BE1030538B1 - Liposomaal preparaat met ingekapselde hormonen, werkwijze voor de productie en gebruik ervan - Google Patents

Abstract

De huidige uitvinding betreft een werkwijze voor het produceren van een liposomaal preparaat middels emulgatie, waarbij het preparaat liposomen bevat met ingekapselde hormonen of esters daarvan, omvattende: een eerste emulgeerstap waarbij een eerste samenstelling geëmulgeerd wordt, de eerste samenstelling omvattende water, propyleenglycol, een emulgator en een in te kapselen hormoon; met het kenmerk dat voor het emulgeren van de eerste emulgeerstap, een rotor-stator emulgator gebruikt wordt dewelke voorzien is van een stator met perforaties met een diameter begrepen tussen 0,8 en 5 mm, en waarbij de rotatiesnelheid minstens 6000 rpm is. De uitvinding betreft ook een liposomaal preparaat omvattende liposomen met ingekapselde hormonen of esters daarvan, en een liposomaal preparaat voor gebruik in hormoontherapie of voor gebruik in de behandeling van hypogonadisme en/of bijnierinsufficiëntie.

Description

LIPOSOMAAL PREPARAAT MET INGEKAPSELDE HORMONEN, WERKWIJZE

VOOR DE PRODUCTIE EN GEBRUIK ERVAN

TECHNISCH DOMEIN

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het produceren van een iposomaal preparaat, op een liposomaal preparaat en het gebruik van dergelijk preparaat.

STAND DER TECHNIEK

Lipsomen zijn sferische vesikels of blaasjes met ten minste één lipidenbilaag of - dubbellaag. Liposomen kunnen worden gebruikt als vehikel voor de toediening van voedingsstoffen en farmaceutische geneesmiddelen, zoals lipidennanodeelties In MRNA- vaccins en DNA-vaccins. Liposomen kunnen worden bereid door biologische membranen te verstoren, bijvoorbeeld door sonicatie,

Liposomen zijn meestal samengesteld uit fosfolipiden, vooral fosfatidyicholine, maar kunnen ook andere lipiden bevallen, zoals ei-fosfatidylethanolamine, zolang ze compatibel zijn met de structuur van de lipidenbllaag.

De belangrijkste typen liposomen zijn het multilamellaire vesikel (multilamellar liposome vesicle MLV, met meerdere lipidebilagen in lamellaire fase), het kleine unilamellaire liposoomvesikel (small unilamellar liposome vesicle: SUV, met één lipidebilayer), het grote unilamellaire vesikel (large unilamellar liposome vesicle: LUV), en het cochieaatvesikel, Een minder gewenste vorm zijn multivesiculiaire liposomen, waarbij één blaasje één of meer kleinere blaasjes bevat.

Liposomen worden o.a. gebruikt voor topisch of rechtstreeks op de huid aangebrachte liposomaal ingekapselde moleculen voor transdermale toediening van dezelfde moleculen met systematisch effect tot doel. Hun lipide dubbellaag-structuur gelijkt op deze van natuurlijke celmembranen en laat hen toe de vioeibaarheid van celmembranen te beïnvloeden, ermee te fusioneren en te migreren iussen de cellen en celmembranen.

Multiiamellaire liposomen kunnen geneesmiddelen binnen een half uur doorheen de dermis, epidermis en stratum corneum lagen van de huid brengen in significant hogere hoeveelheden dan conventionele bereidingen zonder liposomen.

© BE2022/5374

WO2010096836 beschrijft reeds een werkwijze voor het bereiden van liposomen met ingekapseld hydrocortison, een samenstelling van een liposomaal gel en het gebruik ervan voor transdermale toediening, Hierbij worden de liposomen met ingekapseld hydrocortison geëmulgeerd of gesuspendeerd in een aangepast gel. De liposomen worden daartoe gemengd in een geschikte mixer samen met gel matrices die een polymere driedimensionale structuur rond de liposomen vormen, zoals bijvoorbeeld een hydrogel. Ook EP3025732 beschrijft een werkwijze voor het bereiden van een liposomale bereiding voor het toedienen van ingekapselde geneesmiddelen middels emulgatie. Ook uit bijvoorbeeld WO0120990 zijn verdere werkwijzen voor het produceren van liposomale bereidingen gekend, Daarnaast worden liposomale bereidingen besproken in US2020038325, CA2366998 en EP2308468.

Een probleem met de gekende liposomale bereidingen met geneesmiddelen dewelke ingekapseld zijn in de liposomen, is dat serumwaarden van het betrokken geneesmiddel! in het bloed niet relatief constant blijven op een gewenst peil over een langere tijd bij applicatie bij een patiënt, Hierdoor moet de bereiding zeer regelmatig opnieuw toegediend worden, meerdere malen per dag, ongeacht of deze toediening transdermaal, per os of intraveneus uitgevoerd wordt. Doordat deze liposomen meerdere malen toegediend dienen te worden, is het voor veel patiënten moeilijk om therapietrouw te blijven, ie. het gewillig en blijvend volgen van de door een arts voorgeschreven behandeling door een patient. Een verminderde therapietrouw kan leiden tot een verhoogd risico op ziekte, sterfte en hogere kosten.

Er is nood aan een verbeterde bereiding geschikt voor het toedienen van geneesmiddelen, waarbij serumwaarden van het geneesmiddel in het bloed gedurende langere lijd relatief stabiel bijft, waardoor minder applicaties nodig zijn,

De huidige uitvinding beoogt een oplossing te vinden voor tenminste enkele van bovenvermelde problemen.

SAMENVATTING VAN DE UITVINDING

De uitvinding betreft een werkwijze voor het produceren van een liposomaal preparaat middels emulgatie, waarbij het preparaat liposomen bevat met ingekapselde hormonen of ester daarvan volgens conclusie 1. De werkwijze omvat het gebruik van een rotor- stator emulgator voorzien van een stator met perforaties met specifieke kenmerken.

3 BE2022/5374

In een tweede aspect betreft de uitvinding een liposomaal preparaat omvattende liposomen met ingekapselde hormonen of esters daarvan volgens conclusie 10,

In een derde aspect betreft de uitvinding een liposomaal preparaat voor gebruik in hormoontherapie of voor gebruik in de behandeling van een patiënt die hormoontherapie nodig heeft volgens conclusie 14.

In een vierde aspect betreft de uitvinding een liposomaal preparaat voor gebruik in de behandeling van hypogonadisme en/of bijnierinsufficiëntie volgens conclusie 15.

Voorkeurs-uitvoeringsvormen worden besproken in de afhankelijke conclusies.

Het voordeel van de werkwijze voor het produceren van een liposomaal preparaat, het liposomaal preparaat en het gebruik van het liposomaal preparaat volgens de huidig uitvinding, is dat dergelijk preparaat de ingekapselde hormonen of esters daarvan bijzonder efficiënt vrijgeeft. Meer bepaald is een langdurige vrijgave mogelijk, bij voorkeur van minstens 8 tot 32h. Hierdoor kan het aantal applicaties verminderd worden, wat therapietrouw bij de patiënt bevordert en kostenbesparend is.

BESCHRIJVING VAN DE FIGUREN

Figuur 1 geeft schematisch en in vooraanzicht een rotor-stator emulgator weer dewelke gebruikt wordt in de werkwijze voor het produceren van een liposomaal preparaat volgens een uitvoeringsvorm van de uitvinding.

Figuur 2 geeft een schematisch en in zijaanzicht een rotor-stator emulgator weer dewelke gebruikt wordt in de werkwijze voor het produceren van een liposomaal preparaat volgens een uitvoeringsvorm van de uitvinding.

Figuur 3 geeft een experimentele stator weer met perforaties van 1,6 mm, zoals gebruikt in de werkwijze voor het produceren van een liposomaal preparaat volgens een uitvoeringsvorm van de uitvinding en zoals besproken in onderstaande voorbeelden,

Figuur 4 geet een conventionele stator weer met perforaties van 9 mm, zoals besproken in onderstaande voorbeelden.

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING

De uitvinding betreft een werkwijze voor het produceren van een liposomaal preparaal middels emulgatie, waarbij het preparaat liposomen bevat met ingekapselde hormonen of ester daarvan. De werkwijze omvat het gebruik van een rotor-stator emulgator

4 BE2022/5374 voorzien van een stator met perforaties met specifieke kenmerken, De uitvinding betreft ook een liposomaal preparaat en het gebruik van een liposormaal preparaat. Het grote voordeel hiervan, is dat dergelijk preparaat de ingekapselde hormonen of esters daarvan bijzonder efficiënt vrijgeeft. Meer bepaald is een langdurige vrijgave mogelijk, bij voorkeur van minstens gedurende 8 tot 32h. Hierdoor kan het aantal applicaties per dag, week of maand verminderd worden, wat therapietrouw bij de patiënt bevordert en kostenbesparend is.

Definities

Tenzij anders gedefinieerd hebben alle termen die gebruikt worden In de beschrijving van de uitvinding, ook technische en welenschappelijke termen, de betekenis zoals ze algemeen begrepen worden door de vakman in het technisch veld van de uitvinding.

Voor een betere beoordeling van de beschrijving van de uitvinding, worden de volgende i5 termen expliciet uitgelegd. “Een”, “de” en “het” refereren in dit document aan zowel het enkelvoud als het meervoud tenzij de context duidelijk anders veronderstelt. Bijvoorbeeld, “een segment” betekent sen of meer dan een segment,

Wanneer “ongeveer” of “rond” in dit document gebruikt wordt bij een meetbare grootheid, een parameter, een tijdsduur of moment, en dergelijke, dan worden variaties bedoeld van +/-20% of minder, bij voorkeur +/-10% of minder, meer bij voorkeur +/- 5% of minder, nog meer bij voorkeur +/-1% of minder, en zelfs nog meer bij voorkeur +/-0.1% of minder dan en van de geciteerde waarde, voor zoverre zulke variaties van toepassing zijn in de beschreven uitvinding. Hier moet echter wel onder verstaan worden dat de waarde van de grootheid waarbij de term "ongeveer” of “rond” gebruikt wordt, zelf specifiek wordt bekendgemaakt,

De termen “omvatten”, “omvattende”, “bestaan uit”, “bestaande uit”, “voorzien van”, “bevatten”, “bevattende”, “behelzen”, “behelzende”, “inhouden”, “inhoudende” zijn synoniemen en zijn inclusieve of open termen die de aanwezigheid van wat volgt aanduiden, en die de aanwezigheid niet uitsluiten of beletten van andere componenten, kenmerken, slementen, leden, stappen, gekend uit of beschreven in de stand der techniek.

Het citeren van numerieke intervallen door de eindpunten omvat alle gehele getallen, breuken en/of reële getallen tussen de eindpunten, deze eindpunten inbegrepen.

° BE2022/5374 “Hormoontherapie” of “hormonale therapie”, betreft in de huidige context elk soort van therapie waarbij hormonen gebruikt worden bij medische behandelingen, Behandeling met hormoonantagonisten kan ook hormonale therapie of antihormoontherapie worden genoemd. De meest algemene klassen van hormoontherapie zijn oncologische hormoontherapie, hormoonvervangingstherapie (voor de menopauze), androgeenvervangingstherapie (ART, waaronder testosteronvervangingstherapie (TRT)), orale anticonceptiepillen, en transgenderhormoontherapie.

Verschillende soorten hormoontherapie worden hieronder besproken en kunnen allen deel uitmaken van het onderwerp van huidige aanvraag: “Hormoonvervangingstherapie” (HRT), ook bekend als menopauzale hormoontherapie (MHT), is bedoeld voor mensen die lijden aan menopauzale symptomen. Het is gebaseerd op het idee dat de behandeling ongemakken kan voorkomen die worden veroorzaakt door verminderde circulerende cestrogeen- en progesteronhormonen, of in het geval van chirurgisch of voortijdig menopauzale personen, dat het het leven kan verlengen en de Incidentie van dementie kan verminderen, Het omvat het gebruik van een of meer van een groep medicijnen die zijn ontworpen om de hormoonspiegels kunstmatig te verhogen. De belangrijkste soorten hormonen zijn oestrogeen, progesteron of progestativa, en soms testosteron. Het wordt vaak aangeduid als “behandeling” in plaats van therapie. “Hormoonvervangingstherapie” voor mensen met hypogonadisme en intersekse- condities (bv. Klinefelter-syndroom, Turner-syndroom). “Androgeenvervangingstherapie” (ART) bij mannen met een laag testosteronniveau ais gevolg van ziekte of veroudering. Het is een hormoonbehandeling die vaak wordt voorgeschreven om de effecten van mannelijk hypogonadisme tegen te gaan of voor mannen die hun testiculaire functie door ziekte, kanker of andere oorzaken hebben verloren. Het wordt soms gebruikt voor laat-onset hypogonadisme (de zogenaamde “andropauze"}, “Transgender hormoontherapie” voor transgenders introduceert geslachissteroiden die geassocieerd worden met het geslacht waarmee de patiënt zich identificeert (met name testosteron voor transgender mannen en oestrogeen voor transgender vrouwen).

Sommige Intersekse- en niet-binaire personen kunnen ook hormoontherapie ondergaan, Geslachtsoverschrijdende hormoonbehandelingen voor transseksuelen worden in twee hoofdtypen onderverdeeld: feminiserende hormoonbehandelingen en masculiniserende hormoonbehandelingen. Ferminiserende hormoontherapie bij geslachtsveranderingstherapie voor transgendervrouwen, en Masculiniserende hormoontherapie bij geslachtsveranderingstherapie voor transseksuele mannen. “Hormonale therapie bij kanker”, zoals androgeen deprivatie therapie voor mannen met prostaatkanker, oestrogeendeprivatietherapie voor vrouwen met cestrogeenreceptor-

© BE2022/5374 positieve borstkanker, en hoge-dosis cestrogeentherapie voor vrouwen met cestrogeenreceptor-positieve borstkanker. “Chemische castratie” van mannen of zedendelinguenten met parafilieën of hyperseksualiteit, "Grogihormoontherapie” bij een tekort aan groeihormoon. “Vervanging van schildidierhormoon” bij hypothyreoïdie. “Antithyroïdetherapie” bij hyperthyreoidie. “Vervanging van glucocorticoiden en/of mineralccorticoïden” bij aandoeningen zoals de ziekte van Addison. “Antiglucocorticoïdtherapie” bij het syndroom van Cushing. “Insulinetherapie” bij diabetes type 1. “Orale anticonceptiepillen” voor verschillende doeleinden, waaronder geboortebeperking.

De term "patiënt" of “proefpersoon” verwijst naar dieren, bij voorkeur warmbloedige dieren, meer bij voorkeur gewervelde dieren, nog meer bij voorkeur zoogdieren, nog meer bij voorkeur primaten, en in het bijzonder naar menselijke patiënten en niet- menselijke zoogdieren en primaten, De voorkeur gaat uit naar menselijke patiënten, De term omvat proefpersonen die een behandeling nodig hebben, meer in het bijzonder proefpersonen die baat zouden hebben bij behandeling van een bepaalde aandoening.

Dergelijke proefpersonen kunnen, zonder beperking, diegenen omvatten bij wie de genoemde aandoening is vastgesteld, diegenen bij wie de genoemde aandoening dreigt te ontstaan en/of diegenen bij wie de genoemde aandoening dient te worden voorkomen.

De term “behandeling” verwijst zowel naar therapeutische behandeling als naar profylactische of preventieve maatregelen, waarbij het doel is de beoogde pathologische aandoening of stoornis te voorkomen of te vertragen (verminderen). Degenen die behandeling nodig hebben, zijn onder meer degenen die de aandoening al hebben, maar ook degenen die de aandoening dreigen te krijgen of bij wie de aandoening moet worden voorkomen, De termen "behandelen" of “behandeling”, zoals hierin gebruikt, omvatten het verlichten, verminderen of verbeteren van de symptomen van de ziekte of aandoening, het voorkomen van bijkomende symptomen, het verbeteren of voorkomen van de onderliggende metabolische oorzaken van de symptomen, het remmen van de ziekte of aandoening, b.v. het stoppen van de ontwikkeling van de ziekte of aandoening, het verlichten van de ziekte of aandoening, het veroorzaken van regressie van de ziekte of aandoening, het verlichten van een door de ziekte of aandoening veroorzaakte aandoening, of het stoppen van de symptomen van de ziekte of aandoening.

? BE2022/5374 “Organische oplosmiddelen” of "organische solventen” zijn koolstofhoudende stoffen die in staal zijn een of meer andere stoffen op te lossen of te dispergeren. Vele klassen van chemische stoffen worden gebruikt als organische oplosmiddelen, waaronder alifatische koolwaterstoffen, aromatische koolwaterstoffen, aminen, esters, ethers, ketonen, en genitreerde of gechloreerde koolwaterstoffen. Organische oplosmiddelen worden in vele industrieën gebruikt. Zij worden gebruikt in verven, vernissen, lakken, kleefstoffen, lijm, ontvettings- en schoonmaakmiddelen, en bij de productie van kleurstoffen, polymeren, plastics, textiel, drukinkten, landbouwproducten en farmaceutische producten.

Beschrijving

In een eerste aspect betreft de uitvinding een werkwijze voor het produceren van een liposomaal preparaat middels emulgatie, waarbij het preparaat liposomen bevat met ingekapselde hormonen of ester daarvan, De werkwijze omvat minstens een eerste emulgeerstap waarbij een eerste samenstelling geëmulgeerd wordt, Deze eerste samenstelling omvat water, propyleenglycol, een emulgator en een in te kapselen hormoon of een ester van dergelijk hormoon, Voor het emulgeren van deze eerste emulgeerstap wordt een rotor-stator emulgator gebruikt dewelke voorzien is van een stator met perforaties met een diameter begrepen tussen 0,8 en 5 mm. De rotatiesnelheid, ie. de snelheid van de rotatie van de rotor binnenin de stator, dient minstens 6000 rpm te zijn.

Een voorbeeld van dergelijke rotor-stator emulgator, is een Silverson® type L5M-A.

Deze is uitgerust met een roterend schoepenwiel als rotor, omgeven door een ringvormige stator, ook wel shearhead genoemd, met perforaties, waarbij het roterend schoepenwiel zorgt voor het aanzuigen van het te emulgeren mengsel onder de rotor, en het vervolgens centrifugaal uitpersen van het mengsel doorheen de perforaties van de stator, waardoor hoge afschuifkrachten of Van Der Waals krachten ontstaan.

Het voordeel van de werkwijze van huidige uitvinding, is dat het resulterende liposomaal preparaat bij toediening aan een patiént, zoals middels transdermale, intraveneuze of per os-toediening, een stabiele, trage en verlengde afgifte van het ingekapselde hormoon verschaft. Om dergelijk preparaat met liposomen en verlengde afgifte te bekomen, is de diameter van de perforaties van de stator essentieel. Deze dient tussen 0,8 en 5 mm te liggen, bij voorkeur tussen 0,8 en 3 mm. Met de meeste voorkeur is de diameter van de perforaties ongeveer 1,6 mm. De rotatiesnelheid van minstens 6000 rpm optimaliseert het resulterende liposomaal preparaat.

8 BE2022/5374

Deze stabiele, trage en verlengde afgifte van het ingekapselde hormoon, betekent dat constante serumwaarden van het hormoon in het bloed van een patiënt bekomen worden, en dat deze eens ze op een gewenst niveau gebracht zijn relatief constant blijven gedurende minstens Su, minstens 10u, minstens 12u, minstens 14u, minstens 1640, minstens 18u, minstens 20u, minstens 2214, minstens 24u, minstens 26u, minstens 28u, minstens 30u, of minstens 32u, bij voorkeur gedurende minstens 8 tot 32 uur.

Hierdoor kan één enkele applicatie per dag voldoende zijn om de serumwaarden van het hormoon constant, of voldoende constant, te houden, Het verminderen van het aantal nodige applicaties per dag, bevordert de therapietrouw bij de patiënt en is kostenbesparend.

De afstand tussen de perforaties in de stator is bij voorkeur zo dat de kleinste afstand van een eerste perforatie tot een tweede perforatie 0,5 tot 1,5 mm, bij voorkeur ongeveer 1,0 mm, Deze kleinste afstand kan gemeten worden als de kleinste afstand i5 van een rand van een eerste perforatie tot een rand van een tweede perforatie.

Het ingekapselde hormoon kan elk type hormoon zijn, of elk soort ester daarvan, dat ingekapseld kan worden in een liposcom van het liposomaal preparaat van de huidige uitvinding. Volgens een uitvoeringsvorm is het hormoon een geslachtshormoon, bij voorkeur gekozen uit de groep van testosteron, hydrocortison, oestradicl en progesteron, of ester daarvan.

Testosteron is een androgeen met als actieve metabolieten dihydrotestosteron (DHT) en estradiol {EZ}. Oestradiol of estradiol (17B-estradiol) valt in de groep van oestrogenen. Hydrocortison is de naam voor het hormoon cortisol wanneer het als geneesmiddel wordt geleverd. Cortisol is een steroïde hormoon, in de glucocorticoïde klasse van hormonen. Progesteron (P4) is een endogeen steroïde en progestageen geslachtshormoon.

In een uitvoeringsvorm zijn de esters van hormonen dewelke ingekapseld zijn, esters van steroïden of steroïde esters.

In een uitvoeringsvorm zijn de esters van hormonen dewelke ingekapseld zijn, esters van androgenen of androgeenesters. Deze kunnen esters zijn van natuurlijker of synthetische androgenen.

In een uitvoeringsvorm zijn de esters van hormonen dewelke ingekapseld zijn testosteronesters. Testosteronesters omvatten testosteron caproaat, testosteron

9 BE2022/5374 cypionaat, testosterondecanoaat, testosteron enantaat, testosteron isobutyraat, testosteron Isocaproaat, testosteron phenylpropionaat, testosteron propionaat, testosteron undecanoaat, testosteron acetaat, testosteron cyclohexylpropionaat, testosteron enantaat benziinezuur hydrazone, testosteron hexahydrobenzoaat, testosteron hexahydrobenzylcarbonaat, testosteron hexyloxyfenylpropionaat, testosteron ketolauraat, testosteron nicotinaat, testosteron-fenylacetaat, testosteron fosfaat, testosteron undecylenaat, testosteron valeraat, testosteron buciclaat, polytestosteron phloretine fosfaat, testosteron = 17B-(1-({5-(aminosulfonyl)-2- pyridinvi}carbonyl)-L-proline) {EC586), testosteronacetaat-butyraat, testosteronacetaat-propionaat, testosteronbenzoaat ‚testosteronbutyraat, testosteron diacetaat, testosteron dipropionaat, testosteron formiaat, testosteron isovaleraat, testosteron palmitaat, testosteronfenylbutyraat, testosteron stearaat, testosteron succinaat en testosteron sulfaat, Dihydrotestosteronesters omvatten androstanolone benzoaat, androstanolone enantat, androstanolone propionaat, androstanolone valeraat, dihydrotestosteron acetaat, dihydrotestosteron butyraat, dihydrotestosteron formaat en dihydrotestosteron undecanoaat.

Bij voorkeur is het ingekapselde hormoon testosteron propionaat.

In een uitvoeringsvorm zijn de esters van hormonen dewelke ingekapseld zijn, esters van oestrogenen, bijvoorbeeld estradiolesters, estronesters, estriolesters, ethinylestradiol esters en esters van andere oestrogene steroïden,

Voorbeelden van estradiolesters zijn estradiol acetaat, estradiol benzoaat, estradiol! cypionaat, estradiol dipropionaat, estradiol enantaat, estradiol undecylaat, estradiol valeraat, polyestradiol fosfaat, cloxestradiclacetaat, estradiolbenzoaatbutyraat, estradiolbutviacetaat, estradiol dibutyraat, estradiol dienantaat, estradioldiundecylaat, estradioldiundecylenaat, estradiol! furoaat, estradiol hemisuccinaat, estradiolhexahydrobenzoaat, estradiol palmitaat, estradiol fenylpropionaat, estradiol pivaiaat, estradiol propionaat (estradiol! 17B-propionaat}, estradiol propoxyfenyipropionaat, estradiol stearaat, estradiol sulfaat, estramustine fosfaat (estradiol 3-normustine 17B-fosfaat), estradiol 3-furoaat, estradiol 3-propionaat, estradiol 17B-{1-{4-{aminosulfonyljbenzoyl}-L-proline)}, estradiolacetaat benzoaat, estradiol 17B-acetaat, estradiol 17B-benzoaat, estradiolacetylsalicylaat (estradiol 3- acetylsalicylaat), estradiolantranilaat (estradiol 3-antranilaat), estradiol arachidonaat, estradioibenzoaat cyclooctenylether {estradiol 3-benzoaat 17B-cyclooctenylether;

EBCO), estradiol caprylaat (estradiol octanoaat), estradiol cyclooctylacelaat (EZCoA), estradiol decanoaat (estradiol 17B-decanoaat}, estradiol diacelaat, estradiol dibenzoaat,

9 BE2022/5374 estradiol dicypionaat, estradiol dioleaat, estradiol dipalmitaat, estradiol distearaat, estradiol disulfaat, estradio! glucuronide, estradiolsulfaat glucuronide, estradiol linolaat, estradiol oleaat, estradiol fosfaat, estradiol salicylaat (estradiol 3-salicylaat), estradiol sulfamaat (estradiol-3-O-sulfamaat), estradiol undecylenaat, estrapronikaat (estradiol 3-propionaat 17B-nicotinaat}, orestrate (estradiol 3-propionaat 17B-{1- cyclohexenyl)ether), alestramustine (estradiol 3-(bis(2-chioorethyl)carbamaat}, 17- ester met L-alanine), estradiolmosterd (chloorfenacyl estradiol diester), en estromustine = (estron = 17B-3-N-bis(2-chloorethyl)carbamaat, estron-cytostatisch complex)

Voorbeelden van estronesters zijn estrone acetaat, estrone sulfaat, estropipaat, estrone tetraacetylglucosids, estronbenzoaat, estroncyanaat, estron-enanthaat, estronbenzilinezuurhydrazone, estron-glucuronide, estronfosfaat, estronpropionaat, estron-sulfamaat (estron-3-O-sulfamaat}, en estron-oleaat.

Voorbeelden van estriolesters zijn estriol 3-glucuronide, estrioi acetaat benzoaat, estriol glucuronide, estriol succinaat, estriol natriumsuccinaat, estriol sulfaat, estriol sulfaat glucuronide, estriol tripropionaat, polyestriol fosfaat, estriol dihexanoaat, estriol dipropionaat, estriol fosfaat (E3P), estriol sulfamaat (estrioi-3-O-sulfamaat)}, en estriol triacetaat,

Voorbeelden van ethinylestradiol esters zijn ethinylestradiolsulfonaat (ethinylestradiol 3-isopropylsulfonaat), ethinylestradiolbenzoaat - de 3-benzoaat ester van ethinylestradici, ethinylestradiol N‚N-diethylsulfamaat - de 3-(N,N-diethyl}suifamaat ester van ethinylestradiol, ethinylestradiol pyrrolidinosulfonaat - de 3- pyrrolidinosulfonaat ester van ethinylestradiol, ethinylestradio! sulfamaat - de 3- sulfamaat ester van eïhinylestradiol, en ethinylestradiol sulfaat.

Een voorbeelden van esters van andere steroïde oestrogenen is hydroxyestron diacetaat,

In een uitvoeringsvorm zijn de esters van hormonen dewelke ingekapseld zijn, esters van corticosteroiden, waaronder natuurlijke en synthetische corticosteroïden.

Natuurlijke corticosteroïden zijn bijvoorbeeld esters van desoxycorton, hydrocortison esters, en esters van andere natuurlijke corticosteroïden.

“U BE2022/5374

Voorbeelden van esters van desoxycorton zijn desoxycortonacetaat, desoxycortoncypionaat, desoxycorton-enanthaat, desoxycortonglucoside, en desoxycortonpivalaat.

Voorbeelden van esters van hydrocortison zijn Benzodrocortison (hydrocortison 17- benzoaat>, hydrocortamaat (hydrocortison 21-{diethylamino)acetaat}, hydrocortisonaceponaat (hydrocortison 21-acetaat 17a-propionaat), hydrocortisonacetaat, hydrocortison bendazac, hydrocortisonbutepraat (hydrocortison 17a-butvraat 2l-propionaat) hydrocortisonbutyraat (hydrocortisoni7a-butyraat}, hydrocortison21-butyraat, hydrocortisoncypionaat (hydrocortisoncyclopentaan- propionaat), hydrocortisonfosfaat, hydrocortison succinaat {hydrocortison hemisuccinaat), hydrocortison tebutaat, hydrocortison valeraat, en hydrocortison xanthinezuur.

Voorbeelden van esters van andere natuurlijke corticosteroïden zijn 11-

Dehydrocorticosteronacetaat, cortifen (cortodoxon-chioorfenacylester}, cortisoneacetaat, corticosteronacetaat, corticosteronbenzoaat, en cortodoxonacetaat.

Voorbeelden van esters van synthetische corticosteroïden zijn esters van beclomelason, esters van betamethason, esters van clocortolon, esters van dexamethason, esters van fluocinolonacetonide, esters van fluocortolon, esters van fluprednisolon, esters van methylprednisolon, esters van prednisolon, esters van prednison, esters van tixocortol, en esters van triamcinolonacetonide

In een uitvoeringsvorm zijn de esters van hormonen dewelke ingekapseld zijn, esters van progesteron of progesteron derivaten, Deze omvatten esters van 17a- hydroxyprogesteronderivaten waaronder chioormadinonacetaat, cyproteronacetaat, hydroxyprogesteroncaproaat, medroxyprogesteronacetaat, megestrolacetaat, acetomepregenol, anagestonacetaat, chioormethenmadinonacetaat, flumedroxonacetaat, hydroxyprogesteronacetaat, hydroxyprogesteronheptanoaal, methenmadinonacetaat en pentagestronacetaat; esters van 19- norprogesteronderivaten waaronder gestonoron caproaat, nomegestrolacetaat, en segesteronacetaat; en esters van 19-nortestosteronderivaten waaronder etynodiol diacetaat, norethisteronacetaat, norethisteron-enanthaat, norgestimaat, en quingestanolacetaat.

Het gewenste niveau waarop de serumwaarden van een hormoon in het bloed van een patiënt bij voorkeur constant gehouden worden door de stabiele, trage en verlengde afgifte van het ingekapselde hormoon in het liposomaal preparaat varieert per hormoon.

Bij voorkeur is het gewenste minimale niveau totaal testosteron in het bloed bij een volwassen man 800 ng/di en gewenste minimale niveau aan vrije testosteron in het bloed van een volwassen man 15 ng/di. Het gewenste minimale niveau aan vrije testosteron in het bloed van een volwassen vrouw is 1.2 ng/di,

Bil voorkeur is het gewenste minimale niveau cestradiol in het bloed bij een volwassen vrouw dewelke behandeld wordt bij de menopauze die tussen 150 en 250 ng/L en progesteron tussen 15 en 25 ug/l.

De emulgator in de huidige werkwijze kan elk type emulgator zijn. Volgens een voorkeursvorm is de emulgator een fosfatidyicholine uit lecithine, met meer voorkeur een fosfatidylcholine uit lecithine van sojabonen, Een voorbeeld hiervan is

Phospholipon® 90 G, een merknaam voor een zuivere fosfatidyichoiine uit lecithine van sojabonen gestabiliseerd met 0,1% ascorby! palmitaat van Phospholipid GmbH,

Volgens een uitvoeringsvorm wordt de eerste samenstelling voor minstens 15-25 minuten geëmulgeerd, bij voorkeur voor ten minste 18-22 minuten, met meer voorkeur gedurende ongeveer 20 minuten.

Volgens een uitvoeringsvorm van de huidige werkwijze, zijn de polypropyleengiycol en emulgator aanwezig in de eerste samenstelling in een 1:1 verhouding, in een 1:2 verhouding, een 1:3 verhouding, een 1:4 verhouding, een 1:5 verhouding, een 1:6 verhouding, in een 1:7 verhouding, een 1:8 verhouding, een 1:9 verhouding, een 1:10 verhouding, een 2:1 verhouding, een 3:1 verhouding, een 4:1 verhouding, een 5:1 verhouding, een 6:1 verhouding, een 7:1 verhouding, een 8:1 verhouding, een 9:1 verhouding of een 10:1 verhouding.

Het iposomaal preparaat bekomen volgens de werkwijze van een van bovenstaande uitvoeringsvormen is uitermate geschikt voor toediening aan een patiënt per os (PO) of voor intraveneuze (IV) of transdermale toediening.

De werkwijze kan verder een tweede emulgeerstap omvallen waarbij bovenstaande geémulgeerde samenstelling op basis van water, propyieengiycol, een emulgator en een in te kapselen hormoon of een ester van dergelijk hormoon, toegevoegd wordt aan een

19 BE2022/5374 tweede samenstelling en nogmaals geëmulgeerd wordt. De tweede samenstelling omvat glycerine, water en een polymeer. Optioneel wordt voor het emulgeren in de tweede emulgeerstap eenzelfde rotor-stator emulgator gebruikt als voor de eerste emulgeerstap.

Opnieuw zorgt de rotor-stator emulgator met een stator voorzien van perforaties met een diameter begrepen tussen 0,8 en 5 mm, bij voorkeur met een kleinste afstand tussen de perforaties van 0,5-1,5 mm, en bij voorkeur met een rotatiesnelheid van minstens 6000 rpm, ervoor dat een liposomaal preparaat bekomen wordt dat bij toediening, in dit geval topische/transdermale of per os toediening, serumwaarden in het bloed van het toegediende hormoon constant gehouden worden voor een duurtijd van minstens 8-32u. Deze verlengde afgifte van ingekapseld hormoon geeft ook als voordeel dat één enkeie applicatie per dag voldoende kan zijn,

Het polymeer van de tweede samenstelling kan elk soort polymeer zijn gekend door de vakman, dat geschikt is voor gebruik in/voor de productie van dergelijk Hiposomaal preparaat.

Volgens een uitvoeringsvorm is het polymeer van de tweede samenstelling een geneutraliseerd carbomeer, zoals een synthetisch polymeer van acrylzuur, i.e. een polyacrylzuur of carbomer. Een voorbeeld hiervan is Carbopol®, een merknaam voor types carbomeren. Carbomer wordt veelal gebruikt als emulgator en als verdikkingsmiddei om een product smeerbaar te maken, Carbomer wordt onder meer gebruikt om (hydro)geis te vormen, bijvoorbeeld bij gebruik in handgels of kunsttranen.

Carbomeren worden aanduid op basis van hun molecuulgewicht en specifieke bestanddelen, Zo bestaan onder meer Carbomer 910, 934, 940, 941, 934P, 974P en 980.

Gel op basis van Carbomer 980 is bijvoorbeeld uitermate bestemd voor dermaal gebruik.

Dit carbomeer geeft transparantere gels dan de variëteit 574P die aanbevolen is voor buccaal en oraal gebruik, Als neutraliserend bestanddeel kan bijvoorbeeld trometamoi gebruik worden, dewelke verkozen wordt boven triéthanolamine (trolamine) dat secundaire amines kan bevatten die zich, zelfs na aanbrengen op de huid, kunnen omzetten in kankerverwekkende nitrosamines.

Volgens een uitvoerngsvorm wordt de geémulgeerde samenstelling van de eerste samenstelling samen met de tweede samenstelling voor minstens 10 tot 20 minuten

16 BE2022/5374 geëmulgeerd, bij voorkeur voor minstens 12 tot 18 minuten, met meer voorkeur gedurende ongeveer 15 minuten.

Volgens een uitvoeringsvorm van de huidige werkwijze, zijn de polypropyleengiycol en emulgator aanwezig in de eerste samenstelling en de glycerine aanwezig in de tweede samenstelling, aanwezig in een 1:1:1 verhouding, in een 1:1:1, 1:2:1, 1:3:1, 1:4:1, 1:5:1, 1:6:1, 1:7:1, 1:8:1, 1:9:1, 1:10:1, 2:1:1, 2:2:1, 2:13:1, 2:14:01, 2:5:1, 2:6:1, 2:711, 2:8:1, 2:9:1, 2:10:1, 3:1:1, 3:2:1, 3:3:1, 3:4:1, 3:5:1, 3:6:1, 3:7:1, 3:8:1, 3:9:1, 3:10:1, 4:1:1, 4:2:1, 4:3:1, 4:41, 4:5:1, 4:16:1, 4:7:1, 4:8:1, 4:9:1, 4:10:1 5:1:1, 5:2:1, 5:3:1, 5:4:1, 5:5:1, 5:6:1, 5:71:11, 5:8:1, 5:9:1, of 5:10:1 verhouding, of in een 1:1:2, 1:2:2, 1:3:2, 1:4:2, 1:5:2, 1:6:2, 1:7:2, 1:8:2, 1:9:2, 1:10:2, 2:1:2, 2:212, 2:3:2, 2:14:2, 2:5:2, 2:6:2, 2:712, 2:8:2, 2:9:2, 2:10:2, 3:1:2, 3:2:2, 3:3:2, 3:4:2, 3:5:2, 3:6:2, 3:7:2, 3:8:2, 3:9:2, 3:10:2, 4:1:2, 4:2:2, 4:3:2, 4:4:2, 4:5:2, 4:6:2, 4:712, 4:8:2, 4:9:2, 4:10:2, 5:1:2, 5:2:2, 5:3:2, B:4:2, 5:5:2, 5:6:2, 5:7:2, 5:8:2, 5:9:2, 5:10:2 verhouding, of in een 1:1:3, 1:2:3, 1:3:3, 1:4:3, 1:5:3, 1:6:3, 1:713, 1:8:3, 1:9:3, 1:10:3, 2:1:3, 2:2:3, 2:3:3, 2:4:3, 2:5:3, 2:6:3, 2:7:3, 2:8:3, 2:9:3, 2:10:3, 3:113, 3:2:3, 3:3:3, 3:4:13, 3:5:3, 3:6:3, 3:7:3, 3:81:13, 3:9:3, 3:10:3, 41113, 4:2:3, 41313, 4:14:13, 41513, 41613, 4:713, 4:8:3, 4:9:3, 4:10:3, 5:1:3, 5:2:3, 5:3:3, 5:4:3, 5:5:3, 5:6:3, 5:7:3, 5:8:3, 5:9:3 of 5:10:35 verhouding, of in een 1:1:4, 1:2:4, 1:3:4, 1:4:4, 1:5:4, 1:6:4, 1:7:4, 1:8:4, 1:9:4, 1:10:4, 2:1:4, 2:2:4, 2:3:4, 2:4:4, 2:5:4, 2:6:4, 2:7:4, 2:8:4, 2:9:4, 2:10:4, 3:11:4, 31214, 31314, 31414, 3:5:4, 3:6:4, 3:7:4, 3:8:4, 3:9:4, 3:10:4, 4:1:4, 4:2:4, 4:31:34, 4:14:13, 4:5:4, 4:6:4, 4:714, 4:8:4, 4:9:4, 4:10:4, 5:1:4, 5:2:4, 5:3:4, 5:4:4, 5:5:4, 5:6:4, 5:7:4, 5:8:4, 5:9:4, 5:10:4 verhouding, of in een 1:1:5, 1:2:5, 1:3:5, 1:4:5, 1:5:5, 1:6:5, 1:7:5, 1:8:5, 1:9:5, 1:10:5, 2:1:5, 2:2:5, 2:3:5, 2:4:5, 2:5:5, 2:6:5, 2:7:5, 2:8:5, 2:9:5, 2:10:5, 3:1:5, 3:215, 3:3:5, 31415, 3:15:5, 3:6:5, 3:715, 3:8:5, 3:9:5, 3:10:5, 4:1:5, 4:2:5, 4:3:5, 4:4:5, 4:5:5, 4:6:5, 4:7:5, 4:8:5, 4:9:5, 4:10:5, 5:1:5, 5:2:5, 5:3:5, 5:4:5,

B:5:5, 5:6:5, 5:7:5, 5:8:5, 5:9:5 of 5:10:5 verhouding,

De liposomen in het liposomaal preparaat geproduceerd volgens bovenstaande werkwijze in elk van de uitvoeringsvormen, hebben bij voorkeur een diameter of partikelgrootte van 160 tot 180 nm. De partikelgrootte kan gemeten worden door elk van de methoden gekend door een vakman. Zo kan de partikelgrootte en verdeling (zie verder) bijvoorbeeld gerneten worden via een dynamische lichtverstroolingstechniel bij 25 °C en weergegeven als intensiteits-gewogen gemiddelde deeljesdiameter (Z- gemiddeide).

19 BE2022/5374

In een uitvoeringsvorm hebben minstens 99 %, minstens 98 %, minstens 97 %, minstens 96 %, minstens 95 %, minstens 94 %, minstens 93 %, minstens 92 %, minstens 91 %, minstens 90 %, minstens 89 %, minstens 88 %, minstens 87 %, minstens 86 %, minstens 85 %, minstens 84 %, minstens 83 %, minstens 8 2%, minstens 81 %, minstens 80 % van de liposomen in het liposomaal preparaat geproduceerd volgens bovenstaande wekwijze in elke van de uitvoeringsvormen een diameter of partikelgrootte van 160 tot 180 nm.

Het liposomaal preparaat bekomen volgens de werkwijze van een van bovenstaande uitvoeringsvormen waarbij de tweede emulgeerstap inbegrepen is, is uitermate geschikt voor transdermale toediening aan een patiënt.

In een tweede aspect betreft de huidige uitvinding een liposomaal preparaat omvattende liposomen met ingekapselde hormonen of esters daarvan, waarbij het i5 preparaat water, propyleenglycol, een emulgator en in te kapselen hormoon bevat, waarbij de liposomen een enkele dubbellaag hebben, en waarbij minstens 80 % van de liposomen een diameter of partikelgrootte hebben dewelke begrepen is tussen 160 en 180 nm.

In een uitvoeringsvorm hebben minstens 99 %, minstens 98 %, minstens 97 %, minstens 96 %, minstens 95 %, minstens 94 %, minstens 93 %, minstens 92 %, minstens 91 %, minstens 90 %, minstens 89 %, minstens 88 %, minstens 87 %, minstens 86 %, minstens 85 %, minstens 84 %, minstens 83 %, minstens 8 2%, minstens 81 %, minstens 80 % van de liposomen in het liposomaal preparaat van huidige uitvinding een diameter of partikelgrootte van 160 tot 180 nm, gemelen zoals hierboven reeds beschreven.

De groep van de hormonen dewelke ingekapseld zijn in de liposomen omvatten ook esters van hormonen en zijn bij voorkeur gekozen uit geslachtshormonen zoals hierboven reeds beschreven. De emulgator is bij voorkeur zoals hierboven reeds beschreven.

Volgens een uitvoeringsvorm van het liposomaal preparaat zijn polypropyleenglycol en ernuigator aanwezig in een 1:1 verhouding, in een 1:2 verhouding, een 1:3 verhouding, een 1:4 verhouding, een 1:5 verhouding, een 1:6 verhouding, in een 1:7 verhouding, een 1:8 verhouding, een 1:9 verhouding, een 1:10 verhouding, een 2:1 verhouding, een 3:1 verhouding, een 4:1 verhouding, een 5:1 verhouding, een 6:1 verhouding, een 7:1 verhouding, een 8:1 verhouding, een 9:1 verhouding of een 10:1 verhouding.

19 BE2022/5374

Volgens een uitvoeringsvorm omvat het liposomaal preparaat verder glycerine en een polymeer, zoals een geneutraliseerd carbomeer. Het polymeer is bij voorkeur een polymeer zoals hierboven reeds beschreven.

Volgens een verdere uitvoeringsvorm van het liposomaal preparaat zijn polypropyleenglycol, emulgator en glycerine aanwezig in een 1:1:1 verhouding, in een 1:1:1, 1:2:1, 1:3:1, 1:4:1, 1:5:1, 1:6:1, 1:7:1, 1:8:1, 1:9:1, 1:10:1, 2:11:1, 2:2:1, 21311, 21411, 2:51:11, 2:16:1, 2:711, 21811, 21911, 21:10:11, Bijl, 32211, 3:311, 3:4:1, 3:5:1, 3:6:1, 3:7:1, 3:8:1, 3:9:1, 3:10:1, 4:1:1, 4:2:1, 4:3:1, 4:4:1, 4:5:1, 4:6:1, 4:7:1, 4:8:1, 4:9:1, 4:10:1 5:1:1, 5:2:1, 5:3:1, 510401, 5:5:1, 5:6:1, 5:711, 5:8:1, 5:9:1, of 5:10:1 verhouding, of ineen 1:1:2, 1:2:2, 1:3:2, 1:4:2, 1:5:2, 1:6:2, 1:7:2, 1:8:2, 1:9:2, 1:10:2, 2:1:2, 2:2:2, 2:3:2, 2:4:2, 2:5:2, 2:6:2, 2:7:2, 2:8:2, 2:9:2, 2:10:2, 3:1:2, 3:2:2, 3:3:2, 3:4:2, 3:5:2, 3:6:2, 3:7:2, 3:8:2, 3:9:2, 3:10:2, 4:1:2, 4212, 41312, 41412, 4:512, 4:6:2, 4:712, 41812, 4:9:2, 4:10:2, 5:1:2, 5:2:2, 5:3:2, 5:4:2, 5:5:2, 5:6:2, 5:7:2, 5:8:2, 5:9:2, 5:10:2 verhouding, of in een 1:1:3, 1:2:3, 1:3:3, 1:4:3, 1:5:3, 1:6:3, 1:713, 1:8:3, 1:9:3, 1:10:3, 2:1:3, 2:2:3, 2:3:3, 2:4:3, 2:5:3, 2:6:3, 2:7:3, 2:8:3, 2:9:3, 2:10:3, 3:1:3, 3:2:3, 3:3:3, 3:4:3, 3:5:3, 3:6:3, 3:713, 3:8:3, 3:9:3, 3:10:3, 4:1:3, 4:2:3, 4:3:3, 4:4:3, 4:5:3, 4:6:3, 4:7:3, 4:8:3, 4:9:3, 4:10:3, 5:1:3, 5:2:3, 5:3:3, 5:4:3, 5:5:3, 5:6:3, 5:713, B:8:3, 5:9:3 of 5:10:3 verhouding, of in een 1:1:4, 1:2:4, 1:3:4, 1:4:4, 1:5:4, 1:6:4, 1:7:4, 1:8:4, 1:9:4, 1:10:4, 2:1:4, Z:214, 21314, 2:4:4, 2:5:4, 21614, 2:7:4, 2:8:4, 2:9:4, 2:10:4, 3:1:4, 3:2:4, 3:3:4, 3:4:4, 3:5:4, 3:6:4, 3:7:4, 3:8:4, 3:9:4, 3:10:4, 4:1:4, 4:2:4, 4:3:4, 4:4:4, 4:5:4, 4:6:4, 4:7:4, 4:8:4, 4:9:4, 4:10:4, 5:1:4, 5:2:4, 5:3:4, 5:4:4, 5:5:4, 5:61:14, 5:71:14, 5:8:4, 5:9:4, 5:10:4 verhouding, of in een 1:1:5, 1:2:5, 1:3:5, 1:4:5, 1:5:5, 1:6:5, 1:7:5, 1:8:5, 1:9:5, 1:10:5, 2:1:5, 2:2:5, 2:13:5, 2:4:5, 2:5:5, 2:6:5, 2:715, 2:8:5, 2:9:5, 2:10:5, 3:1:5, 3:2:5, 3:3:5, 3:4:5, 3:5:5, 3:6:5, 3:7:5, 3:8:5, 3:9:5, 3:10:5, 4:1:5, 4:2:5, 4:3:5, 4:4:5, 4:5:5, 4:6:5, 4:7:5, 4:8:5, 4:9:5, 4:10:5,

B:1:5, 5:2:5, 5:3:5, 5:4:5, 5:5:5, 5:6:5, 5:7:5, 5:8:5, 5:9:5 of 5:10:5 verhouding.

Het liposomaai preparaat kan gebruikt worden voor toediening ofwel per os (PO) of intraveneus (IV), ofwel topisch via de huid ie. transdermaal, met het doel het ingekapselde hormoon langdurig vrij te stellen in de bloedstroom, Hierdoor zijn de bloedserumwaarden van het hormoon relatief constant over langere tijd, bij voorkeur minstens voor Bu, bij voorkeur minstens 10u, minstens 12u, minstens 14u, minstens 16u, minstens 18u, minstens 20u, minstens 22u, minstens 24u, minstens Z6u, minstens 28u, minstens 30u, of minstens 32u, bij voorkeur gedurende minstens 8 tot 32 uur.

Door het langdurig vrijstellen van het hormoon en het langdurige relatief constant houden van het hormoon in de bloedstroom, kan het aantal applicaties of toedieningen

7 BE2022/5374 van het hormoon verminderd worden. Bij voorkeur is één toediening per dag voldoende om een relatief constante bloedserumwaarde te bekomen en behouden. In een ander voorbeeld zijn 2 of 3 toedieningen per dag nodig om een relatief constante bloedserumwaarde te bekomen en behouden.

Volgens sen uitvoeringsvorm omvat het liposomaal preparaat van de huidige uitvinding geen organische solventen zoals alcoholen waaronder ethanol, isopropanol en methanol.

Een voordeel hiervan is dat door de afwezigheid van dergelijke alcoholen het preparaat veel huidvriendelijker is, en voorkomt dat bij transdermale toediening de huid op de plaats van applicatie uitdroogt en beschadigd raakt, zeker na veelvoudige toediening van het preparaat met ingekapseld hormoon, bijvoorbeeld via een dagelijkse topicale toediening. Daarnaast is methanol bijvoorbeeld zeer toxisch bij per os toediening. Bij per os toediening is het zeer belangrijk dat het preparaat geen methanol bevat. Volgens een andere of verdere uitvoeringsvorm omvat het liposomaal preparaat solventen i5 gekozen uit water, propyleenglycol en glycerine. Zowel propyleenglycol en glycerine hebben een hydraterend effect op de huid, in tegenstelling tot bovenstaande alcoholen zoals ethanol, isopropanol en methanol.

Volgens een uitvoeringsvorm is het Hiposomaal preparaat van huidige uitvinding zoals beschreven in eik van de voorgaande uitvoeringsvormen bekomen middels de werkwijze van huidige uitvinding zoals beschreven in elk van de voorgaande uitvoeringsvormen,

In een derde aspect betreft de huidige uitvinding een liposomaal preparaat voor gebruik in hormoontherapie of voor gebruik in de behandeling van een patiënt die hormoontherapie nodig heeft. In een vierde aspect betreft de huidige uitvinding een liposomaal preparaat voor gebruik in de behandeling van hypogonadisme. In een vijfde aspect betreft de huidige uitvinding een liposomaal preparaat voor gebruik in de behandeling van bijnierinsufficiëntie, Zowel voor het derde, vierde en vijfde aspect, is het liposomaal preparaat zoals beschreven in een van de voorgaande uitvoeringsvormen, bij voorkeur geproduceerd middels een werkwijze zoals hierboven beschreven in een van de voorgaande uitvoeringsvormen. “Hormoontherapie” of “hormonale therapie”, betreft elk soort van therapie waarbij hormonen gebruikt worden bij medische behandelingen. Behandeling met hormoonantagonisten kan ook hormonale therapie of antinormoontherapie worden genoemd. De meest algemene klassen van hormoontherapie zijn oncologische hormoontherapie, hormoonvervangingstherapie {voor de menopauze}, androgeenvervangingstherapie (ART, waaronder testosteronvervangingstherapie

18 BE2022/5374 (TRT), orale anticonceptiepillen, en transgenderhormoontherapie. Verdere soorten hormoontherapie werden hoger reeds beschreven.

Hypogonadisme is een conditie waarbij er een verminderde functionele activiteit is van de geslachtsklieren - de testikels of de eierstokken - die kan leiden tot een verminderde productie van geslachtshormonen. Lage androgeenspiegels (bv. testosteron) worden hypoandrogenisme genoemd en lage oestrogeenspiegels (bv. oestradiol) hypoestrogenisme. Daarnaast is dit ook gelinkt aan abnormaal lage waarden van progestagenen zoals progesteron bij vrouwen. Hypogonadisme, gewoonlijk aangeduid met het symptoom "laag testosterongehalte" of "laag T-gehalte", kan ook leiden tot een afname van andere hormonen die door de geslachtsklieren worden afgescheiden, zoals progesteron, DHEA, anti-Müllerian hormoon, activine en inhibine. De ontwikkeling van het sperma (spermatogenese) en het vrijkomen van de eicel uit de eierstokken (ovulatie) kunnen door hypogonadisme worden belemmerd, wat, afhankelijk van de i5 ernst van de aandoening, kan leiden tot gedeeltelijke of volledige onvruchtbaarheid.

Symptomen van hypogonadisme zijn bijvoorbesid erectiestoornissen, verminderd seksueel verlangen, vermoeidheid, energieverlies, stemmingsdepressie, verminderde cognitie, regressie van secundaire geslachtskenmerken of osteoporose, ongeacht de onderliggende etiologie, Voorbeelden van dergelijke aandoeningen zijn: - Primair (hypergonadotroop) hypogonadisme (aangeboren of verworven): bv. testiculair falen door cryptorchidisme, bilaterale torsie, orchitis, verdwijnend testissyndroom, orchiectomie, het syndroom van Klinefelter, chemotherapie, of toxische schade door alcohol of zware metalen, Mannen met primair hypogonadisme hebben meestal een laag serum testosterongehalte, en gonadotrofinen {follikelstimulerend hormoon [FSH], luteïiserend hormoon [LH]) boven het normale bereik, Het normale bereik van LH en FSH is tussen 2 en 5 mIU/ml. Hogere waarden wijzen op hypogonadisme, terwijl lagere waarden wijzen op hypofysaire problemen of op een inhibitie van het feedbacksysteem door overdosering. - Secundair (hypogonadotroop) hypogonadisme (aangeboren of verworven): Dv. idiopathisch tekort aan gonadotropine of luteïniserend hormoon-releasing hormoon (LHRH — luteinizing-hormone-releasing hormone) of hypofyse-hynothalamus letsel door tumoren, trauma of bestraling, Mannen met secondair hypogonadisme hebben lage serum testosteron niveaus (minder dan 8,5-10,2 nmol/L of 250-300 ng/dL} maar hebben gonadotropines onder of binnen het normale bereik (2-5 miU/mi voor LH en

FSH).

19 BE2022/5374

Een lage testosteronspiegel kan bijvoorbeeld een gevolg zijn van een testiscarcinoom, een varicocoele, een hydrocoele, een cryptorchidie, hypofysair falen, een hogere leeftijd of een iatrogene oorzaak zoals sterilisatie.

Een lage oestrogeenspiegel kan bijvoorbeeld een gevolg zijn van menopauze, hypofysair falen, polycystische ovaria (PCO) of een genetische afwijking waardoor ovaria niet aanwezig/volgroeid zijn.

Een lage progesteronspiegel kan ook een gevolg zijn van menopauze, hypofysair falen, of een genetische afwijking waardoor ovaria niet aanwezig/volgroeid zijn. “Bijnierinsufficlëntie” of “bijnierschorsinsufficiëntie” is een aandoening waarbij de bijnieren, geen of onvoldoende hoeveelheden van de corticosteroïden hormonen produceren, vooral het stresshormoon cortisol, maar ook de aldosteronproductie (een mineralocorticoïd) dat de natrium-, kalium- en waterretentie regelt, kan verstoord zijn.

Zucht naar zout of zoute gerechten als gevolg van het verlies van natrium in de urine door een tekort aan aldosteron is gebruikelijk, Er zijn dre types van bijnierschorsinsufficiëntie. Ten eerste primaire bijnierschorsinsufficiëntie als het gevolg van aantasting van de bijnieren, Dit wordt de ziekte van Addison genoemd. Hierbij is 80% te wijten aan een auto-immuunziekte of auto-immuunadrenalitis, Andere gevallen zijn het gevolg van adrenogenitaal syndroom of een adenoom (goedaardig tumor) van de bijnier, De ziekte wordt idiopathisch genoemd als er geen bekende oorzaak van de bijnierschorsinsufficiëntie is, Secundaire bijnierinsufficiéntie wordt veroorzaakt door aantasting van de hypofyse of hypothalamus, Dit kan te wijten zijn aan een adenoom zoals een hypofysemicroadenoom of een hypothalamustumor, aan het Syndroom van

Sheehan dat wordt geassocieerd met een vermindering van alleen de hypofyse, of aan een verleden hoofdletsel, Tertiaire bijnierinsufficiëntie is te wijlen aan hypothalamus ziekte en vermindering van corticotropine releasing factor (CRF).

Het zal ook duidelijk zijn voor een vakman, dat de huidige uitvinding ook een liposomaal preparaat betreft volgens een van bovenstaande uitvoeringsvormen, voor gebruik in de behandeling aandoeningen gelinkt aan een verlaagde androgeenspiegel, aan een verlaagde oestrogeenspiegel, of verlaagde progestageenspiegel zoals verlaagde progesteronspiegel.

Het zal duidelijk zijn voor een vakman, dat de huidige uitvinding ook een liposomaal preparaat betreft volgens een van bovenstaande uitvoeringsvormen, voor gebruik in de behandeling van aandoeningen gelinkt aan een verlaagde cortisolspiegel of aldosteronspiegel. De huidige uitvinding betreft ook een liposomaal! preparaat betreft volgens een van bovenstaande uitvoeringsvormen, voor gebruik in de behandeling van de Ziekte van Addison, in de behandeling van adrenogenitaal syndroom, in de behandeling van adenoom van de bijnier, In de behandeling van een hypofysemicroadenoom of een hypothalamustumor, in de behandeling van het

Syndroom van Sheehan en/of in de behandeling van hypothalamus ziekte.

Het liposomaal preparaat voor gebruik in elk van voorgaande aspecten, wordt bij voorkeur toegediend aan een patiënt per os (PO), via intraveneuze toediening (IV) of via transdermale toediening. Het liposomaal preparaat voor transdermale toediening werd bij voorkeur geproduceerd middels de werkwijze van huidige uitvinding, waarbij zowel een eerste als tweede emulgeerstap aanwezig zijn.

In een uitvoeringsvorm is een enkele toediening nodig. In een andere uitvoeringsvorm is meer dan één toediening nodig.

Bijvoorbeeld is een enkele toediening per dag voldoende. In een ander voorbeeld zijn meerdere toedieningen per dag nodig, bijvoorbeeld twee, drie, vier of vijf toedieningen per dag. In nog een ander voorbeeld is één toediening per twee, per drie, per vier, per vijf, per zes of per zeven dagen nodig. In nog een ander voorbeeld is één toediening per 10 dagen, per twee weken, per drie weken, per maand nodig.

De huidige uitvinding betreft ook werkwijze voor het behandelen van een patiënt die hormoontherapie nodig heeft, waarbij een linosomaal preparaat volgens één van de voorgaande uitvoeringsvormen toegediend wordt; een werkwijze voor het behandelen van hypogonadisme, waarbij een liposomaal preparaat volgens één van de voorgaande uitvoeringsvormen toegediend wordt; en een werkwijze voor het behandelen van bijnierinsufficiëntie, waarbij een liposomaal preparaat volgens één van de voorgaande uitvoeringsvormen toegediend wordt,

Daarnaast betreft de huidige uitvinding ook een werkwijze voor het produceren van een geneesmiddel voor hormoontherapie, voor het behandelen van een patiënt die hormoontherapie nodig heeft, voor het behandelen van hypogonadisme of voor het behandelen van bijnierinsufficiëntie, waarbij het geneesmiddel een liposomaal preparaat volgens één van de voorgaande uitvoeringsvormen omvat,

In wat volgt, wordt de uitvinding beschreven a.d.h.v. niet-limiterende voorbeelden die de uitvinding illustreren, en die niet bedoeld zijn of geïnterpreteerd mogen worden om

© BE2022/5374 de omvang van de uitvinding te limiteren, Het zal ook duidelijk zijn dat, hoewel volgende voorbeelden betrekking hebben tot een liposomaal preparaat met ingekapseld testosteron, gelijkaardige experimenten opgezet kunnen worden met andere ingekapselde hormonen, bij voorkeur andere ingekapselde geslachtshormonen zoals hierboven reeds besproken,

VOORBEELDEN

Voorbeeld 1: invloed van de afmeting van de perforaties van de stator van een rotor- statoremulgator op bekomen serumwaarden in het bloed van een ingekapseld hormoon

In huidige voorbeeld wordt zowel een liposomaal preparaat bereid middels een werkwijze van huidige uitvinding {geoptimaliseerde werkwijze) als middels een conventionele werkwijze (conventionele werkwijze). Vervolgens werd telkens het i5 bekomen liposomaal preparaat via topische applicatie op de arm van een testpersoon aangebracht (transdermale toediening). Daarnaast werd ook Testarzon®, een commercieel verkrijgbaar niet-liposomale, transdermaal alcoholisch gel met een concentratie van 20 mg testosteron per gram gel getest, en werden de bloedserumwaarden van het ingekapselde hormoon, in huidig experiment testosteron, vergeleken op meerdere tijdstippen.

Geoptimaliseerde werkwijze: de gebruikte experimentele stator heeft perforaties met een diameter van 1,6 mm waarbij de afstand tussen de perforaties 1 mm is. De partikelafmeting van de bekomen liposomen vertoont slechts één piek aan partikels met partikelafmetingen begrepen tussen 160 en 180 nm.

Conventionele werkwijze: de gebruikte conventionele stator heeft één rij met zes perforaties, waarbij de perforaties een diameter van 9 mm hebben, en waarbij de afstand tussen de perforaties 6 mm is. De partikelafmeting van de bekomen liposomen vertoont een piek op 250 nm, op 1900 nm en op 4500 nm,

De partikelafmetingen werden weergegeven als intensiteits-gewogen gemiddelde deeltjesdiameter {Z-gemiddelde) en zijn bepaald met dynamische lichtverstrociingstechniek op een Zetasizer Nanc-Z590 (Malvern Instruments, Malvern,

UK). De liposomale preparaten werden hiervoor met water voor injectie verdund tot een geschikte concentratie voor de meting. In sommige gevallen werd de verdunning gefilterd door een 5 um celluloseacetaat spuitfiiter (Sartorius). De metingen werden uitgevoerd bij 25 °C,

a} Bereiding van een 2,5 % testosteron houdende liposomaal preparaat

Voor 100 ml liposomaal preparaat (verder ook liposomale bereiding genoemd}:

Samenstelling 1:

Propyleenglycol: 10 mil

Phospholipon@S0G: 10mi

Agua purificata: 64,85 mil

Testosteron propionaat: 2,5 mg

Samenstelling 2:

Glycerine: 10 mi

Carbopol®980 2%: 2 mi

Aqua conservans Conc.: 0,65 mil

Propyleenglycol en water worden opgewarmd tot 70 °C in aparte recipiënten. De phospholipon 90G wordt toegevoegd aan de propyleenglycol en laat men hierin smelten.

Daarna wordt testosteron propionaat hieraan toegevoegd, en vervolgens wordt het water eraan toegevoegd. Deze eerste samenstelling wordt een eerste keer geëmulgeerd gedurende 20 min in een rotor-stator emulgator met een gekozen geperforeerde stator (hetzij de experimentele stator, hetzij de conventionele stator) op een hoge snelheid van tenminste 6000 rom.

Vervolgens wordt carbopol met glycerine en aqua conservans gemengd en toegevoegd aan het geëmulgeerd mengsel waarna het mengsel een tweede maal geëmulgeerd wordt gedurende 15 minuten in de rotor-stator emulgator met een gekozen geperforeerde stator (hetzij de experimentele stator, hetzij de conventionele stator) op een hoge snelheid van tenminste 6000 rom. Het bekomen 2,5 % testosteron houdende

Iiposomaal preparaat is nu klaar voor topicale toediening op de huid, met het doel een transdermaal transport van testosteron te bekomen naar het bloed van een testpersoon. b} Toediening van de 2,5 % testosteron houdende liposomale bereiding of Testarzon® aan een tesipersoon

Als testpersoon werd gekozen voor een gemenopauzeerde vrouw van 52 kg, welke geen endogene testosteron productie heeft die mannelijke testpersonen wel hebben en bijgevolg ook geen circadiaans ritme heeft voor testosteron productie, De gemeten serumwaarden in het bloed zijn dan ook uitsluitend te danken aan het testosteron aanwezig in het 2,5% testosteron houdende liposomaal preparaat of in Testarzon®.

De metabolisatie van testosteron naar androstaandiol-glucuronide werd geminimaliseerd door de inname van 5 mg finasteride door de testpersoon. De testpersoon smeerde de testosteron houdende liposomale bereiding op de binnenkant van de armen voor een hoeveelheid van 1 ml van een linosomale bereiding met 2,5% testosteron, het equivalent van 25 mg testosteron; of 1,25 g Testarzon® met een concentratie van 20 mg testosteron per gram transdermaal gel, ook het equivalent van 25 mg testosteron.

Toediening gebeurde twee dagen op rij om Su ’s ochtends. Bloedafnames gebeurden vanaf lu na de toediening met intervallen van 1u. c} Gemeten resultaten

De metingen van de bloedstalen worden weergegeven in onderstaande tabellen, waarin: - dehydro-epiandrosteron (DHEA) in ug/di, - testosteron totaal (Testosteron) in ng/di, - sexhormoon bindend globuline (SHBG} in nmol/t, - vrije testosteron (Testo vrij} in ng/di, en - androstaandiol-glucuronide (Andro-gluc) in ng/di uitgedrukt worden.

DHEA is een precursor van testosteron;

SHBG is een glycoproteïne dat een bindingseiwit is, ook dragereiwit of carrier gencemd, dat bindt aan androgenen (testosteron, dihydrotestosteron en DHEA) en aan cestrogenen.

Test I: 1 mi liposomaie bereiding van 2,5% testosteron bereid met een experimentele stator met perforaties van 1,6 mm, het equivalent van 25 ma testosteron

Dag 1 liposomale bereiding van 2,5% testosteron; transdermale toediening om Ou gevolgd door een bloedafname elke uur tussen 10u en 17u,

Hormonen Su 10u 17u 12u 13u 14u 15u 16u 17u

DHEA 2 22105 2106 104 OIO 11% 108 105 104

Testosteron 8 16 229 3 4 263 71 9

SHBG | 97 99,9 99,1 99,6 103,1 107,5 1044 105,3

Testo vrij | <0,10 0,13 0,23 0,31 0,34 0,47 0,55 0,69

Andro-gluc. | 0,86 0,52 0,82 0,85 1,89 0,73 0,47 0,63

66 BE2022/5374

Dag 2 liposomale bereiding van 2,5% testosteron; transdermale toediening om Su gevolgd een bloedafname elk uur tussen 10u en 17u. De waarden van de bloedafname van Ou zijn het resultaat van de applicatie van dag 1 om Su.

Hormonen Su 10u 110 12u 134 14u 7150 16u 178

DHEA | 126 122 125 128 1232 132 141 142 125:

Testosteron | 102 158 166 197 214 227 214 2689 267

SHBG | 90 92,2 93,8 98,8 95:8 98,8 100,3 97 85,5

Testo vrij | 2,83 1,42 1,47 1,67 1,87 1,85 1,8 2,46 2,53

Andro-glue. 2,74 1,69 132 08 121 086 12 135 1,29

Test II: 1,25 a Testarzon® met een concentratie van 20 mg testosteron per gram transdermaal gel, het equivaient van 25 mg testosteron.

Testarzon® is een commercieel verkrijgbaar transdermaal alcoholisch gel met een concentratie van 20 mg testosteron per gram transdermaal gel, maar is geen liposomale bereiding. De test I werd herhaald maar nu met Testarzon® aan een dosis equivalent met 25 mg testosteron, of 1,25 g uit een pompje met niet-liposomale alcoholische gel, door dezelfde lestpersoon aangebracht maar na een interval van 10 dagen rust na de vorige test I.

Dag 1 Testarzon® met 25 mg testosteron; transdermale toediening om Su gevolgd door een bloedafname elke uur tussen 10u en 17u.

Hormonen Su 100 17u 12u 13u 14u 15u 16u 17u

CDHEA OO 22126 2124 131 136 128 134 2122 136

Testosteron | 44 64 114 109 121 151 131 129

SHBG | 87,4 87,9 88,6 93,8 91,5 95,7 946 100,9

Tesito vrij | 0,4 0,58 1,05 9,95 1,08 1,31 1,14 1,06

Andro-gluc. | 0,99 0,5 0,43 0,7 1,07 9,89 0,72 0,42

Dag 2 Testarzon® met 25 mg testosteron; transdermale toediening om Su gevolgd een bloedafname elk uur tussen 10u en 17u. De waarden van de bloedafname van Ou zijn het resultaat van de applicatie van dag 1 om Su.

°5 BE2022/5374

De applicatie van de tweede dag gebeurde 1 h voor de eerste bloedafname met dezelfde hoeveelheid Testarzon®. De waarden van de bloedafname van Ou zijn het resultaat van de applicatie van dag 1 om Su.

Hormonen Su 10u 17u 12u 13u 14u 15u 16u 17u

DHEA 000 7 8 1560 LSL 150 158 157 OI

Testosteron | 192 256 198 241 225 212 198 197 180

SHBG | 99,8 105,8 106,1 1048 107,2 107,5 1091 1094 112,4

Tesito vrij 9 1,62 2,07 1,58 1,97 1,77 1,68 1,54 1,52 1,35

Andro-gluc. 9 / / / / / / / / / s

Test IN: Ll miliposomale bereiding van 2,5% testosteron bereid met een experimentele stator met perforaties van © mm, het eguivalent van 25 mg testosteron

De test I werd herhaald maar nu met 1 mi van een liposomale bereiding van 2,5% testosteron, een dosis equivalent met 25 mg testosteron, door dezelfde testpersoon aangebracht maar na een interval van 10 dagen rust na de vorige test IT,

Dag 1 liposomale bereiding van 2,5% testosteron; transdermale toediening om Ou gevolgd door een bloedafname elke uur tussen 10u en 17u.

Hormonen Qu 104 iu 12u 13u 14u 5u 16u 17u

DHEA 1 161 169 174 176 185 188 189° 1983

Testosteron | 19 21 28 32 35 40 37 37

SHBG | 57,3 57,9 57,6 56,9 57,9 58,9 59,2 59.1

Testo vrij | 0,23 0,25 0,34 8,38 0,42 0,47 0,44 0,44

Andro-gluc. | 1,09 0,43 0,85 0,56 0,79 0,56 0,62 0.79

Voor test III werden geen resulaten gemeten op een tweede dag aangezien de testresultaten van dag 1 dermate ondermaats waren dat een tweede dag niet zinvol was. di Vergelijking en interpretatie van de testresultaien

Hieronder worden de testresultaten van de liposomale bereiding van 2,5 % voigens de uitvinding, bereid met een experimentele stator, vergeleken met de testresultaten van het commercieel verkrijgbaar niet-liposomaal transdermaal testosteron gel Testarzon®.

6 BE2022/5374

Een verschillende maar hoge serumwaarde na 32 h op het einde van dag 2 wordt vastgesteld voor de Hiposomale bereiding (LG) volgens de uitvinding en voor het niet- liposomaal gel (TZ) van Testarzon®, nl. - totaal testosteron: 267 ng/di (LG) en 180 ng/di (TZ) - vrij testosteron: 2,53 ng/di (LG) en 1,35 ng/di (T2).

Vergelijkt men de serumwaarde na 8 h op het einde van dag 1 bij toediening van de liposomale bereiding bereid met de experimentele stator (LGexp) met de liposomale bereiding bereid met de conventionele stator (LGcon}, dan blijkt dat 8 h na toediening de volgende serumwaarden gemeten worden: - totaal testosteron: 90 ng/di (LGexp) en 37 ng/di (LGcon) - vrij testosteron: 0,69 ng/di (LGexp} en 0,44 ng/dl (LGcon).

Hieruit blijkt dat het gebruik van de liposomale bereiding geproduceerd middels de werkwijze waarbij de experimentele stator gebruikt wordt, de verkregen serumwaarde 8 h na toediening bijna driemaal hoger liggen voor totaal testosteron en bijna tweemaal hoger liggen voor vrij testosteron dan bij een liposomale bereiding bereid met een conventionele stator.

Vergelijkt men de serumwaarde na 32 h op het einde van dag twee bij toediening van de liposomale bereiding bereid met de experimentele stator (LGexp) met niet- liposomaal alcoholisch gel Testarzon® (TZ), dan blijkt dat 32 h na toediening volgende serumwaarden gemeten worden: - totaal testosteron: 267 ng/di (LGexp)} en 180 ng/di (72) - vrij testosteron: 2,53 ng/di (LGexp) en 1,35 ng/di {TZ}

Hieruit biljkt dat de verkregen serumwaarde 32 h na toediening bijna anderhalf maal hoger ligt voor totaal testosteron en bijna tweemaal hoger ligt voor vrij testosteron dan bij het niet-liposomaal gel Testarzon®.

Gebruikt men echter een conventionele stator met 6 openingen van 9 mm voor het bereiden van de liposomale 2,5 % gel, dan kunnen al na 8 h op het einde van dag 1 geen serum concentraties worden bereikt, vergeljkbaar met deze van het niet- liposomaal testosteron gel Testarzon®.

Volgende serumwaarde na 8 h op het einde van dag 1 werden vastgesteld voor het liposomaal gel met conventionele stator (CS) en voor het niet-liposomaal gel (TZ) van

Testarzon® : - totaal testosteron: 37 ng/di (CS) en 125 ng/d (2 - vrij testosteron: 0,44 ng/di (CS) en 1,06 ng/di (TZ)

Hieruit blijkt dat de conventionele stator niet toelaat de serum concentraties van het niet-liposomaal gel Testarzon® te bereiken, en dit blijkt al na de eerste dag van transdermale toediening.

Met de experimentele stator met perforaties van 1,6 mm volgens de uitvinding kan men de serum concentraties van het niet-liposomale gel Testarzon® wel overtreffen, zodat de huidige uitvinding de mogelijkheid biedt een transdermale niet-liposomale alcoholische gel te vervangen door een transdermale liposomale bereiding die alcoholvrij is, Een voordeel van deze vervanging is dat de behandeling door de afwezigheid van alcohol veel huidvriendelijker is, en voorkomt dat de huid op de armen uitdroogt en beschadigd raakt na veelvoudige toediening van het gewenste hormoon, in casu testosteron, via sen dagelijkse topicale toediening,

UR de metingen blijkt ook dat een hogere serum steady state concentratie van testosteron en vrij testosteron kan bekomen worden met deze experimentele stator, hetgeen impliceert dat: - de liposomen een hoge inkapselefficiéntie vertonen; - de liposomen een hoge huidpenetratie vertonen; - er op de huid na 30 minuten slechts een geringe rest DIJF met een gering contaminatierisico, meer bepaald gering risico op het overdragen van het hormoon naar een derde; - er sprake is van langdurige afgifte van het hormoon door de liposomen gedurende tenminste 32 h: - dat de therapeutisch belangrijke vrije testosteron concentratie in het bioed na 32 h bijna het dubbele is bij gebruik van de liposomale bereiding {2,53 ng/l (LG)) in vergelijking met het alcoholische gel Testarzon® (1,35 na/! (TZ). Di verschi is het resultaat van minstens twee factoren: ten eerste de hogere totale concentratie van totaal testosteron, en ten tweede de lagers concentratie SHBG. Het staal wetenschappelijk vast dat hoe hoger de totale testosteron concentratie is, hoe lager de

SHBG-concentratie wordt.

De werking van de liposomen verkregen met de werkwijze volgens de uitvinding is zeer eenvoudig en als volgt. Het liposomaal preparaat kan topisch worden toegediend voor transdermale toediening, waarbij de lipide dubbellaag in staat is zich te Integreren in en tussen de celmembranen van de huidcellen, zodat de ingekapselde werkzame bestanddelen in het liposoom traag maar langdurig vrijgesteld worden in de huid, of zelfs transdermaal doorheen de huid, tot in de bloedstroom. De liposomale berelding kan ook per os (PO) of Intraveneus (IV) worden toegediend.

Samenvattend biedt het gebruik van de experimentele stator voor het produceren van een liposomaal preparaat met ingekapseld hormoon volgende therapeutische voordelen: - één enkele dosis per dag kan voldoende zijn, hetgeen de therapietrouw bevordert en kostenbesparend is; - mogelijkheid om het hormoon op 0,1 mi nauwkeurig te doseren met een injectiespuit gezien de hoge vloeibaarheid van het bekomen product; - minimaal contaminatierisico, i.e. onvrijwillige doorgave naar een derde persoon; - al na 32 h wordt een stabiele en hoge concentratie van vrij testosteron en totaal testosteron in het bioed bereikt.

Voorbeeld 2: figuurbeschrijving van meerdere rotor-stator emulgators zoals beschreven in voorbeeld 1

Met het inzicht de kenmerken van de uitvinding beter aan te tonen, wordt hier, als voorbeeld zonder enig beperkend karakter, een voorkeur-dragende toepassing beschreven van de werkwijze voor het produceren van een liposomaal preparaat volgens de uitvinding, met verwijzing naar de bijgaande figuren.

In figuur 1 is schematisch en in vooraanzicht een rotor-stator emulgator 1 weergegeven, gebruikt in de werkwijze voor het produceren van liposomaal preparaat volgens een uitvoeringsvorm van de uitvinding, bestaande uit een statief 2 gemonteerd op een sokkel 3 die op een sleunplaat 4 geplaatst is, en een behuizing 5 met motor en bedieningspaneel 6 met regelknoppen om de aandrijfsnelheid en de rotatieduur van een centraal gemonteerde aandrijfas 7 te regelen, De aandrijfas 7 verbindt de motor in de behuizing 5 met een rotor 8 zijnde een schoepenwiel dat roteert binnen een stator 9 zijnde een statische ring met perforaties 10 die zich rond het schoepenwiel in een vaste positie bevindt. De stator 9 wordt in zijn vaste positie gehouden door vier stationaire draagstangen 11, 12, 13, 14 die op een vaste positie aan de behuizing 5 met motor zijn bevestigd.

3 BE2022/5374

In figuur 2 wordt een zijaanzicht van figuur 1 weergegeven, waarbij getoond wordt hoe de aandrijfas 7 met rotor 8 en stator 9 neergelaten kan worden door het verschuiven van de behuizing 5 over het statief 2, zodat de rotor 8 en stator 9 in een recipiënt 15 gevuld met het te emulgeren mengsel gebracht wordt.

In figuur 3 wordt meer in detail een experimentele stator 9 met perforaties van 1,6 mm weergegeven, gemonteerd op een vaste schijf 16, die in zijn vaste positie wordt gehouden door vier stationaire draagstangen 11, 12, 13, 14, De experimentele stator 9 is voorzien van perforaties 10 met een diameter van 1,6 mm met een onderlinge afstand van 1 mm, welke perforaties in horizontale rijen onder elkaar gerangschikt zijn. Het te emulgeren mengsel wordt door de perforaties 10 geperst, door een schoepenwiel aangedreven door de centrale aandrijfas 7. De rotatierichting van de aandrijfas 7 wordt weergegeven door de pijl 17.

In figuur 4 wordt meer in detail een conventionele stator 18 met zes perforaties 10 van 9 mm diameter weergegeven, gemonteerd op een vaste schijf 16, die in zijn vaste positie wordt gehouden door vier stationaire draagstangen 11, 12, 13, 14. De conventionele stator 18 is voorzien van zes perforaties 10 met een diameter van 9 mm en een onderlinge afstand van 6 mm, die samen één horizontale rij vormen op de conventionele stator 18. Het te emulgeren mengsel wordt door de zes perforaties 10 geperst, door een schoepenwiel aangedreven door de centrale aandrijfas 7. De rotatierichting van de aandrijfas 7 wordt weergegeven door de pij! 17.

De huidige uitvinding is geenszins beperkt tot de als voorbeeld beschreven en in de figuren weergegeven uitvoeringsvorm, doch een liposomaal preparaat bereid volgens een van de uitvoeringsvormen van de werkwijze van de uitvinding kan in allerlei uitvoeringsvormen en afmetingen worden verwezenlijkt zonder buiten het kader van de uitvinding te treden, zoals deze in de onderstaande conclusies gedefinieerd is.

Voorbeeld 3: In vitro huidpermeatiestudie

Voorbeelden 3 tot 8 geven verschillende opeenvolgende onderdelen van eénzelfde groot experiment weer. Dit sluit echter niet uit dat enkele van deze onderdelen in een andere chronologische volgorde zouden kunnen uitgevoerd worden.

Voorbeeld 3 betreft een vergelijkende studie van het huidpermeatieprofiel tussen het liposomale preparaat met ingekapseld testosteron van de huidige uitvinding bekomen volgens een werkwijze van de huidige uitvinding en een van referentieproducten

59 BE2022/5374

Testarzon® of Androgel®, dewelke op de commerciële markt beschikbaar zijn. Hiervoor worden in vitro huldbermeatietesten (IVPT — in vitro skin permeation testing) en testen naar depositie in de huid uitgevoerd.

Het doel hiervan is het ontwikkelen van een volledige vergelijking van het huidpermeatieprofiel tussen het liposomale preparaat van de huidige uitvinding en het referentieproduct dat op de markt beschikbaar is, door het uitvoeren van in vitro huidpermeatietesten (IVPT) en een studie naar het gehalte van de drug in de huid. Om de doelstellingen te bereiken, zullen we eerst een hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC) assay voor testosteron (geneesmiddel in beide formuleringen} ontwikkelen en valideren in zowel buffermonsters als huidextractiestalen (taak 1.1}, gevolgd door IVPT- experimenten (taak 1.2) en testosteron huidretentiestudies {taak 1.3}.

Taak 1.1: Ontwikkeling en validatie van een testosteron HPLC-assay

Erzijn in de literatuur veel HPLC-methoden voor testosteron gerapporteerd, waaronder kwantificering in doseringsvormen zoals capsules alsook In serummonsters van patiënten. In huidig experiment wordt gekozen voor de methoden die specifiek voor

IVPT zijn gerapporteerd, meer bepaald wordt het volgende assay geselecteerd:

Isocratische HPLC wordt gebruikt met een een Phenomenex C18 kolom, 5 um, 50 mm x 4,6 mm bij 25 °C. UV-detectie vindt plaats bij 241 nm met een UV/Vis-detector in een

Agilent 1100 HPLC -systeem met ChemsStation-software, Een ontgast mengsel 60:40 van acetonitril en water met een debiet van 1 ml/min wordt als mobiele fase gebruikt.

Testosteron wordt gedetecteerd bij een retentietijd van ongeveer 1,3 min en de limiet van de test bedraagt naar verwachting ongeveer 0,1 ug/mi met een variatiecoëfficiënt (CV) van ongeveer 0,24%. De laagste limiet voor detectie en kwantificering (LOD en

LOO} wordt bepaald, evenals de inter- en intradag-variabiliteit, Onbekende testosteron concentraties in de monsters van de IVPT-tests worden geijkt aan de hand van bekende standaarden.

Taak 1.1 geef dus een gevalideerde HPLC-analysemethode als resultaat.

Taak 1.2: In-vitro huiddoorlatendheidsonderzoek (1 VPT)

Menselijke kadaverhuidmonsters worden verkregen uit erkende weefselbanken in de VS van blanke mannen in de leeftijdsgroep van 20-70 jaar, van de rugzijde van het lichaam en gedermatomeerd tot 500 um. De huid wordt opgeslagen bij -80 °C en wordt niet langer dan een maand voor gebruik bevroren bewaard. De huidmonsters worden vervolgens ontdooid, op maat gesneden en bovenste stratum corneum gemonteerd in verticale statische Franz-diffusiecellen van glas met een donoroppervlak van 0,64 em”

9 BE2022/5374 en een receptorvolume van 5,1 mi. Per groep (referentieformulering en testpreparaat- formulering van de huidige uitvinding) worden minimaal 20 cellen gebruikt, met een totaal van 40 cellen. De cellen worden in een verwarmingsblok van 32 °C geplaatst en gedurende 30 minuten geëquilibreerd. De receptor bevat een geschikte buffer zoals fosfaatgebufferde zoutoplossing en wordt geroerd met magnetische roerstaafjes. De te testen formuleringen op elke huid worden aangebracht op t=0 en er worden monsters (300!) uit het receptorcompartiment van de Franzcel genomen op vooraf bepaalde tijdstippen over een tijd van In totaal 36 uur. Het volume van het monster wordt onmiddellijk vervangen door een gelijk volume receptorbuffer. De monsters worden gefiltreerd met 0,45 um Millipore (Nalgene) filters voordat zij in de HPLC-apparatuur worden geïnjecteerd. Alle monsters worden geanalyseerd met behulp van de gevalideerde HPLC-test die in taak 1.1 is ontwikkeld.

De permeatiegegevens worden uitgedrukt als de cumulatieve hoeveelheid testosteron die per oppervlakte-eenheid over de huidmembranen wordt getransporteerd, als functie van de tijd. Elke permeatiecurve wordt aangepast aan de juiste oplossing van de wel van Fick, waarbij wordt aangenomen dat a) er geen depletie van het geneesmiddel in het donorcompartiment optreedt tijdens de duur van het experiment, b) dat het receptorcompartiment voor "sink"-omstandigheden zorgt en c) dat er op t=0 geen geneesmiddel in de huid aanwezig is. De cumulatieve hoeveelheid geneesmiddel die per opperviakte-zenheid wordt doorgelaten, wordt berekend met vergelijking 1:

UnV + ses CiVs

Qu = ©

Hierin is On de cumulatieve hoeveelheid geneesmiddel die per oppervlakte-eenheid is doorgelaten {ug/cm:)} op verschillende bemonsteringstijdstippen, Cn is de geneesmiddelconcentratie in het ontvangende medium op de verschillende bemonsteringstiidstippen, Ci is de geneesmiddelconcentratie in het ontvangende medium op het ide (n-1) bemonsteringstijdstip, Vr is het volume van de receptoroplossing, Vs is het volume van het afgenomen monster is, en À is het effectieve permealieopperviak van de diffusiecel. De On-waarden worden tegen de tijd uitgezet, waarna de stationaire (steady-state) flux (Jess) berekend wordt uit de helling van het lineaire gedeelte van de grafiek.

De permeabiliteitscoëfficiënt (Kp) wordt berekend met vergelijking 2:

Jss

Kp = Ce (2) waarin CO de aanvankelijke (of initiële} concentratie testosteron in het donorcompartiment is.

3 BE2022/5374

Taak 1.2 geeft dus een kwantificatie van hoeveelheden/concentraties testosteron die door de huidmembranen worden getransporteerd als resultaat.

Taak 1.3: In vitro onderzoek naar de depositie van geneesmiddelen in de huid

Aan het eind van het experiment (36 uur) wordt de huid geoogst en gescheiden in epidermis en dermis en geëxtraheerd voor testosteron, De scheiding van de lagen wordt bereikt door de lengte van het experiment, en de epidermis en dermis kunnen voorzichtig uit elkaar worden gepeld met een chirurgisch pincet. De extractie wordt gevalideerd en uitgevoerd met een combinatie van organische oplosmiddelen, Alle huidextractiestalen worden geanalyseerd met de gevalideerde HPLC-test die in taak 1.1 is ontwikkeld.

Taak 1.3 geeft dus een kwantificatie van de hoeveelheden/concentraties testosteron die uit de leder- en opperhuid worden geëxtraheerd als resultaat.

De statistische significantie wordt bepaald met behulp van ANOVA, terwijl de Students t-test wordt gebruikt om significante verschillen tussen de testmonsters en de referentie te bepalen, Verschillen worden als statistisch significant beschouwd wanneer p < 0,05,

De resultaten worden uitgedrukt in gemiddelden + standaarddeviaties (SD),

Voorbeeld 4: Karakterisering van het liposomaal preparaat van de huidige uitvinding bekomen volgens een werkwijze van de huidige uitvinding, met betrekking tot liposcomdeeltiesgrootteverdeling, zeta potentiaal, deeltjesmorfoiogie, testosteron: belading. insluitingsefficiëntie, en in vitro afgifte (IVRT) van het testosteron.

De belangrijkste doelstelling van dit experiment is het ontwikkelen van een nieuwe liposomale formule (taak 2.1-2) en het volledig karakteriseren van de impact van formule- en procesontwerp. De impact van formule- en procesparameters op de liposcom deeltjesgrootte en -distributie wordt onderzocht, evenals de zeta potentiaal in

Taak 2.3. De gegevens leveren informatie op over de uniformiteit van de liposomaie deeltiesgrootte binnen het liposomaal preparaat en ook de waarden van de lading op de liposomale vesikels (indien aanwezig). Bovendien wordt de morfologie van de deeltjes, de geneesmiddellading en de insluilingsefficiëntie onderzocht in taak 2.4. In

Taak 2.5 wordt de in vitro afgifte (IVRT) van testosteron uit pilootformules onderzocht.

Deze gegevens tonen de consistentie van de testosteronafgiite van het preparaat van de huidige uitvinding alsook hoe de hoeveelheden van het geneesmiddel zich verhouden tot de tijd, Deze bermonsteringstiidstippen worden uitgevoerd tot een afgiftepiateau is bereikt, wat de maximale hoeveelheid geneesmiddel aangeeft dat het preparaat van de

99 BE2022/5374 huidige uitvinding kan vrijgeven uit zijn preparaat-micro-omgeving. Tenslotte wordt een reologische studie uitgevoerd als taak 2.6.

Jaak 2.1: Pre-formulatiedata met betrekking tot optimale excipiënten en additieven/

Compatibiliteitssiudie

Liposoomformules bestaan voornamelijk uit de werkzame stof en fosfolipiden, maar bevatten ook andere functionele ingrediënten zoals penetratieversterkers, pH-regelaars en stabilisatoren. Deze bepalen mee de eigenschappen van liposoomgeneesmiddelen en beïnvloeden de kwaliteit, farmacokinetische en farmacodynamische eigenschappen, en het veiligheidsprofiel van het liposcomgensesmiddel.

Een pre-formulatie literatuurstudie legt zich toe op de selectie van de juiste concentratie en kwaliteit van fosfolipiden, stabilisatoren, penetratieversterkers en andere excipiénten.

Verder is een studie naar de compatibilitet van de geselecteerde hulpstoffen/excipiénten gepland. In een eerste fase worden binaire mengsels bereid, op stabiliteit gebracht en gecontroleerd of er degradatie wordt waargenomen. Het doel van de studie is om uitgebreid het effect van een breed scala van hulpstoffen op de stabiliteit van testosteron te onderzoeken, en dus na te gaan welke hulpstoffen moeten worden vermeden om een stabiele formulering te hebben, Bovendien levert de studie informatie op over de vraag of conserveermiddelen en/of anti-oxidanten kunnen/moeten worden toegevoegd om de formulering te stabiliseren, of dat reeds stabiele formuleringen worden verkregen in combinatie met specifieke excipiénten.

Op basis van de resultaten van deze stabiliteitsgegevens wordt een reeks multicomponent mengsels met geschikte excipiënten bestudeerd, Het onderzoek naar veiligheid en compatibiliteit wordt voortdurend voortgezet om het risico op verrassingen in latere fases te beperken. Een beter begrip van de hulpstoffen en de totale formulering zorgt ervoor dat bepaalde problemen en dure herbewerkingen van formuleringsstappen vermeden worden tijdens het opschalen naar commercialisering.

Wanneer verschillende excipiënten en combinaties van hulpstoffen worden gelest, is een visuele beoordeling van de fysische visusle beoordeling van de fysische eigenschappen een goede eerste screening. pH, viscositeit, dichtheid, assay en homogeniteit worden beoordeeld.

Verschillende kwaliteiten fosfolipiden, stabilisatoren (polymeren zoals Poloxamer en

Carbopo!}, penetratie versterkers (alcoholen, glycolen,...) worden geselecteerd, en er wordt gewerkt aan een rationaliseren van de selectie om de gewenste eigenschappen in onze liposomale formulering te bereiken,

Het is ook van cruciaal belang om te onderzoeken wat de verwachtingen van de patiënten zijn met betrekking tot de kenmerken van het van het product (viscositeit, kleverigheid) en deze te vertalen in de beoogde specificaties voor de ontwikkeling.

Taak 2.2: Formuleringsstudie

Verschillende formuleringen van het liposomaal preparaat van de huidige uitvinding worden onderzocht, dewelke het juiste viscositeits- en stabilteitsprofiel dienen te hebben.

De formuleringsstudie omvat volgende subtaken: - Bepaling van de beoogde producispecificaties, d.w.z. een stabiele en goed gedefinieerde formulering voor topisch (transdermaal) gebruik en met de juiste pH, viscositeit, testosteron concentratie en afgifteprofiel; - Bepalen van rationele kwalitatieve en kwantitatieve formuleringen die geschikt zijn voor gebruik en productiebenadering: raadplegen van literatuur voor vergelijkende producten, selectie van hulpstoffen, bestellen en beoordeling van compatibiliteit; - Uitvoeren van een prototype formulatiestudie op laboschaal - batches met verschillende hulpstoffen worden getest en geëvalueerd.

De formules met de beste eigenschappen (viscositeit, homogeniteit en in-vitro- afgifteprofiel) worden verder onderworpen aan Intensieve karakterisering.

Taak 2.2 geeft dus een innovatieve liposomale testosteronformulering binnen het doelprofiel als resultaat.

Taak 2.3: Liposomale deeltjesgrootte, -verdeling en zelapotentiaal

De gemiddelde grootte van de liposomen en de verdeling worden geanalyseerd met behulp van dynamische lichtverstrooijng (DLS) en een Beckman Coulter (DelsaTM

NanoS}. Het monster wordt zo nodig verdund met het juiste oplosmiddel. De grootte- metingen worden uitgevoerd bij een verstrooiingshoek van 90° bij 25=2 °C.

Het Zetapotentieel wordt gemeten met elektroforetische lichtverstrooing {ELS -

Electrophoretic Light Scattering) (Zetasizer Nano series, Malvern Panalytical,

Westborough, MA}. Alle formuleringsmonsters worden zonder verdere behandeling bij kamertemperatuur geanalyseerd, Alle waarnemingen worden voor de proefformulering in drievoud uitgevoerd.

Taak 2.3 geeft dus de liposomale deeltjesgrootte, deeltjesdistributie en zeta-potentiaal als resultaat,

95 BE2022/5374

Taak 2.4: Morfologie van de deeltjes, belading van het geneesmiddel (testosteron) en insiuitingsefficiëntie van de proefformulering

De dosering van het geneesmiddel en de insluitingsefficiëntie (EE - entrapment efficiency} van liposomale formuleringen zijn kritische parameters die moeten worden geoptimaliseerd omdat ze van invloed zijn op de dosering, de geneesmiddelafgifte en de totale kosten van een liposomale geneesmiddelformulering, Hoe groter de EE, hoe groter de hoeveelheid geneesmiddel die kan worden ingekapseld en getransporteerd naar de doelweefsels.

De geneesmiddellading en EE van de liposomen worden bepaald met een vultrafiltratiemethode. De liposomen (0,5 mil) zullen in een Amicon® Ultra-4 centrifugale filtereenheid worden geplaatst (3000 MWCO, Millipore Centrifugaalfilters, Millipore, MA) en gedurende 10 min. bij 5000 rpm gecentrifugeerd. Het vrije geneesmiddel in het filtraat wordt verdund tot ongeveer 1 mi met een geschikt oplosmiddel en geanalyseerd met de gevalideerde HPLC-methoden beschreven in Voorbeeld 3, Het % EE wordt berekend met de volgende vergelijking:

De — Df

EE% = — x 100 %

De waarin De de totale hoeveelheid testosteron in de liposomen is en Df de hoeveelheid vrij geneesmiddel (testosteron) in het filtraat is, Een andere manier om bovenstaande vergelijking uit te drukken is:

EE(%)} = (hoeveelheid geneesmiddel in liposomen x 100) / hoeveelheid geneesmiddel gebruikt om liposomen te maken

De hoeveelheid geneesmiddel in de liposomen wordt bepaald door de concentratie van het geneesmiddel in de gefilterde liposomen te vermenigvuldigen met het totale liposcomvolume.

Het percentage van de geneesmiddellading wordt berekend zoals hieronder aangegeven: % geneesmiddellading = (hoeveelheid geneesmiddel in liposomen x 100) / (hoeveelheid (geneesmiddel + lipiden) gebruikt bij het maken van de liposomen)

Alle waarnemingen worden in drievoud uitgevoerd voor de proefformulering.

De morfologie van liposomen wordt geobserveerd met behulp van transmissie- elektronenmicroscopie (JEOL JEM- 1230, Japan). Met een ethanoloplossing verdunde monsters worden op koperen roosters aangebracht. Overtollig monster wordt

95 BE2022/5374 verwijderd, en het rooster wordt negatief gekleurd met een druppel fosforrwavelzuur (2% w/v). Het raster wordt grondig aan de lucht gedroogd en de monsters worden geanalyseerd bij 25+2°C,

Taak 2.4 geef dus de morfologie van de deeltjes, belading van het geneesmiddel (testosteron) en insluitingsefficiéntie van de proefformulering

Taak 2.5: Onderzoek naar het vrijkomen van testosteron uit de proefformufering

Een dialysezak (3000MWCO, Sigma, Ronkonkoma, NY) wordt gebruikt om het vrijkomen van testosteron uit de proefformulering te testen. Het celluloseacetaatmembraan wordt vooraf geactiveerd in dubbel gedestilleerd water (molecuulgewicht cutoff 3.000 Da) en in een Franz-diffusiecel (LOGAN FDC-24, Somerset, N]) met een effectief diffusieopperviak van 0,64 cm“ De proefformulering (0,2 ml) wordt in het donorcompartiment toegevoegd en 5 mi vers bereide buffer (met oplosbaarheidsmiddel om de oplosbaarheid van testosteron) wordt toegevoegd aan het receptorcompartiment.

De flesjes worden op 37 + 0,5 °C gehouden en met een magneetstaaf bij 300 rpm geroerd. Het vrijgekomen medium (0,3 mi} wordt opgevangen op 1, 3, 5, 7, 9, 12, 24, 36 en 48 uur (of langer indien nodig) en op elk tijdstip wordt 0,3 ml vers medium teruggeplaatst in het hoofdmedium. De concentratie van testosteron wordt geanalyseerd met gevalideerde HPLC-methoden zoals beschreven in Voorbeeld 1. De hoeveelheid geneesmiddel die vrijkomt uit de formulering wordt berekend met de volgende vergelijking: n—i

Q=(C,.xV+ > C; x Vi )/A {=1 waarin Cn de geneesmiddelconcentratie in het receptormedium op tijdstip n is, Ci de geneesmiddelconcentratie in receptormedium, À het effectieve diffusieoppervlak (0,64 em?), V het volume van het receptormedium (5 mi} en Vi is het bemonsteringsvolume op tijdstip |. Alle waarnemingen worden voor de proefformulering in drievoud (minimaal) uitgevoerd.

Taak 2.5 betreft dus een onderzoek naar de afgifte van testosteron uit de proefformulering.

Taak 2.6: Reologisch onderzoek van de proefformulering van liposomaal testosteron

De oscillerende reologische metingen worden uitgevoerd op een Kinexus Ultra+ (Malvern Pananalytical Ltd. USA) rotationele reometer met rSpace software (ver. 1.75.2326, Malvern Pananalytical Ltd., USA). De monsters worden getest met behulp van een roestvrijstalen plaat-plaatgeometrie (20 mm). De meetspleet wordt ingesteld op 1,0 mm. Voorafgaand aan de experimenten worden de monsters op de onderste plaat geplaatst. Na het neerlaten van de bovenste plaat wordt het overschot met een spatel verwijderd, Elke meting wordt in drievoud uitgevoerd met verse monsters en de gemiddelde waarden van de parameters worden gerapporteerd.

De metingen, waaronder oscillerende spanningsvegen (stress sweeping - SS) en temperatuurvegen (temperature sweeping - TS}, worden achtereenvolgens in één run uitgevoerd. Na plaatsing in de reometer worden de monsters gedurende 2 minuten geéquilibreerd bij 32,0 + 0,5 °C. Daarna wordt het SS-onderzoek uitgevoerd in het bereik van 1,0 - 12,000 Pa, In de tweede stap worden de monsters afgekoeld tot 5,0 + 0,5 °C en wordt een TS-integrator uitgevoerd in het bereik van 5,0 - 30,0 °C, bij een constante spanning van 2,0 Pa. Voor zowel SS- als TS-metingen zal de oscillatiefrequentie op 1,0 Hz worden ingesteld.

De resultaten voor SS-onderzoeken worden gepresenteerd als de afhankelijkheid van opslag- (G') en verlies- (G") moduli vs. oscillatiespanning (T), uitgezet op een logaritmische schaal, Bovendien worden de G' / SG" cross-over punten berekend, De resulaten van temperatuurmetingen worden uitgezet ais G' afhankelijkheid van de temperatuur.

Statistische analyse van de gegevens

De gegevens worden gerapporteerd als gemiddelden + SD. De verkregen resultaten worden geanalyseerd met one-way variantieanalyse (ANOVA} gevolgd door post-hoc

Tukey test. Het statistische significantieniveau in alle tests wordt vastgesteld op 5%.

Alle berekeningen worden uitgevoerd met JMP® Pro 14,2,0 (SAS Institute Inc, Cary,

NC, USA).

Taak 2.5 betreft dus reologische studies van de pilootformulering van het linosomaal preparaat met ingekapseld testosteron van de uitvinding.

Voorbeeld 5: Stabiliteitestudie op het liposomaal preparaat van de huidige uitvinding.

De hoofddoeistelling van huidig experiment is het verder karakteriseren van de piloot liposomale testosteron formulering voor zijn stabiliteit. Dit doel wordt bereikt door de proefformulering te onderwerpen aan twee condities: 25°C/60% relatieve vochtigheid (RH) en 40°C/75% RH voor een periode van 90 dagen (op één batch van de proefformulering}. Voor elke conditie worden de volgende eigenschappen beoordeeld en geregistreerd gedurende de 90 dagen op de volgende tiidstippen van 30, 60 en 90 dagen: a) liposomale grootie en distributie (taak 3.1) en D) het gehalte aan testosteron

98 BE2022/5374 in de formulering (taak 3.2). Het gehalte aan geneesmiddel wordt bepaald met de gevalideerde HPLC-methode zoals beschreven in Voorbeeld 3. Gegevens worden verzameld om een grondig inzicht te krijgen in de stabiliteit onder de verschillende omstandigheden die leiden tot de ontwikkeling van het eindproduct.

Jaak 3.1: Liposomale deeltjesgrootte en -verdeling

De gemiddelde grootte van de liposomen wordt geanalyseerd met behulp van dynamische lichtverstrociing (DLS) en een Beckman Coulter (DelsaTM NanoS). Het monster wordt zo nodig verdund met het geschikte oplosmiddel. De grootte-metingen worden uitgevoerd bij een verstrooiingshoek van 90° bij 25°C+2. Alle formulerings- monsters worden zonder verdere behandeling bij kamertemperatuur geanalyseerd. Alle waarnemingen worden voor de proefformulering in drievoud uitgevoerd.

Taak 3.2: Testosterongehalie van liposomen in de proefformuiering

De hoeveelheid geneesmiddel op elk tijdstip in de vesikels wordt bepaald met behulp van de aanpak en methoden die reeds zijn beschreven in Voorbeeld 4 Taak 2.2. Alle waarnemingen worden in drievoud uitgevoerd voor de proefformulering. Het testosteron wordt geanalyseerd door HPLC met behulp van methoden die zijn beschreven in

Voorbeeld 3.

Statistische analyse van de gegevens

De gegevens worden gerapporteerd als gemiddelden + SD, De verkregen resultaten worden geanalyseerd met one-way variantieanalyse (ANOVA) gevolgd door post-hoc

Tukey test, Het statistische significantieniveau in alle tests wordt vastgesteld op 5%.

Alle berekeningen worden uitgevoerd met JMP® Pro 14.2.0 (SAS Institute Inc, Cary,

NC, USA).

Om de stabiliteit van de proefformule Lijdens opslag te analyseren, wordt een stabiliteitsstudie uitgevoerd bij 25°C/60 RH en 4090/75 RH gedurende een periode van 90 dagen. De inhoud van testosteron in de vesikels en de groctteverdeling worden na 30, 60 en 90 dagen geëvalueerd.

Bovendien wordt een onderzoek tijdens het gebruik uitgevoerd. Het doel van deze studie is het risico te beoordelen van microbiologische besmetting, proliferatie en/of fysisch- chemische degradatie na herhaald openen van de flesjes waarin het liposomaal preparaat bewaard wordt. De flesjes worden elke dag 's morgens geopend en er wordt 1 gram product uit de flesjes genomen om het dagelijks gebruik gedurende 1 week te simuleren, Tussendoor worden de flesjes in beide omstandigheden bewaard en op elk tijdstip gelest. Er worden gegevens verzameld om een grondig inzicht te krijgen van de

99 BE2022/5374 stabiliteit onder de verschillende omstandigheden die leiden tot de ontwikkeling van het eindproduct.

Voorbeeld 6: Optimalisatie van de liposomale formulering en productiemethode (0bD)

Het doel van huidig voorbeeld is tot een zinvol product komen met de juiste kwaliteitsspecificaties om een significant hogere en langdurige biologische beschikbaarheid te bekomen met een superieure steady state van totaal testosteron.

ObD (Quality by Design) is een systematische aanpak die wordt gebruikt om de productkwaliteit te verbeteren, het proces beter te begrijpen en het ondersteunen van adequate naleving van regelgeving voor vehikel-gebaseerde geneesmiddelafgiftesystemen die gewoonlijk wordt gebruikt in de farmaceutische industrie. Het doel van dit onderzoek is het optimaliseren van kritische materiaalattributen en kritische procesparameters om effectief een liposomaal geneesmiddelafgiftesysteem te ontwikkelen voor gebruik in testosteron transdermale applicatie.

De variabelen die in overweging genomen worden zijn de kritische materiaalkenmerken (concentratie en soorten hulpstoffen) en kritieke procesparameters (CPP's) (mengtijd, mengsnelheid en toevoegingssnelheid) variabelen,

De Experimentele Opzet (Design of Experiments - DOE) is een logische benadering van multivariate statistiek die tot doel heeft het wetenschappelijk onderzoek te begeleiden om de effecten van meerdere factoren tegelijk te bestuderen, niet alleen afzonderlijk maar ook op hun interacties. Een full-factoriële experimentele studieopzet stelt onderzoekers in staat om systematisch de respons van verschillende factoren, de relaties tussen factoren en de interacties tussen factoren te bestuderen door de wetenschappelijke fout (scientific error) doeltreffend te kwantificeren. Om de beste fit te selecteren tijdens computermodeliering wordt een statistische tool gebruikt om een gedetailleerd inzicht te krijgen in de verkregen resultaten met behulp van een QbD- benadering.

In de loop der jaren heeft de farmaceutische industrie aanzienijke inspanningen geleverd om de productkwaliieit te waarborgen, de regelgeving na te leven en farmaceutische producten zo kostenefficiënt mogelijk te produceren. Daarom worden geavanceerde processen en technologieën toegepast die een evenwicht vereisen ussen operationele complexiteit en wetenschappelijke vooruitgang. ObD is een nieuwe geavanceerde systematische risico-gebaseerde benadering die op farmaceutica wordt toegepast om formuleringen te ontwikkelen met vooraf gedefinieerde doelstellingen en

69 BE2022/5374 het inzicht in product en proces te intensiveren met verbeterde veiligheid en stabiliteit.

Toepassing van de ObD-benadering wordt geacht een aanzienlijke invloed te hebben op de regelgeving Inzake de kwaliteit van geneesmiddelen in tegenstelling tot oudere empirische processen die een hoger risico op mislukking of suboptimale kwaliteit inhouden. De US Food and Drug Administration (FDA) verzoekt de farmaceutische bedrijven risico-gebaseerde aanpak en ObD-beginselen toe te passen bij de productontwikkeling, van onderzoek en ontwikkeling (R&D) tot de productiecyclus. Dit maakt het een gewenst proces om productmislukking te vermijden tijdens de productie en om te voldoen aan de regelgevingsvereisten (regulatory requirements}.

Taak 4.1: Definiëren van het Quality Target Profile (QTPP) en de Critical Quality

Atributes (COA'5)

Volgens de principes van ObD begint de methodologie met het vaststellen van het

Quality Target Product Profile (OTPP) en het identificeren van de Kritische

Kwaliteitsattributen (KQA's) die nodig zijn om daaraan te voldoen.

Taak 4.2: Analytische ontwikkeling

Analytische methoden die nodig zijn om de specificaties en de fysische en chemische eigenschappen van de formulering te testen na productie worden ontwikkeld en gevalideerd.

Deze methoden omvatten methoden voor het bepalen van het testosterongehalte, en van onzuiverheden in het testosteron (testosteron onzuiverheden assay). Daarnaast worden methoden ontwikkeld voor de bepaling van conserveermiddelen, voor de bepaling van de viscositeit, de pH en de dichtheid.

Taak 4.3: Evaluatie van KMA's en KCP's.

De kritische procesparameters (CPP's) en kritische materiaalkenmerken (KMA's/CMA's} worden geëvalueerd om hun Invioed op de COA's vast te stellen. DOE wordt gebruikt voor risico-evaluatie en -optimalisatie en om de effecten van verschillende variabelen op de respons te begrijpen. Experimentele proeven zuilen gedefinieerd worden door gebruik te maken van full factorial designs om de geoptimaliseerde formulering te bereiken. Het proces wordt uiteindelijk gevalideerd en getest op robuustheid,

Taak 4.4: Microbiologische veiligheid

Aangezien de aanwezigheid van bepaalde micro-organismen In niet-steriele preparaten het potentieel heeft om de therapeutische werking van het product te verminderen of te inactiveren en de gezondheid van de patient negatief te beïnvloeden of te schaden, dient gezorgd te worden voor een lage biologische belasting van de afgewerkte

6 BE2022/5374 doserings-/tosdieningsvorm door de huidige richtlijnen inzake goede fabricagemethoden (Good Manufacturing Practice - GMP) Loe te passen tijdens de vervaardiging, opslag en distributie van het eindproduct. Bovendien zal een methode voor microbisel onderzoek van de formule worden ontwikkeld, uitgevoerd volgens de richtlijnen en gevalideerd.

Taak 4.5: Conserveringseffectietest (Preservative efficacy test - PET)

Een microbieel onderzoek (PET) wordt uitgevoerd op de formulering van het liposomaal preparaat om te garanderen dat het conserveermiddel zijn vermogen om micro- organismen te remmen behoudt en om na te gaan of toevoeging van een conserveermiddel noodzakelijk is In het commerciële product.

Voorbeeld 7: tolereerbaarheidsstudie van het liposomaal preparaat van de huidige uitvinding bij transdermale loepassing.

Het hoofddoel is de cytotoxiciteit en de irritatie te onderzoeken van het geoptimaliseerde liposomale preparaat met ingekapseld testosteron. Humane keratinocyten en fibroblasten worden gebruikt voor de eerste cytotoxiciteitstests in Taak 5.1. Tenslotte wordt een humaan bic-engineered huidmodel over de volledige dikte gebruikt om het irritatiepotentieel van de proefformulering te testen (Taak 5.2). Het algemene doel is om aan te tonen dat de formulering veilig is voor topische huidtoepassingen,

Taak 5.1: Cytotoxiciteit van proefformulering met behulp van een menselijke keratinocyten cellijn (HaCaTs) en menselijke fibroblasten

HaCaT (sen cellijn van menselijke keratinocyten) wordt gekweekt in Dulbecco's Modified

Eagle Medium (DMEM), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine (37°C, 10% CO2, RH 95%). Wanneer 90% confluentie is bereikt, worden de cellen gespoeld met gedestilleerde fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), getrypsiniseerd, en overgeplaatst (passaged} in een 1:4 verhouding. HaCaT's meteen passagegetal lager dan 50 zullen in de studie worden gebruikt, 100 ul HaCaT- celsuspensie wordt toegevoegd aan elke wel in een 96-well-celkweekplaat; de bezaaidichtheid zal ongeveer 2000 cellen per well bedragen (celaantal gemeten met een

Celiometer Auto A4, Nexcelom Bioscience, MA). De cellen worden gedurende 4 uur geïncubeerd om voldoende aanhechting te garanderen, waarna de media in alle weils wordt gewijzigd in de hieronder beschreven experimentele omstandigheden: {a} Proefformulering (met geneesmiddel en liposcom) (in drievoud}; bovendien als controle worden drie weils bereid met celkweekmedium dat liposoomvrije en geneesmiddelvrije formulering/hydrogel, 100% levensvatbaarheidscontroles.

(B) Testosteron opgelost in het kweekmedium met behulp van een oplosmiddel zoals 0,1% v/v DMSO {in hexaplicaten). Celcultuurmedium dat 0,1% v/v DMSO bevat, wordt gebruikt als 100% levensvatbaarheid. (c) Celkweekmedium, celkweekmedium met 10% DMSO, en 10% AlamarBlue® bevattend medium worden toegepast als negatieve controle, positieve controle, en blanco, respectievelijk {in hexaplicaten}.

Cellen die aan deze experimentele omstandigheden worden onderworpen, worden gedurende 3 dagen in cultuur gebracht, waarna de levensvatbaarheid van de cellen wordt gemeten met behulp van de AlamarBlue® metabolic assay. Celcultuurmedium met 10% AlamarBlue® -reagens wordt toegevoegd en de fluorescentie-intensiteit wordt gemeten (560nm/590nm; handmatige versterking 97%) wanneer de negatieve controles roze beginnen te keuren.

De cytotoxiciteitsgegevens en de halfmaximale inhibitieconcentratie (IC50) worden bepaald volgens het protocol dat samen met het AlamarBlue® -assayreagens (AbD

Serotec) wordt geleverd.

Het bovenstaande protocol (indien nodig aangepast) wordt toegepast voor een tweede studie, maar dit keer zullen menselijke fibroblasten worden gebruikt in plaats van de

HaCaT's.

Opdracht 5.2: In-vitro huidirritatietesi met behulp van een driedimensionaal

EpiDermFT-huidmodel

MTT Assay op het 3D EpiDermFT huidmodel:

De in-vitro-irritatiestudie zal worden uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant

MatTek Corporation, Ashland, MA, VS. Het EpidermFT-huidmodel is een driedimensionaal menselijk huidmodel met intacte huidbarrièrefunctie en is opgebouwd uit menselijke huidcellen (fibroblasten en keratinocyten) en bevat alle lagen van de huid: stratum corneum, epidermis en dermis. Het model heeft geen aanhangsels (haarfoilikeis en zweetklieren} of een microcapillaire bloedcirculatie, De EpiDermFT gereconstrueerde menselijke huidplaat wordt overnacht bij 37 °C en 5% CO: in een vochtige incubator, Vervolgens worden de proefformulering met geneesmiddel (testosteron) ingekapseld in liposomen en testosteron alleen opgenomen in de hydrogel basis, gelbasis, blanco liposomen in de gelbasis, 5% (w/v) natriumdodecylsulfaat (SDS), en Duibecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) gebruikt ais de formulering testmonster, positieve, en negatieve controles, respectievelijk. Alle testformuleringen worden rechtstreeks aangebracht op de top van het 3D-weefsel dat gedurende 60 min wordt blootgesteld. Vervolgens wordt de EpiDermFT gespoeld met gedestilleerd PBS,

vervolgens overgebracht in vers medium en geïncubserd gedurende 42 h. Alle tests worden uitgevoerd in drievoud.

Aan het sind van de incubatie (42 uur) worden de huidweefsels overgebracht in een 24- well-plaat die vooraf is gevuld met 300 ul MTT-medium (1 mg/ml} per well en gedurende 3 uur in een 37 °C, 5% CO2-bevochtigde incubator wordt geplaatst. De huidweefsels worden vervolgens uit het MTT-medium verwijderd. Het formazanzout, dat ontstaat uit de MTT-kleurstof en de levensvatbare celreactie, wordt uit de weefsels geëxtraheerd door ze over te brengen in een plaat met 24 weils die 2 mi isopropanol bevat. De ondergedompelde weefsels worden bij 120 rpm bij kamertemperatuur gedurende 2 uur geschud. Na de extractieperiode wordt de optische dichtheid (OD) van het geéxtraheerde formazan bepaald door 200 ul van elke extractieoplossing over te brengen in een nieuwe, optisch heldere plaat met 96 weils. Als blanco wordt isopropanol gebruikt. De OD-waarden worden bepaald met een spectrofotometer bij 570 nm. De procentuele levensvatbaarheid van de cellen wordt berekend met behulp van de volgende vergelijking: % levensvatbaarheid = [OD (monster) x 1001/0D {negatieve controle)

Statistische analyse van de gegevens

De gegevens worden gerapporteerd als gemiddelde + SD. De verkregen resultaten zullen worden geanalyseerd met een one-way variantieanalyse (ANOVA) gevolgd door een post-hoc Tukey test, Het statistische significantieniveau in alle tests zal worden vastgesteld op 5%. Alle berekeningen zullen worden uitgevoerd met JMP® Pro 14.2.0 (SAS Institute Inc. Cary, NC, USA).

Voorbeeld 8: farmacokinetiekstudie van drie formuleringen van het preparaat volgens de huidige uitvinding met verschillende concentraties aan ingekapseld testosteron.

Het doel hiervan is het selecteren van de formulering met de beste concentratie aan testosteron, die het best voldoet aan de vereiste criteria (onder meer met betrekking tot irritatieprofiel), die geschikt is voor gebruik in verdere studies op mensen, Deze formulering presteert ook beter dan de huidige op de markt-beschikbare producten,

Taak 6.1: Onitwerpsynopsis van de geplande studie

Bestudering van bestaande informatie over andere soortgelijke producten die in ontwikkeling zijn, waaronder regelgeving en markt, bestaande gegevens van klinische proeven, etikettering enz. om een ontwerp-synopsis van de geplande studie op te stellen.

Taak 6.2: Onderzoek bij 5 gezonde proefpersonen.

Voor dit onderzoek moeten de proefpersonen eerst een behandeling ondergaan met een

LHRH (uteïniserend hormoon releasing hormoon) agonist plus een aromatase-remmer om hun endogene testosteron productie volledig uit te schakelen. Dit is de beste manier om zich voor te bereiden op de PK-studie.

Testosteron-bloedspiegelbepaling wordt uitgevoerd middels LC:MS.

Het is verondersteld dat de huidige uitvinding niet beperkt is tot de uitvoeringsvormen die hierboven beschreven zijn en dat enkele aanpassingen of veranderingen aan de beschreven voorbeelden kunnen toegevoegd worden zonder de toegevoegde conclusies te herwaarderen. Bijvoorbeeld, de huidige uitvinding werd beschreven met verwijzing naar testosteron, maar het mag duidelijk zijn dat de uitvinding kan toegepast worden (mits aanpassingen aan het testprotocol)}) op een ander hormoon, zoals maar niet geïmiteerd tot één der geslachtshormonen in de bovenstaande uitvoeringsvormen beschreven.

Claims (16)

CONCLUSIES

1. Een werkwijze voor het produceren van een liposomaal preparaat middels emulgatie, waarbij het preparaat liposomen bevat met ingekapselde hormonen of ester daarvan, omvallende: a) een eerste emulgeerstap waarbij een eerste samenstelling geëmulgeerd wordt, de eerste samenstelling omvattende water, propyleenglycol, een emulgator en een in te kapselen hormoon; en optioneel b} een tweede emulgeerstap waarbij de geëmulgeerde samenstelling van stap a) toegevoegd wordt aan een tweede samenstelling en geëmulgeerd wordt, de tweede samenstelling omvattende glycerine, water en een polymeer, met het kenmerk dat voor het emulgeren van de eerste emulgeerstap, en optioneel voor het emulgeren van de tweede emulgeerstap, een rotor-stator emulgator gebruikt wordt dewelke voorzien is van een stator met perforaties met een diameter begrepen tussen 0,8 en 5 mm, en waarbij de rotatiesnelheid minstens 6000 rpm is.

2. De werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de hormonen geslachtshormonen of esters daarvan zijn, bij voorkeur gekozen uit de groep van testosteron, hydrocortison, oestradiol en progesteron en esters daarvan.

3. De werkwijze volgens één der conclusies 1 tot 2, waarbij perforaties van de stator een diameter hebben begrepen tussen 0,8 en 3,0 mm, en optioneel waarbij een kleinste afstand van een eerste tot een tweede perforatie 0,5 tot 1,5 mm is.

4. De werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, waarbij 85 % van de liposomen van het liposomale preparaat een diameter of partikelgrootte hebben begrepen tussen 160 en 180 nm.

5, De werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, waarbij de emulgator een fosfatidylcholine uit lecithine is, bij voorkeur een fosfatidylcholine uit lecithine van sojabonen.

6. De werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, waarbij het polymeer een geneutraliseerde carbomeer is zoals Carbomer 980 of Carbomer 974.

7. De werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, waarbij de eerste samenstelling voor minstens 15-25 minuten geëmulgeerd wordt.

8. De werkwijze volgens eén der voorgaande conclusies, waarbij de geëmulgeerde samenstelling van stap a) samen met de tweede samenstelling voor minstens 10 tot 20 minuten geémulgeerd wordt.

9. De werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, waarbij de polypropyleengiycol en emulgator aanwezig zijn in een 1:1 verhouding, en

65 BE2022/5374 optioneel in het geval van een tweede emulgeerstap waarbij de polypropyleenglycol, emulgator en glycerine aanwezig zijn in een 1:1:1 verhouding.

10. Een liposomaal preparaat omvattende liposomen met ingekapselde hormonen of esters daarvan, waarbij het preparaat water, propyleenglycol, een emulgator, een in te kapselen hormoon, glycerine en een polymeer zoals een geneutraliseerd carbomeer omvat, waarbij de liposomen een enkele dubbellaag hebben, en waarbij minstens 85 % van de liposomen een diameter of partikelgrootte hebben dewelke begrepen is tussen 160 en 180 nm.

il. Het liposomaal preparaat volgens conclusie 10, waarbij de polypropyleenglycol en emulgator aanwezig zijn in een 1:1 verhouding, optioneel waarbij polypropyleengiycol, emulgator en glycerine aanwezig zijn in een 1:1:1 verhouding.

12.Het liposomaal preparaat volgens conclusie 10 of 11, waarbij de hormonen geslachtshormonen of esters daarvan zijn, bij voorkeur gekozen uit de groep van testosteron, hydrocortison, cestradiol en progesteron en esters daarvan,

13. Het liposomaal preparaat volgens één der voorgaande conclusies 10 tot 12, bekomen middels een werkwijze volgens één der conclusies 1 tot 9.

14. Het liposomaal preparaat volgens één der voorgaande conclusies 10 tot 13, voor gebruik in hormoontherapie of voor gebruik in de behandeling van een patiënt die hormoontherapie nodig heeft,

15. Het liposomaal preparaat volgens één der voorgaande conclusies 10 tot 13, voor gebruik in de behandeling van hypogonadisme en/of bijnierinsufficiëntie.

16. Liposomaal preparaat voor gebruik volgens conclusie 14 of 15, waarbij het liposomaal preparaat toegediend wordt per os (PO), via intraveneuze toediening (IV) of via transdermale toediening, optioneel waarbij een de toediening één of meermaals herhaald wordt.