ES2728926T3 - Hialurosomas, su uso en composiciones cosméticas o farmacéuticas tópicas y su proceso de preparación - Google Patents

Abstract

Un proceso para la preparación de vesículas similares a liposomas nanométricas (hialurosomas) para aplicación farmacéutica o cosmética tópica que comprende a) hialuronato, preferiblemente hialuronato de sodio, b) al menos un fosfolípido y c) al menos un ingrediente farmacéutico o cosmético activo, en el que dicho al menos un fosfolípido forma una doble capa y dicho hialuronato está dispuesto dentro de la propia doble capa, comprendiendo dicho proceso las siguientes etapas: a) preparar una solución o dispersión acuosa de al menos un ingrediente farmacéutico o cosmético activo en una solución acuosa de hialuronato; b) mezclar la solución o dispersión de la etapa a) con al menos un fosfolípido hasta la hidratación de al menos un fosfolípido y la formación de un sistema coloidal que comprende las vesículas, en las que el proceso no comprende el uso de un solvente orgánico y en donde ambas etapas a) y la etapa b) se llevan a cabo a temperaturas inferiores a 30ºC, preferiblemente de 20 a 28ºC, incluso más preferiblemente a aproximadamente 25ºC.

Description

DESCRIPCIÓN

Hialurosomas, su uso en composiciones cosméticas o farmacéuticas tópicas y su proceso de preparación

Esta invención se refiere a los hialurosomas, su uso en composiciones cosméticas o farmacéuticas tópicas y su proceso de preparación. Más específicamente, esta invención se refiere a vesículas nanométricas similares a los liposomas (hialurosomas) que comprenden moléculas de hialuronato, moléculas de fosfolípidos y al menos un ingrediente activo farmacéutico o cosmético. La invención también se refiere al uso de hialurosomas en composiciones cosméticas o farmacéuticas tópicas y a su proceso de preparación.

Tradicionalmente, la aplicación de fármacos en la piel tiene como objetivo obtener un efecto suavizante o protector, o introducir ingredientes activos en las capas superiores de la piel. La moderna tecnología farmacéutica reevalúa la administración cutánea de medicamentos para alcanzar un efecto sistémico o dirigido a los tejidos profundos subyacentes, a través del desarrollo de un diseño de formulación preciso. De hecho, el uso de una formulación adecuada puede mejorar el desempeño biofarmacéutico de ciertos medicamentos y/o sustancias cosméticas activas y simplificar el cumplimiento por parte del paciente. Este método de aplicación ha sido descuidado durante mucho tiempo debido a la dificultad objetiva que encuentran los ingredientes activos al filtrarse en la piel para alcanzar los tejidos subyacentes o la circulación sistémica.

Actualmente, una de las estrategias más utilizadas para mejorar la acumulación de fármaco en los tejidos debajo de la piel es usar portadores nanovesiculares, tal como liposomas y estructuras similares a liposomas derivadas conceptualmente de ellos, pero con características funcionales y/o de desempeño que son mejores que el sistema original, particularmente cuando se trata del suministro a la piel. Entre las nanovesículas lamelares más utilizadas se encuentran los niosomas, los etiosomas, los transferosomas y los glicerosomas. Estos sistemas son realmente capaces de prolongar la permanencia de los ingredientes activos en la piel, aumentar la biodisponibilidad y reducir la toxicidad local y sistémica. Estas vesículas, especialmente los transferosomas, no son solo excipientes que simplemente facilitan el paso del medicamento a la piel, interactuando con los lípidos del estrato córneo, sino que son "sistemas de administración" reales capaces de transportar el medicamento a través del estrato córneo y la epidermis, todo el camino hasta la dermis. En los sistemas mencionados anteriormente, que representan la última evolución de los sistemas similares a liposomas destinados a la administración tópica, se puede señalar que la mejora de características tales como la flexibilidad, la capacidad de carga y la estabilidad nunca es sinérgica, lo que resulta solo en un aspecto unilateral y mejora parcial del desempeño global.

Por lo tanto, está claro que es necesario tener nuevos sistemas de administración tópica que superen los inconvenientes de los sistemas conocidos.

Según esta invención, ahora pueden obtenerse nanobiovesículas que tienen mejores capacidades de carga que los sistemas vesiculares conocidos y una mayor capacidad para "retener" el ingrediente activo encapsulado por más tiempo dentro de la estructura vesicular, en comparación con los otros sistemas vesiculares conocidos mencionados anteriormente. Las vesículas en esta invención tienen una capacidad superior de "carga y retención", tanto cuando se trata de fármacos hidrófilos como lipófilos. Estas características se reflejan naturalmente en el desempeño de las vesículas en la piel. De hecho, como se observa en experimentos "in vitro", pueden aumentar la acumulación de ingrediente activo que se lleva a la piel in vitro y, como consecuencia, como lo demuestran las pruebas "in vivo", aumentan la eficacia biológica terapéutica o pseudoterapéutica. La eficacia mejorada de la actividad terapéutica o biológica in vivo está claramente relacionada con la mayor capacidad de "carga y retención" de la molécula activa en las vesículas, junto con la capacidad inherente y mayor de los hialurosomas como suministro a la piel, debido a la acción sinérgica del hialuronato de sodio y moléculas de fosfolípidos. De hecho, el hialuronato se comporta como un promotor de la absorción y como un promotor de la solvatación, y las moléculas de fosfolípidos como vehículos.

Las nanovesículas de la invención se caracterizan por un sistema interlamelar formado por moléculas de hialuronato y fosfolípido. Más específicamente, las nanovesículas de esta invención no tienen moléculas de hialuronato en la superficie solamente, es decir, no son liposomas recubiertos en la superficie con moléculas de hialuronato, tal como ciertos liposomas conocidos (patente de Estados Unidos US6890901 depositada por Marriot et al.), pero consisten en un sistema interlamelar donde las moléculas de ácido hialurónico también están dentro de la bicapa de fosfolípidos (doble capa) de estas nanovesículas. Como tales, las nanovesículas de esta invención son sistemas interlamelares híbridos de moléculas de hialuronato y fosfolípido similares a los liposomas, que pueden denominarse hialurosomas. Las nanovesículas de esta invención también contienen un ingrediente activo que se incorpora en este sistema interlamelar. La estructura de los hialurosomas de acuerdo con esta invención es el resultado de un nuevo método de preparación que, a diferencia de los métodos conocidos para la preparación de liposomas, permite que las cadenas de hialuronato interactúen con las porciones de fosfolípido que son más afines en el disolvente acuoso, creando así una especie de interacción que se mantiene en la estructuración vesicular y crea una mayor capacidad de solvatación que resulta útil cuando se introducen ingredientes activos insolubles en medios acuosos.

Los métodos conocidos para la preparación de liposomas, de hecho, incluyen la solubilización de fosfolípidos en disolventes orgánicos que posteriormente se hacen evaporar (US2008145415; CN103520007). El resultado de estos métodos conocidos es una película lipídica, a partir de la cual la hidratación posterior da origen a las bicapas de fosfolípidos que conducen a la formación de liposomas. De nuevo, según los métodos conocidos mencionados anteriormente, se añaden soluciones de ácido hialurónico después de la formación de la película lipídica. El ácido hialurónico, por lo tanto, no participa en la formación de la estructura interlamelar con las vesículas de fosfolípido, sino que puede moverse solo de forma superficial o hacia el núcleo hidrófilo de los liposomas. A la luz de lo anterior, los métodos conocidos no se refieren a la preparación de hialurosomas.

El documento FR2939317 divulga composiciones cosméticas tópicas que comprenden niosomas o liposomas con bicapas lipídicas, que comprenden ácido hialurónico dentro de las vesículas. Los liposomas se pueden preparar introduciendo la mezcla de lípidos bajo agitación en una solución acuosa que comprende ácido hialurónico a temperatura elevada. El documento CN103520007 divulga liposomas que contienen ácido hialurónico y que se preparan mediante el método de película lipídica, en el que se añade una solución de ácido hialurónico a la película lipídica que se prepara previamente mezclando el fosfolípido y el disolvente orgánico.

La estructura híbrida interlamelar de los hialurosomas, según esta invención, se prepara mediante un proceso en el que se utiliza una dispersión acuosa del ingrediente activo y hialuronato para hidratar las moléculas de fosfolípido a una temperatura ambiente de aproximadamente 20-28°C, y en ausencia de disolventes orgánicos. Por lo tanto, gracias al proceso de esta invención, el hialuronato puede interactuar con las porciones de fosfolípidos más afines en medios acuosos, creando así un tipo de interacción que se mantiene en la estructura vesicular y, por lo tanto, se convierte en parte integral de la estructura de las nanovesículas, y no solo una superficie de recubrimiento de las vesículas. La estructura de los hialurosomas en esta invención permite obtener las siguientes ventajas:

- mayor solvatación del agente encapsulado, lo que desencadena un efecto sobre la cinética de disolución y, en consecuencia, una mayor capacidad del ingrediente activo (especialmente si es poco soluble o insoluble) para ingresar a la solución en líquidos biológicos;

- mayor capacidad de carga y estabilidad vesicular en comparación con los sistemas vesiculares o liposómicos conocidos que se mezclan con ácido hialurónico después de formar el liposoma (patente de estados Unidos US6890901 depositada por Marriot et al.);

- mayor capacidad para retener el ingrediente activo por más tiempo, incluso cuando los ingredientes son sustancias hidrofílicas, ya que estos se capturan previamente en el vehículo estructurado formado por el hialuronato de sodio en agua, que luego se enlaza con los fosfolípidos y permanece anclado a ellos;

- mayor capacidad de "mejora de la piel" en comparación con otros sistemas de administración tópica de naturaleza vesicular, debido a la acción sinérgica del hialuronato de sodio con vesículas de fosfolípido.

El objeto específico de esta invención, por lo tanto, incluye el proceso como se define en la reivindicación 1. El objeto de la presente invención también incluye vesículas de tipo liposoma (hialurosomas) para aplicación farmacéutica o cosmética tópica, que se puede obtener mediante el proceso divulgado en esta invención y que comprende: a) hialuronato, preferiblemente hialuronato de sodio, b) al menos un fosfolípido y c) al menos un ingrediente farmacéutico o cosmético activo, en el que dicho al menos un fosfolípido forma una doble capa en la que se dispone dicho hialuronato, como se define en la reivindicación 9. Además, el hialuronato también se encuentra en el núcleo acuoso y en la superficie externa de las vesículas, además del interior de la doble capa.

La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas o cosméticas para uso tópico que comprenden dichas vesículas, a dichas vesículas o composiciones para uso en el tratamiento médico de trastornos de la piel, y al uso no médico de dichas vesículas o composiciones en el tratamiento cosmético de trastornos de la piel.

Una aplicación farmacéutica o cosmética tópica significa que las vesículas de la invención están destinadas a aplicaciones tópicas en la industria farmacéutica, cosmética y de dispositivos médicos. Las vesículas de esta invención son específicas para la aplicación farmacéutica o cosmética tópica, en particular para la aplicación tanto en la piel sana como en la lesionada, y en las membranas mucosas.

Las moléculas de hialuronato, por ejemplo, son moléculas como el hialuronato de sodio u otras sales de ácido hialurónico que son solubles en agua, en las que el ácido hialurónico tiene un peso molecular de 0,05 a 10 KDa, preferiblemente de 0,2 a 5 KDa, y más preferiblemente de 0,4 a 2 kDa.

Además, estas vesículas no contienen disolventes orgánicos tales como cloroformo, diclorometano y etanol.

Los fosfolípidos que se pueden usar de acuerdo con esta invención, por ejemplo, incluyen uno o más fosfolípidos naturales o sintéticos, puros o mixtos, como lecitina de soja o huevo, fosfatidilcolina hidrogenada o no hidrogenada en diversos grados de pureza, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) diestearoilfosfatidilcolina, palmitoilestearoilfosfatidilcolina, esfingomielina, mezclas de fosfolípidos, hidrogenados y no hidrogenados derivados habas de soja, preferiblemente fosfatidilcolina de habas de soja hidrogenada y no hidrogenada.

Las características esenciales de los fosfolípidos seleccionados para la preparación de hialurosomas son la capacidad para formar vesículas lamelares, la alta biocompatibilidad, la baja degradación metabólica y la ausencia de toxicidad.

Las nanobiovesículas (hialurosomas) de esta invención son muy versátiles y se pueden usar como vehículos de agentes activos hidrófilos, lipófilos y anfifílicos. El primero se disolverá completamente dentro de las cavidades acuosas de las vesículas, es decir, el núcleo central y las capas delgadas acuosas entre las capas dobles, junto con el polímero de hialuronato, que por lo tanto es capaz de capturar y retener mejor las moléculas hidrófilas que permanecen atrapadas en medio de sus cadenas. Por esta razón, estas vesículas, a diferencia de los liposomas, tienen una alta eficiencia de encapsulación, incluso con fármacos hidrófilos. Los fármacos lipófilos o anfipáticos, en cambio, se intercalarán en parte entre las cadenas del fosfolípido en la bicapa y, en parte, se dispersarán permanentemente en la solución acuosa de hialuronato de sodio, gracias a las interacciones moleculares con el polímero.

Los ingredientes activos farmacéuticos y cosméticos a usar de acuerdo con esta invención incluyen antivirales, vitaminas tales como vitamina C y vitamina E, extractos de plantas, fármacos antiinflamatorios, corticosteroides, antibióticos, fungicidas, fármacos contra la psoriasis, aciclovir, ácido transretinoico, betametasona, lidocaína, minoxidil, anfotericina B, gentamicina, rifampicina, vitamina E y sus ésteres, diclofenaco, clorhidrato de lidocaína, alcaloides, hidroxiácidos, antioxidantes y humectantes. Preferiblemente, los ingredientes farmacéuticos y cosméticos activos son para uso tópico.

Por lo tanto, de acuerdo con esta invención, es posible usar ambos compuestos lipófilos tales como curcumina, quercetina, resveratrol, camferol, diclofenaco, aciclovir, ácido transretinoico, dipropionato de betametasona, minoxidil, gentamicina, rifampicina, tocoferol y sus derivados (ésteres) o derivados lipófilos de la vitamina E, y compuestos hidrófilos como, por ejemplo, ficocianina, ácido cafeico, cafeína, diclofenaco sódico, clorhidrato de lidocaína, vitamina C y sus derivados y derivados solubles del tocoferol.

Las nanovesículas de acuerdo con esta invención pueden incluir también surfactantes no iónicos que son compatibles con la formación de vesículas (usualmente usadas en la preparación de niosomas) o codisolventes y/o modificadores.

Los modificadores se agregan a la formulación como estabilizadores y/o como inductores de la carga eléctrica de las vesículas, y pueden ser, por ejemplo, colesterol, estearilamina, ácido oleico, dicetilfosfato y fosfatidilglicerol (PG), preferiblemente colesterol o fosfatidilglicerol. Se usan surfactantes o codisolventes acuosos para aumentar la solubilidad del fármaco y pueden ser, por ejemplo, glicerol, propilenglicol, etilenglicol, alcohol isopropílico, polietilenglicoles, polisorbatos, éteres poliglucosídicos, preferiblemente glicerol o propilenglicol.

En las vesículas de acuerdo con esta invención, dicho hialuronato (a) tiene una concentración de 0,01% a 5%, ^{preferiblemente de} 0^,02^{% a} 2^{%, más preferiblemente de} 0^,1^{% a} 1^{% y dicho al menos un fosfolípido (b) tiene una} concentración de 0,1% a 30%, preferiblemente de 0,5% a 25%, más preferiblemente de 1% a 15%; en el que dichos porcentajes son en peso de hialuronato o fosfolípido en comparación con el peso de la dispersión vesicular.

A modo de ejemplo y sin ninguna limitación del objeto de la presente patente, los hialurosomas pueden tener la composición mostrada en la Tabla 1 a continuación:

Tabla 1

Componente Hialuronato Modificadores Surfactantes no Ingrediente ^{Preservativos H}2^O fosfolípido de sodio iónicos o codisolvente activo

1 - 30% 0,05 - 2%

Dependiendo de su composición, los hialurosomas de esta invención pueden aparecer en forma de vesículas lipídicas unilamelares (pequeñas o grandes) o vesículas lipídicas oligolamelares o multilamelares. Los hialurosomas pueden tener dimensiones variables, aunque siempre dentro del rango nanométrico, con un diámetro medio entre 50 y 500 nm.

Además, los hialurosomas de esta invención pueden incorporarse en formulaciones destinadas a la aplicación tópica, tales como geles, lociones, emulsiones, suspensiones y similares.

Por lo tanto, un objeto adicional de la presente invención es una composición farmacéutica o cosmética para uso tópico que comprende las nanovesículas de esta invención, en combinación con uno o más de los excipientes o adyuvantes farmacéuticamente o cosméticamente aceptables.

Esta invención también se refiere a las nanovesículas o composiciones descritas anteriormente, para uso en el tratamiento de trastornos de la piel. Los tratamientos pueden ser tanto cosméticos como médicos. Entre los tratamientos médicos se pueden enumerar, el tratamiento de alteraciones de la cicatriz y/o tratamiento preventivo y curativo del queloide; el tratamiento de la dermatitis seborreica y atópica; el tratamiento sintomático de algunas enfermedades autoinmunes como la psoriasis. Ejemplos de tratamientos cosméticos basados en el uso de vesículas de acuerdo con esta invención son los tratamientos con función antienvejecimiento, con función antioxidante, efecto drenante, función hidratante y nutritiva, o con una función calmante posterior a la descamación.

Las vesículas de esta invención (hialurosomas), gracias a la acción sinérgica de los fosfolípidos y del hialuronato de sodio, tienen una mayor capacidad de carga y distribución en la piel que los liposomas que, por sí mismos, generalmente favorecen la acumulación de fármacos en la piel en comparación con formulaciones tópicas convencionales como cremas, lociones, pomadas o soluciones.

Cuando los hialurosomas de esta invención se aplican a la piel, algunas de las vesículas, gracias a la acción sinérgica de sus constituyentes, los fosfolípidos y el hialuronato de sodio, actúan como potenciadores y probablemente se fusionan con la matriz lamelar entre los corneocitos y la vuelven fluida. Luego, las otras vesículas que han permanecido intactas se filtran a través de la estructura más fácilmente y alcanzan la epidermis y la dermis, o se acumulan en el estrato córneo, formando un sistema de depósito. Por lo tanto, las vesículas de acuerdo con esta invención tienen la ventaja de actuar simplemente como promotores de la absorción cutánea y como portadores activos de fármacos, al aumentar la biodisponibilidad local y la actividad terapéutica o biológica de las moléculas que se transportan a la piel.

Además, es un objeto adicional de la presente invención un procedimiento para la preparación de dichas vesículas de hialurosomas que comprende las siguientes etapas: a) preparar una solución o dispersión acuosa de al menos un ingrediente farmacéutico o cosmético activo en una solución acuosa de hialuronato; b) mezclar la solución o dispersión de la etapa a) con al menos un fosfolípido hasta la hidratación de dicho fosfolípido y la formación de un sistema coloidal que comprende las vesículas de esta invención. Tanto la etapa a) como la etapa b) se llevan a cabo a temperaturas inferiores a 30°C, preferiblemente de 20 a 28°C, preferiblemente a aproximadamente 25°C. Por lo tanto, el proceso de acuerdo con esta invención no requiere el uso de disolventes orgánicos y la formación de películas lipídicas.

De acuerdo con el procedimiento de esta invención, la concentración de hialuronato en la solución acuosa de ^{hialuronato, preferiblemente hialuronato de sodio, a la que se agrega el ingrediente activo, puede variar de} 0^,01^{% a} 5%, preferiblemente de 0,02% a 2%, más preferiblemente de 0,1% a 1%. El agente activo se agrega a esta solución en una concentración de 0,1% (p/v) a 5% (p/v), preferiblemente 1% (p/v).

Dicho al menos un fosfolípido se puede usar en concentraciones que varían del 0,1% al 30%, preferiblemente del 0,5% al 25%, más preferiblemente del 1% al 15% p/p, siendo los porcentajes en peso de fosfolípido comparables con el peso de la dispersión.

Como se mencionó anteriormente, las moléculas de hialuronato, por ejemplo, son moléculas de hialuronato de sodio u otras sales de ácido hialurónico que son solubles en agua, en las que el ácido hialurónico tiene un peso molecular de 0,05 a 10 KDa, preferiblemente de 0,2 a 5 KDa, y más preferiblemente de 0,4 a 2 KDa.

Los fosfolípidos que se pueden usar de acuerdo con esta invención, por ejemplo, incluyen uno o más fosfolípidos naturales o sintéticos, puros o mixtos, como lecitina de soja o huevo, fosfatidilcolina hidrogenada o no hidrogenada en diversos grados de pureza, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) diestearoilfosfatidilcolina, palmitoilestearoilfosfatidilcolina, esfingomielina, mezclas de fosfolípidos, hidrogenados y no hidrogenados derivados de habas de soja, preferiblemente fosfatidilcolina de habas de soja hidrogenada y no hidrogenada.

Los ingredientes activos farmacéuticos y cosméticos a usar de acuerdo con esta invención incluyen antivirales, vitaminas tales como vitamina C y vitamina E, extractos de plantas, fármacos antiinflamatorios, corticosteroides, antibióticos, fungicidas, fármacos contra la psoriasis, aciclovir, Acido transretinoico, betametasona, lidocaína, minoxidil, anfotericina B, gentamicina, rifampicina, vitamina E y sus ésteres, diclofenaco, clorhidrato de lidocaína, alcaloides, hidroxiácidos, antioxidantes y humectantes. Preferiblemente, los ingredientes farmacéuticos y cosméticos activos son para uso tópico.

El proceso de acuerdo con esta invención puede incluir también surfactantes no iónicos que son compatibles con la formación de vesículas (normalmente, se usan los surfactantes usados en la preparación de niosomas) o codisolventes y/o modificadores. Estos surfactantes o codisolventes y/o modificadores se agregan en la fase lipofílica o acuosa, dependiendo de sus características de solubilidad. Por ejemplo, se pueden agregar junto con el ingrediente activo, ya que generalmente se seleccionan en función de las características de solubilidad del ingrediente activo.

Como se describió anteriormente, los modificadores se agregan a la formulación como estabilizadores y/o como inductores de la carga eléctrica de las vesículas, y pueden ser, por ejemplo, colesterol, estearilamina, ácido oleico, dicetilfosfato y fosfatidilglicerol (PG), preferiblemente colesterol o fosfatidilglicerol.

Se usan surfactantes o codisolventes acuosos para aumentar la solubilidad del fármaco y pueden ser, por ejemplo, glicerol, propilenglicol, etilenglicol, alcohol etílico, alcohol isopropílico, polietilenglicoles, polisorbatos, éteres poliglucosídicos, preferiblemente glicerina, propilenglicol.

El codisolvente acuoso o un surfactante se puede usar en una concentración del 10% (v/v) al 30% (v/v) y ^{preferiblemente al} 20^{% (v/v), en el que el porcentaje representa el volumen de surfactante o codisolvente comparado} con el volumen de la dispersión vesicular.

El modificador se puede usar en concentraciones que van desde 0,01% (p/p) a 2% (p/p), preferiblemente desde 0,05% (p/p) a 1% (p/p) o más preferiblemente desde 0,1 % (p/p) a 0,5% (p/p).

El proceso de acuerdo con esta invención puede comprender además una etapa c) de sonicación. La sonicación puede llevarse a cabo, por ejemplo, a través de 10 a 60 ciclos (cada ciclo se activa durante 5 segundos y se apaga durante 2 segundos), con una amplitud de 14-15 o preferiblemente de 15 a 50 ciclos (cada ciclo se activa durante 5 segundos y apagado por 2 segundos), con una amplitud de 14-15 o más preferiblemente de 20 a 40 ciclos (cada ciclo se activa durante 5 segundos y se apaga durante 2 segundos) con una amplitud de 14-15.

Según una realización particular de esta invención, el proceso para la preparación de hialurosomas consiste en la preparación de una solución acuosa de hialuronato de sodio en una concentración entre el 0,05% (p/v) y el 2% (p/v) y preferiblemente 0,1% (p/v), al que se agrega el agente activo, en una concentración de 0,1% (p/v) a 5% (p/v), preferiblemente 1% (p/v). La dispersión se deja durante 5 horas bajo agitación constante a temperaturas entre 20 y 28°C, preferiblemente a 25°C, para dispersar finamente las moléculas del ingrediente activo que interactúan con las cadenas de polímero y permanecen suspendidas dentro de la red viscoelástica formada por el hialuronato de sodio en la solución acuosa. Posteriormente, los diversos fosfolípidos (puros o mixtos, hidrogenados y no hidrogenados, entre los cuales las mezclas de fosfatidilcolina de soja y huevo, en diversos grados de pureza y que contienen fosfolípidos saturados y/o insaturados) se hidratan con la dispersión acuosa que contiene el ingrediente activo dispersado en el hialuronato de sodio. La dispersión se deja luego nuevamente durante 5 horas bajo agitación constante a temperatura ambiente entre 20 y 28°C, preferiblemente a 25°C, lo que permite la lenta hidratación de los fosfolípidos, y luego se sonica.

Como se indicó anteriormente, el proceso de esta invención, en comparación con los procesos conocidos para la preparación de otros sistemas vesiculares, no requiere el uso de disolventes orgánicos, normalmente utilizados para solubilizar y luego secar los lípidos en forma de una película. De hecho, en esta invención, el fármaco se dispersa en una solución de hialuronato de sodio y los fosfolípidos se hidratan mediante la adición directa de esta dispersión, dejando el sistema bajo agitación durante 5 horas. Esto asegura que los fosfolípidos se hinchen lenta y espontáneamente, formando vesículas lamelares en las que las cadenas de hialuronato que han interactuado con las porciones de fosfolípidos más similares a ellas pueden incorporarse más fácilmente dentro de la bicapa de fosfolípidos. Además, la presencia de un polielectrolito fuerte como el hialuronato de sodio, que interactúa electrostáticamente con ellos, además de contribuir al proceso de hidratación de los fosfolípidos, incluso aquellos que tienen una temperatura de transición de más de 30°C, provocan una acción solvatante capaz de favorecer y facilitar la disolución de los ingredientes activos insolubles.

Si el agente activo no se dispersa homogéneamente en la solución acuosa de hialuronato de sodio, o si se usa un fosfolípido con una temperatura de transición por encima de 30°C, se puede añadir un codisolvente acuoso o un surfactante no iónico compatible (tal como el que se usa para preparar sistemas niosomales), en una concentración entre 10% (v/v) y 30% (v/v) y preferiblemente 20% (v/v), para mejorar la solubilización del ingrediente activo y/o el hinchamiento del fosfolípido. De hecho, la presencia de un surfactante no iónico compatible o un codisolvente acuoso en la etapa de hidratación tiene un efecto sinérgico con aquel del hialuronato de sodio y facilita la solvatación de las moléculas y, por lo tanto, también el hinchamiento de los fosfolípidos. En particular, cuando la temperatura de transición de los fosfolípidos es superior a 30°C, no se hidratan espontáneamente en agua a temperatura ambiente, mientras que se hidratan en las mismas condiciones, en presencia de surfactantes o codisolventes.

Para la solución acuosa de fármaco y hialuronato de sodio, posiblemente se les puede añadir codisolventes acuosos, tales como el glicerol, el etilenglicol, el propilenglicol, el Transcutol y/o los surfactantes no iónicos que son compatibles con un sistema vesicular, hidrófilos que solubles en agua, tales como como PEG de diferente peso molecular, Tween, oramixCG 110.

El proceso de acuerdo con esta invención permite obtener vesículas que tienen mejores características en comparación con otros sistemas portadores conocidos. En particular, la inclusión del polímero de hialuronato en una cierta etapa del proceso de preparación desencadena una serie de dinámicas, inmediatamente perceptibles a través de los parámetros morfológicos y dimensionales (pequeñas vesículas de 150 nm y PI altamente homogénea = 0,26), que se reflejan en términos de desempeño de las vesículas, es decir, aumento de la cinética de solvatación y disolución de los agentes lipofílicos, lo que resulta en un aumento de la carga y la capacidad de administración tópica, y la estabilidad, diferenciándolos. Las vesículas de acuerdo con esta invención, por lo tanto, son claramente distinguibles de otros sistemas vesiculares conocidos cubiertos por polímeros hidrófilos.

Además, el proceso de preparación utilizado para esta invención tiene el beneficio adicional de permitir que todos los fosfolípidos se hidraten, sin la ayuda de disolventes orgánicos y a una temperatura inferior a 30°C, preferiblemente “ 25°C, incluso aquellos cuya temperatura de transición está por encima de 30°C, sin la necesidad de calentarlos por encima de su temperatura de transición, como ocurre en la preparación de las vesículas lamelares conocidas; y de facilitar la solvatación de los ingredientes activos y de capturarlos en la red de polímeros, estabilizando la dispersión acuosa.

Cualquiera que sea el fosfolípido que se use, incluso si su temperatura de transición es superior a 25°C, los hialurosomas se preparan a una temperatura inferior a 30°C (aproximadamente 25°C), mientras que, para la preparación de liposomas convencionales, la temperatura es mayor igual o igual a la temperatura de transición del fosfolípido utilizado. Por ejemplo, los liposomas de fosfatidilcolina hidrogenada se preparan generalmente a 60°C y los de DPPC a 45°C. De hecho, si la fosfatidilcolina hidrogenada se deja en agua, bajo agitación, a 25°C durante 12 horas, no se hincha, no forma capas dobles y permanece en el fondo en forma de polvo. En su lugar, utilizando una mezcla de hialuronato de sodio para hidratar la fosfatidilcolina hidrogenada y dejando la dispersión bajo agitación a 25°C durante 5 horas, se obtiene una dispersión homogénea similar a un gel diluido, en la cual la fosfatidilcolina está completamente hidratada, gracias a la presencia del ácido hialurónico, un polielectrolito que interactúa electrostáticamente con la fosfatidilcolina, que actúa como un humectante y facilita la hinchamiento en el agua. El hecho de que no haya necesidad de calentar la dispersión de los hialurosomas representa una clara ventaja si el ingrediente activo a incorporar es termolábil o parcialmente degradable, cuando se somete a calentamiento.

Posteriormente, si las vesículas son más grandes que 400 nm, la dispersión se somete a sonicación para reducir el tamaño de las vesículas.

Esto forma lamelas híbridas con capas dobles alternas que consisten en capas delgadas de polímero, en las cuales los grupos carboxílicos cargados negativamente de moléculas de polímero de hialuronato interactúan electrostáticamente con la porción positiva de las cabezas polares de los fosfolípidos, y permanecen anclados a estos, formando un sistema continuo en el que las moléculas del agente activo quedan atrapadas entre las cadenas de polímero o en la doble capa. Como tal, el hialuronato reforzará el empaquetamiento interlamelar, formando un sistema híbrido entre el fosfolípido y el polímero en el que la bicapa lipídica está en una condición de movilidad limitada de los fosfolípidos en medio de la red polimérica y el agente activo permanece atrapado y protegido en este sistema híbrido.

Se pueden agregar otras sustancias (colesterol, lípidos cargados, etc.) al sistema básico, como se describió anteriormente, que tienen una acción puramente adyuvante que, por lo tanto, no es restrictiva a su desempeño, a diferencia de otros sistemas de administración tópica de naturaleza vesicular, conocidos por el estado de la técnica (Vemuri S, Rhodes CT. 1995; Cevc G. 2004; Torchilin VP, Weissig V, 2003, glycerosomes 2010).

Esta invención se describirá ahora a modo de ejemplo no limitativo, de acuerdo con sus realizaciones preferidas, con referencia particular a las figuras de los dibujos adjuntos, en los que:

Figura 1. Imagen crio-TEM de hialurosomas que incorporan curcumina al 1% y preparados con hialuronato de sodio en concentraciones de 0,05% (A) y 0,1% (B).

Figura 2. Cantidad de curcumina acumulada (%) en el estrato córneo (SC), en la epidermis (Ep), la dermis (D) y el compartimento receptor (CR) después de 24 horas de experimento usando células de Franz. Los experimentos se ^{repitieron al menos seis veces (n =} 6^{) para cada muestra, y los valores se informaron como valores promedio ±} desviación estándar, el símbolo ° indica que los valores son diferentes (w <0,05) de aquellos de la dispersión de PEG400/ agua utilizada como muestra de control, mientras que el símbolo # indica que los valores son iguales a aquellos de la muestra de control.

Figura 3. Imágenes de ratas ulceradas con TPA (A) y tratadas con la dispersión de curcumina en PEG400/agua (B), con liposomas que incorporan curcumina (C) con hialurosomas que incorporan curcumina y preparados con hialuronato de sodio en concentraciones de 0,05%. (D) y 0,1% (E).

Figura 4. Imágenes de la piel cortada en tiras perpendiculares delgadas en la superficie de la piel. La ficocianina ha sido coloreada en azul y los fosfolípidos en rojo.

Figura 5. Cantidad de ácido diclofenaco acumulado (%) en el estrato córneo (SC), en la epidermis (Ep), la dermis (D) y el compartimento receptor (CR) después de 24 horas de experimento utilizando células de Franz. Los experimentos ^{se repitieron al menos seis veces (n =} 6^{) para cada muestra y los valores se informaron como valores promedio ±} desviación estándar.

Ejemplo 1: Preparación de hialurosomas de acuerdo con la invención y que contiene curcumina, diclofenaco o ficocianina y caracterización fisicoquímica de los hialurosomas.

Para resaltar el potencial y las características de los hialurosomas sin limitar su propósito, un antioxidante y un antiinflamatorio de origen natural (curcumina), o un fármaco antiinflamatorio no esteroideo sintético potente (diclofenaco) en forma ácida, fueron incorporados en estas vesículas como fármacos lipofílicos. Alternativamente, la ficocianina, que es una ficoproteína natural con propiedades antiinflamatorias y antioxidantes, se encapsuló como fármaco hidrofílico. Dada la alta capacidad de carga de los hialurosomas, cada uno de estos fármacos se cargó en las vesículas en altas concentraciones y se prepararon liposomas tradicionales para usarlos como referencia. Las características y funciones químicas y físicas de los hialurosomas se compararon con las de los liposomas convencionales.

Materiales y métodos

1.1 Preparación de hialurosomas y liposomas

La Tabla 2 muestra la composición porcentual de las preparaciones de hialurosomas que incorporan curcumina en concentraciones de 0,5% y 1% (0,5CUR y 1CUR).

Tabla 2

P90G (%) Hialuronato de sodio (%) Curcumina (%) 0,05 Hialurosomas 0,5CUR 18 0,05 0,5

^{0,05 Hialurosomas 1CUR 18} 0,1 1,0

(continuación)

P90G (%) Hialuronato de sodio (%) Curcumina (%) 0,1 Hialurosomas 0,5CUR 18 0,05 0,5

^{0,1 Hialurosomas 1CUR 18} 0,1 1,0

Los hialurosomas que incorporan curcumina al 0,5% e se prepararon pesando 0,5 gramos de curcumina y 0,05 gramos de hialuronato de sodio (muestra 0,05Hial-0,5CUR) o 0,1 gramos de hialuronato de sodio (muestra 0,1Hial-0,5CUR) y se colocaron en 81,45 (muestra 0,05Hial-0,5CUR) o 81,40 (muestra 0,1Hial-0,5CUR) gramos de agua y se deja agitar durante 5 horas a 25 ± 3°C. Se agregaron 18 gramos de Phospholipon 90 G (p90 G) a la dispersión obtenida para ambas muestras y se dejaron agitar durante 5 horas a 25°C. Las muestras obtenidas de este modo se sometieron a sonicación hasta obtener una dispersión homogénea. Se controló el tamaño de las vesículas y, si era necesario, los hialurosomas se sometieron a sonicación (30 ciclos de 2 segundos con detención de 5 segundos) con un desintegrador ultrasónico.

Los liposomas de referencia se prepararon utilizando el método clásico de película lipídica, obtenido disolviendo los componentes lipófilos en un disolvente (cloroformo o etanol) y luego eliminando el disolvente por medio de un evaporador rotatorio. Posteriormente, se añadió la solución de hidratación acuosa a los componentes lipófilos (fosfolípidos, aditivos y curcumina), distribuidos en forma de una película delgada sobre las paredes del recipiente. La ^{dispersión obtenida se dejó agitar durante} 12 ^{horas a una temperatura superior a la temperatura de transición del} fosfolípido utilizado (por ejemplo, 45°C para la DPPC; 25°C para la fosfatidilcolina).

Tabla 3. Composición en porcentaje de las preparaciones de hialurosomas y liposomas que encapsulan 2% de ficocianina.

P90G (%) Hialuronato de sodio (%) PEG400 (%) Ficocianina (%) ^{0,1 Hialurosomas PEG 400.1} 6 0,1 2 ^{Hialurosomas 18} 0,1 10 2 ^{Liposomas 18} 2

Los hialurosomas que incorporaban 2% de ficocianina se prepararon pesando 2 gramos de ficocianina y 0,1 gramos de hialuronato de sodio (muestra 0,1Hial) o 2 gramos de ficocianina, 0,1 gramos de hialuronato de sodio y 10 gramos de PEG 400 (muestra 0,1Hial-PEG400) y se colocaron en 91,9 (muestra 0,1Hial) o 71,90 (muestra 0,1Hial-PEG400) ^{gramos de agua y se dejó agitar durante 5 horas a 25 ± 3°C. Se agregaron} 6 ^{gramos de Phospholipon 90 G (p90 G)} a la dispersión obtenida para la muestra 0,1Hial y 18 gramos de Phospholipon 90 G (p90 G) para la muestra 0,1Hial-PEG400 y se dejó agitar durante 5 horas a 25°C. Las muestras obtenidas de este modo se sometieron a sonicación hasta obtener una dispersión homogénea. Se controló el tamaño de las vesículas y, si fuera necesario, los hialurosomas se sometieron a sonicación (30 ciclos de 2 segundos con detenciones de 5 segundos) con un desintegrador ultrasónico.

La formación real de hialurosomas que incorporan curcumina se confirmó bajo el microscopio óptico con luz polarizada, que mostró los cruces de Malta, lo que indica la presencia de un sistema lamelar [Manosroi A et al., 2003; Mele S et al., 2003; Sinico C et al., 2005]. La formación de vesículas oligolamelares o multilamelares cerradas, individuales, se confirmó con los microscopios tradicionales de transmisión de electrones (TEM) y criogénicos (crio-TEM), como se muestra en la Figura 1. Las muestras que contienen un 0,05% de hialuronato de sodio son predominantemente ^{unilamelares, mientras que las que contienen un} 1^{% están formadas tanto por vesículas unilamelares como} multilamelares.

1.2 Caracterización de hialurosomas y liposomas

La caracterización de los hialurosomas se llevó a cabo observando las muestras bajo un microscopio óptico con luz polarizada y un microscopio electrónico de transmisión a baja temperatura (crio-TEM), analizando dimensionalmente el potencial zeta usando espectroscopia de correlación de fotones (PCS) y midiendo la eficiencia de encapsulación (%E).

Para preparar las muestras para observación bajo crio-TEM, se hizo que una gota de dispersión se absorbiera en una rejilla de carbono, el exceso se absorbió con papel de filtro y la rejilla se vitrificó sumergiéndola en etano mantenida en el punto de fusión. La muestra se observó con un Tecnai F20 TEM (FEI Company) y se fotografió a 200 kV, -170/175°C, utilizando una cámara CCD Eagle (FEI Company).

El tamaño promedio y la amplitud de distribución dimensional (PI) se midieron con la ayuda de espectroscopia de correlación de fotones, utilizando el Zetasizer nano-ZS (Malvern Instrument, Reino Unido) mientras que el potencial Z se midió utilizando el mismo Zetasizer nano-ZS, con la ayuda del análisis de fase de dispersión de luz (M3-PALS), que mide la movilidad electroforética de las partículas en un ambiente de temperatura controlada.

La eficacia de incorporación (para fármacos lipófilos) y la eficiencia de encapsulación (para fármacos hidrófilos) expresa el porcentaje de fármaco realmente encapsulado en las vesículas, y luego recuperado después de la purificación, en comparación con la cantidad inicial (100%) encontrada al final de preparación. La dispersión vesicular se separó del fármaco libre mediante diálisis. La dispersión (1-2 mL) se transfirió al tubo de diálisis sellado en ambos extremos, y se sumergió en un baño de agua, se mantuvo a 25°C y con agitación constante. La cantidad de baño de agua debe ser suficiente para solubilizar todo el fármaco dentro del tubo de diálisis; si fuera necesario, se puede cambiar el agua 1 o 2 veces, para asegurarse de mantener alejado todo el medicamento libre. Las dispersiones ^{vesiculares antes y después de la diálisis se diluyeron con metanol (}1^/1000^{), haciendo estallar las vesículas y liberando} el fármaco, y la concentración del fármaco se cuantificó mediante análisis por HPLC.

1.3 Determinación cuantitativa de curcumina y diclofenaco

La determinación cuantitativa de curcumina se llevó a cabo con un HPLC, Alliance 2690 (Waters, Milán, Italia), con detector espectrofotométrico de UV, longitud de onda de 427 nm, utilizando una columna SunFire C18 (3,5 pm, 4,6 x 150 mm) y una mezcla de acetonitrilo, agua y ácido acético para la fase móvil (94,8:5:0,2, v/v) eluida a una velocidad de 1 mL min-1.

La determinación cuantitativa de diclofenaco se llevó a cabo con el mismo instrumento, a 227 nm, una columna SunFire C18 (3,5 pm, 4,6 x 150 mm) y una mezcla de acetonitrilo y agua para la fase móvil (70:30, v/v) eluida a una velocidad de 0,5 mL min'1.

La determinación cuantitativa de ficocianina se llevó a cabo utilizando un espectrofotómetro UV/visible calibrado a 615 nm. Para determinar con precisión la cantidad de ficocianina, primero se construyó una línea de calibración con 5 soluciones de ficocianina en agua con un título conocido.

1.4 Diámetro promedio, índice de polidispersidad (PI), potencial zeta y eficiencia de encapsulación (% de E) de hialurosomas

La eficacia de incorporación de un ingrediente activo expresa la relación entre la cantidad de fármaco realmente incorporada dentro de las vesículas y la de la dispersión. El fármaco no incorporado en las vesículas se eliminó de la dispersión mediante diálisis (biblio que cur). La cantidad de ingrediente activo contenida en las dispersiones se cuantificó por HPLC; para liberar el fármaco incorporado dentro de estas vesículas, estas últimas se reventaron ^{agregando una gran cantidad de metanol (}1^/1000^{) capaz de solubilizar todo el fosfolípido usado.}

Teniendo en cuenta la cantidad inicial de fármaco y la cantidad encontrada después de la diálisis, la eficiencia de incorporación (% de E) expresada como porcentaje se calculó de acuerdo con la fórmula:

% de E = cantidad de ingrediente activo en la dispersión purificada x 100 / cantidad de ingrediente activo en la dispersión inicial.

Utilizando el 18% del fosfolípido, todos los sistemas preparados son capaces de transportar la curcumina en concentraciones del 0,5% y del 1%, con buenas eficiencias de encapsulación, que siempre son mayores en el caso de los hialurosomas (Tabla 4). Los hialurosomas confirman su mayor capacidad de carga; de hecho, son capaces de ^{incorporar aproximadamente el 79% de la curcumina, mientras que los liposomas solamente -} 66^{%. Además, en la dispersión liposomal que incorpora curcumina al} 1^{%, inmediatamente después de la preparación, siempre se observa} un precipitado en el fondo del tubo de ensayo, que se puede dispersar inmediatamente agitando simplemente el tubo.

Tabla 4. Diámetro promedio, índice de polidispersidad (PI), potencial zeta y eficiencia de incorporación (% de E) de hialurosomas y liposomas que incorporan curcumina en concentraciones de 0,5% y 1% (0,5CUR y 1CUR). Los valores se midieron el día de la preparación y la tabla enumera los valores promedio ± desviación estándar ^{______________________________ obtenidos de al menos seis muestras (n =} 6^{).______________________________}

Diámetro promedio (nM) PI Potencial Zeta (mV) E (%) ^{0,05 Hialurosomas 0,5CUR 151 ± 10 0,28 -26 ± 7 82 ±} 6 0,05 Hialurosomas 1CUR 166 ± 9 0,30 -26 ± 4 76 ± 5 0,1 Hialurosomas 0,5CUR 163 ± 10 0,29 -25 ± 5 81 ± 7 ^{0,1 Hialurosomas 1CUR 177 ± 12 0,30 -24 ±} 6 ^{79 ± 4 Liposomas 0,5CUR 192 ±11 0,42 -29 ±} 6 ^{69 ± 5} Liposomas 1CUR 196 ± 18 0,46 -30 ± 5 63 ± 4

Las principales propiedades físicas y químicas de los hialurosomas, es decir, el diámetro promedio, el índice de polidispersión y el potencial zeta se midieron utilizando un láser dinámico de dispersión luz (Tabla 4), el día de la preparación y luego cada semana durante 4 semanas, a fin de controlar la estabilidad del sistema. El método de preparación de los hialurosomas permite obtener pequeñas vesículas (aproximadamente 150 nm) y escasamente polidispersas (PI~0,26). Además, las dispersiones obtenidas son particularmente estables en el tiempo; durante los 90 días de estudio, no hubo formación de precipitados y el tamaño de sus partículas permanece constante. Cuando las vesículas, en cambio, se preparan de acuerdo con el método utilizado convencionalmente para obtener liposomas recubiertos con un polímero (es decir, cuando los liposomas que contienen el medicamento se preparan primero y ^{luego se agrega el polímero), el tamaño promedio es mayor (aproximadamente} 220 ^{nm), el índice de dispersión} siempre es mayor que 0,32 y, sobre todo, después de 2 a 3 semanas, el fármaco precipita y se forman dos fases separadas en la dispersión. Probablemente debido al mayor tamaño, las formulaciones recubiertas permiten una acumulación del fármaco en la piel que es comparable a la de los liposomas convencionales y la solución acuosa del fármaco. Los hialurosomas de acuerdo con esta invención tienen características que son muy similares a las de los liposomas de referencia, pero son un poco más pequeños y menos polidispersos, el tamaño promedio está entre 151 nm y 177 nm, el índice de dispersión es siempre < 0,30, lo que indica una buena homogeneidad de dispersión, el valor del potencial zeta es altamente negativo, y esto asegura una buena estabilidad del sistema, ya que previene la agregación de vesículas en la dispersión. El tamaño de los hialurosomas y la eficiencia de incorporación de la curcumina permanecen constantes durante las 4 semanas, mientras que el tamaño de los liposomas crece hasta 280 nm, y su eficiencia de incorporación disminuye hasta aproximadamente en un 50%.

Las características de las vesículas que contienen ficocianina se enumeran en la Tabla 5.

Tabla 5. Diámetro medio, índice de polidispersidad (PI), potencial zeta y eficiencia de encapsulación (% de E) de liposomas e hialurosomas que encapsulan ficocianina (1%). La tabla muestra los valores promedio ± desviación ________________________________________ estándar (n = 3).________________________________________ Muestras Promedio (nM) PI Potencial Zeta (mV) E (%) ^{0,1 Hialurosomas 130 ± 4 0,30 -18 ±7 49} ±8 PEG 0,1 Hialurosomas 135 ± 4 0,29 -10 ±4 45 ± 7 ^{Liposomas 145 ±} 8 ^0,43 -20 ^{±9 34} ±6

La ficocianina se encapsuló en los hialurosomas, con y sin PEG400, con mayor eficacia que la obtenida con los liposomas de referencia, aproximadamente el 34% en el primero y el 49% en el segundo. Esto confirma la mayor capacidad de carga de los hialurosomas, incluso con fármacos hidrófilos, gracias a la formación del portador estructurado formado por el hialuronato de sodio, que permanece anclado a la bicapa lipídica. Además, los hialurosomas son estadísticamente más pequeños que los liposomas y están menos polidispersos, por lo que, como en el caso de los hialurosomas que incorporan curcumina, incluso utilizando un fármaco hidrofílico con alto peso molecular, las características químicas y físicas de los hialurosomas son más prometedoras que las de los liposomas. Para probar la capacidad de las vesículas para transportar el medicamento a través de la piel, las vesículas se marcaron con un fosfolípido fluorescente, fosfatidiletanolamina-dioleoilsulforodamina (Rho-PE), y la distribución en la piel de la ficocianina, que es fluorescente (azul), y de los fosfolípidos (rojo) se observó en diferentes etapas, utilizando un microscopio confocal. Para simular mejor las condiciones fisiopatológicas de las heridas superficiales o las lesiones cutáneas, el estrato córneo se removió de la piel del cerdo mediante extracción y las formulaciones de ficocianina se aplicaron directamente sobre la piel viva. Las imágenes de la piel (Figura 3) indican que la ficocianina transportada en los hialurosomas penetra fácil y rápidamente.

Como se mencionó anteriormente, para demostrar la mayor capacidad de los hialurosomas como portadores de la ^{piel, se encapsuló un poderoso fármaco antiinflamatorio no esteroideo sintético,} 1^{% de diclofenaco en forma ácida.} Las características físicas y químicas de los hialurosomas y sus correspondientes liposomas se enumeran en la Tabla 6.

^Tabla 6^{. Diámetro promedio, índice de polidispersidad (PI), potencial zeta y eficiencia de encapsulación (% de E) de} liposomas e hialurosomas que encapsulan ácido diclofenaco (1%). La tabla muestra los valores promedio ± _____________________________________ desviación estándar (n = 3)._____________________________________ Muestras Promedio (nM) PI Potencial Zeta (mV) E (%) 0,1 Hialurosomas 142 ± 11 0,30 -20 ± 7 85 ± 7 Liposomas 187 ± 7 0,40 -18 ± 5 74 ± 5

En este caso, también, los hialurosomas son más pequeños, están menos polidispersos e incorporan una mayor cantidad de fármaco en comparación con los liposomas de referencia. Sus mejores características, como el suministro de fármacos, en realidad se traducen en una mayor acumulación del fármaco en la piel, especialmente en el estrato córneo y la dermis, en comparación con lo obtenido con la solución y los liposomas de referencia.

Ejemplo 2: Estudio in vitro de penetración/permeación cutánea

Se llevaron a cabo estudios in vitro utilizando la piel de un cochinillo, se eliminó inmediatamente después de la muerte del animal, se lavó con agua, se extendió, se envolvió en láminas de aluminio y luego se congeló a -80°C. En el momento del experimento, la piel se cortó en discos y se interpuso entre los dos compartimentos de las células de ^{Franz, con un área efectiva de difusión de 0,785 cm}2 ^{La célula receptora se llenó con una solución salina (5,5 mL de} NaCI al 0,9%) y se mantuvo bajo agitación constante. En el compartimento del donante, se introdujeron 40 pL de cada muestra, al inicio y después de 4 horas, teniendo cuidado de cubrir toda la superficie de la piel. Para cada formulación, se utilizaron seis células. Las células se mantuvieron a una temperatura controlada de 37°C (de modo que la ^{temperatura de la piel es igual a la temperatura fisiológica de 32°C). En momentos predeterminados (2, 4,} 6^, 8 ^{y 24} horas), el compartimiento del receptor se vació y se volvió a llenar con solución salina fresca. Las soluciones muestreadas se liofilizaron, luego se reanudaron con 2 mL de metanol y se analizaron bajo HPLC.

En la hora 24, la piel se lavó cuidadosamente, se secó con papel de filtro y se separó en capas individuales: estrato córneo, epidermis y dermis. El estrato córneo se separó retirándolo con una cinta Master-Aid RollTex. La cinta se aplicó a la piel durante 10 segundos, aplicando una ligera presión y luego se retiró. Después de remover cada tira (mínimo 4 veces), las tiras de cinta utilizadas se cortaron en trozos pequeños y se colocaron en un tubo de ensayo con 3 mL de metanol para extraer el medicamento. La dermis se separó de la piel con un bisturí, se cortó en trozos pequeños y se transfirió a un tubo de ensayo con 3 mL de metanol. Las soluciones metanólicas se sonicaron (2 ciclos de un minuto cada uno) con un Soniprep 150 (MSE Crowley, Reino Unido), para extraer el fármaco de la piel. Las muestras se analizaron bajo HPLC para determinar la cantidad de fármaco.

Resultados

La capacidad de las vesículas para interactuar con la piel y facilitar la transición de sustancias activas, a través del estrato córneo y la epidermis, hasta la dermis o los tejidos subyacentes, se probó mediante experimentos in vitro para medir la penetración cutánea, utilizando curcumina que es una molécula lipófila que sola tiene dificultades para penetrar en la piel. Como comparación, para medir la efectividad de los hialurosomas como portadores de la piel, se utilizaron liposomas y una dispersión de curcumina en PEG400 y agua (5%). Los estudios se realizaron utilizando la concentración más alta de curcumina (1%) y los hialurosomas se prepararon con una concentración de 0,05% y 0,1% de hialuronato de sodio (Figura 2).

Los resultados reportados en la Figura 2 resaltan claramente la mayor capacidad de los hialurosomas, en comparación con los liposomas y la dispersión, al actuar como portadores y facilitar la acumulación de curcumina, especialmente en el estrato córneo, pero también en la epidermis y la dermis, independientemente de la cantidad de hialuronato de sodio utilizado. En todos los casos, incluso cuando se aplica a la dispersión, la acumulación de curcumina es siempre mucho mayor que en el estrato córneo y disminuye progresivamente en las otras capas.

Ejemplo 3: Distribución cutánea de ficocianina y fosfolípidos

Las vesículas que encapsulan la ficocianina se prepararon mediante la adición de Rho-PE (0,35 mg/mL) a los fosfolípidos durante la preparación. Las vesículas marcadas se aplicaron in vitro sobre la piel, como se muestra en el ejemplo 4. Al final, las piezas de piel se cortaron en rodajas finas (25 pm), en ángulo recto con la superficie de la piel, con un criomicrótomo (Leica CM1950, Barcelona, España). Luego se observaron con un microscopio confocal invertido archivos de FluoView (Olympus, Barcelona, España), utilizando una lente UPlanSApo de 20 * 0,75 NA. Se obtuvieron imágenes del tamaño de 1024 * 1024 pm. La ficocianina y Rho-PE se excitaron, 600 nm y 559 nm respectivamente, y se midieron a 640 nm y 578 nm.

Ejemplo 4: Estudio in vivo de la inhibición de mieloperoxidasa y edema

^{Se usaron ratones hembra Hsd para los experimentos in vivo: ICR (CD-1®) de 5 a} 6 ^{semanas (peso 25-35 g) adquiridos} a través de Harlan Laboratories (Barcelona, España). Se permitió que los ratones se aclimataran 1 semana antes de su uso. Todos los estudios se realizaron de acuerdo con las normas de la Unión Europea para el manejo y uso de animales de laboratorio. Los protocolos han sido aprobados por el Comité Institucional para el cuidado y uso de animales de la Universidad de Valencia. Las espaldas de los ratones se afeitaron y se aplicaron (~2 cm2) de 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) disuelto en acetona (243 pM; 3 pg/20 pL) para inducir inflamación de la piel y ulceración (día 1). A los ratones de control se les aplicó solo acetona (20 pL). La dispersión de curcumina o vesículas ^{que incorporan curcumina se aplicaron ( 40 pL) gota a gota a las 3 y} 6 ^{horas después de la aplicación del TPA. El} proceso se repitió (cada 24 horas) en los días 2 y 3. En el día 4, los ratones se sacrificaron por dislocación cervical. Cada grupo estaba formado por cuatro ratones. La inhibición de la inflamación y las úlceras se cuantificaron midiendo la formación de edema y mieloperoxidasa (MPO). El área de la piel dorsal tratada se retiró y pesó para evaluar cualquier aumento indicativo de formación de edema. Para la medición de la MPO, las biopsias de piel se homogeneizaron y se centrifugaron, y el sobrenadante se incubó con peróxido de hidrógeno y tetrametil bencidina. La actividad de MPO se cuantificó a 620 nm espectroscópicamente. El grado de ulceración se evaluó visualmente.

Resultados

Los estudios han demostrado que, en comparación con los liposomas, los hialurosomas permiten una alta acumulación de los dos marcadores fluorescentes en el estrato córneo, y especialmente durante un período de tiempo más largo, favorecen una acumulación discreta en las capas inferiores, la epidermis y dermis. La presencia de una alta concentración de vesículas en la capa más externa de la piel está probablemente vinculada a su capacidad para interactuar con el estrato córneo, en el que luego se fusionan con los lípidos intercelulares. Los hialurosomas pueden alterar la estructura ordenada y compleja de la capa más superficial de la piel, pero también pueden aumentar el grado de hidratación del estrato córneo, en ambos casos favoreciendo la acumulación del fármaco en la piel.

Con respecto a la curcumina, las pruebas confirman la mayor capacidad de los hialurosomas de esta invención para transportar la curcumina en la piel y aumentar su biodisponibilidad en los tejidos de la piel, utilizando pruebas in vivo para medir la efectividad de la curcumina, libre o nanoencapsulada, en el tratamiento de las úlceras cutáneas.

Tabla 7. Valores de edema, inhibición del edema (edema I), mieloperoxidasa (MPO) e inhibición de la mieloperoxidasa (MPO I) en ratones sanos, ulcerados con TPA y tratados con curcumina (CUR) dispersa en PEG400/agua o incorporados en liposomas y hialurosomas. La tabla muestra los valores promedio ± desviación ^{estándar (n =} 6⁾

Tratamiento

Edema (mg) Edema I (%)

MPO I (%) ^{Ratones sanos 3,9 ± 0,38} 100 ^{57 ± 17} 100

^{TPA 10,7 ± 0,68} 0 ^{362 ± 19} 0

^{CUR PEG400 7,1 ± 0,36 53 ± 2 298 ± 19} 20 ^± 2 CUR Liposomas 5,2 ± 0,60 80 ± 3 156 ± 21 67 ± 3 ^{CUR 0,05 Hialurosomas 4,8 ±0,75} 86 ^{± 4 108 ±} 22 ^{83 ± 4 CUR 0,1 Hialurosomas 5,4 ± 0,53 81 ±} 2 111 ^{±18 82 ±3}

Para inducir una lesión en ratones, se utilizó acetato de tetradecanoilforbol (TPA), una sustancia altamente irritante y necrotizante que, si se aplica repetidamente sobre la piel, provoca ulceración e inflamación con la formación de edema, infiltración de neutrófilos y un aumento de mieloperoxidasa (MPO), una enzima que indica inflamación. La aplicación de TPA durante 3 días consecutivos en realidad provoca una ulceración de la piel y la formación de edema (Figura 3A); El tratamiento de la herida con la dispersión de curcumina en PEG400/agua solo conduce a una leve mejoría de la lesión, que parece estar más seca y descamada. El tratamiento con curcumina nanovesicular (liposomas e hialurosomas) siempre conduce a una mejora de las condiciones generales de la herida, donde el tejido de la piel tiene una forma parcial (liposomas) o casi completamente (hialurosomas) reformada y aparece rosado y flexible como el de la piel no ulcerada. En ratones tratados con liposomas, la lesión de la piel se reduce en intensidad y extensión, pero el contorno del tejido de la piel no está totalmente reformado y todavía hay signos de áreas ulceradas. Mientras que ^{en ratones tratados con hialurosomas, especialmente los que contienen hialuronato de sodio al} 0^,1^{%, la piel se ve} completamente reformada y rosada, con cierta descamación en los ratones tratados con 0,05 hialurosomas. Incluso los valores de edema y MPO en ratones tratados con liposomas e hialurosomas se reducen en comparación con los de ratones ulcerados con TPA y no tratados o tratados con dispersión en PEG400/agua, y como tal, los valores de inhibición correspondientes aumentan considerablemente. En particular, la mejoría es más notable en los ratones tratados con 0,1 hialurosomas, en los que la inhibición del edema alcanza aproximadamente el 84% y la de la MPO aproximadamente el 83%.

Por lo tanto, la mayor capacidad de carga y suministro a la piel de los hialurosomas se traduce en la eficacia terapéutica mejorada del fármaco, probablemente también debido al efecto sinérgico del hialuronato de sodio, que reestructura el tejido epidérmico y se utiliza como ingrediente activo en el tratamiento de lesiones cutáneas.

Referencias

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- "Liposomes as carriers for dermal delivery of tretinoin: in vitro evaluation of drug permeation and vesicle-skin interaction" C. Sinico, M. Manconi, M. Peppi, D. Valenti, F. Lai, A.M. Fadda. Journal of Controlled Release,103, 123-136 (2005).

- "Quantitative characterization of phospholipids in milk fat via 31P NMR using a monophasic solvent mixture". Lipids.

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- Manca, M. L., Zaru, M., Manconi, M., Lai, F., Valenti, D., Sinico, C., Fadda, A. M. (2013). Glycerosomes: A new tool for effective dermal and transdermal drug delivery. International Journal of Pharmaceutics, 455 (1-2), 66-74.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para la preparación de vesículas similares a liposomas nanométricas (hialurosomas) para aplicación farmacéutica o cosmética tópica que comprende a) hialuronato, preferiblemente hialuronato de sodio, b) al menos un fosfolípido y c) al menos un ingrediente farmacéutico o cosmético activo, en el que dicho al menos un fosfolípido forma una doble capa y dicho hialuronato está dispuesto dentro de la propia doble capa,

comprendiendo dicho proceso las siguientes etapas:

a) preparar una solución o dispersión acuosa de al menos un ingrediente farmacéutico o cosmético activo en una solución acuosa de hialuronato;

b) mezclar la solución o dispersión de la etapa a) con al menos un fosfolípido hasta la hidratación de al menos un fosfolípido y la formación de un sistema coloidal que comprende las vesículas,

en las que el proceso no comprende el uso de un solvente orgánico y en donde ambas etapas a) y la etapa b) se llevan a cabo a temperaturas inferiores a 30°C, preferiblemente de 20 a 28°C, incluso más preferiblemente a aproximadamente 25°C.

2. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la concentración de hialuronato en la solución acuosa de ^{hialuronato, preferiblemente hialuronato de sodio, a la que se agrega el ingrediente activo, varía entre el} 0^,01^{% (p/p)} a 5% (p/p), preferiblemente 0,02% (p/p) a 2% (p/p), más preferiblemente 0,1% (p/p) a 1% (p/p).

3. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que dicho al menos un ingrediente activo se agrega a la solución de hialuronato en una concentración de 0,1% (p/v) a 5% (p/v), preferiblemente 1% (p/v).

4. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho al menos un fosfolípido se usa en concentraciones que varía del 0,1% (p/p) a 30% (p/p), preferiblemente del 0,5% (p/p) a 25% (p/p), más preferiblemente desde 1% (p/p) a 15% (p/p).

5. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho al menos un fosfolípido se selecciona del grupo que consiste en lecitina de soja o huevo, fosfatidilcolina hidrogenada o no hidrogenada en diversos grados de pureza, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) diestearoilfosfatidilcolina, palmitoilestearoilfosfatidilcolina, esfingomielina, mezclas de fosfolípidos, hidrogenados y no hidrogenados derivados de habas de soja, preferiblemente fosfatidilcolina de habas de soja hidrogenada y no hidrogenada.

6^{. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho al menos un ingrediente farmacéutico} o cosmético activo se selecciona del grupo que consiste en antivirales, vitaminas tales como vitamina C y vitamina E, extractos de plantas, fármacos antiinflamatorios, corticosteroides, antibióticos, fungicidas, fármacos contra la psoriasis, aciclovir, ácido transretinoico, betametasona, lidocaína, minoxidil, anfotericina B, gentamicina, rifampicina, vitamina E y sus ésteres, diclofenaco, clorhidrato de lidocaína, alcaloides, hidroxiácidos, antioxidantes y humectantes.

7. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que también comprende el uso de surfactantes o codisolventes no iónicos y/o modificadores, en el que los modificadores se eligen del grupo que consiste en colesterol, estearilamina, ácido oleico, dicetilfosfato y fosfatidilglicerol (PG), preferiblemente colesterol y fosfatidilglicerol.

8^{. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende además una etapa c) de sonicación.}

9. Vesículas nanométricas de tipo liposoma (hialurosomas) para aplicación farmacéutica o cosmética tópica, obtenibles ^{por el proceso de las reivindicaciones} 1-8^{, en las que dichas vesículas comprenden: a) hialuronato, preferiblemente} hialuronato de sodio, b) al menos un fosfolípido y c) al menos un ingrediente farmacéutico o cosmético activo, en el que dicho al menos un fosfolípido forma una doble capa y dicho hialuronato está dispuesto dentro de la propia doble capa.

10. Vesículas de acuerdo con la reivindicación 9, en las que dicho al menos un fosfolípido se selecciona del grupo que consiste en lecitina de soja o huevo, fosfatidilcolina hidrogenada o no hidrogenada, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) diestearoilfosfatidilcolina, palmitoilestearoilfosfatidilcolina, esfingomielina, mezclas de fosfolípidos, hidrogenados y no hidrogenados derivados de habas de soja, preferiblemente fosfatidilcolina de habas de soja hidrogenada y no hidrogenada.

11. Vesículas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-10, en las que dicho al menos un ingrediente farmacéutico o cosmético activo se selecciona del grupo que consiste en antivirales, vitaminas tales como vitamina C y vitamina E, extractos de plantas, fármacos antiinflamatorios, corticosteroides, antibióticos, fungicidas, fármacos contra la psoriasis, aciclovir, ácido transretinoico, betametasona, lidocaína, minoxidil, anfotericina B, gentamicina, rifampicina, vitamina E y sus ésteres, diclofenaco, clorhidrato de lidocaína, alcaloides, hidroxiácidos, antioxidantes y humectantes.

12. Vesículas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-11, que comprenden además surfactantes o codisolventes no iónicos y/o modificadores, en los que los modificadores se eligen del grupo que consiste en colesterol, estearilamina, ácido oleico, dicetilfosfato y fosfatidilglicerol (PG), preferiblemente colesterol y fosfatidilglicerol.

13. Vesículas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-12, en las que dicho hialuronato (a) tiene una concentración de 0,01% a 5%, preferiblemente de 0,02% a 2%, más preferiblemente de 0,1% a 1%, y dicho al menos un fosfolípido (b) tiene una concentración de 0,1% a 30%, preferiblemente de 0,5% a 25%, más preferiblemente de 1% a 15%; en donde dichos porcentajes son en peso de hialuronato o fosfolípido con respecto al peso de la dispersión ^vesicular.

14. Composición farmacéutica o cosmética para uso tópico que comprende las vesículas de las reivindicaciones 9-13, como ingrediente activo, en combinación con uno o más excipientes o adyuvantes farmacéutica o cosméticamente aceptables.

15. Vesículas como se define en cualquiera de las reivindicaciones 9-13 o la composición de acuerdo con la reivindicación 14, para uso en el tratamiento médico de trastornos de la piel, tales como dermatitis atópica y seborreica, o psoriasis.

16. Uso no médico de vesículas de acuerdo con se define en las reivindicaciones 9-13 o de una composición como se define en la reivindicación 14, en el tratamiento cosmético de trastornos de la piel, tales como deshidratación, envejecimiento oxidativo, alteraciones de cicatrices/queloides.