JP2022533418A

JP2022533418A - 抗ｒｏｒ１／抗ｃｄ３二重特異性結合分子

Info

Publication number: JP2022533418A
Application number: JP2021569109A
Authority: JP
Inventors: ワトキンス，ジェフリー・ディー; イェッセン，カティ; コ，ミラ; ランヌッティ，ブライアン; ヴォー，タン－トラン; ワトキンス，ジェー・モンティ
Original assignee: ベロスビオ・インコーポレイテッド
Priority date: 2019-05-23
Filing date: 2020-05-22
Publication date: 2022-07-22
Also published as: CN113874399A; WO2020237173A1; BR112021023026A2; CA3139111A1; MX2021014193A; TW202110887A; KR20220012313A; EP3972999A1; US20220227866A1; AU2020277489A1

Abstract

本発明は、ＲＯＲ１及びＣＤ３に結合する二重特異性結合分子、並びに、癌などの疾患及び状態を治療するためのそれらの使用方法に関する。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年５月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／８５２，０３９号の優先権を主張するものである。その優先権出願の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含んでおり、その配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２０年５月１８日に作成された配列表の電子コピーは、０２４６５１＿ＷＯ００４＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、そして、サイズは２５８，８４４バイトである。

受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）は、そのリガンドである分泌糖タンパク質Ｗｎｔ５ａからのシグナルを媒介する細胞表面タンパク質である。胚発生中の幹細胞の運命に影響を与えることにおけるその役割と一致して、ＲＯＲ１発現は、胚の転写プログラムに戻る浸潤性悪性腫瘍で観察されるが、正常な成人組織では観察されず、このことは、治療標的として好ましい選択性プロフィールを提供する。ＲＯＲ１は、一般に、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ芽球性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）及びリヒター形質転換又はリヒター症候群（ＲＳ）を患っている患者の悪性細胞において発現される。ＲＯＲ１は、多様な固形腫瘍の細胞表面にも存在し、ここで、ＲＯＲ１は、癌幹細胞のマーカーであるように見える。それは、健康な成人組織では感知できるレベルまでは発現されないが、多種多様な血液腫瘍及び固形腫瘍において高レベルの発現を示すので、ＲＯＲ１は、腫瘍特異的治療に対する魅力的な標的である。

分化抗原群３（ＣＤ３）は、Ｔ細胞受容体複合体（ＴＣＲ）に関連してＴ細胞上に発現される多量体タンパク質複合体であり、そして、Ｔ細胞活性化に必要である。機能的ＣＤ３は、４つの異なる鎖（イプシロン、ガンマ、デルタ、及び、ゼータ）のうちの２つが二量体会合して、以下の３種の二量体対（ガンマ／イプシロン、デルタ／イプシロン、及び、ゼータ／ゼータ）のいずれか１つになることで形成される。ＣＤ３に対する抗体は、Ｔ細胞上でＣＤ３をクラスター化し、それによって、Ｔ細胞の活性化を引き起こすことが示されている。従って、抗ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞の活性化を包含する治療目的のために提案されてきた。例えば、ＣＤ３と標的抗原に結合することができる二重特異性抗体は、標的抗原を発現する組織及び細胞に対するＴ細胞免疫応答を標的とすることを包含する治療用途のために提案されてきた。ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）であるブリナツモマブが最近承認されたことによって、このアプローチが有効になった。

二重特異性結合分子については、多くのフォーマット及び組成物が記載されている。ＰＫ、標的抗原エピトープ、抗原結合成分の相対的親和性並びにパラトープの結合価及び空間構成など、さまざまな変数がこれらの分子のインビボ効力に影響を与える。現在、ＲＯＲ１とＣＤ３の両方に特異的に結合する抗体などの二重特異性結合分子に関するこれら全てのパラメーターを最適化する単一分子を先験的に設計するための信頼できる方法は存在しない。これらのパラメーターのうちの多くのものの影響を体系的に評価し、癌治療などの治療用途にとって最適な二重特異性結合分子を選択するためには、二重特異性構築物を設計すること、製造すること及び試験することが必要である。

上記に鑑みて、ＲＯＲ１抗原の腫瘍特異性をリダイレクトされたＴ細胞の強力な活性と組み合わせる、改善された新規癌治療法が求められている。

本発明は、ＲＯＲ１とＣＤ３を標的とする新規二重特異性結合分子、並びに、これらの抗体のうちの１種以上を含んでいる医薬組成物、並びに、癌を治療するための該抗体及び医薬組成物の使用を対象とする。抗体治療を包含する現在利用可能な癌治療と比較して、本発明の二重特異性結合分子は、優れた臨床応答を提供し得ると予期される。

一部の実施形態では、本開示は、ヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインに特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン及びヒトＣＤ３の細胞外ドメインに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含んでいる二重特異性結合分子を提供する。

特定の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、ヒトＲＯＲ１への結合について配列番号８２に記載されている重鎖アミノ酸配列及び配列番号８３に記載されている軽鎖アミノ酸配列を含んでいる抗体と競合するか、又は、該抗体と同じヒトＲＯＲ１のエピトープに結合する。特定の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、以下のものを含んでいる：
（ａ）それぞれ配列番号９７、６１、６２、６３、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいる重鎖（Ｈ）－ＣＤＲ１－３及び軽鎖（Ｌ）－ＣＤＲ１－３；
（ｂ）それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３；
（ｃ）配列番号７２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでいる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号７３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（ｄ）配列番号７４のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
（ｅ）配列番号７２のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
（ｆ）配列番号８４のアミノ酸配列を含んでいる重鎖（ＨＣ）及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖（ＬＣ）；
（ｇ）配列番号８２のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
（ｈ）配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；又は、
（ｉ）配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ。

特定の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、ヒトＣＤ３への結合について以下のものを含んでいる抗体と競合するか、又は、該抗体と同じヒトＣＤ３のエピトープに結合する：
（ａ）配列番号７０のアミノ酸配列を含んでいる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号７１のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（ｂ）配列番号６６のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；又は、
（ｃ）配列番号６８のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号６９のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ。特定の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは以下のものを含んでいる：
（ａ）それぞれ配列番号５４、５５、５６、５７、５８及び５９のアミノ酸配列を含んでいる重鎖（Ｈ）－ＣＤＲ１－３及び軽鎖（Ｌ）－ＣＤＲ１－３；
（ｂ）それぞれ配列番号４７、４８、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３；
（ｃ）それぞれ配列番号４７、５３、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＧＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３；
（ｄ）配列番号７０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでいる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号７１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（ｅ）配列番号６６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号６７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
（ｆ）配列番号６８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号６９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
（ｇ）配列番号７０のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号７１のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
（ｈ）配列番号６６のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
（ｉ）配列番号６８のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号６９のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
（ｊ）配列番号８０のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
（ｋ）配列番号７６のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；又は、
（ｌ）配列番号７８のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ。

一部の実施形態では、本開示は、以下のものを含んでいる二重特異性結合分子を提供する：
（ａ）それぞれ配列番号９７、６１、６２、６３、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいる重鎖（Ｈ）－ＣＤＲ１－３及び軽鎖（Ｌ）－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号５４、５５、５６、５７、５８及び５９のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｂ）それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号５４、５５、５６、５７、５８及び５９のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｃ）それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号４７、５３、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｄ）それぞれ配列番号９７、６１、６２、６３、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号４７、４８、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｅ）それぞれ配列番号９７、６１、６２、６３、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号４７、５３、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；又は、
（ｆ）それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号４７、４８、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン。

一部の実施形態では、本開示は、以下のものを含んでいる二重特異性結合分子を提供する：
（ａ）それぞれ配列番号７４及び７３のアミノ酸配列を含んでいる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｂ）それぞれ配列番号７２及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｃ）それぞれ配列番号７２及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｄ）それぞれ配列番号７４及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｅ）それぞれ配列番号７４及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；又は、
（ｆ）それぞれ配列番号７２及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン。

一部の実施形態では、本開示は、以下のものを含んでいる二重特異性結合分子を提供する：
（ａ）それぞれ配列番号７４及び７３のアミノ酸配列を含んでいる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｂ）それぞれ配列番号７２及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｃ）それぞれ配列番号７２及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｄ）それぞれ配列番号７４及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｅ）それぞれ配列番号７４及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；又は、
（ｆ）それぞれ配列番号７２及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン。

一部の実施形態では、本開示は、以下のものを含んでいる二重特異性結合分子を提供する：
（ａ）それぞれ配列番号８４及び８３のアミノ酸配列を含んでいる重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｂ）それぞれ配列番号８２及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｃ）それぞれ配列番号８２及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｄ）それぞれ配列番号８４及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｅ）それぞれ配列番号８４及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｆ）それぞれ配列番号８２及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｇ）配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０７又は１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｈ）配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０６又は１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｉ）配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０６又は１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｊ）配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０７又は１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｋ）配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０７又は１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；又は、
（ｌ）配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０６又は１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン。

一部の実施形態では、本開示は、以下のものを含んでいる二重特異性結合分子を提供する：
（ａ）それぞれ配列番号８４及び８３のアミノ酸配列を含んでいる重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｂ）それぞれ配列番号８２及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｃ）それぞれ配列番号８２及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｄ）それぞれ配列番号８４及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｅ）それぞれ配列番号８４及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｆ）それぞれ配列番号８２及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｇ）配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０７又は１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｈ）配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０６又は１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｉ）配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０６又は１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｊ）配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０７又は１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｋ）配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０７又は１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；又は、
（ｌ）配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０６又は１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン。

特定の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、配列番号１４及び１９、配列番号７及び１９、配列番号７及び１８又は配列番号７及び２３のアミノ酸配列を含んでいる。特定の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、以下のものを含んでいる：
（ａ）配列番号１及び１６のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２及び１６のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３及び１６のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４及び１６のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号５及び１６のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号６及び１６のアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号７及び１７のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号７及び２０のアミノ酸配列；
（ｉ）配列番号７及び２１のアミノ酸配列；
（ｊ）配列番号７及び２２のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号８、９及び１６のアミノ酸配列；
（ｌ）配列番号８、１０及び１６のアミノ酸配列；
（ｍ）配列番号８、１１及び１６のアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号１２、１１及び１６のアミノ酸配列；
（ｏ）配列番号１２、１３及び１６のアミノ酸配列；又は、
（ｐ）配列番号８、１５及び１６のアミノ酸配列。

一部の実施形態では、本明細書中に記載されている二重特異性結合分子は、第１及び第２の抗原結合ドメインについて、以下の結合価のいずれかを有し得る：
（ａ）第１の抗原結合ドメインの結合価は２であり、及び、第２の抗原結合ドメインの結合価は２である；
（ｂ）第１の抗原結合ドメインの結合価は１であり、及び、第２の抗原結合ドメインの結合価は１である；又は、
（ｃ）第１の抗原結合ドメインの結合価は２であり、及び、第２の抗原結合ドメインの結合価は１である。

一部の実施形態では、本明細書中に記載されている二重特異性結合分子は、ヒトＩｇＧ１定常領域を含み得る；該定常領域は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び／又はＧ２３７Ａを含むことができ、ここで、該残基は、ＥＵシステムに従って番号が付けられている。

一部の実施形態では、本明細書中に記載されている二重特異性結合分子の第２の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。

本明細書中に記載されている二重特異性結合分子の一部の実施形態では、第２の抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖アミノ酸配列は、第１の抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖アミノ酸配列に、ペプチドリンカーを介して融合している。特定の実施形態では、該ペプチドリンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９３）のアミノ酸配列を有している。特定の実施形態では、第２の抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖アミノ酸配列は、例えば、以下のものに融合し得る：
（ａ）第１の抗原結合ドメインの軽鎖のカルボキシ末端；又は、
（ｂ）第１の抗原結合ドメインの軽鎖のアミノ末端。

特定の実施形態では、本明細書中に記載されている二重特異性結合分子は、以下の特性のうちの少なくとも１（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２）を有している：
（ａ）ＥＬＩＳＡで測定された固定化ＲＯＲ１のＫ_Ｄが０．５ｎＭ以下である；
（ｂ）ＥＬＩＳＡで測定された可溶性ｂ－ＲＯＲ１のＫ_Ｄが０．４ｎＭ以下である；
（ｃ）それぞれ配列番号８２及び８３の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含んでいる抗体と比較して、ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞及び／又はジャーカット細胞において低減されたインターナリゼーションを示す；
（ｄ）ＰＢＭＣに曝露されたＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞において、１μｇ／ｍＬ以下でＬＤＨ放出を誘発させる；
（ｅ）ＰＢＭＣに曝露されたＪｅＫｏ－１細胞において、１μｇ／ｍＬ以下でＬＤＨ放出を誘発させる；
（ｆ）ＰＢＭＣに曝露されたＭｉｎｏ細胞において、１μｇ／ｍＬ以下でＬＤＨ放出を誘発させる；
（ｇ）ＰＢＭＣに曝露されたＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞において、１μｇ／ｍＬ以下でＬＤＨ放出を誘発させる；
（ｈ）フローサイトメトリーで測定した場合、ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞と共培養したＴ細胞の表面のＣＤ６９を１μｇ／ｍＬ以下でアップレギュレートする；
（ｉ）フローサイトメトリーで測定した場合、ＪｅＫｏ－１細胞と共培養したＴ細胞の表面のＣＤ６９を１μｇ／ｍＬ以下でアップレギュレートする；
（ｊ）フローサイトメトリーで測定した場合、Ｍｉｎｏ細胞と共培養したＴ細胞の表面のＣＤ６９を１μｇ／ｍＬ以下でアップレギュレートする；
（ｋ）フローサイトメトリーで測定した場合、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞と共培養したＴ細胞の表面のＣＤ６９を１μｇ／ｍＬ以下でアップレギュレートする；及び、
（ｌ）Ｊｅｋｏ－１細胞又はＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞と共培養したＴ細胞から、１μｇ／ｍＬ以下で、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１０、ＩＬ－６、ＩＬ－４及びＩＬ－２の放出を誘発させる。

本開示は、さらに、細胞毒性剤にコンジュゲートした本明細書中に記載されている二重特異性結合分子を含んでいるイムノコンジュゲートも提供する。

本開示は、さらに、本明細書中に記載されている二重特異性結合分子及び薬学的に許容される賦形剤を含んでいる医薬組成物も提供する。

本開示は、さらに、１以上の単離された核酸分子も提供し、ここで、該核酸分子は、本明細書中に記載されている二重特異性結合分子の第１の抗原結合ドメインの重鎖及び軽鎖可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）をコードするヌクレオチド配列を含んでおり、並びに、さらに、本明細書中に記載されている二重特異性結合分子の第２の抗原結合ドメインのＶＨ及びＶＬをコードするヌクレオチド配列も含んでいる。一部の実施形態では、該単離された核酸分子は、以下のものを含んでいる：
（ａ）配列番号３７及び４２のヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号３０及び４２のヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号３０及び４１のヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号３０及び４６のヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号２４及び３９のヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号２５及び３９のヌクレオチド配列；
（ｇ）配列番号２６及び３９のヌクレオチド配列；
（ｈ）配列番号２７及び３９のヌクレオチド配列；
（ｉ）配列番号２８及び３９のヌクレオチド配列；
（ｊ）配列番号２９及び３９のヌクレオチド配列；
（ｋ）配列番号３０及び４０のヌクレオチド配列；
（ｌ）配列番号３０及び４３のヌクレオチド配列；
（ｍ）配列番号３０及び４４のヌクレオチド配列；
（ｎ）配列番号３０及び４５のヌクレオチド配列；
（ｏ）配列番号３１、３２及び３９のヌクレオチド配列；
（ｐ）配列番号３１、３３及び３９のヌクレオチド配列；
（ｑ）配列番号３１、３４及び３９のヌクレオチド配列；
（ｒ）配列番号３５、３４及び３９のヌクレオチド配列；
（ｓ）配列番号３５、３６及び３９のヌクレオチド配列；又は、
（ｔ）配列番号３１、３８及び３９のヌクレオチド配列。

本開示は、さらに、本明細書中に記載されている単離された核酸分子を含んでいるベクターも提供する。

本開示は、さらに、宿主細胞も提供し、ここで、該宿主細胞は、本明細書中に記載されている二重特異性結合分子の第１の抗原結合ドメインの重鎖及び軽鎖可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）をコードするヌクレオチド配列を含んでおり、並びに、さらに、本明細書中に記載されている二重特異性結合分子の第２の抗原結合ドメインのＶＨ及びＶＬをコードするヌクレオチド配列も含んでいる。一部の実施形態では、該宿主細胞は、以下のヌクレオチド配列を含んでいる：
（ａ）配列番号３７及び４２；
（ｂ）配列番号３０及び４２；
（ｃ）配列番号３０及び４１；
（ｄ）配列番号３０及び４６；
（ｅ）配列番号２４及び３９；
（ｆ）配列番号２５及び３９；
（ｇ）配列番号２６及び３９；
（ｈ）配列番号２７及び３９；
（ｉ）配列番号２８及び３９；
（ｊ）配列番号２９及び３９；
（ｋ）配列番号３０及び４０；
（ｌ）配列番号３０及び４３；
（ｍ）配列番号３０及び４４；
（ｎ）配列番号３０及び４５；
（ｏ）配列番号３１、３２及び３９；
（ｐ）配列番号３１、３３及び３９；
（ｑ）配列番号３１、３４及び３９；
（ｒ）配列番号３５、３４及び３９；
（ｓ）配列番号３５、３６及び３９；又は、
（ｔ）配列番号３１、３８及び３９。

本発明は、さらに、本明細書中に記載されている二重特異性結合分子を産生する方法も提供し、ここで、該方法は、本明細書中に記載されている宿主細胞を提供すること、該二重特異性結合分子の発現に適した条件下で該宿主細胞を培養すること及び得られた二重特異性結合分子を単離することを含んでいる。

本開示は、さらに、患者の癌を治療する方法も提供し、ここで、該方法は、本明細書中に記載されている二重特異性結合分子を該患者に投与することを含んでいる。さらに、本開示は、患者の癌を治療するための薬剤を製造するための本明細書中に記載されている二重特異性結合分子の使用及び患者の癌の治療において使用するための本明細書中に記載されている二重特異性結合分子も提供する。一部の実施形態では、該癌は、ＲＯＲ１陽性癌である。一部の実施形態では、該癌は、白血病、リンパ腫又は固形腫瘍である。一部の実施形態では、該癌は、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｔ細胞白血病、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、リンパ形質細胞様リンパ腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、多発性骨髄腫、辺縁帯リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫又はリヒター形質転換を受けた非ホジキンリンパ腫である。一部の実施形態では、該癌は、結腸癌、非小細胞肺癌、膠芽腫、肝細胞癌、膵臓癌、ユーイング肉腫、骨肉腫、頭頸部癌、卵巣癌、乳癌又はトリプルネガティブ乳癌である。特定の実施形態では、該患者は、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）阻害薬、Ｂ細胞リンパ腫２（Ｂｃｌ－２）阻害薬、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）阻害薬及び／又はホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害薬などの１以上の追加の治療薬で治療され得る。特定の実施形態では、該追加の治療薬は、イブルチニブ、アカラブルチニブ、ベネトクラクス、エベロリムス、サパニセルチブ又はイデラリシブである。

本開示は、さらに、本明細書中に記載されている二重特異性結合分子を含んでいるキットも提供する。さらに、本開示は、本明細書中に記載されている二重特異性結合分子を含んでいる製品も提供し、ここで、該製品は、患者の癌を治療するのに適している。

図１は、本開示の二重特異性結合分子の例示的な構成を示す概略図である。図２は、ＥＬＩＳＡ（パネルＡ）及びＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ生細胞への結合のフローサイトメトリー分析（パネルＢ）で確認された、親Ａｂ１Ｆａｂ（ＷＴ）及び３つの重鎖変異体（Ａｂ２（Ｔ３２Ａ）、Ａｂ３（Ｔ３２Ｅ）及びＷ１１０Ｙ）のヒトＲＯＲ１への結合を示す一対のグラフである。図３は、長時間洗浄条件を使用するＥＬＩＳＡによって確認された、親Ａｂ１Ｆａｂ（ＷＴ）及び３つの変異体（Ａｂ２（Ｔ３２Ａ）、Ａｂ６（Ｔ３２Ａ（ＨＣ）＋Ａ２５Ｐ（ＬＣ））及びＡｂ７（Ｔ３２Ａ（ＨＣ）＋Ｔ６９Ｒ（ＬＣ）））のヒトＲＯＲ１への結合を示すグラフである。図４は、ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞（パネルＡ）及び対照ＭＥＣ細胞（パネルＢ）への結合のフローサイトメトリー分析によって示される、ＲＯＲ１に対する二重特異性構築物１－３、７－９及び１３－１５の選択性を示す一対のグラフである。非特異的ヒトＩｇＧを対照（「対照」）として含ませた。図５は、二重特異性構築物１－３、７－９及び１３－１５（パネルＡ）、４－６及び１０－１２（パネルＢ）並びに３、９及び１５－２０（パネルＣ）の結合に対するＲＯＲ１発現レベルの影響を示す一連のグラフである。結合は、ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞（約５６，０００コピー／細胞）よりも低いレベルのＲＯＲ１（約１３，０００コピー／細胞）を発現するＪｅＫｏ－１細胞を使用するフローサイトメトリーによって評価した。図６は、ＥＬＩＳＡによって特徴付けられた、固定化されたヒトＲＯＲ１への二重特異性構築物の結合を示す一対のグラフである。図７は、ＥＬＩＳＡによって特徴付けられた、可溶性のビオチン化ヒトＲＯＲ１への二重特異性構築物の結合を示すグラフである。図８は、構築物１（パネルＡ）、構築物７（パネルＢ）及び構築物１３（パネルＣ）と一緒にインキュベートしたＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞に関する、ＲＯＲ１に結合した二重特異性結合分子の細胞表面レベル（「表面ｂｉＡｂ」）、二重特異性結合分子によって結合されていない遊離ＲＯＲ１の細胞表面レベル（「占有されていないエピトープ」）及び総細胞表面ＲＯＲ１（「総ＲＯＲ１」）を示す一連のグラフである。図９は、構築物１９（パネルＡ）及び構築物２０（パネルＢ）と一緒にインキュベートしたＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞に関する、ＲＯＲ１に結合した二重特異性結合分子の細胞表面レベル（「表面ｂｉＡｂ」）、二重特異性結合分子によって結合されていない遊離ＲＯＲ１の細胞表面レベル（「占有されていないエピトープ」）及び総細胞表面ＲＯＲ１（「総ＲＯＲ１」）を示す一対のグラフである。図１０は、２４時間のインキュベーション後のＲＯＲ－１トランスフェクトＭＥＣ細胞の表面上の二重特異性構築物１、７及び１３の定量化を示すグラフである。図１１は、フローサイトメトリー分析によって示された、二重特異性構築物１－６（パネルＡ）、７－１２（パネルＢ）及び１３－１５（パネルＣ）のジャーカット細胞への結合を示す一連のグラフである。非特異的ヒトＩｇＧを対照（「対照」）として含ませた。図１２は、フローサイトメトリー分析によって示された、二重特異性構築物１、７及び１３（パネルＡ）並びに二重特異性構築物３、９及び１５－１０（パネルＢ）のジャーカット細胞への結合を示す一対のグラフである。非特異的ヒトＩｇＧを１つの実験において対照（パネルＡ、「対照」）として含ませ、関連のないＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性構築物（米国特許公開第２０１７／０２３３４７２号）を２番目の実験において対照（パネルＢ、「対照１」）として含ませた。図１３は、ＲＯＲ１の非存在下においてＣＤ３に結合した後のジャーカット細胞の表面上の二重特異性構築物１－３、７－９及び１３－１５のレベルを経時的に定量化しているグラフである。図１４は、ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞からのＬＤＨ放出（パネルＡ）及びＣＤ８^＋細胞上のＣＤ６９の細胞表面レベル（パネルＢ）を定量化している一対のグラフであり、ここで、ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞は、（１）ヒトＰＢＭＣ並びに（２）二重特異性構築物１、３、７、９、１３及び１５並びに対照抗ＣＤ１９／抗ＣＤ３二重特異性結合分子（「ＣＤ１９×ＣＤ３」）と一緒にインキュベートされる。図１５は、ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞からのＬＤＨ放出（パネルＡ）及びＣＤ８^＋細胞上のＣＤ６９の細胞表面レベル（パネルＢ）を定量化している一対のグラフであり、ここで、ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞は、ヒトＰＢＭＣ並びに二重特異性構築物３、９及び１５－２０と一緒にインキュベートされる。図１６は、（１）ＰＢＭＣ並びに（２）二重特異性構築物１－３、７－９及び１３－１５並びに抗ＣＤ１９／抗ＣＤ３二重特異性結合分子対照と一緒にインキュベートされたＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞と非トランスフェクトＭＥＣ細胞の間のＬＤＨ放出を比較しているグラフである。ＬＤＨ放出は、標的細胞を含まないサンプル（「ＰＢＭＣ」）及び二重特異性構築物を含まないサンプル（「ｂｉＡｂ無し」）でも評価される。図１７は、Ｔ細胞上のＣＤ６９レベルを評価している一連のグラフであり、ここで、ＲＯＲ１^－／ＣＤ１９^＋ＭＥＣ細胞（パネルＡ）又はＲＯＲ１^＋／ＣＤ１９^＋ＭＥＣ細胞（パネルＢ）は、（１）Ｔ細胞及び（２）二重特異性構築物７又は対照抗ＣＤ１９／抗ＣＤ３二重特異性結合分子（「ＣＤ１９×ＣＤ３」）と一緒にインキュベートされる。図１８は、ＪｅＫｏ－１細胞からのＬＤＨ放出（パネルＡ）及びＣＤ８^＋細胞上のＣＤ６９の細胞表面レベル（パネルＢ）を定量化している一対のグラフであり、ここで、ＪｅＫｏ－１細胞は、ヒトＰＢＭＣ並びに二重特異性構築物２、３、８、９、１４及び１５と一緒にインキュベートされる。図１９は、ＪｅＫｏ－１細胞からのＬＤＨ放出（パネルＡ）及びＣＤ８^＋細胞上のＣＤ６９の細胞表面レベル（パネルＢ）を定量化している一対のグラフであり、ここで、ＪｅＫｏ－１細胞は、ヒトＰＢＭＣ並びに二重特異性構築物３、７、９及び１５－２０と一緒にインキュベートされる。図２０は、Ｍｉｎｏ細胞からのＬＤＨ放出（パネルＡ）及びＣＤ８^＋細胞上のＣＤ６９の細胞表面レベル（パネルＢ）を定量化している一対のグラフであり、ここで、Ｍｉｎｏ細胞は、ヒトＰＢＭＣ及び二重特異性構築物７－９と一緒にインキュベートされる。図２１は、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞からのＬＤＨ放出（パネルＡ）及びＣＤ８^＋細胞上のＣＤ６９の細胞表面レベル（パネルＢ）を定量化している一対のグラフであり、ここで、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞は、ヒトＰＢＭＣ並びに二重特異性構築物２、３、８、９、１２及び１４と一緒にインキュベートされる。図２２は、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞からのＬＤＨ放出（パネルＡ）及びＣＤ８^＋細胞上のＣＤ６９の細胞表面レベル（パネルＢ）を定量化している一対のグラフであり、ここで、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞は、ヒトＰＢＭＣ並びに二重特異性構築物９、１８及び２０と一緒にインキュベートされる。図２３は、示されている標的細胞並びに二重特異性構築物７、９、１８及び２０（パネルＡ）又は二重特異性構築物９、１８、２０（パネルＢ及びＣ）でＴ細胞が活性化された後のＪｅＫｏ－１細胞（パネルＡ）、ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞（パネルＢ）及び模擬トランスフェクトされたＲＯＲ１^－ＭＥＣ細胞（パネルＣ）からのＴＮＦ－αの放出を定量化している一連のグラフである。模擬トランスフェクトされたＲＯＲ１^－ＭＥＣ細胞（パネルＣ）は、単一濃度（１μｇ／ｍＬ）の二重特異性構築物で処理された。「対照１」は、関連のないＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性構築物である。図２４は、示されている標的細胞並びに二重特異性構築物７、９、１８及び２０（パネルＡ）又は二重特異性構築物９、１８及び２０（パネルＢ及びＣ）でＴ細胞が活性化された後のＪｅＫｏ－１細胞（パネルＡ）、ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞（パネルＢ）及び模擬トランスフェクトされたＲＯＲ１^－ＭＥＣ細胞（パネルＣ）からのＩＦＮ－γの放出を定量化している一連のグラフである。模擬トランスフェクトされたＲＯＲ１^－ＭＥＣ細胞（パネルＣ）は、単一濃度（１μｇ／ｍＬ）の二重特異性構築物で処理された。「対照１」は、関連のないＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性構築物である。図２５は、示されている標的細胞並びに二重特異性構築物７、９、１８及び２０（パネルＡ）又は二重特異性構築物９、１８及び２０（パネルＢ及びＣ）でＴ細胞が活性化された後のＪｅＫｏ－１細胞（パネルＡ）、ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞（パネルＢ）及び模擬トランスフェクトされたＲＯＲ１^－ＭＥＣ細胞（パネルＣ）からのＩＬ－２の放出を定量化している一連のグラフである。模擬トランスフェクトされたＲＯＲ１^－ＭＥＣ細胞（パネルＣ）は、単一濃度（１μｇ／ｍＬ）の二重特異性構築物で処理された。「対照１」は、関連のないＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性構築物である。図２６は、示されている標的細胞並びに二重特異性構築物７、９、１８及び２０（パネルＡ）又は二重特異性構築物９、１８及び２０（パネルＢ及びＣ）でＴ細胞が活性化された後のＪｅＫｏ－１細胞（パネルＡ）、ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞（パネルＢ）及び模擬トランスフェクトされたＲＯＲ１^－ＭＥＣ細胞（パネルＣ）からのＩＬ－４の放出を定量化している一連のグラフである。模擬トランスフェクトされたＲＯＲ１^－ＭＥＣ細胞（パネルＣ）は、単一濃度（１μｇ／ｍＬ）の二重特異性構築物で処理された。「対照１」は、関連のないＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性構築物である。図２７は、示されている標的細胞並びに二重特異性構築物７、９、１８及び２０（パネルＡ）又は二重特異性構築物９、１８及び２０（パネルＢ及びＣ）でＴ細胞が活性化された後のＪｅＫｏ－１細胞（パネルＡ）、ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞（パネルＢ）及び模擬トランスフェクトされたＲＯＲ１^－ＭＥＣ細胞（パネルＣ）からのＩＬ－６の放出を定量化している一連のグラフである。模擬トランスフェクトされたＲＯＲ１^－ＭＥＣ細胞（パネルＣ）は、単一濃度（１μｇ／ｍＬ）の二重特異性構築物で処理された。「対照１」は、関連のないＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性構築物である。図２８は、示されている標的細胞並びに二重特異性構築物７、９、１８及び２０（パネルＡ）又は二重特異性構築物９、１８及び２０（パネルＢ及びＣ）でＴ細胞が活性化された後のＪｅＫｏ－１細胞（パネルＡ）、ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞（パネルＢ）及び模擬トランスフェクトされたＲＯＲ１^－ＭＥＣ細胞（パネルＣ）からのＩＬ－１０の放出を定量化している一連のグラフである。模擬トランスフェクトされたＲＯＲ１^－ＭＥＣ細胞（パネルＣ）は、単一濃度（１μｇ／ｍＬ）の二重特異性構築物で処理された。「対照１」は、関連のないＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性構築物である。図２９は、抗ＲＯＲ１及び抗ＣＤ３抗原結合ドメインの示された配列に関する配列番号を示す表である。

本開示は、ＲＯＲ１及びＣＤ３に結合する新規二重特異性結合分子を提供する。一部の実施形態では、ＲＯＲ１及びＣＤ３への二重特異性結合分子の結合は、Ｔ細胞をＲＯＲ１陽性腫瘍細胞に接近させ、従って、Ｔ細胞の細胞傷害性を呼び起こすことによって癌を治療する。別途示されていない限り、本明細書中で使用されている場合、「ＲＯＲ１」は、ヒトＲＯＲ１を示している。ヒトＲＯＲ１ポリペプチド配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｑ０１９７３－１（ＳＥＱＩＤＮＯ：８９）で入手可能である。別途示されていない限り、本明細書中で使用されている場合、「ＣＤ３」は、ヒトＣＤ３を示している。ＣＤ３は、ガンマ鎖、デルタ鎖及び２つのイプシロン鎖で構成されている。ヒトＣＤ３ガンマポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｕｍｂｅｒＮＰ＿００００６４．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９０）で入手可能である。ヒトＣＤ３デルタポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｕｍｂｅｒＮＰ＿０００７２３．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９１）で入手可能である。ヒトＣＤ３イプシロンポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｕｍｂｅｒＮＰ＿０００７２４．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：９２）で入手可能である。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子の抗原結合ドメインは、抗ＲＯＲ１抗体及び抗ＣＤ３抗体に由来する。用語「抗体」（Ａｂ）又は「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書中で使用されている場合、ジスルフィド結合によって相互連結された２つの重（Ｈ）鎖（約５０－７０ｋＤａ）及び２つの軽（Ｌ）鎖（約２５ｋＤａ）を含んでいる四量体を示し得る。各重鎖は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）で構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されている。該ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分化することができ、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と称されるより保存された領域が点在している。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ（Ｈ－ＣＤＲは本明細書中では重鎖からのＣＤＲを示し；及び、Ｌ－ＣＤＲは本明細書中では軽鎖からのＣＤＲを示す）及び４つのＦＲで構成されており、以下の順序でアミノ末端からカルボキシル末端へと配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。

所与のＣＤＲ又はＦＲの正確なアミノ酸配列境界は、以下のものによって記載されているスキームを包含するいくつかのよく知られているスキームのいずれかを使用して容易に決定することが可能である：Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，５ｔｈＥｄ．，ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉｅｔａｌ．，ＪＭＢ２７３，９２７－９４８（１９９７）（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）；ＭａｃＣａｌｌｕｍｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６）（「コンタクト」番号付けスキーム）；Ｌｅｆｒａｎｃｅｔａｌ．，ＤｅｖＣｏｍｐＩｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５－７７（２００３）（「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）；及び、ＨｏｎｅｇｇｅｒａｎｄＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，ＪＭｏｌＢｉｏｌ，３０９（３）：６５７－７０（２００１）（「Ａｈｏ」番号付けスキーム）。

所与のＣＤＲ又はＦＲの境界は、確認するために使用されるスキームに応じて変化し得る。例えば、Ｋａｂａｔスキームは配列アラインメントに基づいているが、Ｃｈｏｔｈｉａスキームは構造情報に基づいている。ＫａｂａｔスキームとＣｈｏｔｈｉａスキームの両方に関する番号付けは、最も一般的な抗体領域の配列の長さに基づいており、挿入は「３０ａ」などの挿入文字で対応されている。上記２つのスキームでは、特定の挿入と削除（「ｉｎｄｅｌｓ」）を異なる位置に配置するため、番号付けが異なる。コンタクトスキームは、複雑な結晶構造の分析に基づいており、多くの点でＣｈｏｔｈｉａの番号付けスキームと類似している。別途示されていない限り、本明細書中で言及されている抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、コンタクト及びＡｈｏのいずれかの方法に従って確認され得る。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子が由来する抗ＲＯＲ１抗体及び／又は抗ＣＤ３抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、該抗ＲＯＲ１及び／又は抗ＣＤ３抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である。

用語「親和性」は、抗原と、抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は関連する分子（例えば、二重特異性結合分子など）との間の誘引力の尺度を示している。抗原に対する抗体の内因性の誘引性は、典型的には、特定の抗体－抗原相互作用の結合親和性平衡定数（Ｋ_Ｄ）として表される。抗体は、Ｋ_Ｄが≦１ｍＭ（好ましくは、≦１００ｎＭ）である場合、抗原に特異的に結合すると言われる。Ｋ_Ｄ結合親和性定数は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭ）又はバイオレイヤー干渉分光法（Ｂｉｏ－ＬａｙｅｒＩｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）（これは、例えば、ＩＢＩＳＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＩＢＩＳＭＸ９６ＳＰＲシステム又はＦｏｒｔｅＢｉｏ製のＯｃｔｅｔ^ＴＭシステムを使用する）によって、測定することができる。

用語「パラトープ」は、抗体の抗原結合部位（即ち、抗原エピトープを認識してそれに結合する抗体の部分）を示している。

用語「エピトープ」は、本明細書中で使用されている場合、抗体又は関連する分子（例えば、二重特異性結合分子など）に特異的に結合する抗原の一部（決定基）を示している。エピトープ決定基は、一般に、アミノ酸又は炭水化物又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、そして、一般に、特定の三次元構造特性及び特定の電荷特性を有している。エピトープは、「線状」又は「立体配座」であり得る。線状エピトープでは、タンパク質（例えば、抗原）と相互作用する分子（抗体など）との間の相互作用点が、全て、そのタンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に存在している。配座エピトープでは、相互作用点は、一次アミノ酸配列において互いに分離されているタンパク質上のアミノ酸残基全体にわたって存在している。抗原上の所望のエピトープが決定されたら、当技術分野でよく知られている技術を使用してそのエピトープに対する抗体を生成することが可能である。例えば、線状エピトープに対する抗体は、例えば、その線状エピトープのアミノ酸残基を有するペプチドで動物を免疫することによって生成することができる。配座エピトープに対する抗体は、例えば、配座エピトープの関連するアミノ酸残基を含んでいるミニドメインで動物を免疫することによって生成することができる。特定のエピトープに対する抗体は、さらにまた、例えば、目的の標的分子（例えば、ＲＯＲ１又はＣＤ３）又はその関連部分で動物を免疫し、次いで、当該エピトープへの結合についてスクリーニングすることによって生成することができる。

当技術分野で既知の方法（これは、限定するものではないが、競合アッセイ、エピトープビニング及びアラニンスキャニングを包含する）を使用することによって、抗体が、本開示の二重特異性結合分子とＲＯＲ１若しくはＣＤ３の同じエピトープに結合するか、又は、本開示の二重特異性結合分子との結合について競合するかを、確認することができる。一実施形態では、本開示の二重特異性結合分子を飽和条件下でＲＯＲ１又はＣＤ３に結合させることが可能であり、次いで、試験抗体の前記抗原に結合する能力を測定する。該試験抗体が参照二重特異性結合分子と同時に前記抗原に結合することができる場合、その試験抗体は、該参照二重特異性結合分子とは異なるエピトープに結合する。しかしながら、該試験抗体が同時に抗原に結合することができない場合、その試験抗体は、同じエピトープ、重複するエピトープ又は本開示の二重特異性結合分子によって結合されるエピトープに近接しているエピトープに結合する。この実験は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ^ＴＭ、ＳＰＲ、バイオレイヤー干渉法又はフローサイトメトリーを使用して、実施することができる。本開示の二重特異性結合分子がＲＯＲ１又はＣＤ３への結合に関して別の抗体と交差競合するかどうかを試験するために、上記で記載した競合方法を２つの方向で使用することができる。即ち、既知の抗体が該試験抗体をブロックするかどうか及びその逆について確認する。このような交差競合実験は、例えば、ＩＢＩＳＭＸ９６ＳＰＲ機器又はＯｃｔｅｔ^ＴＭシステムを使用して、実施することができる。

抗体の「抗原結合部分」又は「抗原結合フラグメント」という用語は、本明細書中で使用されている場合、抗原（例えば、ヒトＲＯＲ１若しくはＣＤ３又はそれらの一部）に特異的に結合する能力を保持している抗体の１以上の部分又はフラグメントを示している。全長抗体の特定のフラグメントがその抗体の抗原結合機能を果たすことが可能であることが示されている。用語「抗原結合部分」に包含される結合フラグメントの例としては、以下のものを挙げることができる：（ｉ）Ｆａｂフラグメント：Ｖ_Ｌドメイン、Ｖ_Ｈドメイン、Ｃ_Ｌドメイン及びＣ_Ｈｌドメインで構成されている一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント：ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含んでいる二価フラグメント；（ｉｉｉ）Ｖ_ＨドメインとＣ_Ｈｌドメインで構成されているＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体のシングルアームのＶ_Ｌドメイン及びＶ_Ｈドメインで構成されるＦｖフラグメント；（ｖ）Ｖ_ＨドメインからなるｄＡｂフラグメント；及び、（ｖｉ）抗原に特異的に結合することが可能な単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン（Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈ）は別々の遺伝子によってコードされているが、それらは、組換え法を使用して、それらをＶ_ＬドメインとＶ_Ｈドメインが対になっている単一のタンパク質鎖として作成することができる合成リンカーによって結合させて一価の分子（単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）として知られている）を形成させることができる。さらにまた、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌを含んでいる抗原結合分子も本開示の範囲内にある。Ｖ_Ｈの場合、該分子は、さらに、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域又はＣＨ３領域のうちの１以上も含み得る。そのような一本鎖抗体はさらに、抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に含まれることも意図されている。ダイアボディなどの単鎖抗体の他の形態も包含される。ダイアボディは、二価の二重特異性抗体であり、ここで、Ｖ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインは単一のポリペプチド鎖において発現されるが、ただし、同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用しており、それによって、そのドメインを別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、２つの抗原結合部位を作る。

別途示されていない限り、本開示において言及されている全ての抗体アミノ酸残基番号は、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ番号付けスキーム（ＨｏｎｅｇｇｅｒａｎｄＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，ＪＭｏｌＢｉｏｌ，３０９（３）：６５７－７０（２００１））（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ及びＰｌｕｋｋｔｈｕｎ、ＪＭｏｌＢｉｏｌ、３０９（３）：６５７－７０（２００１））に従うものである。

抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性結合分子
本開示は、ヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインに特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン及びヒトＣＤ３の細胞外ドメインに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含んでいる二重特異性結合分子に関する。

一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、ＲＯＲ１タンパク質の細胞外部分におけるエピトープ（例えば、免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン及びＫｒｉｎｇｌｅドメインのうちの１つ以上におけるエピトープ）に結合する。特定の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号９４又は９５に示されているＲＯＲ１のアミノ酸配列（コンジュゲーションの便宜のために付加される末端システインを含んでいない）に結合する。

一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、ヒトＲＯＲ１への結合についてＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／３２５７２に記載されている抗ＲＯＲ１抗体と競合するか、及び／又は、該抗体と同じヒトＲＯＲ１のエピトープに結合する。一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、ヒトＲＯＲＩへの結合について配列番号８２に記載されている重鎖アミノ酸配列及び配列番号８３に記載されている軽鎖アミノ酸配列を含んでいる抗体（「Ａｂ１」）と競合するか、及び／又は、該抗体と同じヒトＲＯＲ１のエピトープに結合する。

一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号８２のアミノ酸配列における重鎖（Ｈ）－ＣＤＲ１－３及び配列番号８３のアミノ酸配列における軽鎖（Ｌ）－ＣＤＲ１－３を含んでおり、ここで、該ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＩＭＧＴ法若しくはコンタクト法又はそれらの任意の組み合わせによって確認される。

一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、以下のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる：
・それぞれ、配列番号６０、６１、６２、６３、６４及び６５；
・それぞれ、配列番号９７、６１、６２、６３、６４及び６５；
・それぞれ、配列番号９８、６１、６２、６３、６４及び６５；
・それぞれ、配列番号６０、６１、６２、９９、６４、６５；
・それぞれ、配列番号６０、６１、６２、６３、１０２、６５；
・それぞれ、配列番号９７、６１、６２、９９、６４、６５；
・それぞれ、配列番号９７、６１、６２、６３、１０２、６５；
・それぞれ、配列番号９８、６１、６２、９９、６４、６５；又は、
・それぞれ、配列番号９８、６１、６２、６３、１０２、６５。

一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号７２と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含んでいる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号７３と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含んでいる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでいる。

一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、以下のものを含んでいる：
・配列番号７２のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
・配列番号７４のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
・配列番号７５のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
・配列番号７２のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号１００のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
・配列番号７２のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号１０３のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
・配列番号７４のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号１００のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
・配列番号７４のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号１０３のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
・配列番号７５のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号１００のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；又は、
・配列番号７５のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号１０３のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ。

一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号８２と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含んでいる重鎖（ＨＣ）及び配列番号８３と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含んでいる軽鎖（ＬＣ）を含んでいる。

一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、以下のものを含んでいる：
・配列番号８２のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号８４のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号８５のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号８２のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号８２のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号８４のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号８４のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号８５のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；又は、
・配列番号８５のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ。

特定の実施形態では、ＨＣ配列は、エフェクター機能を低減又は排除するように修飾される。例えば、ＨＣ配列のＩｇＧ１部分は、「ＬＡＬＡ」（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）又は「ＬＡＬＡＧＡ」（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ）突然変異を含むことができる（ここで、全ての残基は、ＥＵ番号付けスキームに従って番号付けされる）。

一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、以下のものを含んでいる：
・配列番号７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号１４のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号１０５のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号１４のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号１４のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号１０５のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；又は、
・配列番号１０５のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ。

一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、以下のものを含んでいる：
・配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号８８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号８８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；又は、
・配列番号８８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ。

一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、以下のものを含んでいる：
・配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号８８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
・配列番号８８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；又は、
・配列番号８８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ。

一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、該６つのＣＤＲ、該重鎖及び軽鎖可変ドメイン及び／又はＰＣＴ／ＵＳ２０１３／３２５７２に記載されている抗ＲＯＲ１抗体の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含んでいる。

一部の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、「Ｔｕｎｎａｃｌｉｆｆｅｅｔａｌ．，ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１：５４６－５５０（１９８９））」において定義されているＣＤ３のグループＩ又はグループＩＩエピトープに結合する。

一部の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、ヒトＣＤ３への結合について抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３又はＳＰ３４と競合するか、及び／又は、該抗体と同じヒトＣＤ３のエピトープに結合する。一部の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、ヒトＣＤ３への結合について以下のものを含んでいる抗体と競合するか、及び／又は、該抗体と同じヒトＣＤ３のエピトープに結合する：
・配列番号６６のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
・配列番号６８のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号６９のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；又は、
・配列番号７０のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号７１のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ。

一部の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、以下のアミノ酸配列内にＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる：
・それぞれ、配列番号６６及び６７；
・それぞれ、配列番号６８及び６９；又は、
・それぞれ、配列番号７０及び７１；
ここで、該ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＩＭＧＴ法若しくはコンタクト法又はそれらの任意の組み合わせによって確認される。

一部の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、以下のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる：
・それぞれ、配列番号４７、４８、４９、５０、５１及び５２、
・それぞれ、配列番号４７、５３、４９、５０、５１及び５２；又は、
・それぞれ、配列番号５４、５５、５６、５７、５８及び５９。

一部の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、以下のものを含んでいる：
・配列番号６６と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号６７と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
・配列番号６８と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号６９と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；又は、
・配列番号７０と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号７１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含んでいるＶＬ。

一部の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、以下のものを含んでいる：
・配列番号６６のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
・配列番号６８のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号６９のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
・配列番号７０のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号７１のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
・配列番号７６のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
・配列番号７８のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；又は、
・配列番号８０のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ。

一部の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、該６つのＣＤＲ及び／又は米国特許公開第２０１８／０１１２０１１号に記載されている抗ＣＤ３抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインを含んでいる。

本開示は、さらに、上記で記載した第１及び第２の抗原結合ドメインの任意の組み合わせも企図する。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、以下のものを含んでいる：
・それぞれ配列番号９７、６１、６２、６３、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号５４、５５、５６、５７、５８及び５９のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号５４、５５、５６、５７、５８及び５９のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号４７、５３、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号９７、６１、６２、６３、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号４７、４８、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号９７、６１、６２、６３、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号４７、５３、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号４７、４８、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号９８、６１、６２、６３、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号５４、５５、５６、５７、５８及び５９のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号９８、６１、６２、６３、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号４７、４８、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号９８、６１、６２、６３、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号４７、５３、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号６０、６１、６２、９９、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号５４、５５、５６、５７、５８及び５９のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号６０、６１、６２、９９、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号４７、４８、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号６０、６１、６２、９９、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号４７、５３、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、１０２及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号５４、５５、５６、５７、５８及び５９のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、１０２及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号４７、４８、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、１０２及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号４７、５３、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号９７、６１、６２、９９、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号５４、５５、５６、５７、５８及び５９のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号９７、６１、６２、９９、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号４７、４８、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号９７、６１、６２、９９、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号４７、５３、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号９７、６１、６２、６３、１０２及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号５４、５５、５６、５７、５８及び５９のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号９７、６１、６２、６３、１０２及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号４７、４８、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号９７、６１、６２、６３、１０２及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号４７、５３、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号９８、６１、６２、９９、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号５４、５５、５６、５７、５８及び５９のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号９８、６１、６２、９９、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号４７、４８、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号９８、６１、６２、９９、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号４７、５３、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号９８、６１、６２、６３、１０２及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号５４、５５、５６、５７、５８及び５９のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号９８、６１、６２、６３、１０２及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号４７、４８、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；又は、
・それぞれ配列番号９８、６１、６２、６３、１０２及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号４７、５３、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、以下のものを含んでいる：
・それぞれ配列番号７４及び７３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７２及び７３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７２及び７３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７４及び７３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７４及び７３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７２及び７３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７５及び７３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７５及び７３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７５及び７３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７２及び１００のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７２及び１００のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７２及び１００のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７２及び１０３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７２及び１０３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７２及び１０３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７４及び１００のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７４及び１００のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７４及び１００のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７４及び１０３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７４及び１０３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７４及び１０３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７５及び１００のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７５及び１００のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７５及び１００のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７５及び１０３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７５及び１０３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；又は、
・それぞれ配列番号７５及び１０３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％）同一であるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、以下のものを含んでいる：
・それぞれ配列番号７４及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７２及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７２及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７４及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７４及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７２及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７５及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７５及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７５及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７２及び１００のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７２及び１００のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７２及び１００のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７２及び１０３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７２及び１０３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７２及び１０３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７４及び１００のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７４及び１００のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７４及び１００のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７４及び１０３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７４及び１０３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７４及び１０３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７５及び１００のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７５及び１００のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７５及び１００のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７５及び１０３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７５及び１０３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；又は、
・それぞれ配列番号７５及び１０３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、以下のものを含んでいる：
・それぞれ配列番号８４及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号８２及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号８２及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号８４及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号８４及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号８２及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号８５及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号８５及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号８５及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号８２及び１０１のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号８２及び１０１のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号８２及び１０１のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号８２及び１０４のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号８２及び１０４のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号８２及び１０４のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号８４及び１０１のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号８４及び１０１のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号８４及び１０１のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号８４及び１０４のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号８４及び１０４のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号８４及び１０４のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号８５及び１０１のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号８５及び１０１のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号８５及び１０１のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号８５及び１０４のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号８５及び１０４のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；又は、
・それぞれ配列番号８５及び１０４のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン。

特定の実施形態では、ＨＣ配列は、エフェクター機能を低減又は排除するように修飾される。例えば、ＨＣ配列のＩｇＧ１部分は、Ｌ２３５Ｅ、「ＬＡＬＡ」（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）又は「ＬＡＬＡＧＡ」（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ）突然変異を含むことができる（ここで、全ての残基は、ＥＵ番号付けスキームに従って番号付けされる）。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、以下のものを含んでいる：
・それぞれ配列番号１４及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号１４及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号１４及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号１０５及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号１０５及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号１０５及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７及び１０１のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７及び１０１のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７及び１０１のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７及び１０４のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７及び１０４のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号７及び１０４のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号１４及び１０１のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号１４及び１０１のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号１４及び１０１のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号１４及び１０４のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号１４及び１０４のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号１４及び１０４のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号１０５及び１０１のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号１０５及び１０１のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号１０５及び１０１のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号１０５及び１０４のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・それぞれ配列番号１０５及び１０４のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；又は、
・それぞれ配列番号１０５及び１０４のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、以下のものを含んでいる：
・配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；又は、
・配列番号８８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、以下のものを含んでいる：
・配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１又は８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
・配列番号８８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７又は７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；又は、
・配列番号８８のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９又は７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、以下のものを含んでいる：
・配列番号１及び１６のアミノ酸配列；
・配列番号２及び１６のアミノ酸配列；
・配列番号３及び１６のアミノ酸配列；
・配列番号４及び１６のアミノ酸配列；
・配列番号５及び１６のアミノ酸配列；
・配列番号６及び１６のアミノ酸配列；
・配列番号７及び１７のアミノ酸配列；
・配列番号７及び１８のアミノ酸配列；
・配列番号７及び１９のアミノ酸配列；
・配列番号７及び２０のアミノ酸配列；
・配列番号７及び２１のアミノ酸配列；
・配列番号７及び２２のアミノ酸配列；
・配列番号８、９及び１６のアミノ酸配列；
・配列番号８、１０及び１６のアミノ酸配列；
・配列番号８、１１及び１６のアミノ酸配列；
・配列番号１２、１１及び１６のアミノ酸配列；
・配列番号１２、１３及び１６のアミノ酸配列；
・配列番号１４及び１９のアミノ酸配列；
・配列番号８、１５及び１６のアミノ酸配列；又は、
・配列番号７及び２３のアミノ酸配列。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、上記で記載した１又は２の第１の抗原結合ドメインを含んでいる。一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、上記で記載した１又は２の第２の抗原結合ドメインを含んでいる。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子における第１の抗原結合ドメインは、１又は２の結合価を有している。一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子における第２の抗原結合ドメインは、１又は２の結合価を有している。第１及び第２の抗原結合ドメインの結合価の任意の組み合わせが意図される；例えば、第１及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれ、２及び２の結合価を有し得る；それぞれ、１及び１の結合価を有し得る；それぞれ、２及び１の結合価を有し得る；又は、それぞれ、１及び２の結合価を有し得る。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ又はＩｇＤ定常領域を含むことができる。特定の実施形態では、該ヒト定常領域は、ＩｇＧイソタイプの定常領域、例えば、ＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ若しくはＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の定常領域である。一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、ヒトκ定常領域を含むことができる。本明細書中に記載されている二重特異性結合分子のクラスは、別のクラス又はサブクラスと変更又は交換することができる。例えば、元々ＩｇＭであった定常領域は、ＩｇＧにクラス変更することができる。さらに、クラス変更を使用して、１つのＩｇＧサブクラスを別のサブクラスに変換することができ、例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ２に変換することができる。κ軽鎖定常領域は、例えば、λ軽鎖定常領域に変更することができる。

特定の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、ヒトＩｇＧ定常領域を含むことができる。特定の実施形態では、該ＩｇＧ定常領域は、エフェクター機能を低減又は排除する突然変異を含み得る（例えば、「Ｗａｎｇｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＣｅｌｌ９（１）：６３－７３（２０１８）」を参照されたい）。例えば、本開示の二重特異性結合分子は、突然変異Ｌ２３５Ｅ、「ＬＡＬＡ」突然変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）又は「ＬＡＬＡＧＡ」突然変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ）を有するヒトＩｇＧ１定常領域を含むことができる（ここで、全て、ＥＵ番号付けスキームに従って番号が付けられている）。

本開示の二重特異性結合分子のクラス（イソタイプ）及びサブクラスは、当技術分野で知られている任意の方法によって確認することができる。一般に、抗体のクラス及びサブクラスは、抗体の特定のクラス及びサブクラスに特異的な抗体を使用して確認することができる。そのような抗体は市販されている。クラス及びサブクラスは、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット及び他の手法で確認することができる。あるいは、クラス及びサブクラスは、当該抗体の重鎖及び／又は軽鎖の定常領域の全部又は一部を配列決定し、それらのアミノ酸配列を免疫グロブリンのさまざまなクラス及びサブクラスの既知アミノ酸配列と比較し、当該抗体のクラス及びサブクラスを確認することによって、決定することができる。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、ホモ二量体である。一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、ヘテロ三量体（重鎖ヘテロ二量体と組み合わされた軽鎖）であり、ここで、その重鎖ヘテロ二量体は、例えば、「ＢｒｉｎｋｍａｎｎａｎｄＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，ＭＡＢＳ９：１８２－２１２（２０１７）」に記載されているフォーマットにある。例えば、「ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ」、ＨＡ－ＴＦ、ＺＷ１、ＣＨ３電荷ペア、ＥＷ－ＲＶＴ、ＬＵＺ－Ｙ、「ＳｔｒａｎｄＥｘｃｈａｎｇｅＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＤｏｍａｉｎｂｏｄｙ」（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）、「Ｂｉｃｌｏｎｉｃ、ＤｕｏＢｏｄｙ」、ＢＥＡＴ、７．８．６０、２０．８．３４、Ｔｒｉｏｍａｂ／Ｑｕａｄｒｏｍａ又はＣｒｏｓｓＭＡｂ戦略を使用して、本開示の二重特異性結合分子の構造内の免疫グロブリンのＦｃ領域を含んでいるポリペプチドのヘテロ二量体化（例えば、ホモ二量体化を超えて）を促進することができる。特定の実施形態では、「ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ」アプローチを使用することができ、ここで、ドメインの「ｋｎｏｂ」変異体は、小さな側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、トレオニン又はバリン）をより大きな側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることによって得られる。ドメインの「ｈｏｌｅ」変異体は、大きな側鎖を有するアミノ酸（例えば、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン又はトリプトファン）をより小さな側鎖を持つ別のアミノ酸（例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、トレオニン又はバリン）で置き換えることによって得られる。特定の実施形態では、ｋｎｏｂ及び／又はｈｏｌｅの突然変異は、ＣＨ３ドメイン内にある。

一部の実施形態では、抗ＲＯＲ１抗体の抗原結合フラグメント及び／又は抗ＣＤ３抗体の抗原結合フラグメントは、本開示の二重特異性結合分子を作製する際に使用することができる。抗体フラグメントの例としては、限定するものではないが、以下のものを挙げることができる：Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；組換えＩｇＧ（ｒｌｇＧ）フラグメント；ダイアボディ；線形抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ又はｓＦｖ）；及び、単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ）。特定の実施形態では、該フラグメントは、可変重鎖領域及び／又は可変軽鎖領域を含んでいる単鎖抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖｓ）である。

特定の実施形態では、第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン又はその両方は、抗体全体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでいる単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であり、ここで、該融合タンパク質は、抗体と同じ抗原特異性を保持している。ＶＨ及びＶＬは、ペプチドリンカーを介して連結され得る。特定の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖである。

単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を作製するために、ＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡフラグメントを可変リンカーをコードする別のフラグメント（例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）４（配列番号：９６）をコードするフラグメント）に動作可能に連結させ、それによって、ＶＨ及びＶＬ配列は、ＶＬ及びＶＨドメインが可変リンカーによって結合された連続的な単鎖タンパク質として発現され得る。単一のＶＨ及びＶＬのみが使用されている場合、該単鎖抗体は一価であり得る；２つのＶＨとＶＬが使用されている場合、２価であり得る；又は、３つ以上のＶＨとＶＬが使用されている場合、多価であり得る。

一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインのアミノ酸配列は、例えばペプチドリンカーを介して、第２の抗原結合ドメインのアミノ酸配列に融合して、融合ポリペプチドを形成する。特定の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、そして、第１の抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖アミノ酸配列に融合している。例えば、第２の抗原結合ドメインは、以下のものに融合し得る：
・第１の抗原結合ドメインの重鎖のアミノ末端；
・第１の抗原結合ドメインの軽鎖のアミノ末端；
・第１の抗原結合ドメインの重鎖のカルボキシ末端；及び／又は
・第１の抗原結合ドメインの軽鎖のカルボキシ末端。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、図１の概略図Ａ－Ｅのいずれかに示されるように構成される。

特定の実施形態では、第１及び第２の抗原結合ドメインをコンジュゲートするペプチドリンカーは、長さが５～３０、５～２５、５～１５、１０～３０、１０～２０又は１０～１５アミノ酸である。特定の実施形態では、該ペプチドリンカーは、ペプチドリンカーの溶解性を可能にするアミノ酸（例えば、セリン及びトレオニン）を含んでいる。特定の実施形態では、該リンカーは帯電していてもよい（例えば、米国特許第９，８５６，３２７号を参照されたい）。特定の実施形態では、該ペプチドリンカーは、ペプチドリンカーの柔軟性を可能にするアミノ酸（例えば、グリシン）又はペプチドリンカーの剛性を可能にするアミノ酸を含んでいる。特定の実施形態では、第１及び第２の抗原結合ドメインをコンジュゲートするペプチドリンカーの配列は、（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）Ｘであり、ここで、Ｘは、１、２、３又は４であり得る（配列番号１１４）。特定の実施形態では、該ペプチドリンカーの配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９３）である。

一部の実施形態では、本明細書中に記載されている第２の抗原結合ドメインは、例えば、二重特異性結合分子の凝集を防止又は低減するために、ジスルフィド結合を安定化させるための１以上の突然変異（例えば、アミノ酸残基がシステインで置き換えられている）を含んでいる。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、ＥＬＩＳＡによって測定される場合、１００ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．００５ｎＭ又は０．００１ｎＭ以下（例えば、０．５ｎＭ以下）の固定化ＲＯＲ１に対するＫ_Ｄを有する。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、ＥＬＩＳＡによって測定される場合、１００ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．００５ｎＭ又は０．００１ｎＭ以下（例えば、０．４ｎＭ以下）の可溶性ｂ－ＲＯＲ１に対するＫ_Ｄを有する。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、ＥＬＩＳＡによって測定される場合、１００ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．００５ｎＭ又は０．００１ｎＭ以下（例えば、５ｎＭ以下）のＣＤ３に対するＫ_Ｄを有する。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、０．９ｎｇ／ｍＬ、０．８ｎｇ／ｍＬ、０．７ｎｇ／ｍＬ、０．６ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、０．４ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．０５ｎｇ／ｍＬ又は０．０１ｎｇ／ｍＬ以下で、ＰＢＭＣに曝露されたＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞においてＬＤＨ放出を誘発させる。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、０．９ｎｇ／ｍＬ、０．８ｎｇ／ｍＬ、０．７ｎｇ／ｍＬ、０．６ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、０．４ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．０５ｎｇ／ｍＬ又は０．０１ｎｇ／ｍＬ以下で、ＰＢＭＣに曝露されたＪｅＫｏ－１細胞においてＬＤＨ放出を誘発させる。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、０．９ｎｇ／ｍＬ、０．８ｎｇ／ｍＬ、０．７ｎｇ／ｍＬ、０．６ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、０．４ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．０５ｎｇ／ｍＬ又は０．０１ｎｇ／ｍＬ以下で、ＰＢＭＣに曝露されたＭｉｎｏ細胞においてＬＤＨ放出を誘発させる。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、０．９ｎｇ／ｍＬ、０．８ｎｇ／ｍＬ、０．７ｎｇ／ｍＬ、０．６ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、０．４ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．０５ｎｇ／ｍＬ又は０．０１ｎｇ／ｍＬ以下で、ＰＢＭＣに曝露されたＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞においてＬＤＨ放出を誘発させる。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、インビトロでＰＢＭＣによる、ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞、ＪｅＫｏ－１細胞、Ｍｉｎｏ細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞又はそれらの任意の組み合わせのＲＯＲ１依存性死滅を誘発させる。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、フローサイトメトリーで測定される場合、５０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、０．９ｎｇ／ｍＬ、０．８ｎｇ／ｍＬ、０．７ｎｇ／ｍＬ、０．６ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、０．４ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．０５ｎｇ／ｍＬ又は０．０１ｎｇ／ｍＬ以下で、ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞と一緒にインキュベートされたＴ細胞の表面上のＣＤ６９をアップレギュレートする。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、フローサイトメトリーで測定される場合、５０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、０．９ｎｇ／ｍＬ、０．８ｎｇ／ｍＬ、０．７ｎｇ／ｍＬ、０．６ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、０．４ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．０５ｎｇ／ｍＬ又は０．０１ｎｇ／ｍＬ以下で、ＪｅＫｏ－１細胞と一緒にインキュベートされたＴ細胞の表面上のＣＤ６９をアップレギュレートする。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、フローサイトメトリーで測定される場合、５０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、０．９ｎｇ／ｍＬ、０．８ｎｇ／ｍＬ、０．７ｎｇ／ｍＬ、０．６ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、０．４ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．０５ｎｇ／ｍＬ又は０．０１ｎｇ／ｍＬ以下で、Ｍｉｎｏ細胞と一緒にインキュベートされたＴ細胞の表面上のＣＤ６９をアップレギュレートする。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、フローサイトメトリーで測定される場合、５０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、０．９ｎｇ／ｍＬ、０．８ｎｇ／ｍＬ、０．７ｎｇ／ｍＬ、０．６ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、０．４ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．０５ｎｇ／ｍＬ又は０．０１ｎｇ／ｍＬ以下で、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞と一緒にインキュベートされたＴ細胞の表面上のＣＤ６９をアップレギュレートする。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、μｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、０．９ｎｇ／ｍＬ、０．８ｎｇ／ｍＬ、０．７ｎｇ／ｍＬ、０．６ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、０．４ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．０５ｎｇ／ｍＬ又は０．０１ｎｇ／ｍＬ以下で、ＪｅＫｏ－１細胞又はＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞と共培養されたＴ細胞からのＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１０、ＩＬ－６、ＩＬ－４及びＩＬ－２の放出を誘発させる。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、以下の特性のうちの少なくとも１つを有する：
（ａ）ＥＬＩＳＡで測定した固定化ＲＯＲ１に対するＫ_Ｄは、０．５ｎＭ以下である；
（ｂ）ＥＬＩＳＡで測定した可溶性ｂ－ＲＯＲ１に対するＫ_Ｄは、０．４ｎＭ以下である；
（ｃ）それぞれ配列番号８２及び８３の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含んでいる抗体と比較して、ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞及び／又はジャーカット細胞におけるインターナリゼーションの低減を示す；
（ｄ）ＰＢＭＣに曝露されたＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞において、１μｇ／ｍＬ以下でＬＤＨ放出を誘発させる；
（ｅ）ＰＢＭＣに曝露されたＪｅＫｏ－１細胞において、１μｇ／ｍＬ以下でＬＤＨ放出を誘発させる；
（ｆ）ＰＢＭＣに曝露されたＭｉｎｏ細胞において、１μｇ／ｍＬ以下でＬＤＨ放出を誘発させる；
（ｇ）ＰＢＭＣに曝露されたＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞において、１μｇ／ｍＬ以下でＬＤＨ放出を誘発させる；
（ｈ）フローサイトメトリーで測定される場合、１μｇ／ｍＬ以下で、ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞と共培養されたＴ細胞の表面上のＣＤ６９をアップレギュレートする；
（ｉ）フローサイトメトリーで測定される場合、１μｇ／ｍＬ以下で、ＪｅＫｏ－１細胞と共培養されたＴ細胞の表面上のＣＤ６９をアップレギュレートする；
（ｊ）フローサイトメトリーで測定される場合、１μｇ／ｍＬ以下で、Ｍｉｎｏ細胞と共培養されたＴ細胞の表面上のＣＤ６９をアップレギュレートする；
（ｋ）フローサイトメトリーで測定される場合、１μｇ／ｍＬ以下で、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞と共培養されたＴ細胞の表面上のＣＤ６９をアップレギュレートする；及び、
（ｌ）１μｇ／ｍＬで、ＪｅＫｏ－１細胞又はＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞と共培養されたＴ細胞からのＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１０、ＩＬ－６、ＩＬ－４及びＩＬ－２の放出を誘発させる。

特定の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、上記特性のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２を有する。特定の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、前記特性の全てを有する。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、ＲＯＲ１陽性細胞に対するＴ細胞の細胞傷害性を誘発させる。

核酸分子及びベクター
本開示は、さらに、本明細書中に記載されている二重特異性結合分子をコードする核酸分子及び配列も提供する。一部の実施形態では、異なる核酸分子は、該二重特異性結合分子を形成する異なるポリペプチドをコードする。別の実施形態では、同じ核酸分子は、該二重特異性結合分子を形成するポリペプチドの２つ以上又は全てをコードする。

ヌクレオチド配列への言及は、別途示されていない限り、その相補体を包含する。従って、特定の配列を有する核酸への言及は、その相補配列を有するその相補鎖を包含するものと理解されるべきである。本明細書中で言及されている用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドのいずれかであっても、又は、いずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態であっても、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドのポリマー形態を意味する。この用語は、一本鎖形態及び二本鎖形態を包含する。

上記実施形態のいずれにおいても、該核酸分子は単離することができる。本明細書中において「単離された」又は「精製された」と称されている核酸分子は、（１）それらの起源のゲノムＤＮＡ又は細胞ＲＮＡの核酸から分離された核酸、及び／又は、（２）自然界には存在しない核酸、である。

一部の実施形態では、本開示の核酸分子は、以下のものをコードするヌクレオチド配列を含んでいる：
・本開示の二重特異性結合分子の第１の抗原結合ドメインのＨ－ＣＤＲ１－３及び／又はＬ－ＣＤＲ１－３；
・本開示の二重特異性結合分子の第２の抗原結合ドメインのＨ－ＣＤＲ１－３及び／又はＬ－ＣＤＲ１－３；
・本開示の二重特異性結合分子の第１の抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬ；
・本開示の二重特異性結合分子の第２の抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬ；及び／又は
・本開示の二重特異性結合分子の第１の抗原結合ドメインのＨＣ及び／又はＬＣ。

一部の実施形態では、本開示の核酸分子は、本開示の二重特異性結合分子の第１の抗原結合ドメインのＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３をコードするヌクレオチド配列を含んでおり、さらに、本開示の二重特異性結合分子の第２の抗原結合ドメインのＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３をコードするヌクレオチド配列を含んでいる。一部の実施形態では、本開示の核酸分子は、本開示の二重特異性結合分子の第１の抗原結合ドメインのＶＨ及びＶＬをコードするヌクレオチド配列を含んでおり、さらに、本開示の二重特異性結合分子の第２の抗原結合ドメインのＶＨ及びＶＬをコードするヌクレオチド配列を含んでいる。一部の実施形態では、本開示の核酸分子は、本開示の二重特異性結合分子の第１の抗原結合ドメインのＨＣ及びＬＣをコードするヌクレオチド配列を含んでおり、さらに、本開示の二重特異性結合分子の第２の抗原結合ドメインのＶＨ及びＶＬをコードするヌクレオチド配列を含んでいる。

一部の実施形態では、本開示の核酸分子は、配列番号２４－４６からなる群から選択される１以上のヌクレオチド配列を含んでいる。

特定の実施形態では、本開示の核酸分子は、以下のものを含んでいる：
・配列番号２４及び３９のヌクレオチド配列；
・配列番号２５及び３９のヌクレオチド配列；
・配列番号２６及び３９のヌクレオチド配列；
・配列番号２７及び３９のヌクレオチド配列；
・配列番号２８及び３９のヌクレオチド配列；
・配列番号２９及び３９のヌクレオチド配列；
・配列番号３０及び４０のヌクレオチド配列；
・配列番号３０及び４１のヌクレオチド配列；
・配列番号３０及び４２のヌクレオチド配列；
・配列番号３０及び４３のヌクレオチド配列；
・配列番号３０及び４４のヌクレオチド配列；
・配列番号３０及び４５のヌクレオチド配列；
・配列番号３１、３２及び３９のヌクレオチド配列；
・配列番号３１、３３及び３９のヌクレオチド配列；
・配列番号３１、３４及び３９のヌクレオチド配列；
・配列番号３５、３４及び３９のヌクレオチド配列；
・配列番号３５、３６及び３９のヌクレオチド配列；
・配列番号３７及び４２のヌクレオチド配列；
・配列番号３１、３８及び３９のヌクレオチド配列；又は、
・配列番号３０及び４６のヌクレオチド配列。

さらなる態様において、本開示は、本明細書中に記載されている二重特異性結合分子を形成する１以上のポリペプチドを発現するのに適したベクターを提供する。用語「ベクター」は、本明細書中で使用されている場合、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。一部の実施形態では、該ベクターは、プラスミド、即ち、追加のＤＮＡセグメントが連結され得るＤＮＡの環状二本鎖断片である。一部の実施形態では、該ベクターはウイルスベクターであり、ここで、追加のＤＮＡセグメントはそのウイルスゲノムに連結され得る。一部の実施形態では、該ベクターは、それらが導入される宿主細胞内において自律的に複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。別の実施形態では、該ベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されるとその宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、それにより、宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが動作可能に連結されている遺伝子の発現を誘導することができる。そのようなベクターは、本明細書中においては、「組換え発現ベクター」（又は、単に「発現ベクター」）と称されている。

一部の実施形態では、本開示の核酸分子は、第２の抗原結合ドメインからのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にインフレームで連結された第１の抗原結合ドメインからのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでいることができる。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、ＤＮＡが転写制御配列及び翻訳制御配列などの必要な発現制御配列に動作可能に連結されるように、該二重特異性結合分子のポリペプチド成分をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入することによって、発現される。発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、植物ウイルス、例えば、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどが包含される。該コード配列は、ベクター内の転写制御配列及び翻訳制御配列が、コード配列の転写及び翻訳を調節するそれらの意図された機能を果たすように、ベクターに連結され得る。該発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合性があるように選択され得る。本開示の二重特異性結合分子の異なるポリペプチド成分をコードするヌクレオチド配列は、同じ又は別個のベクターに挿入することができ、そして、同じ又は異なる発現制御配列（例えば、プロモーター）に動作可能に連結され得る。一実施形態では、２以上のコード配列は、同じ発現ベクターに挿入され、そして、同一の発現制御配列（例えば、共通のプロモーター）に動作可能に連結されることができるか、又は、別個の同じ発現制御配列（例えば、プロモーター）に動作可能に連結されることができるか、又は、異なる発現制御配列（例えば、プロモーター）に動作可能に連結されることができる。該コード配列は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子フラグメント及びベクター上の相補的制限部位のライゲーション、又は、制限部位が存在しない場合は、平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入することができる。

宿主細胞及び二重特異性結合分子生成方法
本開示のさらなる態様は、本開示の二重特異性結合分子を生成させる方法に関する。一部の実施形態では、本明細書中で定義されている二重特異性結合分子を生成させる方法は、該二重特異性結合分子を発現することができる組換え宿主細胞（例えば、本明細書中に記載されている宿主細胞）を提供すること、該二重特異性結合分子の発現に適した条件下で該宿主細胞を培養すること、及び、得られた二重特異性結合分子を単離すること、を含んでいる。

発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当技術分野でよく知られており、そして、そのような哺乳動物細胞株には、「ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ」（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が包含される。これらのものとしては、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞、２９３フリースタイル細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、アフリカングリーンモンキー腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、Ａ５４９細胞及び他の多くの細胞株などがある。使用することができる他の細胞株は、昆虫細胞株（例えば、Ｓｆ９又はＳｆ２１細胞）及び酵母細胞株である。細胞株は、それらの発現レベルに基づいて選択することができる。

一部の実施形態では、本開示の宿主細胞は、以下のものをコードするヌクレオチド配列を含んでいる：
・本開示の二重特異性結合分子の第１の抗原結合ドメインのＨ－ＣＤＲ１－３及び／又はＬ－ＣＤＲ１－３；
・本開示の二重特異性結合分子の第２の抗原結合ドメインのＨ－ＣＤＲ１－３及び／又はＬ－ＣＤＲ１－３；
・本開示の二重特異性結合分子の第１の抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬ；
・本開示の二重特異性結合分子の第２の抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬ；及び／又は、
・本開示の二重特異性結合分子の第１の抗原結合ドメインのＨＣ及び／又はＬＣ。

一部の実施形態では、本開示の宿主細胞は、本開示の二重特異性結合分子の第１の抗原結合ドメインのＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３をコードするヌクレオチド配列を含んでおり、さらに、本開示の二重特異性結合分子の第２の抗原結合ドメインのＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３をコードするヌクレオチド配列を含んでいる。一部の実施形態では、本開示の宿主細胞は、本開示の二重特異性結合分子の第１の抗原結合ドメインのＶＨ及びＶＬをコードするヌクレオチド配列を含んでおり、さらに、本開示の二重特異性結合分子の第２の抗原結合ドメインのＶＨ及びＶＬをコードするヌクレオチド配列を含んでいる。一部の実施形態では、本開示の宿主細胞は、本開示の二重特異性結合分子の第１の抗原結合ドメインのＨＣ及びＬＣをコードするヌクレオチド配列を含んでおり、さらに、本開示の二重特異性結合分子の第２の抗原結合ドメインのＶＨ及びＶＬをコードするヌクレオチド配列を含んでいる。

一部の実施形態では、本開示の宿主細胞は、配列番号２４－４６からなる群から選択される１以上のヌクレオチド配列を含んでいる。

特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、以下のものを含んでいる：
・配列番号２４及び３９のヌクレオチド配列；
・配列番号２５及び３９のヌクレオチド配列；
・配列番号２６及び３９のヌクレオチド配列；
・配列番号２７及び３９のヌクレオチド配列；
・配列番号２８及び３９のヌクレオチド配列；
・配列番号２９及び３９のヌクレオチド配列；
・配列番号３０及び４０のヌクレオチド配列；
・配列番号３０及び４１のヌクレオチド配列；
・配列番号３０及び４２のヌクレオチド配列；
・配列番号３０及び４３のヌクレオチド配列；
・配列番号３０及び４４のヌクレオチド配列；
・配列番号３０及び４５のヌクレオチド配列；
・配列番号３１、３２及び３９のヌクレオチド配列；
・配列番号３１、３３及び３９のヌクレオチド配列；
・配列番号３１、３４及び３９のヌクレオチド配列；
・配列番号３５、３４及び３９のヌクレオチド配列；
・配列番号３５、３６及び３９のヌクレオチド配列；
・配列番号３７及び４２のヌクレオチド配列；
・配列番号３１、３８及び３９のヌクレオチド配列；又は、
・配列番号３０及び４６のヌクレオチド配列。

医薬組成物
本開示の別の態様は、活性成分として（又は、唯一の活性成分として）本開示の二重特異性結合分子を含んでいる医薬組成物である。該医薬組成物は、本明細書中に記載されているような任意の二重特異性結合分子を含むことができる。一部の実施形態では、該組成物は、本明細書中に記載されている癌（例えば、ＲＯＲ１陽性癌）の改善、予防及び／又は治療を目的としている。

一般に、本開示の二重特異性結合分子は、例えば、以下に記載されるように、１種類以上の薬学的に許容される賦形剤と関連する製剤として投与されるのに適している。

用語「賦形剤」は、本明細書において、本開示の化合物以外の任意の成分について記載するために使用される。賦形剤の選択は、特定の投与方法、溶解性及び安定性に対する当該賦形剤の効果並びに投与形態の性質などの要因に大きく依存する。本明細書中で使用されている場合、「薬学的に許容される賦形剤」には、生理学的に適合性のある任意の全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが包含される。薬学的に許容される賦形剤のいくつかの例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、並びに、それらの組み合わせである。多くの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）又は塩化ナトリウムなどを当該組成物に含ませることが好ましい。薬学的に許容される物質のさらなる例は、湿潤剤又は少量の補助物質（例えば、湿潤剤若しくは乳化剤、防腐剤又は緩衝剤）であり、これらは、当該二重特異性結合分子の貯蔵寿命又は有効性を高める。

本開示の医薬組成物及びそれらを調製する方法は、当業者には容易に明らかであろう。それらの調製のためのそのような組成物及び方法は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ（ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，１９９５）」の中に見出すことができる。医薬組成物は、好ましくは、ＧＭＰ（適正製造規範）条件下で製造される。

本開示の医薬組成物は、単一の単位用量として又は複数の単一の単位用量として、バルクで、調製、包装又は販売することができる。本明細書中で使用されている場合、「単位用量」は、所定量の活性成分を含んでいる医薬組成物の個別量である。該活性成分の量は、一般に、対象者に投与されるであろう活性成分の投与量又はそのような投与量の便利な画分（例えば、そのような投与量の２分の１又は３分の１）に等しい。

当技術分野において受け入れられているペプチド、タンパク質又は抗体を投与するための任意の方法を、本開示の二重特異性結合分子に対して適切に利用することができる。

本開示の医薬組成物は、典型的には、非経口投与に適している。本明細書中で使用されている場合、医薬組成物の「非経口投与」は、対象者の組織の物理的破れ及び当該組織におけるその破れを介した医薬組成物の投与を特徴とする任意の投与経路を包含し、かくして、一般に、血流内、筋肉内又は臓器内への直接的な投与をもたらす。従って、非経口投与には、限定するものではないが、医薬組成物を注射することによる該医薬組成物の投与、外科的切開を介して医薬組成物を適用することによる該医薬組成物の投与、及び、組織貫通性の非外科的創傷を介して医薬組成物を適用することによる該医薬組成物の投与などが包含される。特に、非経口投与は、限定するものではないが、以下のものを包含することが意図されている：皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内、静脈内、動脈内、髄腔内、脳室内、尿道内、頭蓋内、腫瘍内及び滑液嚢内への注射又は注入；及び、腎臓透析注入技術。局所潅流も意図されている。特定の実施形態は、静脈内経路及び皮下経路を包含する。

非経口投与（例えば、静脈内投与）に適した医薬組成物の製剤は、典型的には、滅菌水又は滅菌等張食塩水などの薬学的に許容される担体と組み合わされた活性成分を含んでいる。そのような製剤は、ボーラス投与又は連続投与に適した形態で調製、包装又は販売することができる。注射可能な製剤は、単位投与形態で、例えば、アンプル内にある単位投与形態で、又は、防腐剤を含んでいる複数回投与容器内にある単位投与形態で、調製、包装又は販売することができる。非経口投与用の製剤としては、限定するものではないが、懸濁液剤、溶液剤、油性ビヒクル又は水性ビヒクルの中のエマルション剤及びペースト剤などがある。そのような製剤は、さらに、１種類以上のさらなる成分（例えば、限定するものではないが、懸濁化剤、安定剤又は分散剤）を含むことができる。非経口投与用製剤の一実施形態では、活性成分は、再構成された組成物の非経口投与に先だって適切なビヒクル（例えば、無菌のパイロジェンフリー水）で再構成させるための乾燥形態（即ち、粉末形態又は顆粒形態）で提供される。非経口製剤は、塩類、炭水化物及び緩衝剤（好ましくは、ｐＨ３～９にするため）などの賦形剤を含むことができる水溶液剤も包含するが、一部の用途では、それらは、さらに適切には、無菌の非水性溶液として、又は、適切なビヒクル（例えば、無菌のパイロジェンフリー水）と組み合わせて使用される乾燥形態として、製剤することができる。代表的な非経口投与形態としては、無菌水溶液（例えば、プロピレングリコール水溶液又はデキストロース水溶液）の中の溶液又は懸濁液などがある。そのような投与形態は、必要に応じて、適切に緩衝することができる。有用な他の非経口投与可能な（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ－ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｂｌｅ）製剤としては、微結晶形態の活性成分又はリポソーム調製物中の活性成分を含んでいる製剤などがある。非経口投与用の製剤は、即時放出性及び／又は放出調節性であるように製剤することができる。放出調節性製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的化放出及びプログラム放出が包含される。

二重特異性結合分子の治療的使用
一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、患者における癌（例えば、ＲＯＲ１陽性癌）を治療するために使用される。該患者は、哺乳動物、例えば、ヒトであり得る。ＲＯＲ１は、リンパ腫及び固形腫瘍を包含する多くのタイプの腫瘍で発現することが示されている。ヒトの癌の高い割合がＲＯＲ１を発現する。例えば、Ｚｈａｎｇらは、彼らが調べた卵巣癌の５４％、結腸癌の５７％、肺癌の７７％、リンパ腫の９０％、皮膚癌の８９％、膵臓癌の８３％、精巣癌の７３％、膀胱癌の４３％、子宮癌の９６％、前立腺癌の９０％及び副腎癌の８３％が抗ＲＯＲ１抗体４Ａ５で中程度から強程度に染色されたことを示した（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，ＡｍＪＰａｔｈｏｌ．１８１（６）：１９０３－１０（２０１２））。Ｄａｎｅｓｈｍａｎｅｓｈらは、同様に、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）及びヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）におけるＲＯＲ１のほぼ普遍的な発現、並びに、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）／辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び骨髄腫などの他のリンパ系癌におけるＲＯＲ１のさまざまな程度の発現を見いだした（Ｄａｎｅｓｈｍａｎｅｓｈｅｔａｌ．，ＬｅｕｋＬｙｍｐｈｏｍａ５４（４）：８４３－５０（２０１３））。複数のグループが、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）のサブセットにおけるＲＯＲ１の発現を実証した（例えば、「Ｄａｖｅｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＯｎｅ７：ｅ５２６５５（２０１２）」を参照されたい）。ＲＯＲ１は、肝細胞癌（ＨＣＣ）又は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の症例のかなりの割合においても発現する（米国特許公開２０１８／０３６９４０６）。さらに、ＲＯＲ１の発現は、侵攻性癌で増加し、予後不良と相関することが示されている；従って、本開示の二重特異性結合分子は、侵攻性又は進行性の癌を治療するのに特によく適している。

「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」及び「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、生物学的障害及び／又はそれに付随する症状の少なくとも１つを緩和する方法又は無にする方法を示している。本明細書中で使用されている場合、疾患、障害又は状態を「緩和する（ａｌｌｅｖｉａｔｅ）」は、疾患、障害又は状態の症状の重症度及び／又は発生頻度を低減させることを意味する。さらに、本明細書中における「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」への言及は、治癒的、対症的及び予防的治療への言及を含んでいる。癌の治療には、癌の増殖を阻害すること（これは、癌の部分的又は完全な退縮を引き起こすことを包含する）、癌の進行若しくは転移を阻害すること、癌の再発若しくは残存病変を予防すること及び／又は患者の生存期間を延長させることが包含される。

二重特異性結合分子は、本明細書中に記載されている癌に罹患している患者に治療有効量で投与することができる。「治療有効量」は、治療されている疾患の症状のうちの１つ以上をある程度軽減させる、投与されている治療薬の量を示している。治療有効量の抗癌治療薬は、例えば、腫瘍の縮小、生存の増加、癌細胞の排除、疾患の進行の低減、転移の逆転又は医療専門家が望む他の臨床的エンドポイントをもたらし得る。

一部の実施形態では、本明細書中に記載されている二重特異性結合分子によって治療可能な癌は、ＲＯＲ１発現癌（即ち、ＲＯＲ１陽性癌）である。該癌は、遺伝子又はタンパク質の発現を確認する任意の適切な方法（例えば、組織学、フローサイトメトリー、ＲＴ－ＰＣＲ、又は、ＲＮＡ－Ｓｅｑ）によってＲＯＲ１を発現しているものとして確認することができる。当該確認に使用される癌細胞は、腫瘍生検又は循環腫瘍細胞の収集によって得ることができる。特定の実施形態では、フローサイトメトリー又は免疫組織化学などの抗体ベースのアッセイが使用される場合、ＲＯＲ１発現癌は、イソタイプ対照抗体よりも高い抗ＲＯＲ１抗体反応性を示す細胞を有する任意の癌である。特定の実施形態では、ＲＮＡベースのアッセイが使用される場合、ＲＯＲ１発現癌は、陰性対照細胞又はＲＯＲ１を発現しない癌と比較して、より高いレベルのＲＯＲ１ＲＮＡを示す癌である。

特定の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、血液学的悪性腫瘍（例えば、白血病及び／又はリンパ腫）を治療するために使用される。特定の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、固形腫瘍を治療するために使用される。治療対象の癌は、例えば、リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、辺縁細胞Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞性Ｂ細胞リンパ腫、リヒター形質転換を受けた非ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、リンパ形質細胞様リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｔ細胞白血病、肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、腎細胞癌、肝細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、上皮扁平上皮癌、神経膠芽細胞腫、メラノーマ、骨髄腫、多発性骨髄腫、胃癌、脳癌、肺癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌及び頭頸部癌から選択され得る。特定の実施形態では、該癌は、マントル細胞リンパ腫、乳癌、肺癌、骨肉腫及びユーイング肉腫から選択される。

一部の実施形態では、治療対象の癌は、他の治療法に対して難治性である癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌）であり得る。該癌は、例えば、初期段階、中期段階、後期段階又は転移段階であり得る。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子で治療される患者は、事前の癌治療を受けている。別の態様では、該患者は事前の癌治療を受けていない。

本開示の二重特異性結合分子は、追加の治療的処置なしで、即ち、単独の療法（単独療法）として投与することができる。あるいは、本開示の二重特異性結合分子による治療は、少なくとも１種類の付加的な治療的処置を含み得る（併用療法）。一部の実施形態では、二重特異性結合分子は、癌を治療するために、別の薬剤／薬物と同時投与し得るか又は製剤し得る。該追加の治療は、例えば、化学療法、抗腫瘍剤若しくは抗血管新生剤、異なる抗癌抗体及び／又は放射線療法を含み得る。

特定の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、（例えば、本明細書中に記載されている癌を治療するために）追加の治療薬又は生物学的に活性な分子と組み合わせて使用される。生物学的に活性な分子の例としては、限定するものではないが、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子薬、プロドラッグ、炭水化物、造影剤、脂質、ヌクレオシド、放射性核種、オリゴヌクレオチド、毒素、細胞、抗生物質、殺菌剤、抗ウイルス薬、抗炎症薬、抗腫瘍薬、心血管作動薬、抗不安剤、ホルモン、成長因子、ステロイド剤及び微生物由来の毒素などを挙げることができる。一部の実施形態では、該追加の治療薬は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）阻害剤、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）の阻害剤、ホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤、ヤヌスキナーゼ／シグナルトランスデューサー及び転写活性化因子（Ｊａｋ／ＳＴＡＴ）シグナル伝達阻害剤、Ｂ細胞リンパ腫２（Ｂｃｌ－２）阻害剤、脾臓チロシンキナーゼ（ＳＹＫ）阻害剤、微小管阻害剤、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤、ＤＮＡ修復阻害剤、ＤＮＡ架橋剤、ヌクレオシド類似体又は免疫調節剤である。一部の実施形態では、該追加の治療薬は、以下のものである：抗体、例えば、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）又はベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）；ブルトン型チロシンキナーゼ阻害剤例えば、アカラブルチニブ又はイブルチニブ；ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、サパニセルチブ、エベロリムス又はＢＥＺ２３５；ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば、イデラリシブ又はブパルリシブ；Ｊａｋ／ＳＴＡＴシグナル伝達阻害剤、例えば、ルキソリチニブ；Ｂｃｌ－２阻害剤、例えば、ＡＢＴ－１９９／ベネトクラクス、Ｂｃｌ－２ｉ－１又はＢｃｌ－２ｉ－２；ＳＹＫ阻害剤、例えば、フォスタマチニブ；微小管阻害剤、例えば、パクリタキセル又はビンクリスチン；ＥＧＦＲ阻害剤、例えば、エルロチニブ；ＰＡＲＰ阻害剤、例えば、オラパリブ；ＡＬＫ阻害剤、例えば、クリゾチニブ；ＤＮＡ修復阻害剤、例えば、カルボプラチン；ＤＮＡ架橋剤、例えば、オキサリプラチン／シスプラチン；ヌクレオシド類似体、例えば、ゲムシタビン；又は、免疫調節薬（ＩＭｉＤ）、例えば、レナリドミド又はポマリドミド。特定の実施形態では、該追加の治療薬は、イブルチニブ、アカラブルチニブ、ベネトクラクス、Ｂｃｌ－２ｉ－１、Ｂｃｌ－２ｉ－２、エベロリムス、サパニセルチブ、イデラリシブ、パクリチニブ、ブパルリシブ、ＢＥＺ２３５、ルキソリチニブ、フォスタマチニブ、リツキシマブ、リツキシマブ－ＣＨＯＰ、レナリドミド、ポマリドミド、パクリタキセル、ビンクリスチン、エルロチニブ、クリゾチニブ、カルボプラチン、オキサリプラチン／シスプラチン、ベバシズマブ又はゲムシタビンである。

特定の実施形態では、本発明の二重特異性結合分子は、（例えば、本明細書中に記載されている癌を治療するために）患者の免疫系を増強する免疫チェックポイントモジュレーターと組み合わせて使用される。例えば、該コンジュゲートは、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１、これは、Ｂ７－Ｈ１、ＣＤ２７４としても知られている）、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ、ＣＤ２７３）、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、２Ｂ４、Ａ２ａＲ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ２２６、ＣＤ２７６、ＤＲ３、ＧＡＬ９、ＧＩＴＲ、ＨＡＶＣＲ２、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＩＣＯＳ（誘導性Ｔ細胞共刺激因子）、ＫＩＲ、ＬＡＩＲ１、ＬＩＧＨＴ、ＭＡＲＣＯ（コラーゲン構造を有するマクロファージ受容体）、ＰＳ（ホスファチジルセリン）、ＯＸ－４０、ＳＬＡＭ、ＴＩＧＨＴ、ＶＩＳＴＡ、ＶＴＣＮ１又はそれらの任意の組み合わせを標的とする抗体若しくは抗体誘導体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ、アプタマー又はペプチドなどの免疫チェックポイント阻害剤と一緒に使用される。

特定の実施形態では、本開示の二重特異性結合分子は、Ｔ細胞（例えば、患者に対して自系又は同種異系のＴ細胞）と組み合わせて患者に投与される。患者がヒトである特定の実施形態では、Ｔ細胞もヒトである。一部の実施形態では、該二重特異性結合分子は、患者に投与する前にＴ細胞に結合させる。

本開示の二重特異性結合分子を、本明細書中に記載されている治療方法において使用することができること、本明細書中に記載されている治療において使用するためのものであることができること及び／又は本明細書中に記載されている治療のための医薬品の製造において使用することができること、は理解される。本開示は、さらに、本明細書中に記載されている本開示の二重特異性結合分子を含んでいるキット及び製品も提供する。

製品及びキット
本開示は、さらに、本開示の二重特異性結合分子の医薬組成物を含んでいる１つ以上の容器（例えば、シングルユース容器又はマルチユース容器）、場合により付加的な生物学的に活性な分子（例えば、別の治療薬）及び使用説明書を含んでいる製品（例えば、キット）も提供する。該二重特異性結合分子及び場合による追加の生物学的に活性な分子は、非反応性のガラス又はプラスチックから作られたバイアル又はアンプルなどの適切なパッキングに別々に包装することができる。特定の実施形態では、該バイアル又はアンプルには、該二重特異性結合分子及び／又は追加の生物学的に活性な分子を含んでいる凍結乾燥粉末が入れられている。特定の実施形態では、該バイアル又はアンプルには、該二重特異性結合分子又は生物学的に活性な分子の濃縮されたストック（例えば、２倍、５倍、１０倍以上）が入れられている。特定の実施形態では、該製品（例えば、キット）は、該二重特異性結合分子及び／又は生物学的に活性な分子を投与するための医療機器（例えば、注射器及び針）；及び／又は、適切な希釈剤（例えば、滅菌水及び通常の生理食塩水）を含んでいる。本開示は、さらに、前記製品を製造する方法も包含する。

本明細書中において別途定義されていない限り、本開示に関連して使用される科学的用語及び技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものである。代表的な方法及び材料について以下で説明するが、本明細書中に記載されているものと類似又は同等の方法及び材料も、本開示の実施又は試験において使用することができる。矛盾する場合は、定義を含んでいる本明細書が優先される。

一般に、本明細書中に記載されている細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、合成有機化学、医薬品化学並びにタンパク質及び核酸化学並びにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法及びそれらの技術は、当技術分野においてよく知られており、そして、一般的に使用されている。酵素反応及び精製技術は、当技術分野において一般的に達成されるように、又は、本明細書中に記載されているように、製造業者の仕様に従って実施する。

さらに、文脈によって別段の必要がない限り、単数形は複数形を包含し、及び、複数形は単数形を包含するものである。本明細書及び実施形態を通して、「有している（ｈａｖｅ）」及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、又は、「有している（ｈａｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された整数又は整数のグループを含んでいるが、他の任意の整数又は整数のグループを除外はしないということを意味するものと理解される。

本明細書中において言及されている全ての刊行物及び他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。本明細書中では多くの文書が引用されているが、この引用は、これらの文書のいずれかが当技術分野における一般的な知識の一部を形成することを認めるものではない。

本発明がよりよく理解され得るようにするために、以下に実施例を記載する。これらの実施例は、例示することのみを目的としており、決して本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

実施例
以下の実施例は、本発明の代表的な実施形態を例証しており、決して限定することを意味するものではない。

実施例１：抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性結合分子の設計及び発現
複数の変数は、ＰＫ、エピトープ、結合成分の相対的親和性並びにパラトープの結合価及び空間的構成を包含する、二重特異性結合分子のインビボ効力に影響を与える。現在、これら全てのパラメーターを最適化する単一分子を推測的に設計するための信頼できる方法は存在しない。従って、これらのパラメーターの多くが有する影響を体系的に評価するために、複数の抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性構築物を設計し、製造し、及び、試験した。

最適な構成（特に、ＲＯＲ１及びＣＤ３結合成分の最も活性な相対的空間配置）を提供する構造を確認するために、図１に要約されているように、さまざまな構築物を設計した。さまざまな二重特異性フォーマットがすでに記載されているが（例えば、「ＢｒｉｎｋｍａｎｎａｎｄＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，ＭＡＢＳ９：１８２－２１２（２０１７）」を参照されたい）、現在の取り組みは、好ましいＰＫを可能にするために、及び、充分に確立されたプロテインＡに基づく抗体精製アプローチを使用するために、抗体Ｆｃ成分を含んでいるフォーマットに焦点を当てている。

二重特異性結合分子で使用されるＲＯＲ１結合成分は、ヒトＲＯＲ１に対して高度に選択的であることが実証されており、及び、ヒト臨床試験において安全であることが証明されている（例えば、「Ｃｈｏｉｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ２２：９５１－９５９（２０１８）」を参照されたい）。さらに、二重特異性結合分子について、ＳＰ３４及びＯＫＴ３抗体に基づく抗ＣＤ３ｓｃＦｖ配列を使用して、２つの異なるＣＤ３エピトープに特異的なＣＤ３結合成分を用いて試験した。ＣＤ３抗体は、それらのエピトープの異なる特性に基づいて分類されている（Ｔｕｎｎａｃｌｉｆｆｅｅｔａｌ．，ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１：５４６－５５０（１９８９））。このシステムを使用して、ＳＰ３４はグループＩとして分類され、ＯＫＴ３はグループＩＩとして分類される。

特定の構築物について、野生型抗体Ｆｃ配列を使用することで、ＲＯＲ１及びＣＤ３の両方に対して二価である二重特異性構築物の評価が可能になった（図１、Ａ、Ｂ及びＥ）。他の構築物では、Ｆｃ領域内のｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ変異を使用することで、ＲＯＲ１とＣＤ３に対して結合価が異なる二重特異性結合分子の発現が可能になった。例えば、１つの構築物は、ＲＯＲ１に対して二価であり、ＣＤ３に対して一価であり（図１、Ｄ）、一方、別の構築物は、ＲＯＲ１及びＣＤ３の両方に対して一価である（図１、Ｃ）。

最後に、親和性及び結合価が変化したＲＯＲ１パラトープを異なるＣＤ３パラトープと組み合わせて試験して、異なる相対的親和性／アビディティーを有するＣＤ３及びＲＯＲ１パラトープの効果について評価した。

これらの設計パラメーターに基づいて、複数の二重特異性構築物を発現させ、精製し、及び、特性決定を行った。

材料及び方法
配列番号１１０のリーダー配列を有する二重特異性構築物をコードするコドン最適化ＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．４ベクターにクローン化し、次いで、一過性トランスフェクションによってＥｘｐｉ２９３細胞に導入した。該細胞を、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ発現培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号Ａ１４３５１０３）を含んでいる４０ｍＬの培養液中で増殖させた。次いで、ＨｉＴｒａｐＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号１１－００３４－９３）を使用して、抗体をその培養液上清から１段階で精製した。精製された抗体をＰＢＳ（ｐＨ７．２）の中に保存し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで純度を特徴付けした。３つの異なるポリペプチド鎖からなる構築物の純度は、ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷｘｌ７．８ｍｍ×３８０ｍｍカラムを使用したＳＥＣでさらに特徴付けした。移動相は、０．１Ｍリン酸緩衝液、０．１ＭＮａ_２Ｓ_４（ｐＨ６．７）であり、カラムは、０．７ｍＬ／分の流量で実施した。

結果
抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性結合分子の配列は、表１（タンパク質）及び表２（ＤＮＡ）に要約されている。

構築物の大部分は、よく発現し（１７／２０は＞１ｍｇを発現した；１４／２０は＞２ｍｇを発現した）、そして、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定して、殆どの場合、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して単一の段階で実質的に精製された（表３）。

ジスルフィド安定化抗ＣＤ３ｓｃＦｖを含んでいない構築物は、プロテインＡクロマトグラフィーの後で、概してより高純度（＞９０％）であった（表３、構築物２と５を比較する）。

ＳＥＣ分析は、３つの異なるポリペプチド鎖からなる構築物に対して実施した。一般に、単一のプロテインＡ精製段階の後、２つの異なる鎖からなる構築物（野生型Ｆｃ）が、３つの異なる鎖からなる構築物（ヘテロマーＦｃ）よりも高い純度で得られた（表３、サンプル１－３及び７－９の純度をサンプル１３－１７と比較する）。

まとめると、これらのデータは、当該構築物の大部分が良好に発現し、そして、単一のプロテインＡ精製段階の後で＞９０％純粋であることを示している。

実施例２：抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性結合分子のＲＯＲ１への結合
構成、ＲＯＲ１親和性及びＲＯＲ１結合価が異なっている二重特異性結合分子を、細胞毒性に対するこれらのパラメーターの影響を確認するために、ヒトＲＯＲ１への結合について評価した。二重特異性構築物１－２０のヒトＲＯＲ１への結合は、ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞、ＪｅＫｏ－１細胞及び組換えＲＯＲ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を使用して特徴付けた。

材料及び方法
細胞とフローサイトメトリーを使用するＲＯＲ１結合アッセイ
ＲＯＲ１結合は、ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞及びＪｅＫｏ－１細胞の両方を使用して定量化した。各条件に関して、２．５Ｅ５細胞を使用した。該細胞を、２％ＦＢＳを含んでいる５０μＬのＰＢＳの中に入れた。次に、該細胞を被験二重特異性結合分子の等体積の２Ｘストックで希釈した。該細胞と抗体を氷上で２０分間共インキュベートした。次いで、該細胞を３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、１００μＬの抗ヒトＦｃ－ＰＥコンジュゲート抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１２４９９８８２）の中に再懸濁させ、氷上で減光しながら２０分間インキュベートした。次いで、該細胞を３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで２５℃で１０分間固定化した。次いで、該細胞を３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＭｉｌｔｅｎｙｉＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザーで分析した。

組換えＲＯＲ１－ＥＣＤ及びＥＬＩＳＡを使用するＲＯＲ１結合アッセイ
組換えＲＯＲ１への二重特異性結合分子の結合について、２つの異なる構成を使用するＥＬＩＳＡによって評価した。第１の構成では、ＲＯＲ１タンパク質を９６ウェルプレート上に固定化し、そして、該二重特異性構築物を滴定した（詳細は下記）。該二重特異性結合分子は、二重特異性結合分子を９６ウェルプレート上に固定化して可溶性ビオチン化ＲＯＲ１（ｂ－ＲＯＲ１）を滴定する第２の構成を使用して、ＲＯＲ１結合についても特徴付けを行った（詳細は下記）。

固定化ＲＯＲ１ＥＬＩＳＡ
９６ウェルＣｏｓｔａｒ－３３６６プレートを、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍＬのヒトＴＬ１Ａ（ＡｅｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号Ｒ０１－Ｈ５２２Ｙ）を５０μＬ／ウェルで用いて、４℃で一晩コーティングした。そのプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んでいるＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）で１回リンスし、そして、ＰＢＳ中の５％無脂肪乳（５％Ｍ－Ｐ）を１００μＬ／ウェルで用いて２５℃で１時間ブロックした。抗体サンプルを５％Ｍ－Ｐを使用して連続２倍希釈し、２５℃で１時間インキュベートした（５０μＬ／ウェル）。そのプレートをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、５％Ｍ－Ｐで１０，０００倍に希釈した５０μＬ／ウェルの抗ヒトカッパ、ＨＲＰコンジュゲート（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈカタログ番号２０６０－０５）を２５℃で１時間加えた。そのプレートをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、５０μＬ／ウェルの１－ＳｔｅｐＵｌｔｒａＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号３４０２８）で発色させた。２ＮＨ_２ＳＯ_４を添加して反応を停止させ、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダーを使用してＡ４５０を測定した。

可溶性ＲＯＲ１ＥＬＩＳＡ
ＲＯＲ１をビオチン化するために、２００μｇのヒトＲＯＲ１（ＡｅｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号Ｒ０１－Ｈ５２２Ｙ）を２ｍＬの水に再懸濁させて１００μｇ／ｍＬとし、次いで、ＥＺ－ＬｉｎｋＳｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチン（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号２１３２７）と１：５のモル比で合し、２５℃で２時間インキュベートした。３１μＬの７５０ｍＭアルギニン塩酸塩を添加することにより反応を停止させ、４℃で保存した。

可溶性ＲＯＲ１への二重特異性構築物の結合を測定するために、９６ウェルＣｏｓｔａｒ－３３６６プレートを、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトカッパ（ＳｕｔｅｒｎａＢｉｏｔｅｃｈカタログ番号２０６０－０１）を５０μＬ／ウェルで用いて、４℃で一晩コーティングした。そのプレートをＰＢＳ－Ｔで１回リンスし、１００μＬ／ウェルの５％Ｍ－Ｐで２５℃で１時間ブロックし、ＰＢＳ－Ｔで１回リンスし、そして、２μｇ／ｍＬの該二重特異性結合分子を加えて２５℃で１時間インキュベートした。そのプレートをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。ビオチン化ＲＯＲ１を５％Ｍ－Ｐで連続３倍希釈し、２５℃で１時間インキュベートした（５０μＬ／ウェル）。そのプレートをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。ｂ－ＲＯＲ１の結合を検出するために、１％ＢＳＡ－ＰＢＳで１：５０００に希釈した５０μＬ／ウェルのニュートラアビジン－ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号３１０３０）を２５℃で１時間添加した。そのプレートをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、次いで、５０μＬ／ウェルの１－ＳｔｅｐＵｌｔｒａＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号３４０２８）で発色させた。２ＮＨ_２ＳＯ_４を添加して反応を停止させ、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダーを使用してＡ４５０を測定した。

結果
それぞれがＨ－ＣＤＲ２中の単一のアミノ酸によって親抗体とは異なっている３つの抗ＲＯＲ１Ｆａｂ変異体について、ＥＬＩＳＡベースのスクリーニング及び生細胞結合を使用して、ヒトＲＯＲ１への結合について特徴付けを行った。該変異体のうちの２つ、Ｔ３２Ａ及びＴ３２Ｅは、親Ｆａｂよりも高い親和性を示し（図２、パネルＡ、白丸及び白四角対黒丸）、残りの変異体、Ｗ１１０Ｙは、より低い親和性を示した（図２、パネルＡ、三角）。これらの変異体の相対的な親和性について、生きたＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞を使用してさらに特徴付けを行った。ＥＬＩＳＡベースのスクリーニングと同様に、変異体Ｔ３２Ａ及びＴ３２Ｅはより高い親和性を示したが（図２、パネルＢ、白丸及び白四角対黒丸）、Ｗ１１０Ｙは結合が低減した（図２、パネルＢ、三角）。対照の空のベクターをトランスフェクトしたＭＥＣ細胞を使用した場合は変異体のいずれの結合も検出されなかった（図示せず）。このことは、ＲＯＲ１に対する変異体の特異性を示している。該変異体の相対的な結合強度は、アッセイフォーマットに関係なく、極めて類似していた。例えば、Ｔ３２Ａ変異体は親抗体よりも４～４．７倍高い親和性であったが、Ｗ１１０Ｙ変異体は親抗体よりも５．９～６．８倍低い親和性であった。これらの非常に密接に関連する変異体は、１～２のアミノ酸によって互いに異なっており、ＲＯＲ１に対して２７倍の範囲の結合活性を示し、並びに、ＲＯＲ１及びＣＤ３に対してさまざまな親和性を持つ抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性結合分子の設計を可能にする。

次に、それぞれが重鎖Ｔ３２Ａ突然変異と組み合わせて別個の軽鎖ＣＤＲ突然変異を含んでいる２つの追加の抗ＲＯＲ１Ｆａｂ変異体について、前述のＥＬＩＳＡベースのスクリーニングの改変版を使用してヒトＲＯＲ１への結合について特徴付けを行った。具体的には、固定化されたＲＯＲ１へのＦａｂの結合に続く１回目の洗浄段階を、該プレートを大量のＰＢＳ－Ｔの中に入れて１時間の解離段階を延長することによって変更した。これにより、解離速度の遅い変異体を互いに区別できるようになった。該改変されたＥＬＩＳＡを使用して、２つの変異体、Ｔ３２Ａ（ＨＣ）＋Ａ２５Ｐ（ＬＣ）及びＴ３２Ａ（ＨＣ）＋Ｔ６９Ｒ（ＬＣ）は、Ｔ３２Ａよりも強い結合を示した（図３）。先に記載したように、Ｔ３２Ａ変異体は親（ＷＴ）と比較して結合において５倍を超える改善を示したが、Ｔ３２Ａ（ＨＣ）＋Ａ２５Ｐ（ＬＣ）及びＴ３２Ａ（ＨＣ）＋Ｔ６９Ｒ（ＬＣ）は親Ｆａｂと比較してさらなる改善を示した（それぞれ、＞８倍及び＞１３倍）。これらの極めて密接に関連している変異体は、１～３アミノ酸のアミノ酸によって互いに異なっており、ＲＯＲ１に対して８０～９０倍の範囲の結合活性を示し、並びに、ＲＯＲ１及びＣＤ３に対してさまざまな親和性を持つ抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性結合分子の設計を可能にする。

該二重特異性結合分子を、ＲＯＲ１結合に関して、以下の３種のアッセイを使用して試験した：（１）生細胞への結合及びフローサイトメトリーによる検出、（２）ＥＬＩＳＡによって測定される固定化ＲＯＲ１への結合、及び、（３）ＥＬＩＳＡによって測定される可溶性のビオチン化ＲＯＲ１への結合。採用したスクリーニングフォーマットに関係なく、全ての構築物は、ＲＯＲ１に選択的に結合した（図４－７）。

ＲＯＲ１に対する選択性は、ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞及び対照ＭＥＣ細胞への結合を測定することによって実証された。ＲＯＲ１トランスフェクト細胞への該二重特異性結合分子の結合は濃度依存性であり（図４、パネルＡ）、いずれの濃度でも対照細胞への結合は観察されなかった（図４、パネルＢ）。両方の細胞株に対する対照（「対照」）として、非特異的ヒトＩｇＧを含ませた。

ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞への該二重特異性構築物の結合強度における変動が観察された（図４、パネルＡ）。例えば、ＲＯＲ１二価構築物は、ＲＯＲ１一価構築物よりも強く結合した（図４、パネルＡ、構築物１－３及び７－９を構築物１３－１５と比較する）。結合強度におけるこの相違は、低い濃度（＜１００ｎｇ／ｍＬ）で最も明白であった。

該二重特異性構築物の結合に対するＲＯＲ１発現レベルの影響について、ＪｅＫｏ－１細胞を使用するフローサイトメトリーによって評価した。ＪｅＫｏ－１細胞は、ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞（約５６，０００コピー／細胞）よりも低いレベルのＲＯＲ１（約１３，０００コピー／細胞）を発現する。全ての構築物は、ＪｅＫｏ－１細胞に結合した（図５）。ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞を使用して観察された相対的な結合の傾向は、ＪｅＫｏ－１細胞を用いて観察された。具体的には、一価のＲＯＲ１構築物は、一般に、二価の構築物よりも弱く結合した（図５、パネルＡ、構築物１４及び１５を他の構築物と比較する；図５、パネルＣ、構築物１５－１７を他の構築物と比較する）。次に、ＲＯＲ１への二重特異性結合分子の結合について、ＲＯＲ１の組換え発現された細胞外ドメインを使用するＥＬＩＳＡによって特徴付けを行った。ＲＯＲ１をマイクロタイタープレート上に固定化し、該二重特異性結合分子を滴定し、抗ヒトカッパ－ＨＲＰ試薬を使用して結合を定量した。細胞結合データと一致して、全ての構築物は、濃度依存的にＲＯＲ１に結合した（図６）。さらに、一価のＲＯＲ１構築物１３－１５は、２価の構築物のうちの２つを除く全てと比較して、より低い緊密で結合した。該二価の二重特異性結合分子の結合活性は、親の抗ＲＯＲ１ＩｇＧ（対照）と同程度であり、このことは、Ｉｇ分子にｓｃＦｖドメインを付加してもＲＯＲ１結合が阻害されなかったことを示している。このフォーマットで試験された該二重特異性構築物の相対的な親和性は、表４において要約されている。

抗原が固定化されている細胞アッセイ及びＥＬＩＳＡにおいて一価構築物と対比して二価構築物で観察されたより強い結合は、結合活性効果と一致している。これが事実であるかどうかを確認するために、ヤギ抗ヒトカッパ抗体でコーティングされたマイクロタイタープレート上に該二重特異性結合分子を固定化し、ビオチン化ＲＯＲ１を滴定することによって、可溶性単量体ＲＯＲ１への結合を評価した。全ての二重特異性結合分子は、このフォーマットで活性であり（図７）、殆どの場合、一価と二価の構築物の間に顕著な相違はなかった。これらの結果は、使用するアッセイフォーマットに応じて、結合活性効果と一致している。抗ＣＤ３ｓｃＦｖが重鎖又は軽鎖のアミノ末端に修正された両方の変異体（それぞれ、構築物１９及び２０）で弱い結合が観察され、このことは、ＲＯＲ１パラトープに近接したＣＤ３パラトープの配置がＲＯＲ１結合をある程度阻害し得ることを示唆している。

より高い親和性のＲＯＲ１結合ドメインを含んでいる二重特異性結合分子構築物（構築物１６－１８）は、野生型（より低い親和性）ＲＯＲ１結合ドメイン（構築物９、１９、２０）を利用した対応する構築物よりも高い親和性でビオチン化ＲＯＲ１に結合した。二重特異性構築物１８（二価、より高い親和性ＲＯＲ１）は、対応する構築物９（二価、より低い親和性ＲＯＲ１）よりも強く結合した。同様に、二重特異性構築物１６及び１７（一価、より高い親和性ＲＯＲ１）は、構築物１５（一価、より低い親和性ＲＯＲ１）よりも強く結合した。これらのデータは、表４において要約されている。さらに、親和性のより高いＲＯＲ１結合ドメインを有する二重特異性結合分子は、親ＩｇＧ（対照）よりも高い親和性で可溶性ＲＯＲ１に結合した。

実施例３：抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性結合分子によるＲＯＲ１インターナリゼーション
ＲＯＲ１及びＲＯＲ１を認識する二重特異性結合分子のインターナリゼーション及びリサイクルは、インビボでの治療効果に影響を及ぼし得る。例えば、Ｔ細胞が関与する前のＲＯＲ１の結合、インターナリゼーション及び分解は、細胞毒性を低下させると予期され得る。５つの異なる構成を有する抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性結合分子について、結合及びインターナリゼーションに関して特徴付けを行った。

さまざまな二重特異性構築物のインターナリゼーションの特徴付けを行うのと同時に、ＲＯＲ１の細胞表面発現を、２つの異なるＲＯＲ１抗体を使用して調べた。一方の抗体（ＵＣ９６１）は、該二重特異性結合分子と同じＲＯＲ１エピトープを認識し、もう一方の抗体（４Ａ５）は、重複しないＲＯＲ１エピトープを認識する。

さらに、二重特異性結合分子の細胞表面結合を、３７℃で２４時間インキュベートした後で評価して、長時間の曝露がさまざまな結合分子の細胞表面レベルに影響を及ぼしたかどうかを確認した。

ＲＯＲ１二重特異性結合分子のインターナリゼーション及びＲＯＲ１のリサイクル／再発現について、ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞及びフローサイトメトリーを使用して特徴付けを行った。

材料及び方法
二重特異性結合分子のインターナリゼーションの測定
フローサイトメトリーを使用して、０、３０、６０、１２０、１８０及び２４０分でインターナリゼーションされていない細胞表面抗体を定量化するパルス・チェイス法を使用して、二重特異性結合分子のインターナリゼーションを測定した。ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、冷インキュベーション緩衝液（２％ＦＢＳを含んでいるＲＰＭＩ－Ｆｉｓｈｅｒ／Ｇｉｂｃｏカタログ番号１６１４００７１）の中に１ｍＬあたり１×１０^７で再懸濁させた。次いで、３．５×１０^６個の細胞を、試験した各二重特異性構築物に対して、マイクロ遠心チューブに分注した。等量（３５０μＬ）の二重特異性結合分子を該細胞と合して、最終濃度を３０μｇ／ｍＬとした。先の結合研究に基づいて、３０μｇ／ｍＬは、二価ＲＯＲ１構築物（構築物１－１２）のより高い親和性／結合活性に対して飽和していると予期された。細胞と抗体を氷上で２０分間インキュベートし、１ｍＬの冷ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳを含んでいるＰＢＳ）で５回洗浄し、そして、１．４μＬのインキュベーション緩衝液に再懸濁させた。続いて、該サンプルを３７℃で０、３０、６０、１２０、１８０及び２４０分間インキュベートし、その後、２００μＬの各サンプルを氷に移してインターナリゼーションを停止させた。

各構築物及び各時点のサンプルを半分に分割し（各１００μＬ）、スピンダウンさせた。該サンプルの半分を１００μＬの二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ、Ｆｃ－γ特異的－ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号１２－４９９８）に再懸濁させて、結合した二重特異性構築物を検出した。残りの半分は、ＵＣ９６１－ＰＥと４Ａ５－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の１００μＬカクテルで染色した。ＵＣ９６１は、該二重特異性構築物と同じエピトープに結合し、それによって、該二重特異性結合分子によって結合されていない遊離ＲＯＲ１を検出する。４Ａ５は、異なるエピトープでＲＯＲ１に結合し、従って、結合に関して該二重特異性結合分子と競合しない。従って、４Ａ５は、全細胞表面ＲＯＲ１（結合及び遊離）を検出する。両方の染色セットは、暗所の氷上で２０分間インキュベーション緩衝液に留めた。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、１００μＬの固定緩衝液（ＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒド）に２５℃で１０分間再懸濁させた。次いで、固定された細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、分析した。

蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を各染色について定量化した。いくつかの対照条件を使用した。バックグラウンド蛍光の除去に使用するために、染色されていない対照細胞について、ＰＥ及びＡ１６４７ＭＦＩを測定した。該二重特異性構築物に曝露されていない細胞は、二次抗体の非特異的染色を明らかにするために二次抗体ＰＥで染色し（二次陰性対照）、及び、最大ＵＣ９６１結合対照を得るためにＵＣ９６１－ＰＥで染色した。表面二重特異性結合分子、占有されていない細胞表面ＲＯＲ１エピトープ及び総ＲＯＲ１の定量化は、以下のようにして実施した：

結果
本明細書中に記載されている二重特異性結合分子を構築するために使用した抗ＲＯＲ１抗体を用いた先の実験によって、以下のことが実証された：（１）該抗体が急速にインターナリゼーションされた；及び、（２）ＲＯＲ１が結合された抗体なしで細胞表面に再出現した。この細胞表面の発現は、エンドソームコンパートメントからのＲＯＲ１のリサイクルの結果であるか、又は、デノボ合成若しくは細胞内ストアの輸送によるＲＯＲ１の急速なアップレギュレーションを反映している（例えば、米国特許公開２０１８／０３６９４０６を参照されたい）。異なる二重特異性構築物は、可変のインターナリゼーション及びＲＯＲ１リサイクル／再発現パターンを示した（図８及び図９）。

該重鎖のカルボキシ末端への抗ＣＤ３ｓｃＦｖの配置（構成Ａ、構築物１）は、急速なインターナリゼーションをもたらした（図８、パネルＡ、円）。時間ゼロでは、遊離エピトープが検出されなかったため、利用可能なＲＯＲ１二重特異性エピトープは飽和していた。総ＲＯＲ１表面レベルが減少し（図８、パネルＡ、四角）及び該二重特異性結合分子によって認識される遊離ＲＯＲ１エピトープが検出されなかった（図８、パネルＡ、三角）ので、ＲＯＲ１は、当該実験時間経過中に有意なレベルで細胞表面にリサイクルされず又は再発現されなかった。これらのデータは、該二重特異性結合分子－ＲＯＲ１複合体のインターナリゼーション及びリソソームへの輸送と一致している。極めて類似したインターナリゼーション及び輸送が、二重特異性結合分子構築物２及び３を用いて観察された（示されていない）。

該軽鎖のカルボキシ末端への抗ＣＤ３ｓｃＦｖの配置（構成Ｂ、構築物７）は、インターナリゼーションを有意に阻害した（図８、パネルＢ；図８、パネルＡにおける構築物３に対してインターナリゼーションの程度を比較する）。時間０で、該構築物はそのエピトープを完全に飽和させた。総細胞表面ＲＯＲ１レベルは、比較的一定に見えた（図８、パネルＢ、四角）。さらに、該二重特異性によって認識される遊離ＲＯＲ１エピトープは、時間依存的に増加し（図８、パネルＢ、三角）、細胞表面からの該二重特異性結合分子の解離又はＲＯＲ１のリサイクル／再発現のいずれかと一致する。極めて類似したインターナリゼーション及び輸送が、二重特異性結合分子構築物８及び９を用いて観察された（示されていない）。

一価の抗ＲＯＲ１（構成Ｃ、構築物１３）も、効率的にインターナリゼーションされなかった（図８、パネルＣ）。先の研究は、二価構築物の結合が３０μｇ／ｍＬで飽和していることを示した（図４、パネルＡ、及び、図５）。しかしながら、３０μｇ／ｍＬでの一価抗ＲＯＲ１二重特異性結合分子の結合は、この実験では、細胞表面ＲＯＲ１を飽和させるようには見えなかった。時間０では、構築物１３の結合程度は、時間０での構築物１及び７の対応する飽和ＭＦＩの結合程度の約８０％にすぎなかった（図８、パネルＣ、時間０での円を四角と比較する）。さらに、構築物１３によって認識される遊離ＲＯＲ１エピトープも、時間０で検出された（図８、パネルＣ、三角）。要約すると、一価の二重特異性結合分子構築物１３、全細胞表面ＲＯＲ１及び占有されていない二重特異性エピトープのレベルは、全て、実験期間中にわたって比較的一定のままであった。まとめると、これらのデータは、二重特異性結合分子１３が殆どインターナリゼーションしないことと一致している。極めて類似したインターナリゼーション及び輸送が、構築物１５を用いて観察された（示されていない）。

１つの重鎖のアミノ末端への抗ＣＤ３ｓｃＦｖの配置（構成Ｄ、構築物１９）は、部分的なインターナリゼーションをもたらした（図９、パネルＡ、円）。総ＲＯＲ１表面レベルが増加し（図９、パネルＡ、四角）及び該二重特異性結合分子によって認識されるＲＯＲ１エピトープの時間依存性検出が増加した（図９、パネルＡ、三角形）ので、ＲＯＲ１は、当該実験時間経過中に有意なレベルで細胞表面にリサイクルされたか又は再発現された。１つの重鎖のアミノ末端への抗ＣＤ３ｓｃＦｖ部分の配置は、構成Ｂ（該軽鎖のカルボキシ末端に融合した抗ＣＤ３ｓｃＦｖ）を有する二重特異性結合分子と極めて類似したインターナリゼーション及び輸送をもたらした。

該軽鎖のアミノ末端への抗ＣＤ３ｓｃＦｖの配置（構成Ｅ、構築物２０）は、部分的なインターナリゼーションをもたらした（図９、パネルＢ、円）。総ＲＯＲ１表面レベルが増加し（図９、パネルＢ、四角）及び該二重特異性結合分子によって認識されるＲＯＲ１エピトープの時間依存性検出が増加した（図９、パネルＢ、三角）ので、ＲＯＲ１は、当該実験時間経過中に有意なレベルで細胞表面にリサイクルされたか又は再発現された。該軽鎖のアミノ末端への抗ＣＤ３ｓｃＦｖ部分の配置は、構成Ｂ（該軽鎖のカルボキシ末端に融合した抗ＣＤ３ｓｃＦｖ）を有する二重特異性結合分子と極めて類似したインターナリゼーション及び輸送をもたらした。

細胞表面に結合した二重特異性結合分子のレベルに対するＲＯＲ１の輸送及び発現の長期的影響を確認するために、細胞を該二重特異性結合分子と一緒に２４時間インキュベートし、洗浄し、そして、細胞表面二重特異性結合分子を測定した。２４時間のインキュベーション後の表面二重特異性結合分子の定量によって、重鎖のカルボキシ末端に融合した抗ＣＤ３ｓｃＦｖを有する二重特異性結合分子（図１０、構築物１、円）が、軽鎖のカルボキシ末端に融合した抗ＣＤ３ｓｃＦｖを有する二重特異性結合分子（図１０、構築物７、四角）又はＦｃのアミノ末端に融合した抗ＣＤ３ｓｃＦｖを有する二重特異性結合分子（図１０、構築物１３、三角形）よりも低いレベルで存在していることが明らかになった。重鎖のカルボキシ末端に抗ＣＤ３ｓｃＦｖが融合している構築物の細胞表面レベルの低下（他の二重特異性構成では低下していない）は、表面ＲＯＲ１のダウンレギュレーションを示唆しており、そして、該インターナリゼーション実験（図８）で行われた観察と一致している。

実施例４：ＣＤ３結合及び抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性結合分子のインターナリゼーション
Ｔ細胞の表面上のＴＣＲ－ＣＤ３複合体の数は、新しいタンパク質の合成及び分泌、インターナリゼーション、リサイクル及び分解の組み合わせを反映している。抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３による治療は、インターナリゼーションによって表面からＣＤ３を選択的に除去することが示されている。

３つの抗ＣＤ３配列を、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性結合分子におけるｓｃＦｖ構築物として使用した。該配列のうちの２つは、ＯＫＴ３の異なるヒト化バージョン（Ａｂ８及びＡｂ９）であり、３番目の配列は、異なる抗ＣＤ３抗体ＳＰ３４（Ａｂ１０）のサードパーティヒト化バージョンである。上記で記載したように、ＯＫＴ３とＳＰ３４は異なるエピトープに結合し、抗ＣＤ３抗体は、それらのエピトープの異なる特性に基づいて分類されている（Ｔｕｎｎａｃｌｉｆｆｅｅｔａｌ．，ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１：５４６－５５０（１９８９））。このシステムを使用した場合、ＳＰ３４はグループＩとして分類され、ＯＫＴ３はグループＩＩとして分類される。ＳＰ３４に基づく配列（しかしながら、ＯＫＴ３に基づく配列ではない）は、カニクイザルＣＤ３と交差反応性があると予期される。

さまざまなＣＤ３パラトープについて、５つの異なる構成（図１、Ａ－Ｅ）で評価し、そして、一価の抗ＣＤ３二重特異性構築物（図１、Ｃ及びＤ）の結合を特定の二価の抗ＣＤ３構築物（図１、Ａ、Ｂ及びＥ）と比較した。３つ全てのｓｃＦｖ配列のジスルフィド安定化バージョンについても、さまざまな二重特異性構成で評価した。

ＲＯＲ１関与がない場合のさまざまな二重特異性構築物のインターナリゼーションについて評価した。二重特異性結合分子の結合とインターナリゼーションは、ジャーカット細胞とフローサイトメトリーを使用して特徴付けを行った。

材料及び方法
ＣＤ３結合アッセイ
ＣＤ３結合を定量化するために、各条件に対して２．５Ｅ５ジャーカット細胞を使用した。２％ＦＢＳを含んでいる５０μＬのＰＢＳに該細胞を入れることによってその細胞を懸濁させて５Ｅ６／ｍＬとすることによって、該細胞の２×ストックを作製した。次に、その細胞を被験二重特異性結合分子の等体積の２×ストックで希釈した。該細胞と抗体を氷上で２０分間共インキュベートした。次いで、その細胞を３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、１００μＬのヤギ抗ヒトＦｃ－ＰＥコンジュゲート抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１２４９９８８２）に１：５００希釈で再懸濁させ、氷上で減光しながら２０分間インキュベートした。次いで、該細胞を３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで２５℃で１０分間固定した。その細胞を３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＭｉｌｔｅｎｙｉＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザーで分析した。

ＣＤ３インターナリゼーションアッセイ
二重特異性結合分子のインターナリゼーションを定量化するために、２．５Ｅ５ジャーカット細胞を１μｇ／ｍＬの該二重特異性結合分子と氷上で２０分間共インキュベートした。次いで、該細胞を３００μＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、培地に再懸濁させ、３７℃でインキュベートした。さまざまな時点で、細胞を取り出し、３００μＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、上記で記載したように処理した。

結果
５つの異なる二重特異性構成（図１）について評価した。ＣＤ３結合は、ジャーカット細胞への結合によって示されるように、試験した全ての二重特異性構成でＯＫＴ３に基づく配列とＳＰ３４に基づく配列の両方で保持された。該構築物は、さまざまな程度に結合した（図１１及び図１２）。

ＯＫＴ３配列及びＳＰ３４配列のいずれかを用いて試験された全ての二重特異性構成（構築物１－１５）に関して、ＯＫＴ３に基づく配列はＳＰ３４に基づく配列よりも高い親和性で結合した。例えば、構築物１及び２は構築物３よりも強く結合し（図１１、パネルＡ）、構築物７及び８は構築物９よりも強く結合し（図１１、パネルＢ）、構築物１３及び１４は構築物１５よりも強く結合した（図１１、パネルＣ）。非特異的ヒトＩｇＧを対照（「対照」）として含めた。

抗ＣＤ３ｓｃＦｖのジスルフィド安定化変異体を作製するためのシステイン残基の導入は、結合に悪影響を及ぼさなかった。ジスルフィド安定化変異体の結合は、対応する非ジスルフィド安定化配列と区別がつかなかった（図１１、パネルＡ、それぞれ構築物１－３を構築物４－６と比較する；及び、図１１、パネルＢ、構築物７－９をそれぞれ構築物１０－１２と比較する）。

該二重特異性結合分子の配置は、抗ＣＤ３ｓｃＦｖの結合に大きな影響を及ぼした（図１２）。ジャーカット細胞への最も強い結合は、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ部分が軽鎖（図１２、パネルＢ、構築物２０）又は重鎖（図１２、パネルＢ、構築物１９）のアミノ末端に配置されたときに観察された。逆に、抗ＣＤ３ｓｃＦｖが軽鎖のカルボキシ末端に配置された場合（図１２、パネルＢ、構築物９及び１８）、より弱い結合が観察された。１つの重鎖のアミノ末端に配置された単一の抗ＣＤ３ｓｃＦｖ部分（一価ＣＤ３結合；図１２、パネルＢ、構築物１９）は、重鎖（二価ＣＤ３結合；図１２、パネルＢ、構築物３）又は軽鎖（二価ＣＤ３結合；図１２、パネルＢ、構築物９及び１８）のカルボキシ末端における２つの抗ＣＤ３ｓｃＦｖ部分の配置と同様に又はそれよりも良好に結合した。非特異的ヒトＩｇＧを１つの実験（図１２、パネルＡ、「対照」）に対照として含ませ、一方、無関係のＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性構築物（米国特許公開２０１７／０２３３４７２；配列番号１１１－１１３）を２番目の実験（図１２、パネルＢ、「対照１」）に対照として含ませた。

同様の傾向が、ＯＫＴ３配列を使用するこれらの二重特異性構成のサブセットを用いて観察された。具体的には、Ｆｃのアミノ末端に融合した一価の抗ＣＤ３ｓｃＦｖが最も強く結合し（図１２、パネルＡ、構築物１３）、次が、ｓｃＦｖが重鎖のカルボキシ末端に融合した構築物（図１２、パネルＡ、構築物１）であり、次が、ｓｃＦｖが軽鎖のカルボキシ末端に融合した構築物（図１２、パネルＡ、構築物７）であった。

該二重特異性結合分子の構成が、ＣＤ３パラトープの結合価よりも、ＣＤ３結合強度のより重要な決定因子であるように見えることは注目すべきである。この驚くべき効果は、重鎖（図１２、パネルＢ、構築物１９）又はＦｃ（図１２、パネルＡ、構築物１３、並びに、図１２、パネルＢ、構築物１５及び１６）のアミノ末端に融合した一価の抗ＣＤ３構築物が、重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端に融合した二価の抗ＣＤ３構築物（図１２、パネルＢ、構築物３、９及び１８）と同等又はそれよりも良好に結合したことが観察されたことによって強調される。

まとめると、これらのデータは、ＣＤ３結合の強度を調節するための３つの異なるアプローチが存在していることを示している。第１に、ＳＰ３４に基づく配列とＯＫＴ３に基づく配列は、同じ二重特異性フォーマットで互いに比較した場合、異なる結合強度を示す。第２に、ＳＰ３４に基づく配列とＯＫＴ３に基づく配列の両方の結合強度は、該二重特異性結合分子の構成によって影響を受ける。最後に、ヘテロマーＦｃ構築物を使用するとによって、一価又は二価の抗ＣＤ３二重特異性結合分子が可能になる。

抗ＣＤ３抗体によるＴ細胞活性化は、ＣＤ３のインターナリゼーションの増加をもたらす可能性がある。該ＣＤ３は、インターナリゼーションされると、リサイクル経路に入り、そして、細胞表面で再発現され得るか、又は、リソソームに分類されて分解され得る。腫瘍抗原（ＲＯＲ１）の関与がない場合に二重特異性結合分子によって誘導されるＣＤ３のインターナリゼーション及び分解は、インビボでの該二重特異性結合分子の細胞毒性活性を阻害し得る。結果として、該二重特異性結合分子は、ＲＯＲ１の非存在下でのＣＤ３への結合後のインターナリゼーションについて特徴付けられた（図１３）。

二重特異性結合分子の結合及び４℃での洗浄に続いて、ジャーカット細胞を３７℃でインキュベートした。次いで、細胞表面上の二重特異性結合分子の量をさまざまな時点で定量化した。該二重特異性結合分子は最初は異なる強度で結合したため（図１１及び図１２）、インターナリゼーションは、時間０で観察された結合の割合（％）として報告された。この方法で定量化された表面二重特異性結合分子のレベルは、インターナリゼーションと解離の組み合わせを反映している。それにもかかわらず、以下に概説されている理由により、表面レベルに影響を与える主な要因は、該二重特異性結合分子の解離ではなく、インターナリゼーションであるように思われた。

表面二重特異性結合分子のレベルは、試験した全ての二重特異性構築物について時間依存的に減少したが、損失の程度は変化した。試験した９の構築物のうち８について、最初の３０分以内に急速なインターナリゼーション（＞５０％）が観察され、その後、次の３．５時間にわたって、より遅いが継続的なインターナリゼーションが観察された。軽鎖のカルボキシ末端に融合したＳＰ３４に基づく配列からなる構築物９は、実験期間中、インターナリゼーションが最も少なく、二重特異性結合分子の約５０％が４時間後でも細胞表面で検出可能であった。さらに、重鎖のカルボキシ末端に融合した抗ＣＤ３ｓｃＦｖ部分からなる構築物１及び３は、中間のインターナリゼーションを示し、４時間のインキュベーション後も細胞表面で約２０％が検出可能であった。

先に論じたように、経時的に観察される細胞表面二重特異性結合分子の染色の低減は、インターナリゼーションとは対照的に、当該表面からの二重特異性結合分子の解離を反映している可能性がある。しかしながら、経時的にシグナルの最小の損失を示した二重特異性構築物のうちの２つ、構築物３及び９は、特徴付けられた最も弱い結合構築物の中にあり（それぞれ、図１１、パネルＡ及びパネルＢ）、一方、時間０で極めて強い結合を示し構築物１３（図１１、パネルＣ）の結合は、４時間での染色は弱かった（初期シグナルの８％）。まとめると、これらのデータは、ＳＰ３４に基づく抗ＣＤ３ｓｃＦｖ部分からなる特定の構成が、ＯＫＴ３に基づくｓｃＦｖ部分からなる構成よりもインターナリゼーションする可能性が低いことを示唆している。

実施例５：インビトロでの抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性結合分子のリダイレクトされたＴ細胞の毒性
２０の抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性結合分子を試験して、Ｔ細胞介在細胞毒性アッセイにおける抗体効力に対する複数のパラメーターの影響について評価した。調べた変数には、抗ＣＤ３のエピトープ及び結合価、抗ＲＯＲ１の親和性及び結合価並びにＣＤ３とＲＯＲ１の結合成分のさまざまな構成が含まれていた。

当該構築物の死滅活性を、さまざまなレベルのＲＯＲ１発現を有する血液学的腫瘍癌細胞及び固形腫瘍癌細胞のパネルに対して試験した。該二重特異性結合分子の死滅活性を特徴付けることに加えて、ＣＤ６９をマーカーとして使用してＴ細胞の活性化を評価した。活性化Ｔ細胞によるサイトカイン放出についても、特徴付けを行った。

材料及び方法
ヒトＰＢＭＣを用いた細胞毒性アッセイ
細胞毒性アッセイのために、標的細胞を、ＲＰＭＩ（フェノールレッドなし）、ペニシリン－ストレプトマイシンを含有する１０％ＦＢＳ中の４Ｅ５細胞／ｍＬに再懸濁させた。続いて、２Ｅ４細胞／ウェル（５０μＬ／ウェル）を９６ウェルプレートに移し、３７℃のインキュベーターの中に１時間入れた。懸濁細胞には丸底プレートを使用し、接着細胞株には平底プレートを使用した。ヒトＰＢＭＣは、以下に記載されているようにして単離した。ＰＢＭＣを２Ｅ６細胞／ｍＬに再懸濁させ、次いで、２Ｅ５細胞／ウェル（１００μＬ／ウェル）を標的細胞を含んでいるウェルに加えた。別途示されていない限り、使用した腫瘍細胞（標的）に対するＰＢＭＣ（エフェクター細胞）の比率は、１０：１（Ｅ：Ｔ比）であった。標的細胞とＰＢＭＣを混合させ、３７℃のインキュベーターの中に１時間入れた。該二重特異性結合分子を培地で適切な濃度に希釈し、５０μＬを標的細胞とＰＢＭＣの混合物に加え、３７℃のインキュベーターの中に２４時間入れた。各実験に以下の対照を含ませた：（１）培地のみ（Ｍｅｄｉａ）、（２）溶解緩衝液用に調整された培地（Ａｄｊ）、（３）ＰＢＭＣのみ（ＰＢＭＣ）、（４）ＬＤＨの自然放出のみを目的とする標的細胞（ＳＲ）、（５）ＬＤＨの最大放出のみを目的とする標的細胞（ＭＲ）、及び、（６）二重特異性結合分子を含まない標的細胞及びＰＢＭＣ（ＡＩＣＣ）。

ＰＢＭＣの分離
ＳｅｐＭａｔｅ－５０（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）円錐管の下部チャンバーに、１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌを入れた。血液は、匿名化された正常なドナーから得てヘパリン採血管の中に入れ、２５℃で滅菌ＰＢＳと１：１の比率で混合させた。その希釈された血液をＳｅｐＭａｔｅ－５０管の上部チャンバーに層状に入れ、ブレーキを使用して２５℃で１５分間１２００×ｇで遠心分離した。ＰＢＭＣ（上部チャンバーの内容物）を取得するために、該ＳｅｐＭａｔｅ－５０管をすばやく逆さにして新たな５０ｍＬ円錐管に入れた。次いで、該細胞を、５００×ｇで３分間遠心分離することにより、ＰＢＳ中の冷５％ＦＢＳで３回洗浄した。最後に、該細胞を１０ｍＬの培地（フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ、ペニシリン－ストレプトマイシンを含んでいる１０％ＦＢＳ）に再懸濁させ、細胞数を数えるためにアリコートを取り出した。次いで、細胞を細胞毒性アッセイのプレーティングに使用した。

ＬＤＨ放出の定量化
２４時間のインキュベーション後のＬＤＨ放出を定量化するために、２０μＬの１０×溶解緩衝液をＡｄｊウェル及びＭＲウェルに加え、各ウェルの内容物をＶ底９６ウェルプレートに移し、５００×ｇで５分間スピンダウンした。次いで、後続のアッセイに使用するために、１７０μＬの上清を別の９６ウェルプレートに移した。新たな透明底９６ウェルプレート内で、５０μＬの上清を５０μＬのＣｙｔｏＴｏｘ９６Ｎｏｎ－ＲａｄｉｏａｃｔｉｖｅＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙＡｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ１７８０）と合し、そのプレートを暗所で２５℃で３０分間インキュベートした。最後に、５０μＬの停止溶液を添加した後、４９０ｎｍで吸光度を読み取った。％ＬＤＨ放出は、製造元の指示に従って計算した。

Ｔ細胞活性化の評価
ＣＤ６９のアップレギュレーションを使用して、Ｔ細胞の初期の活性化を特徴付けた。ＣＤ６９の定量は、フローサイトメトリーを使用して実行した。簡単に説明すれば、ペレット化細胞を、１００μＬのＰＢＳ中２％ＰＦＡに再懸濁させ、２５℃で１０分間インキュベートすることによって固定した。その細胞を３００μＬのＰＢＳで２回洗浄し、１５０μＬのＰＢＳに再懸濁させ、使用するまで暗所で４℃で保存した。次いで、当該細胞を遠心分離によって収集し、１００μＬの染色カクテルの中に再懸濁させ、暗所で４℃で２０分間インキュベートした。その染色カクテルは、ＰＢＳ中で１：７５に希釈されたＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ抗ヒトＣＤ８クローンＳＫ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄカタログ番号３４４７１７）、ＰＢＳ中で１：５００に希釈されたＰＥ／Ｃｙ７抗ヒトＣＤ６９クローンＦＮ５０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄカタログ番号３１０９１１）及びＰＢＳ中で１：５００に希釈されたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７マウス抗ヒトＲＯＲ１クローン４Ａ５で構成されていた。次いで、その細胞を３００μＬの冷ＰＢＳで３回洗浄し、１５０μＬのＰＢＳ中２％ＦＢＳの中に再懸濁させた。サンプルは、ＭｉｔｅｎｙｉＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザーで分析した。

リダイレクトＴ細胞アッセイにおけるＰＢＭＣからのサイトカイン放出の定量化
サイトカイン放出を測定するために、ＭＳＤ（登録商標）Ｖ－ＰＬＥＸＣｙｔｏｋｉｎｅＰａｎｅｌ１ＨｕｍａｎＫｉｔを使用して、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０及びＴＮＦ－αを同時に測定した。該アッセイは、製造業者の指示に従って実施した。簡単に説明すれば、Ｖ－ｐｌｅｘＣｙｔｏｋｉｎｅＰａｎｅｌ１プレートを１５０μＬ／ウェルの洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含んでいるＰＢＳ）で３回洗浄した。次に、ウェルごとに、５０μＬの希釈されたサンプル及び標準物質を添加した。そのプレートを粘着プレートシールで密封し、振盪機上で、４℃、５００ｒｐｍで一晩インキュベートした。その翌日、該プレートを１５０μＬ／ウェルの洗浄緩衝液で３回洗浄し、２５μＬの検出抗体溶液と一緒に、振盪基上で、室温で２時間インキュベートした。そのプレートを洗浄緩衝液でさらに３回洗浄した。最後に、１５０ｕＬのＲｅａｄＢｕｆｆｅｒＴを添加した後、ＭＳＤ機器を使用して分析した。

結果
ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞の抗原依存性の死滅が、試験された二重特異性構築物の大部分で観察されたが、相対的な効力はさまざまであった。代表的な滴定プロフィールが、図１４、パネルＡ（構成Ａ、Ｂ及びＣを有する構築物）及び図１５、パネルＡ（構成Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥを有する構築物）に示されている。構築物２、８及び１４の滴定プロフィール（示されていない）は、それぞれ、構築物１、７及び１３の滴定プロフィールと類似していた。

予想通り、異なるＰＢＭＣドナーが使用された場合、該二重特異性結合分子の絶対効力はある程度変動した。それにもかかわらず、異なる構築物の相対的な効力は、有意に変動しなかった。例えば、二重特異性結合分子構築物９は、一貫して最も活性の高いものの１つであり、ＲＯＲ１をトランスフェクトされたＭＥＣ標的細胞を用いて、１人のドナーで、＜０．１ｎｇ／ｍＬのＥＣ_５０を示し（図１４、パネルＡ）、及び、２番目のドナーで、１．１ｎｇ／ｍＬのＥＣ_５０を示した（図１５、パネルＡ）。

構築物１－３、７－９及び１３－１５は、全て、１μｇ／ｍＬで選択的死滅を示した（構築物１－３及び７－９については、５ｎＭ、構築物１３－１５については、８ｎＭ）（図１６、黒い棒グラフ）。死滅の抗原依存性は、標的細胞を含まないサンプル（図１６、「ＰＢＭＣ」）若しくは抗体を含まないサンプル（図１６、「ｂｉＡｂなし」）におけるＬＤＨ放出の欠如によって、又は、トランスフェクトされていないＭＥＣ細胞を標的細胞として使用した場合（図１６、灰色の棒グラフ）に、実証された。それにひきかえ、対照の抗ＣＤ１９／抗ＣＤ３二重特異性結合分子（ＣｒｅａｔｉｖｅＢｉｏｌａｂｓカタログ番号ＢＳＡＢ－Ｌ００２）は、ＲＯＲ１でトランスフェクトされたＭＥＣ細胞及びトランスフェクトされていないＭＥＣ細胞の両方の細胞毒性を誘導した（図１６、「ＣＤ１９×ＣＤ３」）。二重特異性構築物１６－２０は、この実験では試験しなかった。

培養物中のＴ細胞の活性化について、Ｔ細胞活性化の初期マーカーであるＣＤ６９のアップレギュレーションを調べることによって評価した。細胞毒性データと一致して、活性化は、１μｇ／ｍＬで、番号１７及び番号１９を除く全ての構築物で観察された（図１４、パネルＢ；図１５、パネルＢ）。より強力な二重特異性結合分子については、より低い濃度で活性化が観察された（図１４、パネルＢ、７対３を比較する；図１５、パネルＢ、１８対３を比較する）。

ＣＤ６９発現の増加によって評価されるＴ細胞活性化は、一般に、該二重特異性結合分子の細胞毒性活性を反映していた。しかしながら、ＣＤ６９活性化が細胞毒性と直接相関しない例が存在した（図１９、７と９を比較する；図２０、７対８及び９を比較する）。

Ｔ細胞の活性化は、抗原依存性であった（図１７）。Ｒ０Ｒ１^－／ＣＤ１９^＋ＭＥＣ細胞と共培養されたＴ細胞は、対照ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性結合分子の存在下では活性化されたが（図１７、パネルＡ、左）、ＲＯＲ１二重特異性結合分子の存在下では活性化されなかった（図１７、パネルＡ、右）。しかしながら、Ｔ細胞をＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞（ＲＯＲ１^＋／ＣＤ１９^＋）と共培養した場合、そのＴ細胞は、ＲＯＲ１二重特異性結合分子の存在下で活性化された（図１７、パネルＢ、右）。これらのデータは、この研究で特徴付けられた二重特異性構築物によるＴ細胞の活性化にＲＯＲ１が必要であることを示している。

次に、該二重特異性結合分子による異なるヒト標的細胞のＲＯＲ１依存性死滅について調べた。マントル細胞リンパ腫細胞株であるＪｅＫｏ－１細胞のＲＯＲ１依存性死滅は、効力は異なるものの、構成Ａ、Ｂ、Ｃ及びＥの全ての二重特異性結合分子で観察された。代表的な滴定プロフィールが、図１８、パネルＡ（構成物１－１５）及び図１９、パネルＡ（構築物１６－２０）に示されている。ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞を用いてなされた観察と一致して、Ｔ細胞の活性化は、一般に、該二重特異性結合分子の相対的な細胞毒性を反映していた（図１８、パネルＢ；図１９、パネルＢ）。

第２のマントル細胞リンパ腫細胞株であるＭｉｎｏ細胞についても、同様に、標的細胞株として試験した。構成Ｂを有する３つの非ジスルフィド安定化構築物は、全て、Ｍｉｎｏ細胞に対して強力な活性を示し（図２０、パネルＡ）、ＳＰ３４に基づくＣＤ３配列（構築物９）が最も強力であった。興味深いことに、構築物９は、ＯＫＴ３に基づく構築物よりも弱くＴ細胞を活性化した（ＣＤ６９のアップレギュレーションによる確認）（図２０、パネルＢ）。

同様に、乳房腫瘍細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－４６８のＲＯＲ１依存性死滅が、二重特異性構成Ａ、Ｂ、Ｃ及びＥを用いてさまざまな効力で観察された。代表的な滴定プロフィールが、図２１、パネルＡ（構成物１－１５）及び図２２、パネルＡ（構築物１６－２０）に示されている。ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞及びＪｅＫｏ－１細胞を用いてなされた観察と一致して、Ｔ細胞の活性化は、一般に、該二重特異性結合分子の相対的な細胞毒性を反映していた（図２１、パネルＢ；図２２、パネルＢ）。

ＪｅＫｏ－１細胞、ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞及びモックトランスフェクト（ＲＯＲ１^－）ＭＥＣ細胞のリダイレクトされた死滅におけるＴ細胞の活性化に続くサイトカイン放出の誘導について、特徴付けを行った。代表的な用量反応グラフが、構築物７、９、１８、２０及び対照ＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性結合分子（米国特許公開２０１７／０２３３４７２）に関して示されている（図２３（ＴＮＦ－α）、図２４（ＩＦＮ－γ）、図２５（ＩＬ－２）、図２６（ＩＬ－４）、図２７（ＩＬ－６）、図２８（ＩＬ－１０））。用量依存的なサイトカイン産生（ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６及びＩＬ－１０）は、試験した全ての構築物について、ＪｅＫｏ－１細胞（パネルＡ）及びＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞（パネルＢ）で観察されたが、モックトランスフェクト（ＲＯＲ１^－）ＭＥＣ細胞（パネルＣ）では観察されなかった。ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞は、ＪｅＫｏ－１細胞よりも高いレベルのＲＯＲ１を発現し（表５）、試験した二重特異性結合分子に対してＪｅＫｏ－１細胞よりも感受性が高かったが、このことは、標的発現レベルの重要性を示している。サイトカインの分泌は、ＲＯＲＬの発現に依存していた。１μｇ／ｍＬの該構築物をモックトランスフェクト（ＲＯＲ１^－）ＭＥＣ細胞と一緒にインキュベートしても（パネルＣ）、いずれのサイトカインの分泌もバックグラウンドを有意に超えるレベルでは誘導されなかった（二重特異性抗体対照なし）。それに反して、ＲＯＲ１×ＣＤ３二重特異性結合分子（「対照１」）をモックトランスフェクト（ＲＯＲ１^－）ＭＥＣ細胞と一緒にインキュベーションした場合、炎症性サイトカインＩＦＮ－γが多少分泌された（図２４、パネルＣ）。ＩＬ－６を除いて、対照１は、ＪｅＫｏ－１細胞を用いて試験した場合、より高い全体的なレベルのサイトカイン分泌を誘導した。それに反して、対照１を包含する全ての構築物は、より高いＲＯＲ１を発現するトランスフェクトされたＭＥＣ細胞を用いて試験した場合、同様のレベルのサイトカイン分泌を誘導した。

該二重特異性結合分子のうちのいくつかのさまざまな標的細胞に対する活性の要約が表５に示されている。

まとめると、さまざまな特性及び構成を有する抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性結合分子によるさまざまな標的細胞株のリダイレクトされたＴ細胞死滅は、特定の傾向を特定した。

エフェクター細胞としてのヒトＰＢＭＣ及びさまざまな標的細胞株を使用するインビトロ細胞毒性アッセイに基づいて、構成Ｂ、Ｅ及びＣは、構成Ａ及びＤよりも強力である傾向を示した。構成に基づく相対的効力は、ＣＤ３結合アーム及びＲＯＲ１結合アームの相対的空間的位置付けを反映し得る。該効力は、さらに、さまざまな構成が二重特異性結合分子の輸送に及ぼす影響も反映し得る。例えば、構成Ｂ及びＣの二重特異性結合分子は、構成Ａの二重特異性結合分子ほど迅速には又は同程度には、インターナリゼーションしない。

ＯＫＴ３に基づく配列は、ＣＤ３に対して、ＳＰ３４に基づく配列よりもより高い親和性を有しているように見えたが、二価のＳＰ３４に基づく配列を有する二重特異性結合分子は、多くの場合より強力であった。増強されたその活性は、親和性、又は、追加的若しくは代替的に、ＳＰ３４によって認識される別個のエピトープを反映している可能性がある。興味深いことに、一価のＣＤ３結合を有する二重特異性結合分子を評価した場合、その傾向は異なっていた。場合によっては、ＯＫＴ３に基づく配列はＳＰ３４に基づく配列よりも強力であった（図１４、構築物１３と１５を比較する）。

標的細胞のＲＯＲ１発現レベルと細胞毒性の間に直接的な相関は観察されなかった（表５）。それにもかかわらず、抗ＲＯＲ１抗体のより高い親和性の変異体は、親のＷＴ配列よりも強力であった。これは、ＲＯＲ１の発現レベルが低い状況では、ますます重要になる可能性を有する。

これらの実験の結果は、ＣＤ３結合成分及びＲＯＲ１結合成分は、別々に最適化及び特徴付けを行うことができるが、最も活性な二重特異性結合分子は、異なる二重特異性構成を使用して結合成分の異なる対の経験的な試験を実施することを通してのみ確認することが可能であることを示している。該実験は、構築物９及び１８（構成Ｂ）が一貫して最も強力な抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３二重特異性結合分子の中にあることを示している。このことは、ＣＤ３結合実験によってこれらの構築物がＲＯＲ１の非存在下でジャーカット細胞への最も弱い結合剤の１つであることが示されたので、特に注目すべきである。ＲＯＲ１が腫瘍の微小環境に関与するまで、Ｔ細胞上のＣＤ３の活性化及びインターナリゼーションが最小限になるので、これは有用な特徴であると期待される。

Claims

ヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインに特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン及びヒトＣＤ３の細胞外ドメインに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含んでいる、二重特異性結合分子。
前記第１の抗原結合ドメインが、ヒトＲＯＲ１への結合について配列番号８２に記載されている重鎖アミノ酸配列及び配列番号８３に記載されている軽鎖アミノ酸配列を含んでいる抗体と競合するか、又は、該抗体と同じヒトＲＯＲ１のエピトープに結合する、請求項１に記載の二重特異性結合分子。
前記第１の抗原結合ドメインが、以下のものを含んでいる、請求項１に記載の二重特異性結合分子：
（ａ）それぞれ配列番号９７、６１、６２、６３、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいる重鎖（Ｈ）－ＣＤＲ１－３及び軽鎖（Ｌ）－ＣＤＲ１－３；
（ｂ）それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３；
（ｃ）配列番号７２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでいる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号７３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（ｄ）配列番号７４のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
（ｅ）配列番号７２のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
（ｆ）配列番号８４のアミノ酸配列を含んでいる重鎖（ＨＣ）及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖（ＬＣ）；
（ｇ）配列番号８２のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；
（ｈ）配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ；又は、
（ｉ）配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣ。
前記第２の抗原結合ドメインが、ヒトＣＤ３への結合について以下のものを含んでいる抗体と競合するか、又は、該抗体と同じヒトＣＤ３のエピトープに結合する、請求項１～３のいずれか１項に記載の二重特異性結合分子：
（ａ）配列番号７０のアミノ酸配列を含んでいる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号７１のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（ｂ）配列番号６６のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；又は、
（ｃ）配列番号６８のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号６９のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ。
前記第２の抗原結合ドメインが、以下のものを含んでいる、請求項１～３のいずれか１項に記載の二重特異性結合分子：
（ａ）それぞれ配列番号５４、５５、５６、５７、５８及び５９のアミノ酸配列を含んでいる重鎖（Ｈ）－ＣＤＲ１－３及び軽鎖（Ｌ）－ＣＤＲ１－３；
（ｂ）それぞれ配列番号４７、４８、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３；
（ｃ）それぞれ配列番号４７、５３、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＧＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３；
（ｄ）配列番号７０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでいる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号７１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（ｅ）配列番号６６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号６７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
（ｆ）配列番号６８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号６９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
（ｇ）配列番号７０のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号７１のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
（ｈ）配列番号６６のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
（ｉ）配列番号６８のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号６９のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
（ｊ）配列番号８０のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；
（ｋ）配列番号７６のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ；又は、
（ｌ）配列番号７８のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及び配列番号７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＬ。
以下のものを含んでいる、請求項１に記載の二重特異性結合分子：
（ａ）それぞれ配列番号９７、６１、６２、６３、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいる重鎖（Ｈ）－ＣＤＲ１－３及び軽鎖（Ｌ）－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号５４、５５、５６、５７、５８及び５９のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｂ）それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号５４、５５、５６、５７、５８及び５９のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｃ）それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号４７、５３、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｄ）それぞれ配列番号９７、６１、６２、６３、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号４７、４８、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｅ）それぞれ配列番号９７、６１、６２、６３、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号４７、５３、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン；又は、
（ｆ）それぞれ配列番号６０、６１、６２、６３、６４及び６５のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号４７、４８、４９、５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含んでいるＨ－ＣＤＲ１－３及びＬ－ＣＤＲ１－３を含んでいる第２の抗原結合ドメイン。
以下のものを含んでいる、請求項１に記載の二重特異性結合分子：
（ａ）それぞれ配列番号７４及び７３のアミノ酸配列を含んでいる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｂ）それぞれ配列番号７２及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｃ）それぞれ配列番号７２及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｄ）それぞれ配列番号７４及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｅ）それぞれ配列番号７４及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；又は、
（ｆ）それぞれ配列番号７２及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン。
以下のものを含んでいる、請求項１に記載の二重特異性結合分子：
（ａ）それぞれ配列番号７４及び７３のアミノ酸配列を含んでいる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｂ）それぞれ配列番号７２及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｃ）それぞれ配列番号７２及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｄ）それぞれ配列番号７４及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｅ）それぞれ配列番号７４及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；又は、
（ｆ）それぞれ配列番号７２及び７３のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン。
以下のものを含んでいる、請求項１に記載の二重特異性結合分子：
（ａ）それぞれ配列番号８４及び８３のアミノ酸配列を含んでいる重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｂ）それぞれ配列番号８２及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｃ）それぞれ配列番号８２及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｄ）それぞれ配列番号８４及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｅ）それぞれ配列番号８４及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｆ）それぞれ配列番号８２及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｇ）配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０７又は１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｈ）配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０６又は１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７０及び７１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｉ）配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０６又は１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｊ）配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０７又は１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｋ）配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０７又は１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６８及び６９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；又は、
（ｌ）配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０６又は１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号６６及び６７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン。
以下のものを含んでいる、請求項１に記載の二重特異性結合分子：
（ａ）それぞれ配列番号８４及び８３のアミノ酸配列を含んでいる重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｂ）それぞれ配列番号８２及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｃ）それぞれ配列番号８２及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｄ）それぞれ配列番号８４及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｅ）それぞれ配列番号８４及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｆ）それぞれ配列番号８２及び８３のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及びＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｇ）配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０７又は１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｈ）配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０６又は１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号８０及び８１のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｉ）配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０６又は１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｊ）配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０７又は１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；
（ｋ）配列番号８７のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０７又は１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７８及び７９のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン；又は、
（ｌ）配列番号８６のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ、配列番号１０６又は１０９のアミノ酸配列を含んでいるＨＣ及び配列番号８３のアミノ酸配列を含んでいるＬＣを含んでいる第１の抗原結合ドメイン、並びに、それぞれ配列番号７６及び７７のアミノ酸配列を含んでいるＶＨ及びＶＬを含んでいる第２の抗原結合ドメイン。
配列番号１４及び１９のアミノ酸配列を含んでいる、ヒトＲＯＲ１及びヒトＣＤ３に特異的に結合する二重特異性結合分子。
配列番号７及び１９のアミノ酸配列を含んでいる、ヒトＲＯＲ１及びヒトＣＤ３に特異的に結合する二重特異性結合分子。
配列番号７及び１８のアミノ酸配列を含んでいる、ヒトＲＯＲ１及びヒトＣＤ３に特異的に結合する二重特異性結合分子。
配列番号７及び２３のアミノ酸配列を含んでいる、ヒトＲＯＲ１及びヒトＣＤ３に特異的に結合する二重特異性結合分子。
以下のものを含んでいる、ヒトＲＯＲ１及びヒトＣＤ３に特異的に結合する二重特異性結合分子：
（ａ）配列番号１及び１６のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２及び１６のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３及び１６のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４及び１６のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号５及び１６のアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号６及び１６のアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号７及び１７のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号７及び２０のアミノ酸配列；
（ｉ）配列番号７及び２１のアミノ酸配列；
（ｊ）配列番号７及び２２のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号８、９及び１６のアミノ酸配列；
（ｌ）配列番号８、１０及び１６のアミノ酸配列；
（ｍ）配列番号８、１１及び１６のアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号１２、１１及び１６のアミノ酸配列；
（ｏ）配列番号１２、１３及び１６のアミノ酸配列；又は、
（ｐ）配列番号８、１５及び１６のアミノ酸配列。
（ａ）第１の抗原結合ドメインの結合価は２であり、及び、第２の抗原結合ドメインの結合価は２である；
（ｂ）第１の抗原結合ドメインの結合価は１であり、及び、第２の抗原結合ドメインの結合価は１である；又は、
（ｃ）第１の抗原結合ドメインの結合価は２であり、及び、第２の抗原結合ドメインの結合価は１である；
請求項１～１５のいずれか１項に記載の二重特異性結合分子。
ヒトＩｇＧ１定常領域を含んでいる、請求項１～８のいずれか１項に記載の二重特異性結合分子。
アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａ（ここで、該残基は、ＥＵシステムに従って番号が付けられている）を含んでいるヒトＩｇＧ１定常領域を含んでいる、請求項１～８のいずれか１項に記載の二重特異性結合分子。
前記第２の抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、請求項１～１８のいずれか１項に記載の二重特異性結合分子。
前記第２の抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖アミノ酸配列が、前記第１の抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖アミノ酸配列に、ペプチドリンカーを介して融合している、請求項１～１９のいずれか１項に記載の二重特異性結合分子。
前記第２の抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖アミノ酸配列と前記第１の抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖アミノ酸配列の間の前記ペプチドリンカーが、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９３）のアミノ酸配列を有している、請求項２０に記載の二重特異性結合分子。
前記第２の抗原結合ドメインが：
（ａ）前記第１の抗原結合ドメインの軽鎖のカルボキシ末端；又は、
（ｂ）前記第１の抗原結合ドメインの軽鎖のアミノ末端；
に融合している、請求項２０又は２１に記載の二重特異性結合分子。
以下の特性のうちの少なくとも１を有している、請求項１～２２のいずれか１項に記載の二重特異性結合分子：
（ａ）ＥＬＩＳＡで測定された固定化ＲＯＲ１のＫ_Ｄが０．５ｎＭ以下である；
（ｂ）ＥＬＩＳＡで測定された可溶性ｂ－ＲＯＲ１のＫ_Ｄが０．４ｎＭ以下である；
（ｃ）それぞれ配列番号８２及び８３の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含んでいる抗体と比較して、ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞及び／又はジャーカット細胞において低減されたインターナリゼーションを示す；
（ｄ）ＰＢＭＣに曝露されたＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞において、１μｇ／ｍＬ以下でＬＤＨ放出を誘発させる；
（ｅ）ＰＢＭＣに曝露されたＪｅＫｏ－１細胞において、１μｇ／ｍＬ以下でＬＤＨ放出を誘発させる；
（ｆ）ＰＢＭＣに曝露されたＭｉｎｏ細胞において、１μｇ／ｍＬ以下でＬＤＨ放出を誘発させる；
（ｇ）ＰＢＭＣに曝露されたＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞において、１μｇ／ｍＬ以下でＬＤＨ放出を誘発させる；
（ｈ）フローサイトメトリーで測定した場合、ＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞と共培養したＴ細胞の表面のＣＤ６９を１μｇ／ｍＬ以下でアップレギュレートする；
（ｉ）フローサイトメトリーで測定した場合、ＪｅＫｏ－１細胞と共培養したＴ細胞の表面のＣＤ６９を１μｇ／ｍＬ以下でアップレギュレートする；
（ｊ）フローサイトメトリーで測定した場合、Ｍｉｎｏ細胞と共培養したＴ細胞の表面のＣＤ６９を１μｇ／ｍＬ以下でアップレギュレートする；
（ｋ）フローサイトメトリーで測定した場合、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞と共培養したＴ細胞の表面のＣＤ６９を１μｇ／ｍＬ以下でアップレギュレートする；及び、
（ｌ）Ｊｅｋｏ－１細胞又はＲＯＲ１トランスフェクトＭＥＣ細胞と共培養したＴ細胞から、１μｇ／ｍＬ以下で、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１０、ＩＬ－６、ＩＬ－４及びＩＬ－２の放出を誘発させる。
細胞毒性剤にコンジュゲートした請求項１～２３のいずれか１項に記載の二重特異性結合分子を含んでいる、イムノコンジュゲート。
請求項１～２３のいずれか１項に記載の二重特異性結合分子及び薬学的に許容される賦形剤を含んでいる、医薬組成物。
単離された核酸分子であって、請求項１～２３のいずれか１項に記載の二重特異性結合分子の第１の抗原結合ドメインの重鎖及び軽鎖可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）をコードするヌクレオチド配列を含んでおり、並びに、さらに、請求項１～２３のいずれか１項に記載の二重特異性結合分子の第２の抗原結合ドメインのＶＨ及びＶＬをコードするヌクレオチド配列も含んでいる、前記単離された核酸分子。
（ａ）配列番号３７及び４２のヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号３０及び４２のヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号３０及び４１のヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号３０及び４６のヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号２４及び３９のヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号２５及び３９のヌクレオチド配列；
（ｇ）配列番号２６及び３９のヌクレオチド配列；
（ｈ）配列番号２７及び３９のヌクレオチド配列；
（ｉ）配列番号２８及び３９のヌクレオチド配列；
（ｊ）配列番号２９及び３９のヌクレオチド配列；
（ｋ）配列番号３０及び４０のヌクレオチド配列；
（ｌ）配列番号３０及び４３のヌクレオチド配列；
（ｍ）配列番号３０及び４４のヌクレオチド配列；
（ｎ）配列番号３０及び４５のヌクレオチド配列；
（ｏ）配列番号３１、３２及び３９のヌクレオチド配列；
（ｐ）配列番号３１、３３及び３９のヌクレオチド配列；
（ｑ）配列番号３１、３４及び３９のヌクレオチド配列；
（ｒ）配列番号３５、３４及び３９のヌクレオチド配列；
（ｓ）配列番号３５、３６及び３９のヌクレオチド配列；又は、
（ｔ）配列番号３１、３８及び３９のヌクレオチド配列；
を含んでいる、請求項２６に記載の単離された核酸分子。
は、以下のものを含んでいる：
請求項２６又は２７に記載の単離された核酸分子を含んでいる、ベクター。
宿主細胞であって、請求項１～２３のいずれか１項に記載の二重特異性結合分子の第１の抗原結合ドメインの重鎖及び軽鎖可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）をコードするヌクレオチド配列を含んでおり、並びに、さらに、請求項１～２３のいずれか１項に記載の二重特異性結合分子の第２の抗原結合ドメインのＶＨ及びＶＬをコードするヌクレオチド配列も含んでいる、前記宿主細胞。
前記宿主細胞が、
（ａ）配列番号３７及び４２；
（ｂ）配列番号３０及び４２；
（ｃ）配列番号３０及び４１；
（ｄ）配列番号３０及び４６；
（ｅ）配列番号２４及び３９；
（ｆ）配列番号２５及び３９；
（ｇ）配列番号２６及び３９；
（ｈ）配列番号２７及び３９；
（ｉ）配列番号２８及び３９；
（ｊ）配列番号２９及び３９；
（ｋ）配列番号３０及び４０；
（ｌ）配列番号３０及び４３；
（ｍ）配列番号３０及び４４；
（ｎ）配列番号３０及び４５；
（ｏ）配列番号３１、３２及び３９；
（ｐ）配列番号３１、３３及び３９；
（ｑ）配列番号３１、３４及び３９；
（ｒ）配列番号３５、３４及び３９；
（ｓ）配列番号３５、３６及び３９；又は、
（ｔ）配列番号３１、３８及び３９；
のヌクレオチド配列を含んでいる、請求項２９に記載の宿主細胞。
請求項１～２３のいずれか１項に記載の二重特異性結合分子を産生する方法であって、
請求項２９又は３０に記載の宿主細胞を提供すること；
前記二重特異性結合分子の発現に適した条件下で前記宿主細胞を培養すること；及び、
得られた二重特異性結合分子を単離すること；
を含んでいる、前記方法。
患者の癌を治療する方法であって、請求項１～２３のいずれか１項に記載の二重特異性結合分子を該患者に投与することを含む、前記方法。
患者の癌を治療するための薬剤を製造するための、請求項１～２３のいずれか１項に記載の二重特異性結合分子の使用。
患者の癌の治療において使用するための、請求項１～２３のいずれか１項に記載の二重特異性結合分子。
前記癌がＲＯＲ１陽性癌である、請求項３２～３４のいずれか１項に記載の方法、使用又は使用するための二重特異性結合分子。
前記癌が、白血病、リンパ腫又は固形腫瘍である、請求項３２～３４のいずれか１項に記載の方法、使用又は使用するための二重特異性結合分子。
前記癌が、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｔ細胞白血病、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、リンパ形質細胞様リンパ腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、多発性骨髄腫、辺縁帯リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫又はリヒター形質転換を受けた非ホジキンリンパ腫である、請求項３２～３４のいずれか１項に記載の方法、使用又は使用するための二重特異性結合分子。
前記癌が、結腸癌、非小細胞肺癌、膠芽腫、肝細胞癌、膵臓癌、ユーイング肉腫、骨肉腫、頭頸部癌、卵巣癌、乳癌又はトリプルネガティブ乳癌である、請求項３２～３４のいずれか１項に記載の方法、使用又は使用するための二重特異性結合分子。
前記患者が、追加の治療薬で治療される、請求項３２～３８のいずれか１項に記載の方法、使用又は使用するための二重特異性結合分子。
前記追加の治療薬が、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）阻害薬、Ｂ細胞リンパ腫２（Ｂｃｌ－２）阻害薬、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）阻害薬及びホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害薬からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法、使用又は使用するための二重特異性結合分子。
前記追加の治療薬が、イブルチニブ、アカラブルチニブ、ベネトクラクス、エベロリムス、サパニセルチブ及びイデラリシブからなる群から選択される、請求項３９に記載の方法、使用又は使用するための二重特異性結合分子。
請求項１～２３のいずれか１項に記載の二重特異性結合分子を含んでいる、キット。
請求項３２及び３５～４１のいずれか１項に記載の方法に従う癌の治療において使用するための、請求項４２に記載のキット。
請求項１～２３のいずれか１項に記載の二重特異性結合分子を含んでいる製品であって、ここで、該製品は、患者の癌を治療するのに適している、前記製品。
前記癌治療が、請求項３２及び３５～４１のいずれか１項に記載の方法に従う、請求項４４に記載の製品。