KR20220012313A - 항-ror1/항-cd3 이중특이적 결합 분자 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 ROR1 및 CD3에 결합하는 이중특이적 결합 분자, 및 질환 및 상태, 예컨대 암을 치료하기 위해 그를 사용하는 방법에 관한 것이다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참고
본 출원은 2019년 5월 23일에 출원한 미국 가특허 출원 62/852,039를 우선권으로 주장한다. 상기 우선권의 개시내용은 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다. 2020년 5월 18일에 생성된 서열 목록의 전자 사본은 024651_WO004_SL.txt의 명칭 및 258,844 바이트의 크기를 갖는다.
수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1)은 그의 리간드인 분비된 당단백질 Wnt5a로부터 신호를 매개하는 세포 표면 단백질이다. 배아 발생 동안에 줄기 세포의 운명에 영향을 미치는 그의 역할과 일치하게, ROR1 발현은 배아 전사 프로그램으로 되돌아가는 침습성 악성종양에서 관찰되지만, 정상적인 성인 조직에서는 관찰되지 않으며, 이는 치료 표적으로서 유리한 선택성 프로파일을 제공한다. ROR1은 일반적으로 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프모구성 백혈병 (CLL), 맨틀 세포 림프종 (MCL), 여포성 림프종 (FL), 변연부 림프종 (MZL), 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL), 및 리히터(Richter) 형질전환 또는 리히터 증후군 (RS)을 가진 환자의 악성 세포 상에서 발현된다. ROR1은 다발성 고형 종양의 세포 표면 상에도 존재하며, 이는 암 줄기 세포의 마커로 보인다. 이는 건강한 성인 조직에서는 상당한 수준으로 발현되지 않지만, 여러 혈액학적 및 고형 종양에서는 높은 수준의 발현을 나타나기 때문에, ROR1은 종양-특이적인 요법에서 매력적인 표적이다.
분화 클러스터 3 (CD3)은 T 세포 수용체 복합체 (TCR)와 회합하여 T 세포 상에서 발현되는 다량체성 단백질 복합체이며, T 세포 활성화를 위해 필요하다. 기능적 CD3은 4가지 별개의 쇄 (엡실론, 감마, 델타 및 제타) 중 2개의 이량체성 회합에 의해 하기 3쌍의 이량체 중 하나로 형성된다: 감마/엡실론, 델타/엡실론 및 제타/제타. CD3에 대한 항체는 T 세포 상에서 CD3을 클러스터화하여, T 세포 활성화를 유발하는 것으로 나타났다. 따라서, 항-CD3 항체는 T 세포의 활성화를 수반하는 치료 목적을 위해 제안되었다. 예를 들어, CD3 및 표적 항원에 결합할 수 있는 이중특이적인 항체는 표적 항원을 발현하는 조직 및 세포에 대한 T 세포 면역 반응을 표적화하는 것을 수반하는 치료 용도를 위해 제안되었다. CD19 x CD3 이중특이적인 T-세포 인게이저 (BiTE)인 블리나투모맙의 최근 승인은 이 접근법을 검증하였다.
이중특이적 결합 분자에 대한 수많은 포맷 및 조성물이 기재되었다. PK, 표적화된 항원 에피토프, 항원-결합 성분의 상대적인 친화도, 및 파라토프의 결합가 및 공간 구성을 비롯한 여러 변수가 이들 분자의 생체내 효능에 영향을 미친다. 현재, 이중특이적 결합 분자, 예컨대 ROR1 및 CD3 둘 다에 특이적으로 결합하는 항체에 대한 이들 모든 파라미터를 최적화시키는 선험적인 단일 분자를 설계하는 신뢰할만한 방법이 없다. 이중특이적인 구축물은 이들 여러 파라미터의 영향을 체계적으로 평가하고, 암 치료와 같은 치료 용도를 위한 최적의 이중특이적 결합 분자를 선택하기 위해 설계되고, 제조되고, 시험되어야 한다.
상기 관점에서, ROR1 항원의 종양 특이성을 재지정된 T 세포의 강력한 활성과 조합시키는 신규하고 개선된 암 치료제가 필요하다.
본 발명은 ROR1 및 CD3을 표적화하는 신규한 이중특이적 결합 분자, 뿐만 아니라 이들 항체 중 하나 이상을 포함하는 제약 조성물, 및 암 치료를 위한 항체 및 제약 조성물의 용도에 관한 것이다. 항체 치료를 비롯하여 현재 이용가능한 암 치료와 비교하여, 본 발명의 이중특이적 결합 분자가 우수한 임상 반응을 제공할 수 있는 것으로 고려된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 ROR1의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인 및 인간 CD3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 이중특이적 결합 분자를 제공한다.
특정한 실시양태에서, 제1 항원-결합 도메인은 인간 ROR1에 결합하기 위해 서열식별번호(SEQ ID NO): 82에 제시된 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 83에 제시된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체와 경쟁하거나, 또는 그와 동일한 인간 ROR1 에피토프에 결합한다. 특별한 실시양태에서, 제1 항원-결합 도메인은 하기를 포함한다:
a) 각각 서열식별번호: 97, 61, 62, 63, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 (H)-CDR1-3 및 경쇄 (L)-CDR1-3;
b) 각각 서열식별번호: 60, 61, 62, 63, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3;
c) 서열식별번호: 72와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열식별번호: 73과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL);
d) 서열식별번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
e) 서열식별번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
f) 서열식별번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 (HC) 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 (LC);
g) 서열식별번호: 82의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
h) 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC; 또는
i) 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC.
특정한 실시양태에서, 제2 항원-결합 도메인은 인간 CD3에 결합하기 위해 하기를 포함하는 항체와 경쟁하거나, 또는 그와 동일한 인간 CD3 에피토프에 결합한다:
a) 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열식별번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL);
b) 서열식별번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
c) 서열식별번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 VL. 특별한 실시양태에서, 제2 항원-결합 도메인은 하기를 포함한다:
a) 각각 서열식별번호: 54, 55, 56, 57, 58, 및 59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 (H)-CDR1-3 및 경쇄 (L)-CDR1-3;
b) 각각 서열식별번호: 47, 48, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3;
c) 각각 서열식별번호: 47, 53, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3;
d) 서열식별번호: 70과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열식별번호: 71과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL);
e) 서열식별번호: 66과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 67과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
f) 서열식별번호: 68과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 69와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
g) 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
h) 서열식별번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
i) 서열식별번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
j) 서열식별번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
k) 서열식별번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
l) 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 VL.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 이중특이적 결합 분자를 제공한다:
a) 각각 서열식별번호: 97, 61, 62, 63, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 (H)-CDR1-3 및 경쇄 (L)-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 54, 55, 56, 57, 58, 및 59의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
b) 각각 서열식별번호: 60, 61, 62, 63, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 54, 55, 56, 57, 58, 및 59의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
c) 각각 서열식별번호: 60, 61, 62, 63, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 47, 53, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
d) 각각 서열식별번호: 97, 61, 62, 63, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 47, 48, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
e) 각각 서열식별번호: 97, 61, 62, 63, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 47, 53, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인; 또는
f) 각각 서열식별번호: 60, 61, 62, 63, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 47, 48, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 이중특이적 결합 분자를 제공한다:
a) 각각 서열식별번호: 74 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
b) 각각 서열식별번호: 72 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
c) 각각 서열식별번호: 72 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
d) 각각 서열식별번호: 74 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
e) 각각 서열식별번호: 74 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인; 또는
f) 각각 서열식별번호: 72 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 이중특이적 결합 분자를 제공한다:
a) 각각 서열식별번호: 74 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
b) 각각 서열식별번호: 72 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
c) 각각 서열식별번호: 72 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
d) 각각 서열식별번호: 74 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
e) 각각 서열식별번호: 74 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인; 또는
f) 각각 서열식별번호: 72 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 이중특이적 결합 분자를 제공한다:
a) 각각 서열식별번호: 84 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
b) 각각 서열식별번호: 82 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
c) 각각 서열식별번호: 82 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
d) 각각 서열식별번호: 84 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
e) 각각 서열식별번호: 84 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
f) 각각 서열식별번호: 82 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
g) 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 107 또는 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
h) 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 106 또는 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
i) 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 106 또는 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
j) 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 107 또는 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
k) 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 107 또는 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인; 또는
l) 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 106 또는 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 이중특이적 결합 분자를 제공한다:
a) 각각 서열식별번호: 84 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
b) 각각 서열식별번호: 82 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
c) 각각 서열식별번호: 82 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
d) 각각 서열식별번호: 84 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
e) 각각 서열식별번호: 84 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
f) 각각 서열식별번호: 82 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
g) 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 107 또는 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
h) 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 106 또는 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
i) 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 106 또는 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
j) 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 107 또는 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
k) 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 107 또는 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인; 또는
l) 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 106 또는 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인.
특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 서열식별번호: 14 및 19, 서열식별번호: 7 및 19, 서열식별번호: 7 및 18, 또는 서열식별번호: 7 및 23의 아미노산 서열을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 하기를 포함한다:
a) 서열식별번호: 1 및 16의 아미노산 서열;
b) 서열식별번호: 2 및 16의 아미노산 서열;
c) 서열식별번호: 3 및 16의 아미노산 서열;
d) 서열식별번호: 4 및 16의 아미노산 서열;
e) 서열식별번호: 5 및 16의 아미노산 서열;
f) 서열식별번호: 6 및 16의 아미노산 서열;
g) 서열식별번호: 7 및 17의 아미노산 서열;
h) 서열식별번호: 7 및 20의 아미노산 서열;
i) 서열식별번호: 7 및 21의 아미노산 서열;
j) 서열식별번호: 7 및 22의 아미노산 서열;
k) 서열식별번호: 8, 9, 및 16의 아미노산 서열;
l) 서열식별번호: 8, 10, 및 16의 아미노산 서열;
m) 서열식별번호: 8, 11, 및 16의 아미노산 서열;
n) 서열식별번호: 12, 11, 및 16의 아미노산 서열;
o) 서열식별번호: 12, 13, 및 16의 아미노산 서열; 또는
p) 서열식별번호: 8, 15, 및 16의 아미노산 서열.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이중특이적 결합 분자는 제1 및 제2 항원-결합 도메인에 대해 하기 임의의 결합가를 가질 수 있다:
a) 제1 항원-결합 도메인은 2의 결합가를 갖고, 제2 항원-결합 도메인은 2의 결합가를 갖거나;
b) 제1 항원-결합 도메인은 1의 결합가를 갖고, 제2 항원-결합 도메인은 1의 결합가를 갖거나; 또는
c) 제1 항원-결합 도메인은 2의 결합가를 갖고, 제2 항원-결합 도메인은 1의 결합가를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이중특이적 결합 분자는 인간 IgG1 불변 영역을 포함할 수 있고; 상기 불변 영역은 아미노산 치환 L234A, L235A, 및/또는 G237A를 함유할 수 있고, 여기서 잔기는 EU 시스템에 따라 넘버링된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이중특이적 결합 분자의 제2 항원-결합 도메인은 scFv이다.
본원에 기재된 이중특이적 결합 분자의 일부 실시양태에서, 제2 항원-결합 도메인의 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열은 펩티드 링커를 통해 제1 항원-결합 도메인의 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열에 융합된다. 특정한 실시양태에서, 펩티드 링커는 GGGGSGGGGS의 아미노산 서열 (서열식별번호: 93)을 갖는다. 특별한 실시양태에서, 제2 항원-결합 도메인의 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열은 예를 들어 하기에 융합될 수 있다:
a) 제1 항원-결합 도메인의 경쇄의 카르복시-말단; 또는
b) 제1 항원-결합 도메인의 경쇄의 아미노-말단.
특정한 실시양태에서, 본원에 기재된 이중특이적 결합 분자는 하기 성질 중 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개)를 갖는다:
a) ELISA에 의해 결정되는 바와 같이 0.5 nM 이하의 고정된 ROR1에 대한 KD를 갖고;
b) ELISA에 의해 결정되는 바와 같이 0.4 nM 이하의 가용성 b-ROR1에 대한 KD를 갖고;
c) 각각 서열식별번호: 82 및 83의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체와 비교하여 ROR1-형질감염된 MEC 세포 및/또는 Jurkat 세포에서 감소된 내재화를 입증하고;
d) 1 μg/mL 이하에서 PBMC-노출된 ROR1-형질감염된 MEC 세포에서 LDH 방출을 유도하고;
e) 1 μg/mL 이하에서 PBMC-노출된 JeKo-1 세포에서 LDH 방출을 유도하고;
f) 1 μg/mL 이하에서 PBMC-노출된 Mino 세포에서 LDH 방출을 유도하고;
g) 1 μg/mL 이하에서 PBMC-노출된 MDA-MB-468 세포에서 LDH 방출을 유도하고;
h) 유세포 측정에 의해 결정되는 바와 같이 1 μg/mL 이하에서 ROR1-형질감염된 MEC 세포와 공동-배양한 T 세포의 표면 상에서 CD69를 상향조절하고;
i) 유세포 측정에 의해 결정되는 바와 같이 1 μg/mL 이하에서 JeKo-1 세포와 공동-배양한 T 세포의 표면 상에서 CD69를 상향조절하고;
j) 유세포 측정에 의해 결정되는 바와 같이 1 μg/mL 이하에서 Mino 세포와 공동-배양한 T 세포의 표면 상에서 CD69를 상향조절하고;
k) 유세포 측정에 의해 결정되는 바와 같이 1 μg/mL 이하에서 MDA-MB-468 세포와 공동-배양한 T 세포의 표면 상에서 CD69를 상향조절하고;
l) 1 μg/mL 이하에서 Jeko-1 또는 ROR1-형질감염된 MEC 세포와 공동-배양한 T 세포로부터 IFN-γ, TNF-α, IL-10, IL-6, IL-4, 및 IL-2의 방출을 유도한다.
본 개시내용은 또한 세포독성제에 접합된 본원에 기재된 이중특이적 결합 분자를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 이중특이적 결합 분자 및 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 이중특이적 결합 분자의 제1 항원-결합 도메인의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 (VH 및 VL)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2 항원-결합 도메인의 VH 및 VL을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 하나 이상의 단리된 핵산 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산 분자(들)은 하기를 포함한다:
a) 서열식별번호: 37 및 42의 뉴클레오티드 서열;
b) 서열식별번호: 30 및 42의 뉴클레오티드 서열;
c) 서열식별번호: 30 및 41의 뉴클레오티드 서열;
d) 서열식별번호: 30 및 46의 뉴클레오티드 서열;
e) 서열식별번호: 24 및 39의 뉴클레오티드 서열;
f) 서열식별번호: 25 및 39의 뉴클레오티드 서열;
g) 서열식별번호: 26 및 39의 뉴클레오티드 서열;
h) 서열식별번호: 27 및 39의 뉴클레오티드 서열;
i) 서열식별번호: 28 및 39의 뉴클레오티드 서열;
j) 서열식별번호: 29 및 39의 뉴클레오티드 서열;
k) 서열식별번호: 30 및 40의 뉴클레오티드 서열;
l) 서열식별번호: 30 및 43의 뉴클레오티드 서열;
m) 서열식별번호: 30 및 44의 뉴클레오티드 서열;
n) 서열식별번호: 30 및 45의 뉴클레오티드 서열;
o) 서열식별번호: 31, 32, 및 39의 뉴클레오티드 서열;
p) 서열식별번호: 31, 33 및 39의 뉴클레오티드 서열;
q) 서열식별번호: 31, 34, 및 39의 뉴클레오티드 서열;
r) 서열식별번호: 35, 34, 및 39의 뉴클레오티드 서열;
s) 서열식별번호: 35, 36, 및 39의 뉴클레오티드 서열; 또는
t) 서열식별번호: 31, 38, 및 39의 뉴클레오티드 서열.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 단리된 핵산 분자(들)를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 이중특이적 결합 분자의 제1 항원-결합 도메인의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 (VH 및 VL)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2 항원-결합 도메인의 VH 및 VL을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 하기 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
a) 서열식별번호: 37 및 42;
b) 서열식별번호: 30 및 42;
c) 서열식별번호: 30 및 41;
d) 서열식별번호: 30 및 46;
e) 서열식별번호: 24 및 39;
f) 서열식별번호: 25 및 39;
g) 서열식별번호: 26 및 39;
h) 서열식별번호: 27 및 39;
i) 서열식별번호: 28 및 39;
j) 서열식별번호: 29 및 39;
k) 서열식별번호: 30 및 40;
l) 서열식별번호: 30 및 43;
m) 서열식별번호: 30 및 44;
n) 서열식별번호: 30 및 45;
o) 서열식별번호: 31, 32, 및 39;
p) 서열식별번호: 31, 33 및 39;
q) 서열식별번호: 31, 34, 및 39;
r) 서열식별번호: 35, 34, 및 39;
s) 서열식별번호: 35, 36, 및 39; 또는
t) 서열식별번호: 31, 38, 및 39.
본 발명은 또한 본원에 기재된 숙주 세포를 제공하고, 이중특이적 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에 상기 숙주 세포를 배양하고, 생성된 이중특이적 결합 분자를 단리하는 것을 포함하는, 본원에 기재된 이중특이적 결합 분자를 생성하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 환자에게 본원에 기재된 이중특이적 결합 분자를 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 추가로, 본 개시내용은 환자에서 암을 치료하기 위한 의약을 제조하기 위한 본원에 기재된 이중특이적 결합 분자의 용도, 및 환자에서 암을 치료하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 이중특이적 결합 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 암은 ROR1-양성 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 백혈병, 림프종, 또는 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 암은 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, T-세포 백혈병, 맨틀 세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 여포성 림프종, 버킷(Burkitt) 림프종, T 세포 비-호지킨(Hodgkin) 림프종, 림프형질세포양 림프종, 발덴스트롬(Waldenstroem) 마크로글로불린혈증, 다발성 골수종, 변연부 림프종, 소형 림프구성 림프종, 또는 리히터 형질전환을 거친 비-호지킨 림프종이다. 일부 실시양태에서, 암은 결장암, 비-소세포 폐암, 교모세포종, 간세포 암종, 췌장암, 유잉(Ewing) 육종, 골육종, 두경부암, 난소암, 유방암, 또는 삼중 음성 유방암이다. 특정한 실시양태에서, 환자는 1종 이상의 추가의 치료제, 예컨대 브루톤(Bruton) 티로신 키나제 (BTK) 억제제, B-세포 림프종 2 (Bcl-2) 억제제, 라파마이신의 포유동물 표적 (mTOR) 억제제, 및/또는 포스포이노시티드 3-키나제 (PI3K) 억제제로 치료될 수 있다. 특별한 실시양태에서, 추가의 치료제는 이브루티닙, 아칼라브루티닙, 베네토클락스, 에베롤리무스, 사파니세르팁, 또는 이델랄리십이다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 이중특이적 결합 분자를 포함하는 키트를 제공한다. 추가로, 본 개시내용은 본원에 기재된 이중특이적 결합 분자를 포함하는 제조 물품을 제공하며, 상기 제조 물품은 환자에서 암 치료에 적합하다.
도 1은 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자의 예시적인 구성을 나타내는 개략적인 다이어그램이다.
도 2는 ELISA에 의해 (패널 A) 및 살아있는 ROR1-형질감염된 MEC 세포에 대한 결합의 유세포 측정 분석에 의해 (패널 B) 결정되는 바와 같이, 모 Ab1 Fab (WT) 및 3가지 중쇄 변이체 (Ab2 (T32A), Ab3 (T32E), 및 W110Y)의 인간 ROR1에 대한 결합을 나타내는 그래프 쌍이다.
도 3은 연장된 세척 조건을 이용하여 ELISA에 의해 결정되는 바와 같이, 모 Ab1 Fab (WT) 및 3가지 변이체 (Ab2 (T32A), Ab6 (T32A (HC) + A25P (LC)), 및 Ab7 (T32A (HC) + T69R (LC)))의 인간 ROR1에 대한 결합을 나타내는 그래프이다.
도 4는 ROR1-형질감염된 MEC 세포 (패널 A) 및 대조군 MEC 세포 (패널 B)에 대한 결합의 유세포 측정 분석에 의해 입증되는 바와 같이, ROR1에 대한 이중특이적인 구축물 1-3, 7-9, 및 13-15의 선택성을 나타내는 그래프 쌍이다. 대조군으로서 비특이적인 인간 IgG가 포함되었다 ("대조군").
도 5는 이중특이적인 구축물 1-3, 7-9, 및 13-15 (패널 A), 4-6 및 10-12 (패널 B), 및 3, 9, 및 15-20 (패널 C)의 결합에 대한 ROR1 발현 수준의 영향을 나타내는 그래프 세트이다. 결합은 ROR1-형질감염된 MEC 세포 (~56,000 카피/세포)에 비해 낮은 수준의 ROR1 (~13,000 카피/세포)을 발현하는 JeKo-1 세포를 이용하여 유세포 측정에 의해 평가되었다.
도 6은 ELISA에 의해 특징분석되는 바와 같이, 고정된 인간 ROR1에 대한 이중특이적인 구축물의 결합을 나타내는 그래프 쌍이다.
도 7은 ELISA에 의해 특징분석되는 바와 같이, 가용성의 비오틴화 인간 ROR1에 대한 이중특이적인 구축물의 결합을 나타내는 그래프이다.
도 8은 구축물 1 (패널 A), 구축물 7 (패널 B), 및 구축물 13 (패널 C)과 함께 인큐베이션한 ROR1-형질감염된 MEC 세포에 대해, ROR1에 결합된 이중특이적 결합 분자의 세포 표면 수준 ("표면 biAb"), 이중특이적 결합 분자에 결합되지 않은 유리 ROR1의 세포 표면 수준 ("비점유 에피토프"), 및 전체 세포 표면 ROR1 ("전체 ROR1")을 나타내는 그래프 세트이다.
도 9는 구축물 19 (패널 A) 및 구축물 20 (패널 B)과 함께 인큐베이션한 ROR1-형질감염된 MEC 세포에 대해, ROR1에 결합된 이중특이적 결합 분자의 세포 표면 수준 ("표면 biAb"), 이중특이적 결합 분자에 결합되지 않은 유리 ROR1의 세포 표면 수준 ("비점유 에피토프"), 및 전체 세포 표면 ROR1 ("전체 ROR1")을 나타내는 그래프 쌍이다.
도 10은 24 시간 동안 인큐베이션 후에 ROR-1 형질감염된 MEC 세포의 표면 상에서 이중특이적인 구축물 1, 7, 및 13의 정량화를 나타내는 그래프이다.
도 11은 유세포 측정 분석에 의해 입증되는 바와 같이, 이중특이적인 구축물 1-6 (패널 A), 7-12 (패널 B), 및 13-15 (패널 C)의 Jurkat 세포에 대한 결합을 나타내는 그래프 세트이다. 대조군으로서 비특이적인 인간 IgG가 포함되었다 ("대조군").
도 12는 유세포 측정 분석에 의해 입증되는 바와 같이, 이중특이적인 구축물 1, 7, 및 13 (패널 A), 및 이중특이적인 구축물 3, 9, 및 15-10 (패널 B)의 Jurkat 세포에 대한 결합을 나타내는 그래프 쌍이다. 한 실험에서는 대조군으로서 비특이적인 인간 IgG가 포함된 반면에 (패널 A, "대조군"), 두번째 실험에서는 대조군으로서 관련이 없는 ROR1 x CD3 이중특이적인 구축물 (미국 특허 공보 2017/0233472)이 포함되었다 (패널 B, "대조군 1").
도 13은 ROR1의 부재하에 CD3과의 결합 후에 시간 경과에 따른 Jurkat 세포의 표면 상에서 이중특이적인 구축물 1-3, 7-9, 및 13-15의 수준을 정량화하는 그래프이다.
도 14는 ROR1-형질감염된 MEC 세포로부터 LDH 방출 (패널 A) 및 CD8+ 세포 상에서 CD69의 세포 표면 수준 (패널 B)을 정량화하는 그래프 쌍이며, 여기서 ROR1-형질감염된 MEC 세포는 (1) 인간 PBMC, 및 (2) 이중특이적인 구축물 1, 3, 7, 9, 13, 및 15, 및 대조군 항-CD19/항-CD3 이중특이적 결합 분자 ("CD19 x CD3")와 함께 인큐베이션된다.
도 15는 ROR1-형질감염된 MEC 세포로부터 LDH 방출 (패널 A) 및 CD8+ 세포 상에서 CD69의 세포 표면 수준 (패널 B)을 정량화하는 그래프 쌍이며, 여기서 ROR1-형질감염된 MEC 세포는 인간 PBMC 및 이중특이적인 구축물 3, 9, 및 15-20과 함께 인큐베이션된다.
도 16은 (1) PBMC, 및 (2) 이중특이적인 구축물 1-3, 7-9, 및 13-15, 및 항-CD19/항-CD3 이중특이적 결합 분자 대조군과 함께 인큐베이션한 ROR1-형질감염된 및 비-형질감염된 MEC 세포로부터 LDH 방출을 비교하는 그래프이다. LDH 방출은 또한 표적 세포를 함유하지 않는 샘플 ("PBMC") 및 이중특이적인 구축물을 함유하지 않는 샘플 ("biAb 없음")에서 평가된다.
도 17은 T 세포에 대한 CD69 수준을 평가하는 그래프 세트이며, 여기서 ROR1-/CD19+ MEC 세포 (패널 A) 또는 ROR1+/CD19+ MEC 세포 (패널 B)는 (1) T 세포, 및 (2) 이중특이적인 구축물 7 또는 대조군 항-CD19/항-CD3 이중특이적 결합 분자 ("CD19 x CD3")와 인큐베이션된다.
도 18은 JeKo-1 세포로부터 LDH 방출 (패널 A) 및 CD8+ 세포 상에서 CD69의 세포 표면 수준 (패널 B)을 정량화하는 그래프 쌍이며, 여기서 JeKo-1 세포는 인간 PBMC 및 이중특이적인 구축물 2, 3, 8, 9, 14, 및 15와 함께 인큐베이션된다.
도 19는 JeKo-1 세포로부터 LDH 방출 (패널 A) 및 CD8+ 세포 상에서 CD69의 세포 표면 수준 (패널 B)을 정량화하는 그래프 쌍이며, 여기서 JeKo-1 세포는 인간 PBMC 및 이중특이적인 구축물 3, 7, 9, 및 15-20과 함께 인큐베이션된다.
도 20은 Mino 세포로부터 LDH 방출 (패널 A) 및 CD8+ 세포 상에서 CD69의 세포 표면 수준 (패널 B)을 정량화하는 그래프 쌍이며, 여기서 Mino 세포는 인간 PBMC 및 이중특이적인 구축물 7-9와 함께 인큐베이션된다.
도 21은 MDA-MB-468 세포로부터 LDH 방출 (패널 A) 및 CD8+ 세포 상에서 CD69의 세포 표면 수준 (패널 B)을 정량화하는 그래프 쌍이며, 여기서 MDA-MB-468 세포는 인간 PBMC 및 이중특이적인 구축물 2, 3, 8, 9, 12, 및 14와 함께 인큐베이션된다.
도 22는 MDA-MB-468 세포로부터 LDH 방출 (패널 A) 및 CD8+ 세포 상에서 CD69의 세포 표면 수준 (패널 B)을 정량화하는 그래프 쌍이며, 여기서 MDA-MB-468 세포는 인간 PBMC 및 이중특이적인 구축물 9, 18, 및 20과 함께 인큐베이션된다.
도 23은 지정된 표적 세포 및 이중특이적인 구축물 7, 9, 18, 및 20 (패널 A) 또는 9, 18, 20 (패널 B 및 C)에 의한 T 세포의 활성화 후에, JeKo-1 세포 (패널 A), ROR1-형질감염된 MEC 세포 (패널 B), 및 모의-형질감염된 ROR1- MEC 세포 (패널 C)로부터 TNF-α의 방출을 정량화하는 그래프 세트이다. 모의-형질감염된 ROR1- MEC 세포 (패널 C)는 단일 농도 (1 μg/mL)의 이중특이적인 구축물로 처리되었다. "대조군 1"은 관련이 없는 ROR1 x CD3 이중특이적인 구축물이다.
도 24는 지정된 표적 세포 및 이중특이적인 구축물 7, 9, 18, 및 20 (패널 A) 또는 9, 18, 및 20 (패널 B 및 C)에 의한 T 세포의 활성화 후에, JeKo-1 세포 (패널 A), ROR1-형질감염된 MEC 세포 (패널 B), 및 모의-형질감염된 ROR1- MEC 세포 (패널 C)로부터 IFN-γ의 방출을 정량화하는 그래프 세트이다. 모의-형질감염된 ROR1- MEC 세포 (패널 C)는 단일 농도 (1 μg/mL)의 이중특이적인 구축물로 처리되었다. "대조군 1"은 관련이 없는 ROR1 x CD3 이중특이적인 구축물이다.
도 25는 지정된 표적 세포 및 이중특이적인 구축물 7, 9, 18, 및 20 (패널 A) 또는 9, 18, 및 20 (패널 B 및 C)에 의한 T 세포의 활성화 후에, JeKo-1 세포 (패널 A), ROR1-형질감염된 MEC 세포 (패널 B), 및 모의-형질감염된 ROR1- MEC 세포 (패널 C)로부터 IL-2의 방출을 정량화하는 그래프 세트이다. 모의-형질감염된 ROR1- MEC 세포 (패널 C)는 단일 농도 (1 μg/mL)의 이중특이적인 구축물로 처리되었다. "대조군 1"은 관련이 없는 ROR1 x CD3 이중특이적인 구축물이다.
도 26은 지정된 표적 세포 및 이중특이적인 구축물 7, 9, 18, 및 20 (패널 A) 또는 9, 18, 및 20 (패널 B 및 C)에 의한 T 세포의 활성화 후에, JeKo-1 세포 (패널 A), ROR1-형질감염된 MEC 세포 (패널 B), 및 모의-형질감염된 ROR1- MEC 세포 (패널 C)로부터 IL-4의 방출을 정량화하는 그래프 세트이다. 모의-형질감염된 ROR1- MEC 세포 (패널 C)는 단일 농도 (1 μg/mL)의 이중특이적인 구축물로 처리되었다. "대조군 1"은 관련이 없는 ROR1 x CD3 이중특이적인 구축물이다.
도 27은 지정된 표적 세포 및 이중특이적인 구축물 7, 9, 18, 및 20 (패널 A) 또는 9, 18, 및 20 (패널 B 및 C)에 의한 T 세포의 활성화 후에, JeKo-1 세포 (패널 A), ROR1-형질감염된 MEC 세포 (패널 B), 및 모의-형질감염된 ROR1- MEC 세포 (패널 C)로부터 IL-6의 방출을 정량화하는 그래프 세트이며, 모의-형질감염된 ROR1- MEC 세포 (패널 C)는 단일 농도 (1 μg/mL)의 이중특이적인 구축물로 처리되었다. "대조군 1"은 관련이 없는 ROR1 x CD3 이중특이적인 구축물이다.
도 28은 지정된 표적 세포 및 이중특이적인 구축물 7, 9, 18, 및 20 (패널 A) 또는 9, 18, 및 20 (패널 B 및 C)에 의한 T 세포의 활성화 후에, JeKo-1 세포 (패널 A), ROR1-형질감염된 MEC 세포 (패널 B), 및 모의-형질감염된 ROR1- MEC 세포 (패널 C)로부터 IL-10의 방출을 정량화하는 그래프 세트이다. 모의-형질감염된 ROR1- MEC 세포 (패널 C)는 단일 농도 (1 μg/mL)의 이중특이적인 구축물로 처리되었다. "대조군 1"은 관련이 없는 ROR1 x CD3 이중특이적인 구축물이다.
도 29는 항-ROR1 및 항-CD3 항원-결합 도메인의 지정된 서열에 대한 서열식별번호를 나타내는 표이다.
도 2는 ELISA에 의해 (패널 A) 및 살아있는 ROR1-형질감염된 MEC 세포에 대한 결합의 유세포 측정 분석에 의해 (패널 B) 결정되는 바와 같이, 모 Ab1 Fab (WT) 및 3가지 중쇄 변이체 (Ab2 (T32A), Ab3 (T32E), 및 W110Y)의 인간 ROR1에 대한 결합을 나타내는 그래프 쌍이다.
도 3은 연장된 세척 조건을 이용하여 ELISA에 의해 결정되는 바와 같이, 모 Ab1 Fab (WT) 및 3가지 변이체 (Ab2 (T32A), Ab6 (T32A (HC) + A25P (LC)), 및 Ab7 (T32A (HC) + T69R (LC)))의 인간 ROR1에 대한 결합을 나타내는 그래프이다.
도 4는 ROR1-형질감염된 MEC 세포 (패널 A) 및 대조군 MEC 세포 (패널 B)에 대한 결합의 유세포 측정 분석에 의해 입증되는 바와 같이, ROR1에 대한 이중특이적인 구축물 1-3, 7-9, 및 13-15의 선택성을 나타내는 그래프 쌍이다. 대조군으로서 비특이적인 인간 IgG가 포함되었다 ("대조군").
도 5는 이중특이적인 구축물 1-3, 7-9, 및 13-15 (패널 A), 4-6 및 10-12 (패널 B), 및 3, 9, 및 15-20 (패널 C)의 결합에 대한 ROR1 발현 수준의 영향을 나타내는 그래프 세트이다. 결합은 ROR1-형질감염된 MEC 세포 (~56,000 카피/세포)에 비해 낮은 수준의 ROR1 (~13,000 카피/세포)을 발현하는 JeKo-1 세포를 이용하여 유세포 측정에 의해 평가되었다.
도 6은 ELISA에 의해 특징분석되는 바와 같이, 고정된 인간 ROR1에 대한 이중특이적인 구축물의 결합을 나타내는 그래프 쌍이다.
도 7은 ELISA에 의해 특징분석되는 바와 같이, 가용성의 비오틴화 인간 ROR1에 대한 이중특이적인 구축물의 결합을 나타내는 그래프이다.
도 8은 구축물 1 (패널 A), 구축물 7 (패널 B), 및 구축물 13 (패널 C)과 함께 인큐베이션한 ROR1-형질감염된 MEC 세포에 대해, ROR1에 결합된 이중특이적 결합 분자의 세포 표면 수준 ("표면 biAb"), 이중특이적 결합 분자에 결합되지 않은 유리 ROR1의 세포 표면 수준 ("비점유 에피토프"), 및 전체 세포 표면 ROR1 ("전체 ROR1")을 나타내는 그래프 세트이다.
도 9는 구축물 19 (패널 A) 및 구축물 20 (패널 B)과 함께 인큐베이션한 ROR1-형질감염된 MEC 세포에 대해, ROR1에 결합된 이중특이적 결합 분자의 세포 표면 수준 ("표면 biAb"), 이중특이적 결합 분자에 결합되지 않은 유리 ROR1의 세포 표면 수준 ("비점유 에피토프"), 및 전체 세포 표면 ROR1 ("전체 ROR1")을 나타내는 그래프 쌍이다.
도 10은 24 시간 동안 인큐베이션 후에 ROR-1 형질감염된 MEC 세포의 표면 상에서 이중특이적인 구축물 1, 7, 및 13의 정량화를 나타내는 그래프이다.
도 11은 유세포 측정 분석에 의해 입증되는 바와 같이, 이중특이적인 구축물 1-6 (패널 A), 7-12 (패널 B), 및 13-15 (패널 C)의 Jurkat 세포에 대한 결합을 나타내는 그래프 세트이다. 대조군으로서 비특이적인 인간 IgG가 포함되었다 ("대조군").
도 12는 유세포 측정 분석에 의해 입증되는 바와 같이, 이중특이적인 구축물 1, 7, 및 13 (패널 A), 및 이중특이적인 구축물 3, 9, 및 15-10 (패널 B)의 Jurkat 세포에 대한 결합을 나타내는 그래프 쌍이다. 한 실험에서는 대조군으로서 비특이적인 인간 IgG가 포함된 반면에 (패널 A, "대조군"), 두번째 실험에서는 대조군으로서 관련이 없는 ROR1 x CD3 이중특이적인 구축물 (미국 특허 공보 2017/0233472)이 포함되었다 (패널 B, "대조군 1").
도 13은 ROR1의 부재하에 CD3과의 결합 후에 시간 경과에 따른 Jurkat 세포의 표면 상에서 이중특이적인 구축물 1-3, 7-9, 및 13-15의 수준을 정량화하는 그래프이다.
도 14는 ROR1-형질감염된 MEC 세포로부터 LDH 방출 (패널 A) 및 CD8+ 세포 상에서 CD69의 세포 표면 수준 (패널 B)을 정량화하는 그래프 쌍이며, 여기서 ROR1-형질감염된 MEC 세포는 (1) 인간 PBMC, 및 (2) 이중특이적인 구축물 1, 3, 7, 9, 13, 및 15, 및 대조군 항-CD19/항-CD3 이중특이적 결합 분자 ("CD19 x CD3")와 함께 인큐베이션된다.
도 15는 ROR1-형질감염된 MEC 세포로부터 LDH 방출 (패널 A) 및 CD8+ 세포 상에서 CD69의 세포 표면 수준 (패널 B)을 정량화하는 그래프 쌍이며, 여기서 ROR1-형질감염된 MEC 세포는 인간 PBMC 및 이중특이적인 구축물 3, 9, 및 15-20과 함께 인큐베이션된다.
도 16은 (1) PBMC, 및 (2) 이중특이적인 구축물 1-3, 7-9, 및 13-15, 및 항-CD19/항-CD3 이중특이적 결합 분자 대조군과 함께 인큐베이션한 ROR1-형질감염된 및 비-형질감염된 MEC 세포로부터 LDH 방출을 비교하는 그래프이다. LDH 방출은 또한 표적 세포를 함유하지 않는 샘플 ("PBMC") 및 이중특이적인 구축물을 함유하지 않는 샘플 ("biAb 없음")에서 평가된다.
도 17은 T 세포에 대한 CD69 수준을 평가하는 그래프 세트이며, 여기서 ROR1-/CD19+ MEC 세포 (패널 A) 또는 ROR1+/CD19+ MEC 세포 (패널 B)는 (1) T 세포, 및 (2) 이중특이적인 구축물 7 또는 대조군 항-CD19/항-CD3 이중특이적 결합 분자 ("CD19 x CD3")와 인큐베이션된다.
도 18은 JeKo-1 세포로부터 LDH 방출 (패널 A) 및 CD8+ 세포 상에서 CD69의 세포 표면 수준 (패널 B)을 정량화하는 그래프 쌍이며, 여기서 JeKo-1 세포는 인간 PBMC 및 이중특이적인 구축물 2, 3, 8, 9, 14, 및 15와 함께 인큐베이션된다.
도 19는 JeKo-1 세포로부터 LDH 방출 (패널 A) 및 CD8+ 세포 상에서 CD69의 세포 표면 수준 (패널 B)을 정량화하는 그래프 쌍이며, 여기서 JeKo-1 세포는 인간 PBMC 및 이중특이적인 구축물 3, 7, 9, 및 15-20과 함께 인큐베이션된다.
도 20은 Mino 세포로부터 LDH 방출 (패널 A) 및 CD8+ 세포 상에서 CD69의 세포 표면 수준 (패널 B)을 정량화하는 그래프 쌍이며, 여기서 Mino 세포는 인간 PBMC 및 이중특이적인 구축물 7-9와 함께 인큐베이션된다.
도 21은 MDA-MB-468 세포로부터 LDH 방출 (패널 A) 및 CD8+ 세포 상에서 CD69의 세포 표면 수준 (패널 B)을 정량화하는 그래프 쌍이며, 여기서 MDA-MB-468 세포는 인간 PBMC 및 이중특이적인 구축물 2, 3, 8, 9, 12, 및 14와 함께 인큐베이션된다.
도 22는 MDA-MB-468 세포로부터 LDH 방출 (패널 A) 및 CD8+ 세포 상에서 CD69의 세포 표면 수준 (패널 B)을 정량화하는 그래프 쌍이며, 여기서 MDA-MB-468 세포는 인간 PBMC 및 이중특이적인 구축물 9, 18, 및 20과 함께 인큐베이션된다.
도 23은 지정된 표적 세포 및 이중특이적인 구축물 7, 9, 18, 및 20 (패널 A) 또는 9, 18, 20 (패널 B 및 C)에 의한 T 세포의 활성화 후에, JeKo-1 세포 (패널 A), ROR1-형질감염된 MEC 세포 (패널 B), 및 모의-형질감염된 ROR1- MEC 세포 (패널 C)로부터 TNF-α의 방출을 정량화하는 그래프 세트이다. 모의-형질감염된 ROR1- MEC 세포 (패널 C)는 단일 농도 (1 μg/mL)의 이중특이적인 구축물로 처리되었다. "대조군 1"은 관련이 없는 ROR1 x CD3 이중특이적인 구축물이다.
도 24는 지정된 표적 세포 및 이중특이적인 구축물 7, 9, 18, 및 20 (패널 A) 또는 9, 18, 및 20 (패널 B 및 C)에 의한 T 세포의 활성화 후에, JeKo-1 세포 (패널 A), ROR1-형질감염된 MEC 세포 (패널 B), 및 모의-형질감염된 ROR1- MEC 세포 (패널 C)로부터 IFN-γ의 방출을 정량화하는 그래프 세트이다. 모의-형질감염된 ROR1- MEC 세포 (패널 C)는 단일 농도 (1 μg/mL)의 이중특이적인 구축물로 처리되었다. "대조군 1"은 관련이 없는 ROR1 x CD3 이중특이적인 구축물이다.
도 25는 지정된 표적 세포 및 이중특이적인 구축물 7, 9, 18, 및 20 (패널 A) 또는 9, 18, 및 20 (패널 B 및 C)에 의한 T 세포의 활성화 후에, JeKo-1 세포 (패널 A), ROR1-형질감염된 MEC 세포 (패널 B), 및 모의-형질감염된 ROR1- MEC 세포 (패널 C)로부터 IL-2의 방출을 정량화하는 그래프 세트이다. 모의-형질감염된 ROR1- MEC 세포 (패널 C)는 단일 농도 (1 μg/mL)의 이중특이적인 구축물로 처리되었다. "대조군 1"은 관련이 없는 ROR1 x CD3 이중특이적인 구축물이다.
도 26은 지정된 표적 세포 및 이중특이적인 구축물 7, 9, 18, 및 20 (패널 A) 또는 9, 18, 및 20 (패널 B 및 C)에 의한 T 세포의 활성화 후에, JeKo-1 세포 (패널 A), ROR1-형질감염된 MEC 세포 (패널 B), 및 모의-형질감염된 ROR1- MEC 세포 (패널 C)로부터 IL-4의 방출을 정량화하는 그래프 세트이다. 모의-형질감염된 ROR1- MEC 세포 (패널 C)는 단일 농도 (1 μg/mL)의 이중특이적인 구축물로 처리되었다. "대조군 1"은 관련이 없는 ROR1 x CD3 이중특이적인 구축물이다.
도 27은 지정된 표적 세포 및 이중특이적인 구축물 7, 9, 18, 및 20 (패널 A) 또는 9, 18, 및 20 (패널 B 및 C)에 의한 T 세포의 활성화 후에, JeKo-1 세포 (패널 A), ROR1-형질감염된 MEC 세포 (패널 B), 및 모의-형질감염된 ROR1- MEC 세포 (패널 C)로부터 IL-6의 방출을 정량화하는 그래프 세트이며, 모의-형질감염된 ROR1- MEC 세포 (패널 C)는 단일 농도 (1 μg/mL)의 이중특이적인 구축물로 처리되었다. "대조군 1"은 관련이 없는 ROR1 x CD3 이중특이적인 구축물이다.
도 28은 지정된 표적 세포 및 이중특이적인 구축물 7, 9, 18, 및 20 (패널 A) 또는 9, 18, 및 20 (패널 B 및 C)에 의한 T 세포의 활성화 후에, JeKo-1 세포 (패널 A), ROR1-형질감염된 MEC 세포 (패널 B), 및 모의-형질감염된 ROR1- MEC 세포 (패널 C)로부터 IL-10의 방출을 정량화하는 그래프 세트이다. 모의-형질감염된 ROR1- MEC 세포 (패널 C)는 단일 농도 (1 μg/mL)의 이중특이적인 구축물로 처리되었다. "대조군 1"은 관련이 없는 ROR1 x CD3 이중특이적인 구축물이다.
도 29는 항-ROR1 및 항-CD3 항원-결합 도메인의 지정된 서열에 대한 서열식별번호를 나타내는 표이다.
본 개시내용은 ROR1 및 CD3에 결합하는 새로운 이중특이적 결합 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, ROR1 및 CD3에 대한 이중특이적 결합 분자의 결합은 T 세포가 ROR1-양성 종양 세포에 근접하게 하여, T 세포 세포독성을 유발함으로써 암을 치료한다. 달리 명시되지 않는다면, 본원에서 사용된 바와 같이, "ROR1"은 인간 ROR1을 지칭한다. 인간 ROR1 폴리펩티드 서열은 유니프롯(UniProt) 수탁 번호 Q01973-1 (서열식별번호: 89)하에 입수가능하다. 달리 명시되지 않는다면, 본원에서 사용된 바와 같이, "CD3"은 인간 CD3을 지칭한다. CD3은 감마 쇄, 델타 쇄, 및 2개의 엡실론 쇄로 구성된다. 인간 CD3 감마 폴리펩티드 서열은 진뱅크(GenBank) 수탁 번호 NP_000064.1 (서열식별번호: 90)하에 입수가능하다. 인간 CD3 델타 폴리펩티드 서열은 진뱅크 수탁 번호 NP_000723.1 (서열식별번호: 91)하에 입수가능하다. 인간 CD3 엡실론 폴리펩티드 서열은 진뱅크 수탁 번호 NP_000724.1 (서열식별번호: 92)하에 입수가능하다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자의 항원-결합 도메인은 항-ROR1 항체 및 항-CD3 항체로부터 유래된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체" (Ab) 또는 "면역글로불린" (Ig)은 디술피드 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄 (H) (약 50-70 kDa) 및 2개의 경쇄 (L) (약 25 kDa)를 포함하는 사량체를 지칭할 수 있다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 중쇄 불변 영역 (CH)으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 경쇄 불변 영역 (CL)으로 구성된다. VH 및 VL 도메인은 "프레임워크 영역" (FR)으로 지칭되는 더욱 보존된 영역 사이에 삽입된, "상보성 결정 영역" (CDR)으로 지칭되는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR (본원에서 H-CDR은 중쇄로부터의 CDR을 지정하고; 본원에서 L-CDR은 경쇄로부터의 CDR을 지정함) 및 4개의 FR로 구성되며, 아미노-말단에서 카르복실-말단으로 하기 순서로 정렬된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
주어진 CDR 또는 FR의 정확한 아미노산 서열 경계는 [Kabat et al., 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] ("카바트(Kabat)" 넘버링 방식); [Al-Lazikani et al., JMB 273,927-948 (1997)] ("코티아(Chothia)" 넘버링 방식); [MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)] ("접촉" 넘버링 방식); [Lefranc et al., Dev Comp Immunol. 27(1):55-77 (2003)] ("IMGT" 넘버링 방식); 및 [Honegger and Plueckthun, J Mol Biol, 309(3):657-70 (2001)] ("Aho" 넘버링 방식)에 의해 기재된 것들을 비롯하여 몇몇 널리 공지된 임의의 방식을 이용하여 용이하게 결정될 수 있다.
주어진 CDR 또는 FR의 경계는 식별을 위해 사용되는 방식에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 카바트 방식은 서열 정렬을 기반으로 하는 반면에, 코티아 방식은 구조 정보를 기반으로 한다. 카바트 및 코티아 방식 둘 다에 대한 넘버링은 가장 공통된 항체 영역 서열 길이를 기반으로 하며, 삽입은 삽입 문자, 예를 들어, "30a"로 제공된다. 두 방식은 상이한 위치에서 특정한 삽입 및 결실 ("indel")을 배치하여, 상이하게 넘버링한다. 접촉 방식은 복잡한 결정 구조의 분석을 기반으로 하며, 여러 면에서 코티아 넘버링 방식과 유사하다. 달리 나타내지 않는다면, 본원에서 지칭된 항체의 CDR은 카바트, 코티아, IMGT, 접촉 및 Aho 방법 중 어느 것에 따라 식별될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자가 유래되는 항-ROR1 항체 및/또는 항-CD3 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-ROR1 및/또는 항-CD3 항체는 키메라, 인간화, 또는 완전 인간 항체이다.
용어 "친화도"는 항원과 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 관련된 분자, 예컨대 이중특이적 결합 분자 사이의 인력의 척도를 지칭한다. 항원에 대한 항체의 고유 인력은 전형적으로 특정한 항체-항원 상호작용의 결합 친화도 평형 상수 (KD)로 표현된다. KD가 ≤ 1 mM, 바람직하게는 ≤ 100 nM일 때, 항체가 항원에 특이적으로 결합한다고 한다. KD 결합 친화도 상수는 예를 들어 표면 플라즈몬 공명 (비아코어(BIAcore)TM) 또는 생물층 간섭계에 의해, 예를 들어 이비스 테크놀로지즈(IBIS Technologies)로부터의 IBIS MX96 SPR 시스템 또는 포르테바이오(ForteBio)로부터의 옥텟(Octet)TM 시스템을 이용하여 측정될 수 있다.
용어 "파라토프"는 항체의 항원-결합 부위 (즉, 항원 에피토프를 인식하여 그에 결합하는 항체의 부분)를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프"는 항체 또는 관련된 분자, 예컨대 이중특이적 결합 분자에 특이적으로 결합하는 항원의 부분 (결정소)을 지칭한다. 에피토프 결정소는 일반적으로 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 측쇄와 같이 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹으로 이루어지고, 일반적으로 특이적인 삼차원 구조 특징, 뿐만 아니라 특이적인 전하 특징을 갖는다. 에피토프는 "선형" 또는 "배좌형"일 수 있다. 선형 에피토프에서는, 단백질 (예를 들어, 항원)과 상호작용 분자 (예컨대, 항체) 사이의 모든 상호작용 지점이 단백질의 일차 아미노산 서열을 따라 선형으로 발생한다. 배좌형 에피토프에서는, 상호작용 지점이 일차 아미노산 서열에서 서로 분리된 단백질 상의 아미노산 잔기를 가로질러 발생한다. 항원 상의 원하는 에피토프가 결정되면, 관련 기술분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 해당 에피토프에 대한 항체를 생성하는 것이 가능하다. 예를 들어, 선형 에피토프에 대한 항체는 예를 들어 선형 에피토프의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드로 동물을 면역화시킴으로써 생성될 수 있다. 배좌형 에피토프에 대한 항체는 예를 들어 배좌형 에피토프의 관련 아미노산 잔기를 함유하는 미니-도메인으로 동물을 면역화시킴으로써 생성될 수 있다. 특정한 에피토프에 대한 항체는 또한 예를 들어 관심 표적 분자 (예를 들어, ROR1 또는 CD3) 또는 그의 관련 부분으로 동물을 면역화시킨 다음, 에피토프와의 결합에 대해 스크리닝함으로써 생성될 수 있다.
경쟁 검정, 에피토프 비닝, 및 알라닌 스캐닝을 비롯하여 이로 제한되지 않는 관련 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 항체가 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자와 동일한 ROR1 또는 CD3 에피토프에 결합하거나 또는 결합하기 위해 그와 경쟁하는지 여부를 결정할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자가 포화 조건하에 ROR1 또는 CD3에 결합하게 한 다음, 시험 항체가 상기 항원에 결합하는 능력을 측정한다. 시험 항체가 기준 이중특이적 결합 분자와 동시에 상기 항원에 결합할 수 있다면, 시험 항체는 기준 이중특이적 결합 분자와 상이한 에피토프에 결합한다. 그러나, 시험 항체가 동시에 항원에 결합할 수 없다면, 시험 항체는 동일한 에피토프, 겹치는 에피토프, 또는 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자에 의해 결합되는 에피토프에 매우 근접한 에피토프에 결합한다. 이 실험은 예를 들어 ELISA, RIA, 비아코어TM, SPR, 생물층 간섭계 또는 유세포 측정을 이용하여 수행될 수 있다. 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자가 ROR1 또는 CD3에 결합하기 위해 또 다른 항체와 교차-경쟁하는지 여부를 시험하기 위해, 상기 기재된 경쟁 방법을 두 방향으로, 즉, 공지된 항체가 시험 항체를 차단하는지 및 그 반대인지를 결정하여 이용할 수 있다. 이러한 교차-경쟁 실험은 예를 들어 IBIS MX96 SPR 장비 또는 옥텟TM 시스템을 이용하여 수행될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 항체의 "항원-결합 부분" 또는 "항원-결합 단편"은 항원 (예를 들어, 인간 ROR1 또는 CD3, 또는 그의 일부분)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 부분 또는 단편을 지칭한다. 전장 항체의 특정한 단편이 항체의 항원-결합 기능을 수행할 수 있는 것으로 나타났다. 용어 "항원-결합 부분" 내에 포함되는 결합 단편의 예에는 (i) Fab 단편: VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편: 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편; 및 (vi) 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)이 포함된다. 추가로, Fv 단편의 두 도메인, VL 및 VH가 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 VL 및 VH 도메인이 쌍을 형성하여 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄 (단일 쇄 가변 단편 (scFv)으로 공지됨)로 만들어질 수 있게 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 이용하여 결합될 수 있다. VH 및/또는 VL을 포함하는 항원-결합 분자 또한 본 개시내용 내에 포함된다. VH의 경우, 분자는 CH1, 힌지, CH2 또는 CH3 영역 중 하나 이상을 또한 포함할 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 다른 형태의 단일 쇄 항체, 예컨대 디아바디 또한 포함된다. 디아바디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 발현되지만, 동일한 쇄 상의 두 도메인 사이에서 쌍을 형성하기에는 너무 짧은 링커를 사용하여, 도메인이 또 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 형성하게 하여 2개의 항원-결합 부위를 생성하는 것인 2가의 이중특이적인 항체이다.
달리 나타내지 않는다면, 본 개시내용에서 언급된 모든 항체 아미노산 잔기 번호는 오네게르(Honegger) 넘버링 방식 (Honegger and Plueckthun, J Mol Biol, 309(3):657-70 (2001))에 따른 것들이다.
항-ROR1/항-CD3 이중특이적 결합 분자
본 개시내용은 인간 ROR1의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인 및 인간 CD3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 이중특이적 결합 분자에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 제1 항원-결합 도메인은 ROR1 단백질의 세포외 부분 상의 에피토프, 예컨대 면역글로불린 (Ig)-유사의 프리즐드(Frizzled) 및 크링글(Kringle) 도메인 중 하나 이상에서의 에피토프에 결합한다. 특정한 실시양태에서, 제1 항원-결합 도메인은 서열식별번호: 94 또는 95에 나타낸 ROR1의 아미노산 서열에 결합한다 (접합의 편의를 위해 첨가되는 말단 시스테인은 포함하지 않음).
일부 실시양태에서, 제1 항원-결합 도메인은 인간 ROR1에 결합하기 위해 PCT 특허 출원 PCT/US2013/32572에 기재된 항-ROR1 항체와 경쟁하고/거나, 그와 동일한 인간 ROR1 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 항원-결합 도메인은 인간 ROR1에 결합하기 위해 서열식별번호: 82에 제시된 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 83에 제시된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체 ("Ab1")와 경쟁하고/거나, 그와 동일한 인간 ROR1 에피토프에 결합한다.
일부 실시양태에서, 제1 항원-결합 도메인은 서열식별번호: 82의 아미노산 서열에서 중쇄 (H)-CDR1-3 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열에서 경쇄 (L)-CDR1-3을 포함하고, CDR은 카바트, 코티아, IMGT, 또는 접촉 방법, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 결정된다.
일부 실시양태에서, 제1 항원-결합 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함한다:
- 각각 서열식별번호: 60, 61, 62, 63, 64, 및 65;
- 각각 서열식별번호: 97, 61, 62, 63, 64, 및 65;
- 각각 서열식별번호: 98, 61, 62, 63, 64, 및 65;
- 각각 서열식별번호: 60, 61, 62, 99, 64, 65;
- 각각 서열식별번호: 60, 61, 62, 63, 102, 65;
- 각각 서열식별번호: 97, 61, 62, 99, 64, 65;
- 각각 서열식별번호: 97, 61, 62, 63, 102, 65;
- 각각 서열식별번호: 98, 61, 62, 99, 64, 65; 또는
- 각각 서열식별번호: 98, 61, 62, 63, 102, 65.
일부 실시양태에서, 제1 항원-결합 도메인은 서열식별번호: 72와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열식별번호: 73과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 항원-결합 도메인은 하기를 포함한다:
- 서열식별번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
- 서열식별번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
- 서열식별번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
- 서열식별번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
- 서열식별번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 103의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
- 서열식별번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
- 서열식별번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 103의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
- 서열식별번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
- 서열식별번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 103의 아미노산 서열을 포함하는 VL.
일부 실시양태에서, 제1 항원-결합 도메인은 서열식별번호: 82와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 (HC) 및 서열식별번호: 83과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 (LC)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 항원-결합 도메인은 하기를 포함한다:
- 서열식별번호: 82의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 82의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 82의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC; 또는
- 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC.
특정한 실시양태에서, HC 서열은 이펙터 기능을 감소시키거나 또는 제거하도록 변형된다. 예를 들어, HC 서열의 IgG1 부분은 "LALA" (L234A/L235A), 또는 "LALAGA" (L234A/L235A/G237A) 돌연변이를 포함할 수 있다 (여기서 모든 잔기는 EU 넘버링 방식에 따라 넘버링됨).
일부 실시양태에서, 제1 항원-결합 도메인은 하기를 포함한다:
- 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 105의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 105의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC; 또는
- 서열식별번호: 105의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC.
일부 실시양태에서, 제1 항원-결합 도메인은 하기를 포함한다:
- 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 106의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 107의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 108의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 106의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 106의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 107의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 107의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 108의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC; 또는
- 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 108의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC.
일부 실시양태에서, 제1 항원-결합 도메인은 하기를 포함한다:
- 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
- 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC; 또는
- 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC.
일부 실시양태에서, 제1 항원-결합 도메인은 PCT/US2013/32572에 기재된 바와 같은 항-ROR1 항체의 6개의 CDR, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인, 및/또는 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 항원-결합 도메인은 [Tunnacliffe et al., International Immunology 1:546-550 (1989))]에 정의된 바와 같은 CD3의 그룹 I 또는 그룹 II 에피토프에 결합한다.
일부 실시양태에서, 제2 항원-결합 도메인은 인간 CD3에 결합하기 위해 항-CD3 항체 OKT3 또는 SP34와 경쟁하고/거나, 그와 동일한 인간 CD3 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제2 항원-결합 도메인은 인간 CD3에 결합하기 위해 하기를 포함하는 항체와 경쟁하고/거나, 그와 동일한 인간 CD3 에피토프에 결합한다:
- 서열식별번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
- 서열식별번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
- 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 VL.
일부 실시양태에서, 제2 항원-결합 도메인은 하기 아미노산 서열의 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하고:
- 각각 서열식별번호: 66 및 67;
- 각각 서열식별번호: 68 및 69; 또는
- 각각 서열식별번호: 70 및 71;
여기서, CDR은 카바트, 코티아, IMGT, 또는 접촉 방법, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 결정된다.
일부 실시양태에서, 제2 항원-결합 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함한다:
- 각각 서열식별번호: 47, 48, 49, 50, 51, 및 52;
- 각각 서열식별번호: 47, 53, 49, 50, 51, 및 52; 또는
- 각각 서열식별번호: 54, 55, 56, 57, 58, 및 59.
일부 실시양태에서, 제2 항원-결합 도메인은 하기를 포함한다:
- 서열식별번호: 66과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 67과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
- 서열식별번호: 68과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 69와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
- 서열식별번호: 70과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 71과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL.
일부 실시양태에서, 제2 항원-결합 도메인은 하기를 포함한다:
- 서열식별번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
- 서열식별번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
- 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
- 서열식별번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
- 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
- 서열식별번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 VL.
일부 실시양태에서, 제2 항원-결합 도메인은 미국 특허 공보 2018/0112011에 기재된 바와 같은 항-CD3 항체의 6개의 CDR 및/또는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 개시내용은 또한 상기 기재된 제1 및 제2 항원-결합 도메인의 임의의 조합을 고려한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 하기를 포함한다:
- 각각 서열식별번호: 97, 61, 62, 63, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 54, 55, 56, 57, 58, 및 59의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 60, 61, 62, 63, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 54, 55, 56, 57, 58, 및 59의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 60, 61, 62, 63, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 47, 53, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 97, 61, 62, 63, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1- 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 47, 48, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 97, 61, 62, 63, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 47, 53, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 60, 61, 62, 63, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 47, 48, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 98, 61, 62, 63, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 54, 55, 56, 57, 58, 및 59의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 98, 61, 62, 63, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 47, 48, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 98, 61, 62, 63, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 47, 53, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 60, 61, 62, 99, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 54, 55, 56, 57, 58, 및 59의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 60, 61, 62, 99, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 47, 48, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 60, 61, 62, 99, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 47, 53, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 60, 61, 62, 63, 102, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 54, 55, 56, 57, 58, 및 59의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 60, 61, 62, 63, 102, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 47, 48, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 60, 61, 62, 63, 102, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 47, 53, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 97, 61, 62, 99, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 54, 55, 56, 57, 58, 및 59의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 97, 61, 62, 99, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 47, 48, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 97, 61, 62, 99, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 47, 53, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 97, 61, 62, 63, 102, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 54, 55, 56, 57, 58, 및 59의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 97, 61, 62, 63, 102, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 47, 48, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 97, 61, 62, 63, 102, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 47, 53, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 98, 61, 62, 99, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 54, 55, 56, 57, 58, 및 59의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 98, 61, 62, 99, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 47, 48, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 98, 61, 62, 99, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 47, 53, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 98, 61, 62, 63, 102, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 54, 55, 56, 57, 58, 및 59의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 98, 61, 62, 63, 102, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 47, 48, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인; 또는
- 각각 서열식별번호: 98, 61, 62, 63, 102, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 47, 53, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 하기를 포함한다:
- 각각 서열식별번호: 74 및 73의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 72 및 73의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 72 및 73의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 74 및 73의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 74 및 73의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 72 및 73의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 75 및 73의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 75 및 73의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 75 및 73의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 72 및 100의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 72 및 100의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 72 및 100의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 72 및 103의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 72 및 103의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 72 및 103의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 74 및 100의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 74 및 100의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 74 및 100의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 74 및 103의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 74 및 103의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 74 및 103의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 75 및 100의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 75 및 100의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 75 및 100의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 75 및 103의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 75 및 103의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인; 또는
- 각각 서열식별번호: 75 및 103의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 하기를 포함한다:
- 각각 서열식별번호: 74 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 72 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 72 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 74 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 74 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 72 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 75 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 75 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 75 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 72 및 100의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 72 및 100의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 72 및 100의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 72 및 103의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 72 및 103의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 72 및 103의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 74 및 100의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 74 및 100의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 74 및 100의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 74 및 103의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 74 및 103의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 74 및 103의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 75 및 100의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 75 및 100의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 75 및 100의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 75 및 103의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 75 및 103의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인; 또는
- 각각 서열식별번호: 75 및 103의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 하기를 포함한다:
- 각각 서열식별번호: 84 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 82 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 82 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 84 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 84 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 82 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 85 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 85 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 85 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 82 및 101의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 82 및 101의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 82 및 101의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 82 및 104의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 82 및 104의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 82 및 104의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 84 및 101의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 84 및 101의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 84 및 101의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 84 및 104의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 84 및 104의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 84 및 104의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 85 및 101의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 85 및 101의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 85 및 101의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 85 및 104의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 85 및 104의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인; 또는
- 각각 서열식별번호: 85 및 104의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인.
특정한 실시양태에서, HC 서열은 이펙터 기능을 감소시키거나 또는 제거하도록 변형된다. 예를 들어, HC 서열의 IgG1 부분은 L235E, "LALA" (L234A/L235A), 또는 "LALAGA" (L234A/L235A/G237A) 돌연변이를 포함할 수 있다 (여기서 모든 잔기는 EU 넘버링 방식에 따라 넘버링됨).
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 하기를 포함한다:
- 각각 서열식별번호: 14 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 7 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 7 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 14 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 14 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 7 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 105 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 105 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 105 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 7 및 101의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 7 및 101의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 7 및 101의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 7 및 104의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 7 및 104의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 7 및 104의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 14 및 101의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 14 및 101의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 14 및 101의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 14 및 104의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 14 및 104의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 14 및 104의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 105 및 101의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 105 및 101의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 105 및 101의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 105 및 104의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 각각 서열식별번호: 105 및 104의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인; 또는
- 각각 서열식별번호: 105 및 104의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 하기를 포함한다:
- 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 107의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 106의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 106의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 107의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 107의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 106의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 108의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 108의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 108의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 106의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 106의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 106의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 106의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 106의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 106의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 107의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 107의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 107의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 107의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 107의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 107의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 108의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 108의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 108의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 108의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 108의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인; 또는
- 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 108의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 하기를 포함한다:
- 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71 또는 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
- 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67 또는 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인; 또는
- 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69 또는 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 하기를 포함한다:
- 서열식별번호: 1 및 16의 아미노산 서열;
- 서열식별번호: 2 및 16의 아미노산 서열;
- 서열식별번호: 3 및 16의 아미노산 서열;
- 서열식별번호: 4 및 16의 아미노산 서열;
- 서열식별번호: 5 및 16의 아미노산 서열;
- 서열식별번호: 6 및 16의 아미노산 서열;
- 서열식별번호: 7 및 17의 아미노산 서열;
- 서열식별번호: 7 및 18의 아미노산 서열;
- 서열식별번호: 7 및 19의 아미노산 서열;
- 서열식별번호: 7 및 20의 아미노산 서열;
- 서열식별번호: 7 및 21의 아미노산 서열;
- 서열식별번호: 7 및 22의 아미노산 서열;
- 서열식별번호: 8, 9, 및 16의 아미노산 서열;
- 서열식별번호: 8, 10, 및 16의 아미노산 서열;
- 서열식별번호: 8, 11, 및 16의 아미노산 서열;
- 서열식별번호: 12, 11, 및 16의 아미노산 서열;
- 서열식별번호: 12, 13, 및 16의 아미노산 서열;
- 서열식별번호: 14 및 19의 아미노산 서열;
- 서열식별번호: 8, 15, 및 16의 아미노산 서열; 또는
- 서열식별번호: 7 및 23의 아미노산 서열.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 상기 기재된 1개 또는 2개의 제1 항원-결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 상기 기재된 1개 또는 2개의 제2 항원-결합 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자에서 제1 항원-결합 도메인은 1 또는 2의 결합가를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자에서 제2 항원-결합 도메인은 1 또는 2의 결합가를 갖는다. 제1 및 제2 항원-결합 도메인의 결합가의 임의의 조합이 고려된다; 예를 들어, 제1 및 제2 항원-결합 도메인은 각각 2 및 2; 각각 1 및 1; 각각 2 및 1; 또는 각각 1 및 2의 결합가를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 인간 IgG, IgM, IgE, IgA 또는 IgD 불변 영역을 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 인간 불변 영역은 IgG 이소타입, 예를 들어 IgG 서브클래스 IgG1, IgG2a 또는 IgG2b, IgG3, 또는 IgG4의 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 인간 κ 불변 영역을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 이중특이적 결합 분자의 클래스는 또 다른 클래스 또는 서브클래스로 변경 또는 전환될 수 있다. 예를 들어, 원래 IgM인 불변 영역은 IgG로 클래스 전환될 수 있다. 추가로, 클래스 전환을 이용하여 한 IgG 서브클래스를 또 다른 것으로, 예를 들어 IgG1에서 IgG2로 전환시킬 수 있다. κ 경쇄 불변 영역은 예를 들어 λ 경쇄 불변 영역으로 변경될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 인간 IgG 불변 영역을 포함할 수 있다. 특별한 실시양태에서, IgG 불변 영역은 이펙터 기능을 감소시키거나 또는 제거하는 돌연변이를 포함할 수 있다 (예를 들어, [Wang et al., Protein Cell 9(1):63-73 (2018)] 참고). 예를 들어, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 돌연변이 L235E, "LALA" 돌연변이 (L234A/L235A), 또는 "LALAGA" 돌연변이 (L234A/L235A/G237A)를 갖는 인간 IgG1 불변 영역을 포함할 수 있으며, 모두 EU 넘버링 방식에 따라 넘버링된다.
본 개시내용의 이중특이적 결합 분자의 클래스 (이소타입) 및 서브클래스는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 항체의 클래스 및 서브클래스는 항체의 특정한 클래스 및 서브클래스에 대해 특이적인 항체를 이용하여 결정될 수 있다. 이러한 항체는 상업적으로 입수가능하다. 클래스 및 서브클래스는 ELISA, 웨스턴 블롯, 뿐만 아니라 다른 기술에 의해 결정될 수 있다. 대안적으로, 클래스 및 서브클래스는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 영역 모두 또는 일부를 시퀀싱하고, 그들의 아미노산 서열을 면역글로불린의 다양한 클래스 및 서브클래스의 공지된 아미노산 서열과 비교하고, 항체의 클래스 및 서브클래스를 결정함으로써 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 동종이량체이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 이종삼량체 (중쇄 이종이량체와 조합된 경쇄)이며, 여기서 중쇄 이종이량체는 예를 들어 [Brinkmann and Kontermann, MABS 9:182-212 (2017)]에 기재된 포맷을 갖는다. 예를 들어, "놉-인투-홀(knobs-into-holes)", HA-TF, ZW1, CH3 전하 쌍, EW-RVT, LUZ-Y, 가닥 교환 조작된 도메인 바디 (시드바디(SEEDbody)), 바이클로닉(Biclonic), 듀오바디(DuoBody), BEAT, 7.8.60, 20.8.34, 트리오맙(Triomab)/쿠아드로마(Quadroma), 또는 크로스맙(CrossMAb) 전략을 이용하여, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자의 아키텍쳐에서 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드의 이종이량체화 (예를 들어, 동종이량체화에 비해)를 촉진시킬 수 있다. 특정한 실시양태에서, "놉-인투-홀" 접근법을 이용할 수 있고, 여기서 도메인의 "놉" 변이체는 작은 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글리신, 세린, 트레오닌 또는 발린)을 더 큰 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 (예를 들어, 아르기닌, 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판)으로 대체함으로써 수득된다. 도메인의 "홀" 변이체는 더 큰 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아르기닌, 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판)을 더 작은 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글리신, 세린, 트레오닌 또는 발린)으로 대체함으로써 수득된다. 특정한 실시양태에서, 놉 및/또는 홀 돌연변이는 CH3 도메인에 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자를 제조하는데 항-ROR1 항체의 항원-결합 단편 및/또는 항-CD3 항체의 항원-결합 단편을 이용할 수 있다. 항체 단편의 예에는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 재조합 IgG (rIgG) 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv 또는 sFv); 및 단일 도메인 항체 (예를 들어, sdAb, sdFv, 나노바디)가 포함되나 이로 제한되는 것은 아니다. 특정한 실시양태에서, 단편은 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역을 포함하는 단일-쇄 항체 단편, 예컨대 scFv이다.
특별한 실시양태에서, 제1 항원-결합 도메인, 제2 항원-결합 도메인, 또는 이들 둘 다는 전체 항체의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 항체의 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는 단일 쇄 항체 (scFv)이며, 융합 단백질은 항체와 동일한 항원 특이성을 보유한다. VH 및 VL은 펩티드 링커를 통해 연결될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제2 항원-결합 도메인은 CD3에 특이적으로 결합하는 scFv이다.
단일 쇄 항체 (scFv)를 생성하기 위해, VH- 및 VL-코딩 DNA 단편은 가요성 링커를 코딩하는, 예를 들어 아미노산 서열 (Gly4 -Ser)4 (서열식별번호: 96)를 코딩하는 또 다른 단편에 작동가능하게 연결되어, VH 및 VL 서열이 인접한 단일-쇄 단백질로서 발현될 수 있고, VL 및 VH 도메인은 가요성 링커에 의해 결합된다. 단일 VH 및 VL만이 사용된 경우 단일 쇄 항체는 1가일 수 있거나; 2개의 VH 및 VL이 사용된 경우 2가일 수 있거나; 또는 2개 초과의 VH 및 VL이 사용된 경우 다가일 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 항원-결합 도메인의 아미노산 서열은 예를 들어 펩티드 링커를 통해 제2 항원-결합 도메인의 아미노산 서열에 융합되어, 융합 폴리펩티드를 형성한다. 특정한 실시양태에서, 제2 항원-결합 도메인은 scFv이고, 제1 항원-결합 도메인의 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열에 융합된다. 예를 들어, 제2 항원-결합 도메인은 하기에 융합될 수 있다:
- 제1 항원-결합 도메인의 중쇄의 아미노-말단;
- 제1 항원-결합 도메인의 경쇄의 아미노-말단;
- 제1 항원-결합 도메인의 중쇄의 카르복시-말단; 및/또는
- 제1 항원-결합 도메인의 경쇄의 카르복시-말단.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 도 1에서 임의의 도식 A-E에 도시된 것과 같이 구성된다.
특정한 실시양태에서, 제1 및 제2 항원-결합 도메인을 접합시키는 펩티드 링커는 5-30, 5-25, 5-15, 10-30, 10-20 또는 10-15개의 아미노산 길이이다. 특정한 실시양태에서, 펩티드 링커는 예를 들어 세린 및 트레오닌과 같이 펩티드 링커 가용성을 허용하는 아미노산을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 링커는 하전될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 9,856,327 참고). 특정한 실시양태에서, 펩티드 링커는 예를 들어 글리신과 같이 펩티드 링커 가요성 또는 펩티드 링커 강직성을 허용하는 아미노산을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 제1 및 제2 항원-결합 도메인을 접합시키는 펩티드 링커의 서열은 (Gly4-Ser)X이며, 여기서 X는 1, 2, 3 또는 4일 수 있다 (서열식별번호: 114). 특별한 실시양태에서, 펩티드 링커의 서열은 GGGGSGGGGS (서열식별번호: 93)이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제2 항원-결합 도메인은 디술피드 결합을 안정화시키기 위해, 예를 들어 이중특이적 결합 분자의 응집을 방지하거나 또는 감소시키기 위해 하나 이상의 돌연변이 (예를 들어, 아미노산 잔기를 시스테인으로 대체)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 ELISA에 의해 결정되는 바와 같이 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.1 nM, 0.09 nM, 0.08 nM, 0.07 nM, 0.06 nM, 0.05 nM, 0.04 nM, 0.03 nM, 0.02 nM, 0.01 nM, 0.005 nM, 또는 0.001 nM 이하 (예를 들어, 0.5 nM 이하)의 고정된 ROR1에 대한 KD를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 ELISA에 의해 결정되는 바와 같이 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.1 nM, 0.09 nM, 0.08 nM, 0.07 nM, 0.06 nM, 0.05 nM, 0.04 nM, 0.03 nM, 0.02 nM, 0.01 nM, 0.005 nM, 또는 0.001 nM 이하 (예를 들어, 0.4 nM 이하)의 가용성 b-ROR1에 대한 KD를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 ELISA에 의해 결정되는 바와 같이 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.1 nM, 0.09 nM, 0.08 nM, 0.07 nM, 0.06 nM, 0.05 nM, 0.04 nM, 0.03 nM, 0.02 nM, 0.01 nM, 0.005 nM, 또는 0.001 nM 이하 (예를 들어, 5 nM 이하)의 CD3에 대한 KD를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 10 μg/mL, 5 μg/mL, 1 μg/mL, 100 ng/mL, 50 ng/mL, 20 ng/mL, 10 ng/mL, 9 ng/mL, 8 ng/mL, 7 ng/mL, 6 ng/mL, 5 ng/mL, 4 ng/mL, 3 ng/mL, 2 ng/mL, 1 ng/mL, 0.9 ng/mL, 0.8 ng/mL, 0.7 ng/mL, 0.6 ng/mL, 0.5 ng/mL, 0.4 ng/mL, 0.3 ng/mL, 0.2 ng/mL, 0.1 ng/mL, 0.05 ng/mL, 또는 0.01 ng/mL 이하에서 PBMC-노출된 ROR1-형질감염된 MEC 세포에서 LDH 방출을 유도한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 10 μg/mL, 5 μg/mL, 1 μg/mL, 100 ng/mL, 50 ng/mL, 20 ng/mL, 10 ng/mL, 9 ng/mL, 8 ng/mL, 7 ng/mL, 6 ng/mL, 5 ng/mL, 4 ng/mL, 3 ng/mL, 2 ng/mL, 1 ng/mL, 0.9 ng/mL, 0.8 ng/mL, 0.7 ng/mL, 0.6 ng/mL, 0.5 ng/mL, 0.4 ng/mL, 0.3 ng/mL, 0.2 ng/mL, 0.1 ng/mL, 0.05 ng/mL, 또는 0.01 ng/mL 이하에서 PBMC-노출된 JeKo-1 세포에서 LDH 방출을 유도한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 10 μg/mL, 5 μg/mL, 1 μg/mL, 100 ng/mL, 50 ng/mL, 20 ng/mL, 10 ng/mL, 9 ng/mL, 8 ng/mL, 7 ng/mL, 6 ng/mL, 5 ng/mL, 4 ng/mL, 3 ng/mL, 2 ng/mL, 1 ng/mL, 0.9 ng/mL, 0.8 ng/mL, 0.7 ng/mL, 0.6 ng/mL, 0.5 ng/mL, 0.4 ng/mL, 0.3 ng/mL, 0.2 ng/mL, 0.1 ng/mL, 또는 0.05 ng/mL, 0.01 ng/mL 이하에서 PBMC-노출된 Mino 세포에서 LDH 방출을 유도한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 10 μg/mL, 5 μg/mL, 1 μg/mL, 100 ng/mL, 50 ng/mL, 20 ng/mL, 10 ng/mL, 9 ng/mL, 8 ng/mL, 7 ng/mL, 6 ng/mL, 5 ng/mL, 4 ng/mL, 3 ng/mL, 2 ng/mL, 1 ng/mL, 0.9 ng/mL, 0.8 ng/mL, 0.7 ng/mL, 0.6 ng/mL, 0.5 ng/mL, 0.4 ng/mL, 0.3 ng/mL, 0.2 ng/mL, 0.1 ng/mL, 0.05 ng/mL, 또는 0.01 ng/mL 이하에서 PBMC-노출된 MDA-MB-468 세포에서 LDH 방출을 유도한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 시험관내에서 PBMC에 의해 ROR1-형질감염된 MEC 세포, JeKo-1 세포, Mino 세포, MDA-MB-468 세포, 또는 이들의 임의의 조합물의 ROR1-의존성 사멸을 유도한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 유세포 측정에 의해 결정되는 바와 같이 50 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL, 1 μg/mL, 100 ng/mL, 50 ng/mL, 20 ng/mL, 10 ng/mL, 9 ng/mL, 8 ng/mL, 7 ng/mL, 6 ng/mL, 5 ng/mL, 4 ng/mL, 3 ng/mL, 2 ng/mL, 1 ng/mL, 0.9 ng/mL, 0.8 ng/mL, 0.7 ng/mL, 0.6 ng/mL, 0.5 ng/mL, 0.4 ng/mL, 0.3 ng/mL, 0.2 ng/mL, 0.1 ng/mL, 0.05 ng/mL, 또는 0.01 ng/mL 이하에서 ROR1-형질감염된 MEC 세포와 함께 인큐베이션한 T 세포의 표면 상에서 CD69를 상향조절한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 유세포 측정에 의해 결정되는 바와 같이 50 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL, 1 μg/mL, 100 ng/mL, 50 ng/mL, 20 ng/mL, 10 ng/mL, 9 ng/mL, 8 ng/mL, 7 ng/mL, 6 ng/mL, 5 ng/mL, 4 ng/mL, 3 ng/mL, 2 ng/mL, 1 ng/mL, 0.9 ng/mL, 0.8 ng/mL, 0.7 ng/mL, 0.6 ng/mL, 0.5 ng/mL, 0.4 ng/mL, 0.3 ng/mL, 0.2 ng/mL, 0.1 ng/mL, 0.05 ng/mL, 또는 0.01 ng/mL 이하에서 JeKo-1 세포와 함께 인큐베이션한 T 세포의 표면 상에서 CD69를 상향조절한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 유세포 측정에 의해 결정되는 바와 같이 50 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL, 1 μg/mL, 100 ng/mL, 50 ng/mL, 20 ng/mL, 10 ng/mL, 9 ng/mL, 8 ng/mL, 7 ng/mL, 6 ng/mL, 5 ng/mL, 4 ng/mL, 3 ng/mL, 2 ng/mL, 1 ng/mL, 0.9 ng/mL, 0.8 ng/mL, 0.7 ng/mL, 0.6 ng/mL, 0.5 ng/mL, 0.4 ng/mL, 0.3 ng/mL, 0.2 ng/mL, 0.1 ng/mL, 0.05 ng/mL, 또는 0.01 ng/mL 이하에서 Mino 세포와 함께 인큐베이션한 T 세포의 표면 상에서 CD69를 상향조절한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 유세포 측정에 의해 결정되는 바와 같이 50 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL, 1 μg/mL, 100 ng/mL, 50 ng/mL, 20 ng/mL, 10 ng/mL, 9 ng/mL, 8 ng/mL, 7 ng/mL, 6 ng/mL, 5 ng/mL, 4 ng/mL, 3 ng/mL, 2 ng/mL, 1 ng/mL, 0.9 ng/mL, 0.8 ng/mL, 0.7 ng/mL, 0.6 ng/mL, 0.5 ng/mL, 0.4 ng/mL, 0.3 ng/mL, 0.2 ng/mL, 0.1 ng/mL, 0.05 ng/mL, 또는 0.01 ng/mL 이하에서 MDA-MB-468 세포와 함께 인큐베이션한 T 세포의 표면 상에서 CD69를 상향조절한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 10 μg/mL, 5 μg/mL, 1 μg/mL, 100 ng/mL, 50 ng/mL, 20 ng/mL, 10 ng/mL, 9 ng/mL, 8 ng/mL, 7 ng/mL, 6 ng/mL, 5 ng/mL, 4 ng/mL, 3 ng/mL, 2 ng/mL, 1 ng/mL, 0.9 ng/mL, 0.8 ng/mL, 0.7 ng/mL, 0.6 ng/mL, 0.5 ng/mL, 0.4 ng/mL, 0.3 ng/mL, 0.2 ng/mL, 0.1 ng/mL, 0.05 ng/mL, 또는 0.01 ng/mL 이하에서 JeKo-1 또는 ROR1-형질감염된 MEC 세포와 공동-배양한 T 세포로부터 IFN-γ, TNF-α, IL-10, IL-6, IL-4, 및 IL-2의 방출을 유도한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 하기 성질 중 적어도 하나를 갖는다:
a) ELISA에 의해 결정되는 바와 같이 0.5 nM 이하의 고정된 ROR1에 대한 KD를 갖고;
b) ELISA에 의해 결정되는 바와 같이 0.4 nM 이하의 가용성 b-ROR1에 대한 KD를 갖고;
c) 각각 서열식별번호: 82 및 83의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체와 비교하여 ROR1-형질감염된 MEC 세포 및/또는 Jurkat 세포에서 감소된 내재화를 입증하고;
d) 1 μg/mL 이하에서 PBMC-노출된 ROR1-형질감염된 MEC 세포에서 LDH 방출을 유도하고;
e) 1 μg/mL 이하에서 PBMC-노출된 JeKo-1 세포에서 LDH 방출을 유도하고;
f) 1 μg/mL 이하에서 PBMC-노출된 Mino 세포에서 LDH 방출을 유도하고;
g) 1 μg/mL 이하에서 PBMC-노출된 MDA-MB-468 세포에서 LDH 방출을 유도하고;
h) 유세포 측정에 의해 결정되는 바와 같이 1 μg/mL 이하에서 ROR1-형질감염된 MEC 세포와 공동-배양한 T 세포의 표면 상에서 CD69를 상향조절하고;
i) 유세포 측정에 의해 결정되는 바와 같이 1 μg/mL 이하에서 JeKo-1 세포와 공동-배양한 T 세포의 표면 상에서 CD69를 상향조절하고;
j) 유세포 측정에 의해 결정되는 바와 같이 1 μg/mL 이하에서 Mino 세포와 공동-배양한 T 세포의 표면 상에서 CD69를 상향조절하고;
k) 유세포 측정에 의해 결정되는 바와 같이 1 μg/mL 이하에서 MDA-MB-468 세포와 공동-배양한 T 세포의 표면 상에서 CD69를 상향조절하고;
l) 1 μg/mL 이하에서 JeKo-1 또는 ROR1-형질감염된 MEC 세포와 공동-배양한 T 세포로부터 IFN-γ, TNF-α, IL-10, IL-6, IL-4, 및 IL-2의 방출을 유도한다.
특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 상기 성질 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개를 갖는다. 특별한 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 상기 모든 성질을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 ROR1-양성 세포에 대한 T 세포 세포독성을 유도한다.
핵산 분자 및 벡터
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 이중특이적 결합 분자를 코딩하는 핵산 분자 및 서열을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상이한 핵산 분자는 이중특이적 결합 분자를 형성하는 상이한 폴리펩티드를 코딩한다. 다른 실시양태에서, 동일한 핵산 분자는 이중특이적 결합 분자를 형성하는 1개 초과의 또는 모든 폴리펩티드를 코딩한다.
뉴클레오티드 서열에 대한 언급은 달리 명시되지 않는다면 그의 상보체를 포함한다. 따라서, 특정한 서열을 갖는 핵산에 대한 언급은 그의 상보성 서열과 함께 그의 상보성 가닥을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 언급된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드, 또는 이들 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태인, 적어도 10개 염기 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미한다. 상기 용어는 단일- 및 이중-가닥 형태를 포함한다.
상기 임의의 실시양태에서, 핵산 분자는 단리될 수 있다. 본원에서 "단리된" 또는 "정제된"으로 언급된 핵산 분자는 (1) 그들의 기원 공급원의 게놈 DNA 또는 세포 RNA의 핵산으로부터 분리되었고/거나; (2) 천연에서 발생하지 않는 핵산이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산 분자는 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자의
- 제1 항원-결합 도메인의 H-CDR1-3 및/또는 L-CDR1-3
- 제2 항원-결합 도메인의 H-CDR1-3 및/또는 L-CDR1-3;
- 제1 항원-결합 도메인의 VH 및/또는 VL;
- 제2 항원-결합 도메인의 VH 및/또는 VL; 및/또는
- 제1 항원-결합 도메인의 HC 및/또는 LC
를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산 분자는 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자의 제1 항원-결합 도메인의 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2 항원-결합 도메인의 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산 분자는 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자의 제1 항원-결합 도메인의 VH 및 VL을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2 항원-결합 도메인의 VH 및 VL을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산 분자는 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자의 제1 항원-결합 도메인의 HC 및 LC를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2 항원-결합 도메인의 VH 및 VL을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산 분자는 서열식별번호: 24-46으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산 분자는 하기를 포함한다:
- 서열식별번호: 24 및 39의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 25 및 39의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 26 및 39의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 27 및 39의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 28 및 39의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 29 및 39의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 30 및 40의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 30 및 41의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 30 및 42의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 30 및 43의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 30 및 44의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 30 및 45의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 31, 32, 및 39의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 31, 33 및 39의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 31, 34, 및 39의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 35, 34, 및 39의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 35, 36, 및 39의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 37 및 42의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 31, 38, 및 39의 뉴클레오티드 서열; 또는
- 서열식별번호: 30 및 46의 뉴클레오티드 서열.
추가의 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 이중특이적 결합 분자를 형성하는 폴리펩티드 중 하나 이상을 발현하는데 적합한 벡터를 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 그가 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드, 즉, 추가의 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 DNA의 원형 이중 가닥 조각이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이고, 추가의 DNA 절편은 바이러스 게놈에 라이게이션될 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터, 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 실시양태에서, 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입시 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있고, 이로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정한 벡터는 그들이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히 "발현 벡터")로 지칭된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산 분자는 제2 항원-결합 도메인으로부터의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 프레임 내에서 연결된 제1 항원-결합 도메인으로부터의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 이중특이적 결합 분자의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 DNA를 발현 벡터에 삽입하여, DNA가 필요한 발현 제어 서열, 예컨대 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되게 함으로써 발현된다. 발현 벡터에는 플라스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (AAV), 식물 바이러스, 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스, 담배 모자이크 바이러스, 코스미드, YAC, EBV 유래된 에피솜 등이 포함된다. 코딩 서열을 벡터에 라이게이션하여, 벡터 내에서 전사 및 번역 제어 서열이 코딩 서열의 전사 및 번역을 조절하는 그들의 의도된 기능으로 작용할 수 있게 한다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 상용성이도록 선택될 수 있다. 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자의 상이한 폴리펩티드 성분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 동일한 또는 별도의 벡터에 삽입될 수 있고, 동일한 또는 상이한 발현 제어 서열 (예를 들어, 프로모터)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 한 실시양태에서, 2개 이상의 코딩 서열이 동일한 발현 벡터에 삽입되고, 동일한 발현 제어 서열 (예를 들어, 공통 프로모터)에, 별도의 동일한 발현 제어 서열 (예를 들어, 프로모터)에, 또는 상이한 발현 제어 서열 (예를 들어, 프로모터)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 코딩 서열은 표준 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보성 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우에는 평활 말단 라이게이션)에 의해 발현 벡터에 삽입될 수 있다.
숙주 세포, 및 이중특이적 결합 분자 생성 방법
본 개시내용의 추가의 측면은 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자를 생성하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 정의된 이중특이적 결합 분자를 생성하는 방법은 이중특이적 결합 분자를 발현할 수 있는 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 본원에 기재된 숙주 세포)를 제공하고, 이중특이적 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에 상기 숙주 세포를 배양하고, 생성된 이중특이적 결합 분자를 단리하는 것을 포함한다.
발현을 위한 숙주로서 이용가능한 포유동물 세포주는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, ATCC)으로부터 입수가능한 여러 불멸화 세포주를 포함한다. 이들에는 무엇보다도 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0 세포, SP2 세포, HEK-293T 세포, 293 프리스타일(Freestyle) 세포 (인비트로젠(Invitrogen)), NIH-3T3 세포, HeLa 세포, 아기 햄스터 신장 (BHK) 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포 암종 세포 (예를 들어, Hep G2), A549 세포, 및 수많은 다른 세포주가 포함된다. 사용될 수 있는 다른 세포주는 곤충 세포주, 예컨대 Sf9 또는 Sf21 세포, 및 효모 세포주이다. 세포주는 그들의 발현 수준을 기반으로 하여 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 숙주 세포는 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자의
- 제1 항원-결합 도메인의 H-CDR1-3 및/또는 L-CDR1-3
- 제2 항원-결합 도메인의 H-CDR1-3 및/또는 L-CDR1-3;
- 제1 항원-결합 도메인의 VH 및/또는 VL;
- 제2 항원-결합 도메인의 VH 및/또는 VL; 및/또는
- 제1 항원-결합 도메인의 HC 및/또는 LC
를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 숙주 세포는 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자의 제1 항원-결합 도메인의 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2 항원-결합 도메인의 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 숙주 세포는 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자의 제1 항원-결합 도메인의 VH 및 VL을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2 항원-결합 도메인의 VH 및 VL을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 숙주 세포는 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자의 제1 항원-결합 도메인의 HC 및 LC를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2 항원-결합 도메인의 VH 및 VL을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 숙주 세포는 서열식별번호: 24-46으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 숙주 세포는 하기를 포함한다:
- 서열식별번호: 24 및 39의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 25 및 39의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 26 및 39의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 27 및 39의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 28 및 39의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 29 및 39의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 30 및 40의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 30 및 41의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 30 및 42의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 30 및 43의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 30 및 44의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 30 및 45의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 31, 32, 및 39의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 31, 33 및 39의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 31, 34, 및 39의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 35, 34, 및 39의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 35, 36, 및 39의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 37 및 42의 뉴클레오티드 서열;
- 서열식별번호: 31, 38, 및 39의 뉴클레오티드 서열; 또는
- 서열식별번호: 30 및 46의 뉴클레오티드 서열.
제약 조성물
본 개시내용의 또 다른 측면은 활성 성분으로서 (또는 단독 활성 성분으로서) 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자를 포함하는 제약 조성물이다. 제약 조성물은 본원에 기재된 임의의 이중특이적 결합 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 암 (예를 들어, ROR1-양성 암)의 개선, 예방 및/또는 치료를 위해 의도된다.
일반적으로, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 예를 들어 하기 기재된 1종 이상의 제약상 허용가능한 부형제(들)과 회합된 제형으로서 투여하기에 적합하다.
용어 "부형제"는 본 개시내용의 화합물(들) 이외의 임의의 성분을 기재하기 위해 본원에서 사용된다. 부형제(들)의 선택은 특정한 투여 방식, 가용성 및 안정성에 대한 부형제의 효과, 및 투여 형태의 성질과 같은 인자에 따라 크게 좌우될 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "제약상 허용가능한 부형제"에는 생리학적으로 상용성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 제약상 허용가능한 부형제의 일부 예는 물, 식염수, 인산염 완충된 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 뿐만 아니라 이들의 조합물이다. 여러 경우에, 조성물에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 제약상 허용가능한 물질의 추가의 예는 습윤제, 또는 이중특이적 결합 분자의 보관 수명 또는 효능을 증강시키는 미량의 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제이다.
본 개시내용의 제약 조성물 및 그의 제조 방법은 관련 기술분야의 기술자에게 용이하게 이해될 것이다. 이러한 조성물 및 그의 제조 방법은 예를 들어 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995)]에서 확인할 수 있다. 제약 조성물은 바람직하게는 GMP (우수 제조 관리 기준) 조건하에 제조된다.
본 개시내용의 제약 조성물은 벌크로, 단일 단위 용량으로서 또는 다수개의 단일 단위 용량으로서 제조되거나, 포장되거나 또는 판매될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "단위 용량"은 예정된 양의 활성 성분을 포함하는 제약 조성물의 구분된 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에게 투여되는 활성 성분의 용량, 또는 예를 들어 이러한 용량의 1/2 또는 1/3과 같이 이러한 용량의 편리한 분획과 동등하다.
관련 기술분야에서 허용되는 펩티드, 단백질 또는 항체를 투여하기 위한 임의의 방법이 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자를 위해 적합하게 이용될 수 있다.
본 개시내용의 제약 조성물은 전형적으로 비경구 투여에 적합하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 제약 조성물의 "비경구 투여"에는 대상체의 조직의 물리적 파열을 특징으로 하는 임의의 투여 경로 및 조직 파열을 통한 제약 조성물의 투여에 의해, 일반적으로 혈류, 근육 또는 내부 장기로의 직접적인 투여가 포함된다. 따라서, 비경구 투여에는 조성물의 주사, 수술적 절개를 통한 조성물의 적용, 조직-관통 비-수술적 창상을 통한 조성물의 적용 등에 의한 제약 조성물의 투여가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 특히, 비경구 투여에는 피하, 복강내, 근육내, 흉골내, 정맥내, 동맥내, 경막내, 뇌실내, 요도내, 두개내, 종양내, 및 활막내 주사 또는 주입; 및 신장 투석 주입 기술이 포함되나 이로 제한되지 않는 것으로 고려된다. 부분 관류 또한 고려된다. 특정한 실시양태에는 정맥내 및 피하 경로가 포함된다.
비경구 투여 (예를 들어, 정맥내 투여)에 적합한 제약 조성물의 제형은 전형적으로 활성 성분을 제약상 허용가능한 담체, 예컨대 멸균수 또는 멸균성 등장성 식염수와 조합하여 포함한다. 이러한 제형은 볼루스 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조되거나, 포장되거나 또는 판매될 수 있다. 주사가능한 제형은 보존제를 함유하는 단위 용량 형태, 예컨대 앰풀 또는 다중-용량 컨테이너로 제조되거나, 포장되거나 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형에는 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 중의 에멀젼, 페이스트 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 이러한 제형은 현탁화제, 안정화제 또는 분산화제를 비롯하여 이로 제한되지 않는 1종 이상의 추가의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형의 한 실시양태에서, 활성 성분은 재구성된 조성물의 비경구 투여 전에 적합한 비히클 (예를 들어, 멸균성의 발열원-무함유 물)로 재구성하기 위한 건조 (즉, 분말 또는 과립) 형태로 제공된다. 비경구 제형이 부형제, 예컨대 염, 탄수화물 및 완충화제 (바람직하게는 3 내지 9의 pH로)를 함유할 수 있는 수성 용액 또한 포함하지만, 일부 적용에서 이들은 더욱 적합하게는 멸균성 비-수성 용액으로서 또는 적합한 비히클, 예컨대 멸균성의 발열원-무함유 물과 함께 사용되는 건조 형태로서 제형화될 수 있다. 예시적인 비경구 투여 형태에는 멸균성 수성 용액, 예를 들어 수성 프로필렌 글리콜 또는 덱스트로스 용액 중의 용액 또는 현탁액이 포함된다. 이러한 용량 형태는 적합하게는 원하는 경우 완충될 수 있다. 유용한 다른 비경구 투여가능한 제형에는 미세결정질 형태 또는 리포솜 제제로 활성 성분을 포함하는 것들이 포함된다. 비경구 투여를 위한 제형은 즉시 및/또는 변형된 방출을 위해 제형화될 수 있다. 변형된 방출 제형에는 지연된-, 지속된-, 펄스형-, 제어된-, 표적화된 및 프로그래밍된 방출이 포함된다.
이중특이적 결합 분자의 치료 용도
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 환자에서 ROR1-양성 암과 같은 암을 치료하기 위해 사용된다. 환자는 포유동물, 예를 들어 인간일 수 있다. ROR1은 림프종 및 고형 종양을 비롯하여 여러 유형의 종양에 걸쳐 발현되는 것으로 나타났다. 높은 비율의 인간 암은 ROR1을 발현한다. 예를 들어, 장(Zhang) 등은 그들이 실험한 난소암의 54%, 결장암의 57%, 폐암의 77%, 림프종의 90%, 피부암의 89%, 췌장암의 83%, 고환암의 73%, 방광암의 43%, 자궁암의 96%, 전립선암의 90%, 및 부신암의 83%가 항-ROR1 항체 4A5에 의한 중간 내지 강한 염색을 가졌음을 나타내었다 (Zhang et al., Am J Pathol. 181(6):1903-10 (2012)). 다네쉬마네쉬(Daneshmanesh) 등은 유사하게 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 및 털모양 세포 백혈병 (HCL)에서 ROR1의 거의 보편적인 발현, 및 다른 림프구암, 예컨대 맨틀 세포 림프종 (MCL), 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL)/변연부 림프종 (MZL), 여포성 림프종 (FL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 골수성 백혈병 (AML), 및 골수종에서 다양한 정도의 발현을 발견하였다 (Daneshmanesh et al., Leuk Lymphoma 54(4):843-50 (2013)). 여러 그룹은 B-세포 급성 림프모구성 백혈병 (ALL)의 서브세트에서 ROR1의 발현을 입증하였다 (예를 들어, [Dave et al., PLoS One 7:e52655 (2012)] 참고). ROR1은 또한 상당한 비율의 간세포암 (HCC) 또는 비-소세포 폐암 (NSCLC) 사례에서 발현된다 (미국 특허 공보 2018/0369406). 추가로, ROR1 발현이 공격적인 암에서 증가하고, 불량한 예후와 상관관계가 있는 것으로 나타났고; 따라서 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 공격적인 또는 진행된 암을 치료하는데 특히 적합하다.
"치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 생물학적 장애 및/또는 그에 수반되는 증상 중 적어도 하나를 완화시키거나 또는 저지하는 방법을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 질환, 장애 또는 상태를 "완화시키는" 것은 질환, 장애 또는 상태의 중증도 및/또는 그의 증상의 발생 빈도를 감소시키는 것을 의미한다. 추가로, 본원에서 "치료"에 대한 언급에는 치유적, 완화적 및 예방적 치료에 대한 언급이 포함된다. 암 치료는 암 성장의 억제 (부분적인 또는 완전한 암 퇴행의 유발 포함), 암 진행 또는 전이의 억제, 암 재발 또는 잔류 질환의 예방, 및/또는 환자 생존의 연장을 포함한다.
이중특이적 결합 분자는 본원에 기재된 암을 가진 환자에게 치료 유효량으로 투여될 수 있다. "치료 유효량"은 치료할 장애의 증상 중 하나 이상을 어느 정도 경감시키는 투여될 치료제의 양을 지칭한다. 항암 치료제의 치료 유효량은 예를 들어 종양 축소, 증가된 생존, 암 세포 제거, 감소된 질환 진행, 전이의 역전, 또는 건강관리 전문가가 원하는 다른 임상적 종점을 일으킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이중특이적 결합 분자에 의해 치료가능한 암은 ROR1-발현 (즉, ROR1-양성) 암이다. 암은 유전자 또는 단백질 발현을 결정하는 임의의 적합한 방법에 의해, 예를 들어 조직학, 유세포 측정, RT-PCR, 또는 RNA-Seq에 의해 ROR1-발현으로서 확인될 수 있다. 결정을 위해 이용되는 암 세포는 종양 생검을 통해 또는 순환하는 종양 세포의 수집을 통해 수득될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 항체-기반 검정, 예컨대 유세포 측정 또는 면역조직화학이 이용되는 경우, ROR1-발현 암은 이소타입 대조군 항체에 비해 더 큰 항-ROR1 항체 반응성을 나타내는 세포를 갖는 임의의 암이다. 특정한 실시양태에서, RNA-기반 검정이 이용되는 경우, ROR1-발현 암은 ROR1을 발현하지 않는 음성 대조군 세포 또는 암과 비교하여 상승된 수준의 ROR1 RNA를 나타내는 것들이다.
특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자를 이용하여 혈액학적 악성종양 (예를 들어, 백혈병 및/또는 림프종)을 치료한다. 특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자를 이용하여 고형 종양을 치료한다. 치료할 암은 예를 들어 림프종, 소형 림프구성 림프종, 변연부 림프종, 변연 세포 B-세포 림프종, 버킷 림프종, 맨틀 세포 림프종, 여포성 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 리히터 형질전환을 거친 비-호지킨 림프종, T 세포 비-호지킨 림프종, 림프형질세포양 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, T 세포 백혈병, 육종, 골육종, 유잉 육종, 신세포 암종, 간세포 암종, 결장암, 결장직장암, 유방암, 편평 상피 세포암, 교모세포종, 흑색종, 골수종, 다발성 골수종, 위암, 뇌암, 폐암, 비-소세포 폐암, 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 전립선암, 고환암, 갑상선암, 및 두경부암으로부터 선택될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 암은 맨틀 세포 림프종, 유방암, 폐암, 골의 골육종, 및 유잉 육종으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 치료할 암은 다른 치료제에 대해 불응성인 암 (예를 들어, 삼중 음성 유방암)일 수 있다. 암은 예를 들어 초기, 중기, 후기 또는 전이 단계일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자에 의해 치료되는 환자는 이전에 암 치료를 받은 적이 있다. 다른 측면에서, 환자는 이전에 암 치료를 받은 적이 없다.
본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 추가의 치료적 처치없이, 즉, 단독 요법 (단일요법)으로서 투여될 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자에 의한 치료에는 적어도 1종의 추가의 치료적 처치 (조합 요법)가 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 결합 분자는 암 치료를 위해 또 다른 의약/약물과 함께 공동-투여되거나 또는 제형화될 수 있다. 추가의 처치는 예를 들어 화학요법제, 항신생물제, 또는 항형관신생제, 상이한 항암 항체, 및/또는 방사선 요법을 포함할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 (예를 들어, 본원에 기재된 암을 치료하기 위해) 추가의 치료제 또는 생물학적으로 활성인 분자와 조합되어 사용된다. 생물학적으로 활성인 분자의 예에는 펩티드, 단백질, 효소, 소형 분자 약물, 전구약물, 탄수화물, 영상화제, 지질, 뉴클레오시드, 방사성 핵종, 올리고뉴클레오티드, 독소, 세포, 항생제, 살진균제, 항바이러스제, 항염증제, 항종양제, 심혈관제, 항불안제, 호르몬, 성장 인자, 스테로이드제, 미생물로부터 유래된 독소 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 억제제, 브루톤 티로신 키나제 (BTK) 억제제, 라파마이신의 포유동물 표적 (mTOR)의 억제제, 포스포이노시티드 3-키나제 (PI3K) 억제제, 야누스(Janus) 키나제/신호 변환인자 및 전사 활성화제 (Jak/STAT) 신호전달 억제제, B-세포 림프종 2 (Bcl-2) 억제제, 비장 티로신 키나제 (SYK) 억제제, 미세소관 억제제, 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 억제제, 폴리 ADP 리보스 폴리머라제 (PARP) 억제제, 역형성 림프종 키나제 (ALK) 억제제, DNA-복구 억제제, DNA 가교제, 뉴클레오시드 유사체, 또는 염증조절제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 항체, 예컨대 리툭시맙 (항-CD20) 또는 베바시주맙 (항-VEGF); 브루톤 티로신 키나제 억제제, 예컨대 아칼라브루티닙 또는 이브루티닙; mTOR 억제제, 예컨대 사파니세르팁, 에베롤리무스 또는 BEZ235; PI3K 억제제, 예컨대 이델랄리십 또는 부파를리십; Jak/STAT 신호전달 억제제, 예컨대 룩솔리티닙; Bcl-2 억제제, 예컨대 ABT-199/베네토클락스, Bcl-2i-1, 또는 Bcl-2i-2; SYK 억제제, 예컨대 포스타마티닙; 미세소관 억제제, 예컨대 파클리탁셀 또는 빈크리스틴; EGFR 억제제, 예컨대 에를로티닙; PARP 억제제, 예컨대 올라파립; ALK 억제제, 예컨대 크리조티닙; DNA-복구 억제제, 예컨대 카르보플라틴; DNA 가교제, 예컨대 옥살라플라틴/시스플라틴; 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 겜시타빈; 또는 면역조절 약물 (IMiD), 예컨대 레날리도미드 또는 포말리도미드이다. 특정한 실시양태에서, 추가의 치료제는 이브루티닙, 아칼라브루티닙, 베네토클락스, Bcl-2i-1, Bcl-2i-2, 에베롤리무스, 사파니세르팁, 이델랄리십, 파크리티닙, 부파를리십, BEZ235, 룩솔리티닙, 포스타마티닙, 리툭시맙, 리툭시맙-CHOP, 레날리도미드, 포말리도미드, 파클리탁셀, 빈크리스틴, 에를로티닙, 크리조티닙, 카르보플라틴, 옥살라플라틴/시스플라틴, 베바시주맙, 또는 겜시타빈이다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 결합 분자는 (예를 들어, 본원에 기재된 암을 치료하기 위해) 환자의 면역계를 증강시키는 면역 체크포인트 조절제와 조합하여 사용된다. 예를 들어, 접합체는 면역 체크포인트 억제제, 예컨대 항체 또는 항체 유도체, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 소형 간섭 RNA, 압타머, 또는 펩티드, 표적화 프로그래밍된 사멸-리간드 1 (PD-L1이며, B7-H1, CD274로도 공지됨), 프로그래밍된 사멸 1 (PD-1), CTLA-4, PD-L2 (B7-DC, CD273), LAG3, TIM3, 2B4, A2aR, B7H1, B7H3, B7H4, BTLA, CD2, CD27, CD28, CD30, CD40, CD70, CD80, CD86, CD137, CD160, CD226, CD276, DR3, GAL9, GITR, HAVCR2, HVEM, IDO1, IDO2, ICOS (유도성 T 세포 공동 자극인자), KIR, LAIR1, LIGHT, MARCO (콜라겐 구조를 갖는 대식세포 수용체), PS (포스파티딜세린), OX-40, SLAM, TIGHT, VISTA, VTCN1, 또는 이들의 임의의 조합물과 함께 사용된다.
특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자는 T 세포 (예를 들어, 환자에 대해 자가 또는 동종이계인 T 세포)와 조합하여 환자에게 투여된다. 특별한 실시양태에서, 환자가 인간인 경우, T 세포 또한 인간이다. 일부 실시양태에서, 환자에게 투여 전에 이중특이적 결합 분자는 T 세포에 결합된다.
본 개시내용의 이중특이적 결합 분자가 본원에 기재된 치료 방법에서 사용될 수 있고, 본원에 기재된 치료에서 사용하기 위한 것일 수 있고/거나, 본원에 기재된 치료를 위한 의약의 제조에서 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 본 개시내용은 본원에 기재된 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자를 포함하는 키트 및 제조 물품 또한 제공한다.
제조 물품 및 키트
본 개시내용은 또한 제조 물품, 예를 들어 본 개시내용의 이중특이적 결합 분자, 임의적으로 추가의 생물학적으로 활성인 분자 (예를 들어, 또 다른 치료제)의 제약 조성물을 함유하는 하나 이상의 컨테이너 (예를 들어, 일회용 또는 다회용 컨테이너), 및 사용 지침서를 포함하는 키트를 제공한다. 이중특이적 결합 분자 및 임의적으로 추가의 생물학적으로 활성인 분자는 적합한 포장, 예컨대 비반응성 유리 또는 플라스틱으로 제조된 바이알 또는 앰풀에 별도로 포항될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 바이알 또는 앰풀은 이중특이적 결합 분자 및/또는 추가의 생물학적으로 활성인 분자를 포함하는 동결건조된 분말을 보유한다. 특정한 실시양태에서, 바이알 또는 앰풀은 이중특이적 결합 분자 또는 생물학적으로 활성인 분자의 농축된 스톡 (예를 들어, 2x, 5x, 10x 또는 그 초과)을 보유한다. 특정한 실시양태에서, 제조 물품, 예컨대 키트는 이중특이적 결합 분자 및/또는 생물학적으로 활성인 분자를 투여하기 위한 의료 기기 (예를 들어, 시린지 및 니들); 및/또는 적절한 희석제 (예를 들어, 멸균수 및 생리 식염수)를 포함한다. 본 개시내용은 또한 상기 물품을 제조하는 방법을 포함한다.
본원에서 달리 정의되지 않는다면, 본 개시내용과 함께 사용된 과학적 및 기술적 용어들은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가져야 한다. 예시적인 방법 및 물질이 하기에 기재되지만, 본원에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 방법 및 물질 또한 본 개시내용의 실시 또는 시험에서 이용될 수 있다. 상충되는 경우, 정의를 비롯한 본 명세서가 우선할 것이다.
일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양물, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 분석 화학, 합성 유기 화학, 의학 및 제약 화학, 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 이용된 명명법 및 그의 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되고 일반적으로 이용되는 것들이다. 효소 반응 및 정제 기술은 관련 기술분야에서 일반적으로 수행되는 바와 같이 또는 본원에 기재된 바와 같이 제조자의 사양에 따라 수행된다.
추가로, 문맥상 달리 필요하지 않다면, 단수 용어는 복수 용어를 포함해야 하고, 복수 용어는 단수 용어를 포함해야 한다. 본 명세서 및 실시양태 전반에 걸쳐, 단어 "갖다" 및 "포함하다" 또는 변형어, 예컨대 "갖는다", "갖는", "포함한다" 또는 "포함하는"은 명시된 정수 또는 정수 그룹의 포함을 암시하는 것으로 이해될 것이지만, 임의의 다른 정수 또는 정수 그룹을 배제하지 않는다.
본원에서 언급된 모든 공보 및 다른 참고문헌은 그들의 전문이 참고로 포함된다. 수많은 문서가 본원에 인용되지만, 이러한 인용은 이들 임의의 문서가 관련 기술분야의 일반적인 공통 지식의 일부를 형성하는 것을 인정하는 것을 구성하지 않는다.
본 발명을 더욱 잘 이해할 수 있도록, 하기 실시예가 제시된다. 이들 실시예는 단지 설명의 목적이며, 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 대표적인 실시양태를 설명하며, 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: 항-ROR1/항-CD3 이중특이적 결합 분자의 설계 및 발현
PK, 에피토프, 결합 성분의 상대적인 친화도, 및 파라토프의 결합가 및 공간 구성을 비롯한 다중 변수가 이중특이적 결합 분자의 생체내 효능에 영향을 미친다. 현재, 이들 모든 파라미터를 최적화시키는 선험적인 단일 분자를 설계하는 신뢰할만한 방법이 없다. 따라서, 이들 여러 파라미터의 영향을 체계적으로 평가하기 위해 다중 항-ROR1/항-CD3 이중특이적인 구축물을 설계하고, 제조하고, 시험하였다.
최적의 구성을 제공하는 구조, 구체적으로 ROR1 및 CD3 결합 성분의 가장 활성인 상대적인 공간 구성을 확인하기 위해, 도 1에 요약된 바와 같이 다양한 구축물을 설계하였다. 다양한 이중특이적인 포맷이 기재되었지만 (예를 들어, [Brinkmann and Kontermann, MABS 9:182-212 (2017)] 참고), 현재의 노력은 유리한 PK를 가능하게 하고 널리 확립된 단백질 A-기반 항체 정제 접근법을 이용하기 위해 항체 Fc 성분을 함유하는 포맷에 집중하였다.
이중특이적 결합 분자에서 사용되는 ROR1 결합 성분은 인간 ROR1에 대해 고도로 선택적인 것으로 입증되었고, 인간 임상 시험에서 안전한 것으로 증명되었다 (예를 들어, [Choi et al., Cell Stem Cell 22:951-959 (2018)] 참고). 추가로, 이중특이적 결합 분자는 SP34 및 OKT3 항체를 기반으로 하는 항-CD3 scFv 서열을 이용하여 2가지 별개의 CD3 에피토프에 대해 특이적인 CD3 결합 성분에 의해 시험하였다. CD3 항체는 그들의 에피토프의 별개의 특징을 기반으로 하여 분류되었다 (Tunnacliffe et al., International Immunology 1:546-550 (1989)). 이 시스템을 이용하여, SP34는 그룹 I로 분류된 반면에, OKT3은 그룹 II로 분류되었다.
특정한 구축물의 경우, 야생형 항체 Fc 서열의 사용은 ROR1 및 CD3 둘 다에 대해 2가인 이중특이적인 구축물의 평가를 가능하게 하였다 (도 1, A, B, 및 E). 다른 구축물의 경우, Fc 영역에서 놉-인투-홀 돌연변이의 사용은 ROR1 및 CD3에 대해 상이한 결합가를 갖는 이중특이적 결합 분자의 발현을 가능하게 하였다. 예를 들어, 한 구축물은 ROR1에 대해 2가 및 CD3에 대해 1가인 반면에 (도 1, D), 또 다른 구축물은 ROR1 및 CD3 둘 다에 대해 1가이다 (도 1, C).
최종적으로, 변경된 친화도 및 결합가를 갖는 ROR1 파라토프를 상이한 CD3 파라토프와 조합하여 시험하여, 상이한 상대적인 친화도/결합력을 갖는 CD3 및 ROR1 파라토프의 효과를 평가하였다.
이들 설계 파라미터를 기반으로 하여, 다중 이중특이적인 구축물을 발현하고, 정제하고, 특징분석하였다.
물질 및 방법
서열식별번호: 110의 리더 서열을 갖는 이중특이적인 구축물을 코딩하는 코돈-최적화된 DNA를 pcDNA3.4 벡터에 클로닝한 다음, 일시적인 형질감염에 의해 Expi293 세포에 도입시켰다. Expi293F 발현 배지 (써모피셔(ThermoFisher) cat. #A1435103)를 함유하는 40 mL 배양물에서 세포를 성장시켰다. 후속적으로, 하이트랩 맵셀렉트 슈레(HiTrap MabSelect SuRe) (지이 헬쓰케어(GE Healthcare) cat. #11-0034-93)를 이용하여 단일 단계에서 배양물 상청액으로부터 항체를 정제하였다. 정제된 항체를 PBS, pH 7.2에서 보관하였고, 순도를 SDS-PAGE에 의해 특징분석하였다. 3가지 별개의 폴리펩티드 쇄로 이루어진 구축물의 순도는 TSK겔(TSKgel) G3000SWxl 7.8 mm x 380 mm 컬럼을 사용하는 SEC에 의해 추가로 특징분석하였다. 이동상은 0.1M 인산염 완충제, 0.1M Na2SO4, pH 6.7이었고, 컬럼은 0.7 mL/min의 유속에서 작동시켰다.
결과
항-ROR1/항-CD3 이중특이적 결합 분자의 서열은 표 1 (단백질) 및 표 2 (DNA)에 요약되어 있다.
표 1. 이중특이적인 구축물 폴리펩티드 서열의 요약
표 2. 이중특이적인 구축물 DNA 서열의 요약
SDS-PAGE에 의해 결정된 바와 같이, 대부부의 구축물이 잘 발현되었고 (17/20은 >1 mg 발현됨; 14/20은 >2 mg 발현됨), 대부분의 경우에 단백질 A 크로마토그래피를 이용하는 단일 단계에서 실질적으로 정제되었다 (표 3).
표 3. 이중특이적인 구축물의 발현 및 정제의 요약
디술피드-안정화된 항-CD3 scFv를 함유하지 않는 구축물은 단백질 A 크로마토그래피 후에 일반적으로 보다 높은 순도 (>90%)를 가졌다 (표 3, 구축물 2 및 5와 비교).
3가지 별개의 폴리펩티드 쇄로 이루어진 구축물에 대해 SEC 분석을 수행하였다. 일반적으로, 단일 단백질 A 정제 단계 후에, 2가지 별개의 쇄로 이루어진 구축물 (야생형 Fc)은 3가지 별개의 쇄로 이루어진 구축물 (헤테로머 Fc)에 비해 더 높은 순도로 수득되었다 (표 3, 샘플 1-3 및 7-9의 순도와 샘플 13-17을 비교).
종합적으로, 이들 데이터는 대부분의 구축물이 잘 발현되고, 단일 단백질 A 정제 단계 후에 >90% 순도를 가짐을 입증한다.
실시예 2: ROR1에 대한 항-ROR1/항-CD3 이중특이적 결합 분자의 결합
상이한 구성, ROR1 친화도, 및 ROR1 결합가를 갖는 이중특이적 결합 분자를 인간 ROR1과의 결합에 대해 평가하여, 세포독성에 대한 이들 파라미터의 영향을 결정하였다. 인간 ROR1에 대한 이중특이적인 구축물 1-20의 결합은 ROR1-형질감염된 MEC 세포, JeKo-1 세포, 및 재조합 ROR1 세포외 도메인 (ECD)을 이용하여 특징분석하였다.
물질 및 방법
세포 및 유세포 측정을 이용하는 ROR1 결합 검정
ROR1-형질감염된 MEC 세포 및 JeKo-1 세포 둘 다를 이용하여 ROR1 결합을 정량화하였다. 각각의 조건에 대해, 2.5E5 세포를 사용하였다. 세포를 2% FBS를 갖는 50 μL의 PBS에 넣었다. 다음으로, 세포를 동등한 부피의 시험 이중특이적 결합 분자의 2X 스톡으로 희석하였다. 세포 및 항체를 얼음 상에서 20 분 동안 공동-인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 300 μL의 FACS 완충제로 3회 세척하고, 100 μL의 항-인간 Fc-PE 접합체 항체 (인비트로젠 cat. #12499882)에 재현탁시키고, 얼음 상에서 감소된 광하에 20 분 동안 인큐베이션하였다. 후속적으로, 세포를 300 μL의 FACS 완충제로 3회 세척하고, 25℃에서 10 분 동안 2% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 이어서, 세포를 300 μL의 FACS 완충제로 2회 세척하고, 밀테니 맥스퀀트 분석기(Miltenyi MACSQuant Analyzer) 상에서 분석하였다.
재조합 ROR1-ECD 및 ELISA를 이용하는 ROR1 결합 검정
재조합 ROR1에 대한 이중특이적 결합 분자의 결합을 2가지 상이한 구성을 이용하여 ELISA에 의해 평가하였다. 첫번째 구성에서는, ROR1 단백질을 96-웰 플레이트 상에 고정시켰고, 이중특이적인 구축물을 적정하였다 (상세한 내용은 하기 참고). 또한, 이중특이적 결합 분자를 96-웰 플레이트 상에 고정시키고 가용성 비오틴화 ROR1 (b-ROR1)을 적정한 두번째 구성을 이용하여 ROR1 결합에 대해 이중특이적 결합 분자를 특징분석하였다 (상세한 내용은 하기 참고).
고정된 ROR1 ELISA
96-웰 코스타(Costar)-3366 플레이트를 PBS 중에서 50 μL/웰의 2 μg/mL 인간 TL1A (아크로 바이오시스템즈(Acro Biosystems) cat. #R01-H522Y)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 0.05% 트윈(Tween) 20을 함유하는 PBS (PBS-T)로 1회 세정하고, 25℃에서 1 시간 동안 PBS 중에서 100 μL/웰의 5% 무지방 우유 (5% M-P)로 차단하였다. 항체 샘플을 5% M-P를 사용하여 2배 계열 희석하고, 25℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다 (50 μL/웰). 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하고, 5% M-P 중에서 10,000배 희석된 50 μL/웰 항-인간 카파, HRP 접합체 (써던 바이오텍(Southern Biotech) cat. #2060-05)를 25℃에서 1 시간 동안 첨가하였다. 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하고, 50 μL/웰 1-단계 울트라(Ultra) TMB-ELISA (써모 사이언티픽(Thermo Scientific) cat. #34028)에 의해 발달시켰다. 2 N H2SO4를 첨가하여 반응을 종결시키고, 스펙트라맥스(Spectramax) 플레이트 판독기를 사용하여 A450을 결정하였다.
가용성 ROR1 ELISA
ROR1을 비오틴화하기 위해, 200 μg의 인간 ROR1 (아크로 바이오시스템즈 cat. #R01-H522Y)를 2 mL 물 중에서 100 μg/mL로 재현탁시킨 다음, EZ-링크 술포-NHS-LC-비오틴 (써모 사이언티픽 cat. # 21327)과 1:5 몰비로 합하고, 25℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 31 μL의 750 mM 아르기닌 히드로클로라이드를 첨가하여 반응을 종결시키고, 4℃에서 보관하였다.
가용성 ROR1에 대한 이중특이적인 구축물의 결합을 측정하기 위해, 96-웰 코스타-3366 플레이트를 PBS 중에서 50 μL/웰의 2 μg/mL 염소 항-인간 카파 (써던 바이오텍 cat. #2060-01)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS-T로 1회 세정하고, 25℃에서 1 시간 동안 100 μL/웰 5% M-P로 차단하고, PBS-T로 1회 세정하고, 2 μg/mL의 이중특이적 결합 분자를 첨가하고, 25℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하였다. 비오틴화 ROR1을 5% M-P에 의해 3배 계열 희석하고, 25℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다 (50 μL/웰). 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하였다. b-ROR1의 결합을 검출하기 위해, 1% BSA-PBS 중에서 1:5000 희석된 50 μL/웰 뉴트라비딘(Neutravidin)-HRP (피어스(Pierce) cat. #31030)를 25℃에서 1 시간 동안 첨가하였다. 플레이트를 PBS-T로 3회 세척한 다음, 50 μL/웰 1-단계 울트라 TMB-ELISA (써모 사이언티픽 cat. #34028)에 의해 발달시켰다. 2 N H2SO4를 첨가하여 반응을 종결시키고, 스펙트라맥스 플레이트 판독기 상에서 A450을 결정하였다.
결과
H-CDR2에서 단일 아미노산이 모 항체와 각각 상이한 3가지 항-ROR1 Fab 변이체를 ELISA-기반 스크리닝 및 살아있는 세포 결합을 이용하여 인간 ROR1에 대한 결합에 대해 특징분석하였다. 변이체 중 2가지, T32A 및 T32E는 모 Fab에 비해 더 높은 친화도를 나타낸 반면에 (도 2, 패널 A, 열린 원 및 사각형 대 닫힌 원), 다른 변이체, W110Y는 더 낮은 친화도를 나타내었다 (도 2, 패널 A, 삼각형). 이들 변이체의 상대적인 친화도는 살아있는 ROR1-형질감염된 MEC 세포를 이용하여 추가로 특징분석하였다. ELISA-기반 스크리닝을 기반으로 하여, 변이체 T32A 및 T32E는 더 높은 친화도를 나타낸 반면에 (도 2, 패널 B, 열린 원 및 사각형 대 닫힌 원), W110Y는 감소된 결합을 가졌다 (도 2, 패널 B, 삼각형). 대조군 빈 벡터 형질감염된 MEC 세포를 사용할 때 어떠한 변이체의 결합도 검출되지 않았고 (도시되지 않음), 이는 ROR1에 대한 변이체의 특이성을 입증한다. 변이체의 상대적인 결합 강도는 검정 포맷과는 무관하게 매우 유사하였다. 예를 들어, T32A 변이체는 모 항체에 비해 4 내지 4.7배 더 높은 친화도를 가진 반면에, W110Y 변이체는 모 항체에 비해 5.9 내지 6.8배 더 낮은 친화도를 가졌다. 이들 매우 밀접하게 관련된 변이체는 1 내지 2개 아미노산만큼 서로 상이하고, ROR1에 대해 27배 범위의 결합 활성을 나타내며, ROR1 뿐만 아니라 CD3에 대한 친화도 범위를 갖는 항-ROR1/항-CD3 이중특이적 결합 분자의 설계를 가능하게 한다.
다음으로, 중쇄 T32A 돌연변이와 조합된 별개의 경쇄 CDR 돌연변이를 각각 함유하는 2가지 추가의 항-ROR1 Fab 변이체를 이전에 기재된 ELISA-기반 스크린의 변형된 버전을 이용하여 인간 ROR1에 대한 결합에 대해 특징분석하였다. 구체적으로, 고정된 ROR1에 대한 Fab의 결합 후에 첫번째 세척 단계는 연장된 1 시간 해리 단계 동안에 다량의 PBS-T 중에 플레이트를 배치함으로써 변경되었다. 이는 느린 해리 속도를 갖는 변이체가 서로 구별될 수 있게 하였다. 변형된 ELISA를 이용하여, 2가지 변이체, T32A (HC) + A25P (LC) 및 T32A (HC) + T69R (LC)는 T32A에 비해 더 강한 결합을 나타내었다 (도 3). 이전에 기재된 바와 같이, T32A 변이체는 모체 (WT)에 비해 결합에서 >5배 개선을 나타낸 반면에, T32A (HC) + A25P (LC) 및 T32A (HC) + T69R (LC)는 모 Fab에 비해 결합에서 추가의 개선 (각각 >8배 및 >13배)을 나타내었다. 이들 매우 밀접하게 관련된 변이체는 1-3개 아미노산만큼 서로 상이하고, ROR1에 대해 80 내지 90배 범위의 결합 활성을 나타내며, ROR1 뿐만 아니라 CD3에 대한 친화도 범위를 갖는 항-ROR1/항-CD3 이중특이적 결합 분자의 설계를 가능하게 한다.
이중특이적 결합 분자는 3가지 검정을 이용하여 ROR1 결합에 대해 시험하였다: (1) 살아있는 세포에 대한 결합 및 유세포 측정에 의한 검출, (2) ELISA에 의해 결정되는 고정된 ROR1에 대한 결합, 및 (3) ELISA에 의해 결정되는 가용성의 비오틴화 ROR1에 대한 결합. 사용된 스크리닝 포맷과는 무관하게, 모든 구축물은 선택적으로 ROR1과 결합하였다 (도 4-7).
ROR1에 대한 선택성은 ROR1-형질감염된 MEC 세포 및 대조군 MEC 세포에 대한 결합을 측정함으로써 입증되었다. ROR1-형질감염된 세포에 대한 이중특이적 결합 분자의 결합은 농도 의존적이며 (도 4, 패널 A), 어떠한 농도에서도 대조군 세포에 대한 결합은 관찰되지 않았다 (도 4, 패널 B). 두 세포주 모두에 대해 비특이적인 인간 IgG가 대조군 ("대조군")으로서 포함되었다.
ROR1-형질감염된 MEC 세포에 대한 이중특이적인 구축물의 결합 강도의 변동이 관찰되었다 (도 4, 패널 A). 예를 들어, ROR1 2가 구축물은 ROR1 1가 구축물에 비해 더 단단하게 결합하였다 (도 4, 패널 A, 구축물 1-3 및 7-9과 13-15의 비교). 결합 강도에서 이러한 차이는 보다 낮은 농도에서 가장 명백하였다 (<100 ng/mL).
이중특이적인 구축물의 결합에 대한 ROR1 발현 수준의 영향을 JeKo-1 세포를 이용하여 유세포 측정에 의해 평가하였다. JeKo-1 세포는 ROR1-형질감염된 MEC 세포 (~56,000 카피/세포)에 비해 낮은 수준의 ROR1 (~13,000 카피/세포)을 발현한다. 모든 구축물이 JeKo-1 세포에 결합하였다 (도 5). ROR1-형질감염된 MEC 세포를 이용하여 관찰된 상대적인 결합 경향이 JeKo-1 세포에 의해 관찰되었다. 구체적으로, 1가 ROR1 구축물은 일반적으로 2가 구축물에 비해 약하게 결합하였다 (도 5, 패널 A, 구축물 14 및 15와 다른 구축물의 비교; 도 5, 패널 C, 구축물 15-17과 다른 구축물의 비교).
다음으로, ROR1에 대한 이중특이적 결합 분자의 결합은 ROR1의 재조합적으로 발현된 세포외 도메인을 이용하여 ELISA에 의해 특징분석하였다. ROR1을 미세역가 플레이트 상에 고정시키고, 이중특이적 결합 분자를 적정하고, 결합을 항-인간 카파-HRP 시약에 의해 정량화하였다. 세포 결합 데이터와 일치하게, 모든 구축물은 농도-의존적인 방식으로 ROR1과 결합하였다 (도 6). 더욱이, 1가 ROR1 구축물 13-15는 2가 구축물 중 2가지를 제외한 모든 구축물에 비해 덜 단단히 결합하였다. 2가 이중특이적 결합 분자의 결합 활성은 모 항-ROR1 IgG (대조군)와 유사하였고, 이는 Ig 분자에 scFv 도메인을 부가하는 것이 ROR1 결합을 억제하지 않았음을 입증한다. 이 포맷으로 시험한 이중특이적인 구축물의 상대적인 친화도는 표 4에 요약되어 있다.
세포 검정에서 및 항원이 고정된 ELISA에서 1가 구축물에 비해 2가 구축물에 의해 관찰된 더 강한 결합은 결합력 효과와 일치한다. 이런 경우였는지 확인하기 위해, 염소 항-인간 카파 항체로 코팅된 미세역가 플레이트 상에 이중특이적 결합 분자를 고정시키고, 비오틴화 ROR1을 적정함으로써 가용성의 단량체성 ROR1에 대한 결합을 평가하였다. 모든 이중특이적 결합 분자는 이 포맷에서 활성이었고 (도 7), 대부분의 경우에, 1가 및 2가 구축물 사이에 주목할만한 차이는 없었다. 이들 결과는 이용된 검정 포맷에 따라 결합력 효과와 일치한다. 항-CD3 scFv가 중쇄 또는 경쇄의 아미노 말단에서 수정된 것인 2가지 변이체 (각각 구축물 19 및 20) 모두에 의해 더 약한 결합이 관찰되었고, 이는 ROR1 파라토프와 매우 근접한 CD3 파라토프의 배치가 ROR1 결합을 어느 정도 억제할 수 있음을 시사한다.
더 높은 친화도 ROR1 결합 도메인을 함유하는 이중특이적 결합 분자 구축물 (구축물 16-18)은 야생형 (더 낮은 친화도) ROR1 결합 도메인을 사용한 상응하는 구축물 (구축물 9, 19, 20)에 비해 더 높은 친화도로 비오틴화 ROR1과 결합하였다. 이중특이적인 구축물 18 (2가, 더 높은 친화도 ROR1)은 상응하는 구축물 9 (2가, 더 낮은 친화도 ROR1)에 비해 더 단단히 결합하였다. 마찬가지로, 이중특이적인 구축물 16 및 17 (1가, 더 높은 친화도 ROR1)은 구축물 15 (1가, 더 낮은 친화도 ROR1)에 비해 더 단단히 결합하였다. 이들 데이터는 표 4에 요약되어 있다. 추가로, 더 높은 친화도 ROR1 결합 도메인을 갖는 이중특이적 결합 분자는 모 IgG (대조군)에 비해 더 높은 친화도로 가용성 ROR1과 결합하였다.
표 4. ROR1에 대한 이중특이적 결합 분자 친화도
실시예 3: 항-ROR1/항-CD3 이중특이적 결합 분자에 의한 ROR1 내재화
ROR1, 및 ROR1을 인식하는 이중특이적 결합 분자의 내재화 및 재순환은 생체내 치료 효능에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, T 세포의 결속 전에 ROR1의 결합, 내재화 및 분해는 세포독성을 감소시킬 것으로 예상될 수 있다. 5가지 별개의 구성을 갖는 항-ROR1/항-CD3 이중특이적 결합 분자를 결합 및 내재화에 대해 특징분석하였다.
다양한 이중특이적인 구축물의 내재화를 특징분석하는 것과 동시에, ROR1의 세포 표면 발현을 2가지 상이한 ROR1 항체를 이용하여 실험하였다. 한 항체 (UC961)는 이중특이적 결합 분자와 동일한 ROR1 에피토프를 인식하는 반면에, 다른 것 (4A5)은 겹치지 않는 ROR1 에피토프를 인식한다.
또한, 연장된 노출이 다양한 결합 분자의 세포 표면 수준에 영향을 미쳤는지를 결정하기 위해, 이중특이적 결합 분자의 세포 표면 결합을 37℃에서 24 시간 인큐베이션 후에 평가하였다.
ROR1 이중특이적 결합 분자의 내재화 및 ROR1의 재순환/재발현은 ROR1-형질감염된 MEC 세포 및 유세포 측정을 이용하여 특징분석하였다.
물질 및 방법
이중특이적 결합 분자의 내재화의 측정
이중특이적 결합 분자의 내재화는 유세포 측정을 이용하여 내재화되지 않은 세포 표면 항체를 0, 30, 60, 120, 180 및 240 분째에 정량화하는 펄스-추적 방법을 이용하여 측정하였다. ROR1-형질감염된 MEC 세포를 저온의 PBS로 세척하고, 저온 인큐베이션 완충제 (2% FBS를 갖는 RPMI - 피셔(Fisher)/깁코(Gibco) cat. #16140071) 중에서 mL당 1x107에서 재현탁시켰다. 이어서, 3.5x106 세포를 시험한 각각의 이중특이적인 구축물에 대해 미세원심분리 튜브에 분취하였다. 동등한 부피 (350 μL)의 이중특이적 결합 분자를 세포와 조합하여, 30 μg/mL의 최종 농도를 만들었다. 이전의 결합 연구를 기반으로 하여, 30 μg/mL가 2가 ROR1 구축물 (구축물 1-12)의 더 높은 친화도/결합력에 대해 포화될 것으로 예상되었다. 세포 및 항체를 얼음 상에서 20 분 동안 인큐베이션하고, 1 mL의 저온 FACS 완충제 (2% FBS를 갖는 PBS)로 5회 세척하고, 1.4 mL의 인큐베이션 완충제에 재현탁시켰다. 후속적으로, 샘플을 37℃에서 0, 30, 60, 120, 180 및 240 분 동안 인큐베이션한 후, 200 μL의 각각의 샘플을 얼음으로 옮겨서 내재화를 중단시켰다.
각각의 구축물 및 시점에 대한 샘플을 반으로 나누고 (각각 100 μL), 회전시켰다. 샘플 중 절반은 100 μL 이차 항체 (염소 항-인간 IgG-PE, Fc-감마 특이적 - 이바이오사이언시즈(eBiosciences) cat. #12-4998)에 재현탁시켜, 결합된 이중특이적인 구축물을 검출하였다. 다른 절반은 UC961-PE 및 4A5-알렉사플루오르(AlexaFluor)647의 100 μL 칵테일로 염색하였다. UC961은 이중특이적인 구축물과 동일한 에피토프에 결합하여, 이중특이적 결합 분자에 결합되지 않은 유리 ROR1을 검출한다. 4A5는 상이한 에피토프에서 ROR1에 결합하며, 따라서 결합을 위해 이중특이적 결합 분자와 경쟁하지 않는다. 따라서, 4A5는 전체 세포 표면 ROR1 (결합 및 유리)을 검출한다. 두 염색 세트 모두 어두운 곳에서 얼음 상에서 20 분 동안 인큐베이션 완충제 중에 두었다. 세포를 FACS 완충제로 3회 세척하고, 25℃에서 10 분 동안 100 μL의 고정 완충제 (PBS 중 2% 파라포름알데히드)에 재현탁시켰다. 후속적으로, 고정된 세포를 FACS 완충제로 1회 세척하고, 분석하였다.
각각의 염색에 대해 중앙 형광 강도 (MFI)를 정량화하였다. 몇몇 대조군 조건을 이용하였다. 염색되지 않은 대조군 세포에 대한 PE 및 Al647 MFI를 측정하여, 백그라운드 형광 차감을 위해 이용하였다. 이중특이적인 구축물에 노출되지 않은 세포를 이차 항체 PE로 염색하여 이차 항체 (이차 음성 대조군)의 비특이적인 염색을 설명하고, UC961-PE로 염색하여 최대 UC961 결합 대조군을 수득하였다. 표면 이중특이적 결합 분자, 비점유 세포 표면 ROR1 에피토프, 및 전체 ROR1의 정량화를 다음과 같이 수행하였다:
결과
본원에 기재된 이중특이적 결합 분자의 구축에 사용된 항-ROR1 항체에 의한 이전의 실험은 다음을 입증하였다: (1) 항체가 신속히 내지화되었고, (2) ROR1이 결합된 항체없이 세포 표면 상에 다시 나타났다. 이러한 세포 표면 발현은 엔도솜 구획으로부터 ROR1 재순환의 결과이거나, 또는 데노보 합성 또는 세포내 보관소의 수송을 통한 ROR1의 신속한 상향조절을 반영한다 (예를 들어, 미국 특허 공보 2018/0369406 참고). 상이한 이중특이적인 구축물은 가변 내재화 및 ROR1 재순환/재발현 패턴을 나타내었다 (도 8 및 도 9).
중쇄의 카르복시-말단에서 항-CD3 scFv의 배치 (구성 A, 구축물 1)는 신속한 내재화를 유도하였다 (도 8, 패널 A, 원). 0 시간째에, 이용가능한 ROR1 이중특이적인 에피토프가 포화되었고, 이는 유리 에피토프가 검출되지 않았기 때문이다. 전체 ROR1 표면 수준이 감소함에 따라, ROR1은 실험 시간 동안에 세포 표면으로 재순환되지 않았거나 또는 유의한 수준에서 재발현되지 않았으며 (도 8, 패널 A, 사각형), 이중특이적 결합 분자에 의해 인식되는 유리 ROR1 에피토프가 검출되지 않았다 (도 8, 패널 A, 삼각형). 이들 데이터는 이중특이적 결합 분자-ROR1 복합체의 내재화 및 리소좀으로의 수송과 일치한다. 매우 유사한 내재화 및 수송이 이중특이적 결합 분자 구축물 2 및 3에서 관찰되었다 (도시되지 않음).
경쇄의 카르복시-말단에서 항-CD3 scFv의 배치 (구성 B, 구축물 7)는 내재화를 유의하게 억제하였다 (도 8, 패널 B, 구축물 3에 비한 내재화 정도를 도 8, 패널 A에서 비교함). 0 시간째에, 구축물은 그의 에피토프를 완전히 포화시켰다. 전체 세포 표면 ROR1 수준은 비교적 일정한 것으로 보였다 (도 8, 패널 B, 사각형). 또한, 이중특이적에 의해 인식되는 유리 ROR1 에피토프는 시간-의존적인 방식으로 증가하였고 (도 8, 패널 B, 삼각형), 이는 세포 표면으로부터 이중특이적 결합 분자의 해리 또는 ROR1의 재순환/재발현과 일치한다. 매우 유사한 내재화 및 수송이 이중특이적 결합 분자 구축물 8 및 9에서 관찰되었다 (도시되지 않음).
1가 항-ROR1 (구성 C, 구축물 13) 또한 효율적으로 내재화되지 않았다 (도 8, 패널 C). 이전의 연구는 2가 구축물의 결합이 30 μg/mL에서 포화되었음을 입증하였다 (도 4, 패널 A 및 도 5). 그러나, 30 μg/mL에서 1가 항-ROR1 이중특이적 결합 분자의 결합이 이 실험에서 세포 표면 ROR1을 포화시키는 것으로 보이지 않았다. 0 시간째에 구축물 13의 결합 정도는 0 시간째에 구축물 1 및 7의 상응하는 포화된 MFI의 단지 ~80%이었다 (도 8, 패널 C, 0 시간째에 원과 사각형을 비교함). 추가로, 구축물 13에 의해 인식되는 유리 ROR1 에피토프 또한 0 시간째에 검출되었다 (도 8, 패널 C, 삼각형). 요약하면, 1가 이중특이적 결합 분자 구축물 13, 전체 세포 표면 ROR1 및 비점유 이중특이적인 에피토프의 수준 모두 실험 기간에 걸쳐 비교적 일정하게 유지되었다. 종합적으로, 이들 데이터는 이중특이적 결합 분자 13의 내재화 거의 없음과 일치한다. 매우 유사한 내재화 및 수송은 구축물 15에서 관찰되었다 (도시되지 않음).
한 중쇄의 아미노-말단에서 항-CD3 scFv의 배치 (구성 D, 구축물 19)는 부분적인 내재화를 유도하였다 (도 9, 패널 A, 원). 전체 ROR1 표면 수준이 증가하고 (도 9, 패널 A, 사각형), 이중특이적 결합 분자에 의해 인식되는 ROR1 에피토프의 시간-의존적인 검출이 증가함에 따라 (도 9, 패널 A, 삼각형), 실험 시간 동안에 ROR1은 유의한 수준으로 세포 표면으로 재순환되거나 또는 재발현되었다. 한 중쇄의 아미노-말단에서 항-CD3 scFv 모이어티의 배치는 구성 B를 갖는 이중특이적 결합 분자 (경쇄의 카르복시-말단에 융합된 항-CD3 scFv)와 매우 유사한 내재화 및 수송을 발생시켰다.
경쇄의 아미노-말단에서 항-CD3 scFv의 배치 (구성 E, 구축물 20)는 부분적인 내재화를 유도하였다 (도 9, 패널 B, 원). 전체 ROR1 표면 수준이 증가하고 (도 9, 패널 B, 사각형), 이중특이적 결합 분자에 의해 인식되는 ROR1 에피토프의 시간-의존적인 검출이 증가함에 따라 (도 9, 패널 B, 삼각형), 실험 시간 동안에 ROR1이 유의한 수준으로 세포 표면으로 재순환되거나 또는 재발현되었다. 경쇄의 아미노-말단에서 항-CD3 scFv 모이어티의 배치는 구성 B를 갖는 이중특이적 결합 분자 (경쇄의 카르복시-말단에 융합된 항-CD3 scFv)와 매우 유사한 내재화 및 수송을 발생시켰다.
세포 표면에 결합된 이중특이적 결합 분자의 수준에 대한 ROR1 수송 및 발현의 장기간 영향을 결정하기 위해, 세포를 이중특이적 결합 분자와 함께 24 시간 동안 인큐베이션하고, 세척하고, 세포 표면 이중특이적 결합 분자를 측정하였다. 24 시간 인큐베이션 후에 표면 이중특이적 결합 분자의 정량화는 중쇄의 카르복시-말단에 융합된 항-CD3 scFv를 갖는 이중특이적 결합 분자 (도 10, 구축물 1, 원)가 경쇄의 카르복시-말단에 융합된 항-CD3 scFv를 갖는 이중특이적 결합 분자 (도 10, 구축물 7, 사각형) 또는 Fc의 아미노-말단에 융합된 항-CD3 scFv를 갖는 이중특이적 결합 분자 (도 10, 구축물 13, 삼각형)에 비해 더 낮은 수준으로 존재하였음을 나타내었다. 다른 이중특이적인 구성이 아니라 항-CD3 scFv가 중쇄의 카르복시-말단에 융합된 구축물의 감소된 세포 표면 수준은 표면 ROR1의 하향조절을 시사하고, 내재화 실험에서 이루어진 관찰과 일치한다 (도 8).
실시예 4: 항-ROR1/항-CD3 이중특이적 결합 분자의 CD3 결합 및 내재화
T 세포의 표면 상에서 TCR-CD3 복합체의 수는 새로운 단백질의 합성 및 분비, 내재화, 재순환 및 분해의 조합을 반영한다. 항-CD3 항체 OKT3으로의 처리는 내재화에 의해 표면으로부터 CD3을 선택적으로 제거하는 것으로 나타났다.
항-ROR1/항-CD3 이중특이적 결합 분자에서 scFv 구축물로서 3가지 항-CD3 서열이 사용되었다. 서열 중 2가지는 OKT3의 상이한 인간화 버전 (Ab8 및 Ab9)인 반면에, 세번째 서열은 상이한 항-CD3 항체의 제3자 인간화 버전인 SP34 (Ab10)이다. 상기 언급된 바와 같이, OKT3 및 SP34는 별개의 에피토프에 결합하고, 항-CD3 항체는 그들의 에피토프의 별개의 특징을 기반으로 하여 분류되었다 (Tunnacliffe et al., International Immunology 1:546-550 (1989)). 이 시스템을 이용하여, SP34는 그룹 I로 분류되는 반면에, OKT3은 그룹 II로 분류된다. SP34-기반 서열은 시노몰구스 CD3과 교차-반응성인 것으로 예상되나, OKT3-기반 서열은 그렇지 않다.
다양한 CD3 파라토프는 5가지 별개의 구성 (도 1, A-E)에서 평가되었고, 1가 항-CD3 이중특이적인 구축물 (도 1, C 및 D)의 결합을 특정한 2가 항-CD3 구축물 (도 1, A, B 및 E)과 비교하였다. 3가지 모든 scFv 서열의 디술피드-안정화된 버전 또한 다양한 이중특이적인 구성에서 평가하였다.
ROR1 결속의 부재하에 다양한 이중특이적인 구축물의 내재화를 평가하였다. 이중특이적 결합 분자의 결합 및 내재화는 Jurkat 세포 및 유세포 측정을 이용하여 특징분석하였다.
물질 및 방법
CD3 결합 검정
CD3 결합을 정량화하기 위해, 각각의 조건에 대해 2.5E5 Jurkat 세포를 사용하였다. 2% FBS를 갖는 50 μL의 PBS에 세포를 두어서 5E6/mL로 재현탁시킴으로써 2X 스톡의 세포를 제조하였다. 다음으로, 세포를 동등한 부피의 2X 스톡의 시험 이중특이적 결합 분자로 희석하였다. 세포 및 항체를 얼음 상에서 20 분 동안 공동-인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 300 μL의 FACS 완충제로 3회 세척하고, 1:500 희석으로 100 μL의 염소 항-인간 Fc-PE 접합체 항체 (인비트로젠 cat. #12499882)에 재현탁시키고, 얼음 상에서 감소된 광하에서 20 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 300 μL의 FACS 완충제로 3회 세척하고, 2% 파라포름알데히드로 25℃에서 10 분 동안 고정하였다. 세포를 300 μL의 FACS 완충제로 2회 세척하고, 밀테니 맥스퀀트 분석기 상에서 분석하였다.
CD3 내재화 검정
이중특이적 결합 분자의 내재화를 정량화하기 위해, 2.5E5 Jurkat 세포를 1 μg/mL의 이중특이적 결합 분자와 함께 얼음 상에서 20 분 동안 공동-인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 300 μL의 빙온 FACS 완충제로 3회 세척하고, 배양 배지에 재현탁시키고, 37℃에서 인큐베이션하였다. 다양한 시간에, 세포를 제거하고, 300 μL의 빙온 FACS 완충제로 세척하고, 상기 기재된 바와 같이 가공하였다.
결과
5가지 상이한 이중특이적인 구성 (도 1)을 평가하였다. Jurkat 세포에 대한 결합에 의해 입증되는 바와 같이, 시험한 모든 이중특이적인 구성에서 OKT3- 및 SP34-기반 서열 둘 다에서 CD3 결합이 보존되었다. 구축물은 다양한 정도로 결합하였다 (도 11 및 도 12).
OKT3 및 SP34 서열을 이용하여 시험한 모든 이중특이적인 구성 (구축물 1-15)에 대해, OKT3-기반 서열은 SP34-기반 서열에 비해 더 높은 친화도로 결합하였다. 예를 들어, 구축물 1 및 2는 3에 비해 더 단단히 결합하였고 (도 11, 패널 A), 구축물 7 및 8은 9에 비해 더 단단히 결합하였고 (도 11, 패널 B), 구축물 13 및 14는 15에 비해 더 단단히 결합하였다 (도 11, 패널 C). 비특이적인 인간 IgG가 대조군 ("대조군")으로서 포함되었다.
항-CD3 scFv의 디술피드-안정화된 변이체를 생성하기 위한 시스테인 잔기의 도입은 결합에 부정적인 영향을 미치지 않았다. 디술피드-안정화된 변이체의 결합은 상응하는 비-디술피드 안정화된 서열과 구별될 수 없었다 (도 11, 패널 A, 구축물 1-3을 각각 4-6과 비교, 및 도 11, 패널 B, 구축물 7-9를 각각 10-12와 비교).
이중특이적 결합 분자의 구성은 항-CD3 scFv의 결합에 중대한 영향을 미쳤다 (도 12). Jurkat 세포에 대한 가장 강한 결합은 항-CD3 scFv 모이어티가 경쇄 (도 12, 패널 B, 구축물 20) 또는 중쇄 (도 12, 패널 B, 구축물 19)의 아미노-말단에 배치될 때 관찰되었다. 역으로, 더 약한 결합은 항-CD3 scFv가 경쇄의 카르복시-말단 (도 12, 패널 B, 구축물 9 및 18)에 배치될 때 관찰되었다. 한 중쇄의 아미노-말단에 배치된 단일 항-CD3 scFv 모이어티 (1가 CD3 결합; 도 12, 패널 B, 구축물 19) 또한 결합하거나, 또는 중쇄 (2가 CD3 결합; 도 12, 패널 B, 구축물 3) 또는 경쇄 (2가 CD3 결합; 도 12, 패널 B, 구축물 9 및 18)의 카르복시-말단에서 2가지 항-CD3 scFv 모이어티의 배치에 비해 더 양호하게 결합하였다. 한 실험에서는 대조군으로서 비특이적인 인간 IgG가 포함된 반면에 (도 12, 패널 A, "대조군"), 두번째 실험에서는 대조군으로서 관련이 없는 ROR1 x CD3 이중특이적인 구축물 (미국 특허 공보 2017/0233472; 서열식별번호: 111-113)이 포함되었다 (도 12, 패널 B, "대조군 1").
OKT3 서열을 이용하여 이들 이중특이적인 구성의 서브세트에서 유사한 경향이 관찰되었다. 구체적으로, Fc의 아미노-말단에 융합된 1가 항-CD3 scFv는 가장 강하게 결합하였고 (도 12, 패널 A, 구축물 13), 그 다음에 scFv가 중쇄의 카르복시-말단에 융합된 구축물 (도 12, 패널 A, 구축물 1), 그 다음에 scFv가 경쇄의 카르복시-말단에 융합된 구축물 (도 12, 패널 A, 구축물 7)이었다.
이중특이적 결합 분자의 구성이 CD3 파라토프 결합가에 비해 CD3 결합 강도의 더욱 중요한 결정소인 것으로 보인다는 점을 주목할만 하다. 이러한 놀라운 효과는 중쇄 (도 12, 패널 B, 구축물 19) 또는 Fc (도 12, 패널 A, 구축물 13 및 도 12, 패널 B, 구축물 15 및 16)의 아미노 말단에 융합된 1가 항-CD3 구축물 또한 결합하거나 또는 중쇄 및 경쇄의 카르복시-말단에 융합된 2가 항-CD3 구축물 (도 12, 패널 B, 구축물 3, 9 및 18)에 비해 더 양호하게 결합하였다는 관찰에 의해 강조된다.
종합적으로, 이들 데이터는 CD3 결합의 강도를 조절하는 3가지 상이한 접근법이 있음을 입증한다. 첫번째로, SP34- 및 OKT3-기반 서열은 동일한 이중특이적인 포맷에서 서로 비교할 때 상이한 결합 강도를 나타낸다. 두번째로, SP34- 및 OKT3-기반 서열 둘 다의 결합 강도는 이중특이적 결합 분자의 구성에 의해 영향을 받는다. 최종적으로, 헤테로머 Fc 구축물의 사용은 1가 또는 2가 항-CD3 이중특이적 결합 분자를 가능하게 한다.
항-CD3 항체에 의한 T 세포 활성화는 CD3의 내재화를 증가시킬 수 있다. 일단 내재화되면, CD3은 재순환 경로에 들어갈 수 있고, 세포 표면에서 재발현될 수 있거나 또는 리소좀으로 분류되어 분해될 수 있다. 종양 항원 (ROR1) 결속의 부재하에 이중특이적 결합 분자에 의해 유도된 CD3의 내재화 및 분해는 생체내 이중특이적 결합 분자의 세포독성 활성을 억제할 수 있다. 결과적으로, 이중특이적 결합 분자는 ROR1의 부재하에 CD3과의 결합 후 내재화를 특징으로 하였다 (도 13).
이중특이적 결합 분자의 결합 및 4℃에서 세척 후에, Jurkat 세포를 37℃에서 인큐베이션하였다. 후속적으로, 세포 표면 상에서 이중특이적 결합 분자의 양을 다양한 시점에서 정량화하였다. 이중특이적 결합 분자가 초기에 상이한 강도로 결합하였기 때문에 (도 11 및 도 12), 내재화는 0 시간째에 관찰된 결합의 백분율로서 보고되었다. 이러한 방식으로 정량화된 표면 이중특이적 결합 분자의 수준은 내재화 및 해리의 조합을 반영한다. 그럼에도 불구하고, 하기에 요약된 이유로, 표면 수준에 영향을 미치는 일차 인자는 이중특이적 결합 분자의 해리가 아니라 내재화인 것으로 나타났다.
표면 이중특이적 결합 분자의 수준은 시험한 모든 이중특이적인 구축물에 대해 손실 정도는 다르지만 시간-의존적인 방식으로 감소하였다. 시험한 9가지 구축물 중 8가지에 대해 처음 30 분 내에 신속한 내재화 (>50%)가 관찰되었고, 그 후에 다음 3.5 시간에 걸쳐 더 느리지만 연속적인 내재화가 관찰되었다. 경쇄의 카르복시-말단에 융합된 SP34-기반 서열로 이루어진 구축물 9는 실험 기간에 걸쳐 가장 적게 내재화되었고, 이중특이적 결합 분자의 대략 50%는 4 시간 후에도 여전히 세포 표면 상에서 검출가능하였다. 또한, 중쇄의 카르복시-말단에 융합된 항-CD3 scFv 모이어티로 이루어진 구축물 1 및 3은 중간 정도의 내재화를 나타내었고, ~20%는 4 시간 인큐베이션 후에 여전히 세포 표면 상에서 검출가능하였다.
이전에 논의된 바와 같이, 시간에 걸쳐 관찰된 세포 표면 이중특이적 결합 분자의 감소된 염색이 내재화와는 대조적으로 표면으로부터 이중특이적 결합 분자의 해리를 반영하는 것이 가능하다. 그러나, 시간에 걸쳐 가장 적은 신호 손실을 나타낸 이중특이적인 구축물 중 2가지인 구축물 3 및 9는 특징분석된 가장 약한 결합 구축물인 반면에 (도 11, 각각 패널 A 및 패널 B), 0 시간째에 매우 강한 결합을 나타낸 구축물 13의 결합 (도 11, 패널 C)은 4 시간째에 약하게 염색되었다 (초기 신호의 8%). 종합적으로, 이들 데이터는 SP34-기반 항-CD3 scFv 모이어티로 이루어진 특정한 구성이 OKT3-기반 scFv 모이어티로 이루어진 구성에 비해 더 적은 정도로 내재화될 수 있음을 시사한다.
실시예 5: 시험관내 항-ROR1/항-CD3 이중특이적 결합 분자의 재지정된 T 세포 독성
T-세포 매개된 세포독성 검정에서 항체 효능에 대한 다중 파라미터의 영향을 평가하기 위해 20가지 항-ROR1/항-CD3 이중특이적 결합 분자를 시험하였다. 시험한 변수에는 항-CD3 에피토프 및 결합가, 항-ROR1 친화도 및 결합가, 및 CD3 및 ROR1 결합 성분의 다양한 구성이 포함되었다.
구축물의 사멸 활성을 다양한 수준의 ROR1 발현을 갖는 혈액학적 및 고형 종양 암 세포의 패널에 대해 시험하였다. 이중특이적 결합 분자의 사멸 활성을 특징분석하는 것 외에도, T 세포의 활성화는 마커로서 CD69를 사용하여 평가하였다. 활성화된 T 세포에 의한 사이토킨 방출 또한 특징분석하였다.
물질 및 방법
인간 PBMC에 의한 세포독성 검정
세포독성 검정을 위해, 표적 세포를 RPMI (페놀 레드 없음), 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 10% FBS에서 4E5 세포/mL로 재현탁시켰다. 후속적으로, 2E4 세포/웰 (50 μL/웰)을 96-웰 플레이트로 옮기고, 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이터에 두었다. 둥근 바닥 플레이트는 현탁 세포를 위해 사용하였고, 편평 바닥 플레이트는 부착성 세포주를 위해 사용하였다. 인간 PBMC는 하기 기재된 바와 같이 단리되었다. PBMC를 2E6 세포/mL로 재현탁시키고, 후속적으로 표적 세포를 함유하는 웰에 2E5 세포/웰 (100 μL/웰)을 첨가하였다. 달리 나타내지 않는다면, 사용된 PBMC (이펙터 세포) 대 종양 세포 (표적)의 비는 10:1 (E:T 비)이었다. 표적 세포 및 PBMC를 혼합하고, 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이터에 두었다. 이중특이적 결합 분자를 배지에서 적절한 농도로 희석하고, 50 μL를 표적 세포 및 PBMC의 혼합물에 첨가한 다음, 37℃에서 24 시간 동안 인큐베이터에 두었다. 각각의 실험에 하기 대조군이 포함되었다: (1) 배지 단독 (배지), (2) 용해 완충제에 대해 조정된 배지 (Adj), (3) PBMC 단독 (PBMC), (4) LDH의 자발적인 방출을 위한 표적 세포 단독 (SR), (5) LDH의 최대 방출을 위한 표적 세포 단독 (MR), 및 (6) 이중특이적 결합 분자없이 표적 세포 및 PBMC (AICC).
PBMC의 단리
셉메이트(SepMate)-50 (스템셀 테크놀로지즈(StemCell Technologies)) 원뿔형 튜브의 하부 챔버를 15 mL의 피콜(Ficoll)로 채웠다. 확인되지 않은 정상 공여자로부터의 혈액을 헤파린 혈액 수집 튜브에 수집하고, 25℃에서 멸균성 PBS와 1:1 비로 혼합하였다. 희석된 혈액을 셉메이트-50 튜브의 상단 챔버 상에 쌓고, 브레이크를 이용하여 25℃에서 15 분 동안 1200 x g하에 원심분리하였다. PBMC (상단 챔버 내용물)를 수득하기 위해, 셉메이트-50 튜브를 50 mL 원뿔형 튜브로 신속히 뒤집었다. 이어서, 세포를 500 x g하에 3 분 동안 원심분리함으로써 PBS 중 저온 5% FBS로 3회 세척하였다. 최종적으로, 세포를 10 mL의 배지 (페놀 레드 무함유 RPMI, 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 10% FBS)에 재현탁시키고, 세포 카운트를 위해 분취물을 제거하였다. 이어서, 세포독성 검정을 플레이팅하기 위해 세포를 사용하였다.
LDH 방출의 정량화
24 시간 인큐베이션 후에 LDH 방출을 정량화하기 위해, 20 μL의 10X 용해 완충제를 Adj 및 MR 웰에 첨가하고, 각각의 웰의 내용물을 V-바닥 96 웰 플레이트로 옮기고, 500 x g하에 5 분 동안 회전시켰다. 후속적으로, 170 μL의 상청액을 후속적인 검정에 사용하기 위해 별도의 96 웰 플레이트로 옮겼다. 신선한 투명 바닥 96 웰 플레이트에서, 50 μL의 상청액을 50 μL의 사이토톡스(CytoTox) 96 비-방사성 세포독성 검정 (프로메가(Promega) cat. #G1780)과 합하고, 플레이트를 어두운 곳에서 25℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 최종적으로, 490 nm에서 흡광도를 판독하기 전에 50 μL의 정지 용액을 첨가하였다. % LDH 방출을 제조자의 지침에 따라 계산하였다.
T 세포 활성화의 평가
T 세포의 초기 활성화를 특징분석하기 위해 CD69의 상향조절을 이용하였다. 유세포 측정을 이용하여 CD69의 정량화를 수행하였다. 간략히, 펠렛화된 세포를 PBS 중 2% PFA 100 μL에 재현탁시키고 25℃에서 10 분 동안 인큐베이션함으로써 고정시켰다. 세포를 300 μL의 PBS로 2회 세척하고, 150 μL의 PBS에 재현탁시키고, 4℃에서 어두운 곳에서 사용할 때까지 보관하였다. 후속적으로, 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 100 μL의 염색 칵테일에 재현탁시키고, 4℃에서 20 분 동안 어두운 곳에서 인큐베이션하였다. 염색 칵테일은 PBS 중 퍼시픽 블루(Pacific Blue) 항-인간 CD8 클론 SK1 (바이오레전드(BioLegend) cat. #344717) 1:75 희석, PE/Cy7 항-인간 CD69 클론 FN50 (바이오레전드 cat. #310911) 1:500 희석, 및 알렉사플루오르647 마우스 항-인간 ROR1 클론 4A5 1:500 희석으로 이루어졌다. 이어서, 세포를 300 μL의 저온 PBS로 3회 세척하고, PBS 중 2% FBS 150 μL에 재현탁시켰다. 샘플을 밀테니 맥스퀀트 분석기 상에서 분석하였다.
재지정된 T-세포 검정에서 PBMC로부터 사이토킨 방출의 정량화
사이토킨 방출을 측정하기 위해, MSD® 브이-플렉스(V-PLEX) 사이토킨 패널 1 인간 키트를 사용하여 IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 및 TNF-α를 동시에 측정하였다. 검정을 제조자의 지침에 따라 수행하였다. 간략히, 브이-플렉스 사이토킨 패널 1 플레이트를 150 μL/웰의 세척 완충제 (0.05% 트윈-20을 갖는 PBS)로 3회 세척하였다. 다음으로, 웰당 50 μL의 희석된 샘플 및 캘리브레이터를 첨가하였다. 플레이트를 접착성 플레이트 밀봉재로 밀봉하고, 진탕기 상에서 4℃에서 밤새 500 rpm하에 인큐베이션하였다. 다음 날, 플레이트를 150 μL/웰의 세척 완충제로 3회 세척하고, 25 μL의 검출 항체 용액과 함께 진탕기 상에서 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충제로 3회 세척하였다. 마지막으로, MSD 장비를 사용하여 분석하기 전에 150 uL의 판독 완충제 T를 첨가하였다.
결과
ROR1-형질감염된 MEC 세포의 항원-의존성 사멸이 시험한 대부분의 이중특이적인 구축물에서 관찰되었지만, 상대 효능은 다양하였다. 대표적인 적정 프로파일이 도 14, 패널 A (구성 A, B 및 C을 갖는 구축물) 및 도 15, 패널 A (구성 A, B, C, D 및 E를 갖는 구축물)에 도시되어 있다. 구축물 2, 8 및 14의 적정 프로파일 (도시되지 않음)은 각각 구축물 1, 7 및 13의 적정 프로파일과 유사하였다.
예상되는 바와 같이, 상이한 PBMC 공여자를 사용하였을 때 이중특이적 결합 분자의 절대 효능은 어느 정도 다양하였다. 그럼에도 불구하고, 상이한 구축물의 상대 효능은 유의하게 변동하지 않았다. 예를 들어, 이중특이적 결합 분자 구축물 9는 일관되게 가장 활성인 것 중 하나였고, ROR1-형질감염된 MEC 표적 세포를 사용하여 한 공여자에서 <0.1 ng/mL (도 14, 패널 A) 및 두번째 공여자에서 1.1 ng/mL (도 15, 패널 A)의 EC50을 나타내었다.
구축물 1-3, 7-9, 및 13-15 모두 1 μg/mL에서 선택적인 사멸을 입증하였다 (구축물 1-3 및 7-9의 경우 5 nM, 구축물 13-15의 경우 8 nM (도 16, 흑색 막대). 사멸의 항원 의존성은 표적 세포를 함유하지 않거나 (도 16, "PBMC") 또는 항체를 함유하지 않는 (도 16, "biAb 없음") 샘플에서 또는 비-형질감염된 MEC 세포가 표적 세포로서 사용되었을 때 (도 16, 회색 막대) LDH 방출 결여에 의해 입증되었다. 대조적으로, 대조군 항-CD19/항-CD3 이중특이적 결합 분자 (크리에이티브 바이오랩스(Creative Biolabs) cat. #BSAB-L002)는 ROR1-형질감염된 및 비-형질감염된 MEC 세포 둘 다의 세포독성을 유도하였다 (도 16, "CD19 x CD3"). 이중특이적인 구축물 16-20은 이 실험에서 시험하지 않았다.
T 세포 활성화의 초기 마커인 CD69의 상향조절을 실험함으로써 배양물에서 T 세포의 활성화를 평가하였다. 세포독성 데이터와 일치하게, 활성화는 1 μg/mL에서 #17 및 #19를 제외한 모든 구축물에서 관찰되었다 (도 14, 패널 B; 도 15, 패널 B). 더욱 강력한 이중특이적 결합 분자의 경우, 더 낮은 농도에서 활성화가 관찰되었다 (도 14, 패널 B, 7 대 3의 비교; 도 15, 패널 B, 18 대 3의 비교).
증가된 CD69 발현에 의해 평가되는 바와 같이 T 세포 활성화는 일반적으로 이중특이적 결합 분자의 세포독성 활성을 반영하였다. 그러나, CD69 활성화가 세포독성과 직접적인 상관관계가 없는 예가 있었다 (도 19, 7 및 9의 비교; 도 20, 7 대 8 및 9의 비교).
T 세포의 활성화는 항원-의존적이었다 (도 17). ROR1-/CD19+ MEC 세포와 공동-배양한 T 세포는 대조군 CD19 x CD3 이중특이적 결합 분자의 존재하에 활성화되었지만 (도 17, 패널 A, 좌측), ROR1 이중특이적 결합 분자의 존재하에서는 그렇지 않았다 (도 17, 패널 A, 우측). 그러나, T 세포를 ROR1-형질감염된 MEC 세포 (ROR1+/CD19+)와 공동-배양하였을 때, T 세포는 ROR1 이중특이적 결합 분자의 존재하에 활성화되었다 (도 17, 패널 B, 우측). 이들 데이터는 ROR1이 이 연구에서 특징분석된 이중특이적인 구축물에 의한 T 세포 활성화를 위해 필요함을 입증한다.
다음으로, 이중특이적 결합 분자에 의한 상이한 인간 표적 세포의 ROR1-의존성 사멸을 실험하였다. 맨틀 세포 림프종 세포주인 JeKo-1 세포의 ROR1-의존성 사멸은 효능은 다양하지만 구성 A, B, C 및 E를 갖는 모든 이중특이적 결합 분자에서 관찰되었다. 대표적인 적정 프로파일은 도 18, 패널 A (구축물 1-15) 및 도 19, 패널 A (구축물 16-20)에 도시되어 있다. ROR1-형질감염된 MEC 세포에 의해 이루어진 관찰과 일치하게, T 세포의 활성화는 일반적으로 이중특이적 결합 분자의 상대적인 세포독성을 반영하였다 (도 18, 패널 B; 도 19, 패널 B).
두번째 맨틀 세포 림프종 세포주인 Mino 세포 또한 표적 세포주로서 시험하였다. 구성 B를 갖는 3가지 모든 비-디술피드 안정화된 구축물은 Mino 세포에 대해 강력한 활성을 나타내었으며 (도 20, 패널 A), SP34-기반 CD3 서열 (구축물 9)이 가장 강력하였다. 흥미롭게도, 구축물 9는 (CD69의 상향조절에 의해 결정되는 바와 같이) OKT3 기반 구축물에 비해 적게 T 세포를 활성화시켰다 (도 20, 패널 B).
마찬가지로, 유방 종양 세포주 MDA-MB-468의 ROR1-의존성 사멸은 이중특이적인 구성 A, B, C 및 E에서 다양한 효능으로 관찰되었다. 대표적인 적정 프로파일은 도 21, 패널 A (구축물 1-15) 및 도 22, 패널 A (구축물 16-20)에 도시되어 있다. ROR1-형질감염된 MEC 세포 및 JeKo-1 세포에 의해 이루어진 관찰과 일치하게, T 세포의 활성화는 일반적으로 이중특이적 결합 분자의 상대적인 세포독성을 반영하였다 (도 21, 패널 B; 도 22, 패널 B).
JeKo-1 세포, ROR1-형질감염된 MEC 세포, 및 모의-형질감염된 (ROR1-) MEC 세포의 재지정된 사멸에서 T 세포의 활성화 후 사이토킨 방출의 유도를 특징분석하였다. 구축물 7, 9, 18, 20 및 대조군 ROR1 x CD3 이중특이적 결합 분자에 대한 대표적인 용량-반응 그래프가 도시된다 (미국 특허 공보 2017/0233472). (도 23 (TNF-α), 도 24 (IFN-γ), 도 25 (IL-2), 도 26 (IL-4), 도 27 (IL-6), 도 28 (IL-10)). 용량-의존적인 사이토킨 생성 (TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6 및 IL-10)이 시험한 모든 구축물에 대해 JeKo-1 세포 (패널 A) 및 ROR1-형질감염된 MEC 세포 (패널 B)에서 관찰되었지만, 모의-형질감염된 (ROR1-) MEC 세포 (패널 C)에서는 관찰되지 않았다. ROR1-형질감염된 MEC 세포는 JeKo-1 세포에 비해 더 높은 수준의 ROR1을 발현하고 (표 5), JeKo-1 세포에 비해 시험한 이중특이적 결합 분자에 대해 더 민감하였으며, 이는 표적 발현 수준의 중요성을 입증한다. 사이토킨의 분비는 ROR1 발현에 의존적이다. 1 μg/mL의 구축물과 모의-형질감염된 (ROR1-) MEC 세포의 인큐베이션 (패널 C)은 백그라운드 (이중특이적인 항체 없음 대조군)보다 유의하게 높은 수준에서 사이토킨 분비를 전혀 유도하지 않았다. 대조적으로, ROR1 x CD3 이중특이적 결합 분자 ("대조군 1")와 모의-형질감염된 (ROR1-) MEC 세포의 인큐베이션은 염증성 사이토킨 IFN-γ의 일부 분비를 유발하였다 (도 24, 패널 C). IL-6을 제외하고, 대조군 1은 JeKo-1 세포에서 시험할 때 더 높은 전반적인 수준의 사이토킨 분비를 유도하였다. 대조적으로, 대조군 1을 비롯한 모든 구축물은 더 높은 ROR1-발현 형질감염된 MEC 세포에서 시험할 때 유사한 수준의 사이토킨 분비를 유도하였다.
다양한 표적 세포에 대한 일부 이중특이적 결합 분자의 활성의 요약이 표 5에 제시되어 있다.
표 5. 이중특이적인 구축물에서 시험한 세포주의 요약
종합적으로, 다양한 성질 및 구성을 갖는 항-ROR1/항-CD3 이중특이적 결합 분자에 의한 다양한 표적 세포주의 재지정된 T-세포 사멸의 특정한 경향을 확인하였다.
이펙터 세포로서 인간 PBMC 및 다양한 표적 세포주를 사용하는 시험관내 세포독성 검정을 기반으로 하여, 구성 B, E 및 C는 구성 A 및 D에 비해 더 강력한 경향을 나타내었다. 구성을 기반으로 하는 상대 효능은 CD3 및 ROR1 결합 아암의 상대적인 공간 배치를 반영할 수 있다. 효능은 또한 다양한 구성이 이중특이적 결합 분자의 수송에 미치는 영향을 반영할 수 있다. 예를 들어, 구성 B 및 C의 이중특이적 결합 분자는 구성 A의 이중특이적 결합 분자만큼 신속히 또는 그와 동일한 정도로 내재화되지 않은다.
OKT3-기반 서열이 SP34-기반 서열에 비해 CD3에 대해 더 높은 친화도를 갖는 것으로 보였지만, 2가 SP34-기반 서열을 갖는 이중특이적 결합 분자는 종종 더 강력하였다. 증강된 활성은 친화도, 또는 추가로 또는 대안적으로 SP34에 의해 인식되는 별개의 에피토프를 반영할 수 있다. 흥미롭게도, 1가 CD3 결합을 갖는 이중특이적 결합 분자를 평가했을 때에는, 경향이 상이하였다. 일부 경우에, OKT3-기반 서열은 SP34-기반 서열보다 더 강력하였다 (도 14, 구축물 13 및 15의 비교).
표적 세포 ROR1 발현 수준과 세포독성 사이에는 직접적인 상관관계가 관찰되지 않았다 (표 5). 그럼에도 불구하고, 항-ROR1 항체의 더 높은 친화도 변이체는 모 WT 서열에 비해 더욱 강력하였다. 이는 ROR1 발현 수준이 더 낮은 상황에서 중요성이 증가할 수 있다.
이들 실험 결과는, CD3 및 ROR1 결합 성분이 별도로 최적화되고 특징분석될 수 있더라도, 가장 활성인 이중특이적 결합 분자가 상이한 이중특이적인 구성을 이용하는 결합 성분의 상이한 쌍의 실험적 시험을 통해서만 확인될 수 있음을 나타낸다. 상기 실험은 구축물 9 및 18 (구성 B)이 일관되게 가장 강력한 항-ROR1/항-CD3 이중특이적 결합 분자였음을 입증한다. CD3 결합 실험은 이들 구축물이 ROR1의 부재하에 Jurkat 세포에 대해 가장 약한 결합체였음을 입증하였기 때문에 이는 특히 주목할만 하다. ROR1이 종양 미세환경에 관여할 때까지 T 세포 상의 CD3의 활성화 및 내재화가 최소일 것이므로, 이는 유용한 특징인 것으로 예상된다.
표 6. 항원-결합 도메인
SEQUENCE LISTING
<110> VELOSBIO INC.
<120> ANTI-ROR1/ANTI-CD3 BISPECIFIC BINDING MOLECULES
<130> 024651.WO004
<140>
<141>
<150> 62/852,039
<151> 2019-05-23
<160> 114
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 701
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ala Tyr
20 25 30
Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ser Phe Asp Pro Tyr Asp Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val
65 70 75 80
Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Trp Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly His Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
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<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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caggttcagc tgcaagagtc tggccctggc ctggtcaagc ctagccaaac actgagcctg 60
acctgtaccg tgtccggcta cgccttcacc gcctacaata tccactgggt ccgacaggcc 120
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ggccccagcg tgttccctct ggctcctagc agcaagtcta caagcggagg aacagccgct 420
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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polynucleotide"
<400> 33
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<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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polynucleotide"
<400> 34
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<400> 37
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<211> 2133
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 38
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tcttgtgccg ccagcggctt caccttcaac acctacgcca tgaactgggt ccgacaggcc 120
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ggaggaacag ccgctctggg ctgtctggtc aaggactact ttcccgagcc agtgaccgtg 1260
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agattttccg gcagcggcta cggcaccgat ttcaccctga ccatcaacaa catcgagagc 240
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ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaaa gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600
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<210> 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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atcagctgta gagccagcaa gagcatcagc aagtacctgg cctggtatca gcagaagcct 120
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cccagagaag ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caatagccaa 480
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<213> Artificial Sequence
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<400> 41
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<213> Artificial Sequence
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<400> 45
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<211> 1437
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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polynucleotide"
<400> 46
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<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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peptide"
<400> 47
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1 5 10
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
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Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
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Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
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Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
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Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ala Tyr
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260 265 270
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275 280 285
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Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
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Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
130 135 140
Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly
145 150 155 160
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr
165 170 175
Tyr Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Ser Asp Asn
180 185 190
Ala Lys Asp Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
195 200 205
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Ala Ala
210 215 220
Leu Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
225 230 235 240
Ser Thr Lys Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu
245 250 255
Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265 270
<210> 113
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide"
<400> 113
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 114
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(20)
<223> /note="This sequence may encompass 1-4 'Gly Gly Gly Gly Ser'
repeating units"
<400> 114
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
Claims (45)
- 인간 ROR1의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인 및 인간 CD3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 이중특이적 결합 분자.
- 제1항에 있어서, 제1 항원-결합 도메인이 인간 ROR1에 결합하기 위해 서열식별번호: 82에 제시된 중쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호: 83에 제시된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체와 경쟁하거나, 또는 그와 동일한 인간 ROR1 에피토프에 결합하는 것인 이중특이적 결합 분자.
- 제1항에 있어서, 제1 항원-결합 도메인이 하기를 포함하는 것인 이중특이적 결합 분자:
a) 각각 서열식별번호: 97, 61, 62, 63, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 (H)-CDR1-3 및 경쇄 (L)-CDR1-3;
b) 각각 서열식별번호: 60, 61, 62, 63, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3;
c) 서열식별번호: 72와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열식별번호: 73과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL);
d) 서열식별번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
e) 서열식별번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
f) 서열식별번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 (HC) 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 (LC);
g) 서열식별번호: 82의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC;
h) 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC; 또는
i) 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원-결합 도메인이 인간 CD3에 결합하기 위해 하기를 포함하는 항체와 경쟁하거나, 또는 그와 동일한 인간 CD3 에피토프에 결합하는 것인 이중특이적 결합 분자:
a) 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열식별번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL);
b) 서열식별번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
c) 서열식별번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 VL. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원-결합 도메인이 하기를 포함하는 것인 이중특이적 결합 분자:
a) 각각 서열식별번호: 54, 55, 56, 57, 58, 및 59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 (H)-CDR1-3 및 경쇄 (L)-CDR1-3;
b) 각각 서열식별번호: 47, 48, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3;
c) 각각 서열식별번호: 47, 53, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3;
d) 서열식별번호: 70과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열식별번호: 71과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL);
e) 서열식별번호: 66과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 67과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
f) 서열식별번호: 68과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 69와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL;
g) 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
h) 서열식별번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
i) 서열식별번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
j) 서열식별번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
k) 서열식별번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
l) 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 VL. - 제1항에 있어서, 하기를 포함하는 이중특이적 결합 분자:
a) 각각 서열식별번호: 97, 61, 62, 63, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 (H)-CDR1-3 및 경쇄 (L)-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 54, 55, 56, 57, 58, 및 59의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
b) 각각 서열식별번호: 60, 61, 62, 63, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 54, 55, 56, 57, 58, 및 59의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
c) 각각 서열식별번호: 60, 61, 62, 63, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 47, 53, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
d) 각각 서열식별번호: 97, 61, 62, 63, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 47, 48, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
e) 각각 서열식별번호: 97, 61, 62, 63, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 47, 53, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인; 또는
f) 각각 서열식별번호: 60, 61, 62, 63, 64, 및 65의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 47, 48, 49, 50, 51, 및 52의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1-3 및 L-CDR1-3을 포함하는 제2 항원-결합 도메인. - 제1항에 있어서, 하기를 포함하는 이중특이적 결합 분자:
a) 각각 서열식별번호: 74 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
b) 각각 서열식별번호: 72 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
c) 각각 서열식별번호: 72 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
d) 각각 서열식별번호: 74 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
e) 각각 서열식별번호: 74 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인; 또는
f) 각각 서열식별번호: 72 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인. - 제1항에 있어서, 하기를 포함하는 이중특이적 결합 분자:
a) 각각 서열식별번호: 74 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
b) 각각 서열식별번호: 72 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
c) 각각 서열식별번호: 72 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
d) 각각 서열식별번호: 74 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
e) 각각 서열식별번호: 74 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인; 또는
f) 각각 서열식별번호: 72 및 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인. - 제1항에 있어서, 하기를 포함하는 이중특이적 결합 분자:
a) 각각 서열식별번호: 84 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
b) 각각 서열식별번호: 82 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
c) 각각 서열식별번호: 82 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
d) 각각 서열식별번호: 84 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
e) 각각 서열식별번호: 84 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
f) 각각 서열식별번호: 82 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
g) 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 107 또는 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
h) 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 106 또는 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 70 및 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
i) 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 106 또는 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
j) 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 107 또는 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
k) 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 107 또는 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 68 및 69의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인; 또는
l) 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 106 또는 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 66 및 67의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인. - 제1항에 있어서, 하기를 포함하는 이중특이적 결합 분자:
a) 각각 서열식별번호: 84 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
b) 각각 서열식별번호: 82 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
c) 각각 서열식별번호: 82 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
d) 각각 서열식별번호: 84 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
e) 각각 서열식별번호: 84 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
f) 각각 서열식별번호: 82 및 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC 및 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
g) 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 107 또는 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
h) 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 106 또는 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 80 및 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
i) 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 106 또는 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
j) 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 107 또는 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인;
k) 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 107 또는 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 78 및 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인; 또는
l) 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 서열식별번호: 106 또는 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC, 및 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 제1 항원-결합 도메인, 및 각각 서열식별번호: 76 및 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 제2 항원-결합 도메인. - 서열식별번호: 14 및 19의 아미노산 서열을 포함하는, 인간 ROR1 및 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 결합 분자.
- 서열식별번호: 7 및 19의 아미노산 서열을 포함하는, 인간 ROR1 및 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 결합 분자.
- 서열식별번호: 7 및 18의 아미노산 서열을 포함하는, 인간 ROR1 및 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 결합 분자.
- 서열식별번호: 7 및 23의 아미노산 서열을 포함하는, 인간 ROR1 및 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 결합 분자.
- 하기를 포함하는, 인간 ROR1 및 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 결합 분자:
a) 서열식별번호: 1 및 16의 아미노산 서열;
b) 서열식별번호: 2 및 16의 아미노산 서열;
c) 서열식별번호: 3 및 16의 아미노산 서열;
d) 서열식별번호: 4 및 16의 아미노산 서열;
e) 서열식별번호: 5 및 16의 아미노산 서열;
f) 서열식별번호: 6 및 16의 아미노산 서열;
g) 서열식별번호: 7 및 17의 아미노산 서열;
h) 서열식별번호: 7 및 20의 아미노산 서열;
i) 서열식별번호: 7 및 21의 아미노산 서열;
j) 서열식별번호: 7 및 22의 아미노산 서열;
k) 서열식별번호: 8, 9, 및 16의 아미노산 서열;
l) 서열식별번호: 8, 10, 및 16의 아미노산 서열;
m) 서열식별번호: 8, 11, 및 16의 아미노산 서열;
n) 서열식별번호: 12, 11, 및 16의 아미노산 서열;
o) 서열식별번호: 12, 13, 및 16의 아미노산 서열; 또는
p) 서열식별번호: 8, 15, 및 16의 아미노산 서열. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
a) 제1 항원-결합 도메인이 2의 결합가를 갖고, 제2 항원-결합 도메인이 2의 결합가를 갖거나;
b) 제1 항원-결합 도메인이 1의 결합가를 갖고, 제2 항원-결합 도메인이 1의 결합가를 갖거나; 또는
c) 제1 항원-결합 도메인이 2의 결합가를 갖고, 제2 항원-결합 도메인이 1의 결합가를 갖는 것인 이중특이적 결합 분자. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 이중특이적 결합 분자.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 치환 L234A, L235A, 및 G237A를 함유하는 인간 IgG1 불변 영역을 포함하며, 잔기가 EU 시스템에 따라 넘버링되는 것인 이중특이적 결합 분자.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원-결합 도메인이 scFv인 이중특이적 결합 분자.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원-결합 도메인의 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열이 펩티드 링커를 통해 제1 항원-결합 도메인의 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열에 융합된 것인 이중특이적 결합 분자.
- 제20항에 있어서, 제2 항원-결합 도메인의 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열과 제1 항원-결합 도메인의 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열 사이의 펩티드 링커가 GGGGSGGGGS의 아미노산 서열 (서열식별번호: 93)을 갖는 것인 이중특이적 결합 분자.
- 제20항 또는 제21항에 있어서, 제2 항원-결합 도메인이 하기에 융합된 것인 이중특이적 결합 분자:
a) 제1 항원-결합 도메인의 경쇄의 카르복시-말단; 또는
b) 제1 항원-결합 도메인의 경쇄의 아미노-말단. - 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 성질 중 적어도 하나를 갖는 이중특이적 결합 분자:
a) ELISA에 의해 결정되는 바와 같이 0.5 nM 이하의 고정된 ROR1에 대한 KD를 갖는 것;
b) ELISA에 의해 결정되는 바와 같이 0.4 nM 이하의 가용성 b-ROR1에 대한 KD를 갖는 것;
c) 각각 서열식별번호: 82 및 83의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체와 비교하여 ROR1-형질감염된 MEC 세포 및/또는 Jurkat 세포에서 감소된 내재화를 입증하는 것;
d) 1 μg/mL 이하에서 PBMC-노출된 ROR1-형질감염된 MEC 세포에서 LDH 방출을 유도하는 것;
e) 1 μg/mL 이하에서 PBMC-노출된 JeKo-1 세포에서 LDH 방출을 유도하는 것;
f) 1 μg/mL 이하에서 PBMC-노출된 Mino 세포에서 LDH 방출을 유도하는 것;
g) 1 μg/mL 이하에서 PBMC-노출된 MDA-MB-468 세포에서 LDH 방출을 유도하는 것;
h) 유세포 측정에 의해 결정되는 바와 같이 1 μg/mL 이하에서 ROR1-형질감염된 MEC 세포와 공동-배양한 T 세포의 표면 상에서 CD69를 상향조절하는 것;
i) 유세포 측정에 의해 결정되는 바와 같이 1 μg/mL 이하에서 JeKo-1 세포와 공동-배양한 T 세포의 표면 상에서 CD69를 상향조절하는 것;
j) 유세포 측정에 의해 결정되는 바와 같이 1 μg/mL 이하에서 Mino 세포와 공동-배양한 T 세포의 표면 상에서 CD69를 상향조절하는 것;
k) 유세포 측정에 의해 결정되는 바와 같이 1 μg/mL 이하에서 MDA-MB-468 세포와 공동-배양한 T 세포의 표면 상에서 CD69를 상향조절하는 것; 및
l) 1 μg/mL 이하에서 Jeko-1 또는 ROR1-형질감염된 MEC 세포와 공동-배양한 T 세포로부터 IFN-γ, TNF-α, IL-10, IL-6, IL-4, 및 IL-2의 방출을 유도하는 것. - 세포독성제에 접합된 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 이중특이적 결합 분자를 포함하는 면역접합체.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 이중특이적 결합 분자 및 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는 제약 조성물.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 이중특이적 결합 분자의 제1 항원-결합 도메인의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 (VH 및 VL)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2 항원-결합 도메인의 VH 및 VL을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 단리된 핵산 분자(들).
- 제26항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 핵산 분자(들):
a) 서열식별번호: 37 및 42의 뉴클레오티드 서열;
b) 서열식별번호: 30 및 42의 뉴클레오티드 서열;
c) 서열식별번호: 30 및 41의 뉴클레오티드 서열;
d) 서열식별번호: 30 및 46의 뉴클레오티드 서열;
e) 서열식별번호: 24 및 39의 뉴클레오티드 서열;
f) 서열식별번호: 25 및 39의 뉴클레오티드 서열;
g) 서열식별번호: 26 및 39의 뉴클레오티드 서열;
h) 서열식별번호: 27 및 39의 뉴클레오티드 서열;
i) 서열식별번호: 28 및 39의 뉴클레오티드 서열;
j) 서열식별번호: 29 및 39의 뉴클레오티드 서열;
k) 서열식별번호: 30 및 40의 뉴클레오티드 서열;
l) 서열식별번호: 30 및 43의 뉴클레오티드 서열;
m) 서열식별번호: 30 및 44의 뉴클레오티드 서열;
n) 서열식별번호: 30 및 45의 뉴클레오티드 서열;
o) 서열식별번호: 31, 32, 및 39의 뉴클레오티드 서열;
p) 서열식별번호: 31, 33 및 39의 뉴클레오티드 서열;
q) 서열식별번호: 31, 34, 및 39의 뉴클레오티드 서열;
r) 서열식별번호: 35, 34, 및 39의 뉴클레오티드 서열;
s) 서열식별번호: 35, 36, 및 39의 뉴클레오티드 서열; 또는
t) 서열식별번호: 31, 38, 및 39의 뉴클레오티드 서열. - 제26항 또는 제27항의 단리된 핵산 분자(들)를 포함하는 벡터.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 이중특이적 결합 분자의 제1 항원-결합 도메인의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 (VH 및 VL)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2 항원-결합 도메인의 VH 및 VL을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 숙주 세포.
- 제29항에 있어서, 상기 숙주 세포가 하기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 숙주 세포:
a) 서열식별번호: 37 및 42;
b) 서열식별번호: 30 및 42;
c) 서열식별번호: 30 및 41;
d) 서열식별번호: 30 및 46;
e) 서열식별번호: 24 및 39;
f) 서열식별번호: 25 및 39;
g) 서열식별번호: 26 및 39;
h) 서열식별번호: 27 및 39;
i) 서열식별번호: 28 및 39;
j) 서열식별번호: 29 및 39;
k) 서열식별번호: 30 및 40;
l) 서열식별번호: 30 및 43;
m) 서열식별번호: 30 및 44;
n) 서열식별번호: 30 및 45;
o) 서열식별번호: 31, 32, 및 39;
p) 서열식별번호: 31, 33 및 39;
q) 서열식별번호: 31, 34, 및 39;
r) 서열식별번호: 35, 34, 및 39;
s) 서열식별번호: 35, 36, 및 39; 또는
t) 서열식별번호: 31, 38, 및 39. - 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 이중특이적 결합 분자를 제조하는 방법이며,
제29항 또는 제30항의 숙주 세포를 제공하고,
이중특이적 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에 상기 숙주 세포를 배양하고,
생성된 이중특이적 결합 분자를 단리하는 것을 포함하는 방법. - 환자에게 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 이중특이적 결합 분자를 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법.
- 환자에서 암을 치료하기 위한 의약을 제조하기 위한 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 이중특이적 결합 분자의 용도.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에서 암을 치료하는데 사용하기 위한 이중특이적 결합 분자.
- 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 ROR1-양성 암인 방법, 용도, 또는 이중특이적 결합 분자.
- 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 백혈병, 림프종, 또는 고형 종양인 방법, 용도, 또는 이중특이적 결합 분자.
- 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, T-세포 백혈병, 맨틀 세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 여포성 림프종, 버킷 림프종, T 세포 비-호지킨 림프종, 림프형질세포양 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 다발성 골수종, 변연부 림프종, 소형 림프구성 림프종, 또는 리히터 형질전환을 거친 비-호지킨 림프종인 방법, 용도, 또는 이중특이적 결합 분자.
- 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 결장암, 비-소세포 폐암, 교모세포종, 간세포 암종, 췌장암, 유잉 육종, 골육종, 두경부암, 난소암, 유방암, 또는 삼중 음성 유방암인 방법, 용도, 또는 이중특이적 결합 분자.
- 제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 추가의 치료제로 치료되는 것인 방법, 용도, 또는 이중특이적 결합 분자.
- 제39항에 있어서, 추가의 치료제가 브루톤 티로신 키나제 (BTK) 억제제, B-세포 림프종 2 (Bcl-2) 억제제, 라파마이신의 포유동물 표적 (mTOR) 억제제, 및 포스포이노시티드 3-키나제 (PI3K) 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법, 용도, 또는 이중특이적 결합 분자.
- 제39항에 있어서, 추가의 치료제가 이브루티닙, 아칼라브루티닙, 베네토클락스, 에베롤리무스, 사파니세르팁, 및 이델랄리십으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법, 용도, 또는 이중특이적 결합 분자.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 이중특이적 결합 분자를 포함하는 키트.
- 제42항에 있어서, 제32항 및 제35항 내지 제41항 중 어느 한 항의 방법에 따라 암 치료에 사용하기 위한 키트.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 이중특이적 결합 분자를 포함하는, 환자에서 암 치료에 적합한 제조 물품.
- 제44항에 있어서, 암 치료가 제32항 및 제35항 내지 제41항 중 어느 한 항의 방법에 따른 것인 제조 물품.
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