ES2715190T3 - Dispositivo de ensayo y lector - Google Patents

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Steven Alexander Keatch
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Abstract

Un método para realizar un ensayo en una muestra, comprendiendo el método: introducir una muestra fluida en un cartucho microfluídico; comprendiendo el cartucho: un sustrato que comprende uno o más canales microfluídicos dispuestos en el mismo y que comprende un agente de unión dispuesto dentro de dicho(s) canal(es) para unir cualquier analito dentro de la muestra, comprendiendo el agente de unión propiedades magnéticas; un puerto de muestra para introducir dicha muestra de fluido en el cartucho; un sumidero de salida de fluido para eliminar fluido de dicho(s) canal(es); una o más características de tope diseñadas para evitar que la muestra u otros líquidos pasen a través de la(s) característica(s) de tope solo por acción capilar y al menos un puerto de entrada de fluido para permitir introducir uno o más fluidos en el cartucho y transportarlos a través del(los) canal(es) microfluídico(s) y/o el aire que se debe ventilar desde el cartucho; permitir que la muestra de fluido se extraiga a través del cartucho, de modo que la muestra de fluido entre en contacto con dicho agente de unión antes de ser detenida por dicha una o más características de tope, por lo que al menos una porción de cualquier analito presente en la muestra está limitada por el agente de unión que comprende propiedades magnéticas; mantener el analito unido en posición utilizando el imán o el campo magnético aplicado por un lector; lavar cualquier material no unido del analito unido utilizando el lector; y detectar de manera fluorescente cualquier analito unido presente en el cartucho; caracterizado por que la etapa de lavado se realiza utilizando solo el aire presente en el cartucho y la detección fluorescente se realiza en el aire.

Description

DESCRIPCION
Dispositivo de ensayo y lector
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a metodos de realizacion de ensayos, usando un cartucho.
Antecedentes de la invencion
El mercado del diagnostico in vitro (DIV) es muy competitivo y hay una necesidad constante en el mercado del DIV para desarrollar pruebas de DIV rapidas, de bajo volumen, precisas y baratas. Esto se combina con el hecho de que existe un fuerte deseo en el mercado de desarrollar pruebas de sangre con puncion capilar en los dedos con una complejidad reducida para el usuario para permitir la penetracion total en el mercado (por ejemplo, puntos de atencion, cirugia medica, hogar, etc.). Este modelo de prueba de DIV con puncion capilar en los dedos ha demostrado ser un gran exito para las pruebas de diabetes y se ha convertido en un mercado de 3,5 miles de millones de dolares (ref: Medical Device Today). El deseo y la capacidad de evolucionar IDV de inmunoensayo hacia el analisis de sangre con puncion capilar en los dedos se ha visto obstaculizado por los desarrollos tecnologicos, sin embargo, esto sigue siendo un objetivo dorado para muchas empresas de diagnostico, ya que permite una menor complejidad y una mayor colocacion de productos en el mercado existente o sin explotar.
El documento US2005/054078 describe un dispositivo de inmunoensayo y un metodo de su uso. Se describe una etapa de lavado que comprende el uso de un fluido de lavado segmentado por segmentos de aire.
Uno de los objetivos de la presente invencion es proporcionar un sistema de ensayo barato y fiable para llevar a cabo pruebas de DIV.
Se encuentra entre los objetivos de la presente invencion proporcionar una plataforma de diseno de cartucho de ensayo y lector que pueda fabricarse facil y economicamente, asi como ser capaz de ser configurado para llevar a cabo un ensayo o ensayos especificados.
Se encuentra entre los objetivos de la presente invencion proporcionar un cartucho de ensayo que pueda adaptarse facilmente para llevar a cabo varios diferentes ensayos especificados.
Se encuentra entre los objetivos de la presente invencion proporcionar un sistema de ensayo que comprenda un lector que, preferiblemente, se pueda usar o adaptar facilmente para realizar varios ensayos diferentes.
Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona un metodo para realizar un ensayo en una muestra, comprendiendo el metodo: introducir una muestra de fluido en un cartucho microfluidico; comprendiendo el cartucho: un sustrato que comprende uno o mas canales microfluidicos dispuestos en el mismo y que comprende un agente de union dispuesto dentro de dicho(s) canal(es) para unir cualquier analito dentro de la muestra, comprendiendo el agente de union propiedades magneticas;
un puerto de muestra para introducir dicha muestra de fluido en el cartucho;
un sumidero de salida de fluido para eliminar fluido de dicho(s) canal(es); una o mas caracteristicas de tope disenadas para evitar que la muestra u otros liquidos pasen a traves de las caracteristicas de tope solo por accion capilar y
al menos un puerto de entrada de fluido para permitir que uno o mas fluidos se introduzcan en el cartucho y se transporten a traves del(los) canal(es) microfluidico(s) y/o el aire que se debe ventilar desde el cartucho; permitir que la muestra de fluido se extraiga a traves del cartucho, de modo que la muestra de fluido entre en contacto con dicho agente de union antes de ser detenida por dicha una o mas caracteristicas de tope, por lo que al menos una porcion de cualquier analito presente en la muestra esta limitada por el agente de union que comprende propiedades magneticas;
mantener el analito unido en posicion utilizando el iman o el campo magnetico aplicado por un lector;
lavar cualquier material no unido del analito unido utilizando el lector; y
detectar fluorescentemente cualquier analito unido presente en el cartucho; caracterizado por que la etapa de lavado se realiza utilizando solo el aire presente en el cartucho y la deteccion fluorescente se realiza en el aire. La descripcion tambien ensena un cartucho de ensayo microfluidico para su uso en la deteccion de un analito en una muestra de fluido, comprendiendo el cartucho:
un sustrato que comprende uno o mas canales microfluidicos dispuestos en el mismo y
que comprende un agente de union dispuesto dentro de dicho(s) canal(es) para unir cualquiera de dicho analito dentro de la muestra;
un puerto de muestra para introducir dicha muestra de fluido en el cartucho;
al menos un puerto de entrada de fluido para permitir que uno o mas fluidos se introduzcan en el cartucho desde un dispositivo lector asociado y se transporten a traves del(los) canal(es) microflmdico(s); y
un sumidero de salida de fluido para eliminar fluido de dicho(s) canal(es).
El cartucho puede comprender ademas un area de detection donde se puede detectar cualquier analito unido. El area de deteccion puede estar contenida dentro del canal de muestra, que es directamente adyacente o aguas abajo del puerto de muestra.
El diseno del cartucho de la presente invention puede adaptarse facilmente para llevar a cabo un numero de ensayos diferentes y, por lo tanto, puede ser considerado como una plataforma de ensayo para diversos ensayos. El cartucho y el(los) canal(es) dispuesto(s) en el mismo pueden formarse de cualquier manera conocida por los expertos en la materia, que pueden incluir fotolitografia, grabado quimico en humedo, ablation por laser, moldeo por inyeccion, estampado y tecnicas de impresion. Sin embargo, en una ensenanza preferida, el cartucho y los canales y otras caracteristicas dispuestas en el mismo estan formados por un emparedado de tres sustratos separados - un sustrato superior, medio e inferior.
El cartucho puede estar formado de cualquier material adecuado, tal como policarbonato, poliester, poliestireno, PMMA, etc., y el/cada sustrato puede estar formado de uno solo o una pluralidad de material(es). En la realization que comprende tres sustratos, el sustrato intermedio comprende un patron cortado a traves del sustrato, que corresponde a ciertas caracteristicas del cartucho, como el(los) canal(es), el puerto de deposito/depositos de fluido, el area del sumidero y similares. Mediante la aplicacion y el emparedado (por ejemplo, mediante termosellado, pegado, grapado y similares), cortando adecuadamente los sustratos superior e inferior, para emparedar el sustrato intermedio entre los sustratos superior e inferior, se puede proporcionar un cartucho en el que se disponen canales y otras caracteristicas. Las aberturas o caracteristicas en el sustrato superior y/o inferior pueden disenarse para ubicarse conjuntamente con las caracteristicas en un dispositivo lector (como se explicara mas adelante), lo que puede facilitar la ubicacion correcta del cartucho en el lector y tambien permitir de manera importante que un fluido, tal como un tampon de lavado, sea introducido desde un deposito/depositos de fluido en el lector al cartucho o muestra a aplicar o aire a ventilar desde el cartucho. El fluido/tampon de lavado o el gas pueden introducirse en el cartucho por medios adecuados tales como una bomba/medios de bombeo en el lector y los medios de transporte de fluido pueden controlar el transporte de fluido dentro del propio cartucho. De este modo, una vez que se ha introducido una muestra en el cartucho, por ejemplo, a traves de una action capilar, el transporte de fluido adicional dentro y a traves del cartucho se controla/facilita mediante los medios proporcionados en el dispositivo lector. Se apreciara que el fluido introducido en el cartucho a traves del puerto de entrada de fluido puede ser un liquido y/o un gas, tal como aire.
Como se identifica, en uso, la muestra se aplica al cartucho a traves de un orificio de introduction de muestra, tal como a modo de accion capilar o por otros medios. En una realizacion preferida, el puerto de introduccion de muestras es una abertura en un lado o cara del cartucho. Deseablemente, el cartucho tiene la forma de un dispositivo plano generalmente delgado que comprende caras superior e inferior y cuatro bordes. En esta disposition, el puerto de introduccion de la muestra se puede formar en uno de los bordes del cartucho, de modo que el usuario solo necesita contactar la muestra con la abertura formada en el borde, para permitir la captation de la muestra en el cartucho. En uso, el usuario contacta la muestra de fluido con el puerto/abertura y, en ciertas realizaciones, debido a las dimensiones de dicho(s) canal(es) dentro del cartucho, el fluido se introduce en el cartucho por accion capilar. Las dimensiones del puerto/abertura de muestra pueden ser mas pequenas que las dimensiones del canal(es). Cuando el liquido se transporta a traves del cartucho, el fluido no se expulsa a traves del puerto de muestra, ya que no hay superficies que mojar. Sin embargo, debido a que el sumidero ofrece una gran area vacia que se puede humedecer, la ruta fluidica preferencial es hacia el sumidero.
Dicho(s) puerto(s) de entrada de fluido del cartucho esta/estan adaptados para colocalizar con una caracteristica en el lector, de manera que un fluido, tal como un tampon de lavado o de gas, tal como aire, contenido en un deposito/depositos dentro del lector, se pueden introducir en el cartucho. Normalmente, el puerto de entrada es simplemente una abertura u orificio dentro de la superficie superior del cartucho. El cartucho puede incluir mas de un puerto de entrada, por lo que se puede agregar un fluido, o fluidos, en diferentes puntos de tiempo y/o ubicaciones dentro del cartucho. Debe entenderse que generalmente se forma un sello hermetico entre cada uno de dichos puertos de entrada del cartucho y una caracteristica, tal como una valvula o tuberia dentro del lector, que puede estar conectada al fluido del deposito.
De manera deseable, dicho(s) canal(es) en el cartucho tambien comprende(n) una o mas caracteristicas de tope de fluido, que estan disenadas para evitar que la muestra y/u otros fluidos pasen a traves de la caracteristica de tope, en virtud de la accion capilar solamente. Es decir, la muestra o cualquier otro fluido puede ser forzado activamente mas alla de dicha(s) caracteristica(s) de tope por una fuerza, tal como la aplicada por una bomba/bombas proporcionadas por el lector. Una caracteristica de tope preferida es un material hidrofobico (por ejemplo, tintas conductoras o no conductoras imprimibles) o un proceso o material que cambia las propiedades de la superficie de una superficie del canal, creando asi un diferencial hidrofilico/hidrofobico (por ejemplo, mediante ablacion con laser, marcado de superficie, elimination de material de la superficie, materiales metalicos evaporados, etc.), que esta disenado para topar/ser una caracteristica de pared o que esta recubierto en una pared del canal. En la realizacion donde los canales se forman en virtud de tres sustratos que se emparedan juntos formando as^ los canales, el material hidrofobo se puede aplicar a los sustratos superior y/o inferior, de manera que cuando los tres sustratos se emparedan juntos, el material de tope hidrofobo forma una caracteristica en la superficie superior y/o inferior de dicho canal.
Tambien se prefiere que una caracteristica de tope se encuentre aguas arriba de la caracteristica de sumidero, con el fin de que la muestra, despues de la aplicacion inicial, no fluya en la caracteristica de sumidero. Solo cuando se aplica una fuerza, tal como la que se proporciona a traves de una bomba, dentro del lector, el fluido puede pasar la caracteristica de tope aguas arriba de la caracteristica del sumidero y, por lo tanto, permitir que el fluido pase al sumidero. El sumidero de salida de fluido esta disenado para ser un area vacia del cartucho en la que se puede evacuar el fluido gastado o el fluido que no se requiere o considera indeseable. Por ejemplo, la sangre completa contiene muchas proteinas y otros agentes que pueden interferir con las reacciones de ensayo y/o la deteccion del analito capturado, por ejemplo, mediante la deteccion de fluorescencia. La presente invencion permite que la union inicial de cualquier analito se lleve a cabo dentro de la muestra de sangre completa, pero todo o sustancialmente todo el material no unido puede ser posteriormente evacuado a la caracteristica del sumidero, permitiendo que se realicen mas reacciones y/o detecciones. en un medio definido o tampon.
Asi como el(los) canal(es) microfluidico, el cartucho de la presente invencion puede comprender una o mas caracteristicas de electrodo que contactan con el canal y, por lo tanto, con la muestra una vez introducida en el cartucho. Los electrodos estan disenados para hacer contacto con los contactos electricos dentro del lector, lo que permite tomar varias lecturas, cuando sea apropiado. Por ejemplo, uno o mas electrodos en el cartucho pueden disenarse para detectar la carga correcta del cartucho y el lector puede indicar al usuario si el cartucho a) ha sido insertado correctamente en el lector y/o la muestra cargada en el cartucho correctamente. El o los electrodos tambien pueden realizar una o mas mediciones electricas en la propia muestra. Por ejemplo, cuando la muestra es una muestra de sangre completa, el o los electrodos pueden realizar una medicion de hematocrito de la muestra, lo que puede ser importante para determinar la concentracion precisa del analito que se detectara. Las mediciones de conductividad y/o impedancia pueden determinarse segun la muestra que se este estudiando. Por lo tanto, los cartuchos de la presente invencion pueden no solo detectar si un analito esta presente o no en una muestra por medio de la union de cualquier analito, sino que tambien pueden realizarse mediciones electricas en la muestra.
La muestra que se aplica al cartucho puede ser cualquier muestra de fluido adecuado. Puede ser, por ejemplo, una muestra de fluido obtenido de un sujeto, tal como sangre completa, plasma, saliva, semen, sudor, suero, menstruacion, liquido amniotico, lagrimas, frotis de tejido, orina, liquido cefalorraquideo, mucosa y similares. Debe apreciarse que los sistemas de ensayo de la presente invencion pueden aplicarse en el area de la salud humana, incluidos los mercados de IVD grandes y en crecimiento (por ejemplo, cancer, cardiologia y enfermedades infecciosas). Los ensayos tambien pueden usarse para probar farmacos y la accion de los farmacos. Sin embargo, el sistema tambien puede aplicarse en entornos donde es deseable detectar, por ejemplo, agentes toxicos o agentes infecciosos, tal como bacterias o virus. Por lo tanto, se pueden tomar muestras de rios o lagos o hisopos de superficies solidas para obtener una muestra de fluido para proporcionar al cartucho. Los sistemas de ensayo tambien pueden utilizarse para aplicaciones veterinarias. Esencialmente, cualquier ensayo en el que se pueda proporcionar una muestra en forma fluida puede utilizarse en la presente invencion.
La muestra puede, por ejemplo, incluir materiales obtenidos directamente de una fuente, tal como una muestra de sangre completa, asi como materiales pretratados usando tecnicas, tales como filtracion, precipitacion, dilucion, destilacion, mezcla, concentracion, inactivacion de agentes interferentes, etc. Estas etapas pueden llevarse a cabo antes de que la muestra se introduzca en el cartucho o el propio cartucho puede realizarlo.
La muestra puede ser introducida antes de que el cartucho se inserte en el lector o despues de que el cartucho haya sido insertado en el lector. El cartucho puede disenarse de modo que la muestra se introduzca por medio de una accion capilar, o en virtud de que se forme un sello entre un puerto de entrada del cartucho y el lector, la muestra puede introducirse activamente en el cartucho por medio de aire que se extrae a traves del(los) canal(es) microfluidico(s) mediante una bomba/bombas en el lector, tal como una bomba/bombas.
El analito a detectar puede ser cualquier analito deseado y pueden incluir proteinas, peptidos, anticuerpos, ácidos nucleicos, microorganismos (tales como bacterias y virus), agentes quimicos, toxinas, farmacos, metabolitos, restos celulares y similares. Por ejemplo, el presente sistema puede adaptarse para detectar cualquier tipo de analito que pueda unirse a un agente de union adecuado. El agente de union puede ser cualquier agente adecuado que sea capaz de unirse especificamente al analito a detectar. Por ejemplo, si el analito es una proteina o peptido, el agente de union puede ser un receptor o anticuerpo que es capaz de unirse especificamente a la protema/peptido. A la inversa, un anticuerpo puede estar unido por una proteina/peptido al cual el anticuerpo esta disenado para unirse especificamente. Los ácidos nucleicos pueden estar unidos por otros ácidos nucleicos que son capaces de hibridar especificamente con el ácido nucleico del analito. Los microorganismos pueden estar unidos por anticuerpos que se unen especificamente a las proteinas en la superficie del microorganismo. Agentes quimicos, toxinas, productos farmaceuticos, metabolitos pueden estar unidos por restos quimicos que son capaces o que reaccionan o se unen a los analitos quimicos mencionados anteriormente a traves de reacciones de union apropiadas, o afinidades. Los expertos en la tecnica conocen bien muchos tipos de tecnicas de union.
Por otra parte, el agente de union puede ser una enzima o un sustrato enzimatico. Por ejemplo, se pueden eliminar analitos como la glucosa a traves de metodolog^as enzimaticas bien descritas, por ejemplo, el producto de reaccion formado despues de que la enzima que reacciona con la glucosa puede detectarse mediante el uso de tecnicas de deteccion electroqmmica u optica conocidas por el experto en la tecnica. Dichas mediciones se pueden realizar como mediciones independientes o en combinacion con otros analitos que se detectaran en la muestra.
El agente de union puede por si mismo unirse directamente a una pared o superficie de dicho canal dentro del cartucho, por union adecuada a la pared o superficie, por ejemplo, a modo de adsorcion fisica, acoplamiento quimico covalente, enlace quimico no covalente (por ejemplo, biotina-avidina) o una combinacion de cualquiera de los anteriores. En una realization preferida, el agente de union es en forma de una particula magnetica o paramagnetica, que comprende un resto de union y el resto de union esta unido por un enlace quimico no covalente (por ejemplo, biotina-avidina) a la superficie de la particula. Realizaciones adicionales tambien podrian incluir la adsorcion fisica, el acoplamiento quimico covalente, el enlace quimico no covalente (por ejemplo, biotina-avidina) o cualquier combinacion de estos a la superficie de un agente magnetico, tal como una particula magnetica. Los agentes/parficulas magneticos que estan funcionalizados para comprender el agente de union unido a los mismos, pueden simplemente depositarse dentro de un canal del cartucho, de modo que al aplicar la muestra al cartucho y ser atraidos hacia el(los) canal(es), los agentes/parficulas magneticas funcionalizadas son resuspendidas por la muestra de fluido y, por lo tanto, entran en contacto con cualquier analito en la muestra. El area de deposition se puede definir especificamente utilizando caracteristicas de tope hidrofobas, a traves de las tecnicas descritas anteriormente para separar esta area del area de deteccion con el fin de garantizar que no se obtengan altas lecturas de fondo debido a componentes de reactivo (por ejemplo, latex fluorescente) que se estan secando en el area de medicion/deteccion.
Como se ha mencionado anteriormente, asi como los agentes de union, el cartucho puede comprender uno o mas reactivos depositados dentro de dicho(s) canal(es) microfluidico(s), cuyos reactivos pueden facilitar la deteccion del analito capturado. Por ejemplo, dicho uno o mas reactivos pueden incluir un marcador que se ha adaptado para unirse especificamente al analito capturado, facilitando asi su deteccion.
El analito unido puede detectarse directamente siempre que el analito unido sea capaz de generar una senal detectable, o en la union del analito puede colocarse una reaccion, para generar un producto de reaccion y el producto de reaccion puede detectarse. Sin embargo, en una realizacion preferida, el analito unido se pone en contacto con un marcador que puede unirse al analito unido y posteriormente se detecta un complejo marcador/agente de union/analito. El marcador puede unirse a un resto de union adicional que tambien es capaz de unirse especificamente al complejo de agente de union/analito. Normalmente, el marcador puede unirse a una portion diferente del analito a la que se une el primer agente de union, o es capaz de unirse a una region del complejo de agente de union/analito que se forma solo en la generation de tal complejo.
El analito unido se puede transportar al marcador dentro de una region del cartucho por medio de los medios de transporte en el lector haciendo que el analito unido se mueva. Alternativamente, un agente o marcador de deteccion se pone en contacto con el analito unido en virtud de una cantidad de fluido que se introduce en el cartucho desde un deposito/depositos de fluido en el lector.
Es deseable que el agente de union y cualquier agente/marcador de deteccion esten en un estado seco cuando se deposita en el(los) canal(es) del cartucho.
En una realización, el agente/marcador de deteccion que esta disenado para facilitar la deteccion del analito esta inicialmente situado aguas arriba (en terminos de la direction de la muestra que fluye en el cartucho despues de la introduction) desde dicha caracteristica de tope. De esta manera, dicho agente de deteccion no entra inicialmente en contacto con la muestra en la aplicacion inicial de la muestra al cartucho. Solo cuando se suministra un fluido tal como un tampon al cartucho a traves del puerto de entrada de fluido, el agente de deteccion se construye con el analito unido. Cuando se introduce un fluido en el cartucho desde el lector, el agente de deteccion puede ser transportado por el fluido en contacto con el analito unido resuspendido y transportado por el fluido, pasando por la caracteristica de tope y en contacto con el analito capturado.
En otra realización, despues de la fase de union inicial entre la muestra y el agente de union y de lavado opcional, el complejo de parficula-analito magnetico dentro de un medio de tampon podria transferirse a una region aguas arriba del canal, donde se encuentra el marcador, en forma seca dentro del canal. El complejo magnetico parficula-analito dentro del medio de tampon resuspenderia/rehidratarta el marcador y permitiria la union del marcador al analito. Este evento de transferencia es posible debido a la capacidad del lector para eliminar con eficacia y precision el aire del canal (que es un sistema sellado). Este metodo puede permitir un mayor control de la rehidratacion de los reactivos depositados y la homogeneidad de la dispersion de reactivos.
En otra realización, el agente de union y el marcador se depositan en el canal de muestra. La muestra rehidrata estos reactivos permitiendo que se produzca la reaccion de union. En esta realización, todos los reactivos pueden entrar en contacto con la muestra, el lector luego acumula los complejos de particulas de analito-marcador magneticos en una region dentro del canal de muestra a traves de la aplicacion de un iman/electroiman. El lector luego expulsa el marcador/muestra sin unir al sumidero usando un lavado con aire. El lector puede utilizar un deposito/depositos de fluido/aire desechable o tambien un deposito/depositos de fluido reutilizable. El complejo magnetico de partfcula-analito-marcador se cuantifica entonces en un entorno de aire.
Cada cartucho puede estar disenado para realizar la deteccion del analito individual o la deteccion de analitos multiples. Ademas, cada cartucho comprende mas de un sistema de canales microfluidicos, de modo que se puede realizar mas de un ensayo utilizando un solo cartucho.
Es deseable que los cartuchos puedan ser producidos facilmente en masa. El cartucho puede proporcionarse en una tira, donde inicialmente se conectan varios cartuchos, por ejemplo, inicialmente juntos, por ejemplo, a traves de un sello perforado. De esta manera, el usuario puede retirar facilmente un cartucho de la tira, antes de usarlo.
Una vez que el cartucho se ha cargado con una muestra, cualquier analito capturado se puede detectar por medio de un lector adecuado. La presente invencion proporciona un lector de este tipo y un aspecto opcional importante de la presente invencion es la provision separada de un deposito/depositos de fluido/tampon dentro del lector. Una ventaja de esto es que los propios cartuchos pueden estar inicialmente "secos", es decir, que contienen poco o ningun liquido dentro del cartucho antes de la aplicacion de la muestra. Esto no solo simplifica la fabricacion de los propios cartuchos, sino que tambien mejora la vida util y permite que muchos de los cartuchos de la presente invencion se almacenen a temperatura ambiente, con poca degradacion de los componentes quimicos o biologicos dentro del cartucho antes de su uso.
En una ensenanza adicional, se ensena un metodo de realizar un ensayo en una muestra, comprendiendo el metodo:
introducir una muestra en un cartucho microfluidico de la presente invencion de manera que cualquier analito presente en la muestra pueda unirse a un agente de union;
lavar cualquier material no unido del analito unido utilizando un fluido o gas adecuado introducido en el cartucho a traves del puerto de entrada; y
detectar cualquier analito unido marcado presente en el cartucho.
En una ensenanza adicional, se ensena un sistema de ensayo para realizar un ensayo en una muestra de fluido, comprendiendo el sistema de ensayo:
a) un cartucho microfluidico de acuerdo con el primer aspecto (o realizaciones preferidas del mismo); y b) un dispositivo lector, comprendiendo el dispositivo lector:
i) un puerto de recepcion para introducir el cartucho en el lector;
ii) un deposito/depositos internos para almacenar un fluido o un gas;
iii) medios para suministrar el fluido o el gas al puerto o puertos de entrada del cartucho una vez insertado dentro del lector, de modo que el fluido o el gas puedan ser transportados a traves del canal(es) microfluidico(s) del cartucho; y
iv) medios de deteccion para permitir la deteccion de cualquier analito unido o un producto de reaccion formado como resultado de la union del analito al agente de union dentro del cartucho.
El lector incluye un puerto de recepcion en el que el cartucho se va a insertar. El lector puede adaptarse para garantizar la correcta insercion del cartucho y esto podria tomar varias formas. Por ejemplo, el cartucho puede ubicarse inicialmente en un mecanismo portador que ingresa al lector, como puede encontrarse en ordenadores para cargar CD y similares. Alternativamente, el puerto de recepcion puede dimensionarse para permitir que se reciba el cartucho y se puede encontrar un elemento de tope interno dentro del lector en el que el cartucho se apoya una vez que se inserta correctamente. Ademas, o alternativamente, las caracteristicas que se encuentran o cortan en la superficie del cartucho pueden disenarse para ubicarse conjuntamente con las caracteristicas que se encuentran dentro del lector y solo una vez que el cartucho este ubicado correctamente en el lector, se podra leer el cartucho.
El deposito/depositos de fluido estan dimensionados preferiblemente de tal manera que mas de un cartucho de muestra puede ser analizado y leido antes de que el fluido en el deposito/depositos necesite ser reemplazado. Es deseable que se puedan realizar muchos ensayos antes de que sea necesario reemplazar el fluido en el deposito/depositos. Alternativamente, en el caso de que el deposito/depositos internos esten llenos de aire, el deposito/depositos no requeriran ser reemplazados, ya que cuando el deposito/depositos fueron expulsados completamente, podrian retraerse a su posicion inicial, extrayendo aire de la atmosfera. En el caso de un deposito/depositos de fluido, el fluido se puede introducir en el deposito/depositos manualmente desde otra fuente. Preferiblemente, el deposito/depositos toman la forma de un cartucho reemplazable, que puede introducirse en el lector cuando sea necesario. Por ejemplo, un usuario puede tener, o estar provisto de, un lector que puede configurarse para realizar varios diferentes tipos de ensayos, pero al usuario se le proporciona un kit que comprende cartuchos de ensayo y un deposito de Kquido/cartucho de depositos que son adecuados para un analito particular o analitos a detectar. De esta manera, antes de su uso, el usuario inserta el cartucho de deposito/depositos de fluido en el lector. El propio cartucho de deposito/depositos puede tener una caracteristica de identificador unico, tal como un dispositivo de codigo de barras o chip, que el lector reconoce que esta asociado con un ensayo particular que es apropiado para los cartuchos de muestra y el cartucho de deposito/depositos, o el usuario puede configurar el lector para realizar un ensayo particular que esta asociado con el cartucho de muestra particular y opcionalmente el cartucho de deposito/depositos. Para algunos ensayos, aunque pueden requerirse cartuchos de muestra fabricados de manera diferente, se puede usar un solo cartucho de deposito/depositos de fluido para realizar varios ensayos diferentes. Es deseable que un solo cartucho de deposito/depositos de fluido pueda contener suficiente fluido para poder realizar muchos ensayos, como mas de 25 o 50 ensayos, antes de que sea necesario reemplazar el cartucho de deposito/depositos. El fluido puede ser un agente de lavado tal como agua, que puede incluir un tampon, tal como PBS, HEPES y similares. Otros fluidos tambien pueden ser adecuados.
De acuerdo con la invention, el agente de union puede estar unido a la superficie de agentes magneticos, tales como cuentas magneticas; se entiende que el lector comprendera un iman permanente o un electroiman que esta disenado para aplicar un campo magnetico o se acercara al mismo o se aplicara un campo magnetico, para concentrar y mantener las particulas magneticas en un area particular de dicho canal microfluidico del cartucho. Esta area puede ser el area de detection. La concentration de las particulas magneticas en un area particular puede servir para facilitar la deteccion de cualquier analito capturado y/o aumentar la sensibilidad de deteccion. Ademas, al mantener las particulas a traves del campo magnetico, tambien permite que el fluido no deseado que rodea el analito unido sea lavado, dejando asi al analito capturado libre de agentes/contaminantes potencialmente interferentes que pueden estar presentes en la muestra inicial. El campo permanente o electromagnetico puede reducirse o aumentarse, por ejemplo, al mover un iman permanente mas cerca o mas alejado del cartucho, o al aumentar o disminuir la intensidad del campo aplicado. Esto puede servir para permitir que las particulas magneticas se "relajen" o se vuelvan menos concentradas en una ubicacion particular, mientras que el campo magnetico todavia las mantiene o no en cierta medida. Esto puede facilitar que se realicen reacciones adicionales sobre las particulas, que pueden realizarse de manera mas eficiente en comparacion con si las particulas magneticas estuvieran concentradas. Tambien puede ser preferible en ciertas aplicaciones que la deteccion se realice cuando las particulas estan menos "concentradas" o relajadas.
En uso, el iman puede usarse para contener cualquier agente unido una vez que el campo magnetico se ha aplicado a la muestra. El fluido procedente del puerto de entrada de fluido puede introducirse en el cartucho y el fluido puede facilitar el lavado por el aire presente en el cartucho, alejar cualquier componente no unido de la muestra y/o permitir que otros reactivos, tal como un agente de deteccion, puedan introducirse en contacto con el analito capturado.
El lector de la presente invencion comprende ademas medios de deteccion para detectar cualquier analito capturado dentro del cartucho de muestra. Los medios de deteccion pueden ser cualquier medio adecuado dependiendo del ensayo particular. Por ejemplo, los medios de deteccion pueden ser un fluorimetro, que puede usarse para detectar una senal fluorescente, una vez que se haya excitado apropiadamente, del analito o producto de reaction unido, marcado o no marcado. El analito/producto de reaccion unido puede emitir fluorescencia natural una vez que se haya utilizado la luz de una longitud de onda apropiada para excitar el analito/producto, o se puede usar un marcador adicional para unir por separado el analito unido y el marcador detectado por medios fluorescentes. Los marcadores detectables se pueden usar solos, o junto con una microparticula o cuenta, tal como un oxido de metal, polisacarido o particula de latex. Muchos tipos de latex y otras particulas son conocidos en la tecnica.
El lector comprende medios adecuados para el transporte de fluido desde el deposito/depositos de fluido, cuando esta presente, en y en todo el cartucho. El lector tambien puede estar configurado para permitir que el aire, tal como el aire filtrado, se transporte a dicho(s) canal(es) microflmdico(s) del cartucho. El lector comprende tubos, valvulas y/o sellos apropiados, segun sea necesario, para permitir que el fluido en el deposito/depositos y/o el aire se introduzca en el cartucho. Los medios pueden ser una bomba/bombas y la bomba puede bombear fluido/gas en una direction, o puede ser capaz de bombear fluido/gas hacia adelante y hacia atras. Una bomba preferida es un actuador lineal de motor paso a paso, una bomba piezoelectrica, una bomba de osmosis, una bomba peristaltica o una bomba de piston. El suministro de fluido/gas al cartucho de muestra puede ser controlado por un conjunto de control microfluidico, que puede controlar el suministro de uno o mas fluidos/gases al cartucho de muestra, a una o mas aberturas de entrada en el cartucho y en los momentos adecuados.
El lector puede incluir otras caracteristicas, tales como un dispositivo de calentamiento para permitir que los ensayos se lleven a cabo a una temperatura particular, asi como circuitos electricos apropiados y software para permitir que el lector sea programado para llevar a cabo uno o mas ensayos diferentes.
El sistema de plataforma de la presente invencion, que comprende el cartucho y el lector proporciona una serie de ventajas:
1. Volumen reducido de la muestra: la introduction capilar de un fluido, tal como una muestra de sangre mediante puncion en el dedo, reduce la complejidad para el usuario y permite realizar las pruebas en cualquier entorno (por ejemplo, ambulancia, punto de atencion, consulta medica, campo de batalla, etc.), y similar a las pruebas de glucosa, lo que permite colocar los productos en cualquier lugar.
2. Rendimiento, sensibilidad y precision: La capacidad de realizar ensayos de etapas multiples aumentara la sensibilidad, la precision y la reproducibilidad de los ensayos, un requisito importante de cualquier prueba de IVD. Esto sera cada vez mas importante a medida que la f Da continue con su reduccion del error total permitido para el lanzamiento de productos de nuevas pruebas de DIV (la entrada en los mercados de productos nuevos y existentes se volvera mas dificil).
3. Estabilidad a temperatura ambiente: Muchas pruebas de IVD existentes requieren almacenamiento y envio refrigerados, este requisito agrega un coste significativo al producto y tambien restringe el uso y la distribucion del producto. La naturaleza inicial "seca" de los cartuchos de muestra ayuda a su estabilidad y vida util.
4. Los bajos costes de materiales y un proceso de fabricacion simple permiten bajos costes de bienes (COG), lo que permite que se generen ganancias sustanciales y mas elevadas por las ventas de tiras de IVD. Esto es especialmente necesario en el mercado de inmunoanalisis y IVD molecular, donde las pruebas convencionales tienden a ser de alta complejidad, lo que hace que los costes del material de la tira y el coste general del ensayo sean mas altos.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se describira ademas ahora a modo de ejemplo y con referencia a las figuras, que muestran:
La figura 1 muestra una representacion esquematica de un cartucho de muestra de acuerdo con las ensenanzas de la presente invencion;
La figura 2 es una representacion esquematica de como se puede formar un cartucho de las ensenanzas de la presente invencion;
La figura 3 es una fotografia de una porcion de un cartucho de acuerdo con las ensenanzas de la presente invencion que muestra varias caracteristicas;
Las figuras 4 y 5 muestran que la sangre ingresa y llena la porcion del cartucho que se muestra en la figura 3; Las figuras 6, 7 y 8 son fotografias de una porcion detallada de un cartucho de la presente invencion que muestra particulas magneticas que son capturadas por un iman y que se retienen despues de lavar una muestra de sangre;
La figura 9 es una fotografia de una porcion detallada de un cartucho de la presente invencion que muestra particulas magneticas que se mantienen de manera mas difusa despues de la retirada parcial de un iman;
Las figuras 10 y 11 son representaciones esquematicas de realizaciones adicionales de un cartucho de muestra de acuerdo con las ensenanzas de la presente invencion;
La figura 12 es una representacion esquematica de un dispositivo lector de acuerdo con las ensenanzas de la presente invencion;
La figura 13 es un esquema de los mecanismos internos asociados con un dispositivo lector de acuerdo con las ensenanzas de la presente invencion;
La figura 14 es una representacion esquematica de un sistema de gestion de fluidos encontrado dentro de un dispositivo lector de las ensenanzas de la presente invencion;
La figura 15 muestra una representacion esquematica de un sistema de deposito/depositos de fluido y como se puede usar dentro de un lector de las ensenanzas de la presente invencion;
La figura 16 muestra los resultados experimentales graficados de un ensayo humedo total lavado con PSA con los cartuchos de ensayo medidos en el medidor MST Pro V1 de acuerdo con las ensenanzas de la presente invencion;
La figura 17 muestra resultados experimentales graficados que muestran la correlacion entre los ensayos humedos lavados con PSA total medidos en tiras en el medidor MST Pro y el instrumento de referencia Victor V; La figura 18 muestra resultados experimentales graficados que muestran la correlacion entre los ensayos humedos lavados con PSA total medidos en tiras en el medidor MST Pro y el instrumento de referencia Victor V; La figura 19 muestra los resultados experimentales graficados que muestran el ensayo de PSA total en humedo realizado en el medidor y la tira MST Pro, utilizando el medidor una etapa de lavado con aire para expulsar el marcador sin unir del canal;
La figura 20 muestra los resultados experimentales graficados que muestran el ensayo de PSA total en humedo realizado en el medidor y la tira MST Pro, no usando una etapa de lavado y midiendo la intensidad de fluorescencia del fluoroforo despues de que el complejo de particulas magneticas-PSA-latex fluorescente se acumula mediante el iman;
La figura 21 muestra los resultados experimentales graficados que muestran el ensayo total humedo lavado con PSA realizado con el medidor MST Pro V1 y la tira. Para los datos, el medidor MST Pro V1 utiliza un lavado de fluido para expulsar la muestra (que contiene el marcador sin unir) de los canales de la tira al sumidero;
La figura 22 muestra los resultados experimentales graficados de un ensayo seco total de PSA realizado con reactivos secados en tira MST Pro V1 y el ensayo realizado en el medidor MST Pro V1 de acuerdo con las ensenanzas de la presente invencion;
La figura 23 muestra los resultados experimentales graficados de un ensayo de 2 etapas de PSA total medio secado realizado con reactivos secados en la tira MST Pro V1 y el ensayo realizado en el medidor MST Pro V1. En este caso, el latex fluorescente se deposito en el cartucho de prueba en formato seco.
La figura 24 muestra los resultados experimentales graficados de un ensayo de 2 etapas de PSA total medio secado realizado con reactivos secados en la tira MST Pro V1 y el ensayo realizado en el medidor MST Pro V1.
En este caso, las particulas magneticas se depositaron en el cartucho de prueba en formato seco;
La figura 25 muestra los resultados experimentales graficados de una exploracion a traves de un canal de muestra de prueba en la tira MST Pro V1 utilizando el instrumento medidor MST Pro V1; y
La figura 26 muestra una representation esquematica de realizaciones adicionales de un cartucho de muestra (tira MST Pro V1, como se usa en la section experimental) de acuerdo con las ensenanzas de la presente invention.
Un cartucho de muestra (10) de acuerdo con una realization de las ensenanzas de la presente invencion se muestra en la figura 1. Se aplica un fluido, tal como sangre, al puerto de introduction de la muestra (12) (a traves de, por ejemplo, un dedo o sangre venosa). En esta realizacion particular, dos canales (14,16) se extienden desde este puerto de introduccion de la muestra (12), los canales (14,16) estan separados y no estan unidos, aunque para el usuario que esta aplicando la sangre, el canal puede aparecer como uno. Aunque no debe interpretarse como limitativa, la description adicional se referira a la muestra que es una muestra de sangre completa.
La aplicacion total de la muestra puede ser menor que 1 pl en funcion del numero de canales para llenar, por lo tanto, cuando el usuario aplica una muestra, tal como una gota de sangre, ambos canales (14, 16) se llenaran bajo fuerza capilar. Este proceso es muy rapido y esta mas en sintonia con el llenado de las tiras de glucosa en sangre en lugar del relleno de separation de sangre prolongado de algunas plataformas de inmunoensayo. Depositados en los dos canales (14, 16) hay particulas magneticas funcionalizadas con el anticuerpo (18). Como se describira con mas detalle, la sangre llena cada canal (14, 16) hasta las caracteristicas de tope fluidicas (20, 22), un tope (22) aguas abajo de un vacio de sumidero (28) y el otro tope (20) en el canal de muestra principal. Las caracteristicas de tope fluidicas pueden crearse aplicando una tinta hidrofoba imprimible a una superficie del canal. Cuando el cartucho (10) se forma a partir de tres sustratos (50, 52 y 54) como se muestra en la figura 2b, la tinta hidrofoba se puede aplicar a los sustratos superior (50) e inferior (54), para formar una caracteristica de tope en las superficies superior e inferior de un canal. Las caracteristicas de tope fluidicas (20, 22) en el canal principal de la muestra tambien pueden actuar como electrodos de detection de llenado si se hacen de un material electricamente conductor hidrofobo adecuado. A medida que el cartucho (10) se inserta en el lector, se puede iniciar un mecanismo de calentamiento del cartucho, calentando el cartucho a una temperatura constante predefinida durante la duration de la prueba. Esto permite muchos beneficios que se comentan a continuation.
En el extremo de cada uno de los 2 canales de la muestra (14, 16) en el cartucho puede haber un electrodo (23), vease la figura 2. Tambien puede haber un electrodo (23) presente cerca del sumidero de desbordamiento (28) (que tambien podria usarse como zona de medicion electroquimica). A traves del lector, verificando la continuidad electrica entre los electrodos, el lector podra confirmar que los canales (14, 16) se han llenado satisfactoriamente con la muestra. Esto se puede realizar a traves de una simple medicion de conductancia. Para un canal especifico, si los electrodos (23) se han humedecido exitosamente con sangre (lo que significa que ambos canales se llenaron completamente con la muestra), entonces una corriente electrica puede conducir de un electrodo a otro a traves de la muestra de sangre. De lo contrario, si la muestra de sangre no esta presente, o si solo ha llenado parcialmente el canal, entonces uno de los electrodos no se humedecera, lo que significa que la corriente electrica no puede fluir de un electrodo a otro.
En el presente sistema de cartucho/ensayo, debera ser posible medir el hematocrito de la muestra de sangre. El diseno del cartucho significa que la medicion se puede realizar sin ninguna interferencia de los reactivos que se utilizan para la funcionalidad del ensayo primario.
La figura 3 muestra una portion del cartucho (1) con mas detalle y, en particular, las caracteristicas de tope de fluido (20, 22). Una caracteristica adicional (60) se muestra junto al punto de aplicacion de la muestra (12). Esta caracteristica (60) esta disenada para evitar que cualquier muestra humedezca la superficie exterior del cartucho en la aplicacion de la muestra.
Las caracteristicas de tope hidrofobicas (20, 22) estan presentes en ambas superficies interiores eliminando cualquier trayectoria hidrofila que resulta en la interruption del fluido en esta caracteristica. En una realización, se utilizan dos superficies hidrofilas, sin embargo, se podrian usar combinaciones alternativas de superficies hidrofilas/hidrofobas para llenar la tira por action capilar. En un ejemplo extremo de esto, podrian utilizarse dos superficies internas hidrofobas y al proporcionar una accion de "suction" por medio de una bomba en el lector, el cartucho puede llenarse con la muestra.
A medida que la sangre llena los canales de muestra (14, 16) (ver las figuras 4 y 5) las particulas magneticas del anticuerpo funcionalizado (18) (que se depositan previamente en el canal de reactivos secos) se vuelven a suspender por la sangre, lo que permite unir cualquier analito/s presente. La sangre se llena hasta las caracteristicas de tope (20, 22), ver la figura 5. Una vez que las particulas (18) se vuelven a suspender, se permitira que la incubation con la muestra de sangre se produzca durante un periodo de tiempo definido (tiempo de incubation) y se controla mediante software y programacion apropiados del lector. Las particulas magneticas se pueden elegir como la fase de captura debido a su alta movilidad y funcionalidad (dependiendo del tamano, es decir, coeficientes de difusion, etc.) para reducir las distancias de difusion y, en ultima instancia, el tiempo de incubacion. Este tipo de reaction sera muy eficiente y reproducible al unir el analito de las muestras de sangre. Durante la union de las particulas magneticas del analito, se puede realizar una medicion del hematocrito mediante electrodos de hematocrito (24). El lector puede utilizar el valor del hematocrito para calcular la concentracion final del analito, ya que el valor de referencia sera una medicion de plasma realizada por un analizador clinico. Se puede requerir una medicion de hematocrito para corregir la diferencia de concentracion asociada con el analito presente en un volumen dado de muestra debido a las diferentes proporciones de globulos rojos a plasma. Por lo tanto, una medida de la sangre completa se puede corregir para esta diferencia por medio de una medicion de hematocrito para que los resultados sean consistentes con los asociados con una muestra de plasma.
Despues de que las particulas magneticas funcionalizadas de anticuerpos (18) han unido cualquier analito en la sangre de un iman permanente (80) o el campo electromagnetico se utiliza para mantener el complejo de particulas magneticas analito-anticuerpo en su lugar (vease la figura 6). Luego se entrega un tampon de lavado o gas desde un puerto de entrada (26). El medio de lavado se proporciona a partir de un deposito/depositos de tampon presente en el lector (un deposito/depositos de tampon particular y, por lo tanto, se puede insertar el tampon en el lector dependiendo del ensayo particular y, por lo tanto, se detecta el analito). Un volumen definido de tampon (por ejemplo, 1-2 |jL) se expulsa del deposito/depositos del lector a traves de un sistema de bombeo hacia los canales de muestra (14, l6) que empujan la sangre mas alla de la caracteristica de tope de fluido (22) hacia el vacio del sumidero (28), dejando las particulas magneticas en el tampon. (Ver las figuras 7 y 8). Las particulas magneticas (18) se pueden visualizar como una banda discreta (82) que aun se mantiene dentro del canal (14, 16).
Despues de esta etapa, una serie de etapas adicionales de lavado, como anteriormente, pueden realizarse (todas usando la etapa de mantenimiento de las particulas magneticas mediante un campo magnetico aplicado) y donde otros reactivos secos depositados (30, 32) pueden resuspenderse en el tampon (por ejemplo, el mismo tampon que el tampon de lavado) que luego se bombea a los canales de muestra (14, 16), para permitir que ocurran eventos de enlace de una manera muy controlada. O como se describio anteriormente, el complejo de analito de particulas magneticas lavadas que esta contenido dentro de la matriz de tampon limpio puede transportarse aguas arriba, pasando la caracteristica de tope (20) a la ubicacion en la tira donde se seca el marcador en el cartucho de prueba desechable. En este punto, el complejo de analito de particulas magneticas se puede unir al marcador, seguido de una etapa de lavado adicional y de la medicion del marcador. (En ambos de estos ejemplos, solo la reaccion de union al analito de cuentas magneticas se produce en la sangre, todas las demas reacciones y/o etapas de union se producen en un entorno de tampon muy controlado).
Sin embargo, el campo magnetico tambien puede estar "relajado" (vease la figura 9) moviendo el iman de distancia desde el cartucho y reduciendo de este modo la atraccion magnetica de esta manera de las particulas magneticas (18) que todavia pueden mantenerse por el campo magnetico, aunque menos fuertemente y puede formarse una banda mas difusa (84) de particulas. El movimiento del iman (80) hacia el cartucho nuevamente servira para concentrar las particulas (18) una vez mas.
En resumen, esto significa que cualquier reactivo y/o marcador nunca contacta con la matriz de sangre "sucia", y todas las reacciones/union (aparte de la etapa de captura de analito inicial) esta muy controlado en un entorno tamponado, opcionalmente un entorno calentado para maximizar la eficiencia de deteccion y evitar/minimizar la union no especifica y los productos interferentes se eliminaran (maximizando la repetibilidad/precision de la medicion). Esto permite que el sistema actual use reactivos que normalmente no se habrian elegido porque eran "problematicos" en plasma/sangre. Ademas, tambien significa que todas las mediciones de deteccion, tales como las mediciones de fluorescencia tambien se producen en un entorno de tampon "limpio", lo que significa que el enfriamiento/interferencia de la muestra (como se espera en la sangre o el plasma) se reduce/elimina, lo que permite realizar mediciones reproducibles muy sensibles. Esto permite una seleccion mucho mayor de marcadores de deteccion, por ejemplo, fluoruros, porque se minimiza la extincion de la luz de excitacion o emision.
Se debe apreciar que la descripcion anterior, con referencia a la figura 1, se ha hecho en relacion con un cartucho de dos canales, pero la presente invencion tambien se refiere a un solo canal, asi como a varios canales, por ejemplo, 6, 7, 8 cartuchos, etc. Cada canal puede llevar a cabo la misma reaccion con fines de reproducibilidad/precision, o puede disenarse para llevar a cabo diferentes ensayos; de esta manera, cada cartucho puede ser capaz de llevar a cabo una reaccion "multiple".
La figura 10 muestra un cartucho (10) similar al que se muestra en la figura 1, pero adicionalmente muestra electrodos de llenado (23) que pueden detectar el llenado correcto de la muestra por el cartucho (10). Se proporcionan otros electrodos (24) para permitir obtener un valor de hematocrito de la muestra de sangre.
Una realizacion adicional de un cartucho 11 de acuerdo con la presente invencion se muestra en la figura 11. En esta realizacion preferida, 6 canales son alimentados por un solo puerto de entrada de muestra en lugar de que los dos canales sean alimentados por el unico puerto de entrada de muestra. El diseno de la banda de 6 canales es una version ampliada de la banda de 2 canales que se muestra en la figura 1, por lo que se agregaron canales adicionales que comparten el mismo sumidero (90). Esto permite un uso mas efectivo de la huella de la tira y permite una mayor capacidad de multiplexacion.
En ultima instancia, se realiza una medicion (por ejemplo fluorescente) por un lector mediante deteccion optica u otros medios, adecuada para el marcador a detectar. Por ejemplo, si el marcador es un marcador fluorescente, los medios de deteccion pueden ser capaces de realizar y detectar la excitacion y la emision de los fluoforos elegidos: una vista esquematica de un lector portatil de acuerdo con la presente invencion se muestra en las figuras 12-15. Esta realizacion del lector (medidor MST Pro V1) es la realizacion espedfica que se utilizo para realizar los experimentos como se describe en la seccion Experimental. Ademas, todos los resultados experimentales se obtuvieron utilizando el diseno de tira de 6 canales (como se muestra en la figura 26). El lector (100) comprende una plataforma (106) para recibir y mantener un cartucho (10) de la presente invencion y un cabezal de sellado (105) cuya actuacion puede controlarse mediante solenoides (108) para producir un sistema sellado mediante el cual el instrumento puede bombear un gas, tal como aire o un fluido, tal como un tampon de lavado, en la tira de una manera controlada. Ademas, el lector comprende un cartucho de deposito/depositos de fluido (111) para contener fluido o gas para su posterior suministro al cartucho (10). El cartucho de deposito/depositos puede contener una camara separada para cada canal de prueba contenido en la tira, de manera que la activacion y el control del fluido/aire para cada canal de prueba se accione directamente desde lo que efectivamente es una fuente de bomba separada. Alternativamente, el cartucho de deposito/depositos puede comprender una camara que luego se divide en multiples salidas, de tal manera que la activacion y el control del fluido/aire para cada canal de prueba se accione desde una fuente de bombeo comun. El fluido o gas se suministra por medio de un actuador (113) que actua sobre el carcho del deposito/depositos. Tambien se proporcionan medios de deteccion optica (107) y circuitos electricos (112) adecuados y un chip o chip(s) de ordenador asociado(s) y software para controlar el lector y realizar el ensayo. Ademas, debido a que el sistema descrito tiene la flexibilidad de realizar muchas etapas de lavado y suministro de reactivos, muchos formatos de ensayo pueden configurarse utilizando el sistema actual.
Un soporte de iman (103) y el iman asociado que puede estar orientado a 45 grados, (104) pueden ser controlados mediante el uso de un motor (110) con el fin de llevar el iman en contacto o muy cerca de la tira de prueba, con el fin de influir en las particulas magneticas o paramagneticas contenidas dentro de la tira reactiva. Para realizar la medicion del ensayo (por ejemplo, fluorescente), el cabezal de lectura optica (107) se puede mover a lo largo de las zonas de medicion o deteccion (222) de cada uno de los multiples canales de prueba en el cartucho de prueba controlado por un motor (109). Por lo tanto, la cabeza de lectura optica se puede utilizar para realizar multiples mediciones en un cartucho de prueba desechable. La grafica que se muestra en la figura 25 muestra los resultados de una lectura de ejemplo del cabezal de lectura optica a traves de un canal de prueba en el cartucho de prueba. (utilizando el diseno del lector medidor MST Pro V1). A partir de los resultados, se puede ver que el instrumento puede realizar multiples mediciones en todo el ancho del canal de prueba, lo que permite identificar y transformar la senal de fluorescencia maxima en un resultado mediante el uso de un algoritmo y mostrarla al usuario a traves del LCD (101). Ademas, el instrumento podria interpretar la forma asociada con las mediciones tomadas a traves del canal de prueba y usar esto como un control a bordo, por ejemplo, si la respuesta de lectura da la forma de una disminucion constante o un aumento constante en lugar de una respuesta parabolica, entonces podria ser utilizado para determinar un resultado erroneo o no uniforme.
Se apreciara que se requiere el lector de controlar con mucha precision el suministro de fluido/gas de, por ejemplo, el tampon de lavado en el cartucho desechable. El cartucho puede incluir una serie de canales de muestra separados, y es posible que se requieran varias etapas de lavado para cada canal, debiendo realizarse cada paso de lavado a una velocidad de flujo precisa y con un volumen preciso. Cada canal puede tener una pluralidad de puertos de interfaz de lavado ((26) de la figura 1) sobre los cuales se realiza un sello para garantizar el suministro correcto del lavado de tampon/gas desde el deposito/depositos en el lector. Un sistema de gestion fluidica adecuado puede estar compuesto por 3 componentes principales (como se muestra en la figura 14), una bomba/bombas fluidicas (113), un cartucho de deposito/depositos de tampon 111 (y la figura 15) y una interfaz fluidica de lector/cartucho o sello (105).
La bomba/bombas fluidicas que se utilizan para transportar el fluido desde el cartucho de deposito/depositos de tampon a y durante todo el cartucho, puede ser un actuador lineal de motor paso a paso (por ejemplo, E21H4U-5-900 Haydon Kerk Motion Solutions), las caracteristicas asociadas con un actuador lineal de motor paso a paso que lo convierten en una solucion deseable incluyen el hecho de que se bloquea en posicion cuando se detiene (de modo que el fluido no puede empujar contra el cartucho de deposito/depositos de tampon y el actuador lineal) y que los motores paso a paso tienen movimiento de resolucion muy fina (por ejemplo, 0,0015 mm/paso del motor).
La interfaz fluidica de lector/cartucho puede conseguirse mediante el uso de una cabeza de sellado recubierta con caucho suave en el lector que se localiza conjuntamente con dichos orificios de entrada de lavado (26) del cartucho. Alternativamente, una junta de caucho podria ubicarse en el cartucho de prueba desechable, o podria haber una junta de caucho presente tanto en el cabezal de sellado como en el cartucho de prueba desechable. El cabezal de sellado tendra una salida (por ejemplo, un orificio en la membrana de caucho que contiene la salida del sistema de administracion fluidica) que se alinea con cada uno de los puertos de entrada de fluido del cartucho.
El lector puede incluir preferiblemente un tampon de lavado de deposito/depositos. El deposito/depositos de lavado de tampon puede contener el liquido de lavado de tampon para realizar ensayos en varios cartuchos. Alternativamente, en el caso de que el deposito/depositos este lleno de aire, podria ser una caracteristica permanente del diseno del lector, ya que no seria necesario reemplazarlo como se explico anteriormente.
Para hacer el lector adecuado para su uso por el usuario, de tal manera que la sustitucion del cartucho de deposito/depositos de tampon no de como resultado que el Kquido se derrame hacia fuera y sobre el lector o usuario, el cartucho de deposito/depositos de lavado de gas/tampon y el lector pueden estar disenados para tener interfaces de sellado automatico, de manera que cuando se retira el cartucho del deposito/depositos del lector, se sella cualquier fluido dentro de los limites del deposito/depositos y el instrumento. El sello puede disenarse de tal manera que solo se abra cuando el deposito/depositos se inserta correctamente en el punto de interfaz apropiado en el instrumento, se puede incorporar una caracteristica para penetrar en el cartucho de deposito/depositos de tampon de sellado automatico. Para asegurarse de que el fluido de tampon dentro del cartucho de deposito/depositos de lavado de tampon no se evapore, lo que provocaria la formacion de huecos de aire dentro del cartucho, el cartucho de deposito/depositos de tampon puede tener sellos de lamina en ambos extremos, sobre un extremo del embolo de la jeringa, y sobre un extremo de sellado automatico. Estos sellos de lamina se romperan por el controlador de la bomba de jeringa y la funcion de interfaz del cartucho del medidor, respectivamente. Un ejemplo de una realizacion de este tipo se muestra en la figura 15, donde la interfaz fluidica del lector/cartucho de muestra se logra mediante el uso de un cabezal de sellado recubierto de caucho suave en el lector que interactua con el cartucho de muestra. El cabezal de sellado tendra una salida (es decir, un orificio en la membrana de caucho que contiene la salida del sistema de administracion fluidica) que se alinea con cada uno de los puntos de entrada de la tira.
El cartucho de deposito/depositos de tampon/gas puede tener una camara singular que acciona las diversas etapas de lavado asociadas con cada canal de prueba de una sola fuente que luego se divide en multiples puntos de puerto de salida a traves de diversas valvulas y tubos. Preferiblemente, el cartucho de deposito/depositos de tampon/gas puede tener una camara separada para cada canal de prueba, de modo que las etapas de lavado asociadas con cada canal de prueba se realicen desde fuentes individuales. Este tipo de diseno tambien se muestra en la figura 15, y no requiere ninguna valvula en el lector o en el cartucho de prueba. Alternativamente, el cartucho de deposito/depositos puede tener varias camaras que estan asociadas con subgrupos comunes de canales de prueba contenidos en el cartucho de prueba.
Como se discutio anteriormente, con el fin de mantener la fase de captura y el analito unido, etc. consiguiendo su lavado durante las etapas de lavado del tampon y de lavado del reactivo, las cuentas magneticas en la tira de ensayo desechable requieren que se sujeten mediante el lector. Esta funcion se cumplira utilizando un iman permanente o un electroiman. Es posible manipular las cuentas magneticas de ciertas maneras que podrian ayudar a mejorar la precision, la sensibilidad y el rango de medicion. Por ejemplo, para senales fluorescentes de ensayo mas bajas, puede ser beneficioso que el iman reuna todas las cuentas magneticas en un grupo estrechamente unido, aumentando la densidad de los fluoroforos presentes y, por lo tanto, la intensidad de la luz emitida hacia el detector. En contraste, en los casos en que hay senales mas altas, y el sensor de luz y la electronica del lector estan cerca de la saturacion, puede ser beneficioso retirar o mover el iman para relajar o extender las cuentas magneticas sobre un area determinada, reduciendo asi la intensidad de la luz emitida hacia el sensor. Esto podria verse como una nueva forma de utilizar el iman para influir tanto en la sensibilidad como en el rango del ensayo o afectar la cinetica de union de los ensayos de varias etapas. Por lo general, para un iman, los puntos donde la densidad de flujo es mayor (y, por lo tanto, donde las cuentas magneticas tenderan a gravitar estan a lo largo del borde del iman, ya que es donde las lineas de flujo magnetico tienen la trayectoria de viaje mas corta desde el polo norte hasta el polo sur.
Es una caracteristica fisica de desarrollo del ensayo que la temperatura ambiente puede influir en la magnitud de la respuesta. En la presente invencion, este efecto de la temperatura sera impulsado principalmente a traves del efecto de la temperatura en la difusion, por lo que un aumento de la temperatura puede resultar en un aumento de la eficiencia de enlace entre las cuentas magneticas y el analito objetivo, y la union posterior a los reactivos administrados. El sistema actual se puede usar, por ejemplo, en un consultorio medico y en el hogar, y el rango de temperaturas al que estara expuesto el sistema sera amplio, desde tal vez tan bajo como 10 grados centigrados hasta tan alto como 35 grados centigrados. Un metodo para eliminar este efecto de temperatura consiste en calentar la tira de prueba a una temperatura predeterminada, por ejemplo, 40 grados, lo que eliminaria cualquier variation asociada con el ensayo debido a los efectos de la temperatura. Por lo tanto, el lector tambien puede comprender medios de control de temperatura, tales como un calentador.
El control de la temperatura del cartucho se puede implementar mediante la utilization de la superficie superior del bloque optico (que estara en contacto con la tira y puede estar hecho de un metal conductor del calor, tal como aluminio, que tiene buenas propiedades de conductividad termica) como calentador para mantener la temperatura del cartucho de muestra. Alternativamente, la plataforma de soporte en la que se apoya el cartucho de prueba desechable dentro del lector podria utilizarse como la superficie calentada que hace contacto con la tira. El calentamiento de la superficie calentada se puede realizar utilizando una resistencia de alto vataje y bajo valor (por ejemplo, 1 ohmio), o bien utilizando un MOSFET con la pestana del disipador termico del MOSFET unida a la superficie superior del bloque optico. La temperatura se puede controlar colocando un sensor de temperatura en la superficie del bloque de calentamiento y utilizando la salida de este sensor de temperatura para modificar el flujo de corriente a traves de la resistencia de alto vataje/MOSFET. Una ventaja adicional de esta implementation es que la ganancia de fotodiodo de silicio MPPC (el fotodiodo de silicio MPPC es el detector utilizado para medir la intensidad de la luz emitida por los fluoroforos objetivo en la tira de prueba) es sensible a la temperatura ambiente, por lo tanto, implementando la superficie superior del bloque optico como calentador tambien garantizaria que se controla la temperatura ambiente cerca del fotodiodo de silicio MPPC.
Un metodo alternativo de calentar el cartucho de muestra seria crear un elemento de calentamiento muy delgado. El hecho de que el elemento de calentamiento sea muy delgado (100-250 micrometros) tambien significaria que un iman podria colocarse debajo del elemento y aun estar cerca del cartucho para que las cuentas magneticas se puedan recoger. El elemento de calentamiento delgado podria adoptar una forma similar a la de una PCB flexible, con pistas de cobre intercaladas entre dos capas de polimero. Un lado de la capa se puede recubrir con un material reflectante, o se le puede adherir una capa reflectante para hacer la superficie de espejo, si se requiere que el elemento de calentamiento refleje la luz emitida por los fluoroforos objetivo, hacia el fotodiodo de silicio MPPC. Alternativamente, en el caso de que la fluorescencia de fondo se convierta en un problema en el sistema, un lado del elemento podria tener un acabado negro mate en lugar de una superficie reflectante.
El bloque optico del lector de la presente invencion puede ser capaz de proporcionar las fuentes de luz para multiples longitudes de onda de excitacion del fluoroforo y la medicion de la luz emitida posterior de los fluoroforos. Es la intensidad de esta luz emitida por los fluoroforos en el cartucho de prueba desechable lo que proporcionara la medicion del ensayo. El bloque de medicion optica es responsable de medir la cantidad de analito objetivo presente en el cartucho a traves de los marcadores unidos asociados, tal como fluoroforos. El bloque de medicion optica puede comprender un fotodiodo de silicio de contador de fotones de multiples pixeles (MPPC) (por ejemplo, Hamamatsu S10362-11-100C) y un LED de banda ancha de alta potencia que emite un amplio espectro de longitudes de onda (por ejemplo, HP803WW Roithner LaserTechnik GmbH).
Un fotodiodo de silicio MPPC puede preferirse, ya que tiene una ganancia interna muy alta (en la region de 1 millon) en comparacion con un fotodiodo estandar (ganancia = 1) o un fotodiodo de avalancha (ganancia = en la region de 100). Una caracteristica conveniente del fotodiodo de silicona MPPC es que su ganancia interna varia en relacion con la tension de polarizacion inversa que se le aplica (por ejemplo, una tension de polarizacion de 70 V da como resultado una ganancia de aproximadamente 1 millon, mientras que una tension de polarizacion de 65 V da como resultado una ganancia de aproximadamente 100.000). El lector puede utilizar esta relacion para manipular el rango dinamico del sistema de medicion, es decir, para concentraciones de analito mas altas, la tension de polarizacion del fotodiodo se puede reducir para garantizar que la salida del fotodiodo no sature la electronica del instrumento. Cabe senalar que en realizaciones alternativas se podria implementar un fotodiodo estandar o un fotodiodo de avalancha en lugar de un fotodiodo de silicio MPPC.
Una alta potencia de banda ancha LED es conveniente para que un solo LED se pueda usar para generar multiples longitudes de onda de excitacion (es decir, la luz que incide sobre los fluoroforos de analito objetivo) teniendo un portaobjetos de filtro que se puede mover para colocar diferentes filtros frente al LED para generar diferentes longitudes de onda. El portaobjetos tambien contiene filtros asociados con el fotodiodo de silicio para bloquear la luz de excitacion, de modo que el fotodiodo de silicio mida solo la luz emitida por los fluoroforos.
Con referencia al cartucho de 2 canales como se muestra en la figura 1, el bloque de medicion optica puede estar dispuesto de tal manera que hay 2 conjuntos de fotodiodos LED y silicio, uno para cada canal en la tira. La ubicacion de los fotodiodos y los LED es fija. El portaobjetos se puede mover de manera tal que se puedan colocar diferentes filtros entre los LED y los fotodiodos de silicio MPPC para diferentes mediciones. Alternativamente, en lugar de tener 2 conjuntos fijos de fotodiodos de LED y silicio, podria implementarse un solo cabezal optico que pueda moverse entre los diferentes canales de prueba.
Realizaciones alternativas de la configuracion indicada del bloque optico son las siguientes:
1. En una realización, tanto la fuente de excitacion como el detector de emisiones estan ubicados en la misma cara del cartucho. Una alternativa a esto es que el cartucho se encuentra entre la fuente de emisiones y el detector de emisiones.
Una razon por la que la fuente y el detector pueden ubicarse en la misma superficie es para dejar espacio para la integracion del cartucho con el sistema de administracion de fluidos, la interfaz del conector del cartucho, el bloque de calentamiento y el control de particulas magneticas.
2. En otra realización, existe la implementacion de un portaobjetos de filtro movil para permitir la selectividad en la excitacion y la deteccion de varios fluoroforos. En una configuracion mas simple donde solo se requiere la deteccion de un unico fluoroforo por canal, no se requeriria el deslizamiento del filtro y podria reemplazarse con un solo filtro de excitacion fijo y un solo filtro de emision para cada canal.
3. En una realizacion adicional, la fuente de luz para la excitacion de los fluoroforos proviene de un emisor de banda ancha. Implementaciones alternativas donde no existe la necesidad de excitarse en multiples longitudes de onda podrian incluir fuentes de luz especificas de longitud de onda, tal como LED de banda estrecha.
Otra alternativa a un LED de banda ancha seria una lampara de flash de xenon, siendo la intensidad de una lampara de flash de xenon mucho mayor que la de un LED. Ademas, una lampara de flash de xenon emite en un rango mayor de longitudes de onda. Cuando los LED de banda ancha "blanco" o "blanco calido" pueden emitir hasta una longitud de onda de alrededor de 400 nm, las lamparas de flash de xenon pueden emitir hasta alrededor de 200 nm, lo que significa que las lamparas de flash de xenon pueden usarse para longitudes de onda de excitacion en el rango UV.
4. En otra realization, la configuration del bloque optico podria comprender dirigir la luz de excitacion a un espejo dicroico (o divisor de haz) montado en un angulo de 45 grados con respecto a la normal que refleja la luz de excitacion a traves de 90 grados hacia la muestra en el cartucho de prueba desechable. El espejo dicroico se elige de modo que la luz de excitacion generada por el fluoroforo se encuentre en una longitud de onda que se desplaza a traves del espejo dicroico (es decir, no se refleja de nuevo hacia la fuente de emision) donde el fotodiodo de silicio esta situado para la detection de la luz emitida. Tambien se pueden colocar filtros opticos adicionales frente a la fuente de luz y el detector optico en esta configuracion para reducir la banda de paso de las longitudes de onda de luz producidas por el emisor y aceptadas por el detector.
Debido a la variation en los procesos asociados con la fabrication de cartuchos de prueba de ensayo desechable, normalmente se requiere que se caracterice cada lote de cartuchos y para los valores de calibration especificos, que se introduzcan en el lector, de manera que la respuesta de ensayo generada por el cartucho de prueba se pueda normalizar por el lector internamente antes de informar el resultado final del ensayo. En la presente invention, existe la oportunidad de utilizar el cartucho de tampon como una herramienta para transportar datos particulares de interes, por ejemplo, parametros de calibracion de ensayo sobre su lote asociado de cartuchos. Una implementation podria incluir la conexion de un chip de memoria EEPROM al cartucho de deposito/depositos, por lo que el lector puede leer los datos en el chip de memoria EEPROM.
En una realizacion particular, el cartucho de muestra y lector asociado estan disenados para llevar a cabo un inmunoensayo, en el que el analito a detectar es un antigeno y el agente de union es un anticuerpo. Las particulas paramagneticas pueden funcionalizarse mediante la union de anticuerpos contra antigenos libres o libres y complejos.
Debido al presente diseno del cartucho, de manera importante la unica reaction de union que se produce inicialmente es la union a cualquier antigeno en la sangre de anticuerpos, esto da como resultado una serie de ventajas. Principalmente significa que se pueden realizar ensayos de varias etapas, lo que significa que la molecula/particula seleccionada nunca contacta ("ve") la sangre. Este es un beneficio significativo sobre las tecnologias de inmunoensayo POC existentes en las que tanto la fase de captura como el marcador estan en contacto con la muestra. Los esquemas tipicos de union de inmunoensayos POC generalmente consisten en particulas de captura planas o magneticas y un marcador que podria estar unido a una particula, conjugado o polimero, etc. Sin embargo, tanto la fase de captura como la de marcador entran en contacto con la muestra (sangre, plasma, etc.). Esto puede llevar a una serie de problemas. Dentro de los inmunoensayos hay muchas especies que interfieren con las etapas de union del inmunoensayo. Los principales candidatos son los anticuerpos humanos contra animales, como los anticuerpos humanos anti-raton (HAMA), los anticuerpos animales contra animales (en el caso de aplicaciones veterinarias), el factor reumatoide, los anticuerpos anti-BSA, el fibrinogeno, etc. La union especifica no especifica (HAMA, factor reumatoide) y la union no especifica pueden dar como resultado resultados altamente inexactos que resultan en un rendimiento deficiente y, en ultima instancia, en un diagnostico incorrecto de las muestras de pacientes. Esto es especialmente cierto, ya que los inmunoensayos de POC se refieren generalmente al rendimiento del analizador clinico que incorpora ensayos de varias etapas, etapas de lavado muy efectivas y deteccion de marcadores en una matriz limpia. La union especifica y no especifica resulta en un marcador unido a la fase de captura de una manera no consistente con la concentration de analito (puede ser mayor o menor que el resultado esperado), lo que resulta en un resultado inexacto. Pueden emplearse particulas de latex fluorescentes que se funcionalizan mediante la union de anticuerpos contra el antigeno libre y complejo. Por lo tanto, se puede formar un sandwich entre las particulas magneticas, el antigeno a detectar y las particulas de latex fluorescentes.
En una realizacion del presente sistema, sin embargo, el marcador de deteccion, tal como un resto fluorescente nunca en contacto con la sangre, como la sangre se elimina por lavado antes de que cualquier marcador que se ponga en contacto con el analito unido. Por lo tanto, cualquiera de estos eventos matriciales que podrian facilitar la union no especifica no puede producirse porque las cuentas magneticas (18) y el marcador de deteccion no estan presentes en la sangre al mismo tiempo, al igual que algunos sistemas analizadores clinicos. Esto es muy importante cuando se considera el error total permitido (ATE) de un inmunoensayo. Existe un impulso dentro de las autoridades regulatorias, como la FDA para ajustar el ATE en cualquier producto de ensayo nuevo para aumentar la precision de las pruebas con respecto a los sistemas de referencia.
Para una poblacion dada de muestras clinicas, aunque la mayoria de las sangres/muestras se recuperan con precision, la ATE puede ser afectada por unas pocas respuestas inexactas. Por lo tanto, es muy importante que cualquier nueva tecnologia de plataforma este disenada para minimizar estos efectos. La presente invencion tiene como objetivo realizar el diseno apropiado del cartucho y el lector asociado, reduciendo asi el sesgo de muestra a muestra (por ejemplo, elimination de la union especifica no especifica y la union no especifica).
Otra ventaja de solamente realizar la etapa de captura de particulas magneticas en la muestra no tratada, tal como la sangre, es que las mediciones de la sangre pueden llegar a ser muy precisas. La mayoria de los inmunoensayos son altamente sensibles con respecto a las concentraciones de reactivos (es dedr, la concentration de la fase de captura y la fase de marcado). Se requiere una concentracion de reactivo suficiente para impulsar la pendiente, mientras que una concentracion de reactivo demasiado alta da como resultado un aumento de las intercepciones del ensayo. En un analisis de sangre completa, este problema se puede exagerar aun mas, ya que incluso si deposita exactamente el mismo volumen y concentracion de reactivo, los reactivos tendran diferentes concentraciones en diferentes tipos de sangre de hematocrito (ya que los reactivos se resuspenden en diferentes volumenes de plasma). Por ejemplo, los mismos reactivos depositados en un 60 % de sangre de hematocrito tendran 1,87 veces menos volumen que un 25 % de sangre de hematocrito. Como resultado, los reactivos estaran mas concentrados en el 60 % de sangre de hematocrito que en el 25 % de sangre de hematocrito. Esto solo podria causar problemas de sesgo de sangre a sangre, ya que tanto la fase de captura como la de marcado variaran en concentraciones, por lo tanto, la eficiencia general de captura (numero de interacciones de fase de captura-analito-marcador realizadas a partir del numero total de interacciones de fase de captura-analito-marcador posibles = eficiencia de captura) variaran entre las sangres debido a los efectos del hematocrito solo. Esto, junto con las viscosidades variables de diferentes tipos de sangre (y plasma) afecta los coeficientes de difusion de cualquier reactivo movil que puede resultar en un ATE deficiente.
Tener solo las particulas magneticas que se unen al analito en la sangre ayuda a reducir significativamente este problema, ya que las particulas magneticas de gran movilidad y funcionales seran altamente eficientes con respecto a la union del analito. Por lo tanto, la diferencia en la concentracion de particulas magneticas en sangre de hematocrito alta o baja es menos importante, ya que casi todo el analito disponible esta unido en esta etapa. Los efectos de viscosidad de sangre a sangre se minimizan aun mas por el calentamiento del cartucho aplicado, ya que no habra efecto de temperatura, ya que el cartucho siempre tendra una temperatura constante, como se describio anteriormente.
Para un inmunoensayo, una vez que los agentes no unidos en la sangre han sido lavados activamente fuera del canal de muestra hacia fuera en el sumidero, el lector luego entrega una pequena cantidad de tampon en el cartucho de muestra a traves de un punto de entrada de memoria intermedia en la tira que contiene una deposition seca de cuentas de latex fluorescente funcionalizadas con anticuerpos (u otros reactivos de union secundarios). La cuenta de latex fluorescente marcada con anticuerpo es resuspendida por el tampon y luego bombeada al canal que contiene los complejos de analito de particulas magneticas. El iman permanente o el electroiman alojado en el lector todavia esta aplicando un campo magnetico en este punto y "retiene" los complejos de analito de particulas magneticas en su lugar en el canal. Una vez que el latex fluorescente funcionalizado con anticuerpos ha sido transportado por el lector al canal que contiene los complejos de analito-particula magnetica, el campo magnetico se elimina, permitiendo que se produzca una segunda reaction de union. (Aunque tambien seria posible permitir la fase de union mientras el iman esta en position y las cuentas magneticas se mantienen en position). Alternativamente, el complejo de particulas magneticas-analito podria ser transportado aguas arriba en el cartucho de muestra, para contactar con el marcador. Alternativamente, como se describio anteriormente, todos los reactivos de union (fase de captura de particulas magneticas y marcador) podrian depositarse en el canal de muestra y la reaccion de union ocurriria en el canal de muestra. La acumulacion magnetica y el lavado de aire/fluido por el lector aseguran que los complejos de particulas de analito-marcador magneticos se cuantifiquen en un entorno de aire/fluido.
La flexibilidad del presente sistema permite el potencial para una medicion muy flexible y sensible. En este punto, todo el sistema esta configurado para una alta eficiencia de captura, lo que da como resultado ensayos muy sensibles, ya que las particulas magneticas se cargan efectivamente con analito, por lo que las colisiones con el marcador deberian dar como resultado eventos de union exitosos. Para mayor claridad, se describira un esquema de union; sin embargo, debido a la flexibilidad del diseno de la plataforma actual, se puede formatear casi cualquier arquitectura de ensayo concebida.
Una etapa de lavado se realiza generalmente para eliminar cualquier medicion optica posterior del marcador no unido que se hace a continuation, en un entorno 'limpio'. En el caso de la detection fluorescente, esto permite el uso de fluoroforos que no serian utilizables en algunas matrices (por ejemplo, sangre) donde, de lo contrario, se produciria una extincion significativa de la senal especifica (sin la elimination de esta matriz).
Se podria proporcionar una amplification adicional de la senal, si es necesario, mediante la resuspension y el bombeo de un reactivo de union terciario en el canal. Por ejemplo, podria usarse una particula marcada adicional (marcador identico o diferente) con anticuerpos contra un componente de la particula marcada primaria (por ejemplo, un inmunogeno acoplado a la particula marcada para la cual existen buenos anticuerpos). Una vez mas, se realizaria una etapa de retention y lavado magnetico para eliminar cualquier particula marcada recubierta con marcador secundario no unido. El lector luego mediria el marcador de la misma manera (si se usara el mismo marcador) o de una manera diferente si se usara un marcador diferente. Esta medida adicional podria utilizarse para aumentar el rango y la sensibilidad de la medicion.
Muchos inmunoensayos POC actuales que utilizan marcadores fluorescentes que miden los marcadores en una matriz de sangre o plasma. Como se describio anteriormente, hay muchos componentes en la sangre y el plasma (albumina serica humana, bilirrubina, hemoglobina, etc.) que interfieren con la longitud de onda de excitation o emision utilizada para medir la concentracion del fluoroforo capturado. Como resultado, la precision dentro y entre las sangres de otros inmunoensayos POC puede verse afectada unicamente por la medicion del marcador fluorescente solamente (ademas de todos los problemas de union de la matriz). Como resultado, se utilizan fluoroforos que intentan minimizar estos efectos, por lo que no son necesariamente el mejor marcador fluorescente que se debe utilizar, sino la necesidad de realizar la medicion de fluorescencia en una "matriz sucia". Sin embargo, la plataforma actual permitira una eleccion extendida de marcadores fluorescentes que permitan elegir los marcadores que dan como resultado el mejor rendimiento del ensayo. Esto solo es una ventaja; tambien significa que la multiplexacion puede lograrse mas facilmente como se discutio.
La presente invencion posibilita la multiplexacion (es decir, la deteccion de mas de un analito usando una sola muestra) dentro de un unico canal utilizando particulas magneticas como una fase de captura. Por ejemplo, si no es posible usar multiples marcadores fluorescentes debido a las propiedades opticas de la sangre y el plasma, entonces la multiplexacion no seria posible dentro de un canal porque no hay manera de proporcionar especificidad de medicion, ya que las particulas magneticas no pueden distribuirse espacialmente en particulas magneticas especificas para el analito 1, 2, etc. Esta es la razon por la cual la captura plana se utiliza como fase de captura en plataformas POC que pueden realizar multiplexacion. Por ejemplo, algunas pruebas de panel utilizan el mismo marcador fluorescente (debido a las limitaciones de sangre y plasma) para los marcadores con los anticuerpos de captura para cada analito distribuido espacialmente en la tira para permitir la capacidad de multiplexacion. Como las particulas magneticas son moviles y susceptibles al campo magnetico aplicado, la especificidad debida a la distribucion espacial de las particulas magneticas (especificas contra diferentes analitos) es dificil de lograr debido a las limitaciones opticas del marcador fluorescente en plasma o sangre. Sin embargo, al proporcionar una etapa de lavado como en la presente invencion, la multiplexacion dentro de un solo canal utilizando particulas magneticas y marcadores fluorescentes se convierte en una realidad. Ademas, el diseno de la banda de 6 canales permite la multiplexacion con un fluoroforo y, por lo tanto, aumenta la capacidad de multiplexacion general cuando se tiene en cuenta la multiplexacion dentro del canal (multiples fluoroforos).
Debido a la flexibilidad que ofrece la capacidad de realizar una sola etapa, ensayos de multiples etapas y lavado multiples etapas, hay una gran oportunidad de ampliar los rangos de medicion de analito o linealizar la curva de respuesta a la dosis de un ensayo. Por ejemplo, las curvas tipicas de respuesta a dosis de inmunoensayo son sigmoidales. Esto se debe a la saturacion del reactivo (reactivo insuficiente para mantener la union lineal) o la saturacion del marcador/metodo de deteccion (es decir, los metodos de deteccion se saturan y ya no pueden medir el marcador de manera lineal). Sin embargo, la plataforma actual permitira una respuesta lineal completa en todo el rango de medicion, y esto puede lograrse mediante varios metodos. Por ejemplo, el lector puede medir la concentracion de las particulas fluorescentes en cada etapa del ensayo de varias etapas. Por lo tanto, despues de que se haya producido la etapa inicial de union de particulas fluorescentes, el lector podria medir la intensidad de la fluorescencia. Esta podria ser una medicion de rango, por ejemplo, por lo que si la intensidad supera un valor umbral (establecido durante la calibracion), utiliza la intensidad de fluorescencia para calcular la concentracion del analito (calibracion 1) y la prueba se detiene en este punto. Sin embargo, si la intensidad de fluorescencia esta por debajo del valor umbral, esto indicaria una baja concentracion de analito y las etapas de amplificacion adicionales descritas anteriormente (calibracion 2) y la subsiguiente intensidad de fluorescencia utilizada para calcular la concentracion de analito. Esto tambien podria lograrse utilizando los dos canales, en los que un canal se sintoniza para realizar mediciones muy sensibles, mientras que el otro se ajusta (concentracion de reactivo y/o tiempo de enlace) para realizar mediciones lineales en la porcion restante del rango de medicion del analito. La saturacion optica que resulta en la no linealidad tambien puede ser combatida por el lector. La plataforma actual permite muchas formas diferentes de lograr respuestas lineales en los rangos medibles, lo que permitira una calibracion mas precisa que resulta en una mejor precision dentro y entre la sangre, lo que resulta en un ATE mejor. Se preve que la distribucion de particulas magneticas podria usarse para afectar tanto a la medicion del marcador fluorescente como las reacciones de union. Por ejemplo, las particulas magneticas podrian medirse como una distribucion homogenea/distribuida en todo el canal, permitiendo mediciones de rango, mientras que las mismas particulas magneticas podrian acumularse para aumentar la intensidad de fluorescencia para impulsar la sensibilidad de la medicion. Asimismo, el mismo principio podria usarse para afectar las reacciones de union y ajustar los ensayos en consecuencia.
En el diseno de cartucho mostrado en la figura 1, se muestran dos canales identicos; sin embargo, las mediciones no requieren esto, por lo tanto, se puede emplear un canal en el cartucho, y esto podria permitir una medicion de inmunoensayo por debajo de 1 |jL.
En comparacion con el diseno de la tira 2 de canal, se unen los canales dentro del diseno de la tira 6 de canal (que se muestran en la figura 11). En la banda de 2 canales, los dos canales son entidades separadas que no estan unidas. El diseno de 6 canales puede tener canales unidos (al igual que el diseno de 2 canales) porque el sistema es un sistema sellado. En la figura 11, se muestran electrodos que podrian usarse para mediciones electroquimicas (219) que podrian situarse en uno o mas de los canales de muestra. Tambien se muestran electrodos que podrian usarse para la deteccion electroquimica y/o del fluido de muestra, asi como para actuar como caracteristicas de tope fluidicas (220, 221). La figura 11 tambien muestra 2 caracteristicas alternativas de diseno de la tira que podrian prestar la tira para ser llenada con la muestra de prueba que se presenta al final de la tira (217) o la parte superior de la tira (218). Cada canal de prueba dentro del cartucho de prueba puede tener uno o mas puertos de lavado (206, 208, 200, 202).
Los puertos de lavado de tira (200, 202) estan cerrados (sellados por el lector). Despues de un cierto tiempo (por ejemplo, 5 minutos), el lector puede colocar un iman en contacto con la tira reactiva, o muy cerca de la misma, lo que hara que las cuentas magneticas se acumulen en una banda apretada que se mantendra en posicion durante la etapa de lavado primario. El cartucho de la bomba de jeringa se puede activar para realizar una etapa de lavado con liquido o gas, un canal a la vez, por ejemplo, utilizando valvulas para controlar la apertura y el cierre de cada canal. (por ejemplo, el primer puerto (206) en aislamiento). O todos los canales al mismo tiempo, por lo que cada puerto (206 y 202) esta abierto al cartucho de la bomba de jeringa a traves de la ausencia de un sistema de valvulas, o un sistema de valvulas donde todas las valvulas asociadas estan abiertas. La realizacion preferida es el caso donde no hay valvulas presentes, ni en el lector ni en el cartucho de prueba desechable. Cuando la sangre se lava con tampon o gas (por ejemplo, aire) que se introduce a traves del primer puerto (206), la sangre se empuja sobre una caracteristica de tope fluidica (221) en el sumidero (210). La acumulacion de particulas magneticas descrita anteriormente, los procesos de relajacion por permanente o electroimanes, etc. siguen siendo exactamente iguales. En el caso de que el cartucho de la bomba de jeringa haya lavado los canales de prueba del cartucho de prueba con gas para un ensayo de una sola etapa, en este punto, la medicion fluorescente final para cada canal se puede realizar en el area de deteccion/medicion (222). Debe tenerse en cuenta que, en este caso, la medicion es la de una banda magnetica acumulada: complejo fluoroforo en el aire. En el caso de un ensayo de varias etapas, se requiere que el lector realice tareas adicionales, como se indica a continuacion.
La sangre no se empuja en los otros canales (212, 213, 214, 215, 216), ya que los puertos (200, 202) estan sellados o bajo presion/fuerza positiva debida al cartucho de bomba de jeringa que actua sobre estos puertos al mismo tiempo. (En este caso, no se requieren valvulas ni en el lector ni en el cartucho de prueba desechable). Por lo tanto, el unico lugar para que la sangre desplazada vaya es el sumidero (210). Cada canal tiene al menos un puerto(s) de entrada de fluido, por lo tanto, como el primer puerto esta abierto (por ejemplo, 206) y se usa como un puerto para dispensar liquido en el cartucho, los puertos adicionales (por ejemplo, 208) ubicados en el canal superior pueden cerrarse, evitando que se dispense fluido por el canal. Por lo tanto, la sangre se lava del canal y en el sumidero.
Una entrega secundaria del marcador puede ser realizada o, alternativamente, el complejo de analito de particulas magneticas puede ser transferido hasta el canal a la zona en la que el marcador se deposita (211, 212, 213, 214, 215, 216). Debe tenerse en cuenta que las caracteristicas impresas en el diseno de la tira se pueden usar para contener estos reactivos en un area predefinida. Este concepto tambien podria aplicarse a los reactivos primarios depositados en el canal de muestra de prueba (223). Esta entrega secundaria del proceso de marcado puede nuevamente realizarse individualmente en un proceso canal por canal, o puede realizarse en todos los canales a la vez. Cuando se usan varios puertos para un canal, este proceso se basa en los puertos (200, 202, 206, 208) que se abren y cierran (solo se abre un puerto por canal a la vez), en el caso de un solo puerto asociado con cada canal, esto no es necesario. En el caso de la entrega del marcador, el primer puerto de lavado de tiras (206) utilizado para la etapa de lavado se cerrara, y el segundo puerto ubicado en el canal se abrira y se usara para dispensar fluido para rehidratar y entregar el marcador al complejo de particula magnetica-analito o eliminar el aire (lo que resulta en un evento de transferencia). El evento de transferencia es posible porque la tira es un sistema sellado, y en lugar de bombear fluido hacia la tira, la "bomba" aspira aire desde la tira, lo que da como resultado que el complejo de analito de particulas magneticas en el tampon sea aspirado a lo largo del canal hacia el marcador depositado. Este proceso se repetiria para los canales restantes (212, 213, 214, 215, 216).
En el caso en el que solo hay un puerto asociado con cada canal de prueba (figura 26, 224), el volumen de aire presente en la zona (225) entre la muestra de ensayo y el puerto puede ser utilizado para desplazar la muestra a partir del area del canal de muestra (rellenado desde el puerto de entrada de muestra (226)). Por lo tanto, en el caso de que el cartucho de la bomba de jeringa contenga fluido, solo se requiere un puerto para realizar un ensayo de 2 etapas, ya que el lavado primario se realiza utilizando aire que ya esta presente en el canal de prueba del cartucho de prueba, lo que permite que el fluido posterior se bombee desde el cartucho para rehidratar los reactivos secundarios (depositados en la region identificada por el punto 227) y presentarlos al complejo de particulas magneticas presentes en el area del canal de muestra del canal de prueba. Es posible realizar un ensayo de 1 etapa con un lavado con aire con solo 1 puerto (224) asociado con cada canal, este es el diseno del cartucho (tira MST Pro V1, figura 26) asociado con la seccion experimental.
Como se ha descrito anteriormente, la presente plataforma permite medir multiples analitos dentro de cada canal. La multiplexacion se puede realizar facilmente en un canal depositando particulas magneticas con diferentes agentes de union contra los analitos que se mediran. Esto podria lograrse haciendo preparaciones individuales de particulas magneticas funcionalizadas con anticuerpos y luego combinandolas y depositandolas en el canal de muestra. En comparacion, se podria hacer una preparacion unica mediante la cual una poblacion de anticuerpos mixtos (contra todos los analitos que se van a medir) se acopla a una poblacion de particulas magneticas que da como resultado particulas magneticas que tienen varios anticuerpos diferentes acoplados a las mismas. En ambas realizaciones, se podrian hacer preparaciones de particulas de latex fluorescente/fluoroforos confiriendo la especificidad de anticuerpo requerida contra los analitos a medir, permitiendo que se realice un complejo clasico de "sandwich" de inmunoensayo (los inmunoensayos que emplean mediciones de fluorescencia en sangre y plasma no podrian realizar estas mediciones como las particulas magneticas especificas de diferentes analitos no podrian distribuirse espacialmente como se describio anteriormente). Se podrian realizar mas etapas de amplificacion si fuera necesario; y los reactivos podrian sintonizarse aun mas para permitir esto. Existe una amplia gama de fluoroforos disponibles con diferentes longitudes de onda de excitacion y emision y se preve que se puedan medir hasta 5 analitos diferentes dentro de un canal. Ademas de las mediciones de inmunoensayo, las mediciones electroqmmicas tambien podrian incorporarse en la medicion de la tira. Por ejemplo, se podria realizar una medicion electroqmmica de la concentracion de glucosa y una medicion de hemoglobina glicosilada utilizando la plataforma presente. Por ejemplo, en el caso de una medicion electroquimica de glucosa, se incorporaria un conjunto adicional de electrodos que reflejaria la posicion de los electrodos de hematocrito en el otro canal. Todos los reactivos necesarios se depositarian en los electrodos. A medida que la sangre llena los canales y se producen todos los eventos de inmunoensayo descritos anteriormente, se produce la medicion electroquimica de la glucosa en la sangre, el lector interpreta la concentracion de glucosa y la sangre se lava en el sumidero. Por lo tanto, la plataforma actual podra incorporar una gama muy diversa de mediciones en un cartucho.
Muchas de las plataformas actuales de inmunoensayos POC requieren el almacenamiento de las tiras refrigerado. La presente invention puede evitar tales problemas empleando caracteristicas que hacen posible la estabilidad a temperatura ambiente. Por ejemplo, otros sistemas de inmunoensayo POC tienen bolsas de tampon que contienen un sustrato enzimatico (un reactivo humedo), estos sustratos tienen una estabilidad de temperatura ambiente limitada y, como resultado, el producto tiene un perfil de estabilidad refrigerado. En comparacion, el unico reactivo "humedo" de la presente invencion es cartucho de deposito/depositos de tampon. Esto no esta contenido dentro del cartucho de muestra y como el tampon generalmente no se apaga a temperatura ambiente, la presente invencion evita este problema. Del mismo modo, ninguno de los reactivos es reactivo humedo, ya que todos se depositaran en el cartucho y seran resuspendidos por el tampon cuando se entreguen al canal de muestra o resuspendidos por la sangre. Los reactivos secos depositados evitaran asi cualquier inestabilidad del reactivo humedo; asimismo, se han evitado los marcadores de enzimas (es decir, los marcadores de enzimas y anticuerpos) (debido a sus perfiles de estabilidad deficientes) y las formulaciones de estabilizacion se pueden optimizar para un solo reactivo (por ejemplo, particulas magneticas) sin afectar al perfil de estabilidad de otros reactivos (por ejemplo, el marcador).
Seccion experimental
Materiales:
Maleimida-PEG2-biotina:
Thermo Scientific, Cat 21901 (EZ-link maleimida-PEG2-biotina).
Particulas de latex de amina fluorescente:
Invitrogen, Cat F8765 (1 |jm de fluoesferas de color amarillo verdoso con funcionalizacion de la superficie de la amina)
Particulas de latex de neutravidina fluorescentes:
Invitrogen, Cat F8776 (1 jm de fluoesferas de color amarillo-verde con funcionalizacion de la superficie con neutravidina)
Particulas paramagneticas:
Ademtech, Cat 03223 (200nm Strep particulas paramagneticas)
Anticuerpo 1H12:
Hytest, Cat 4P33 MAb 1H12 (anti-PSA, humano)
Anticuerpo 5A6:
Hytest, Cat 4P33 MAb 5A6 (anti-PSA, humano)
PBS:
Thermo Scientific, Cat 28372 (paquetes de solution salina tamponada con fosfato BupH)
BSA:
Sigma, Cat A4503-50G (albumina, a partir de suero bovino)
Agua:
Sigma, Cat W4502 (agua para biologia molecular)
2MEA:
Thermo Scientific, Cat 20408 (clorhidrato de 2-mercaptoetanolamina)
SPDP:
Pierce, Cat 21857 (3-(2-piridilditio) propionato de N-succinimidilo)
PSA:
Hytest, Cat 8P78 (antigeno espedfico de la prostata)
Kit de cuantificacion de biotina:
Thermo Scientific, Cat 28005 (kit de cuantificacion de biotina Pierce)
Columnas de exclusion de tamano:
Thermo Scientific, Cat 89882 (columnas desaladoras de centrifugacion Zeba)
Columnas de exclusion de tamano:
GE Healthcare, Cat. 17-0851-01 (columnas PD10)
EDTA:
Sigma, Cat EDS-100G (ácido tetraacetico etilendiamina, anhidro)
Tween:
Sigma P7949-100ML (Tween-20)
DMSO:
Thermo Scientific, Cat 20684 (dimetilsulfoxido)
Preparacion de reactivos
Preparacion de particulas paramagneticas y de latex utilizando interacciones estreptavidina-biotina y neutravidina-biotina, respectivamente.
Anticuerpo.
Reduccion de enlaces de disulfuro de anticuerpos para biotinilacion
Use un stock de anticuerpo sin diluir (1H12 y 5A6) a una concentracion entre 2 y 7 mg/ml. Se extrae un volumen apropiado de stock de anticuerpos para dar 1 mg de anticuerpo. Un volumen apropiado de EDTA 14,28 mM en PBS, pH 7,2 se agrega a 1 mg de anticuerpo para dar una concentracion de EDTA de 1 mM.
Se disuelven 6 mg de 2MEA en 100 |jl de EDTA 1 mM en PBS, pH 7,2. Se agrega 1 j l de esta solucion 2MEA por cada 10 j l de solucion de anticuerpo. Esta solucion se mezcla y se incuba en un bano de agua a 37 grados durante 90 minutos.
Esta solucion se pasa luego a traves de una columna PD10 (previamente equilibrada con EDTA 1 mM en PBS, pH 7,2) y se recogen las fracciones de 500 jl. Se toma una muestra de cada fraccion y se mide en un espectrofotometro UV, con la absorbancia a 280 nm utilizada para cuantificar la proteina encontrada en cada fraccion. Las fracciones que contienen concentraciones significativas de proteina se seleccionan y combinan y se vuelven a medir en el espectrofotometro UV. Esta medicion se utiliza para determinar la concentracion de anticuerpos usando un coeficiente de extincion del anticuerpo de 1 mg/ml = 1,4 unidades de absorbancia a 280 nm.
Union de maleimida-PEG2-biotina a anticuerpo
La maleimida-PEG2-biotina se disuelve en EDTA 1 mM en PBS, pH 7,2 para dar una solucion 20 mM. Se anade un volumen apropiado de esto al anticuerpo reducido para dar un exceso molar 40 veces mayor de maleimida-PEG2-biotina sobre el anticuerpo reducido. Luego se mezcla y se incuba durante 3 horas a temperatura ambiente. Luego se pasa a traves de otra columna PD10 que ha sido pre-equilibrada con EDTA 1 mM en PBS, pH 7,2. Se recogen fracciones de 500 j l y se miden utilizando el espectrofotometro UV a 280 nm. Las fracciones que contienen niveles significativos de proteinas son elegidas y combinadas. Una muestra de esta solucion se mide nuevamente a 280 nm por absorbancia, y la concentracion de anticuerpo se determina utilizando el coeficiente de extincion del anticuerpo de 1 mg/ml = 1,4 unidades de absorbancia a 280 nm. El numero de biotinas unidas por anticuerpo se determina luego utilizando el kit de cuantificacion de biotina Pierce, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Latex.
Union del anticuerpo biotinilado 5A6 al latex
1 |jm de latex recubierto con neutravidina se lava en 0,1 % de Tween-20 en PBS, pH 7,2 (mediante centrifugacion a 16100x g para 3,5 min, 4 °C) y se resuspendieron en el mismo a una concentracion de 0,5 % de solidos. El anticuerpo biotinilado 5A6 se diluye a una concentracion de 200 jg/ml en tween-20 al 0,1 % en PBS, pH 7,2. Luego se agrega un volumen igual de 200 jg/ml de b5A6 al latex al 0,5 %. Esta solucion se mezcla bien y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente con agitacion en un mezclador giratorio (30 rpm) en la oscuridad.
Luego, las particulas se lavan 4 veces (utilizando centrifugacion a 16100x g, 3,5 min a 4 °C) con un volumen igual de PBS, pH 7,2 para eliminar cualquier anticuerpo biotinilado no unido y se resuspenden en PBS, pH 7,2 para dar una concentracion de latex de un 0,25 % de solidos.
Esto sera referido en el texto como latex funcionalizado 1.
Particulas paramagneticas
Union del anticuerpo a la particula
Particulas paramagneticas recubiertas con estreptavidina a 200 nm se lavan (utilizando un separador magnetico) en tween al 0,1 % en PBS, pH 7,2 y se resuspenden en la misma para dar una concentracion de solidos del 0,5 %. El anticuerpo biotinilado 1H12 se diluye en Tween al 0,1% en PBS, pH 7,2 para dar 50 jg/ml. Un volumen igual de particulas paramagneticas al 0,5 % y 50 jg/ml de anticuerpo biotinilado se combinan, se mezclan y se dejan incubar durante 70 minutos a temperatura ambiente, con agitacion usando un agitador rotatorio a 30 rpm.
Las particulas paramagneticas se lavaron 4 veces (utilizando un separador magnetico) en un volumen igual de tween al 0,1 % en PBS, pH 7,2 y se resuspendieron en el mismo para dar una concentracion de particulas paramagneticas de 0,5 % de solidos. Esto sera referido en el texto como particulas paramagneticas funcionalizadas.
Preparacion de particulas de latex utilizando interacciones amina-SPDP.
Anticuerpo.
Reduccion de enlace de disulfuro de anticuerpo para la union a SPDP
Se usa un stock de anticuerpo sin diluir (5A6) a una concentracion entre 2 y 7 mg/ml. Se extrae un volumen apropiado de stock de anticuerpos para dar 100 jg de anticuerpo. Un volumen apropiado de EDTA 14,28 mM en PBS, pH 7.2 se agrega a 100 jg de anticuerpo para dar una concentracion de EDTA de 1 mM.
Se disuelven 6 mg de 2MEA en 625 j l de EDTA 1 mM en PBS, pH 7,2. Se agrega 1 j l de esta solucion 2MEA por cada 10 j l de solucion de anticuerpo. Esta solucion se mezcla y se incuba en un bano de agua a 37 grados durante 90 minutos.
Esta solucion se pasa luego a traves de una columna de desalinizacion por centrifugacion Zeba (previamente equilibrada con EDTA 1 mM en PBS, pH 7,2) y se recoge el flujo. Se toma y se mide una muestra de flujo a traves del espectrofotometro UV, con la absorbancia a 280 nm registrada. Esta medicion se utiliza para determinar la concentracion de anticuerpos usando un coeficiente de extincion del anticuerpo de 1 mg/ml = 1,4 unidades de absorbancia a 280 nm.
Latex.
El latex fluorescente funcionalizado con amina se lava en EDTA 1 mM en PBS, pH 7,2 (usando centrifugacion a 16100x g durante 3,5 min, 4 °C) y se resuspende en el mismo a una concentracion de 0,5 % de solidos.
El SPDP se disuelve en un volumen apropiado de DMSO para dar una concentracion de 20 mM de SPDP. Luego se agrega SPDP en DMSO al latex al 0,5 % para dar SPDP 1 mM. Esto se mezcla e incuba en la oscuridad durante 70 minutos con agitacion suave (30 rpm en el mezclador rotativo). Luego, el latex se lava 3 veces con un volumen de reaccion 2x de EDTA 1 mM en p Bs , pH 7,2 (usando centrifugacion a 16100x g durante 3,5 min, 4 °C). El latex se resuspende luego en el mismo volumen apropiado para obtener una concentracion de latex de 0,5 % de solidos. Esto proporciona un latex que esta unido a SPDP, listo para la union del anticuerpo reducido.
Union de latex con anticuerpos reducidos con SPDP unido.
Anticuerpo reducido 5A6 se diluye a 1 mg/ml en EDTA 1 mM en PBS, pH 7,2. Luego se mezcla 1 mg/ml de anticuerpo con latex al 0,5 % unido a SPDP en una proporcion de 1:1. Esto proporciona una mezcla de union de latex al 0,25 % con 500 jg/ml de anticuerpo en EDTA 1 mM en PBS, pH 7,2.
Esta reaccion de union se incuba a temperatura ambiente en la oscuridad durante 19,5 horas y luego se lava 4 veces con un volumen de reaccion 1x de PBS, pH 7,2 (usando centrifugacion a 16100x g durante 3,5 min, 4 °C). El latex se resuspendio luego en PBS, pH 7,2 en el volumen apropiado para dar solidos al 0,25 %.
Esto sera referido en el texto como latex funcionalizado 2.
Procedimientos de ensayo
Ensayo 1:1 etapa de ensayo en humedo con lavado manual
Se anaden 7 |jl de particulas paramagneticas funcionalizadas al 0,5 % (con b1H12 unido) a un eppendorf y se colocan en un separador magnetico. El sobrenadante se elimina y las particulas se resuspenden en 49 j l de 30 mg/ml de BSA en un 0,05 % de tween-20 en PBS, pH 7,2. A esto, se anaden 7 j l de latex 1 funcionalizado al 0,25 % (con 5A6 biotinilado unido) y se mezcla la solucion.
Se retiraron 8 j l de esta mezcla y se agregaron a 2 j l de proteina PSA en 60 mg/ml de BSA en PBS, pH 7,2 (N.B. El PSA se encuentra a 5 veces la concentracion final requerida). Se mezcla y se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente.
El eppendorf se agrega luego a un separador magnetico y el sobrenadante se elimina cuidadosamente. Luego se agregan 20 j l de tween-20 al 0,05 % en PBS, pH 7,2 al sedimento, mientras se mantiene en el separador magnetico. Se elimino el sobrenadante y se usaron 20 j l de tween-20 al 0,05 % en PBS, pH 7,2 para resuspender los complejos de particulas, una vez retirados del separador magnetico.
Esto se repite con varias concentraciones diferentes de PSA, produciendo complejos de ensayo humedos lavados que se han diluido 2x de la reaccion original.
Estos complejos diluidos y lavados se miden de 3 maneras diferentes de la siguiente manera:
Medida de ensayo en humedo lavado 1:
Se anaden 2 j l de complejos de ensayo humedos lavados a 38 j l de PBS en un Optiplato negro de 384 pocillos para la medicion de fluorescencia. Luego se mide la placa con un Perkin Elmer Victor3 V. La senal fluorescente en el pozo se mide con el programa incorporado 'Fluorescein (485 nm/535 nm, 0,1s)', adaptado para su uso en un formato de 384 pocillos. Este programa utiliza la excitacion a 485 nm y la emision a 535 nm con un tiempo de medicion de 0,1 s.
Medida de ensayo en humedo lavado 2:
8 |jl de complejos de ensayo lavados en humedo se utilizan para rellenar un cartucho 'tira MST Pro V1' (como se muestra en la figura 26). Los reactivos de ensayo humedos lavados se aplicaron al cartucho a traves del puerto de entrada de la muestra (226). Esto permitio que la muestra (en este caso los reactivos de ensayo humedos lavados) llenara los 6 canales hasta las caracteristicas de tope fluidicas (229, 228, 239, 237) (que tambien pueden actuar como electrodos de deteccion de llenado a traves de la conexion electrica al lector a traves del conector (230)). Este cartucho se inserta en un lector 'medidor MST Pro V1' (como se muestra en la figura 12) y la senal se mide por la optica en el lector que escanea cada canal utilizando un movimiento lineal del cabezal optico en la posicion (222, 242). En este metodo, los complejos de ensayo humedos lavados se distribuyen homogeneamente por todo el canal y, por lo tanto, en el area de deteccion (es decir, no se concentran en una banda mediante el uso de un campo magnetico). Cabe senalar que las mediciones no se realizan en el canal (243) en estos experimentos, ya que se ha configurado como un canal de correccion del hematocrito con electrodos de hematocrito (237) para las mediciones de sangre completa que no se utilizan aqui. Tambien se debe tener en cuenta que los electrodos de hematocrito, en este caso, se han hecho de un material hidrofobo para evitar el llenado de todo el canal y, por lo tanto, de la muestra de desecho. Para electrodos de hematocrito en funcionamiento se usaria un material menos hidrofobo o hidrofilo. Medida de ensayo en humedo lavado 3:
Los cartuchos (tira MST Pro V1) llenos de complejos de ensayo humedos lavados, como se describe en la medicion ensayo humedo lavado 2 anterior, entonces se volvieron a medir utilizando el Victor3 V. Esto se llevo a cabo fijando el cartucho a un Optiplate negro de 384 pocillos y alineando el canal del cartucho a medir (en las posiciones 222, 241) sobre un pocillo especifico. La senal fluorescente del canal se midio luego midiendo la senal del pocillo correspondiente utilizando el programa incorporado 'Fluorescein (485 nm/535 nm, 0,1 s)', adaptado para su uso en un formato de 384 pocillos. Este programa utiliza la excitacion a 485 nm y la emision a 535 nm con un tiempo de medicion de 0,1 s. Esto se repitio para cada canal a medir.
Resultados para el ensayo 1:
Los resultados para las comparaciones entre los diferentes metodos de medicion de los complejos de ensayo humedos lavados se muestran en las figuras 16, 17 y 18.
La figura 16 muestra el total de los ensayos humedos lavados con PSA medidos en una tira MST Pro V1 en el medidor MST Pro V1 (medicion 2 del ensayo humedo lavado). Se realizaron ensayos de PSA total en humedo segun la metodolog^a experimental descrita anteriormente. El ensayo humedo total lavado con PSA se midio en el medidor MST Pro V1 como se muestra en la figura 12. Los resultados muestran claramente una respuesta de ensayo sistematico con una fase lineal inicial seguida de una fase no lineal. El corte clinico para los ensayos de PSA total utilizados en el cribado del cancer de prostata es de 4 ng/ml. El ensayo es claramente lo suficientemente sensible como para realizar mediciones precisas por encima del valor de umbral de corte de una manera cuantitativa. En este conjunto de datos, los complejos de particulas de PSA-latex paramagnetico se distribuyen homogeneamente a lo largo de los canales de tira durante la fase de medicion optica. El medidor MST Pro solo se ha utilizado para medir los ensayos en humedo lavados con PSA total en una tira.
La figura 17 muestra la correlacion entre los ensayos humedos lavados con PSA total medidos en tiras en el medidor MST Pro y Victor3 V. Las mismas tiras (que contienen los ensayos humedos lavados con PSA total lavados) que se midieron en el medidor MST Pro (ver la figura 16, medicion del ensayo lavado en humedo 2) se midio luego en el Victor3 V (medicion del ensayo humedo lavado 3), con los resultados resumidos en la figura 17. Se observa una clara correlacion entre los dos metodos de medicion (medidor MST Pro V1 y Victor3 V), especialmente considerando que el Victor3 V es un lector de placas convencional y no esta disenado para medir senales fluorescentes en tiras de laminado. Esto probablemente explica el mayor error asociado con las mediciones de Victor V. Los datos demuestran que la medicion optica realizada por el medidor MST Pro V1 es una medicion precisa altamente sensible, especialmente cuando se compara con una muy costosa tecnologia de lector de placa fluorescente "estandar de oro" (Victor3 V).
La figura 18 muestra la correlacion entre los ensayos humedos lavados con PSA total medidos en tiras en el medidor MST Pro y el Victor V. Los ensayos humedos lavados con PSA total tambien se midieron en un ensayo de placa de microtitulacion convencional utilizando el Victor3 V (medicion de ensayo humedo lavado 1). Estos resultados se compararon con los ensayos humedos lavados con PSA total medidos en una tira con el medidor MST Pro V1 (medicion de ensayo humedo lavado 2). La correlacion entre las dos metodologias de medicion se muestra en la figura 18. Se observa una excelente correlacion entre las dos metodologias que demuestran la capacidad de realizar mediciones altamente sensibles y precisas utilizando el medidor y tira MST Pro (Platforma) en volumenes de muestra muy pequenos. El canal de muestra es de 1 |jL, sin embargo, el volumen medido en la tira V1 de MST pro por el bloque optico es solo de aproximadamente 0,2 j L.
Ensayo 2: Ensayo en humedo de 1 etapa con lavado y medicion realizado en el lector 'medidor MST pro V1'
Los reactivos del ensayo se combinan en los siguientes volumenes y concentraciones en un tubo eppendorf:
Particulas paramagneticas funcionalizadas al 0,5% (con b1H12 unido): 1 j l 30 mg/ml de BSA, interpolation al 0,05% en PBS, pH 7,2: 6 jl 0,25% de latex funcionalizado 1 (con 5A6 biotinilado unido): 1 j l PSA (diluido en 60 mg/ml de BsA en PBS, pH 7,2): 2 jl
Todos los reactivos se mezclan y luego se usan para llenar los canales de un cartucho 'tira MST Pro V1' (consulte la figura 26 para la description del cartucho usado) a traves del puerto de entrada de muestra (226) donde llena los canales hasta las caracteristicas de tope fluidica (229 , 228, 237). Este cartucho se inserta en un lector 'medidor MST Pro V1' (consulte la figura 12 para obtener una descripcion del lector utilizado) a traves del conector (230), donde se produce una incubation de 5 minutos. Luego, el lector trae un iman permanente al cartucho donde actua para recolectar las particulas paramagneticas y cualquier cosa unida a las mismas en el area de detection (222, 241). La cabeza del lector optico luego realiza una medicion de la senal fluorescente escaneando las areas de deteccion de cada canal (222, 241). Esta medicion incluye el latex fluorescente unido especificamente a las particulas paramagneticas a traves de PSA y tambien cualquier latex fluorescente no unido que se encuentra dentro del area de deteccion (consulte la figura 20 para obtener una descripcion de estos resultados). El cabezal de sellado del lector forma un cierre hermetico a los fluidos con puertos de entrada de los canales 1,2, 3, 4, 5, 6 (224, 231,232, 233, 234, 235, respectivamente). Mientras los complejos paramagneticos se mantienen en su lugar con el iman, el lector realiza una etapa de lavado expulsando a) el tampon de lavado (0,1% tween-20 en PBS, pH 7,2) o b) aire del cartucho de la bomba de jeringa (como se muestra) en la figura 15, imagen inferior del cartucho de jeringa de 6 camaras a traves de los puertos de entrada (231, 232, 233, 234, 235, 224) para desplazar el fluido de muestra del canal y, por lo tanto, eliminar el latex sin unir del area de deteccion, donde se desplaza hacia el sumidero (236). Luego, el cabezal del lector optico realiza una medicion de la senal fluorescente restante de los complejos de union dentro de la matriz de la sustancia de lavado (fluido o aire) al escanear las areas de deteccion de cada canal (222, 241) (ver la figura 19 para una descripcion de estos resultados usando el lavado con aire y la figura 21 para los resultados usando el lavado con tampon de lavado).
Resultados para el ensayo 2:
La figura 20 muestra un ensayo de PSA total en humedo realizado en el medidor y tira MST Pro, no usa una etapa de lavado y mide la intensidad de fluorescencia del fluoroforo despues de que el complejo de particulas paramagneticas-PSA-latex fluorescente se acumula por el iman. Un control integrado altamente efectivo se resume en la figura 20. Antes de que el medidor realice un lavado con aire o fluido, el iman acumula complejos de particulas de latex paramagnetico-PSA-fluorescente. En este punto, el medidor puede realizar una lectura optica de los canales y cuantificar la concentration del marcador de latex fluorescente como se muestra en la figura 20. Es interesante que los recuentos de ADC de respuesta fluorescente esten relacionados con la concentracion de PSA, es decir, una respuesta de dosis sin una etapa de lavado, que podria utilizarse como un ensayo homogeneo independiente. Luego, el medidor realiza la etapa de lavado y mide la concentracion de los complejos de latex fluorescente de particulas paramagneticas-PSA. La senal fluorescente del ensayo siempre debe ser inferior despues de la etapa de lavado (aire o fluido), ya que el marcador fluorescente no unido se retira del canal.
La figura 19 muestra el ensayo de PSA total en humedo realizado en el medidor y la tira MST Pro, el medidor utiliza una etapa de lavado con aire para expulsar el marcador sin unir del canal. Los ensayos humedos lavados con PSA total se realizaron con medidor y tira MST Pro V1. El medidor MST Pro V1 utiliza un lavado con aire para expulsar la muestra (que contiene el marcador sin unir) de los canales de tira en el sumidero. Los resultados se resumen en la figura 19, la curva de respuesta a la dosis del ensayo demuestra claramente una respuesta de ensayo rapida, sensible, precisa y cuantitativa para el PSA total. El tiempo de prueba de 5 minutos seria una mejora significativa en las pruebas de PSA POC rapidas actuales, al igual que las mejoras en la sensibilidad/precision y la naturaleza cuantitativa del ensayo demostrado. Es interesante que los datos demuestran claramente que un "lavado con aire" es un metodo muy eficaz para eliminar el marcador fluorescente no unido del canal y que las mediciones precisas de los marcadores fluorescentes unidos a las particulas paramagneticas a traves del analito (PSA) se puedan realizar en un entorno no liquido. Esto permite formatear ensayos simples, pero altamente funcionales en la plataforma MST Pro.
La figura 21 muestra un ejemplo de una curva de respuesta de dosis de datos para el ensayo de PSA total en humedo realizado en el medidor y tira MST Pro, donde el medidor utiliza una etapa de lavado con fluido para expulsar el marcador sin unir del canal. El lavado con liquido es altamente efectivo y demuestra una prueba de PSA rapida, sensible y precisa. En comparacion con la metodologia de lavado con aire, los complejos de marcador de particulas de latex fluorescente-PSA paramagnetico se miden opticamente en el entorno fluido. El lavado con tampon fluido podria contener componentes que podrian mejorar aun mas la senal fluorescente (por ejemplo, agentes quelantes, agentes de liberation de tinte fluorescente, etc.).
Ensayo 3: Ensayo en seco de 1 etapa con lavado y medicion realizado en el lector 'medidor MST pro V1'
Los reactivos se depositan y se secan dentro de un cartucho de 'tira MST Pro V1' de la siguiente manera:
8 |jl de particulas paramagneticas funcionalizadas al 0,5% (con 1H12 biotinilado unido) 8 j l de trehalosa 25 mg/ml en PBS, pH 7,2
8 j l de 300 mg/ml de BSA en PBS, pH 7,2
8 j l de tween-20 al 0,1% en PBS, pH 7,2
8 j l de 0,25 % de latex funcionalizado 2 (con 5A6 unido mediante SPDP)
Los reactivos anteriores se combinan y se agrega 1 j l de esta mezcla de deposition de 1 etapa por canal de un cartucho de 'tira MST Pro V1' (como se muestra en la figura 26). Los reactivos se depositan en la position (223, 242) en cada canal y no se les permite ingresar al area de detection (222, 241) (esto se logra mediante el uso de una linea de pluma hidrofobica para definir el area de deposicion del reactivo en una sola superficie del laminado cartucho, que es suficiente para evitar la propagation del reactivo, pero no lo suficientemente fuerte como para evitar el llenado de la muestra del cartucho completamente montado por la fuerza del capilar). Para la deposicion, el cartucho esta medio montado, con solo la parte inferior y la capa media del cartucho unidas entre si. Los reactivos se pipetean en la zona de deposicion de reactivos del canal de muestra de prueba medio montado (consulte la figura 26, con la zona de deposicion de reactivos indicada en el cartucho como punto 223, 242). Estos se secan en un horno a 33 °C durante 10 minutos. La capa superior del cartucho se une a la mitad del cartucho montado para producir un cartucho de tres capas completamente montado (consulte la figura 2 para ver un ejemplo de como las tres capas se unen para formar un cartucho montado, para un diseno de cartucho diferente) con reactivos secos. La figura 26 (240) indica la forma del material adhesivo de doble cara que se corta para formar canales y estructuras de sumidero cuando se une entre dos capas de material laminado. Luego, el cartucho se almacena en una bolsa de lamina sellada que contiene desecante hasta su uso.
La proteina PSA se diluye a la concentracion requerida en 60 mg/ml de BSA en PBS, pH 7,2. Se inserta un cartucho que contiene reactivos secos en el lector de 'medidor MST Pro V1' y luego se agregan 8 j l de PSA al cartucho para llenar los canales de muestra de prueba. La muestra se aplica al cartucho a traves del puerto de entrada de la muestra (226) y llena los canales por la fuerza capilar hasta las caracteristicas de tope fluidicas hidrofobas (229, 228, 239, 237). La incubation de enlace de 5 minutos se produce antes de que el lector lleve un iman permanente al cartucho donde actua para recolectar las particulas paramagneticas y todo lo que se encuentre vinculado al area de deteccion (222, 241). El cabezal de sellado del lector forma un cierre hermetico a los fluidos con puertos de entrada de los canales 1, 2, 3, 4, 5, 6 (224, 231, 232, 233, 234, 235, respectivamente). Mientras los complejos paramagneticos se mantienen en su lugar con el iman, el lector realiza una etapa de lavado expulsando aire del cartucho de la bomba de jeringa (como se muestra en la figura 15, imagen inferior del cartucho de jeringa de 6 camaras) para desplazar el fluido de muestra del canal y, por lo tanto, retirar el latex sin unir del area de deteccion y colocandolo en el sumidero (236). La cabeza del lector optico luego realiza una medicion de la senal fluorescente restante (de los complejos de enlace de sandwich espedficos de particulas paramagneticas, pardculas fluorescentes de PSA) que permanecen en el aire al escanear las areas de detection de cada canal (222, 241) (ver la figura 22 para una description de estos resultados).
Resultados para el ensayo 3:
La figura 22 muestra los resultados de un ensayo de PSA en seco total realizado en el medidor y la tira MST Pro, el medidor utiliza la etapa de lavado con aire para expulsar el marcador no unido del canal. Todos los reactivos fueron depositados en la tira. El rango dinamico del ensayo de PSA total se incremento significativamente al usar una preparation diferente del marcador de latex fluorescente y al reducir la tension de entrada al detector optico. Los resultados del resumen se muestran en la figura 22, donde el ensayo es un ensayo completamente seco con todos los reactivos depositados dentro de la tira. El rango de ensayo se ha extendido significativamente, la respuesta lineal se ha incrementado 10 veces (10 a 100 ng/ml), y esto es de gran valor ya que algunos ensayos requieren analisis con un limite de deteccion bajo, pero un rango dinamico grande. Con tales ensayos, la linealidad no se mantiene en el amplio rango dinamico, lo que resulta en una reduction del rendimiento del ensayo en concentraciones mas altas. La plataforma MST Pro puede superar esta limitation de varias maneras. Por ejemplo, la no linealidad debida a la saturation del detector optico se puede superar al reducir la sensibilidad del detector optico al reducir la tension de entrada. Por lo tanto, si la union es lineal, la sensibilidad reducida del detector optico permitira aumentar aun mas el rango dinamico del ensayo (el medidor contendra una curva de calibration de PSA para la configuration del detector optico alto y bajo). En comparacion, si la no linealidad se debe a una limitacion del reactivo, se podrian usar dos canales de la tira MST Pro para maximizar el rendimiento del ensayo en todo el rango del ensayo. Los reactivos desarrollados para realizar mediciones muy sensibles que tienen un rango dinamico limitado podrian depositarse en un canal, mientras que los reactivos que son menos sensibles pero que permiten que el rango dinamico del ensayo se incremente significativamente podrian depositarse en otro canal. Cada conjunto de reactivos/canal tendria su propia curva de calibracion, lo que permitiria mejorar el rendimiento del ensayo en todo el rango del ensayo.
Ensayo 4: Ensayo semiseco de 2 etapas (particulas secas de latex) con lavado y medicion realizadas en el lector de 'medidor MST Pro V1'
Los reactivos se depositan y se secan dentro de un cartucho de 'tira MST Pro V1' de la siguiente manera:
10 |jl de latex funcionalizado al 0,25% (con enlace 5A6 biotinilado)
10 j l de 25 mg/ml de trehalosa en PBS, pH 7,2
20 j l de 300 mg/ml de BSA en PBS, pH 7,2
10 j l de tween-20 al 0,1% en PBS, pH 7,2
Los reactivos anteriores se combinan y se agrega 1 j l de esta mezcla de deposition por canal de un cartucho de 'tira MST Pro V1' (como se muestra en la figura 26). Los reactivos se depositan en la position (223, 242) en cada canal y no se les permite ingresar al area de deteccion (222, 241) (esto se logra mediante el uso de una linea de pluma hidrofobica para definir el area de deposicion del reactivo en una sola superficie del laminado cartucho, que es suficiente para evitar la propagation del reactivo, pero no lo suficientemente fuerte como para evitar el llenado de la muestra del cartucho completamente montado). Para la deposicion, el cartucho esta medio montado, con solo la parte inferior y la capa media del cartucho unidas entre si. Los reactivos se pipetean en la zona de deposicion de reactivos del canal de muestra de prueba medio montado (consulte la figura 26, con la zona de deposicion de reactivos indicada en el cartucho como punto 223, 242). Estos se secan en un horno a 33 °C durante 10 minutos. La capa superior del cartucho se une a la mitad del cartucho montado para producir un cartucho de tres capas completamente montado (consulte la figura 2 para ver un ejemplo de como las tres capas se unen para formar un cartucho montado, para un diseno de cartucho diferente) con reactivos secos. La figura 26 (240) indica la forma del material adhesivo de doble cara que se corta para formar canales y estructuras de sumidero cuando se une entre dos capas de material laminado. Luego, el cartucho se almacena en una bolsa de lamina sellada que contiene desecante hasta su uso.
En este ensayo de 2 etapas, la primera etapa de union (particulas paramagneticas funcionalizadas con PSA) se lleva a cabo en un formato humedo, antes de la segunda etapa de union (particulas paramagneticas funcionalizadas - PSA con latex funcionalizado 1) se produce utilizando el latex funcionalizado seco 1 en el cartucho de la tira MST Pro V1' de la siguiente manera:
Etapa 1
Los siguientes reactivos se combinan:
2 j l de particulas paramagneticas funcionalizadas al 0,5 % (con 1H12 biotinilado unido)
6 j l de 30 mg/ml de BSA en PBS, pH 7.
2 j l de PSA (diluido en 60 mg/ml de BSA en PBS, pH 7,2)
Esta primera reaction de union se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente antes de agregar 8 j l al cartucho que contiene latex funcionalizado seco para llenar los canales de muestra de prueba, como se muestra en la figura 26. La muestra se aplica al puerto de entrada de muestra (226) donde llena los canales hasta las caracteristicas de tope de fluidos (228, 239, 229) (que estan hechas de tinta hidrofoba). La incubacion de enlace de 5 minutos se produce antes de que el lector lleve un iman permanente al cartucho donde actua para recolectar las particulas paramagneticas y todo lo que se encuentre vinculado al area de deteccion. El cabezal de sellado del lector entonces forma un cierre hermetico a los fluidos con puertos de entrada de los canales 1,2, 3, 4, 5, 6 (224, 231,232, 233, 234, 235, respectivamente). Mientras los complejos paramagneticos se mantienen en su lugar con el iman, el lector realiza una etapa de lavado expulsando aire del cartucho de la bomba de jeringa para desplazar el liquido de muestra del canal y, por lo tanto, retira el latex no adherido del area de deteccion (222, 241) y colocandolo en el sumidero (236). La cabeza del lector optico luego realiza una medicion de la senal fluorescente restante (de los complejos de enlace de sandwich especificos de particulas paramagneticas, particulas fluorescentes de PSA) que permanecen en el aire al escanear las areas de deteccion de cada canal (ver la figura 23 para una description de estos resultados).
Resultados para el ensayo 4:
La figura 23 muestra un ensayo de dos etapas de PSA total realizado en el medidor y la tira MST Pro. El medidor utiliza una etapa de lavado con aire para expulsar el marcador no unido del canal. El marcador de latex fluorescente se deposito en la tira. Los resultados de resumen se muestran en la figura 23. El marcador de latex fluorescente se deposito en la tira y la muestra que contenia PSA y particulas paramagneticas se agrego a la tira. El medidor realizo un lavado con aire y midio opticamente la concentration del marcador de latex fluorescente capturado. Se observan curvas de respuesta a la dosis sistematica y demuestran que los ensayos de dos o tres etapas pueden formatearse en la plataforma MST Pro y que el marcador de latex fluorescente podria depositarse en una tira y usarse para realizar ensayos de dos etapas.
Ensayo 5: Ensayo semiseco de 2 etapas (particulas paramagneticas secas) con lavado y medicion realizada en el lector de 'medidor MST Pro V1'
Los reactivos se depositan y se secan dentro de un cartucho de 'tira MST Pro V1' de la siguiente manera:
10 ^l de particulas paramagneticas funcionalizadas al 0,5% (con enlace 1H12 biotinilado)
10 Ml de PBS, pH 7,2
10 Ml de 25 mg/ml de trehalosa en PBS, pH 7,2
10 Ml de 300 mg/ml de BSA en PBS, pH 7,2
10 Ml de tween-20 al 0,1% en PBS, pH 7,2
Los reactivos anteriores se combinan y se agrega 1 Ml de esta mezcla de deposition por canal de un cartucho de 'tira MST Pro V1' (como se muestra en la figura 26). Los reactivos se depositan en la position (223, 242) en cada canal (sin embargo, no es vital que estos reactivos se mantengan separados del area de deteccion ya que no se deposita ningun marcador (latex fluorescente)). Para la deposicion, el cartucho esta medio montado, con solo la parte inferior y la capa media del cartucho unidas entre si. Los reactivos se pipetean en la zona de deposicion de reactivos del canal de muestra de prueba medio montado (consulte la figura 26, con la zona de deposicion de reactivos indicada en el cartucho como punto 223, 242). Estos se secan en un horno a 33 °C durante 10 minutos. La capa superior del cartucho se une a la mitad del cartucho montado para producir un cartucho de tres capas completamente montado (consulte la figura 2 para ver un ejemplo de como las tres capas se unen para formar un cartucho montado, para un diseno de cartucho diferente) con reactivos secos. La figura 26 (240) indica la forma del material adhesivo de doble cara que se corta para formar canales y estructuras de sumidero cuando se une entre dos capas de material laminado. Luego, el cartucho se almacena en una bolsa de lamina sellada que contiene desecante hasta su uso.
En este ensayo de 2 etapa, la primera etapa de union (latex 1 funcionalizado con PSA) se realiza en un formato en humedo, antes de la segunda etapa de union (latex funcionalizado 1-PSA con particulas paramagneticas funcionalizadas) se produce utilizando particulas paramagneticas funcionalizadas secas dentro del cartucho de 'tira MST Pro V1' de la siguiente manera:
Etapa 1
Los siguientes reactivos se combinan:
2 Ml de latex funcionalizado al 0,25 % (con 5A6 biotinilado unido)
6 Ml de 30 mg/ml de BSA en PBS, pH 7,2
2 Ml de PSA (diluido en 60 mg/ml de BSA en PBS, pH 7,2)
Esta primera reaction de union se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente antes de agregar 8 Ml al cartucho (como se muestra en la figura 26) que contiene particulas paramagneticas funcionalizadas secas para llenar los canales de muestra de prueba. La muestra de 8 Ml se aplica al puerto de entrada de muestra (226) y llena los canales hasta las caracteristicas de tope fluidicas (229, 228, 239). La incubacion de enlace de 5 minutos se produce antes de que el lector lleve un iman permanente al cartucho donde actua para recoger las particulas paramagneticas y cualquier cosa unida a ellas en el area de detection (222, 241). El cabezal de sellado del lector entonces forma un cierre hermetico a los fluidos con puertos de entrada de los canales 1,2, 3, 4, 5, 6 (224, 231,232, 233, 234, 235, respectivamente). Mientras los complejos paramagneticos se mantienen en su lugar con el iman, el lector realiza una etapa de lavado expulsando aire del cartucho de la bomba de jeringa para desplazar el liquido de muestra del canal y, por lo tanto, retira el latex no adherido del area de deteccion (222, 241) y colocandolo en el sumidero (236). La cabeza del lector optico luego realiza una medicion de la senal fluorescente restante (de los complejos de enlace de sandwich especificos de particulas paramagneticas, particulas fluorescentes de PSA) que permanecen en el aire al escanear las areas de deteccion de cada canal (222, 241) (ver la figura 24 para una description de estos resultados).
Resultados para el ensayo 5:
La figura 24 muestra un ensayo de PSA total de dos etapas realizado en el medidor y la tira MST Pro, el medidor utiliza etapa de lavado con aire para expulsar el marcador sin unir del canal. La fase de captura de particulas paramagneticas se deposito en la tira. El medidor utiliza una etapa de lavado con aire para expulsar el marcador no unido del canal. Las particulas paramagneticas se depositaron en la tira y se añadió una muestra de PSA/marcador de latex a la tira. El medidor realizo un lavado con aire y midio opticamente la concentration del marcador de latex fluorescente capturado. Se muestra una curva de respuesta a la dosis sistematica para los ensayos de dos etapas y demuestra que los ensayos de dos o tres etapas pueden formatearse en la plataforma MST Pro y que las particulas paramagneticas podrian depositarse en una tira y usarse para realizar ensayos de dos etapas. Estos resultados, junto con los del Ensayo 4 (figura 23) muestran como seria posible secar latex y particulas paramagneticas dentro del mismo cartucho y realizar un ensayo de 2 etapas completamente seco.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un metodo para realizar un ensayo en una muestra, comprendiendo el metodo:
introducir una muestra fluida en un cartucho microflmdico; comprendiendo el cartucho:
un sustrato que comprende uno o mas canales microflmdicos dispuestos en el mismo y que comprende un agente de union dispuesto dentro de dicho(s) canal(es) para unir cualquier analito dentro de la muestra, comprendiendo el agente de union propiedades magneticas;
un puerto de muestra para introducir dicha muestra de fluido en el cartucho;
un sumidero de salida de fluido para eliminar fluido de dicho(s) canal(es); una o mas caracteristicas de tope disenadas para evitar que la muestra u otros liquidos pasen a traves de la(s) caracteristica(s) de tope solo por accion capilar y
al menos un puerto de entrada de fluido para permitir introducir uno o mas fluidos en el cartucho y transportarlos a traves del(los) canal(es) microfluidico(s) y/o el aire que se debe ventilar desde el cartucho; permitir que la muestra de fluido se extraiga a traves del cartucho, de modo que la muestra de fluido entre en contacto con dicho agente de union antes de ser detenida por dicha una o mas caracteristicas de tope, por lo que al menos una porcion de cualquier analito presente en la muestra esta limitada por el agente de union que comprende propiedades magneticas;
mantener el analito unido en posicion utilizando el iman o el campo magnetico aplicado por un lector; lavar cualquier material no unido del analito unido utilizando el lector; y
detectar de manera fluorescente cualquier analito unido presente en el cartucho;
caracterizado por que la etapa de lavado se realiza utilizando solo el aire presente en el cartucho y la deteccion fluorescente se realiza en el aire.
2. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que un marcador u otro reactivo pueden ponerse en contacto con el analito unido.
3. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la deteccion se realiza en cualquier analito unido, que esta sustancialmente libre de componentes de la muestra.
4. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra de fluido es una muestra de sangre completa.
5. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la muestra de fluido introducida en el cartucho microfluidico es inferior a 1 microlitro.
6. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la muestra se introduce en el cartucho mediante accion capilar.
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