejemplo, en la fig. 1K. En una realización de este tipo, el resto de SIRPa puede fusionarse con el extremo N de la región Fc, opcionalmente, mediante un conector. En otra realización más, el resto de inmunoglobulina es un scFv unido en su extremo C con una región Fc. Esta realización se ejemplifica, por ejemplo, en la fig. 1M. En una realización de este tipo, el resto de SIRPa puede fusionarse con el extremo C de la región Fc, opcionalmente, mediante un conector.
En una realización adicional, el resto de inmunoglobulina es una región Fc modificada por ingeniería genética para incluir un dominio de unión a antígeno. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la región Fc es una región Fcab que es una región Fc modificada por ingeniería genética, por ejemplo, para incluir un dominio de unión a antígeno en el dominio CH3. Esta realización se ejemplifica, por ejemplo, en la fig. 1O. En algunas realizaciones, el resto de SIRPa puede fusionarse con el extremo N de la región Fc o Fcab, opcionalmente, mediante un conector, mientras que, en otras realizaciones, el resto de SIRPa puede fusionarse con el extremo C, opcionalmente, mediante un conector. En otra realización más, el resto de inmunoglobulina es un Fab. En otra realización más, el resto de inmunoglobulina es un Fab'. En otra realización más, el resto de inmunoglobulina es un F(ab')2. En otra realización más, el resto de inmunoglobulina es un Fv. En otra realización más, el resto de inmunoglobulina es un scFv. En otra realización más, el resto de inmunoglobulina es un minicuerpo. En otra realización más, el resto de inmunoglobulina es un diacuerpo. En una realización adicional más, el resto de inmunoglobulina es un anticuerpo de dominio único (nanocuerpo). Cualquiera de los restos de inmunoglobulina desvelados en el presente documento puede estar unido al agente de unión a CD47 en el extremo N del resto de inmunoglobulina o en el extremo C del resto de inmunoglobulina. En realizaciones donde el resto de inmunoglobulina es un anticuerpo intacto o incluye tanto una cadena pesada (o una parte de una cadena pesada) como una cadena ligera (o una parte de una cadena ligera), el agente de unión a CD47 se une preferentemente al extremo C de la cadena pesada; sin embargo, también se contempla que el agente de unión a CD47 pueda estar unido al extremo C de la cadena ligera o al extremo N de la cadena pesada, o al extremo N de la cadena ligera. En realizaciones donde el resto de inmunoglobulina es un Fc o un Fcab, el agente de unión a CD47 se une preferentemente en el extremo N de la parte Fc, aunque, en algunas realizaciones, el agente de unión a CD47 está unido en el extremo C de la parte Fc. En una realización, el agente de unión a CD47 se fusiona con el extremo N del resto de inmunoglobulina. En otra realización, el agente de unión a CD47 se fusiona con el extremo C del resto de inmunoglobulina.
Los anticuerpos conocidos en la técnica que podrían ser útiles para crear las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención incluyen anticuerpos anti-EGFR tales como cetuximab, panitumumab, nimotuzumab, matuzumab, futuximab, modotuximab, imgatuzumab, necitumumab; anticuerpos anti-CD20 tales como rituximab, ofatumumab, obinutuzumab, ibritumomab tiuxetan, ocaratuzumab, ocrelizumab, tositumomab 1-131, ublituximab, veltuzumab; y anticuerpos anti-HER2 tales como trastuzumab, pertuzumab, margetuximab; y anticuerpos anti-PD-Ll tales como atezolizumab, avelumab y durvalumab. En otra realización, la invención contempla modificaciones en las secuencias conocidas de cadena pesada y/o ligera de los anticuerpos mencionados anteriormente, siempre que esos anticuerpos modificados conserven las regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada y ligera únicas o suficientes de las regiones determinantes de complementariedad para conservar la especificidad de unión por el antígeno del anticuerpo no modificado.
Secuencias conectoras
Las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención pueden incluir una secuencia conectora que une la parte del agente de unión a CD47 de la proteína de fusión con el anticuerpo o la parte de inmunoglobulina de la proteína de fusión. Un conector preferido es un conector Gly4Ser flexible de longitud variable. Por ejemplo, la secuencia conectora es (Gly4Ser)n donde según diversas realizaciones, n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En una realización, n=4. Puede introducirse un conector Gly4Ser flexible de longitud variable para optimizar las funciones de direccionamiento y efectora.
En una realización, el agente de unión a CD47, que en una realización puede ser una SIRPa o una variante de SIRPa, se une a la parte de anticuerpo o inmunoglobulina a través de una secuencia conectora polipeptídica que conecta el extremo N del agente de unión a CD47 con el extremo C del anticuerpo de la parte de inmunoglobulina de la proteína de fusión.
En otra realización, el agente de unión a CD47, que en una realización puede ser una SIRPa o una variante de SIRPa, se une a la parte de anticuerpo o inmunoglobulina a través de una secuencia conectora polipeptídica que conecta el extremo C del agente de unión a CD47 con el extremo N del anticuerpo o la parte de inmunoglobulina de la proteína de fusión.
La invención también contempla que la parte del agente de unión a CD47 de la proteína de fusión y el anticuerpo o la parte de inmunoglobulina de la proteína de fusión es un conector químico.
Antígenos de células tumorales
Las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención están diseñadas para ser específicas para un antígeno de células tumorales además de ser específicas para CD47. Como se ha descrito anteriormente, las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención pueden lograr el resultado deseado de evitar la unión a CD47 en células sanas siendo biespecíficas tanto para CD47 como para un antígeno de células tumorales. En consecuencia, las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención pueden ser específicas para cualquier antígeno tumoral. Los antígenos de células tumorales ejemplares incluyen, pero sin limitación: 4-1BB, 4F2, a-LEWISy, A2aR, AATK, ACKR, ACVR, ADCYAP1 R1, ADIPOR1, ADIPOR2, ADORA1, ADORA2, ADORA3, ADR, AGTR, AHR, ALK, AMHR2, ANGPT1, ANGPT2, ANGPT4, APLNR, APRILR, AR, AVPR1A, AVPR1B, AVPR2, AXL, B7.1, B7.2, B7-DC, B7-H1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7RP1, BAFF, BAFFR, BAI1, BAI2, BDKRB1, BDKRB2, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, BRD8, BRS3, BTLA, C3AR1, C5AR1, C5AR2, CALCR, CASR, CCKAR, CCKBR, CCR1, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCRL1, CCRL2, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD11, CD15, CD18, CD19, CD20, CD22, CD24, CD25, CD27, CD28, CD30, CD33, CD37, CD38, CD3E, CD40, CD40L, CD43, CD44, CD47, CD52, CD54, CD55, CD56, CD66, CD70, CD73, CD74, CD80, CD86, CD97, CD112, CD123, CD133, CD137, CD137L, CD152, CD154, CD155, CD161, CD163, CD166, CD172, CD200, CD200R, CD206, CD244, CD300, CEA, CEACAM3, CELSR, CHRM1, CHRM2, CHRM3, CHRM4, CHRM5, CIITA, CMKLR1, CNR1, CNR2, CNTFR, CRHR1, CRHR2, CRIM1, CRLF1, CRLF2, CRLF3, CSPG4, CSF1R, CSF2R, CSF3R, CTLA4, CX3CR1, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7, CYSLTR1, CYSLTR2, cripto, DARC, DDR1, DDR2, digoxina, DII4, DRD1, DRD2, DRD3, DRD4, DRD5, DTR4, EDA2R, EDAR, ED-B, EDNRA, EDNRB, EGFR, EGFRvIII, ELTD1, EMR1, EMR2, EMR3, EMR4P, ENG, EPCAM, EPHR, episialina, EPOR, ERBB2, ERBB3, ERBB4, ESR1, ESR2, ESRR, F2R, F4/80, FAS, FCER2, FCGR1, FDF, FFAR, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FGFRL1, fibrina, FKBP, FLT1, FLT3, FLT4, FN14, FOLR1, FPR1, FSHR, FZD1, FZD10, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, G-28, GABBR, GAL9, GALR, GCGR, GD2, GD3, GDNFR, GHR, GHRHR, GHSR, GIPR, GITR, GLP1R, GLP2R, GM3, GM-CSFR, GNRHR, GPBAR1, GPER, Gr-1, hapteno, HCAR, HCRTR, HER1, HER2, HER3, HER4, HLA-DR10, HLA-DRB, HLA-G, HPV16, HPVE6, HPVE7, HMGB1, HMW-MAA, HRH, HTR1, HTR2, HTR3, HTR4, HTR5, HTR6, HTR7, HVEM, ICOS, IDO, IFNAR, IFNGR, IFNLR, IGF1R, IGF2R, IL10R, IL11R, IL12R, IL13R, IL15R, IL17R, IL18R1, IL18RAP, IL1R, IL1RL, IL20R, IL21R, IL22R, IL23R, IL27RA, IL28RA, IL2R, IL31RA, IL35R, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL7R, IL9R, ILT2, ILT3, ILT4, ILT5, INSR, INSRR, IRAK, IRP-2, ITGA1, ITGA10, ITGA11, ITGA2, ITGA2B, ITGA3, ITGA4, ITGA5, ITGA6, ITGA7, ITGA8, ITGA9, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAV, ITGAX, ITGB1, ITGB2, ITGB3, ITGB4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, ITGB8, KAR, KIR, KISS1R, KIT, antígeno L6, LAG3, LAIR1, LEPR, Lewis Y, LGR4, LGR5, LGR6, LHCGR, LIFR, LIR, LMTK2, LMTK3, LPAR, LPHN, LTB4R, LTBR, LTK, lisozima, MAGE-1, MAGE-3, MAS1, MAS1L, MC1R, MC2R, MC3R, MC4R, MC5R, MCHR, MERTK, mesotelina, MET, MFG-E8, MIR, MIG, MLNR, MPL, MRGPRD, MRGPRE, MRGPRF, MRGPRG, MRGPRX1, MRGPRX2, MRGPRX3, MRGPRX4, MST1R, MTNR1, MUC1, MUC16, MUSK, NAIP, NCAM1, NGFR, NIP-cap, NKG2A, NKp46, NLRC, NLRP, NLRX1, NMBR, NMUR1, NMUR2, NODI, NOD2, NPBWR1, NPBWR2, NPFFR, NPR1, NPR2, NPR3, NPSR1, NPY1R, NPY2R, NPY4R, NPY5R, NPY6R, NR0B1, NR0B2, NR1D1, NR1D2, NR1H2, NR1H3, NR1H4, NR1H5P, NR1I2, NR1I3, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR2F6, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR4A3, NR5A1, NR5A2, NR6A1, NRP1, NRP2, NTRK, NTSR2, OGFR, OPR, OSMR, OX40, OX40L, OXER1, OXGR1, OXTR, P2RY, PD-1, PDGFR, PD-L1, PGR, PGRMC2, fosfatidilserina, PLAP, PLAUR, PLXN, PPAR, PRLHR, PRLR, PODXL, PROKR, PSCA, PSMA, PTAFR, PTGDR, PTGDS, PTGER, PTGFR, PTGIR, PTH1R, PTH2R, PTPR, QRFPR, RANK, RAR, RELT, RET, ROBO, ROR, ROS1, RXFP, RXR, RYK, S100A8, S100A9, S1PR, SCTR, SERPINB1, Siglec-F, SDC, SLAM7, SMO, SORT1, SPOCK2, SSEA-1, SSTR, ST2, STYK1, SUCNR1, TAAR, TACR, TAG72, TBXA2R, TEK, TGFBR, THR, TIE1, TIGIT, TIM1, TIM2, TIM3, TIM4, TLR1, TLR10, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TNC, TNFRSF11A, TNFRSF11B, TNFRSF13B, TNFRSF14, TNFRSF17, TNFRSF19, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF21, TNFRSF25, TNFRSF6B, TPRA1, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4, TRHR, TSHR, TUBB3, TWEAKR, TYRO3, UTS2R, VCAM1, VDR, VEGFR, VEGFR2, VIPR1, VIPR2, VISTA y XCR1.
Son conocidos en la técnica métodos para preparar anticuerpos contra un antígeno de células tumorales e incluyen métodos basados en hibridoma, métodos basados en presentación en fagos y presentación en levadura.
Además, es posible crear nuevos anticuerpos contra cualquier antígeno de células tumorales según métodos conocidos y usar los anticuerpos generados de este modo para crear proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención.
Propiedades de las proteínas de fusión de inmunoalobulina
Como se describe en el presente documento, es deseable que las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención, aunque tienen la capacidad de unirse con CD47 en células productoras de enfermedad, tales como células tumorales, no se unen, o al menos se unen a niveles aceptablemente bajos, con CD47 en células normales y, en particular, glóbulos rojos (eritrocitos), de modo que cualquier nivel de unión a CD47 por la proteína de fusión de inmunoglobulina permanezca a niveles aceptables para el uso terapéutico de la proteína de fusión.
En consecuencia, la invención contempla que las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención pueden caracterizarse por su unión relativa con glóbulos rojos (eritrocitos) en comparación con la unión de un control con glóbulos rojos. Un ejemplo de prueba de la unión relativa de proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención con eritrocitos se proporciona en el ejemplo 17 posterior.
Por ejemplo, usando una técnica tal como la citometría de flujo para identificar la intensidad de fluorescencia media (IFM) del % de unión de glóbulos rojos con un anticuerpo de CD47 como control y establecer ese valor en 100 %, se puede medir el % relativo de IFM de unión a glóbulos rojos de la proteína de fusión. En una realización, la proteína de fusión de inmunoglobulina de la invención tiene menos del 35 %, menos del 30 %, menos del 25 %, menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 %, menos del 9 %, menos del 8 %, menos del 7 %, menos del 6 %, menos del 5 %, menos del 4 %, menos del 3 %, menos del 2 % o menos del 1 % de IFM de unión a glóbulos rojos en comparación con el anticuerpo de control que tiene su IFM de RBC calibrado al 100 %. En otras realizaciones, el % de IFM de RBC de la proteína de fusión de inmunoglobulina de la invención está entre 0-1 %, 0-2 %, 0-3 %, 0-4 %, 0-5 %, 0-6 %, 0-7 %, 0-8 %, 0-9 %, 0-10 %, 0-15 %, 0-20 %, 0-25 %, 0-30 %, 0-35 %, 1 -2 %, 1 -3 %, 1 -4 %, 1 -5 %, 1 -6 %, 1 -7 %, 1 -8 %, 1 -9 %, 1-10 %, 1-15 %, 1 -20 %, 1 -25 %, 1 -30 %, 1 -35 %, 2-3 %, 2-4 %, 2-5 %, 2-6 %, 2-7 %, 2­ 8 %, 2-9 %, 2-10 %, 3-4 %, 3-5 %, 3-6 %, 3-7 %, 3-8 %, 3-9 %, 3-10 %, 4-5 %, 4-6 %, 4-7 %, 4-8 %, 4-9 %, 4-10 %, 5-6 %, 5-7 %, 5-8 %, 5-9 %, 5-10 %, 5-15 %, 5-20 %, 5-25 %, 5-30 %, 5-35 %, 6-7 %, 6-8 %, 6-9 %, 6-10 %, 7-8 %, 7-9 %, 7-10 %, 8-9 %, 8-10 %, 9-10 %,10-15 %, 10-20 %, 10-25 %, 10-30 % o 10-35 %, cuando el % de IFM de RBC del anticuerpo anti-CD47 se calibra al 100 %. En otra realización más, el % de IFM de RBC de la proteína de fusión de inmunoglobulina de la invención es 35 % o menos, 30 % o menos, 25 % o menos, 20 % o menos, 15 % o menos, 10 % o menos, 9 % o menos, 8 % o menos, 7 % o menos, 6 % o menos, 5 % o menos, 4 % o menos, 3 % o menos, 2 % o menos o 1 % o menos, cuando el % de IFM de RBC del anticuerpo anti-CD47 se calibra al 100 %. En una realización, el anticuerpo anti-CD47 usado como control es B6H12/huIgG1 cuyas secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada se encuentran en la tabla 4 como la SEQ ID NO: 146 (cadena ligera) y la SEQ ID NO: 148 (cadena pesada). La proteína de fusión también se une a CD47 en una célula distinta de glóbulo rojo. La célula distinta de glóbulo rojo, en una realización, es una célula tumoral.
La invención también contempla métodos para identificar proteínas de fusión de la invención basándose en sus perfiles de hemaglutinación. Un ejemplo de prueba para hemaglutinación de proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención con eritrocitos se proporciona en el ejemplo 18 posterior.
Uso de proteínas de fusión
Las proteínas de fusión desveladas en el presente documento se pueden usar para tratar diversas formas de cáncer. Una lista no limitante de cánceres para cuyo tratamiento se pueden usar las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención incluye cáncer suprarrenal, cáncer de ano, cáncer de conductos biliares, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, cerebro/SNC, cáncer de piel de células basales, cáncer de mama, cáncer de primario desconocido, enfermedad de Castleman, cáncer de cuello uterino, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, dermatofibrosarcoma protuberante, familia de tumores de Ewing, cáncer ocular, cáncer de vesícula biliar, tumores carcinoides gastrointestinales, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), cáncer gástrico, enfermedad trofoblástica gestacional, glioma, glioblastoma, cáncer de cabeza y cuello, enfermedad de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de laringe e hipofaringe, leucemia, leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mieloide crónica, leucemia mielomonocítica crónica (LMMC), cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, tumor carcinoide de pulmón, cáncer de hígado, linfoma, linfoma de la piel, mesotelioma maligno, carcinoma de células de Merkel, melanoma, mieloma múltiple, mieloma, síndrome mielodisplásico, cáncer de la cavidad paranasal y del seno paranasal, cáncer nasofaríngeo, cáncer neuroendocrino, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de cavidad oral y orofaringe, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de pene, tumores de la hipófisis, cáncer de próstata, cáncer renal, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándula salival, sarcoma, sarcoma - cáncer de tejidos blandos en adultos, cáncer de piel de células escamosas, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer de testículo, cáncer de timo, cáncer de tiroides, cáncer de útero, sarcoma uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom y tumor de Wilms.
Las células cancerosas se exponen a una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fusión para inhibir la proliferación de las células cancerosas. En algunas realizaciones, las proteínas de fusión inhiben la proliferación de células cancerosas en al menos 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión se usa en terapia. Por ejemplo, la proteína de fusión se puede usar para inhibir el crecimiento tumoral en un mamífero (por ejemplo, un paciente humano). En algunas realizaciones, el uso de la proteína de fusión para inhibir el crecimiento tumoral en un mamífero incluye administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fusión. En otras realizaciones, la proteína de fusión se puede usar para inhibir la proliferación de una célula tumoral.
Como se usa en el presente documento, "tratar", "que trata", y "tratamiento" significan el tratamiento de una enfermedad en un mamífero, por ejemplo, en un ser humano. Esto incluye: (a) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; y (b) aliviar la enfermedad, es decir, provocar regresión de la patología.
En general, una cantidad terapéuticamente eficaz de componente activo está en el intervalo de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg, por ejemplo, 1 mg/kg a 100 mg/kg, por ejemplo, 1 mg/kg a 10 mg/kg. La cantidad administrada dependerá de variables tales como el tipo y el alcance de la enfermedad o la indicación para tratar, la salud general del paciente, la potencia in vivo del anticuerpo, la formulación farmacéutica y la vía de administración. La dosis inicial se puede aumentar más allá del nivel superior para alcanzar rápidamente el nivel deseado en sangre o tejido. Como alternativa, la dosis inicial puede ser menor que la óptima y la dosis puede aumentarse progresivamente durante el transcurso del tratamiento. La dosis óptima se puede determinar mediante experimentación rutinaria. Para administración parenteral, se administra una dosis entre 0,1 mg/kg y 100 mg/kg, como alternativa entre 0,5 mg/kg y 50 mg/kg, como alternativa entre 1 mg/kg y 25 mg/kg, como alternativa entre 2 mg/kg y 10 mg/kg, como alternativa entre 5 mg/kg y 10 mg/kg y se puede proporcionar, por ejemplo, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez al mes por cada ciclo de tratamiento.
Para uso terapéutico, una proteína de fusión de la invención se combina preferentemente con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa tampones, vehículos y excipientes adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable. El vehículo o vehículos debe(n) ser "aceptable(s)" en el sentido de ser compatible(s) con los ingredientes de las formulaciones y no ser perjudicial(es) para el receptor. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen tampones, disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares, que son compatibles con la administración farmacéutica. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica.
Las composiciones farmacéuticas que contienen proteínas de fusión, tales como las desveladas en el presente documento, pueden presentarse en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse por cualquier método adecuado. Una composición farmacéutica debería formularse para que sea compatible con su vía de administración prevista. Son ejemplos de vías de administración la administración intravenosa (IV), intradérmica, por inhalación, transdérmica, tópica, transmucosa y rectal. Las composiciones farmacéuticas están destinadas a administración parenteral, intranasal, tópica, oral o local, tal como por un medio transdérmico, para tratamiento terapéutico. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por vía parenteral (por ejemplo, mediante inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea) o por ingestión oral, o por aplicación tópica o inyección intraarticular en áreas afectadas por la afección vascular o cancerosa. Las vías adicionales de administración incluyen administración intravascular, intraarterial, intratumoral, intraperitoneal, intraventricular, intraepidural, así como nasal, oftálmica, intraescleral, intraorbital, rectal, tópica o por inhalación de aerosol.
La invención proporciona composiciones para administración parenteral que comprenden los agentes mencionados anteriormente disueltos o suspendidos en un vehículo aceptable, preferentemente un vehículo acuoso, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina, PBS y similares. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según sea necesario para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste de pH y tamponantes, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes, detergentes y similares. La invención también proporciona composiciones para administración oral, que pueden contener ingredientes inertes tales como aglutinantes o cargas para la formulación de un comprimido, una cápsula y similares. Asimismo, la presente invención proporciona composiciones para administración local, que pueden contener ingredientes inertes tales como disolventes o emulsionantes para la formulación de una crema, una pomada y similares.
Una vía de administración preferida para proteínas de fusión es la infusión intravenosa. Se pueden preparar formulaciones útiles por métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Por ejemplo, véase Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a ed. (Mack Publishing Company, 1990). Los componentes de formulación adecuados para la administración parenteral incluyen un diluyente estéril, tal como agua para inyección, solución salina, aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metil parabeno; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como EDTA; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa.
Para administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). El vehículo debería ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debería conservarse frente a microorganismos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos.
Las formulaciones farmacéuticas son preferentemente estériles. La esterilización se puede realizar, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición está liofilizada, la esterilización por filtración puede realizarse antes o después de la liofilización y reconstitución. Las soluciones acuosas pueden empaquetarse para su uso tal cual o liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con un vehículo acuoso estéril antes de la administración. El pH de las preparaciones estará normalmente entre 3 y 11, más preferentemente entre 5 y 9 o entre 6 y 8 y lo más preferentemente entre 7 y 8, tal como de 7 a 7,5. Las composiciones resultantes en forma sólida pueden empaquetarse en múltiples unidades de dosis única, conteniendo cada una una cantidad fija del agente o agentes mencionados anteriormente, tal como en un paquete sellado de comprimidos o cápsulas.
Producción de proteínas de fusión
Las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención se producen en general de manera recombinante, usando células de mamífero que contienen un ácido nucleico o ácidos nucleicos modificados por ingeniería genética para expresar la proteína de fusión. Si una proteína de fusión de inmunoglobulina de la invención requiere que se expresen dos o más cadenas polipeptídicas para el ensamblaje de la proteína de fusión, entonces, la invención contempla que los ácidos nucleicos que codifican cada una de las cadenas polipeptídicas estén contenidos dentro de una célula o células para facilitar la producción recombinante de la proteína de fusión de inmunoglobulina. Por ejemplo, en una realización, un ácido nucleico codifica una cadena pesada o parte de la misma de una proteína de fusión de inmunoglobulina de la invención, mientras que otro ácido nucleico codifica una cadena ligera o parte de la misma de una proteína de fusión de inmunoglobulina de la invención. El ácido nucleico que codifica la cadena pesada o parte de la misma o el ácido nucleico que codifica la cadena ligera o parte de la misma también incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica el resto de unión a CD47, por ejemplo, un resto de SIRPa, como se describe en el presente documento. En una realización adicional, una célula contiene un ácido nucleico codifica una cadena pesada o parte de la misma de una proteína de fusión de inmunoglobulina de la invención y contiene un ácido nucleico que codifica una cadena ligera o parte de la misma de una proteína de fusión de inmunoglobulina de la invención. El ácido nucleico que codifica la cadena pesada o parte de la misma o el ácido nucleico que codifica la cadena ligera o parte de la misma de una proteína de fusión de inmunoglobulina de la invención también contiene un ácido nucleico que codifica un resto de unión a CD47, tal como un resto de SIRPa como se describe en el presente documento.
Aunque se describen métodos ejemplares de expresión y producción de proteínas de fusión en, por ejemplo, los ejemplos 2 y 4 posteriores, se han usado una amplia diversidad de vectores, líneas celulares y métodos de producción de proteínas adecuados para producir productos biofarmacéuticos y podrían usarse en la síntesis de las proteínas de fusión de la invención. Dichos métodos están dentro del conocimiento del experto en la materia.
Ejemplos
Ejemplo 1: Efecto de B6H12 anti-CD47 sobre los glóbulos rojos en monos cynomolgus
Se evaluó el efecto in vivo del anticuerpo monoclonal anti-CD47 B6H12 (quimérico B6H12-IgG4 humano (Lindberg et al, JBC 269: 1567, 1994)) sobre los glóbulos rojos (RBC) en monos cynomolgus. Un grupo de 3 monos recibió una dosis intravenosa única de B6H12 cada uno a 12 mg/kg el día 0. Se extrajeron muestras de sangre a -10 (diez días antes de la inyección para obtener el nivel basal), 0, 1, 3, 5 y 7 días después de la dosis intravenosa única para el recuento de RBC y la determinación del hematocrito (HCT). Las figs. 2A-B muestran que hubo una fuerte reducción de glóbulos rojos de 5,8x109 a 3,7x109 RBC/ml, es decir, una reducción del 40 %, para el día 5 (fig. 2A), junto con una reducción correspondiente en el nivel del hematocrito (fig. 2B). Por lo tanto, el tratamiento con anticuerpos anti-CD47 puede provocar anemia grave.
Ejemplo 2: Proteína de fusión de inmunoglobulina anti-CD20-huIgG1-SIRPa
2(A) Construcción y expresión de anti-CD20-huIgG1-SIRPa.
La generación de un anti-CD20-huIgG1-SIRPa ilustrativo se basa en el anticuerpo monoclonal anti-CD20 2B8 (rituximab) (Reff et al, Blood 83: 435, 1994) y la proteína SIRPa (Jiang et al, JBC 274: 559, 1999). La secuencia de ADN y proteína de la cadena ligera de Fab para 2B8 se proporciona en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, respectivamente. La secuencia de ADN y proteína de la cadena pesada de Fab para 2B8 se proporciona en la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4, respectivamente. La secuencia de ADN y proteína del alelo de SIRPa V1 se proporciona en la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6, respectivamente. La secuencia de ADN y proteína del dominio IgV del alelo de SIRPa V2 se proporciona en la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8, respectivamente. Se generó Anti-CD20-huIgG1-SIRPaV2 uniendo el extremo C del polipéptido de cadena pesada anti-CD20 al dominio IgV de SIRPaV2 a través de un conector (G4S)4.
Para la expresión de anti-CD20-huIgG1-SIRPaV2, las siguientes dos construcciones génicas se ensamblaron mediante técnicas convencionales de ADN recombinante y se clonaron en el vector de expresión de mamífero pTT5 (que contiene la secuencia de péptido señal de cadena ligera de ratón para secreción) como en la Fig. 1A: (1) Construcción VH(anti-CD20)-CH1-H-CH2-CH3-(G4S)4-SIRPaV2 (SEQ iD NO: 11) que codifica los siguientes elementos: dominio variable de cadena pesada anti-CD20 seguido de dominios constantes de cadena pesada humana 1-3 isotipo IgG1 seguido de un conector (G4S)4 y SIRPaV2 y (2) Construcción VL(anti-CD20)-CL (SEQ ID NO: 1) que codifica el dominio variable de cadena ligera anti-CD20 seguido del dominio constante de cadena ligera kappa humana. Las secuencias de aminoácidos correspondientes para estas dos construcciones ilustrativas se muestran en la SEQ ID NO: 12 y la SEQ ID NO: 2, respectivamente.
El conjunto de dos vectores para la expresión de anti-CD20-huIgG1-SIRPaV2 se cotransfectó transitoriamente en células Expi293 usando Expi293fectin (Life Technologies, Grand Island, NY). La proteína se purificó en una sola etapa mediante cromatografía de afinidad de proteína A. La expresión de los dos polipéptidos y el ensamblaje de la molécula tetramérica completa se confirmaron en SDS-PAGE y SEC. Para SDS-PAGe , las muestras de proteínas purificadas se redujeron con DTT y se procesaron en Gel NuPAGE MES 4-12 %, 200 V durante 35 min, seguido de tinción de Coomassie. Las dos bandas principales en el gel tenían el PM esperado y la relación estequiométrica correcta con >95 % de pureza (fig. 3A). En la fig. 3A, el carril 1 muestra el marcador de peso molecular (PM) y el carril 2 muestra el PM esperado (63, 23 kDa) y la relación estequiométrica correcta (1:1) de los dos polipéptidos de anti-CD20-huIgG1-SIRPaV2. Para la SEC, las muestras de proteínas purificadas se analizaron en una columna TSK-GEL Super SW3000 SEC de 4,6 x 300 mm (Tosoh Biosciences, Tokio, Japón) que se equilibró con fosfato de sodio 50 mM, perclorato de sodio 400 mM, pH 6,3 0,1 y 38 2,0 mS/cm2. La cromatografía de exclusión por tamaño mostró un máximo en el PM esperado de aproximadamente 172 kDa para el anti-CD20-huIgGI-SIRPaV2 monomérico (fig. 3B).
Además, se generaron anti-CD20 y anti-CD47 en un formato de anticuerpo monoclonal convencional (huIgG1 anti-CD20 y huIgG1 anti-CD47) y SIRPa en un formato de proteína de fusión Fc (SIRPaV2-Fc y Fc-SIRPaV2) (fig. 1C) como controles para comparar con el formato de anti-CD20-huIgG1-SIRPa.
2(B)(i) Unión de anti-CD20-huIgG1-SIRPa con CD47 expresado en células
Se midió la capacidad de anti-CD20-huIgG1-SIRPaV2 para unirse con CD47 sobreexpresado en la superficie celular y se comparó con las moléculas de control. Se incubaron 2 x 105 células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas con CD47 por pocillo con diversas concentraciones de proteínas diluidas en PBS FBS al 1 % en una placa de 96 pocillos durante 60 min en hielo. Después de lavar con PBS FBS al 1 %, las células se incubaron con FITC F(ab')2 anti IgG humana de cabra, Fcy (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) diluido 1:200 en PBS FBS al 1 % durante 60 min en hielo. Después de lavar de nuevo, las células se fijaron con formaldehído al 1 % en PBS. Las células se analizaron por citometría de flujo (MACSQuant, Miltenyi Biotec, Colonia, Alemania).
Los resultados muestran que anti-CD20-huIgG1-SIRPaV2, anti-CD47, Sirpav2-Fc y Fc-Sirpav2 se unieron a CD47 expresado en células CHO transfectadas con CD47, pero anti-CD20 no se unió porque CD20 no se expresa (fig.
4A). Fc-Sirpav2 y anti-CD47 se unieron con CE50 similares (7-8 nM), pero Sirpav2-Fc se unió mejor (CE50 = 3 nM). Sin embargo, la mediana de fluorescencia fue mayor para anti-CD47, seguido de SIRPaV2-Fc y menor para Fc-Sirpav2 y anti-CD20-huIgG1 -SIRPaV2.
Se midió la capacidad de anti-CD20-huIgGI-SIRPaV2 para unirse con CD47 expresado en la superficie celular de células sanguíneas y se comparó con las moléculas de control. Se enriqueció sangre completa nueva de donantes humanos sanos en leucocitos con precipitación de dextrano y se lavó con PBS FBS al 1 %. Se incubaron 2 x 105 células de sangre completa humana enriquecida en leucocitos por pocillo con proteínas 50 pg/ml diluidas en PBS FBS al 1 % en una placa de 96 pocillos durante 60 min en hielo. Después de lavar con PBS FBS al 1 %, las células se incubaron con una dilución 1:200 de FITC F(ab')2 de cabra anti-IgG humana, Fey (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), una dilución 1:100 de PE de ratón anti-CD235a humano (BD Biosciences, San José, CA) y una dilución 1:100 de eFluor 450 de ratón anti-CD45 humano (eBioscience, San Diego, CA) en PBS FBS al 1 % durante 60 min en hielo para la detección de proteínas y la clasificación celular por citometría de flujo. Después de lavar de nuevo, las células se fijaron con formaldehído al 1 % en PBS. Las células se analizaron por citometría de flujo (MACSQuant, Miltenyi Biotec, Colonia, Alemania).
Los resultados muestran que anti-CD47 se unió a CD47 expresado en eritrocitos y leucocitos, pero anti-CD20-huIgG1-SIRPaV2, SIRPaV2-Fc y Fc-Sirpav2 solo se unieron a CD47 expresado en leucocitos y no a CD47 expresado en eritrocitos (fig. 4B).
2(B)(ii) Demostración de avidez de anti-CD20-huIgG1-SIRPa mediante la unión de ambos antígenos expresados en células
La unión de anti-CD20-huIgG1-SIRPaV2 con CD20 y CD47 en la superficie celular se midió en células de linfoma de linfocitos B Ramos humano que sobreexpresan CD20 y expresan CD47 y células de linfoma de linfocitos B Namalwa humano que sobreexpresan CD47 y expresan CD20. Se incubaron 2 x 105 células Raji o Namalwa por pocillo con diversas concentraciones de proteínas diluidas en PBS FBS 1 % en una placa de 96 pocillos durante 60 min en hielo. Después de lavar con PBS FBS al 1 %, las células se incubaron con FITC F(ab')2 anti IgG humana de cabra, Fcy (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) diluido 1:200 en PBS FBS al 1 % durante 60 min en hielo. Después de lavar de nuevo, las células se analizaron por citometría de flujo (MACSQuant, Miltenyi Biotec, Colonia, Alemania).
Los resultados muestran que la unión de anti-CD20-huIgG1-SIRPaV2 con células Raji y Namalwa fue algo mejorada en comparación con moléculas de control (figs. 4C-D), lo que sugiere un efecto de avidez. Debido a que el marcaje de fluoróforo anuló la unión de SIRPa con CD47, la unión se ensayó mediante detección anti-Fc. Sin embargo, se ha descubierto previamente que la unión de anti-Fc con una región Fc que tiene un resto de proteína adicional unido con su extremo C se reduce en comparación con la misma región Fc sin un resto adicional en un ensayo de unión celular (datos no mostrados), lo que sugiere, sin desear quedar ligados a la teoría, que la unión de anti-Fc con la proteína de fusión de Fc puede estar estéricamente impedida en ese contexto. Por tanto, la observación de unión similar de anti-CD20-huIgG1-SIRPaV2 y anti-CD20 con anti-Fc probablemente subestima la cantidad de unión a células de anti-CD20-huIgG1-SIRPaV2 y de hecho sugiere un efecto de avidez para la unión de anti-CD20-huIgG1-SIRPaV2 a las células. La capacidad de anti-CD20-huIgG1-SIRPaV2 para aprovechar la avidez de unión con las células tumorales al unirse a dos dianas tumorales en la misma célula puede dar como resultado direccionamiento más específico y menos efectos secundarios in vivo.
Ejemplo 3: Anticuerpo biespecífico anti-CD20/anti-CD47
3(A) Descripción de anti-CD20/anti-CD47
La generación de un anticuerpo biespecífico tetravalente ejemplar (TetBiAb) contra CD20 y CD47 se basa en el anticuerpo monoclonal anti-CD20 2B8 (rituximab) (Reff et al, Blood 83: 435, 1994) y el anticuerpo monoclonal anti-CD47 B6H12 (Lindberg et al, JBC 269: 1567, 1994). En el TetBiAb anti-CD20/anti-CD47 contra CD20 y CD47, el extremo C del polipéptido de cadena pesada anti-CD20 está unido al extremo N de la cadena ligera de Fab anti-CD47 a través de un conector G4S (fig. 1D+E). Las propiedades de construcción, expresión y unión de anti-CD20/anti-CD47 se describen en la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO2014/144357.
3(B) Actividades biológicas in vivo de anti-CD20/anti-CD47
La utilidad de anti-CD20/anti-CD47, como sustituto de anti-CD20-huIgG1-SIRPa, fue demostrada por los siguientes experimentos in vivo. En modelos de linfoma diseminado, se inyectaron en ratones SCID i.v. 5 x 106 células de linfoma Daudi humano CD20+ o con 1 x 106 células de linfoma Raji humano CD20+, seguido de inyección i.p. de 25 pg/ratón de un control de isotipo de anticuerpo, 25 pg/ratón de anti-CD20, 25 pg/ratón de anti-CD47 o 42 pg/ratón de anti-CD20/anti-CD47, que es la cantidad equimolar de anticuerpo biespecífico tetravalente. Todos los grupos (n=10-11) recibieron tratamiento dos veces por semana durante 3 semanas y los resultados se indicaron como salud general, por ejemplo, parálisis, que precede a la muerte en 10-14 días, y supervivencia de los ratones. Se descubrió que el tratamiento con anticuerpo biespecífico tetravalente anti-CD20/anti-CD47 era superior a las dos monoterapias en los modelos tumorales tanto Daudi (fig. 5A) como Raji (fig. 5B). Se esperan resultados similares para un anti-CD20-huIgG1-SIRPa.
Ejemplo 4: Proteína de fusión de inmunoglobulina con anti-EGFR-huIsG1-SIRPa
4(A) Construcción y expresión de anti-EGFR-huIgG1-SIRPa
La generación de un anti-EGFR-huIgG1-SIRPa ilustrativo se basa en el anticuerpo monoclonal anti-EGFR C225 (cetuximab) (Kawamoto, PNAS 80: 1337, 1983) y la proteína SIRPa (Jiang et al, JBC 274: 559, 1999). La secuencia de ADN y proteína de la cadena ligera de Fab para C225 se proporciona en la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14, respectivamente. La secuencia de ADN y proteína de la cadena pesada de Fab para C225 se proporciona en la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 16, respectivamente. La secuencia de ADN y proteína del alelo de SIRPa V1 se proporciona en la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6, respectivamente. La secuencia de ADN y proteína del dominio IgV del alelo de SIRPa V2 se proporciona en la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8, respectivamente. Se generó un anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV1 uniendo el extremo C del polipéptido de cadena pesada anti-EGFR al dominio IgV de SIRPaV1 a través de un conector (G4S)4. Se generó un anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 ilustrativo uniendo el extremo C del polipéptido de cadena pesada anti-EGFR al dominio IgV de SIRPaV2 a través de un conector (G4S)3, (G4S)4 o (G4S)5.
Para la expresión del anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV1, las siguientes dos construcciones génicas se ensamblaron mediante técnicas convencionales de ADN recombinante y se clonan en el vector de expresión de mamífero pTT5 (que contiene la secuencia de péptido señal de cadena ligera de ratón para secreción) como en la fig. 1A: (1) Construcción VH(anti-EGFR)-CH1-H-CH2-CH3-(G4S)4-SIRPaV1 (SEQ ID NO: 17) que codifica los siguientes elementos: dominio variable de cadena pesada anti-EGFR seguido de dominios constantes de cadena pesada humana 1-3 isotipo IgG1 seguido de un conector (G4S)4 y el dominio IgV de SIRPaV1 y (2) Construcción VL(anti-EGFR)-CL (SEQ ID NO: 13) que codifica el dominio variable de cadena ligera anti-EGFR seguido del dominio constante de cadena ligera kappa humana. Las secuencias de aminoácidos correspondientes para estas dos construcciones se muestran en la SEQ ID NO: 18 y la SEQ ID NO: 14, respectivamente.
Para la expresión del anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 con diversas longitudes de conectores, las siguientes cuatro construcciones génicas se ensamblaron mediante técnicas convencionales de ADN recombinante y se clonaron en el vector de expresión de mamífero pTT5 (que contiene la secuencia de péptido señal de cadena ligera de ratón para secreción) como en la fig. 1A: (1) Construcción VH(anti-EGFR)-CH1-H-CH2-CH3-(G4S)3-Sirpav2 (SEQ ID NO: 69), que codifica los siguientes elementos: dominio variable de cadena pesada anti-EGFR seguido de dominios constantes de cadena pesada humana 1-3 isotipo IgG1 seguido de un conector (G4S)3 y el dominio IgV de SIRPaV2, (2) Construcción VH(anti-EGFR)-CH1-H-CH2-CH3-(G4S)4-SIRPaV2 (SEQ ID NO: 19), que codifica los siguientes elementos: dominio variable de cadena pesada anti-EGFR seguido de dominios constantes de cadena pesada humana 1-3 isotipo IgG1 seguido de un conector (G4S)4 y el dominio IgV de Sirpav2, (3) Construcción VH(anti-EGFR)-CH1-H-CH2-CH3-(G4S)5-SIRPaV2 (SEQ ID NO: 71), que codifica los siguientes elementos: dominio variable de cadena pesada anti-EGFR seguido de dominios constantes de cadena pesada humana 1-3 isotipo IgG1 seguido de un conector (G4S)5 y el dominio IgV de Sirpav2 y (4) Construcción VL(anti-EGFR)-CL (SEQ ID NO: 13), que codifica los siguientes elementos: dominio variable de cadena ligera anti-EGFR seguido de dominio constante de cadena ligera kappa humana. Las secuencias de aminoácidos correspondientes para estas cuatro construcciones se muestran en las SEQ ID NO: 70, 20, 72 y la SEQ ID NO: 14, respectivamente.
Cada conjunto de dos vectores para la expresión de anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 se cotransfectó transitoriamente en células Expi293 usando Expi293fectin (Life Technologies, Grand Island, NY). Las proteínas se purificaron en una sola etapa mediante cromatografía de afinidad de proteína A. La expresión de los dos polipéptidos y el ensamblaje de las moléculas tetraméricas completas se confirmaron en electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodiopoliacrilamida (SDS-PAGE) y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Para SDS-PAGE, las muestras de proteínas purificadas se redujeron con DTT y se procesaron en Gel NuPAGE MES 4-12 %, 200 V durante 35 min, seguido de tinción de Coomassie. Las dos bandas principales en el gel tenían los pesos moleculares (PM) esperados y la relación estequiométrica correcta con > 95 % de pureza (fig. 6A). En la fig. 6A, el carril 1 muestra el marcador de peso molecular (PM), el carril 2 muestra el PM esperado (64, 23 kDa) y la relación estequiométrica correcta (1:1) de los dos polipéptidos de anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV1, el carril 3 muestra el PM esperado (64, 23 kDa) y la relación estequiométrica correcta (1:1) de los dos polipéptidos de anti-EGFR-huIgG1-(G4S)3-SIRPaV2, el carril 4 muestra el PM esperado (64, 23 kDa) y la relación estequiométrica correcta (1:1) de los dos polipéptidos de anti-EGFR-huIgG1-(G4S)4-SIRPaV2 y el carril 5 muestra el PM esperado (64, 23 kDa) y la relación estequiométrica correcta (1:1) de los dos polipéptidos de anti-EGFR-huIgG1-(G4S)5-SIRPaV2. Para la SEC, las muestras de proteínas purificadas se analizaron en una columna TSK-GEL Super SW3000 SEC de 4,6_300 mm (Tosoh Biosciences, Tokio, Japón) que se equilibró con fosfato de sodio 50 mM, perclorato de sodio 400 mM, pH 6,3 0,1 y 38 2,0 mS/cm2. La cromatografía de exclusión por tamaño mostró un máximo en el PM esperado de aproximadamente 173 kDa para cada una de las proteínas monoméricas anti-EGFR-huIgG1-SIRPa (fig. 6B(i) - (iv)). Además, anti-EGFR y anti-CD47 en un formato de anticuerpo monoclonal convencional (huIgG1 anti-EGFR y huIgG1 anti-CD47) y SIRPa en un formato de proteína de fusión Fc (Sirpav2-Fc, Fc-Sirpav2 y Fc-SIRPaV2CC) (fig.
1C) se generaron como controles para comparar con el formato anti-EGFR-huIgG1-SIRPa. Fc-SIRPaV2CC es una proteína de fusión Fc en la que el resto ECD de SIRPa tiene el dominio IgV del alelo V2 conectado con los dominios IgC del alelo V1 (SEQ ID NO: 192).
4(B)(i) Unión de anti-EGFR-huIgG1-SIRPa con CD47 expresado en células
Se midió la capacidad del anti-EGFR-huIgG1-SIRPa ilustrativo para unirse con CD47 sobreexpresado en la superficie celular y se comparó con las moléculas de control. Se incubaron 2 x 105 células CHO transfectadas con CD47 por pocillo con diversas concentraciones de anticuerpos diluidos en PBS FBS al 1 % en una placa de 96 pocillos durante 60 min en hielo. Después de lavar con PBS FBS al 1 %, las células se incubaron con FITC F(ab')2 anti IgG humana de cabra, Fcy (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) diluido 1:200 en PBS FBS al 1 % durante 60 min en hielo. Después de lavar de nuevo, las células se fijaron con formaldehído al 1 % en PBS. Las células se analizaron por citometría de flujo (MACSQuant, Miltenyi Biotec, Colonia, Alemania).
Los resultados muestran que las proteínas anti-EGFR-huIgG1-SIRPa, anti-CD47, SIRPa-FcV2 y Fc-Sirpav2 se unieron con CD47 expresado en células CHO transfectadas con CD47, pero anti-EGFR no se unió porque EGFR no se expresa (fig. 7A). Anti-EGFR-huIgG1-huSIRPaV2 se unió a CD47 expresado en células CHO mejor que anti-EGFR-huIgG1-huSIRPaV1. La longitud del conector entre Fc y SIRPa no cambió la afinidad de SIRPa por CD47 expresado en células. También se descubrió que SIRPa-FcV2 se unió con CD47 expresado en células CHO transfectadas con CD47 mejor que Fc-Sirpav2, que se unía mejor que Fc-SIRPaV2CC (datos no mostrados).
Se midió la capacidad del anti-EGFR-huIgG1-SIRPa ilustrativo para unirse con CD47 expresado en la superficie celular de las células sanguíneas y se comparó con las moléculas de control. Se enriqueció sangre completa nueva de donantes humanos sanos en leucocitos con precipitación de dextrano y se lavó con PBS FBS al 1 %. Se incubaron 2 x 105 células de sangre completa humana enriquecida en leucocitos por pocillo con proteínas 50 pg/ml diluidas en PBS FBS al 1 % en una placa de 96 pocillos durante 60 min en hielo. Después de lavar con PBS FBS al 1 %, las células se incubaron con una dilución 1:200 de FITC F(ab')2 de cabra anti-IgG humana, Fey (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), una dilución 1:100 de PE de ratón anti-CD235a humano (BD Biosciences, San José, CA) y una dilución 1:100 de eFluor 450 de ratón anti-CD45 humano (eBioscience, San Diego, CA) en PBS FBS al 1 % durante 60 min en hielo para la detección de proteínas y la clasificación celular por citometría de flujo. Después de lavar de nuevo, las células se fijaron con formaldehído al 1 % en PBS. Las células se analizaron por citometría de flujo (MACSQuant, Miltenyi Biotec, Colonia, Alemania).
Los resultados muestran que anti-CD47 se unió a CD47 expresado en eritrocitos y leucocitos, pero anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2, SIRPa-Fc y Fc-SIRPa solo se unieron con CD47 expresado en leucocitos y no con CD47 expresado en eritrocitos (fig. 7B).
4(B)(ii) Demostración de avidez de anti-EGFR-huIgG1-SIRPa mediante la unión de ambos antígenos expresados en células
La capacidad del anti-EGFR-huIgG1 -SIRPa ilustrativo para unirse con avidez a EGFR y CD47 en la superficie celular se midió en células de carcinoma epidermoide A549 humano que sobreexpresan EGFR y expresan CD47. Se incubaron 2 x 105 células A549 por pocillo con diversas concentraciones de anticuerpos diluidos en PBS FBS al 1 % en una placa de 96 pocillos durante 60 min en hielo. Después de lavar con PBS FBS al 1 %, las células se incubaron con FITC F(ab')2 anti IgG humana de cabra, Fcy (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) diluido 1:200 en PBS FBS al 1 % durante 60 min en hielo. Las células se analizaron por citometría de flujo (MACSQuant, Miltenyi Biotec, Colonia, Alemania).
Los resultados muestran que la unión de anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 con células A549 fue similar a la de anti-EGFR (fig. 7C). Debido a que la detección anti-Fc probablemente subestima la unión con células de proteínas de fusión Fc que tienen un resto C-terminal adicional (como se describe para el ejemplo 2B(ii)), la observación de unión similar de anti-EGFR-huIgG1 -SIRPa y anti-EGFR sugiere que efectos de avidez para la unión de anti-EGFR-huIgG1 -SIRPa con las células. Cabe destacar que, en contraste con la unión con CD47 sobreexpresada en células CHO, la unión de anti-CD47 con el CD47 endógeno en las células tumorales A549 fue mucho mejor que la de SIRPa-Fc, que a su vez era mucho mejor que la de Fc-SIRPa. Por otra parte, sin desear quedar ligados a la teoría, la avidez probablemente contribuye al aumento de las actividades biológicas de la proteína de fusión anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 en comparación con anti-EGFR observado con respecto tanto a la ADCC mejorada in vitro (fig. 8) como a la actividad antitumoral mejorada in vivo (fig. 9B). La capacidad de anti-EGFR-huIgG1-SIRPa para aprovechar la avidez de unión con las células tumorales al unirse a dos dianas tumorales en la misma célula puede dar como resultado direccionamiento más específico y menos efectos secundarios in vivo.
4(C) Análisis farmacocinético de anti-EGFR-huIgG1-SIRPa
El análisis farmacocinético de anti-EGFR-huIgG1-SIRPa se midió después de la inyección en ratones y se comparó con las moléculas de control. Se permitió que 36 ratones hembra sanos C57BL/6 (8 semanas de edad) de Charles River Laboratories se aclimataran durante al menos 3 días. Se administraron dos niveles de dosificación para cada molécula (embolada IV individual) a los ratones en un volumen de 100 pl/ratón (equivalente a 20 o 200 pg por ratón o aproximadamente 1 o 10 mg/kg). En el día de dosificación, 36 ratones fueron asignados aleatoriamente a 6 grupos (N=6/grupo), en los que cada grupo recibió una dosis/una molécula, por vía intravenosa a través de la vena de la cola del ratón, respectivamente. Se registró el peso corporal del ratón. Los ratones que recibieron la misma dosis/artículo (N=6) se dividieron adicionalmente en dos subgrupos (n=3). Cuatro veces se tomaron extracciones de sangre de cada subgrupo, es decir, un subgrupo a las 1 h, 24 h, 72 h y 168 h, mientras que otro a las 7 h, 48 h, 120 h y 240 h. En los puntos temporales indicados, se tomaron muestras pequeñas de sangre usando un microcapilar de vidrio heparinizado y se recogieron en tubos recubiertos con heparina para evitar la coagulación. Después de la centrifugación para retirar las células, la concentración de las proteínas en plasma se determinó mediante ELISA, se ensayó mediante captura con anti-IgG humano H+L (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA), seguido de detección con Fc anti-IgG humano conjugado con peroxidasa (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) para detectar anti-EGFR-huIgG1-SIRPa.
Los resultados muestran que anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 se eliminó de forma similar a un anticuerpo (fig. 9A). Después de un descenso inicial doble en la fase de distribución en el primer punto temporal, las concentraciones en plasma disminuyeron linealmente según una semivida en circulación de aproximadamente 8 días. La exposición dependía de la dosis con un ABC después de 10 días de 2059 h*pg/ml para la dosis de 20 pg y 13164 h*pg/ml para la dosis de 200 pg. El aclaramiento dependía de la dosis con 0,49 ml/h.kg para la dosis de 20 pg y 0,76 ml/h.kg para la dosis de 200 pg.
4(D)(i) Actividades biológicas in vitro de anti-EGFR-huIgG1-SIRPa
La actividad biológica in vitro de anti-EGFR-huIgG1-SIRPa se muestra en un ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Se transfirieron 6 x 104 células de carcinoma epidermoide A549 humano a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se incubaron durante una noche a 37 0C. Los medios de las células se retiraron y se reemplazaron con diluciones en serie de los anticuerpos recombinantes para concentraciones entre 0,02 y 1600 ng/ml. Después de una incubación de 15-30 min a 37 0C, se añadieron 1,5 x 105 células efectoras (células Jurkat modificadas por ingeniería genética que expresan de manera estable el receptor FcyRIIIa, variante de V158 (alta afinidad), y un elemento de respuesta NFAT que impulsa la expresión de luciferasa de luciérnaga (Promega Madison, WI)) a cada pocillo de placas que contenían anticuerpos y células A549 (relación de células efectoras con respecto a diana 2,5:1). Después de una incubación de 24 horas, se midió la actividad de ADCC mediante actividad luciferasa añadiendo reactivo Bio-Glo (Promega Madison, WI) y midiendo la luminiscencia después de una incubación de 15 min.
Se descubrió que el anti-EGFR-huIgG1 -SIRPaV2 tenía actividad de ADCC significativamente mayor que anti-EGFR, Sirpav2-Fc y Fc-Sirpav2 (fig. 8). Sin desear quedar ligados a la teoría, la actividad in vitro muy mejorada de anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 en comparación con anti-EGFR está muy probablemente causada por la unión impulsada por la avidez con CD47 una vez que se ha producido la interacción de mayor afinidad entre EGFR y la proteína de fusión en la misma célula, lo que da como resultado unión simultánea de dos dianas tumorales en la misma célula.
4(D)(ii) Actividades biológicas in vivo de anti-EGFR-huIgG1-SIRPa
La utilidad de anti-EGFR-huIgG1-SIRPa se muestra mediante un experimento in vivo. En un modelo de tumor de pulmón ortotópico, se inyectaron en ratones NOD-SCID i.v. 2,5 x 106 células de carcinoma epidermoide humano A549-luc, seguido de inyección i.p. de 250 pg/ratón de un control de isotipo de anticuerpo, 250 pg/ratón de anti-EGFR, 250 pg/ratón de anti-CD47, 132 pg/ratón de SIRPa-Fc, combinación de 250 pg/ratón de anti-EGFR y 132 pg/ratón de SIRPa-Fc o 292 pg/ratón de anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2, que es la cantidad equimolar de proteína de fusión. Todos los grupos (n=7) recibieron tratamiento dos veces por semana durante 3 semanas y los resultados se presentaron como señales bioluminiscentes de los pulmones, el estado de salud general, por ejemplo, parálisis, que precedió a la muerte en 10-14 días, y supervivencia de los ratones.
Se descubrió que el tratamiento con anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 era superior a las dos monoterapias (fig. 9B). De manera específica, basándose en la mediana de días de supervivencia, anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 fue significativamente más eficaz que anti-EGFR (40 días frente a 31 días, p=0,0175). Por otra parte, basándose en la supervivencia general, la proteína de fusión fue algo más eficaz que la combinación de las dos monoterapias, a pesar del hecho de que SIRPa-Fc se une con la célula diana A549 mejor que el Fc-SIRPa. Sin desear quedar ligados a la teoría, la actividad antitumoral mejorada de anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 está muy probablemente causada por la unión impulsada por la avidez con CD47 una vez que se ha producido la interacción de mayor afinidad entre EGFR y la proteína de fusión en la misma célula, lo que da como resultado ADCP mejorado y ADCC in vivo. El bloqueo simultáneo de las interacciones tanto EGF/EGFR como SIRPa/CD47, evitando de este modo la señalización de estas dos rutas, también puede contribuir a la mejora de las actividades antitumorales in vivo.
Ejemplo 5: Proteínas de fusión de inmunoglobulina anti-HER2-huIgG1-SIRPa
5(A) Construcción y expresión de anti-HER2-huIgG1-SIRPa
La generación de un anti-HER2-huIgG1-SIRPa ilustrativo se basa en el anticuerpo monoclonal anti-HER2 4D5 (trastuzumab) (Carter et al, PNAS 89: 4285, 1992) y la proteína SIRPa (Jiang et al, JBC 274: 559, 1999). La secuencia de ADN y proteína de la cadena ligera de Fab para 4D5 se proporciona en la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22, respectivamente. La secuencia de ADN y proteína de la cadena pesada de Fab para 4D5 se proporciona en la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24, respectivamente. La secuencia de ADN y proteína del dominio IgV del alelo de SIRPa V2 se proporciona en la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8, respectivamente. Se generó Anti-HER2-huIgG1-SIRPaV2 uniendo el extremo C del polipéptido de cadena pesada anti-HER2 al dominio IgV de SIRPaV2 a través de un conector (G4S)4.
Para la expresión de anti-HER2-huIgG1-SIRPaV2, las siguientes dos construcciones génicas se ensamblaron mediante técnicas convencionales de ADN recombinante y se clonaron en el vector de expresión de mamífero pTT5 (que contiene la secuencia de péptido señal de cadena ligera de ratón para secreción) como en la Fig. 1A: (1) Construcción VH(anti-HER2)-CH1-H-CH2-CH3-(G4S)4-SIRPaV2 (SEQ ID NO: 25) que codifica los siguientes elementos: dominio variable de cadena pesada anti-HER2 seguido de dominios constantes de cadena pesada humana 1-3 seguido de un conector (G4S)4 y dominio IgV de SIRPaV2 y (2) Construcción VL(anti-HER2)-CL (SEQ ID NO: 21), que codifica los siguientes elementos: dominio variable de cadena ligera anti-HER2 seguido de dominio constante de cadena ligera kappa humana. Los aminoácidos correspondientes para estas dos construcciones se muestran en la SEQ ID NO: 26 y la SEQ ID NO: 22, respectivamente.
Los dos vectores se cotransfectaron de manera transitoria en células Expi293 usando Expi293fectin (Life Technologies, Grand Island, NY) para expresión de anti-HER2-huIgG1-SIRPa. La proteína se purificó en una sola etapa mediante cromatografía de afinidad de proteína A. La expresión de los dos polipéptidos y el ensamblaje de la molécula tetramérica completa se confirmaron en electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Para SDS-PAGE, las muestras de proteínas purificadas se redujeron con DTT y se procesaron en Gel NuPAGE MES 4-12 %, 200 V durante 35 min, seguido de tinción de Coomassie. Las dos bandas principales en el gel tenían los pesos moleculares (PM) esperados y la relación estequiométrica correcta con > 95 % de pureza (fig. 10A). En la fig. 10A, el carril 1 muestra el marcador de peso molecular (PM) y el carril 2 muestra el PM esperado (64, 23 kDa) y la relación estequiométrica correcta (1:1) de los dos polipéptidos de anti-HER2-huIgG1-SIRPaV2. Para la SEC, las muestras de proteínas purificadas se analizaron en una columna TSK-GEL Super SW3000 SEC de 4,6 x 300 mm (Tosoh Biosciences, Tokio, Japón) que se equilibró con fosfato de sodio 50 mM, perclorato de sodio 400 mM, pH 6,3 0,1 y 38 2,0 mS/cm2. La cromatografía de exclusión por tamaño mostró un máximo en el PM esperado de aproximadamente 173 kDa para el anti-HER2-huIgG1-SIRPaV2 monomérico (fig. 10B).
Además, se generaron anti-HER2 y anti-CD47 en un formato de anticuerpo monoclonal convencional (huIgG1 anti-HER2 y huIgG1 anti-CD47) y SIRPa en un formato de proteína de fusión Fc (Sirpav2-Fc y Fc-Sirpav2) (fig. 1C) como controles para comparar con el formato de anti-HER2-huIgG1 -SIRPa.
5(B)(i) Unión de anti-HER2-huIgG1-SIRPa con CD47 expresado en células
Se midió la capacidad de anti-HER2-huIgG1-SIRPa para unirse con CD47 expresado en la superficie celular y se comparó con las moléculas de control. Se incubaron 2 x 105 células CHO transfectadas con CD47 por pocillo con diversas concentraciones de anticuerpos diluidos en PBS FBS al 1 % en una placa de 96 pocillos durante 60 min en hielo. Después de lavar con PBS FBS al 1 %, las células se incubaron con FITC F(ab')2 anti IgG humana de cabra, Fcy (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) diluido 1:200 en PBS FBS al 1 % durante 60 min en hielo. Las células se analizaron por citometría de flujo (MACSQuant, Miltenyi Biotec, Colonia, Alemania).
Los resultados muestran que anti-HER2-huIgG1-SIRPaV2, anti-CD47, Sirpav2-Fc y Fc-Sirpav2 se unieron con CD47 sobreexpresado en células CHO transfectadas, pero anti-HER2 no se unió porque HER2 no se expresa (fig. 11A). De nuevo, SIRPa-Fc mostró una mediana de la fluorescencia mayor que Fc-SIRPa.
Se midió la capacidad de anti-HER2-huIgG1-SIRPa para unirse con CD47 expresado en la superficie celular de células sanguíneas y se comparó con las moléculas de control. Se enriqueció sangre completa nueva de donantes humanos sanos en leucocitos con precipitación de dextrano y se lavó con PBS FBS al 1 %. Se incubaron 2 x 105 células de sangre completa humana enriquecida en leucocitos por pocillo con proteínas 50 pg/ml diluidas en PBS FBS al 1 % en una placa de 96 pocillos durante 60 min en hielo. Después de lavar con PBS FBS al 1 %, las células se incubaron con una dilución 1:200 de FITC F(ab')2 de cabra anti-IgG humana, Fcy (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), una dilución 1:100 de PE de ratón anti-CD235a humano (BD Biosciences, San José, CA) y una dilución 1:100 de eFluor 450 de ratón anti-CD45 humano (eBioscience, San Diego, CA) en PBS FBS al 1 % durante 60 min en hielo para la detección de proteínas y la clasificación celular por citometría de flujo. Después de lavar de nuevo, las células se fijaron con formaldehído al 1 % en PBS. Las células se analizaron por citometría de flujo (MACSQuant, Miltenyi Biotec, Colonia, Alemania).
Los resultados muestran que anti-CD47 se unió con CD47 expresado en eritrocitos y leucocitos, pero anti-HER2-huIgG1-SIRPaV2, SIRPaV2-Fc y Fc-Sirpav2 solo se unieron a CD47 expresado en leucocitos y no a CD47 expresado en eritrocitos (fig. 11B).
5(B)(ii) Avidez de unión de anti-HER2-hulgG1-SIRPa en células que expresan ambos antígenos
La capacidad de anti-HER2-huIgG1-SIRPa para unirse con avidez a HER2 y CD47 en la superficie celular se midió en células de adenocarcinoma de mama/glándula mamaria BT474 humana que sobreexpresan HER2 y expresan CD47. Se incubaron 2 x 105 células BT474 por pocillo con diversas concentraciones de anti-HER2-huIgG1-SIRPa, Fc-SIRPa, anti-HER2 y anti-CD47 diluidos en PBS FBS al 1 % en una placa de 96 pocillos durante 60 min en hielo. Después de lavar con PBS FBS al 1 %, las células se incubaron con FITC F(ab')2 anti IgG humana de cabra, Fcy (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) diluido 1:200 en PBS FBS al 1 % durante 60 min en hielo. Después de lavar de nuevo, las células se fijaron con formaldehído al 1 % en PBS. Las células se analizaron por citometría de flujo (MACSQuant, Miltenyi Biotec, Colonia, Alemania).
Los resultados muestran que la unión de anti-HER2-huIgGI-SIRPaV2 con células BT474 se mejora en comparación con moléculas de control, ya sea individualmente o en combinación (fig. 11C), lo que proporciona pruebas de avidez. Como se ha explicado en ejemplos anteriores, la detección basada en anti-Fc probablemente subestima la unión de la proteína de fusión anticuerpo-SIRPa con células. Por tanto, la observación de unión similar de anti-HER2-huIgG1-SIRPaV2 y anti-HER2 sugiere efectos de avidez para la unión de anti-HER2-huIgG1-SIRPa a células. La capacidad de anti-HER2-huIgG1-SIRPa para aprovechar la avidez de unión con las células tumorales al unirse a dos dianas tumorales en la misma célula puede dar como resultado direccionamiento más específico y menos efectos secundarios in vivo.
Ejemplo 6: Proteínas de fusión de inmunoglobulina anti-GD2-huIgG1-SIRPa
La generación de un anti-GD2-huIgG1-SIRPa ilustrativo se basa en el anticuerpo monoclonal anti-GD2 14.18 (Hank et al, Clin. Cancer Re. 15: 5923, 2009) y la proteína SIRPa (Jiang et al, JBC 274: 559, 1999). La secuencia de AdN y proteína de la cadena ligera de Fab para 14.18 se proporciona en la SEQ ID NO: 27 y la SEQ ID NO: 28, respectivamente. La secuencia de ADN y proteína de la cadena pesada de Fab para 14.18 se proporciona en la SEQ ID NO: 29 y la SEQ ID NO: 30, respectivamente. La secuencia de ADN y proteína del dominio IgV del alelo de SIRPa V2 se proporciona en la SeQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8, respectivamente. Se genera Anti-GD2-huIgG1-SIRPaV2 uniendo el extremo C del polipéptido de cadena pesada anti-GD2 a SIRPaV2 a través de un conector (G4S)4.
Para la expresión de anti-GD2-huIgG1-SIRPaV2, las siguientes dos construcciones génicas se ensamblan mediante técnicas convencionales de ADN recombinante y se clonan en el vector de expresión de mamífero pTT5 (que contiene la secuencia de péptido señal de cadena ligera de ratón para secreción) como en la fig. 1A: (1) Construcción VH(anti-GD2)-CH1-H-CH2-CH3-(G4S)4-SIRPaV2 (SEQ ID NO: 31) que codifica los siguientes elementos: dominio variable de cadena pesada anti-GD2 seguido de dominios constantes de cadena pesada humana 1-3 seguido de un conector (G4S)4 y dominio IgV de SIRPaV2 y (2) Construcción VL(anti-GD2)-CL (SeQ ID NO: 27) que codifica los siguientes elementos: dominio variable de cadena ligera anti-GD2 seguido de dominio constante de cadena ligera kappa humana. Los aminoácidos correspondientes para estas dos construcciones se muestran en la SEQ ID NO: 32 y la SEQ ID NO: 28, respectivamente.
Además, se generan anti-GD2 y anti-CD47 en un formato de anticuerpo monoclonal convencional (huIgG1 anti-GD2 y huIgG1 anti-CD47) y SIRPa en un formato de proteína de fusión Fc (Sirpav2-Fc y Fc-Sirpav2) (fig. 1C) como controles para comparar con el formato de anti-GD2-huIgG1-SIRPa.
Ejemplo 7: Proteínas de fusión de inmunoglobulina anti-PD-L1-huIgG1-SIRPa
7(A) Construcción y expresión de anti-PD-L1-huIgG1-SIRPa
La generación de un anti-PD-L1-huIgG1-SIRPa ilustrativo se basa en el anticuerpo monoclonal anti-PD-L1 avelumab (Publicación de Solicitud de Patente Internacional N.° WO2013/079174) y la proteína SIRPa (Jiang et al, JBC 274: 559, 1999). La secuencia de ADN y proteína de la cadena ligera de Fab para anti-PD-LI se proporciona en la SEQ ID NO: 33 y la SEQ ID NO: 34, respectivamente. La secuencia de ADN y proteína de la cadena pesada de Fab para anti-PD-L1 se proporciona en la SEQ ID NO: 35 y la SEQ ID NO: 36, respectivamente. La secuencia de a Dn y proteína del dominio IgV humano del alelo de SIRPa V2 se proporciona en la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8, respectivamente. La secuencia de ADN y proteína de SIRPa murino se proporciona en la SEQ ID NO: 37 y la SEQ ID NO: 38, respectivamente. Se generó anti-PD-L1-huIgG1-muSIRPa uniendo el extremo C del polipéptido de cadena pesada anti-PD-LI al dominio IgV de muSIRPa a través de un conector (G4S)4.
Para la expresión de anti-PD-L1-huIgG1-muSIRPa, las siguientes dos construcciones génicas se ensamblaron mediante técnicas convencionales de ADN recombinante y se clonaron en el vector de expresión de mamífero pTT5 (que contiene la secuencia de péptido señal de cadena ligera de ratón para secreción) como en la fig. 1A: (1) Construcción VH(anti-PD-L1)-CH1-H-CH2-CH3-(G4S)4-muSIRPa (SEQ iD NO: 41) que codifica los siguientes elementos: dominio variable de cadena pesada anti-PD-L1 seguido de dominios constantes de cadena pesada humana 1-3 seguido de un conector (G4S)4 y dominio IgV de muSIRPa y (2) Construcción VL(anti-PD-L1)-CL (SEQ ID NO: 33) que codifica los siguientes elementos: dominio variable de cadena ligera anti-PD-LI seguido de dominio constante de cadena ligera kappa humana. Los aminoácidos correspondientes para estas dos construcciones se muestran en la SEQ ID NO: 42 y la SEQ ID NO: 34, respectivamente.
Los dos vectores se cotransfectaron de manera transitoria en células Expi293 usando Expi293fectin (Life Technologies, Grand Island, NY) para expresión de anti-PD-L1-huIgG1-muSIRPa. La proteína se purificó en una sola etapa mediante cromatografía de afinidad de proteína A. La expresión de los dos polipéptidos y el ensamblaje de la molécula tetramérica completa se confirmaron en electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Para SDS-PAGE, las muestras de proteínas purificadas se redujeron con DTT y se procesaron en Gel NuPAGE MES 4-12 %, 200 V durante 35 min, seguido de tinción de Coomassie. Las dos bandas principales en el gel tenían los pesos moleculares (PM) esperados y la relación estequiométrica correcta con > 95 % de pureza (fig. 12A). En la fig. 12A, el carril 1 muestra el marcador de peso molecular (PM) y el carril 2 muestra el PM esperado (64, 23 kDa) y la relación estequiométrica correcta (1:1) de los dos polipéptidos de anti-PD-L1-huIgG1-muSIRPa. Para la SEC, las muestras de proteínas purificadas se analizaron en una columna TSK-GEL Super SW3000 SEC de 4,6 x 300 mm (Tosoh Biosciences, Tokio, Japón) que se equilibró con fosfato de sodio 50 mM, perclorato de sodio 400 mM, pH 6,3 0,1 y 38 2,0 mS/cm2. La cromatografía de exclusión por tamaño mostró un máximo en el PM esperado de aproximadamente 173 kDa para el anti-PD-LI-huIgG1-muSIRPa monomérico (fig. 12B).
Además, anti-PD-LI y anti-CD47 en un formato de anticuerpo monoclonal convencional (IgG1 anti-PD-LI y huIgG1 anti-CD47) y SIRPa en un formato de proteína de fusión Fc (SIRPaV2-Fc, Fc-huSIRPaV2 y Fc-muSIRPa) (fig. 1C) se generan como controles para comparar con el formato anti-PD-L1-huIgG1-SIRPa.
7(B) Avidez de unión de anti-PD-L1-huIgG1-SIRPa en células que expresan ambos antígenos
La capacidad de anti-PD-L1-huIgG1-muSIRPa para unirse con avidez con PD-L1 y CD47 en la superficie celular se midió en células de linfoma de linfocitos B de ratón A20 que sobreexpresan PD-L1 y expresan CD47. Se incubaron 2 x 105 células A20 por pocillo con diversas concentraciones de anti-PD-L1-huIgG1-muSIRPa, Fc-muSIRPa y anti-PD-Ll diluidos en PBS FBS al 1 % en una placa de 96 pocillos durante 60 min en hielo. Después de lavar con PBS FBS al 1 %, las células se incubaron con FITC F(ab')2 anti IgG humana de cabra, Fcy (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) diluido 1:200 en PBS FBS al 1 % durante 60 min en hielo. Después de lavar de nuevo, las células se fijaron con formaldehído al 1 % en PBS. Las células se analizaron por citometría de flujo (MACSQuant, Miltenyi Biotec, Colonia, Alemania).
Los resultados muestran que la unión de anti-PD-L1-huIgG1-muSIRPa con células A20 se mejoró en general en comparación con la unión de las moléculas de control (fig. 13), lo que proporciona pruebas de avidez. Como se ha explicado en ejemplos anteriores, la detección basada en anti-Fc probablemente subestima la unión de la proteína de fusión anticuerpo-SIRPa con células. Por tanto, la observación de unión similar de anti-PD-L1-huIgG1-muSIRPa y anti-PD-L1 sugiere efectos de avidez para la unión de anti-PD-L1-huIgG1-mu-SIRPa con células. La capacidad de anti-PD-L1-huIgG1-muSIRPa para aprovechar la avidez de unión con las células tumorales al unirse a dos dianas tumorales en la misma célula puede dar como resultado direccionamiento más específico y menos efectos secundarios in vivo.
Ejemplo 8: Proteínas de fusión de inmunoglobulina anti-EGFR-huIgGI-SIRPa (aglucosilado)
8(A) Construcción y expresión de anti-EGFR-huIgG1-SIRPa (aglucosilado)
La generación de un anti-EGFR-huIgG1-SIRPa(aglucosilado) ilustrativo se basa en el anticuerpo monoclonal anti-EGFR C225 (cetuximab) (Kawamoto, PNAS 80: 1337, 1983) y la proteína SIRPa con mutación N110Q (Jiang et al, JBC 274: 559, 1999). Se mostró que SIRPa aglucosilado, a través de N110Q, se unía peor con CD47 que el SIRPa glucosilado (Ogura et al, JBC 279: 13711, 2004). La secuencia de ADN y proteína de la cadena ligera de Fab para C225 se proporciona en la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14, respectivamente. La secuencia de ADN y proteína de la cadena pesada de Fab para C225 se proporciona en la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 16, respectivamente. La secuencia de ADN y proteína del alelo de SIRPa V1 se proporciona en la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6, respectivamente. Se genera anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV1 (N110Q) uniendo el extremo C del polipéptido de cadena pesada anti-EGFR al dominio IgV de SIRPaV1 (N110Q) a través de un conector (G4S)4.
Para la expresión del anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV1 (N110Q), las siguientes dos construcciones génicas se ensamblaron mediante técnicas convencionales de ADN recombinante y se clonan en el vector de expresión de mamífero pTT5 (que contiene la secuencia de péptido señal de cadena ligera de ratón para secreción) como en la fig. 1A: (1) Construcción VH(anti-EGFR)-CH1-H-CH2-CH3-(G4S)4-SIRPaV1(N110Q) (s Eq ID NO: 43) que codifica los siguientes elementos: dominio variable de cadena pesada anti-EGFR seguido de dominios constantes de cadena pesada humana 1-3 isotipo IgG1 seguido de un conector (G4S)4 y el dominio IgV de SIRPaV1(N110Q). (2) Construcción VL(anti-EGFR)-CL (SEQ ID NO: 13), que codifica los siguientes elementos: dominio variable de cadena ligera anti-EGFR seguido de dominio constante de cadena ligera kappa humana. Las secuencias de aminoácidos correspondientes para estas dos construcciones se muestran en la SEQ ID NO: 44 y la SEQ ID NO: 14, respectivamente.
Los dos vectores se cotransfectaron de manera transitoria en células Expi293 usando Expi293fectin (Life Technologies, Grand Island, NY) para expresión de anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV1(N110Q). La proteína se purificó en una sola etapa mediante cromatografía de afinidad de proteína A. La expresión de los dos polipéptidos y el ensamblaje de la molécula tetramérica completa se confirmaron en electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodiopoliacrilamida (SDS-PAGE) y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Para SDS-PAGE, las muestras de proteínas purificadas se redujeron con DTT y se procesaron en Gel NuPAGE MES 4-12 %, 200 V durante 35 min, seguido de tinción de Coomassie. Las dos bandas principales en el gel tenían los pesos moleculares (PM) esperados y la relación estequiométrica correcta con > 95 % de pureza (fig. 14A). En la fig. 14A, el carril 1 muestra el marcador de peso molecular (PM) y el carril 2 muestra el PM esperado (64, 23 kDa) y la relación estequiométrica correcta (1:1) de los dos polipéptidos de anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV1(N110Q). Para la SEC, las muestras de proteínas purificadas se analizaron en una columna TSK-GEL Super SW3000 SEC de 4,6 x 300 mm (Tosoh Biosciences, Tokio, Japón) que se equilibró con fosfato de sodio 50 mM, perclorato de sodio 400 mM, pH 6,3 0,1 y 38 2,0 mS/cm2. La cromatografía de exclusión por tamaño mostró un máximo en el PM esperado de aproximadamente 173 kDa para el anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV1 (N110Q) (fig. 14B).
Además, anti-EGFR y anti-CD47 en un formato de anticuerpo monoclonal convencional (huIgG1 anti-EGFR y huIgG1 anti-CD47) y SIRPa en un formato de proteína de fusión Fc (Sirpav2-Fc y Fc-SIRPaV2) (fig. 1C) se generan como controles para comparar con el formato anti-EGFR-huIgG1-SIRPa.
8(B) Unión de anti-EGFR-huIgGI-SIRPa (aglucosilado) a CD47 expresado en células
Se midió la capacidad de anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV1(N110Q) para unirse con CD47 sobreexpresado en la superficie celular y se comparó con las moléculas de control. Se incubaron 2 x 105 células CHO transfectadas con CD47 por pocillo con diversas concentraciones de anticuerpos diluidos en PBS FBS al 1 % en una placa de 96 pocillos durante 60 min en hielo. Después de lavar con PBS FBS al 1 %, las células se incubaron con FITC F(ab')2 anti IgG humana de cabra, Fey (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) diluido 1:200 en PBS FBS al 1 % durante 60 min en hielo. Después de lavar de nuevo, las células se fijaron con formaldehído al 1 % en PBS. Las células se analizaron por citometría de flujo (MACSQuant, Miltenyi Biotec, Colonia, Alemania).
Los resultados muestran que anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV1(N110Q) se unió con CD47 expresado en células CHO transfectadas (fig. 15). A diferencia de informes anteriores (Ogura et al., JBC 279: 13711, 2004), anti-EGFR-huIgG1-huSIRPa V1 (N110Q) se unió también con CD47 como anti-EGFR-huIgG1-huSIRPaV1.
Ejemplo 9: Proteínas de fusión de inmunoglobulina anti-EGFR-huIgG1/anti-EGFR-LC-SIRPa
9(A) Construcción y expresión de anti-EGFR-huIgG1/anti-EGFR-SIRPa
La generación de un anti-EGFR-huIgG1/anti-EGFR-SIRPa ilustrativo se basa en el anticuerpo monoclonal antiEGFR C225 (cetuximab) (Kawamoto, PNAS 80: 1337, 1983) y la proteína SIRPa (Jiang et al, JBC 274: 559, 1999). La secuencia de ADN y proteína de la cadena ligera de Fab para C225 se proporciona en la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14, respectivamente. La secuencia de ADN y proteína de la cadena pesada de Fab para C225 se proporciona en la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 16, respectivamente. La secuencia de ADN y proteína del alelo de SIRPa V1 se proporciona en la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6, respectivamente, y la secuencia de ADN y proteína del dominio IgV del alelo de SIRPa V2 se proporciona en la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8, respectivamente. En una realización particular, anti-EGFR-huIgG1/anti-EGFR-LC-SIRPa se genera uniendo el extremo C del polipéptido de cadena ligera anti-EGFR al dominio IgV de SIRPaV2 a través de un conector (G4S)4 y también se puede fusionar directamente sin ningún conector o con (GXS)Y, donde X, Y = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más.
Para la expresión de anti-EGFR-huIgG1/anti-EGFR-LC-SIRPaV2, las siguientes dos construcciones génicas se ensamblaron mediante técnicas convencionales de ADN recombinante y se clonaron en el vector de expresión de mamífero pTT5 (que contiene la secuencia de péptido señal de cadena ligera de ratón para secreción) como en la fig. IF: (1) Construcción VH(anti-EGFR)-CH1-H-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 45), que codifica los siguientes elementos: dominio variable de cadena pesada anti-EGFR, seguido de los dominios constantes de cadena pesada humana 1-3 isotipo IgG y (2) Construcción VL(anti-EGFR)-CL-(G4S)2-SIRPaV2 (SEQ ID NO: 47), que codifica los siguientes elementos: dominio variable de cadena ligera anti-EGFR, seguido del dominio constante de cadena ligera kappa humana, seguido de un conector (G4S)4 y el dominio IgV de SIRPaV2. Las secuencias de aminoácidos correspondientes para estas dos construcciones se muestran en la SEQ ID NO: 46 y la SEQ ID NO: 48, respectivamente.
Para la expresión de anti-EGFR-ds1-huIgG1/anti-EGFR-LC-SIRPaV2, las siguientes dos construcciones génicas se ensamblaron mediante técnicas convencionales de ADN recombinante y se clonaron en el vector de expresión de mamífero pTT5 (que contiene la secuencia de péptido señal de cadena ligera de ratón para secreción) como en la fig. 1F: (1) Construcción VH(anti-EGFR) (ds1-G44C)-CH1-H-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 73), que codifica los siguientes elementos: dominio variable de cadena pesada anti-EGFR con una mutación estabilizadora (ds1 :G44C) para compensar la desestabilización de la fusión de la cadena ligera (Orcutt et al., PEDS 23: 221, 2010), seguido de dominios constantes de cadena pesada humana 1-3 isotipo IgG y (2) Construcción VL(anti-EGFR)(ds1-A100C)-CL-(G4S)4-Sirpav2 (SEQ ID NO: 77), que codifica los siguientes elementos: dominio variable de cadena ligera anti-EGFR con una mutación estabilizadora (ds1: A100C), seguido del dominio constante de cadena ligera kappa humana, seguido de un conector (G4S)4 y el dominio IgV de SIRPaV2. Las secuencias de aminoácidos correspondientes para estas dos construcciones se muestran en la SEQ ID NO: 74 y la SEQ ID NO: 78, respectivamente.
Para la expresión de anti-EGFR-ds2-huIgG1/anti-EGFR-LC-SIRPa, las siguientes dos construcciones génicas se ensamblaron mediante técnicas convencionales de ADN recombinante y se clonaron en el vector de expresión de mamífero pTT5 (que contiene la secuencia de péptido señal de cadena ligera de ratón para secreción) como en la fig. IF: (1) Construcción VH(anti-EGFR)(ds2-Q105C)-CH1-H-CH2-CH3 (SEQ ID NO: 75), que codifica los siguientes elementos: dominio variable de cadena pesada anti-EGFR con una mutación estabilizadora (ds2: Q105C) para compensar la desestabilización de la fusión de la cadena ligera (Orcutt et al, PEDS 23: 221, 2010), seguido de dominios constantes de cadena pesada humana 1-3 isotipo IgG y (2) Construcción VL(anti-EGFR)(ds2-S43C)-CL-(G4S)4-SIRPaV2 (SEQ ID NO: 79), que codifica los siguientes elementos: dominio variable de cadena ligera anti-EGFR con una mutación estabilizadora (ds2: S43C), seguido del dominio constante de cadena ligera kappa humana, seguido de un conector (G4S)4 y el dominio IgV de SIRPaV2. Las secuencias de aminoácidos correspondientes para estas dos construcciones se muestran en la SEQ ID NO: 76 y la SEQ ID NO: 80, respectivamente.
Además, anti-EGFR y anti-CD47 en un formato de anticuerpo monoclonal convencional (huIgG1 anti-EGFR y huIgG1 anti-CD47) y SIRPa en un formato de proteína de fusión Fc (SIRPaV2-Fc y Fc-SIRPaV2) (fig. 1C) se generan como controles para comparar con el formato anti-EGFR-huIgG1/anti-EGFR-LC-SIRPa.
Se examinó un método alternativo de estabilización mediante la introducción del formato de apareamiento de disulfuro de cadena pesada y ligera de IgG4, mediante la introducción de dos mutaciones (S131C y C222S en la SEQ ID NO: 46) en el dominio CH1 de cadena pesada. La cisteína C-terminal de cadena ligera que normalmente se emparejaría con la cadena pesada C222 formará ahora un enlace disulfuro con C131. Además, esta cadena pesada mutada puede tener cualquiera de las mutaciones ds1 o ds2 para mejorar aún más la estabilidad y combinarse con la cadena ligera respectiva (ds1 o ds2).
Cada uno de los dos vectores se cotransfectaron de manera transitoria en células Expi293 usando Expi293fectin (Life Technologies, Grand Island, NY) para la expresión de anti-EGFR-huIgG1/anti-EGFR-LC-SIRPa. Las proteínas se purificaron en una sola etapa mediante cromatografía de afinidad de proteína A. La expresión de los dos polipéptidos y el ensamblaje de la molécula tetramérica completa se confirmaron en electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Para SDS-PAGE, las muestras de proteínas purificadas se redujeron con DTT y se procesaron en Gel NuPAGE MES 4-12 %, 200 V durante 35 min, seguido de tinción de Coomassie. Las dos bandas principales en el gel tenían los pesos moleculares (PM) esperados y la relación estequiométrica correcta con > 95 % de pureza (fig. 21A). En la fig. 21A, el carril 1 muestra el marcador de peso molecular (PM), el carril 2 muestra el PM esperado (49, 36 kDa) y la relación estequiométrica correcta (1:1) de los dos polipéptidos de anti-EGFR-huIgG1/anti-EGFR-LC-SIRPa, el carril 3 muestra el PM esperado (49, 36 kDa) y la relación estequiométrica correcta (1:1) de los dos polipéptidos de anti-EGFR-ds1-huIgG1/anti-EGFR-LC-SIRPa y el carril 4 muestra el PM esperado (49, 36 kDa) y la relación estequiométrica correcta (1:1) de los dos polipéptidos de anti-EGFR-ds2-huIgG1/anti-EGFR-LC-SIRPa. Las secuencias de tipo silvestre de los dominios VH y VL tenían el menor número de bandas adicionales en el SDS PAGE, contrario a la expectativa de que las mutaciones ds1 y ds2 estabilizarían la fusión de cadena ligera. Para la SEC, las muestras de proteínas purificadas se analizaron en una columna TSK-GEL Super SW3000 SEC de 4,6 x 300 mm (Tosoh Biosciences, Tokio, Japón) que se equilibró con fosfato de sodio 50 mM, perclorato de sodio 400 mM, pH 6,3 0,1 y 38 2,0 mS/cm2. La cromatografía de exclusión por tamaño mostró un máximo en el PM esperado de aproximadamente 172 kDa para el anti-EGFR-huIgG1/anti-EGFR-SIRPa monomérico (fig. 21B).
Además, anti-EGFR y anti-CD47 en un formato de anticuerpo monoclonal convencional (huIgG1 anti-EGFR y huIgG1 anti-CD47) y SIRPa en un formato de proteína de fusión Fc (SIRPaV2-Fc y Fc-Sirpav2) (fig. 1C) se generan como controles para comparar con el formato anti-EGFR-huIgG1-SIRPa.
9(B) Unión de anti-EGFR-huIgG1/anti-EGFR-LC-SIRPa con CD47 expresado en células
Se midió la capacidad de anti-EGFR-huIgG1/anti-EGFR-LC-Sirpav2 para unirse con CD47 sobreexpresado en la superficie celular y se comparó con las moléculas de control. Se incubaron 2 x 105 células CHO transfectadas con CD47 por pocillo con diversas concentraciones de anticuerpos diluidos en PBS FBS al 1 % en una placa de 96 pocillos durante 60 min en hielo. Después de lavar con PBS FBS al 1 %, las células se incubaron con FITC F(ab')2 anti IgG humana de cabra, Fcy (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) diluido 1:200 en PBS FBS al 1 % durante 60 min en hielo. Después de lavar de nuevo, las células se fijaron con formaldehído al 1 % en PBS. Las células se analizaron por citometría de flujo (MACSQuant, Miltenyi Biotec, Colonia, Alemania). Los resultados muestran que anti-EGFR-huIgG1/anti-EGFR-LC-SIRPaV2 se unió con CD47 expresado en células CHO transfectadas, pero no tan bien como anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 (fig. 21C).
Ejemplo 10: Proteína de fusión de inmunoglobulina SIRPa-Fc(huIgG1)-anti-EGFR(Fab)
10(A) Construcción y expresión de SIRPa-Fc(huIgG1)-anti-EGFR(Fab)
La generación de un SIRPa-Fc(huIgG1)-anti-EGFR(Fab) ilustrativo se basa en el anticuerpo monoclonal anti-EGFR C225 (cetuximab) (Kawamoto, PNAS 80: 1337, 1983) y la proteína SIRPa (Jiang et al, JBC 274: 559, 1999). La secuencia de ADN y proteína de la cadena ligera de Fab para C225 se proporciona en la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14, respectivamente. La secuencia de ADN y proteína de la cadena pesada de Fab para C225 se proporciona en la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 16, respectivamente. La secuencia de ADN y proteína del dominio IgV del alelo de SIRPa V2 se proporciona en la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8, respectivamente. Se generó SIRPa-Fc(huIgG1)-anti-EGFR(Fab) uniendo SIRPa al extremo N de la cadena pesada de Fc a través de un conector (G4S)2 seguido de la unión de la cadena pesada Fab anti-EGFR al terminal C de la cadena pesada Fc a través de un conector (G4S)4.
Para la expresión del SIRPaV2-Fc(huIgG1)-anti-EGFR(Fab), las siguientes dos construcciones génicas se ensamblaron mediante técnicas convencionales de ADN recombinante y se clonaron en el vector de expresión de mamífero pTT5 (que contiene la secuencia de péptido señal de cadena ligera de ratón para secreción), como en la fig. 1H: (1) Construcción SIRPaV2-(G4S)2-H-CH2-CH3-(G4S)4-VH(anti-EGFR)-CH1 (SEQ ID NO: 49), que codifica los siguientes elementos: el dominio IgV de SIRPaV2 seguido de un conector (G4S)4 y la región bisagra de la cadena pesada humana con cisteína (que forma de manera nativa un enlace disulfuro con la cadena ligera) mutada a una serina, (EPKSS, SEQ ID NO: 50), seguido de los dominios constantes 2 y 3, seguido de un conector (G4S)4 y dominio variable de cadena pesada anti-EGFR seguido del dominio constante de cadena pesada humana 1 seguido de la región bisagra (EPKSC, SEQ ID NO: 51, para permitir un enlace disulfuro con la cadena ligera anti-EGFR) y (2) Construcción VL(anti-EGFR)-CL (SEQ ID NO: 13), que codifica los siguientes elementos: dominio variable de cadena ligera anti-EGFR seguido de dominio constante de cadena ligera kappa humana. Las secuencias de aminoácidos correspondientes para estas dos construcciones se muestran en la SEQ ID NO: 52 y la SEQ ID NO: 14, respectivamente.
Los dos vectores se cotransfectaron de manera transitoria en células Expi293 usando Expi293fectin (Life Technologies, Grand Island, NY) para la expresión de SIRPaV2-Fc(huIgG1)-anti-EGFR (Fab). La proteína se purificó en una sola etapa mediante cromatografía de afinidad de proteína A. La expresión de los dos polipéptidos y el ensamblaje de la molécula tetramérica completa se confirmaron en electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodiopoliacrilamida (SDS-PAGE) y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Para SDS-PAGE, las muestras de proteínas purificadas se redujeron con DTT y se procesaron en Gel NuPAGE MES 4-12 %, 200 V durante 35 min, seguido de tinción de Coomassie. Las dos bandas principales en el gel tenían los pesos moleculares (PM) esperados y la relación estequiométrica correcta con > 95 % de pureza (fig. 16A). En la fig. 16A, el carril 1 muestra el marcador de peso molecular (PM) y el carril 2 muestra el PM esperado (64, 23 kDa) y la relación estequiométrica correcta (1:1) de los dos polipéptidos de SIRPa-Fc(huIgG1 )-anti-EGFR(Fab). Para la SEC, las muestras de proteínas purificadas se analizaron en una columna TSK-GEL Super SW3000 SEC de 4,6 x 300 mm (Tosoh Biosciences, Tokio, Japón) que se equilibró con fosfato de sodio 50 mM, perclorato de sodio 400 mM, pH 6,3 0,1 y 38 2,0 mS/cm2. La cromatografía de exclusión por tamaño mostró un máximo en el PM esperado de aproximadamente 173 kDa para el SIRPa-Fc(huIgG1)-anti-EGFR(Fab) (fig. 16B).
Además, anti-EGFR y anti-CD47 en un formato de anticuerpo monoclonal convencional (huIgG1 anti-EGFR y huIgG1 anti-CD47) y SIRPa en un formato de proteína de fusión Fc (Sirpav2-Fc y Fc-SIRPaV2) (fig. 1C) se generan como controles para comparar con el formato SIRPa-Fc(huIgG1 )-anti-EGFR(Fab).
10(B) Unión de SIRPa-Fc(huIgG1)-anti-EGFR(Fab) a CD47 expresado en células
Se midió la capacidad de SIRPa-Fc(huIgG1)-anti-EGFR(Fab) para unirse con CD47 sobreexpresado en la superficie celular y se comparó con las moléculas de control. Se incubaron 2 x 105 células CHO transfectadas con CD47 por pocillo con diversas concentraciones de anticuerpos diluidos en PBS FBS al 1 % en una placa de 96 pocillos durante 60 min en hielo. Después de lavar con PBS FBS al 1 %, las células se incubaron con FITC F(ab')2 anti IgG humana de cabra, Fcy (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) diluido 1:200 en PBS FBS al 1 % durante 60 min en hielo. Después de lavar de nuevo, las células se fijaron con formaldehído al 1 % en PBS. Las células se analizaron por citometría de flujo (MACSQuant, Miltenyi Biotec, Colonia, Alemania).
Los resultados muestran que SIRPa-Fc(huIgG1)-anti-EGFR(Fab) unido a CD47 expresado en células CHO transfectadas con CD47 (fig. 17A). La unión de SIRPa-Fc(huIgG1)-anti-EGFR(Fab) o el Sirpav2-Fc de control fue similar a la de anti-CD47 y mejor que la de anti-EGFR-huIgG1 -huSIRPaV2 o Fc-Sirpav2.
10(C)(i) Actividades biológicas in vitro de SIRPa-Fc(huIgG1)-anti-EGFR(Fab)
La actividad biológica in vitro de SIRPa-Fc(huIgG1)-anti-EGFR(Fab) se mostró en un ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Se transfirieron 6 x 104 células de carcinoma epidermoide A549 humano a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se incubaron durante una noche a 37 0C. Los medios de las células se retiraron y se reemplazaron con diluciones en serie de los anticuerpos recombinantes para concentraciones entre 0,02 y 1600 ng/ml. Después de una incubación de 15-30 min a 37 0C, se añadieron 1,5 x 105 células efectoras (células Jurkat modificadas por ingeniería genética que expresan de manera estable el receptor FcyRIIIa, variante de V158 (alta afinidad), y un elemento de respuesta NFAT que impulsa la expresión de luciferasa de luciérnaga (Promega Madison, WI)) a cada pocillo de placas que contenían anticuerpos y células A549 (relación de células efectoras con respecto a diana 2,5:1). Después de una incubación de 24 horas, se midió la actividad de ADCC mediante actividad luciferasa añadiendo reactivo Bio-Glo (Promega Madison, WI) y midiendo la luminiscencia después de una incubación de 15 min.
Se descubrió que SIRPaV2-Fc(huIgG1)-anti-EGFR (Fab) tenía actividad de ADCC menor que anti-EGFR, pero mayor actividad de ADCC que Fc-Sirpav2 (fig. 17B). La orientación del dominio de unión con respecto al dominio Fc dicta la actividad de ADCC. Por tanto, SIRPa-FcV2 tiene mayor actividad que Fc-Sirpav2 (fig. 17B) y anti-EGFR tiene mayor actividad que Fc-anti-EGFR(Fab) (datos no mostrados, pero no se observó actividad). Sin desear quedar ligados a la teoría, dado que el resto anti-EGFR(Fab) de SIRPaV2-Fc(huIgG1)-anti-EGFR(Fab) se unió con células con mayor afinidad que el resto SIRPa, puede situar el Fc en una orientación para actividad óptima de ADCC.
10(C)(ii) Actividades biológicas in vivo de SIRPa-Fc(huIgG1)-anti-EGFR(Fab)
La utilidad de Sirpav2-Fc(huIgG1)-anti-EGFR(Fab) se muestra mediante un experimento in vivo. En un modelo de tumor de pulmón ortotópico, se inyectaron en ratones NOD-SCID i.v. 2,5 x 106 células de carcinoma epidermoide humano A549-luc, seguido de inyección i.p. de 400 pg/ratón de un control de isotipo de anticuerpo, 250 pg/ratón de anti-EGFR, combinación de 250 pg/ratón de anti-EGFR y 136 pg/ratón de SIRPaV2-Fc, 298 pg/ratón de anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 o 298 pg/ratón de SIRPaV2-Fc(huIgG1)-anti-EGFR(Fab), que es la cantidad equimolar de proteína de fusión. Todos los grupos (n=7) recibieron tratamiento dos veces por semana durante 3 semanas y los resultados se presentaron como señales bioluminiscentes de los pulmones, el estado de salud general, por ejemplo, parálisis, que precedió a la muerte en 10-14 días, y supervivencia de los ratones.
Se descubrió que el tratamiento con la proteína de fusión SIRPaV2-Fc(huIgG1)-anti-EGFR(Fab) es ligeramente inferior a la combinación y anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 (mediana de supervivencia 40 días, 42 días y 43,5 días respectivamente, fig. 18), a pesar de tener unión similar con EGFR y unión superior con CD47. La reducción en ADCC mostrada en la fig. 17B puede explicar la disminución de la eficacia antitumoral de SIRPaV2-Fc(huIgG1)-anti-EGFR(Fab) en comparación con anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2.
Ejemplo 11: Proteínas de fusión de inmunoglobulina SIRPa-Fc(huIgG1)-anti-EGFR(scFv)
La generación de un SIRPa-Fc(huIgG1)-anti-EGFR(scFv) ilustrativo se basa en la proteína SIRPa (Jiang et al, JBC 274: 559, 1999) y el anti-EGFR(scFv) C225 (Patente de los Estados Unidos n.° US 7.820.165). La secuencia de ADN y proteína del dominio IgV del alelo de SIRPa V2 se proporciona en la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8, respectivamente. La secuencia de ADN y proteína de anti-EGFR(scFv) C225 se proporciona en la SEQ ID NO: 53 y la SEQ ID NO: 54, respectivamente. Se genera SIRPV2a-Fc(huIgG1)-anti-EGFR(scFv) uniendo el dominio IgV de SIRPa al extremo N de la cadena pesada de Fc a través de un conector (G4S)2 seguido de unión de anti-EGFR(scFv) al extremo C de la cadena pesada de Fc a través de un conector (G4S)4.
Para la expresión del SIRPaV2-Fc(huIgG1)-anti-EGFR(scFv) C225, la siguiente construcción génica se ensambló mediante técnicas convencionales de ADN recombinante y se clonó en el vector de expresión de mamífero pTT5 (que contiene la secuencia de péptido señal de cadena ligera de ratón para secreción), como en la fig. 1J: Construcción SIRPaV2-(G4S)2-H-CH2-CH3-(G4S)4-C225(VH)-(G4S)3-C225(VL) (SEQ ID NO: 55), que codifica los siguientes elementos: El dominio de IgV de SIRPaV2 seguido de un conector (G4S)4 y región bisagra de cadena pesada humana con cisteína (que forma de manera nativa un enlace disulfuro con la cadena ligera) mutada a una serina, (EPKSS, SEQ ID NO: 50), seguido de los dominios constantes 2 y 3, seguido de un conector (G4S)4 y dominio variable de cadena pesada anti-EGFR, seguido de un conector (G4S)3 y dominio variable de cadena ligera anti-EGFR. La secuencia de aminoácidos correspondiente para esta construcción se muestra en la SEQ ID NO: 56. Además, anti-EGFR y anti-CD47 en un formato de anticuerpo monoclonal convencional (huIgG1 anti-EGFR y huIgG1 anti-CD47), anti-EGFR en un formato scFv (anti-EGFR(scFv)) y SIRPa en un formato de proteína de fusión Fc (Sirpav2-Fc y Fc-SIRPaV2) (fig. 1C) se generaron como controles para comparar con el formato de SIRPaV2-Fc(huIgG1 )-anti-EGFR(scFv).
Ejemplo 12: Proteínas de fusión de inmunoglobulina anti-EGFR(scFv)-Fc(huIgG1)-SIRPa
La generación de un anti-EGFR(scFv)-Fc(huIgG1)-SIRPa ilustrativo se basa en el anti-EGFR(scFv) C225 (Patente de los Estados Unidos n.° US 7.820.165) y la proteína SIRPa (Jiang et al, JBC 274: 559, 1999). La secuencia de ADN y proteína de anti-EGFR(scFv) C225 se proporciona en la SEQ ID NO: 53 y la SEQ ID NO: 54, respectivamente. La secuencia de ADN y proteína del dominio IgV del alelo de SIRPa V2 se proporciona en la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8, respectivamente. Se genera anti-EGFR(scFv)-Fc(huIgG1)-Sirpav2 uniendo anti-EGFR(scFv) con el extremo N de la cadena pesada de Fc a través de un conector (G4S)2 seguido de unión del dominio IgV de SIRPaV2 al extremo C de la cadena pesada de Fc a través de un conector (G4S)4.
Para expresión del anti-EGFR(scFv) C225-Fc(huIgG1)-SIRPaV2, la siguiente construcción génica se ensambló mediante técnicas convencionales de ADN recombinante y se clonó en el vector de expresión de mamífero pTT5 (que contiene la secuencia de péptido señal de cadena ligera de ratón para secreción), como en la fig. 1L: Construcción C225(VH)-(G4S)3-C225(VL)-(G4S)2-H-CH2-CH3-(G4S)4-SIRPaV2 (SEQ ID NO: 57), que codifica los siguientes elementos: dominio variable de cadena pesada anti-EGFR, seguido de un conector (G4S)3 y dominio variable de cadena ligera anti-EGFR seguido de un conector (G4S)4 y región bisagra de cadena pesada humana con cisteína (que forma de manera nativa un enlace disulfuro con la cadena ligera) mutada a una serina, (EPKSS, SEQ ID NO: 50), seguido de los dominios constantes 2 y 3, seguido de un conector (G4S)4 y el dominio IgV de SIRPaV2. La secuencia de aminoácidos correspondiente para esta construcción se muestra en la SEQ ID NO: 58.
Además, anti-EGFR y anti-CD47 en un formato de anticuerpo monoclonal convencional (huIgG1 anti-EGFR y huIgG1 anti-CD47), anti-EGFR en un formato scFv (anti-EGFR(scFv)) y SIRPa en un formato de proteína de fusión Fc (Sirpav2-Fc y Fc-Sirpav2) (fig. 1C) se generaron como controles para comparar con el formato de anti-EGFR(scFv)-Fc(huIgG1 )-Sirpav2.
Ejemplo 13: Proteínas de fusión de inmunoglobulina SIRPa-Fc(huIgG1)-anti-CD19(scFv)
La generación de SIRPa-Fc(huIgG1)-anti-CD19(scFv) se basa en la proteína SIRPa (Jiang et al, JBC 274: 559, 1999) y el anti-CD19(scFv) CHRI-19Fv1 (Nicholson et al, Molecular Immunology 34: 1157, 1997). La secuencia de ADN y proteína del dominio IgV del alelo de SIRPa V2 se proporciona en la SEQ ID nO: 7 y la SEQ ID NO: 8, respectivamente. La secuencia de ADN y proteína de CHRI-19Fv1 se proporciona en la SEQ ID NO: 59 y la SEQ ID NO: 60, respectivamente. Se genera SIRPaV2-Fc(huIgG1)-anti-CD19(scFv) uniendo el dominio IgV de SIRPaV2 al extremo N de la cadena pesada de Fc a través de un conector (G4S)2 seguido de unión de anti-CD19(scFv) al extremo C de la cadena pesada de Fc a través de un conector (G4S)4.
Para la expresión del SIRPaV2-Fc(huIgG1)-anti-CD19(scFv), la siguiente construcción génica se ensambla mediante técnicas convencionales de ADN recombinante y se clona en el vector de expresión de mamífero pTT5 (que contiene la secuencia de péptido señal de cadena ligera de ratón para secreción), como en la fig. 1J: Construcción SIRPaV2-(G4S)2-H-CH2-CH3-(G4S)4-CHRI-19Fv1 (VH)-conector-CHRI-19Fv1 (VL) (SEQ ID NO: 61), que codifica los siguientes elementos: SIRPaV2 seguido de un conector (G4S)4 y región bisagra de cadena pesada humana con cisteína (que forma de manera nativa un enlace disulfuro con la cadena ligera) mutada a una serina, (EPKSS, SEQ ID NO: 50), seguido de los dominios constantes 2 y 3, seguido de un conector (G4S)4 y dominio variable de cadena pesada anti-CD19, seguido de un conector (G4S)3 y dominio variable de cadena ligera anti-CD19. Las secuencias de aminoácidos correspondientes para esta construcción se muestran en la SEQ ID NO: 62.
Además, anti-CD47 en un formato de anticuerpo monoclonal convencional (huIgGI anti-CD47), anti-CD19 en un formato scFv (anti-CD19(scFv)) y SIRPa en un formato de proteína de fusión Fc (Sirpav2-Fc y Fc-Sirpav2) (fig. 1C) se generan como controles para comparar con el formato SIRPaV2-Fc(huIgG1 )-anti-CD19(scFv).
Ejemplo 14: Proteínas de fusión de inmunoglobulina anti-CD19(scFv)-Fc(huIgG1)-SIRPa
La generación de un anti-CD19(scFv)-Fc(huIgG1)-SIRPa ilustrativo se basa en el anti-CD19(scFv) CHRI-19Fv1 (Nicholson et al, Molecular Immunology 34: 1157, 1997) y la proteína SIRPa (Jiang et al, JBC 274: 559, 1999). La secuencia de AdN y proteína de c Hr I-19Fv1 se proporciona en la SEQ ID NO: 59 y la SEQ ID NO: 60, respectivamente. La secuencia de ADN y proteína del dominio IgV del alelo de SIRPa V2 se proporciona en la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8, respectivamente. Se genera anti-CD19(scFv)-Fc(huIgG1)-SIRPaV2 uniendo anti-CD19(scFv) al extremo N de la cadena pesada de Fc a través de un conector (G4S)2 seguido de unión del dominio IgV de SIRPaV2 al extremo C de la cadena pesada de Fc a través de un conector (G4S)4.
Para la expresión de anti-CD19(scFv)-Fc(huIgG1)-SIRPaV2, la siguiente construcción génica se ensambla mediante técnicas convencionales de ADN recombinante y se clona en el vector de expresión de mamífero pTT5 (que contiene la secuencia de péptido señal de cadena ligera de ratón para secreción), como en la fig. 1L: Construcción CHRI-19Fv1(VH)-conector-19Fv1(VL)-(G4S)2-H-CH2-CH3-(G4S)4-SIRPaV2 (SEQ ID NO: 63), que codifica los siguientes elementos: dominio variable de cadena pesada anti-CD19, seguido de un conector (G4S)3 y dominio variable de cadena ligera anti-CD19, seguido de un conector (G4S)4 y región bisagra de cadena pesada humana con cisteína (que forma de manera nativa un enlace disulfuro con la cadena ligera) mutada a una serina, (EPKSS, SEQ ID NO: 50), seguido de los dominios constantes 2 y 3, seguido de un conector (G4S)4 y el dominio IgV de SIRPaV2. Las secuencias de aminoácidos correspondientes para esta construcción se muestran en la SEQ ID NO: 64.
Además, anti-CD47 en un formato de anticuerpo monoclonal convencional (huIgG1 anti-CD47), anti-CD19 en un formato scFv (anti-CD19(scFv)) y SIRPa en un formato de proteína de fusión Fc (SIRPaV2-Fc y Fc-Sirpav2) (fig. 1C) se generan como controles para comparar con el formato anti-CD19(scFv)-Fc(huIgG1 )-SIRPaV2.
Ejemplo 15: Proteínas de fusión de inmunoglobulina SIRPa-Fcab(HER2)
15(A) Construcción y expresión de SIRPa-Fcab(HER2)
La generación de un SIRPa-Fcab(HER2) ilustrativo se basa en la proteína SIRPa (Jiang et al, JBC 274: 559, 1999) y el Fcab anti-HER2 H10-03-6 (Wozniak-Knopp et al, PEDS 23: 289, 2010). La secuencia de ADN y proteína del dominio IgV del alelo de SIRPa V2 se proporciona en la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8, respectivamente. La secuencia de ADN y proteína de Fcab(HER2) se proporciona en la SEQ ID NO: 65 y la SEQ ID NO: 66, respectivamente. Se genera Sirpav2-Fcab(HER2) uniendo el dominio IgV de SIRPaV2 con el extremo N de Fcab(HER2) a través de un conector (G4S)2.
Para la expresión de Sirpav2-Fcab (HER2), la siguiente construcción génica se ensambló mediante técnicas convencionales de ADN recombinante y se clonó en el vector de expresión de mamífero pTT5 (que contenía la secuencia de péptido señal de cadena ligera de ratón para secreción), como en la fig. 1F: Construcción SIRPaV2-(G4S)2-H-CH2-CH3(anti-HER2) (SEQ ID NO: 67), que codifica los siguientes elementos: SIRPaV2 seguido de un conector (G4S)4 y región bisagra de cadena pesada humana con cisteína (que forma de manera nativa un enlace disulfuro con la cadena ligera) mutada a una serina, (EPKSS, SEQ ID NO: 50), seguido del dominio constante 2 y el dominio constante 3 que se ha modificado para unirse con HER2 a través de los bucles AB, CD y EF. Las secuencias de aminoácidos correspondientes para esta construcción se muestran en la SEQ ID NO: 68.
El vector se transfectó transitoriamente en células Expi293 usando Expi293fectin (Life Technologies, Grand Island, NY) para la expresión de SIRPaV2-Fcab(HER2). La proteína se purificó en una sola etapa mediante cromatografía de afinidad de proteína A. La expresión de la molécula se confirmó en electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Para SDS-PAGE, la muestra de proteína purificada se redujo con DTT y se procesó en gel NuPAGE MES 4-12 %, 200 V durante 35 min, seguido de tinción de Coomassie. La banda principal en el gel tenía los pesos moleculares (PM) esperados con > 95 % de pureza (fig. 19A). En la fig. 19A, el carril 1 muestra el marcador de peso molecular (PM) y el carril 2 muestra el PM esperado (40 kDa) de SIRPaV2-Fcab(HER2). Para la SEC, la muestra de proteína purificada se analizó en una columna TSK-GEL Super SW3000 SEC 4,6 x 300 mm (Tosoh Biosciences, Tokio, Japón) que se equilibró con fosfato de sodio 50 mM, perclorato de sodio 400 mM, pH 6,3 0,1 y 38 2,0 mS/cm2. La cromatografía de exclusión por tamaño mostró un máximo en el PM esperado de aproximadamente 80 kDa para el Sirpav2-Fcab(HER2) (fig.
19B).
Además, anti-HER2 y anti-CD47 en un formato de anticuerpo monoclonal convencional (huIgG1 anti-HER2 y huIgG1 anti-CD47), Fcab(HER2) y SIRPa en un formato de proteína de fusión Fc (Sirpav2-Fc y Fc-Sirpav2) (fig. 1C) se generaron como controles para comparar con el formato de Sirpav2-Fcab(HER2).
15(B)(i) Unión de SIRPa-Fcab(HER2) con CD47 expresado en células
Se midió la capacidad de Sirpav2-Fcab(HER2) para unirse con CD47 expresado en la superficie celular y se comparó con las moléculas de control. Se incubaron 2 x 105 células CHO transfectadas con CD47 por pocillo con diversas concentraciones de anticuerpos diluidos en PBS FBS al 1 % en una placa de 96 pocillos durante 60 min en hielo. Después de lavar con PBS FBS al 1 %, las células se incubaron con FITC F(ab')2 anti IgG humana de cabra, Fcy (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) diluido 1:200 en PBS FBS al 1 % durante 60 min en hielo. Después de lavar de nuevo, las células se fijaron con formaldehído al 1 % en PBS. Las células se analizaron por citometría de flujo (MACSQuant, Miltenyi Biotec, Colonia, Alemania).
Los resultados muestran que Sirpav2-Fcab(HER2), anti-CD47 y SIRPa-Fc se unieron con CD47 expresado en células CHO transfectadas, pero anti-HER2 y Fcab (HER2) no se unieron porque HER2 no se expresa (fig. 20A). 15(B)(ii) Avidez de unión de SIRPa-Fcab(HER2) en células que expresan ambos antígenos
La capacidad de SIRPaV2-Fcab(HER2) para unirse con avidez con HER2 y CD47 en la superficie celular se midió en células de adenocarcinoma de mama/glándula mamaria BT474 humana que sobreexpresan HER2 y expresan CD47. Se incubaron 2 x 105 células BT474 por pocillo con diversas concentraciones de SIRPaV2-Fcab(HER2), SIRPaV2-Fc, Fcab(HER2), anti-HER2 y anti-CD47 diluido en PBS FBS al 1 % en una placa de 96 pocillos durante 60 min en hielo. Después de lavar con PBS FBS al 1 %, las células se incubaron con FITC F(ab')2 anti IgG humana de cabra, Fey (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) diluido 1:200 en PBS FBS al 1 % durante 60 min en hielo. Después de lavar de nuevo, las células se fijaron con formaldehído al 1 % en PBS. Las células se analizaron por citometría de flujo (MACSQuant, Miltenyi Biotec, Colonia, Alemania).
Los resultados muestran que la unión de Sirpav2-Fcab(HER2) con células BT474 se mejoró en comparación con la unión de Fcab(HER2), en particular a concentraciones menores (fig. 20B), lo que proporciona pruebas claras de avidez. La capacidad de SIRPaV2-Fcab(HER2) para aprovechar la avidez de unión con las células tumorales al unirse a dos dianas tumorales en la misma célula puede dar como resultado direccionamiento más específico y menos efectos secundarios in vivo.
Ejemplo 16: Métodos computacionales para identificar restos de SIRPa que afectan a la unión de CD47 Se utilizaron métodos computacionales con los que están familiarizados los expertos en la materia para identificar restos de SIRPa que pueden afectar a la unión de SIRPa con CD47 y para predecir mutaciones con el potencial de disminuir o aumentar la afinidad de unión de SIRPa por CD47 e identificar candidatos que merezca la pena investigar experimentalmente. En resumen, se analizó la estructura cristalina del complejo CD47/SIRPa para identificar posiciones de restos de SIRPa que se ha predicho que afectan a la unión con CD47.
Se realizó mutagénesis computacional en el conjunto seleccionado de posiciones de SIRPa para llegar a un valor para la diferencia en la energía de unión de diversas mutaciones potenciales en comparación con SIRPa de tipo silvestre, y se estableció un valor umbral para clasificar las mutaciones que se ha predicho que tienen afinidad reducida o afinidad aumentada por CD47 en relación con SIRPa de tipo silvestre. Debido a que la configuración del valor umbral para la designación de variantes de SIRPa de afinidad reducida o aumentada solapaba, también hubo solapamiento significativo en las mutaciones predichas por ordenador enumeradas en la Tabla 1 y la Tabla 2 (véase a continuación).
Figure imgf000033_0001
Tabla 2: Las mutaciones de SIRPa que se ha predicho que tienen unión con CD47 más estrecha en comparación con el ti o silvestre.
Figure imgf000034_0001
33 variantes de SIRPa que contienen mutaciones de un solo punto, principalmente de la tabla 2, se seleccionaron para caracterización experimental adicional. (Véase tabla 3 en el ejemplo 17).
Ejemplo 17: Variantes anti-EGFR-huIsG1-SIRPa
17(A) Construcción y expresión de variantes de anti-EGFR-huIgG1-SIRPa
Las variantes de anticuerpo-SIRPa se generaron en el contexto de anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 descrito en el ejemplo 4. Las mutaciones en el dominio IgV del alelo de SIRPa V2 se enumeran en la tabla 3 (en referencia a la SEQ ID NO: 8). Se generaron variantes de anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 uniendo el extremo C del polipéptido de cadena pesada anti-EGFR al dominio IgV de SIRPaV2 variante a través de un conector (G4S)4.
Para la expresión de cada una de las variantes de anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2, las siguientes dos construcciones génicas se ensamblaron mediante técnicas convencionales de ADN recombinante y se clonaron en el vector de expresión de mamífero pTT5 (que contiene la secuencia de péptido señal de cadena ligera de ratón para secreción) como en la fig. 1A:
(1) Construcción VH(anti-EGFR)-CH1-H-CH2-CH3-(G4S)4-SIRPaV2 (SEQ ID NO: 19) modificándose la secuencia para codificar la mutación o mutaciones particulares enumeradas en la tabla 3 para cada variante; la construcción codificó los siguientes elementos: dominio variable de cadena pesada anti-EGFR seguido de dominios constantes de cadena pesada humana 1-3 isotipo IgG1 seguido de un conector (G4S)4 y el dominio IgV de SIRPaV2 variante y (2) Construcción VL(anti-EGFR)-CL (SEQ ID NO: 13), que codifica los siguientes elementos: dominio variable de cadena ligera anti-EGFR seguido de dominio constante de cadena ligera kappa humana. Las secuencias de aminoácidos correspondientes para estas dos construcciones se muestran en la SEQ ID NO: 20 (cuya secuencia debe modificarse para incluir las mutaciones particulares enumeradas en la tabla 3) y la SEQ ID NO: 14 respectivamente.
El conjunto de dos vectores para cada una de las variantes anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 se cotransfectó transitoriamente en células Expi293 usando Expi293fectin (Life Technologies, Grand Island, NY) para la expresión de cada una de las variantes anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2. Las proteínas se purificaron en una sola etapa mediante cromatografía de afinidad de proteína A. La expresión de los dos polipéptidos y el ensamblaje de la molécula tetramérica completa se confirmaron en cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Para la SEC, las muestras de proteínas purificadas se analizaron en una columna TSK-GEL Super SW3000 SEC de 4,6_300 mm (Tosoh Biosciences, Tokio, Japón) que se equilibró con fosfato de sodio 50 mM, perclorato de sodio 400 mM, pH 6,3 0,1 y 38 2,0 mS/cm2. La cromatografía de exclusión por tamaño mostró un máximo en el PM esperado de aproximadamente 173 kDa para el anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 monomérico. Se presentó el porcentaje del máximo monomérico en relación con todos los máximos de SEC para cada variante en la Tabla 3.
Además, anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 de tipo silvestre ("TS"), anticuerpo quimérico B6H12/huIgG1 ("anti-CD47") y anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 con múltiples mutaciones ("1D4" (V27I / K53R / S66T / K68R / F103V), (Weiskopf, Science 341: 88, 2013); "AS2" (K53R / S66T / K68R); y "AS1" (L4V / V27I / I31T / K53R / S66T / K68R / F94L)) se generaron como controles positivos y se generó anti-EGFR como control negativo.
17(B)(i) Unión de variantes anti-EGFR-huIgG1-SIRPa con CD47 expresado en células
Se midió la capacidad de variantes anti-EGFR-hulgG1-SIRPaV2 para unirse con CD47 sobreexpresado en la superficie celular y se comparó con las moléculas de control. Se incubaron 2 x 105 células CHO transfectadas para expresar altos niveles de CD47 por pocillo con diversas concentraciones de anticuerpos diluidos en PBS FBS al 1 % en una placa de 96 pocillos durante 60 min en hielo. Después de lavar con PBS FBS al 1 %, las células se incubaron con FITC F(ab')2 anti IgG humana de cabra, Fcy (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) diluido 1:200 en PBS FBS al 1 % durante 60 min en hielo. Después de lavar de nuevo, las células se fijaron con formaldehído al 1 % en PBS. Las células se analizaron por citometría de flujo (MACSQuant, Miltenyi Biotec, Colonia, Alemania). Se calculó una CE50 para cada variante para unión con CD47 expresada en células CHO ajustando los datos a una curva sigmoidea (log(agonista) frente a respuesta - Pendiente variable (cuatro parámetros)) con Graph Pad Prism y presentados en la tabla 3.
Los resultados muestran que muchas variantes anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2, incluyendo V6I, V27I, I31R, I31T, Q37H, Q37W, H56P y S66Q, se unieron con CD47 expresado en células CHO transfectadas con mayor afinidad que anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 de tipo silvestre (tabla 3), mientras que las variantes E54P y M72R se unieron con afinidad similar. Como se esperaba, los controles positivos anti-CD47, 1D4, AS2 y AS1 también se unieron con CD47 con mayor afinidad y el control negativo anti-EGFR no se unió porque EGFR no se expresa. Los resultados muestran que una mutación de un solo punto en SIRPa es suficiente para aumentar la afinidad de SIRPa por CD47.
Para comparar la afinidad de unión intrínseca, es decir, minimizar el efecto de avidez debido a la interacción bivalente que se produce a alta densidad de receptores, se determinó la unión de variantes anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 y moléculas de control con células que expresaban bajos niveles de CD47. Se incubaron 2 x 105 células de linfoma Ramos humano CD47bajo por pocillo con diversas concentraciones de anticuerpos diluidos en PBS FBS al 1 % en una placa de 96 pocillos durante 60 min en hielo. Después de lavar con PBS FBS al 1 %, las células se incubaron con FITC F(ab')2 anti IgG humana de cabra, Fcy (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) diluido 1:200 en PBS FBS al 1 % durante 60 min en hielo. Después de lavar de nuevo, las células se fijaron con formaldehído al 1 % en PBS. Las células se analizaron por citometría de flujo (MACSQuant, Miltenyi Biotec, Colonia, Alemania). Se calculó una CE50 para cada variante para unión con CD47 expresada en células Ramos ajustando los datos a una curva sigmoidea (log(agonista) frente a respuesta - Pendiente variable (cuatro parámetros)) con Graph Pad Prism y presentados en la tabla 3.
Los resultados muestran que muchas variantes anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2, incluyendo V6I, V27I, I31R, I31T, Q37H, Q37W, E54P, H56P, S66Q y M72R, se unieron con CD47 expresado en células Ramos con mayor afinidad que anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 de tipo silvestre (tabla 3), pero las diferencias en valores de CE50 entre las variantes fueron mayores en comparación con las diferencias vistas con células CD47alto. Como se esperaba, los controles positivos anti-CD47, 1D4, AS2 y AS1 también se unieron con CD47 con mayor afinidad y el control negativo anti-EGFR no se unió con células Ramos porque EGFR no se expresa.
Se midió la capacidad del anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 de mayor afinidad para unirse con CD47 expresado en la superficie celular de células sanguíneas y se comparó con las moléculas de control. Se incubaron 2 x 105 células de sangre completa nuevas de donantes humanos sanos por pocillo con 50 pg/ml de proteínas diluidas en PBS FBS al 1 % en una placa de 96 pocillos durante 60 min en hielo. Después de lavar con PBS FBS al 1 %, las células se incubaron con una dilución 1:200 de FITC F(ab')2 de cabra anti-IgG humana, Fcy (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) para detectar la unión de variantes anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 y una dilución 1:100 de CD235a anti­ humano de ratón PE (BD Biosciences, San José, CA) para seleccionar eritrocitos en PBS FBS al 1 % durante 60 min en hielo. Después de lavar de nuevo, las células se fijaron con formaldehído al 1 % en PBS. Las células se analizaron por citometría de flujo (MACSQuant, Miltenyi Biotec, Colonia, Alemania). La mediana de la intensidad de fluorescencia (IFM) a 50 pg/ml de cada variante anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 se determinó y se presentó en la tabla 3. Además, el grado de unión a eritrocitos se expresó como un % de la IFM anti-CD47 ((100 x (IFM de proteína)/(IFM de anti-CD47)).
Los resultados confirmaron que anti-CD47 se unió con CD47 expresado en eritrocitos, pero anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 no (tabla 3), como se ha mostrado antes (fig. 7B). Varias de las variantes anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2, incluyendo v 6i, V27I, I31T, Q37H, E54P y M72R, conservaron falta de unión a eritrocitos, similar a anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 de tipo silvestre (3 % o menos de unión a anti-CD47). Sin embargo, otras variantes, incluyendo I31R y S66Q, tenían cierto nivel de unión con eritrocitos (12 % y 21 % de unión anti-CD47, respectivamente), al igual que los controles positivos 1D4 (53 %), AS2 (12 %) y AS1 (37 %). Q37W y H56P solo se unieron débilmente con eritrocitos (4 % de unión con anti-CD47).
Tabla 3: Lista de variantes anti-EGFR-huIgG1 -SIRPaV2, que muestra el porcentaje de monómero por SEC, la CE50 (nM) de unión con CD47 expresada en células CD47alto (células CHO transfectadas con CD47) y células CD47bajo (células de Ramos), la IFM (intensidad de fluorescencia media) de las proteínas a 50 pg/ml unidas con eritrocitos humanos (RBC) y el % de unión a RBC con respecto a la IFM anti-CD47 (calculada como (100 x (IFM de proteína)/(IFM de anti-CD47)). Anti-EGFR-huIgG1 -SIRPaV2 de tipo silvestre ("TS"), el anticuerpo quimérico de control positivo B6H12/huIgG1 ("anti-CD47") y anti-EGFR de control negativo están en negrita y los controles positivos de SIRPa de mayor afinidad ("1D4", "AS2" y "AS1") están en cursiva.
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Para mejorar potencialmente el índice terapéutico de una proteína de fusión anti-EGFR-huIgG1-SIRPa en el tratamiento del cáncer, puede ser deseable seleccionar una variante anti-EGFR-huIgG1-SIRPa con un aumento óptimo en la unión con CD47 en células CD47alto y CD47bajo en comparación con anti-EGFR-huIgG1-SIRPa y una falta relativa de unión a eritrocitos (en particular, en comparación con anti-CD47). Por ejemplo, se puede elegir una variante con un aumento de aproximadamente 5 veces a aproximadamente 30 veces en la unión con células CD47bajo en comparación con anti-EGFR-huIgG1-SIRPa de tipo silvestre y aproximadamente un 30 % o menos, aproximadamente un 10 % o menos, aproximadamente un 5 % o menos o aproximadamente un 3 % o menos de unión con eritrocitos en comparación con anti-CD47. Cumpliendo dichos criterios, se caracterizó adicionalmente la actividad biológica de anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2(Q37W) variante ejemplar. Se contempla que para mejorar el índice terapéutico de una proteína de fusión de anticuerpo-SIRPa que se dirige a un antígeno tumoral diferente, tal como CD20 o HER2, se pueden usar criterios análogos para elegir la variante óptima de SIRPa.
Ejemplo 18: Anti-EGFR-hulgG1-SIRPa(Q37W)
18(A) Construcción y expresión de anti-EGFR-huIgG1-SIRPa(Q37W)
Los vectores anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2(Q37W) del ejemplo 17 se cotransfectaron transitoriamente en células Expi293 usando Expi293fectin (Life Technologies, Grand Island, NY) para expresión de anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2(Q37W). La proteína se purificó en una sola etapa mediante cromatografía de afinidad de proteína A. La expresión de los dos polipéptidos y el ensamblaje de la molécula tetramérica completa se confirmaron en electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Para SDS-PAGE, las muestras de proteínas purificadas se redujeron con DTT y se procesaron en Gel NuPAGE MES 4-12 %, 200 V durante 35 min, seguido de tinción de Coomassie. Las dos bandas principales en el gel tenían los pesos moleculares (PM) esperados y la relación estequiométrica correcta con > 95 % de pureza (fig.
22A). En la fig. 22A, el carril 1 muestra el marcador de peso molecular (PM) y el carril 2 muestra el PM esperado (64, 23 kDa) y la relación estequiométrica correcta (1:1) de los dos polipéptidos de anti-EGFR-huIgG1-Sirpav2(Q37W). Para la SEC, las muestras de proteínas purificadas se analizaron en una columna TSK-GEL Super SW3000 SEC de 4,6_300 mm (Tosoh Biosciences, Tokio, Japón) que se equilibró con fosfato de sodio 50 mM, perclorato de sodio 400 mM, pH 6,3 0,1 y 38 2,0 mS/cm2. La cromatografía de exclusión por tamaño mostró un máximo en el PM esperado de aproximadamente 173 kDa para el anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2(Q37W) (fig. 22B).
Además, anti-EGFR y anti-CD47 en un formato de anticuerpo monoclonal convencional (hulgG1 anti-EGFR y hulgG1 anti-CD47) y SIRPa en un formato de proteína de fusión Fc (Sirpav2-Fc, Fc-Sirpav2 y Fc-SIRPaV2(Q37W)) (fig. 1C) y anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 de tipo silvestre se generaron como controles para comparar con anti-EGFR-huIgG1-Sirpav2(Q37W).
18(B) Actividades biológicas in vitro de anti-EGFR-huIgG1-SIRPa(Q37W)
Se determinó la capacidad de anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 (Q37W) para causar que los eritrocitos se hemaglutinen y se comparó con las moléculas de control. Se incubaron 30-50 pl de células de sangre completa humana nueva por pocillo con 1, 3, 10 y 30 pg/ml de proteínas de prueba en un volumen total de 100 pl de HBSS BSA al 0,5 % en una placa de 96 pocillos a 37 0C durante 2-4 horas. Las placas se centrifugaron y el sobrenadante se retiró. Los sedimentos celulares se resuspendieron con 100 pl de PBS. Los pocillos se clasificaron entre solubilización completa de RBC (sin hemaglutinación), sedimento parcial y solubilización (+ hemaglutinación) y sedimento denso de células sin solubilización (++ hemaglutinación).
Los resultados confirmaron que anti-CD47 provoca que los eritrocitos se hemaglutinen (+ hemaglutinación a 3 pg/ml y + hemaglutinación a 10 y 30 pg/ml), pero anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 a todas las concentraciones probadas no se hemaglutinó, lo que se correlaciona con la falta de unión de eritrocitos mostrada en la fig. 7B (datos no mostrados). Anti-EGFR-huIgG1-Sirpav2(Q37W) a todas las concentraciones probadas tampoco provocó que los eritrocitos se hemaglutinaran, a pesar del aumento de la unión de anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2(Q37W) con eritrocitos. Estos datos proporcionan pruebas de apoyo adicionales de que anti-EGFR-huIgG1-Sirpav2 (Q37W) puede lograr un mejor índice terapéutico al aumentar la unión sin aumentar la toxicidad relacionada con eritrocitos.
18(C) Actividades biológicas in vivo de anti-EGFR-huIgG1-SIRPa(Q37W)
La utilidad de anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2(Q37W) se muestra mediante un experimento in vivo. En un modelo de tumor de pulmón ortotópico, se inyectaron en ratones NOD-SCID i.v. 2,5 x 106 células de carcinoma epidermoide humano A549-luc, seguido de inyección i.p. de 400 pg/ratón de un control de isotipo de anticuerpo, 250 pg/ratón de anti-EGFR, 298 pg/ratón de anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 o 298 pg/ratón de anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2(Q37W), que es la cantidad equimolar de proteína de fusión. Todos los grupos (n=8) recibieron tratamiento dos veces por semana durante 3 semanas y los resultados se presentaron como señales bioluminiscentes de los pulmones, el estado de salud general, por ejemplo, parálisis, que precedió a la muerte en 10-14 días, y supervivencia de los ratones.
Se descubrió que el tratamiento con proteína de fusión anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 (Q37W) era superior a las dos monoterapias y anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 (fig. 23). La introducción de una sola mutación Q37w en el resto SIRPaV2 de la proteína de fusión mejoró la mediana de días de supervivencia de 43,5 días para el anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 de tipo silvestre a 55 días y la diferencia es muy significativa (p=0,0019). Los resultados muestran claramente que aumentar la afinidad de SIRPa por CD47 dio como resultado mayor eficacia antitumoral, que, sin desear quedar ligados a la teoría, puede explicarse más fácilmente por la unión mejorada de CD47 impulsada por avidez y el direccionamiento a las células A549 para su eliminación por células inmunitarias. El anti-EGFR-huIgG1-SIRPaV2 de tipo silvestre fue a su vez más eficaz que el anticuerpo anti-EGFR, prolongando la mediana de los días de supervivencia de 35,5 a 43,5 días (p=0,0187), lo que confirma lo observado en un experimento previo (fig. 9B). Por tanto, estos datos proporcionan pruebas de apoyo adicionales de que anti-EGFR-huIgG1-Sirpav2(Q37W) puede lograr un mejor índice terapéutico al aumentar la unión sin aumentar la toxicidad relacionada con eritrocitos.
Ejemplo 19: Anti-CD20-huIgG1-SIRPa(Q37W)
19(A) Construcción y expresión de anti-CD20-huIgG1-SIRPa(Q37W)
Anti-CD20-huIgG1-SIRPaV2(Q37W) ilustrativo se basa en el anti-CD20-huIgG1-SIRPaV2 descrito en el ejemplo 2. Se generó anti-CD20-huIgG1-SIRPaV2(Q37W) uniendo el extremo C del polipéptido de cadena pesada anti-CD20 al dominio IgV de SIRPaV2 que contiene la mutación Q37W a través de un conector(G4S)4.
Para la expresión de anti-CD20-huIgG1-SIRPaV2, las siguientes dos construcciones génicas se ensamblaron mediante técnicas convencionales de ADN recombinante y se clonaron en el vector de expresión de mamífero pTT5 (que contiene la secuencia de péptido señal de cadena ligera de ratón para secreción) como en la fig. 1A: (1) Construcción VH(anti-CD20)-CH1-H-CH2-CH3-(G4S)4-Sirpav2(Q37W) (SeQ ID NO: 11 alterado por la mutación de codificación del alelo de SIRPa V2 Q37W) que codifica los siguientes elementos: dominio variable de cadena pesada anti-CD20 seguido de dominios constantes de cadena pesada humana 1-3 isotipo IgG1 seguido de un conector (G4S)4 y el dominio IgV de SIRPaV2 variante con mutación en Q37W y (2) Construcción VL(anti-CD20)-CL (SEQ ID NO: 1) que codifica el dominio variable de cadena ligera anti-CD20 seguido del dominio constante de cadena ligera kappa humana. Las secuencias de aminoácidos correspondientes para estas dos construcciones se muestran en la SeQ ID NO: 12, que contiene adicionalmente la mutación del alelo de SIRPa V2 Q37W y la SEQ ID NO: 2, respectivamente.
El conjunto de dos vectores para la expresión de anti-CD20-huIgG1-SIRPaV2(Q37W) se cotransfectó transitoriamente en células Expi293 usando Expi293fectin (Life Technologies, Grand Island, NY). La proteína se purificó en una sola etapa mediante cromatografía de afinidad de proteína A. La expresión de los dos polipéptidos y el ensamblaje de la molécula tetramérica completa se confirmaron en SDS-PAGE y SEC. Para SDS-PAGE, las muestras de proteínas purificadas se redujeron con DTT y se procesaron en Gel NuPAGE MES 4-12 %, 200 V durante 35 min, seguido de tinción de Coomassie. Las dos bandas principales en el gel tenían el PM esperado y la relación estequiométrica correcta con >95 % de pureza (fig. 24A). En la fig. 24A, el carril 1 muestra el marcador de peso molecular (PM) y el carril 2 muestra el PM esperado (63, 23 kDa) y la relación estequiométrica correcta (1:1) de los dos polipéptidos de anti-CD20-huIgG1-SIRPaV2. Para la SEC, las muestras de proteínas purificadas se analizaron en una columna TSK-GEL Super SW3000 SEC de 4,6 x 300 mm (Tosoh Biosciences, Tokio, Japón) que se equilibró con fosfato de sodio 50 mM, perclorato de sodio 400 mM, pH 6,3 0,1 y 38 2,0 mS/cm2. La cromatografía de exclusión por tamaño mostró un máximo en el PM esperado de aproximadamente 172 kDa para el anti-CD20-huIgG1-SIRPaV2(Q37W) monomérico (fig. 24B).
Además, anti-CD20 y anti-CD47 en un formato de anticuerpo monoclonal convencional (huIgG1 anti-CD20 y huIgG1 anti-CD47) y SIRPa en un formato de proteína de fusión Fc (Sirpav2-Fc, Fc-Sirpav2 y Fc-SIRPaV2(Q37W)) (fig. 1C) y anti-CD20-huIgG1-SIRPaV2 de tipo silvestre del ejemplo 2 se generaron como controles para comparar con anti-CD20-huIgG1-SIRPaV2(Q37W).
19(B) Actividad biológica in vivo de la combinación de anti-CD20 con Fc-SIRPaV2(Q37W)
Como una indicación de la actividad biológica mejorada de anti-CD20-huIgG1-Sirpav2(Q37W) en comparación con anti-CD20-huIgG1-SIRPaV2, se usó un modelo de linfoma diseminado en ratón para probar la combinación de anti-CD20 con Fc-Sirpav2 o Fc-Sirpav2(Q37W). Se inyectaron ratones SCID i.v. con 5 x 106 células de linfoma Daudi humano CD20+, seguido de inyección i.p. de 25 pg/ratón de un control de isotipo de anticuerpo, 25 pg/ratón de anti-CD20, combinación de 25 pg/ratón de anti-CD20 y 14 pg/ratón de Fc-Sirpav2 o combinación de 25 pg/ratón de anti-CD20 y 14 pg/ratón de Fc-Sirpav2(Q37W). Todos los grupos (n=10) recibieron tratamiento dos veces por semana durante 3 semanas y los resultados se indicaron como salud general, por ejemplo, parálisis, que precedió a la muerte en 10-14 días, y supervivencia de los ratones.
Aunque el experimento aún no ha concluido, se descubrió que cien días después del inicio del tratamiento, 10 de 10 ratones tratados con la combinación de anti-CD20 y Fc-Sirpav2(Q37W) y 8 de 10 ratones tratados con la combinación de anti-CD20 y Fc-Sirpav2, seguían vivos, en comparación con 6 de 10 ratones tratados con anti-CD20 solo (fig. 25). Por lo tanto, hasta el momento, se descubrió que el tratamiento con la combinación de anti-CD20 y Fc-Sirpav2(Q37W) era superior a la combinación de anti-CD20 y Fc-Sirpav2, que a su vez era superior a la monoterapia anti-CD20. Se espera que anti-CD20-huIgG1-Sirpav2(Q37W) también tenga actividad mejorada en comparación con anti-CD20-huIgG1 -SIRPaV2.
Tabla 4: Secuencias de aminoácidos ácidos nucleicos
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Claims (23)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de fusión de inmunoglobulina con SIRPa que comprende:
(i) un dominio extracelular de IgV de la proteína alfa reguladora de señal (SIRPa) o una variante de SIRPa que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80 % idéntica (a) a los restos 3-115 de la SEQ ID NO: 6, (b) a los restos 3-114 de la SEQ ID NO: 8 o (c) a los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 190, en donde la variante de SIRPa comprende una modificación en un aminoácido en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 6, 27, 31,37, 54, 56, 66 o 72 de la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 190, en donde la modificación es una sustitución seleccionada del grupo que consiste en: V6I; V27I; A27I; 131R; I31T; Q37W; Q37H; E54P; H56P; S66Q; L66Q; y M72R; y
(ii) una molécula de inmunoglobulina o parte de la misma que se une con un antígeno de superficie en una célula promotora de enfermedad.
2. La proteína de fusión de inmunoglobulina con SIRPa de la reivindicación 1, en donde
(i) la célula promotora de enfermedad es una célula tumoral y el antígeno de superficie es un antígeno tumoral; (ii) la variante de SIRPa comprende una secuencia de aminoácidos al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % idéntica a los restos 3-115 de la SEQ ID NO: 6, a los restos 3-114 de la SEQ ID NO: 8 o a los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 190; y/o
(iii) la variante de SIRPa comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % idéntica a los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 6 o a los restos 1-114 de la SEQ iD NO: 8.
3. La proteína de fusión de inmunoglobulina de la reivindicación 1, en donde
(i) la variante de SIRPa comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: restos 1-114 de la SEQ ID NO: 193, restos 1-115 de la SEQ ID NO: 194, restos 1-115 de la SEQ ID NO: 195, restos 1-115 de la SEQ ID NO: 196, restos 1-114 de la SEQ ID NO: 197, restos 1-114 de la SEQ ID NO: 198, restos 1-115 de la SEQ ID NO: 199, restos 1-114 de la SEQ ID NO: 200 y restos 1-115 de la SEQ ID NO: 190; o
(ii) el dominio extracelular de IgV comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los restos 1­ 115 de la SEQ ID NO: 6, restos 1-114 de la SEQ ID NO: 8, 1-114 de la SEQ ID NO: 193, restos 1-115 de la SEQ ID NO: 194, restos 1-115 de la SEQ ID NO: 195, restos 1-115 de la SEQ ID NO: 196, restos 1-114 de la SEQ ID NO: 197, restos 1-114 de la SEQ ID NO: 198, restos 1-115 de la SEQ ID NO: 199, restos 1-114 de la SEQ ID NO: 200 y restos 1-115 de la SEQ ID NO: 190 o en donde la variante de SIRPa comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % idéntica a los restos 1-343 de la SEQ ID NO: 6.
4. La proteína de fusión de inmunoglobulina de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la molécula de inmunoglobulina o parte de la misma comprende un dominio variable de anticuerpo o una región Fc modificada por ingeniería genética para contener un sitio de unión a antígeno, opcionalmente en donde la región Fc modificada por ingeniería genética para contener un sitio de unión a antígeno comprende un resto Fcab.
5. La proteína de fusión de inmunoglobulina de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la molécula de inmunoglobulina comprende un anticuerpo intacto o una parte de unión a antígeno del anticuerpo.
6. La proteína de fusión de inmunoglobulina de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la SIRPa o variante de SIRPa está conectada a una cadena ligera de anticuerpo o parte de la misma o a la cadena pesada de anticuerpo o parte de la misma.
7. La proteína de fusión de inmunoglobulina de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la proteína de fusión comprende una parte de una molécula de inmunoglobulina que comprende un fragmento de anticuerpo Fab, un fragmento de anticuerpo F(ab')2 o un anticuerpo monocatenario o en donde la molécula de inmunoglobulina o parte de la misma está conectada a la SIRPa o variante de SIRPa a través de un resto conector.
8. La proteína de fusión de inmunoglobulina de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la SIRPa o variante de SIRPa
(i) está conectada en su extremo N con la molécula de inmunoglobulina o parte de la misma;
(ii) está conectada en su extremo C con la molécula de inmunoglobulina o parte de la misma;
(iii) está conectada con el extremo N de la molécula de inmunoglobulina o parte de la misma; o
(iv) está conectada con el extremo C de la molécula de inmunoglobulina o parte de la misma.
9. La proteína de fusión de inmunoglobulina de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el antígeno tumoral se selecciona del grupo que consiste en HER2, HER3, EGFR, CD20, GD2, PD-L1 y CD19.
10. La proteína de fusión de inmunoglobulina de la reivindicación 5, en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-EGFR opcionalmente en donde el anticuerpo anti-EGFR es cetuximab o en donde el anticuerpo anti-EGFR comprende las regiones determinantes de complementariedad de cetuximab.
11. Una proteína de fusión de inmunoglobulina con SIRPa que comprende:
un anticuerpo anti-EGFR o parte de unión a antígeno del mismo; y
un dominio extracelular de IgV de SIRPa o de una variante de SIRPa que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80 % idéntica a los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 6 o a los restos 1-114 de la SEQ ID NO: 8, en donde
(i) la variante de SIRPa comprende una modificación en un aminoácido en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 6, 27, 31, 37, 54, 56, 66 o 72 de la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8, en donde la modificación es una sustitución seleccionada del grupo que consiste en: V6I; V27I; A27I; I31R; I31T; Q37W; Q37H; E54P; H56P; S66Q; L66Q; y M72R, y/o
(ii) la variante de SIRPa comprende una modificación en un aminoácido en una posición correspondiente a la posición 37 de la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8 donde la sustitución es Q37W.
12. La proteína de fusión de inmunoglobulina con SIRPa de la reivindicación 11, en donde
(i) el anticuerpo anti-EGFR comprende la región variable de cadena pesada y región variable de cadena ligera de cetuximab;
(ii) el anticuerpo anti-EGFR comprende las regiones determinantes de complementariedad de cetuximab;
(iii) el anticuerpo anti-EGFR es cetuximab; o
(iv) el anticuerpo anti-EGFR se selecciona del grupo que consiste en cetuximab, panitumumab, nimotuzumab, matuzumab, futuximab, imgatuzumab y necitumumab, opcionalmente en donde el anticuerpo anti-EGFR comprende las regiones determinantes de complementariedad de un anticuerpo seleccionado de cetuximab, panitumumab, nimotuzumab, matuzumab, futuximab, imgatuzumab y necitumumab.
13. La proteína de fusión de inmunoglobulina de la reivindicación 1,
en donde el antígeno de superficie es un antígeno de células tumorales;
en donde la proteína de fusión tiene un % de intensidad de fluorescencia media (IFM) de unión a glóbulos rojos (RBC) de 10 % o menos cuando el % de IFM de unión a RBC para un anticuerpo anti-CD47 está calibrado al 100 %, en donde el anticuerpo anti-CD47 es B6H12/hulgG1; y
en donde la proteína de fusión también se une con un antígeno CD47 en una célula distinta de glóbulo rojo.
14. La proteína de fusión de inmunoglobulina de la reivindicación 13, en donde el dominio extracelular IgV de SIRPa o una variante de SIRPa comprende una secuencia de aminoácidos al menos 85 % idéntica, al menos 90 % idéntica o al menos 95 % idéntica a los restos 3-115 de la SEQ ID NO: 6 o 3-114 de la SEQ ID NO: 8; y/o en donde el dominio extracelular IgV de SIRPa o una variante de SIRPa comprende una secuencia de aminoácidos al menos 85 % idéntica, al menos 90 % idéntica o al menos 95 % idéntica a los restos 1-115 de la SEQ ID NO: 6 o 1-114 de la SEQ ID NO: 8.
15. La proteína de fusión de inmunoglobulina de una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14, en donde el antígeno de células tumorales es EGFR y/o en donde la molécula de inmunoglobulina es un anticuerpo intacto.
16. La proteína de fusión de inmunoglobulina de la reivindicación 15, en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-EGFR, opcionalmente, en donde el anticuerpo anti-EGFR es cetuximab.
17. La proteína de fusión de inmunoglobulina de una cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en donde la proteína de fusión tiene un % de IFM de unión a RBC
(i) de menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 4 %, menos del 3 %, menos del 2 % o menos del 1 %;
(ii) de entre 0-1 %, 0-2 %, 0-3 %, 0-4 %, 1 -2 %, 1 -3 %, 1 -4 %, 2-3 %, 2-4 %, 3-4 %, 5-10 %, 3-7 % o 3-10 %; o (iii) de 5 % o menos, 4 % o menos, 3 % o menos, 2 % o menos o 1 % o menos.
18. La proteína de fusión de inmunoglobulina de una cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en donde la célula distinta de glóbulo rojo es una célula tumoral.
19. Un ácido nucleico o ácidos nucleicos que codifican la proteína de fusión de inmunoglobulina de una cualquiera de las reivindicaciones 1-19.
20. Una célula que comprende el ácido nucleico o ácidos nucleicos de la reivindicación 19.
21. Un método para producir una proteína de fusión de inmunoglobulina manteniendo la célula de la reivindicación 20 en condiciones que permitan la expresión del ácido nucleico o ácidos nucleicos de la reivindicación 19.
22. U na co m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a q u e co m p re n d e u n a ca n tid a d fa rm a c é u tic a m e n te e fica z de la p ro te ín a de fu s ió n de in m u n o g lo b u lin a de u n a c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1-18 y un v e h íc u lo fa rm a c é u tic a m e n te a ce p ta b le .
23. La p ro te ín a de fu s ió n de in m u n o g lo b u lin a de u n a c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 -18 p a ra su uso en el tra ta m ie n to de l c á n c e r en un m a m ífe ro , o p c io n a lm e n te en d o n d e el c á n c e r es de m a m a , c o lo rre c ta l, de p u lm ó n , p a n cre á tico , e n d o m e tria l, o vá rico , g á s trico , de p ró s ta ta , rena l, de l cu e llo u te rin o , m ie lo m a , lin fom a, leuce m ia , de tiro id e s , u te rin o , de v e jig a , n e u ro e n d o c rin o , de c a b e z a y cu e llo , de h íg a do , n a s o fa r ín g e o , te s tic u la r, c á n c e r de p u lm ó n m ic ro c ítico , c á n c e r de pu lm ó n no m ic ro c ítico , m e la n o m a, c á n c e r de p ie l de c é lu la s ba sa les , c á n c e r de p ie l de c é lu la s e sc a m o s a s , d e rm a to fib ro s a rc o m a p ro tu b e ra n te , ca rc in o m a de c é lu la s de M erke l, g lio b la s to m a , g lio m a , sa rco m a , m e s o te lio m a o s ín d ro m e s m ie lo d isp lá s icos .
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