ES2713428T3 - Inmunoensayo de canalización de oxígeno luminiscente utilizando tres anticuerpos y métodos de producción y uso de los mismos - Google Patents

Inmunoensayo de canalización de oxígeno luminiscente utilizando tres anticuerpos y métodos de producción y uso de los mismos Download PDF

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David J Ledden
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Abstract

Un kit que contiene un sistema de detección quimioluminiscente para un analito específico, comprendiendo el kit: (a) una primera composición que comprende un compuesto quimioluminiscente activable por oxígeno singlete y un primer anticuerpo o fragmento de unión del mismo asociado con el mismo, en el que el primer anticuerpo o fragmento de unión del mismo es un anticuerpo de detección que se une específicamente a un primer epítopo del analito, por lo que el compuesto quimioluminiscente activable por oxígeno singlete es capaz de unirse indirectamente al analito a través del primer anticuerpo o fragmento de unión del mismo; (b) una segunda composición que comprende un compuesto quimioluminiscente activable por oxígeno singlete y un segundo anticuerpo o fragmento de unión del mismo asociado con el mismo, en donde el segundo anticuerpo o fragmento de unión del mismo es un anticuerpo de detección que se une específicamente a un segundo epítopo del analito, por lo que el compuesto quimioluminiscente activable por oxígeno singlete es capaz de unirse indirectamente al analito a través del segundo anticuerpo o fragmento de unión del mismo, y en donde el primer y segundo epítopos se superponen al menos parcialmente de tal manera que el primer y segundo anticuerpo o fragmentos de unión del mismo no pueden unirse a una solo molécula del analito; y (c) una tercera composición que comprende un tercer anticuerpo o fragmento de unión del mismo, siendo el tercer anticuerpo o fragmento de unión del mismo un anticuerpo de captura que se une específicamente a un tercer epítopo del analito que no se superpone con el primer y segundo epítopos, por lo que una única molécula de analito puede unirse al tercer anticuerpo o fragmento de unión del mismo y uno del primer y segundo anticuerpos o fragmentos de unión del mismo, y en donde el tercer anticuerpo o fragmento de unión del mismo es capaz de asociarse con un sensibilizador capaz de generar oxígeno singlete en su estado excitado, por lo que la asociación del tercer anticuerpo o fragmento de unión del mismo con el sensibilizador permite la unión indirecta del sensibilizador al analito, y además comprende el sensibilizador, en donde el primer anticuerpo o fragmento de unión y el segundo anticuerpo o fragmento de unión exhiben diferentes afinidades por el analito, uno de los dos anticuerpos o fragmento de unión tiene una afinidad más baja por el analito, mientras que el otro anticuerpo o fragmento de unión tiene una mayor afinidad por el analito.

Description

DESCRIPCION
Inmunoensayo de canalizacion de oxigeno luminiscente utilizando tres anticuerpos y metodos de produccion y uso de los mismos.
Esta solicitud incorpora por referencia la lista de secuencias que se envia junto con esta solicitud en forma legible por ordenador que tiene el nombre de archivo 2014P07114WO-Seq_Listing.txt y es de 6 KB.
Declaracion sobre la investigacion o el desarrollo financiado con fondos federales
No aplicable.
Antecedentes
Las tecnologias de inmunoensayo son ampliamente utilizadas en el campo del diagnostico medico. Un ejemplo de un inmunoensayo usado comercialmente es un inmunoensayo de luminiscencia inducida, como por ejemplo, pero no limitado a, la tecnologia de inmunoensayo de canalizacion de oxigeno luminiscente LOCI® (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Tarrytown, NY). El inmunoensayo de luminiscencia inducida se divulga en la patente de Estados Unidos N° 5.340.716 (concedida a Ullman et al. el 23 de agosto de 1994). La tecnologia LOCI® actualmente disponible implica un inmunoensayo que usa varios reactivos y requiere que dos de estos reactivos (denominados "Sensibead" y "Chemibead") se coloquen cerca uno del otro para lograr una senal. Cuando se expone a la luz a una cierta longitud de onda (como, por ejemplo, 680 nm), el Sensibead libera oxigeno singlete, y si las dos perlas estan muy cerca, el oxigeno singlete se transfiere al Chemibead; esto causa una reaccion quimica que hace que el Chemibead emita luz que se puede medir en una longitud de onda diferente (como, por ejemplo, 612 nm).
Sin embargo, existen obstaculos para esta tecnologia. En particular, el inmunoensayo depende de la sensibilidad y el rango dinamico de uno o mas anticuerpos que se utilizan como el mecanismo de deteccion de analitos. Por ejemplo, ciertos anticuerpos disponibles comercialmente que se utilizan actualmente en inmunoensayos (incluidos los inmunoensayos utilizados en un laboratorio central y/o en un punto de atencion) tienen una sensibilidad limitada. Ademas, cuando la tecnologia de inmunoensayo de luminiscencia inducida se aplica con un anticuerpo de sensibilidad limitada en el desarrollo de un ensayo en el punto de atencion (POC) que utiliza un chip microfluidico, la sensibilidad del ensayo se ve comprometida aun mas por el formato del ensayo, que utiliza un volumen de muestra mas bajo. Por lo tanto, el ensayo en el POC puede no cumplir con un objetivo de sensibilidad requerido para el ensayo. El documento US 5 585 241 A1 divulga un metodo para el ensayo de citometria de flujo de un analito usando particulas monodispersas que portan un companero de union especifico. Este metodo utiliza un par de tipos de particulas diferentes que se distinguen entre si mediante el citometro de flujo y que, respectivamente, tienen companeros de union que tienen la misma especificidad pero una afinidad de union diferente para el analito y que detectan de forma independiente pero simultanea los dos tipos de particulas marcadas que portan ligandos por el citometro de flujo. El documento US 2009/170218 A divulga metodos y reactivos para determinar la presencia y/o la cantidad de ciclosporina A. Los metodos emplean al menos un anticuerpo que se une especificamente a CsA y no se une en grado significativo a entidades que no son ciclosporinas, de manera que el analisis para CsA se distorsionaria. El documento US 2012/045847 A divulga un ensayo para analitos que utilizan multiples receptores, en el que cada receptor diferente se une a al menos dos sitios epitopicos diferentes. Uno de los sitios epitopicos es un sitio de union comun y uno de los sitios epitopicos es un sitio de union no comun, en el que los sitios epitopicos no comunes son diferentes para cada receptor diferente. Ademas, el documento WO 99/46597 A1 divulga un metodo para evaluar el estado de la hormona del crecimiento de un individuo mediante inmunoensayo para el complejo ternario del factor de crecimiento de tipo insulinico 150 KDa (IGF/IGFBP-3/ ALS). Este metodo implica capturar el complejo de IGFBP con un primer anticuerpo acoplado a una fase solida y detectar el complejo con un segundo anticuerpo acoplado a una etiqueta. Ademas, el documento US 8.414.896 B2 divulga una composicion de anticuerpo recombinante que comprende al menos tres anticuerpos anti-EGFR distintos, en la que los anticuerpos se unen al primer, segundo y tercer epitopos de EGFR.
La sensibilidad de un inmunoensayo de deteccion de analito depende de la afinidad de uno o mas anticuerpos antianalito empleados en la arquitectura del ensayo: cuanto mayor sea la afinidad del anticuerpo, mayor sera la sensibilidad del inmunoensayo. Por lo tanto, se desean anticuerpos anti-analito que tengan una alta sensibilidad para uso en el desarrollo de inmunoensayos de luminiscencia inducidos especificos de analito. Desafortunadamente, un anticuerpo que exhibe una sensibilidad sustancialmente mejorada sobre un anticuerpo existente tambien exhibe tipicamente un rango de ensayo dinamico mucho mas estrecho cuando se compara con el anticuerpo existente.
En un ejemplo no limitante particular, un analito especifico para el cual se desea la deteccion por un inmunoensayo de luminiscencia inducida (tal como, pero sin limitacion, un inmunoensayo de luminiscencia inducida por POC) es la Troponina I cardiaca (cTnI). Las troponinas cardiacas se consideran los marcadores bioquimicos mas sensibles y especificos para la deteccion de dano miocardico. La redefinicion de un infarto agudo de miocardio (AMI) por la Sociedad Europea de Cardiologia y el Colegio Americano de Cardiologia (ESC/ACC) recomienda que un aumento del nivel de troponina cardiaca se defina como una medida por encima del valor del percentil 99 del grupo de referencia (Alpert, J. Am. Coll. Cardiol., 36: 959-69 (2000)). Ademas, la recomendacion de e S c / A C C requiere que la imprecision total en el limite de decision del percentil 99 sea del 10% o menos (Tabla 1).
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Estos nuevos estandares de desempeno para los ensayos de troponina cardiaca requieren nuevos enfoques para el diseno de inmunoensayos con el fin de lograr una medicion cuantitativa y precisa de niveles extremadamente bajos de troponina que se encuentran en el dano miocardico menor o temprano. Se han sugerido varias arquitecturas de inmunoensayos, anticuerpos y tecnologias de deteccion para lograr y superar estos nuevos estandares de desempeno.
La seleccion de anticuerpos es fundamental para cumplir los nuevos objetivos de desempeno descritos anteriormente. Los criterios de seleccion deben tener en cuenta no solo la especificidad de la union a la troponina I cardiaca, sino tambien las afinidades de union, que determinan los limites de deteccion y el tiempo de ensayo. Las reactividades cruzadas con otras troponinas cardiacas y esqueleticas, asi como con otros biomarcadores cardiovasculares, deben ser insignificantes.
Ademas, es critico medir la cantidad total de troponina I especifica cardiaca en una muestra del paciente para obtener la maxima sensibilidad analitica. Dado que la troponina I cardiaca (cTnl) existe en forma libre y en forma de complejos con la troponina C cardiaca (cTnC) y, en menor medida, con la troponina T cardiaca (cTnT), es importante seleccionar los anticuerpos que se unen a los epitopos de cTnl que se expresan de manera independiente de la complejacion con otras troponinas cardiacas. La capacidad de unirse a formas libres y complejadas de cTnl tambien es importante en situaciones en las que el tipo de muestra utilizada es el plasma con EDTA. La constante de asociacion entre cTnl y cTnC es mas fuerte en presencia de Ca2+. El EDTA quela el Ca2+, lo que resulta en un aumento en la proporcion de cTnl libre en la muestra. Ademas, la proporcion de cTnl libre y complejada se modula en cierta medida por el grado de proteolisis de cTnl y cTnC.
La seleccion cuidadosa de anticuerpos es esencial para asegurar la recuperacion de cTnl despues de la proteolisis tanto por las proteasas presentes en el miocardio necrotico como en el plasma del paciente. El grado de degradacion varia entre pacientes individuales. La manifestacion de la proteolisis de cTnl conduce a las diferencias aparentes en la estabilidad de la muestra entre los metodos de cTnl disponibles comercialmente y las diferencias de estabilidad entre las muestras. La estabilidad de la muestra para cTnl depende de los epitopos especificos reconocidos por los anticuerpos en el sistema de prueba de cTnl.
Las primeras generaciones de anticuerpos anti-cTnl disponibles comercialmente utilizados en inmunoensayos de luminiscencia inducidos por cTnl tenian una sensibilidad adecuada en el momento de su introduccion; sin embargo, una vez que la definicion de AMl cambio en 2000 (como se divulgo aqui anteriormente), los anticuerpos anti-cTnl disponibles comercialmente ahora exhibian una sensibilidad limitada a los mayores niveles de requisitos de desempeno para los ensayos de cTnl. Por lo tanto, estos anticuerpos de sensibilidad limitada no proporcionaron el objetivo de sensibilidad de ensayo requerido en el formato de inmunoensayo de luminiscencia inducida (incluidos los formatos de laboratorio central y/o de punto de atencion). Ademas, los anticuerpos de sensibilidad limitada son obstaculos aun mayores para el desarrollo de un formato de ensayo del punto de atencion (POC) que utiliza un chip microfluidico, ya que la sensibilidad del ensayo se ve comprometida aun mas por el menor volumen de muestra utilizado en el formato de ensayo del POC.
Un anticuerpo recientemente identificado disenado para el reemplazo del anticuerpo actual de sensibilidad limitada (es decir, un anticuerpo monoclonal de oveja de alta afinidad anti-cTnl) exhibio una sensibilidad sustancialmente mejorada sobre el anticuerpo existente; sin embargo, este nuevo anticuerpo tiene un rango de ensayo dinamico mucho mas estrecho. La meseta de la senal se observo a concentraciones de cTnl por encima de 20 ng/mL, y el ensayo de cTnl mejorado que utiliza el nuevo anticuerpo de alta afinidad no tiene el rango dinamico requerido del ensayo de cTnl comercial actual.
Por lo tanto, se desean nuevos y mejorados inmunoensayos de luminiscencia inducida basados en anticuerpos y arquitecturas de ensayo que muestren una alta sensibilidad en un amplio rango dinamico. Es a tales ensayos, asi como a las composiciones, kits, dispositivos y metodos relacionados con los mismos, a los que se dirigen los conceptos inventivos divulgados y reivindicados.
La invencion se define, por lo tanto, en las reivindicaciones.
Descripcion de las varias vistas de los dibujos
La Figura 1 compara graficamente la sensibilidad y el rango dinamico de los inmunoensayos de Troponina l (cTnl) cardiaca conocidos en la tecnica anterior con la sensibilidad y el rango dinamico de los inmunoensayos construidos de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados.
La Figura 2 ilustra dos realizaciones de arquitecturas de inmunoensayo de luminiscencia inducida de la tecnica anterior.
La Figura 3 ilustra una arquitectura de inmunoensayo de luminiscencia inducida construida de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados.
La Figura 4 contiene un mapa de varias regiones de epitopo de cTnI.
La Figura 5 ilustra una primera realizacion de una arquitectura basica para un dispositivo de microfluidos construido de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados.
La Figura 6 ilustra otra realizacion de una arquitectura basica para un dispositivo de microfluidos construido de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados.
La Figura 7 ilustra otra realizacion de una arquitectura basica para un dispositivo de microfluidos construido de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados.
La Figura 8 ilustra otra realizacion de una arquitectura basica para un dispositivo de microfluidos construido de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados.
La Figura 9 ilustra otra realizacion de una arquitectura basica para un dispositivo de microfluidos construido de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados.
La Figura 10 ilustra otra realizacion mas de una arquitectura basica para un dispositivo de microfluidos construido de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados.
La Figura 11 ilustra una realizacion adicional de una arquitectura basica para un dispositivo de microfluidos construido de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados.
La Figura 12 ilustra una realizacion adicional mas de una arquitectura basica para un dispositivo de microfluidos construido de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados.
La Figura 13 contiene imagenes fotograficas de un dispositivo de microfluidos construido de acuerdo con la arquitectura basica del dispositivo que se muestra en la Figura 6.
La Figura 14 contiene imagenes fotograficas de un dispositivo de microfluidos construido de acuerdo con la arquitectura basica del dispositivo que se muestra en la Figura 11.
La Figura 15 contiene un mapa de epitopos de cTnI que ilustra un primer ejemplo de epitopos reconocidos por un conjunto de tres anticuerpos utilizados en un inmunoensayo de cTnI construido de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados.
La Figura 16 contiene un mapa de epitopos de cTnI que ilustra un segundo ejemplo de epitopos reconocidos por un conjunto de tres anticuerpos utilizados en un inmunoensayo de cTnI construido de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados. El conjunto de tres anticuerpos reconoce tres epitopos: dos epitopos superpuestos reconocidos por dos anticuerpos de deteccion y un tercer epitopo reconocido por un anticuerpo de captura, en el que el tercer epitopo no se superpone con los otros dos epitopos.
La Figura 17 contiene un mapa de epitopos de cTnI que ilustra un tercer ejemplo de epitopos reconocidos por un conjunto de tres anticuerpos utilizados en un inmunoensayo de cTnI construido de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados.
La Figura 18 contiene un mapa de epitopos de BNP que ilustra un primer ejemplo de epitopos reconocidos por un conjunto de tres anticuerpos utilizados en un inmunoensayo de BNP construido de acuerdo con los conceptos inventivos actualmente descritos y reivindicados.
Descripcion detallada
Antes de explicar al menos una realizacion del concepto o conceptos de la invencion en detalle a traves de ejemplos de dibujos, experimentacion, resultados y procedimientos de laboratorio, debe entenderse que el concepto o conceptos de la invencion no estan limitados en su aplicacion a los detalles de construccion y la disposicion de los componentes expuestos en la siguiente descripcion o ilustrados en los dibujos, experimentacion y/o resultados. El concepto o conceptos de la invencion son capaces de otras realizaciones o de ser practicados o llevados a cabo de varias maneras. Como tal, el lenguaje utilizado en este documento esta destinado a tener el mayor alcance y significado posibles; y las realizaciones estan destinadas a servir como ejemplos, no exhaustivas. Ademas, debe entenderse que la fraseologia y la terminologia empleadas en este documento son para fines de descripcion y no deben considerarse limitativas.
A menos que se defina de otro modo en este documento, los terminos cientificos y tecnicos utilizados en relacion con el concepto o conceptos inventivos divulgados y reivindicados en el presente documento deben tener los significados que los expertos en la tecnica entienden comunmente. Ademas, a menos que el contexto lo requiera, los terminos en singular incluiran los plurales y los terminos en plural incluiran el singular. Las reacciones enzimaticas y las tecnicas de purificacion se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se realiza comunmente en la tecnica o como se describe en el presente documento. Las tecnicas y procedimientos anteriores se realizan generalmente de acuerdo con metodos convencionales bien conocidos en la tecnica y como se describe en varias referencias generales y mas especificas que se citan y discuten a lo largo de la presente memoria descriptiva. Las nomenclaturas utilizadas en relacion con, y los procedimientos y tecnicas de laboratorio de quimica analitica, quimica organica sintetica y quimica medica y farmaceutica descritas en este documento son aquellas bien conocidas y comunmente utilizadas en la tecnica.
Todas las patentes, solicitudes de patentes publicadas y publicaciones que no son de patentes mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de habilidad de los expertos en la tecnica a los que se refiere el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados.
Todas las composiciones y/o metodos divulgados y reivindicados en el presente documento pueden fabricarse y ejecutarse sin experimentacion indebida a la luz de la presente divulgacion.
Segun se utiliza de acuerdo con la presente divulgacion, se entendera que los siguientes terminos, a menos que se indique lo contrario, tienen los siguientes significados:
El uso de la palabra "un" o "uno, una" cuando se usa junto con el termino "que comprende" en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva puede significar "uno", pero tambien es consistente con el significado de "uno o mas", "al menos uno" y "uno o mas de uno". Las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Asi, por ejemplo, la referencia a "un compuesto" puede referirse a 1 o mas, 2 o mas, 3 o mas, 4 o mas o mayor numero de compuestos. El termino "plural" se refiere a "dos o mas". El uso del termino "o" en las reivindicaciones se utiliza para significar "y/o" a menos que se indique explicitamente que se refiera solo a alternativas o que las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgacion respalda una definicion que se refiere solo a alternativas e "y/o". A lo largo de esta solicitud, el termino "aproximadamente" se utiliza para indicar que un valor incluye la variacion inherente del error para el dispositivo, el metodo que se esta empleando para determinar el valor o la variacion que existe entre los sujetos del estudio. Por ejemplo, pero no a modo de limitacion, cuando se utiliza el termino "aproximadamente", el valor designado puede variar en ± 20% o ± 10%, o ± 5%, o ± 1%, o ± 0,1% del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para llevar a cabo los metodos divulgados y tal como lo entienden las personas con experiencia ordinaria en la tecnica. Se entendera que el uso del termino "al menos uno" incluye uno, asi como cualquier cantidad mayor que uno, incluidos, entre otros, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100, etc. El termino "al menos uno" puede extenderse hasta 100 o 1000 o mas, dependiendo del termino al que se adjunta; ademas, las cantidades de 100/1000 no deben considerarse limitativas, ya que los limites mas altos tambien pueden producir resultados satisfactorios. Ademas, se entendera que el uso del termino "al menos uno de X, Y y Z" incluye X solo, Y solo y Z solo, asi como cualquier combinacion de X, Y y Z. El uso de terminologia de numeros ordinales (es decir, "primero", "segundo", "tercero", "cuarto", etc.) tiene el unico proposito de diferenciar entre dos o mas elementos y no pretende implicar ninguna secuencia u orden o importancia para un item sobre otro o cualquier orden de adicion, por ejemplo.
Como se utiliza en esta memoria descriptiva y reivindicacion o reivindicaciones, los terminos "que comprende" (y cualquier forma de que comprende, tal como "comprende"), "que tiene" (y cualquier forma de que tiene, tal como "tiene"), "que incluye" (y cualquier forma de que incluye, tal como" incluye") o "conteniendo" (y cualquier forma de conteniendo, tal como "contiene") son inclusivas o abiertas y no excluyen etapas adicionales, elementos o metodos no mencionados.
El termino "o combinaciones de los mismos" como se usa en el presente documento se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los elementos enumerados que preceden al termino. Por ejemplo, "A, B, C, o combinaciones de los mismos" pretende incluir al menos uno de: A, B, C, AB, AC, BC o ABC, y si el orden es importante en un contexto particular, tambien BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC o CAB. Continuando con este ejemplo, se incluyen expresamente las combinaciones conteniendo repeticiones de uno o mas elementos o terminos, tales como BB, AAA, AAB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, etc. El experto en la tecnica entendera que, por lo general, no hay limite en el numero de elementos o terminos en cualquier combinacion, a menos que sea evidente a partir del contexto.
Como se usa en el presente documento, el termino "sustancialmente" significa que el evento o circunstancia posteriormente descrito ocurre completamente o que el evento o circunstancia posteriormente descrito ocurre en gran medida o grado. Por ejemplo, el termino "sustancialmente" significa que el evento o circunstancia descrito posteriormente ocurre al menos el 90% del tiempo, o al menos el 95% del tiempo, o al menos el 98% del tiempo.
Como se usa en el presente documento, la frase "asociado con" incluye tanto la asociacion directa de dos fracciones entre si como la asociacion indirecta de dos fracciones entre si. Los ejemplos no limitantes de asociaciones incluyen la union covalente de una fraccion a otra fraccion mediante un enlace directo o mediante un grupo espaciador, la union no covalente de un fraccion a otra fraccion directamente o por medio de miembros de pares de union especificos unidos a los fracciones, incorporacion de un fraccion en otra fraccion, tal como disolviendo un fraccion en otra fraccion o mediante sintesis, y recubriendo un fraccion en otra fraccion.
El termino "purificado", como se usa en este documento, significa que al menos un orden de magnitud de purificacion se logra en comparacion con el material de partida o el material natural, por ejemplo, pero no como limitacion, dos, tres, cuatro o cinco ordenes de magnitud de purificacion del material de partida o del material natural. Por lo tanto, el termino "purificado" tal como se utiliza en el presente documento no significa necesariamente que el material este purificado al 100%, y por lo tanto dicho termino no excluye la presencia de otro u otros materiales presentes en la composicion purificada.
Los terminos "analogo" y "derivado" se usan en el presente documento de manera intercambiable y se refieren a una sustancia que comprende la misma estructura basica de carbonos y la funcion carbono en su estructura tal como un compuesto dado, pero tambien puede contener una o mas sustituciones de los mismos. El termino "sustitucion" como se usa en el presente documento se entendera que se refiere al reemplazo de al menos un sustituyente en un compuesto con un residuo R. En ciertas realizaciones no limitantes, R puede incluir H, hidroxilo, tiol, un halogeno seleccionado de fluoruro, cloruro, bromuro o yoduro, un compuesto C1-C4 seleccionado de uno de los siguientes: alquilo lineal, ramificado o ciclico, opcionalmente sustituido, y alquenilo lineal ramificado o ciclico, en el que los sustituyentes opcionales se seleccionan de uno o mas de alquenilalquilo, alquinilalquilo, cicloalquilo, cicloalquenilalquilo, arilalquilo, heteroarilalquilo, heterocicloalquilo, heterocicloalquenilalquilo opcionalmente sustituido, arilcicloalquilo, y arilheterocicloalquilo cada uno de los cuales esta opcionalmente sustituido, donde los sustituyentes opcionales se seleccionan de uno o mas de alquenilalquilo, alquinilalquilo, cicloalquilo, cicloalquenilalquilo, arilalquilo, alquilarilo, heteroarilalquilo, heterocicloalquilo, heterocicloalquenilalquilo, arilcicloalquilo y arilheterocicloalquilo opcionalmente sustituidos, fenilo, ciano, hidroxilo, alquilo, arilo, cicloalquilo, ciano, alcoxi, alquiltio, amino, -NH(alquilo), -NH (cicloalquilo) , carboxi y -C(O)-alquilo.
Se entendera que el termino "muestra", tal como se usa en el presente documento, incluye cualquier tipo de muestra biologica que pueda utilizarse de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente reivindicados. Los ejemplos de muestras biologicas que pueden utilizarse incluyen, entre otros, sangre entera o cualquier porcion de la misma (es decir, plasma o suero), saliva, esputo, liquido cefalorraquideo (CSF), piel, fluido intersticial, lagrimas, mucosidad, orina, frotis, combinaciones, y similares.
El termino "companero de union" como se usa en el presente documento se entendera que se refiere a cualquier molecula capaz de asociarse con otra molecula. Por ejemplo, pero no a modo de limitacion, el companero de union puede ser un anticuerpo (incluidos los anticuerpos policlonales o monoclonales), fragmentos de anticuerpos (como, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, Fd, diacuerpos, anticuerpos de cadena sencilla y otros fragmentos de anticuerpos que retienen al menos una parte de la region variable de un anticuerpo intacto), un receptor, un ligando, aptameros, proteinas o peptidos sustitutos de anticuerpos (es decir, proteinas/peptidos de union modificados por ingenieria genetica), polimeros de impresion molecular (es decir, matrices inorganicas), combinaciones o derivados de los mismos, asi como cualquier otra molecula capaz de unirse especificamente al analito.
El termino "anticuerpo" se usa en el sentido mas amplio, y cubre especificamente los anticuerpos monoclonales (incluidos los anticuerpos monoclonales de longitud completa), los anticuerpos policlonales, los anticuerpos multiespecificos (por ejemplo, los anticuerpos biespecificos) y los fragmentos de anticuerpos, siempre y cuando exhiban la actividad biologica deseada. Por lo tanto, los terminos "Anticuerpo" o "peptido(s) de anticuerpo" se refieren a una molecula de inmunoglobulina de longitud completa (es decir, un anticuerpo intacto), o un fragmento de union del mismo que compite con el anticuerpo intacto por la union especifica al antigeno. Los fragmentos de union pueden producirse por tecnicas de ADN recombinante, o por escision enzimatica o quimica de anticuerpos intactos. Los fragmentos de union incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, Fv ligado a disulfuro, Fd, diacuerpos, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos de dominio unico (tales como, entre otros, NANOBODIES® (Ablynx, Zwijnaarde, Belgica)), y otros fragmentos de anticuerpos que retienen al menos una parte de la region variable de un anticuerpo intacto. Vease, por ejemplo, Hudson et al. (Nature Med., 9: 129-134 (2003)).
El termino "fragmento de union a antigeno" o "porcion de union a antigeno" de un anticuerpo, como se usa en este documento, se refiere a uno o mas fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse a un antigeno. La funcion de union a antigeno de un anticuerpo se puede realizar mediante fragmentos de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de union abarcados dentro del termino "fragmento de union a antigeno" de un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, Fv ligado a disulfuro, Fd, diacuerpos, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos de dominio unico (tales como, entre otros, NANOBODIES® (Ablynx, Zwijnaarde, Belgica)), CDRH3 aislado y otros fragmentos de anticuerpos que retienen al menos una parte de la region variable de un anticuerpo intacto. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen utilizando tecnicas recombinantes y/o enzimaticas convencionales y se analizan para determinar la union a antigeno de la misma manera que los anticuerpos intactos.
Los terminos "CDR", y su plural, se refieren a una region determinante de complementariedad (CDR) de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, que determina el caracter de union de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En la mayoria de los casos, tres c Dr estan presentes en una region variable de cadena ligera (CDRL1, CDRL2 y CDRL3) y tres CDR estan presentes en una region variable de cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3). Las CDR contribuyen a la actividad funcional de una molecula de anticuerpo y estan separadas por secuencias de aminoacidos que comprenden andamios o regiones marco. Entre las diversas CDR, las secuencias de CDR3, y en particular CDRH3, son las mas diversas y, por lo tanto, tienen la mayor contribucion a la especificidad del anticuerpo. Existen al menos dos tecnicas para determinar las CDR: (1) un enfoque basado en la variabilidad de secuencia de especies cruzadas (es decir, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (Instituto Nacional de la Salud, Bethesda, Md. (1987)) y (2) un enfoque basado en estudios cristalograficos de complejos antigeno-anticuerpo (Chothia
et al., Nature, 342: 877 (1989)).
El termino "epitopo", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier proteina determinante capaz de
unirse especificamente a una inmunoglobulina o un receptor de celulas T. En ciertas realizaciones, un epitopo es una
region de un antigeno que esta unido especificamente por un anticuerpo. Los determinantes epitopicos suelen incluir
grupos de moleculas quimicamente activas en la superficie, tal como, por ejemplo, grupos de aminoacidos, cadenas
laterales de azucar, fosforilo y/o sulfonilo. En ciertas realizaciones, un epitopo puede tener caracteristicas estructurales
tridimensionales especificas asi como caracteristicas de carga especificas.
Se entendera que el termino "epitopo", como se usa en el presente documento, incluye tanto epitopos lineales como
epitopos conformacionales. Los epitopos lineales estan formados por una secuencia continua de aminoacidos de un
antigeno y, por lo tanto, comprenden la estructura peptido/proteina primaria/lineal de un antigeno. Los epitopos
conformacionales estan formados por secciones discontinuas de la secuencia de aminoacidos de un antigeno y se
basan en caracteristicas de la superficie tridimensional y/o forma de la estructura terciaria de un antigeno.
Un epitopo se define como "igual" que otro epitopo si un anticuerpo particular se une especificamente a ambos
epitopos. En ciertas realizaciones, los polipeptidos que tienen diferentes secuencias primarias de aminoacidos pueden
comprender epitopos que son iguales. En ciertas realizaciones, los epitopos que son iguales pueden tener diferentes
secuencias de aminoacidos primarios. Se dice que diferentes anticuerpos se unen al mismo epitopo si compiten por
la union especifica a ese epitopo.
Un anticuerpo "se une especificamente" a un antigeno cuando reconoce preferentemente el antigeno en una mezcla
compleja de proteinas y/o macromoleculas. En ciertas realizaciones, un anticuerpo comprende un sitio de union a
antigeno que se une especificamente a un epitopo particular. En ciertas de tales realizaciones, el anticuerpo es capaz
de unirse a diferentes antigenos siempre que los diferentes antigenos comprendan ese epitopo particular o epitopos
estrechamente relacionados. En ciertos casos, por ejemplo, las proteinas homologas de diferentes especies pueden
comprender el mismo epitopo. En ciertas realizaciones, un anticuerpo se une especificamente a un antigeno con una
constante de disociacion no superior a 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12
Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha separado y/o recuperado de un componente del entorno en el que se produjo.
Los componentes contaminantes de su entorno de produccion son materiales que podrian interferir con los usos
diagnosticos o terapeuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no
proteicos. En ciertas realizaciones, el anticuerpo se purificara en forma mensurable por al menos tres metodos
diferentes: (1) en mas del 50% en peso del anticuerpo segun lo determinado por el metodo de Lowry, tal como mas
del 75% en peso, o mas del 85% en peso, o mas del 95% en peso, o mas del 99% en peso; (2) en un grado suficiente
para obtener al menos 10 residuos de la secuencia de aminoacidos N-terminal o interna mediante el uso de un
secuenciador de copa giratoria, tal como al menos 15 residuos de secuencia; o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tincion de plata. El
anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las celulas recombinantes ya que no estara presente al menos
un componente del ambiente en el que se produce el anticuerpo. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se
preparara mediante al menos una etapa de purificacion. Ademas, el "anticuerpo aislado" esta sustancialmente libre de
otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigenicas. Sin embargo, un anticuerpo aislado puede tener
cierta reactividad cruzada con otros antigenos relacionados.
El termino "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de
una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogenea que se unen especificamente al mismo epitopo, es decir,
los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos, excepto por posibles mutaciones naturales
que pueden estar presente en pequenas cantidades (aunque puede haber variabilidad en los patrones de glicacion de
los anticuerpos individuales). En contraste con las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que
tipicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticuerpo
monoclonal se dirige contra un unico determinante en el antigeno. Ademas de su especificidad, los anticuerpos
monoclonales son ventajosos porque en un metodo de produccion pueden sintetizarse mediante un cultivo de
hibridoma y, por lo tanto, no estan contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica que
el caracter del anticuerpo se obtiene de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogenea, y no debe
interpretarse como que requiere la produccion del anticuerpo por ningun metodo en particular. Por ejemplo, en una
realizacion, los anticuerpos monoclonales producidos de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos divulgados
y reivindicados en el presente documento pueden prepararse mediante el metodo de hibridoma descrito por primera
vez por Kohler y Milstein (Nature, 256: 495 (1975)).
Los anticuerpos monoclonales utilizados de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos divulgados y reivindicados
en el presente documento pueden producirse mediante cualquier metodologia conocida en la tecnica, que incluye,
entre otros, un resultado de un protocolo de inmunizacion deliberado; un resultado de una respuesta inmune que
resulta en la produccion de anticuerpos naturalmente en el curso de una enfermedad o cancer; anticuerpos derivados
de fagos; y similares. Ademas del metodo de produccion de hibridoma enumerado anteriormente, los anticuerpos
monoclonales del concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados pueden producirse
mediante otros diversos metodos, tales como, entre otros, metodos de ADN recombinante (vease, por ejemplo, la
patente de Estados Unidos N° 4.816.567); aislamiento de fragmentos de anticuerpos de una biblioteca de presentacion
en fagos (vease, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); y Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 -597 (1991)); asf como otras tecnicas de produccion de anticuerpos monoclonales (vease, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)).
Una vez que se han obtenido los anticuerpos, por ejemplo, una vez que se han identificado celulas B individuales y/o se han producido anticuerpos monoclonales, se pueden obtener las secuencias que codifican las regiones variables de estos anticuerpos. Las secuencias de la region variable se pueden obtener, por ejemplo, mediante la primera secuenciacion de la protefna del anticuerpo producida por el hibridoma, celulas B o fago y determinando la secuencia de acido nucleico codificante. En una realizacion, puede secuenciarse en su lugar el ADN o el ADNc de la region variable de inmunoglobulina (VH y VL). Cuando el anticuerpo se deriva de una lfnea celular de hibridoma o de celulas B aisladas, los ADNc que codifican las regiones variables pueden amplificarse utilizando la PCR mediante, por ejemplo, los metodos descritos en Babcook et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 7843-7848 (1996)), y en la publicacion PCT No. WO 92/02551.
El concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados se refieren a una nueva arquitectura de inmunoensayo de luminiscencia inducida que proporciona una sensibilidad mejorada frente a los inmunoensayos de luminiscencia inducida de la tecnica anterior mientras aun se mantiene el rango dinamico del ensayo de la tecnica anterior. Esta nueva arquitectura de inmunoensayo se puede utilizar en el desarrollo de nuevos inmunoensayos de luminiscencia inducida para varios analitos (incluidos, entre otros, cTnl) y es adaptable para uso en laboratorios centrales y/o POC. En esta nueva arquitectura de ensayo, se utilizan dos anticuerpos de deteccion en el ensayo tipo sandwich para reemplazar el anticuerpo de deteccion unico utilizado en la arquitectura del ensayo de cTnl actual. La combinacion de un anticuerpo de mayor afinidad con otro anticuerpo que muestra menos sensibilidad pero mayor rango dinamico en comparacion con el anticuerpo de mayor afinidad resuelve los problemas de sensibilidad y rango dinamico de la arquitectura de ensayo actual.
La Figura 1 demuestra el aumento de la sensibilidad y el rango dinamico del concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados sobre la tecnica anterior. En la Figura 1, las curvas de respuesta a la dosis se representan para dos inmunoensayos de la tecnica anterior y se comparan con el ensayo de los conceptos inventivos actualmente descritos y reivindicados para un analito no limitante particular, cTnl. La curva de respuesta a la dosis representada por los puntos de datos circulares representa el ensayo de cTnl comercial actual, mientras que la curva de respuesta a la dosis representada por puntos de datos cuadrados representa el ensayo que utiliza el anticuerpo anti-cTnl de mayor sensibilidad. Como se puede observar, se observa una meseta en el rango dinamico superior para el ensayo que usa el anticuerpo anti-cTnl de alta sensibilidad, mientras que la sensibilidad se pierde en el rango dinamico mas bajo del ensayo de cTnl comercial actual. Por el contrario, la curva de respuesta a la dosis representada por los puntos de datos triangulares se deriva de la arquitectura del ensayo con cTnl actualmente divulgada y reivindicada que utiliza anticuerpos de deteccion dual. En comparacion con las curvas de dosis-respuesta de las arquitecturas de ensayo de cTnl de la tecnica anterior que utilizan anticuerpos de deteccion unica, la nueva arquitectura de cTnl proporciona no solo la sensibilidad de ensayo de cTnl requerida sino tambien el rango dinamico de ensayo de cTnl requerido.
Las Figuras 2 y 3 proporcionan una comparacion de la arquitectura de inmunoensayo de luminiscencia inducida del concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados con las arquitecturas de ensayo de la tecnica anterior. La Figura 2A ilustra una arquitectura de inmunoensayo de la tecnica anterior que incluye un unico anticuerpo de deteccion (mostrado como asociado a un Chemibead (CB) antes de la incubacion con la muestra conteniendo el analito) y un unico anticuerpo de captura (mostrado como capaz de asociarse con un Sensibead (SB) durante la etapa de incubacion). En la Figura 2B, se representa otra arquitectura de inmunoensayo de la tecnica anterior; en esta estructura, se utilizan anticuerpos de deteccion dual en lugar del anticuerpo de deteccion unico en la Figura 2A (en el que ambos anticuerpos de deteccion son capaces de asociarse con un solo CB). Sin embargo, esta arquitectura de ensayo requiere que los tres anticuerpos (es decir, ambos anticuerpos de deteccion y el anticuerpo de captura unico) deben unirse a un solo analito para la deteccion de los mismos.
Por el contrario, y como se muestra en la Figura 3, la estructura de ensayo del concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados utiliza dos anticuerpos de deteccion (Ab1 y Ab2, ilustrados como asociados con CB1 y CB2, respectivamente) que compiten entre sf para unirse a un analito. Es decir, los dos anticuerpos de deteccion se unen a epftopos que se superponen al menos parcialmente, por lo que los dos anticuerpos de deteccion no pueden unirse a una unica molecula de analito. Uno de los anticuerpos de deteccion (Ab1) puede poseer una alta sensibilidad con un rango dinamico limitado, mientras que el otro anticuerpo de deteccion (Ab2) puede exhibir un nivel mas bajo de sensibilidad con un mayor rango dinamico. El uso de estos dos anticuerpos de deteccion de esta manera resulta en un inmunoensayo que exhibe un nivel de sensibilidad deseado sobre un rango dinamico y un lfmite de deteccion suficientes, como se muestra en la Figura 1.
Volviendo ahora a las realizaciones particulares del concepto o conceptos inventivos actualmente reivindicados y divulgados, se divulgan composiciones de ensayo, asf como kits y dispositivos conteniendo los mismos y metodos de produccion y uso de los mismos. En la invencion, los miembros del sistema productor de senales (sps) comprenden un sensibilizador tal como, por ejemplo, un fotosensibilizador y una composicion quimioluminiscente, donde la activacion del sensibilizador da como resultado un producto que activa la composicion quimioluminiscente. Un miembro de sps generalmente genera una senal detectable que se relaciona con la cantidad de miembros de sps enlazados y/o no enlazados, es decir, la cantidad de miembros de sps enlazados o no enlazados al analito que se esta detectando o a un agente que refleja la cantidad del analito a ser detectado. Un ejemplo de realizacion de una plataforma de ensayo en la que se basa el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados es el inmunoensayo de luminiscencia inducida (LOCI®). El inmunoensayo de luminiscencia inducida se divulga en la patente de Estados Unidos N° 5.340.716.
El concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados incluye una composicion conteniendo un sistema de deteccion quimioluminiscente. En ciertas realizaciones, la composicion incluye al menos tres componentes. El primer componente comprende una composicion que incluye un compuesto quimioluminiscente activable por oxigeno singlete y un primer anticuerpo o fragmento de union del mismo asociado con el mismo, en el que el primer anticuerpo o fragmento de union del mismo es un anticuerpo de deteccion que se une especificamente a un primer epitopo del analito, por lo que el compuesto quimioluminiscente activable por oxigeno singlete es capaz de unirse indirectamente al analito a traves del primer anticuerpo o fragmento de union del mismo. El segundo componente comprende una composicion que incluye un compuesto quimioluminiscente activable por oxigeno singlete y un segundo anticuerpo o fragmento de union del mismo asociado con el mismo, en el que el segundo anticuerpo o fragmento de union del mismo es un anticuerpo de deteccion que se une especificamente a un segundo epitopo del analito, por lo que el compuesto quimioluminiscente activable por oxigeno singlete es capaz de unirse indirectamente al analito a traves del segundo anticuerpo o fragmento de union del mismo, y en donde el primer y segundo epitopos se superponen al menos parcialmente de tal manera que el primer y segundo anticuerpos o fragmentos de union del mismo no pueden unirse a un molecula de analito unico. El tercer componente comprende una composicion que incluye un tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo, siendo el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo un anticuerpo de captura que se une especificamente a un tercer epitopo del analito que no se superpone con el primer y segundo epitopos, por lo que una molecula de analito unico puede unirse al tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo y uno del primer y segundo anticuerpos o fragmentos de union del mismo, y en donde el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo es capaz de asociarse con un sensibilizador capaz de generar oxigeno singlete en su estado excitado, por lo que la asociacion del tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo con el sensibilizador permite la union indirecta del sensibilizador al analito.
Los epitopos primero, segundo y tercero pueden ser todos epitopos lineales y, por lo tanto, reconocen porciones lineales de la secuencia de aminoacidos del analito. Alternativamente, el primero, segundo y tercer epitopos pueden ser todos epitopos conformacionales o una mezcla de epitopos lineales y conformacionales. Es decir, el primer epitopo puede ser un epitopo lineal, mientras que el segundo epitopo puede ser un epitopo conformacional (o viceversa); de esta manera, el primer y segundo anticuerpos/fragmentos de union pueden no necesariamente reconocer porciones superpuestas de la secuencia de aminoacidos lineal del analito; en su lugar, los dos anticuerpos/fragmentos de union pueden reconocer porciones superpuestas de la estructura terciaria de la secuencia de aminoacidos del analito.
En ciertas realizaciones, el tercer componente puede incluir ademas el sensibilizador asociado con el tercer anticuerpo o fragmento de union al mismo. Alternativamente, la composicion puede incluir ademas un cuarto componente que incluye el sensibilizador.
Un sensibilizador es una molecula, generalmente un compuesto, para la generacion de un compuesto intermedio reactivo tal como, por ejemplo, oxigeno singlete, para activacion de un compuesto quimioluminiscente. En algunas realizaciones, el sensibilizador es un fotosensibilizador. Otros sensibilizadores que pueden ser activados quimicamente (mediante, por ejemplo, enzimas y sales metalicas) incluyen, a modo de ejemplo y sin limitacion, otras sustancias y composiciones que pueden producir oxigeno singlete con o, menos preferiblemente, sin activacion por una fuente de luz externa. Por ejemplo, se ha demostrado que ciertos compuestos catalizan la conversion de peroxido de hidrogeno en oxigeno singlete y agua. Los ejemplos no limitantes de otras sustancias y composiciones sensibilizadoras incluyen oxidos de los metales alcalinoterreos Ca, Sr y Ba; derivados de elementos de los grupos 3A, 4A, 5A y 6A en la configuracion d0; oxidos de actinidos y lantanidos; y los oxidantes CIO', BrO', Au3+, IO3' y IO4'; y, en particular, iones molibdato, peroxomolibdato, tungstato y peroxotungstato, y acetonitrilo. Las siguientes referencias proporcionan una descripcion adicional con respecto a las sustancias y composiciones sensibilizadoras que tambien estan dentro del alcance del concepto inventivo actualmente divulgado y reivindicado: Aubry, J. Am. Chem. Soc., 107: 5844-5849 (1985); Aubry, J. Org. Chem., 54: 726-728 (1989); Bohme y Brauer, Inorg. Chem., 31: 3468-3471 (1992); Niu y Foote, Inorg. Chem., 31: 3472-3476 (1992); Nardello et al., Inorg. Chem., 34: 4950-4957 (1995); Aubry y Bouttemy, J. Am. Chem. Soc., 119: 5286-5294 (1997); y Almeida et al., Anal. Chim Acta, 482: 99-104 (2003).
Tambien se incluyen dentro del alcance de los fotosensibilizadores los compuestos que no son verdaderos sensibilizadores pero que, mediante excitacion por calor, luz, radiacion ionizante o activacion quimica, liberaran una molecula de oxigeno singlete. Los miembros de esta clase de compuestos incluyen, por ejemplo, los endoperoxidos tales como el 1,4-biscarboxietil-1,4-naftaleno endoperoxido, 9,10'difenilantracenO'9,10'endoper0xido y 5,6,11,12-tetrafenil naftaleno 5,12-endoperoxido. El calentamiento o la absorcion directa de la luz por estos compuestos libera oxigeno singlete.
Un fotosensibilizador es un sensibilizador para la activacion de un compuesto fotoactivo, por ejemplo, mediante la generacion de oxigeno singlete por excitacion con luz. Los fotosensibilizadores son fotoactivables e incluyen, por ejemplo, colorantes y compuestos aromaticos, y generalmente son compuestos que comprenden atomos unidos covalentemente, generalmente con multiples enlaces dobles o triples conjugados. Los compuestos deben absorber la luz en el rango de longitud de onda de 200 a 1.100 nm, o de 300 a 1.000 nm, o de 450 a 950 nm, con un coeficiente de extincion en su maximo de absorbancia superior a 500 M-1 cm-1, o mayor que 5.000 M-1 cm-1, o mayor que 50.000 M-1 cm'1, en la longitud de onda de excitacion. Los fotosensibilizadores deben ser relativamente fotosensibles y, preferiblemente, no reaccionar eficientemente con el oxfgeno singlete. Los ejemplos de fotosensibilizadores, a modo de ilustracion y no de limitacion, incluyen acetona, benzofenona, 9-tioxantona, eosina, 9,10-dibromoantraceno, azul de metileno, metaloporfirinas, tales como hematoporfirina, ftalocianinas, clorofilas, rosa bengal y buckminsterfullerenos, por ejemplo, y derivados de estos compuestos.
Un compuesto quimioluminiscente (quimioluminiscente) es un compuesto que se puede activar qufmicamente y, como resultado de dicha activacion, emite luz a una cierta longitud de onda. Los ejemplos de quimioluminiscentes, a modo de ilustracion y no de limitacion, incluyen olefinas capaces de reaccionar con oxfgeno singlete o un peroxido para formar hidroperoxidos o dioxetanos, que pueden descomponerse en cetonas o derivados de acido carboxflico; dioxetanos estables que pueden descomponerse por la accion de la luz; acetilenos que pueden reaccionar con el oxfgeno singlete para formar dicetonas; hidrazonas o hidrazidas que pueden formar compuestos azo o carbonilos azoicos tal como luminol; y compuestos aromaticos que pueden formar endoperoxidos, por ejemplo. Como consecuencia de la reaccion de activacion, los quimioluminiscentes causan directa o indirectamente la emision de luz.
En ciertas realizaciones, el compuesto quimioluminiscente activable por oxfgeno singlete puede ser una sustancia que experimenta una reaccion qufmica con oxfgeno singlete para formar una especie intermedia metaestable que puede descomponerse con la emision simultanea o posterior de luz. La composicion que comprende el compuesto quimioluminiscente activable por oxfgeno singlete puede asociarse con el analito objetivo mediante cualquier metodo conocido en la tecnica; por ejemplo, pero no a modo de limitacion, la composicion puede tener una segunda pareja de union especffica del analito asociada con el mismo que permite la asociacion indirecta del compuesto quimioluminiscente al analito objetivo. La composicion que comprende el compuesto quimioluminiscente puede ser excitada directamente por el compuesto quimioluminiscente activado; alternativamente, la composicion puede comprender ademas al menos una molecula fluorescente que es excitada por el compuesto quimioluminiscente activado. Los ejemplos particulares, no limitativos, de compuestos quimioluminiscentes y fotosensibilizadores que pueden utilizarse de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados se exponen en la patente de Estados Unidos N° 5.340.716 (Ullman, et al.).
Las composiciones actualmente divulgadas y reivindicadas incluyen la presencia de dos composiciones quimioluminiscentes activables por oxfgeno singlete, y cualquiera de las composiciones activables por oxfgeno singlete descritas anteriormente en este documento o contempladas de otro modo en el presente documento puede funcionar como la primera y segunda composiciones activables por oxfgeno singlete. En ciertas realizaciones, puede ser deseable que las dos composiciones quimioluminiscentes activables por oxfgeno singlete sean la misma composicion quimioluminiscente activable por oxfgeno singlete. Por ejemplo, la misma composicion quimioluminiscente activable por oxfgeno singlete se asocio con ambos anticuerpos de deteccion/fragmentos de union en el ensayo representado graficamente en la Figura 1, y por lo tanto la senal se detecto a una unica longitud de onda. En otras realizaciones, puede ser deseable que las dos composiciones activables de oxfgeno singlete sean diferentes entre sf. Cuando las composiciones difieren entre sf, la union del primer y segundo anticuerpos/fragmentos de union puede detectarse a diferentes longitudes de onda. Por ejemplo, se podrfa utilizar una primera longitud de onda para detectar el extremo inferior de la curva, y una longitud de onda diferente para detectar el extremo superior de la curva.
Los sensibilizadores utilizados de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados pueden ser capaces de unirse indirectamente al analito objetivo mediante una asociacion con estreptavidina. De esta forma, la biotina se asocia con un primer companero de union especffico del analito, y la union de la estreptavidina y la biotina, en combinacion con la union del primero companero de union especffico del analito al analito objetivo, da como resultado la asociacion indirecta del sensibilizador al analito objetivo. En un ejemplo no limitativo, el sensibilizador puede ser un fotosensibilizador, de manera que el sensibilizador se active por irradiacion con luz.
En ciertas realizaciones, el primer anticuerpo/fragmento de union y el segundo anticuerpo/fragmento de union exhiben diferentes afinidades por el analito. Por ejemplo, uno de los dos anticuerpos/fragmentos de union puede tener una menor afinidad por el analito, mientras que el otro anticuerpo/fragmento de union tiene una mayor afinidad por el analito. En un ejemplo particular, no limitativo, el primer anticuerpo/fragmento de union se puede considerar un anticuerpo de baja afinidad que se une especfficamente al analito con una constante de disociacion en un rango de 10-6 M a 10-10 M y el segundo anticuerpo/fragmento de union se puede considerar un anticuerpo de alta afinidad que se une especfficamente al analito con una constante de disociacion en un rango de 10-10 M a 10-13 M
Se puede utilizar cualquier relacion de anticuerpo de alta afinidad/fragmento de union a anticuerpo de baja afinidad/fragmento de union, siempre que el ensayo sea capaz de funcionar de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados y proporcionar la linealidad deseada y rango dinamico. En realizaciones no limitativas particulares, el anticuerpo de alta afinidad/fragmento de union puede estar presente como aproximadamente 5% a aproximadamente 20% de la combinacion de los dos anticuerpos de deteccion/fragmentos de union, mientras que el anticuerpo de baja afinidad/fragmento de union puede estar presente como aproximadamente 80% a aproximadamente 95% del total de anticuerpos de deteccion presentes. Los ejemplos particulares no limitativos de relaciones de anticuerpo de alta afinidad/fragmento a anticuerpo de baja afinidad/fragmento que pueden utilizarse incluyen aproximadamente 5% (alta) a aproximadamente 95% (baja), aproximadamente 10% (alta) a aproximadamente 90% (baja), y aproximadamente 20% (alta) a aproximadamente 80% (baja).
El primer, segundo y tercer anticuerpo o fragmentos de union de los mismos pueden proporcionarse en cualquier forma que permita que estos anticuerpos/fragmentos de union funcionen de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados. Por ejemplo, cada uno del primero, segundo y tercer anticuerpos/fragmentos de union puede ser un anticuerpo policlonal/fragmento de union o un anticuerpo monoclonal/fragmento de union. Ademas, cualquier combinacion de diferentes tipos de anticuerpos/fragmentos de union se puede utilizar de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados. Por ejemplo, el primer y segundo anticuerpo/fragmentos de union pueden ser anticuerpos monoclonales/fragmentos de union, mientras que el tercer anticuerpo/fragmento de union es un anticuerpo policlonal/fragmento de union. Alternativamente, el primer y segundo anticuerpo/fragmentos de union pueden ser anticuerpos policlonales/fragmentos de union, mientras que el tercer anticuerpo/fragmento de union es un anticuerpo monoclonal/fragmento de union. En otra alternativa mas, uno del primero y segundo anticuerpos/fragmentos de union puede ser un anticuerpo policlonal/fragmento de union, mientras que el otro es un anticuerpo monoclonal/fragmento de union. En este ejemplo, el tercer anticuerpo/fragmento de union puede ser policlonal o monoclonal.
Los anticuerpos pueden ser especificos para cualquier analito para el que se desea la deteccion de esta manera. Los ejemplos no limitantes de analitos contemplados en el presente documento incluyen, pero no estan limitados a, troponinas, tales como troponina I cardiaca (cTnl), CKMB, mioglobina, mieloperoxidasa, p-hCG, BNP, NT-proBNP, PCT, CRP y iPTH, y similares.
Cuando el analito a detectar es cTnl, los tres anticuerpos pueden reconocer cualquiera de los tres epitopos en la molecula de cTnl, siempre que los epitopos se coloquen como se describio anteriormente en este documento. Es decir, el primer y segundo epitopos deben solaparse al menos parcialmente entre si de modo que el primer y segundo anticuerpos o sus fragmentos de union no puedan unirse a una unica molecula de analito; ademas, el tercer epitopo no debe solaparse con el primer epitopo ni con el segundo epitopo, por lo que el tercer anticuerpo o el fragmento de union del mismo puede unirse a una molecula de analito a la que ya esta unido el primer o segundo anticuerpo o el fragmento de union del mismo. La secuencia completa de 210 aminoacidos de cTnl se ha asignado como la SEQ ID NO: 1 en este documento.
La Figura 4 contiene un mapa de varias regiones de epitopo en la secuencia de cTnl, que ilustra algunos de los diversos epitopos que se pueden utilizar de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados. En ciertas realizaciones no limitantes del concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados, el analito a detectar es cTnl, y el primer y segundo anticuerpos/fragmentos de union se unen especificamente a epitopos superpuestos dentro de una de las regiones A, B, C, D, E y F (es decir, las SEQ lD NOS: 2-7, respectivamente) de la Figura 4, mientras que el tercer anticuerpo/fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo dentro de una region diferente. Por ejemplo, pero no a modo de limitacion: (a) el primer y el segundo anticuerpos/fragmentos de union se unen a epitopos superpuestos dentro de la region A (SEQ lD NO: 2), y el tercer anticuerpo/fragmento de union se une especificamente a un epitopo dentro de uno de regiones BF (es decir, una de las SEQ lD NO: 3-7); (b) el primer y segundo anticuerpos/fragmentos de union se unen a epitopos superpuestos dentro de la region B (SEQ lD NO: 3), y el tercer anticuerpo/fragmento de union se une especificamente a un epitopo dentro de una de las regiones A y CF (es decir, una de las SEQ lD NOS: 2 y 4-7); (c) el primer y segundo anticuerpos/fragmentos de union se unen a epitopos superpuestos dentro de la region C (SEQ lD NO: 4), y el tercer anticuerpo/fragmento de union se une especificamente a un epitopo dentro de una de las regiones AB y DF (es decir, una de las SEQ lD NOS: 2-3 y 5-7); (d) el primer y segundo anticuerpos/fragmentos de union se unen a epitopos superpuestos dentro de la region D (SEQ lD NO: 5), y el tercer anticuerpo/fragmento de union se une especificamente a un epitopo dentro de una de las regiones AC y EF (es decir, una de las SEQ lD NOS: 2-4 y 6-7); (e) el primer y segundo anticuerpos/fragmentos de union se unen a epitopos superpuestos dentro de la region E (SEQ lD NO: 6), y el tercer anticuerpo/fragmento de union se une especificamente a un epitopo dentro de una de las regiones AD y F (es decir, una de las SEQ lD NOS: 3-5 y 7); y (f) el primer y segundo anticuerpos/fragmentos de union se unen a epitopos superpuestos dentro de la region F (SEQ lD NO: 7), y el tercer anticuerpo/fragmento de union se une especificamente a un epitopo dentro de una de las regiones AE (es decir, una de las SEQ lD NOS: 2-6). En ejemplos no limitantes particulares, el primer y segundo anticuerpos/fragmentos de union se unen a epitopos superpuestos dentro de la region A o la region B (SEQ lD NO: 2 o SEQ lD NO: 3, respectivamente), y el tercer anticuerpo/fragmento de union se une especificamente a un epitopo dentro de la region C (SEQ lD NO: 4).
Los ejemplos adicionales no limitantes de las combinaciones de epitopos/anticuerpo de cTnl utilizadas en inmunoensayos de cTnl de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados incluyen los siguientes: (i) el primer y segundo anticuerpos/fragmentos de union de los mismos se unen especificamente a cualquiera de los epitopos de las SEQ lD NOS: 8, 9 y 11, mientras que el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente al epitopo de SEQ lD NO: 10; (i) el primer y segundo anticuerpos/fragmentos de union de los mismos se unen especificamente a los epitopos de las SEQ lD NOS: 8 y 9, mientras que el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente al epitopo de la SEQ lD NO: 10; (ii) el primer y segundo anticuerpos/fragmentos de union de los mismos se unen especificamente a los epitopos de las SEQ lD NOS: 9 y 11, mientras que el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente al epitopo de la SEQ lD NO: 10; y (iii) el primer y segundo anticuerpos/fragmentos de union de los mismos se unen especificamente a los epitopos de las SEQ lD NOS: 12 y 13, mientras que el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente al epitopo de la SEQ lD NO: 14. Combinaciones especificas de epitopos se ilustran en las Figuras 15-17 y se discutiran en detalle en los Ejemplos a continuacion.
Cuando el analito a detectar es un peptido natriuretico de tipo B (BNP), los tres anticuerpos pueden reconocer cualquiera de los tres epftopos en la molecula de BNP, siempre que los epftopos se posicionen tal como se describio anteriormente en este documento (es decir, el primer y segundo epftopos se superponen al menos parcialmente entre sf y el tercer epftopo no se superpone con el primero y el segundo epftopos). A una secuencia de 32 aminoacidos de BNP se le ha asignado la SEQ ID NO: 15 y se muestra en la Figura 18, junto con un ejemplo no limitativo de una combinacion de epftopos que puede utilizarse de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados. En el ejemplo no limitativo representado en la Figura 18 (y como se describe en detalle en la seccion de Ejemplos mas adelante), el primer y segundo anticuerpos/fragmentos de union de los mismos pueden unirse especfficamente a los epftopos de las SEQ ID NOS: 16 y 17, mientras que el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especfficamente al epftopo de la SEQ ID NO: 18.
Los reactivos de las composiciones/kits/metodos pueden proporcionarse en cualquier forma y/o formulacion que les permita funcionar de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados. Por ejemplo, pero no a modo de limitacion, los componentes pueden estar en forma de una perla o formulacion similar. Ademas, en ciertas realizaciones, puede ser deseable disponer los reactivos en forma de reactivos liofilizados de un solo uso. El uso de reactivos secos en dispositivos de microfluidos se describe en detalle en la publicacion de la solicitud de patente WO 2013/078130 A1.
En ciertas realizaciones, multiples componentes pueden estar dispuestos juntos en una unica perla o formulacion y/o liofilizados en una sola partícula. Por ejemplo, pero no a modo de limitacion, una sola perla puede incluir el primero y segundo componentes; es decir, una sola perla puede contener tanto al primer y el segundo anticuerpos/fragmentos de union asf como el compuesto o compuestos quimioluminiscentes activables por oxfgeno singlete asociados con los anticuerpos/fragmentos de union. La perla unica conteniendo ambos componentes puede ser liofilizada en una sola partícula o dispuesta en otra formulacion.
Ademas, dos o mas componentes que se disponen en perlas/formulaciones separadas pueden liofilizarse juntas. Por ejemplo, pero no a modo de limitacion, los componentes primero y segundo (conteniendo el primer y el segundo anticuerpos/fragmentos de union asociados con el compuesto o compuestos quimioluminiscentes activables por oxfgeno singlete) se pueden liofilizar juntos. En otro ejemplo no limitante, los componentes primero y segundo (conteniendo el primer y segundo anticuerpos/fragmentos de union asociados con el compuesto o compuestos quimioluminiscentes activables por oxfgeno singlete) y el tercer componente (conteniendo el tercer anticuerpo/fragmento de union) se pueden liofilizar juntos como una sola partícula. Ademas, una sola partícula liofilizada puede contener combinaciones de multiples tipos de perlas/formulaciones; es decir, una sola partícula liofilizada puede contener una mezcla de: (a) una unica perla conteniendo ambos componentes primero y segundo; (b) una perla conteniendo solo el primer componente; y (c) una perla conteniendo solo el segundo componente.
Cualquiera de las composiciones descritas anteriormente o contempladas de otro modo en el presente documento puede incluir ademas componentes adicionales, tales como, pero no limitados a, diluyentes, soluciones de lavado y/o excipientes (utilizados para la reconstitucion de reactivos liofilizados). Ademas, cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento anteriormente o contempladas de otro modo en el presente documento tambien pueden incluir un dispositivo de microfluidos en el que se desechan uno o mas de los componentes descritos anteriormente.
El concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados incluyen ademas kits utiles para realizar convenientemente un ensayo para la determinacion de un analito; el kit puede contener cualquier combinacion de los componentes/reactivos descritos anteriormente (incluyendo cualquiera de las realizaciones de las composiciones descritas en el presente documento anteriormente) en la medida en que esten dentro del alcance del kit de las reivindicaciones 1-5; ademas, el kit puede contener ademas otro reactivo o reactivos para realizar cualquiera de los ensayos particulares descritos o contemplados de otro modo en el presente documento. La naturaleza de estos reactivos adicionales dependera del formato de ensayo particular, y su identificacion esta dentro de la experiencia de un experto en la tecnica.
Los componentes/reactivos pueden estar dispuestos cada uno en contenedores/compartimientos separados, o varios componentes/reactivos pueden combinarse en uno o mas contenedores/compartimientos, dependiendo de la naturaleza competitiva de las constantes/eficiencias de union al anticuerpo y/o la estabilidad de los componentes/reactivos. El kit puede incluir ademas otros reactivos empaquetados por separado para realizar un ensayo, tal como miembros sbp adicionales, miembros sps y reactivos auxiliares, por ejemplo. Ademas, el kit puede incluir un dispositivo de microfluidos en el que se disponen los componentes/reactivos.
Las cantidades relativas de los diversos componentes/reactivos en los kits pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones de los componentes/reactivos que optimizan sustancialmente las reacciones que deben ocurrir durante los metodos de ensayo y ademas optimizan sustancialmente la sensibilidad de un ensayo. Bajo circunstancias apropiadas, uno o mas de los componentes/reactivos en el kit pueden proporcionarse en forma seca, tal como una partícula liofilizada (que incluye, entre otros, esferas, microtabletas, polvos, micropuntos, etc.), y el kit puede incluir ademas excipiente o excipientes para la disolucion de los reactivos secos; de esta manera, se puede obtener una solucion de reactivo que tenga las concentraciones apropiadas para realizar un metodo o ensayo de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados a partir de estos componentes. Se pueden incluir controles positivos y/o negativos con el kit. El kit puede incluir ademas un conjunto de instrucciones escritas que explican como usar el kit. Un kit de esta naturaleza se puede usar en cualquiera de los metodos descritos o contemplados en este documento.
El concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados se dirige adicionalmente a un dispositivo de microfluidos como se define en las reivindicaciones en el que se disponen las composiciones descritas anteriormente en este documento. El dispositivo de microfluidos puede tener una o mas funciones manuales asociadas con el (es decir, donde se requiere pipetear para agregar uno o mas reactivos y/o movimiento de una mezcla entre dos compartimientos); alternativamente, el dispositivo de microfluidos puede ser un sistema completamente automatico y cerrado en el que los reactivos necesarios se disponen en varios compartimientos durante la construccion del dispositivo de microfluidos (en donde los diversos compartimientos estan en comunicacion fluida continua (o pueden estar en comunicacion fluida continua)), y por lo tanto, no se requiere manipulacion manual de la muestra y/o reactivos para realizar el ensayo despues de agregar la muestra al dispositivo de microfluidos. El dispositivo de microfluidos comprende uno o mas compartimientos conteniendo los tres o cuatro componentes descritos anteriormente en el presente documento (es decir, las tres composiciones conteniendo anticuerpos con o sin el sensibilizador; cuando el sensibilizador esta presente, puede proporcionarse solo o puede estar asociado con la tercera composicion conteniendo anticuerpos. El dispositivo puede estar provisto de cualquier numero de compartimientos, cualquier disposicion de compartimientos y cualquier distribucion de los tres o cuatro componentes entre ellos, siempre que el dispositivo pueda funcionar de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados; En las Figuras se proporcionan ejemplos no limitativos de la estructura del dispositivo con fines ilustrativos unicamente. Cuando estan provistos de multiples compartimientos, los compartimientos pueden estar completamente separados entre si, o uno o mas compartimientos pueden ser capaces de estar en comunicacion fluida entre si.
El dispositivo de microfluidos puede incluir ademas una camara de aplicacion de muestra y/o un canal de entrada en el que se puede aplicar/dispuesta una muestra. La camara de aplicacion de muestra/canal de entrada puede estar en comunicacion fluida con uno o mas compartimientos del dispositivo de microfluidos. Ademas, cuando el dispositivo de microfluidos esta provisto tanto con una camara de aplicacion de muestras y un canal de entrada, la camara de aplicacion de muestra puede estar en comunicacion fluida con el canal de entrada, mientras que el canal de entrada puede estar en comunicacion fluida con los uno o mas compartimientos en los que se disponen los reactivos.
Se puede aplicar una muestra directamente en el compartimiento conteniendo los reactivos del ensayo, o la muestra puede pasar a traves de la camara de aplicacion de muestra/canal de entrada antes de entrar en el compartimiento o compartimientos conteniendo el reactivo o reactivos del ensayo. Cuando la muestra pasa a traves de uno o mas componentes antes de alcanzar el compartimiento o compartimientos del ensayo, sustancialmente toda la muestra puede pasar y, por lo tanto, permanece sustancialmente intacta al alcanzar el compartimiento o compartimientos del ensayo. Alternativamente, solo partes de la muestra pueden alcanzar el compartimiento de ensayo. En una realizacion, esto puede ocurrir simplemente debido a restricciones de tamano, peso y/o volumen en los compartimientos mas adelante del compartimiento o compartimientos del ensayo; en otra realizacion, el dispositivo de microfluidos puede contener una o mas estructuras presentes en la camara de aplicacion de muestras, el canal de entrada, un compartimiento mas adelante del compartimiento o compartimientos del ensayo y/o cualquier conexion entre ellos que permita la separacion de ciertos componentes de una muestra de la muestra total y/o el suministro de dichos componentes al compartimiento o compartimientos del ensayo.
En una realizacion, los tres o cuatro reactivos se disponen en un solo compartimiento del dispositivo de microfluidos. En otra realizacion, el dispositivo de microfluidos puede contener al menos dos compartimientos; el primer compartimiento puede contener las primeras tres composiciones (es decir, primer y segundo anticuerpos/fragmentos de union asociados con composiciones activables por oxigeno singlete y el tercer anticuerpo/fragmento de union), mientras que el segundo compartimiento contiene el sensibilizador. Ademas, este dispositivo de microfluidos que comprende dos compartimientos puede comprender ademas un canal de entrada a traves del cual se puede aplicar la muestra; en esta configuracion, el primer compartimiento puede estar en comunicacion fluida con el canal de entrada, y el segundo compartimiento puede de estar en comunicacion fluida con al menos uno de los canales de entrada y el primer compartimiento. En otra realizacion, el dispositivo de microfluidos puede contener al menos tres compartimientos; el primero, segundo y tercero compartimientos pueden contener el primero, segundo y tercero componentes, respectivamente. Ademas, puede ser deseable que el primer anticuerpo/fragmento de union (presente en el primer componente) se una con alta afinidad con el analito objetivo, mientras que el segundo anticuerpo/fragmento de union (presente en el segundo componente) se una con baja afinidad con el analito objetivo. De esta manera, el anticuerpo de mayor afinidad/fragmento de union entra en contacto con el analito antes que el anticuerpo de menor afinidad/fragmento de union.
Cualquiera de los compartimientos del dispositivo de microfluidos puede sellarse para mantener el reactivo o los reactivos dispuestos en el mismo en un ambiente sustancialmente hermetico hasta su uso; por ejemplo, los compartimientos conteniendo reactivo o reactivos liofilizados se pueden sellar para evitar cualquier reconstitucion involuntaria del reactivo o reactivos. El canal de entrada y un compartimiento, asi como dos compartimientos, pueden describirse como "capaces de estar en comunicacion fluida" entre si; esta frase indica que el compartimiento o compartimientos todavia pueden estar sellados, pero los dos compartimientos son capaces de tener un flujo de fluido entre ellos cuando se perfora un sello formado alli o entre ellos.
Los dispositivos de microfluidos del concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados pueden proporcionarse con cualquier otra caracterfstica deseada conocida en la tecnica o bien contemplada en este documento. Por ejemplo, pero no a modo de limitacion, los dispositivos de microfluidos del concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados pueden incluir ademas una camara de lectura; la camara de lectura puede ser un compartimiento conteniendo uno o mas de los componentes del ensayo, o la camara de lectura puede estar en comunicacion fluida con uno o mas compartimientos conteniendo el reactivo o reactivos del ensayo. El dispositivo de microfluidos puede incluir ademas uno o mas compartimientos que contengan otras soluciones, tales como, entre otras, soluciones de lavado, diluyentes, excipientes, soluciones de interferencia, controles positivos, controles negativos, controles de calidad, cualquier combinacion de los mismos y similares. Por ejemplo, el dispositivo de microfluidos puede incluir uno o mas compartimientos conteniendo un diluyente, y este compartimiento o compartimientos pueden estar en comunicacion fluida con cualquier otro compartimiento o compartimientos del dispositivo. En otro ejemplo, el dispositivo de microfluidos puede incluir ademas uno o mas compartimientos conteniendo al menos un excipiente para la reconstitucion de uno o mas reactivos liofilizados, y el compartimiento o compartimientos pueden estar en comunicacion fluida con cualquier otro compartimiento o compartimientos del dispositivo (tal como el compartimiento conteniendo el reactivo liofilizado). Ademas, el dispositivo de microfluidos puede incluir ademas uno o mas compartimientos que contengan una solucion de lavado, y el compartimiento o compartimientos pueden estar en comunicacion fluida con cualquier otro compartimiento o compartimientos del dispositivo.
Ademas, cualquiera de los kits/dispositivos de microfluidos descritos o bien contemplados en este documento pueden incluir multiples ensayos multiplexados en un solo kit/dispositivo. Cuando estan presentes multiples ensayos, ambos pueden construirse y funcionar como se divulga en este documento. Alternativamente, un ensayo como se divulga en este documento se puede multiplexar con cualquier otro tipo de inmunoensayo de luminiscencia inducida conocido en la tecnica (tal como, entre otros, la tecnologfa de inmunoensayo LOCI® descrita en la patente de Estados Unidos N° 5.340.716 y en las solicitudes de patente de Estados Unidos Nos. US201414775343, US201414775348 y US201414776164; todas presentadas el 15 de marzo de 2013, que pueden estar contenidos dentro de los kits/dispositivos de microfluidos del concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados. Cuando hay multiples ensayos presentes en un solo kit/dispositivo de microfluidos, se pueden realizar dos o mas ensayos de forma simultanea y/o secuencial (incluso total o parcialmente secuencialmente). Cuando se realizan dos o mas ensayos a la vez, se puede desear utilizar dos compuestos quimioluminiscentes diferentes activables por oxfgeno singlete. Cuando se realizan dos o mas ensayos en paralelo (ya sea total o parcialmente secuencial), el mismo compuesto quimioluminiscente activable por oxfgeno singlete se puede utilizar en ambos ensayos, y los dos ensayos se leen en diferentes puntos de tiempo.
Cuando estan presentes multiples ensayos en un unico dispositivo de microfluidos, se pueden conectar multiples canales de entrada a la camara de aplicacion de muestras. En ciertas realizaciones, una parte de la muestra puede pasarse desde la camara de aplicacion de la muestra a los multiples canales de entrada sin tener en cuenta el contenido de la misma. Alternativamente, la estructura o estructuras pueden estar presentes en la camara de aplicacion de la muestra, los canales de entrada y/o la conexion entre ellos que permite la separacion de ciertos componentes de la muestra completa y el suministro de dichos componentes a los diferentes ensayos. Un ejemplo no limitativo de un dispositivo de distribucion de muestra que puede ser utilizado de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados se describe en detalle en la solicitud provisional No. 61/790.580, presentada el 15 de marzo de 2013, titulada "Microfluidic Distributing Device" y publicado mas tarde como US2016008813.
El concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados se refiere adicionalmente a un metodo para detectar la presencia y/o concentracion de un analito objetivo en una muestra (tal como, entre otros, sangre entera, celulas sangufneas completas lisadas, o globulos rojos). En una realizacion, el metodo incluye las etapas de combinar, ya sea simultanea o total o parcialmente secuencialmente: una muestra sospechosa de contener el analito especffico; las dos composiciones que comprenden compuestos quimioluminiscentes activables por oxfgeno singlete asociados con el primer y segundo anticuerpos/fragmentos de union; la composicion conteniendo el tercer anticuerpo/fragmento de union, y el sensibilizador. La mezcla se incuba en condiciones que permiten que los tres anticuerpos/fragmentos de union se unan al analito dentro de la muestra; esto da como resultado la formacion de dos complejos en sandwich: un primer complejo en sandwich que comprende una molecula de analito que tiene la composicion conteniendo el primer anticuerpo/fragmento de union y la composicion conteniendo el tercer anticuerpo/fragmento de union que se une a la mismo, y un segundo complejo en sandwich que comprende otra molecula de analito que tiene la composicion conteniendo el segundo anticuerpo/fragmento de union y la composicion conteniendo el tercer anticuerpo/fragmento de union unida a la misma. Si el sensibilizador no esta ya asociado con la composicion conteniendo el tercer anticuerpo/fragmento de union, la incubacion de la mezcla tambien da como resultado la asociacion del sensibilizador con el primer y el segundo complejos en sandwich a traves de la composicion conteniendo el tercer anticuerpo/fragmento de union presente en los complejos en sandwich, poniendo asf al sensibilizador cerca de los compuestos quimioluminiscentes de las composiciones conteniendo el primero y segundo anticuerpo/fragmento de union.
El sensibilizador se activa luego para generar un oxfgeno singlete, en el que la activacion del sensibilizador presente en el primer y segundo complejos en sandwich provoca la activacion de los compuestos quimioluminiscentes presentes en el primer y segundo complejos en sandwich. Luego se determina la cantidad de quimioluminiscencia generada por los compuestos quimioluminiscentes activados presentes en el primer y segundo complejos en sandwich. Las etapas de union/incubacion, activacion y/o determinacion se pueden repetir opcionalmente durante un numero deseado de veces. La presencia y/o concentracion del analito se detecta analizando la cantidad de quimioluminiscencia producida de este modo, en donde la cantidad de quimioluminiscencia es directamente proporcional a la cantidad de analito en la muestra.
Como se menciono anteriormente, la muestra y varios componentes del metodo se proporcionan en combinacion (simultanea o secuencialmente). Cuando la muestra y los diversos componentes del metodo se agregan secuencialmente, el orden de adicion de la muestra/componentes puede variar; una persona que tenga experiencia ordinaria en la tecnica puede determinar el orden particular deseado de adicion de la muestra/diferentes componentes al ensayo. El orden de adicion mas simple, por supuesto, es agregar todos los materiales simultaneamente y determinar la senal producida a partir de ellos. Alternativamente, la muestra y cada uno de los componentes, o grupos de componentes, pueden combinarse secuencialmente. En ciertas realizaciones, una etapa de incubacion puede estar implicada despues de la adicion de la muestra y/o cada componente.
Cuando el sensibilizador es un fotosensibilizador, la etapa de activacion puede definirse adicionalmente como la activacion del fotosensibilizador a traves de la irradiacion con luz. Cuando al menos una de las composiciones primera y segunda comprende ademas al menos una molecula fluorescente que es excitada por el compuesto quimioluminiscente activado, el metodo puede comprender ademas una etapa de medicion de la cantidad de luz emitida por las moleculas fluorescentes para determinar la cantidad de analito en la muestra.
La muestra puede exponerse a una etapa de separacion antes de la combinacion con cualquiera de los reactivos de ensayo. Por ejemplo, pero no a modo de limitacion, puede ser deseable separar el plasma, el suero o un tipo de celula especifico (tal como, entre otros, los globulos rojos) de la muestra de sangre completa antes de comenzar el ensayo, de modo que los componentes presentes en la muestra de sangre completa no afecten la sensibilidad, el rango dinamico y/o el limite de deteccion del ensayo.
Se puede desear diluir la mezcla formada a partir de la etapa de incubacion/union antes de la activacion del sensor, y asi el metodo puede incluir ademas la etapa de agregar un diluyente a la mezcla incubada de muestra y reactivos. Existen multiples factores que pueden contribuir a la senal de fondo, tal como, entre otros, los siguientes: (1) la union no especifica de dos composiciones de ensayo entre si, y (2) la presencia de dos composiciones de ensayo no unidas que estan simplemente muy cerca entre si. Por estas razones, puede ser deseable diluir la mezcla de reaccion final antes de la exposicion a la luz para disociar las composiciones unidas no especificamente y aumentar la distancia media de particulas entre las composiciones no unidas.
Volviendo ahora a las realizaciones particulares mostradas en los Dibujos, las Figuras 5 y 6 representan dispositivos de microfluidos de "sistema abierto", donde se requieren una o mas funciones manuales para la realizacion del ensayo (es decir, se requiere pipeteo para la adicion de uno o mas reactivos y/o movimiento de una mezcla entre dos compartimientos).
La Figura 5 representa un dispositivo de microfluidos construido de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados. El dispositivo de microfluidos esta indicado por el numeral 10 de referencia general e incluye una carcasa 12 que incluye un compartimiento 14. El compartimiento 14 contiene una cantidad predeterminada de cada una de la primera composicion 16 (conteniendo un compuesto quimioluminiscente activable por oxigeno singlete asociado con el primer anticuerpo/fragmento de union), la segunda composicion 18 (conteniendo un compuesto quimioluminiscente activable por oxigeno singlete asociado con el segundo anticuerpo/fragmento de union) y la tercera composicion 20 (conteniendo el tercer anticuerpo/fragmento de union). La tercera composicion 20 puede incluir ademas un sensibilizador que esta asociado con el tercer anticuerpo/fragmento de union, o el compartimiento 14 puede contener ademas una cantidad predeterminada de sensibilizador 22 que esta separada de la tercera composicion 20. Ademas, mientras que las cuatro composiciones 16, 18, 20 y 22 se representan como componentes separados, dos o mas de estos componentes separados pueden liofilizarse juntos en una sola particula.
Cuando se usa el dispositivo 10 de microfluidos de la Figura 5, una muestra se aplica manualmente (es decir, se pipeta) directamente en el compartimiento 14. Si se utiliza un diluyente, el diluyente tambien se puede aplicar manualmente (es decir, se pipeteo) en el compartimiento 14, tal como pero sin limitarse a, despues de la adicion de la muestra y/o la incubacion de la mezcla de reaccion. El compartimiento 14 puede funcionar tanto como una camara de mezcla/incubacion como una camara de lectura, por lo que el sensibilizador se activa en el compartimiento 14 y la quimioluminiscencia asi generada se mide directamente desde el compartimiento 14. Alternativamente, el compartimiento 14 puede funcionar simplemente como una camara de mezcla y/o incubacion, y la mezcla de reaccion pueden retirarse del compartimiento 14 y agregarse a otro dispositivo en el que se realicen las etapas de activacion y/o lectura. Es decir, el ensayo puede requerir el uso de dos dispositivos (chips): el dispositivo 10 asi como un dispositivo separado sin conexion al dispositivo 10. De esta manera, la mezcla de reaccion se incuba fuera del compartimiento 14 del dispositivo 10 y se transfiere al dispositivo separado.
La Figura 6 representa un dispositivo 10a de microfluidos que es similar al dispositivo de microfluidos 10 de la Figura 5, excepto como se divulga a continuacion. El dispositivo 10a de microfluidos incluye una carcasa 12a que incluye un primer compartimiento 14a; sin embargo, la carcasa 12a comprende ademas un segundo compartimiento 24 y un tercer compartimiento 26. La primera composicion 16a, la segunda composicion 18a, la tercera composicion 20a y el sensibilizador 22a se pueden dispersar entre los tres compartimientos 14a, 24 y 26. Solo con fines ilustrativos, las composiciones primera y segunda 16a y 18a se representan como si estuvieran dispuestas en el primer compartimiento 14a, mientras que la tercera composicion 20a esta dispuesta en el segundo compartimiento 24, y el sensibilizador 22a esta dispuesto en el tercer compartimiento 26. Sin embargo, debe entenderse que cualquier orden de dispersion de las composiciones 16a, 18a, 20a y 22a (o 16a, 18a y 20a, cuando el sensibilizador 22a esta incluido en la tercera composicion 20a) entre los compartimientos 14a, 24, y 26 puede utilizarse, siempre que el ensayo pueda funcionar de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados. Ademas, mientras que las cuatro composiciones 16a, 18a, 20a y 22a se representan como componentes separados, dos o mas de los componentes separados se pueden liofilizar juntos en una sola particula.
Cuando se usa el dispositivo 10a de microfluidos de la Figura 6, una muestra se aplica manualmente (es decir, se pipeta) directamente en el compartimiento 14a y se deja incubar con las composiciones 16a y 18a dispuestas en el mismo. La mezcla de reaccion del compartimiento 14a se retira luego del compartimiento 14a y se aplica directamente al compartimiento 24 y se deja incubar con la composicion 20a. La mezcla de reaccion del compartimiento 24 se retira luego del compartimiento 24 y se aplica directamente al compartimiento 26 y se deja incubar con el sensibilizador 22a. La mezcla de reaccion del compartimiento 26 se retira luego del compartimiento 26 y se aplica directamente a la camara 28 de lectura, en la que el sensibilizador 22a se activa en la camara 28 de lectura y la quimioluminiscencia asi generada se mide directamente desde la camara 28 de lectura.
Se entendera que el numero de compartimientos de incubacion/mezcla y el orden de disposicion de los reactivos de ensayo dentro de los dispositivos de microfluidos de sistema abierto representados en las Figuras 5 y 6 son solo para fines de ilustracion, y no deben interpretarse como limitantes. Mientras que las Figuras 5 y 6 representan dispositivos de microfluidos conteniendo uno o tres compartimientos de incubacion/mezcla en los que se disponen los reactivos de ensayo, se entendera que los dispositivos conteniendo uno, dos, tres o cuatro compartimientos de incubacion/mezcla en los que se disponen los reactivos de ensayo estan completamente contemplados dentro del alcance de los conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados. Ademas, cuando el dispositivo contiene dos o mas compartimientos de incubacion/mezcla, los reactivos de ensayo pueden dispersarse entre los dos o mas compartimientos de incubacion/mezcla en cualquier orden deseado, siempre que el ensayo pueda funcionar como se describe en este documento. Ademas, independientemente del numero de compartimientos de incubacion/mezcla presentes, el compartimiento de incubacion/mezcla final tambien puede ser una camara de lectura; alternativamente, una camara de lectura tambien puede estar presente en el dispositivo de microfluidos ademas de las uno, dos, tres o cuatro camaras de incubacion/mezcla. Tambien, el dispositivo de microfluidos puede contener ademas una o mas estructuras adicionales, tales como, pero sin limitarse a, un compartimiento adicional en el que se puede disponer un excipiente y/o diluyente antes de la adicion a uno o mas de los compartimientos.
Las Figuras 7-12 representan dispositivos de microfluidos de "sistema cerrado" en los que los reactivos de ensayo necesarios se disponen en diversos compartimientos de los dispositivos de microfluidos durante la construccion de los mismos. Estos dispositivos de microfluidos comprenden un sistema totalmente automatico y cerrado en el que no se requieren funciones manuales para realizar el ensayo despues de agregar la muestra al dispositivo de microfluidos.
La Figura 7 representa otra realizacion de un dispositivo de microfluidos construido de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados. El dispositivo 40 de microfluidos incluye una carcasa 42 que incluye un compartimiento 44 conteniendo la primera composicion 46, la segunda composicion 48 y la tercera composicion 50. La tercera composicion 50 puede incluir el sensibilizador asociado con el tercer anticuerpo/fragmento de union, o el compartimiento 44 puede contener ademas una cantidad predeterminada de sensibilizador 52 separado de la tercera composicion 50. Ademas, mientras que las cuatro composiciones 46, 48, 50 y 52 se representan como componentes separados, cualquiera de los componentes separados se puede liofilizar juntos en una particula unica.
La carcasa 42 incluye ademas una camara 54 de aplicacion de muestras y un canal 56 de entrada que conecta la camara 44 de aplicacion de muestras con el compartimiento 44. Una muestra (tal como, entre otras, una muestra de sangre) se puede aplicar a la camara 54 de aplicacion de muestras, que esta (o puede estar en) comunicacion fluida con el canal 56 de entrada. El canal 56 de entrada esta (o puede estar en) comunicacion fluida con el compartimiento 44. El compartimiento 44 puede funcionar como camara de mezcla/incubacion y como camara de lectura.
El canal 56 de entrada puede simplemente transferir una porcion de la muestra al compartimiento 44, o el canal 56 de entrada puede contener una o mas estructuras que permitan la separacion de ciertos componentes de toda la muestra (es decir, filtro o filtros de separacion que permiten la separacion de plasma, suero o globulos rojos de una muestra de sangre completa aplicada a la camara 54 de aplicacion de la muestra) y/o la deteccion de degradacion (tal como, por ejemplo, hemolisis) en la muestra.
Cualquiera de los dispositivos de microfluidos descritos o bien contemplados en el presente documento pueden contar con compartimientos adicionales conteniendo otros reactivos/soluciones. Por ejemplo, la Figura 8 muestra un dispositivo 40a de microfluidos que es similar al dispositivo 40 de microfluidos de la Figura 7, excepto que el dispositivo 40a de microfluidos incluye ademas un segundo compartimiento 58 que esta (o es capaz de estar en) comunicacion fluida con la entrada canal 56a y/o el primer compartimiento 44a; el segundo compartimiento 58 contiene una cantidad predeterminada de al menos un reactivo 60, como un excipiente, diluyente, solucion de lavado, etc. Por ejemplo, pero no a manera de limitacion, cuando las composiciones 50a, 52a, 54a y/o 56a estan en la forma de reactivo o reactivos secos, la propia muestra puede utilizarse para reconstituir el reactivo o reactivos secos; alternativamente, el dispositivo de microfluidos puede contar con uno o mas compartimientos conteniendo excipientes que pueden estar (o pueden estar en) comunicacion fluida con el compartimiento o compartimientos conteniendo dicho reactivo o reactivos.
Cualquiera de los compartimientos de cualquiera de los dispositivos microfluidos descritos o bien contemplados en este documento puede estar sellados para mantener el reactivo o reactivos dispuestos en el en un entorno sustancialmente hermetico al aire y/o sustancialmente hermetico a la luz hasta su uso; por ejemplo, los compartimientos conteniendo reactivo o reactivos liofilizados se pueden sellar para evitar cualquier reconstitucion involuntaria del reactivo y/o exposicion de cualquiera de los reactivos a la luz. El canal de entrada y un primer compartimiento, asi como dos compartimientos, pueden describirse como "capaces de comunicacion fluida" entre si; esta frase indica que el compartimiento o compartimientos todavia pueden estar sellados, pero son capaces de tener un flujo de fluido entre ellos cuando se perfora un sello formado en el mismo.
Ademas, debe entenderse que cualquiera de los dispositivos de microfluidos descritos o bien contemplados en el presente documento pueden contar ademas con camaras adicionales y/u otros circuitos de fluidos. Por ejemplo, pero no a modo de limitacion, cualquiera de los dispositivos de microfluidos puede contener adicionalmente una camara o camaras) de mezcla y/o un circuito o circuitos de fluidos que estan dispuestos entre dos camaras de reactivo.
La Figura 9 representa otra realizacion de un dispositivo de microfluidos construido de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados. El dispositivo de microfluidos esta indicado por el numeral general de referencia 80 y es similar a los dispositivos de microfluidos 10, 10a, 40 y 40a de las Figuras 5-8, excepto que el dispositivo 80 de microfluidos contiene dos compartimientos, y los reactivos de ensayo pueden estar divididos entre estos dos compartimientos
El dispositivo 80 de microfluidos incluye una carcasa 82 que incluye una camara 84 de aplicacion de muestras, un canal 86 de entrada, un primer compartimiento 88 y un segundo compartimiento 90. Una muestra (como, por ejemplo, una muestra de sangre) se puede aplicar a la camara 84 de aplicacion de muestras, que esta en (o es capaz de estar en) comunicacion fluida con el canal 86 de entrada. El canal 86 de entrada esta en (o es capaz de estar en) comunicacion fluida con el primer compartimiento 88. El primer compartimiento 88 se ilustra como conteniendo una cantidad predeterminada de cada una de la primera composicion 92 y la segunda composicion 94, y tambien puede contener una cantidad predeterminada de la tercera composicion 96. El segundo compartimiento 90 esta en (o es capaz de estar en) comunicacion fluida con el primer compartimiento 88; el segundo compartimiento 90 se ilustra como conteniendo una cantidad predeterminada de sensibilizador 98. Aunque la tercera composicion 96 se representa en la Figura 9 estando dispuesta en el primer compartimiento 88, debe entenderse que la tercera composicion 96 puede estar dispuesta alternativamente en el segundo compartimiento 90. Ademas, mientras que la tercera composicion 96 y el sensibilizador 98 se representan en la Figura 9 como dos componentes separados, se entendera que una unica composicion puede estar presente en el segundo compartimiento 90 conteniendo tanto la tercera composicion 96 como al sensibilizador 98.
El orden de disposicion de los reactivos 92, 94, 96 y 98 en los compartimientos 88 y 90 es solo a modo de ejemplo y no debe considerarse limitativo. Los reactivos 92, 94, 96 y 98 pueden estar dispuestos en los compartimientos 88 y 90 en cualquier orden deseado. Ademas, mientras que las cuatro composiciones 92, 94, 96 y 98 se representan como componentes separados, cualquiera de los componentes separados puede liofilizarse juntos en una sola particula y disponerse en cualquiera de los compartimientos 88 y 90.
El dispositivo 80 de microfluidos puede ademas estar provisto de uno o mas compartimientos adicionales conteniendo reactivos adicionales (tales como, entre otros, diluyentes, excipientes, soluciones de lavado, etc.). Cuando se proporcionan uno o mas compartimientos adicionales, los compartimientos pueden estar en (o pueden ser capaces de estar en) comunicacion fluida con el primer compartimiento 88 y/o el segundo compartimiento 90.
En ciertas realizaciones, el compartimiento de un dispositivo de microfluidos conteniendo el sensibilizador (tal como el segundo compartimiento 90 del dispositivo 80 de microfluidos de la Figura 9) puede funcionar como una camara de lectura. Alternativamente, puede estar presente un compartimiento adicional que este en (o pueda estar en) comunicacion fluida con el compartimiento conteniendo el sensibilizador, y este compartimiento adicional actua como una camara de lectura. Por ejemplo, la Figura 10 ilustra un dispositivo 110 de microfluidos que comprende una carcasa 112 que incluye una camara 114 de aplicacion de muestras, un canal 116 de entrada, un primer compartimiento 118, un segundo compartimiento 120, una camara 122 de lectura y un compartimiento 132 adicional. Una muestra (como, pero no limitada a, una muestra de sangre) se puede aplicar a la camara 114 de aplicacion de muestra, que esta en (o es capaz de estar en) comunicacion fluida con el canal 116 de entrada. El primer compartimiento 118 esta en (o es capaz de estar en) comunicacion fluida con el canal 116 de entrada, mientras que el segundo compartimiento 120 esta en (o es capaz de estar en) comunicacion fluida con el primer compartimiento 118. El primer y segundo compartimientos 118 y 120 se ilustran como conteniendo las composiciones 124, 126, 128 y 130 del ensayo, como se divulga con mayor detalle mas adelante en el presente documento. La camara 122 de lectura esta en (o es capaz de estar en) comunicacion fluida con el segundo compartimiento 120. El compartimiento 132 adicional esta en (o es capaz de estar en) comunicacion fluida con uno o mas del canal 116 de entrada, el primero compartimiento 118, el segundo compartimiento 120 y/o la camara 122 de lectura. El compartimiento 132 adicional contiene una cantidad predeterminada de al menos un reactivo 134, tal como un excipiente, un diluyente, una solucion de lavado, etc.
Solo a modo de ejemplo, el primer compartimiento 118 se ilustra como conteniendo una cantidad predeterminada de cada una de la primera composicion 124, la segunda composicion 126, y la tercera composicion 128, y el segundo compartimiento 120 se ilustra como conteniendo una cantidad de sensibilizador 130. Sin embargo, debe entenderse que las cuatro composiciones 124, 126, 128 y 130 pueden disponerse en cualquier orden dentro del dispositivo 110 de microfluidos, siempre que el dispositivo 110 de microfluidos es capaz de funcionar de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados. Por ejemplo, pero no a modo de limitacion, la tercera composicion 128 puede disponerse alternativamente en el segundo compartimiento 120. Ademas, mientras que la tercera composicion 128 y el sensibilizador 130 se representan como dos componentes separados, se entendera que la tercera la composicion 128 y el sensibilizador 130 pueden asociarse entre si antes de su disposicion dentro del dispositivo 110 de microfluidos. Ademas, mientras que las cuatro composiciones 124, 126, 128 y 130 se representan como componentes separados, dos o mas de los componentes separados pueden ser liofilizados juntos en una sola particula y dispuestos en cualquiera de los compartimientos 118 o 120.
Los dispositivos 40, 40a y 80 de microfluidos de las Figuras 7-9 ilustran la disposicion de las cuatro composiciones del ensayo dentro de un solo compartimiento, mientras que el dispositivo 110 de microfluidos de la Figura 10 ilustra la dispersion de las cuatro composiciones de ensayo entre dos compartimientos; sin embargo, debe entenderse que las cuatro composiciones de ensayo pueden estar dispersas entre tres o mas compartimientos. Por ejemplo, la Figura 11 ilustra un dispositivo 110s de microfluidos que es similar al dispositivo 110 de microfluidos de la Figura 10, excepto como se describe en el presente documento a continuacion. El dispositivo 110a de microfluidos comprende una carcasa 112a que incluye una camara 114a de aplicacion de muestras, un canal 116a de entrada, un primer compartimiento 118a, un segundo compartimiento 120a, un tercer compartimiento 136, una camara 122a de lectura y un compartimiento 132a adicional. El primer, segundo y tercer compartimientos 118a, 120a y 136 estan en (o son capaces de estar en) comunicacion fluida entre si como se ilustra en la Figura, y los compartimientos 118a, 120a y 136 se ilustran como conteniendo las composiciones 124a, 126a, 128a y 130a del ensayo, como se describe con mayor detalle en el presente documento a continuacion. El tercer compartimiento 136 esta en (o es capaz de estar en) comunicacion fluida con la camara 122a de lectura. El compartimiento 132a adicional esta en (o es capaz de estar en) comunicacion fluida con uno o mas de los canales 116a de entrada, los compartimientos 118a, 120a y 136, y/o la camara 122a de lectura. El compartimiento 132a adicional contiene una cantidad predeterminada de al menos un reactivo 134a, como un excipiente, diluyente, solucion de lavado, etc.
Solo a modo de ejemplo, el primer compartimiento 118a se ilustra como conteniendo una cantidad predeterminada de cada una de las composiciones primera y segunda 124a y 126a, el segundo compartimiento 120a se ilustra como conteniendo una cantidad predeterminada de la tercera composicion 128a, y el tercer compartimiento 136 se ilustra como conteniendo una cantidad predeterminada de sensibilizador 130a. Sin embargo, debe entenderse que las cuatro composiciones 124a, 126a, 128a y 130a pueden disponerse en cualquier orden dentro del dispositivo 110a de microfluidos, siempre que el dispositivo 110a de microfluidos sea capaz de funcionar de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados. Ademas, mientras que la tercera composicion 128a y el sensibilizador 130a se representan como dos componentes separados, se entendera que la tercera composicion 128a y el sensibilizador 130a pueden asociarse entre si antes de la disposicion dentro del dispositivo 110a de microfluidos. Ademas, mientras que las cuatro composiciones 124a, 126a, 128a y 130a se representan como componentes separados, dos o mas de los componentes separados pueden liofilizarse juntos en una sola particula y disponerse en cualquiera de los compartimientos 118a, 120a o 36.
Como se indica en el presente documento anteriormente, cualquiera de las estructuras de ensayo descritas en el presente documento anteriormente se puede multiplexar con un ensayo o ensayos adicionales en un solo dispositivo de microfluidos individual. La Figura 12 representa otra realizacion de un dispositivo de microfluidos construido de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados. El dispositivo de microfluidos esta indicado por el numeral general de referencia 200 y es similar a los dispositivos 10, 10a, 40, 40a, 80, 110 y 110a de microfluidos de las Figuras 5-11, excepto que el dispositivo 200 de microfluidos contiene multiples compartimientos que proporcionan un formato de ensayo multiplexado. El dispositivo 200de microfluidos incluye una carcasa 202 que incluye una camara 204 de aplicacion de muestras, un primer canal 206 de entrada, un segundo canal 208 de entrada, un primer compartimiento 210 y un segundo compartimiento 212. Una muestra (tal como, entre otros, una muestra de sangre) se puede aplicar a la camara 204 de aplicacion de muestras, que esta en (o es capaz de estar en) comunicacion fluida con los canales 206 y 208 de entrada. El primer canal 206 de entrada esta en (o es capaz de estar en) fluidico comunicacion con el primer compartimiento 210. El primer canal 206 de entrada y el primer compartimiento 210 representan la estructura del ensayo descrita en forma detallada en el presente documento anteriormente, y la Figura 12 ilustra la realizacion mas sencilla del mismo (es decir, en la que el primer compartimiento 210 contiene la primera, segunda y tercera composiciones 214, 216 y 218, y un sensibilizador 220). Si bien esta estructura de ensayo representada es similar a la representada en la Figura 7, debe entenderse que cualquiera de las otras estructuras de ensayo descritas en el presente documento anteriormente o bien contempladas en el presente documento pueden utilizarse en el dispositivo de microfluidos del ensayo multiplexado.
El dispositivo 200 de microfluidos tambien esta provisto de un segundo canal 208 de entrada que esta en (o es capaz de estar en) comunicacion fluida con el segundo compartimiento 212. El segundo 208 canal de entrada y el segundo compartimiento 212 se representan simplemente para ilustrar la presencia de una segunda estructura de ensayo; debe entenderse que cualquier estructura/arquitectura del ensayo se puede multiplexar con cualquiera de los ensayos descritos o bien contemplados alli, y por lo tanto, pueden estar presentes multiples compartimientos segun sea necesario para proporcionar la estructura requerida asociada con el segundo ensayo. Ademas, tambien debe entenderse que el segundo compartimiento 212 puede estar provisto de reactivos similares a los presentes en el primer compartimiento 210, de modo que multiples ensayos que detectan diferentes analitos por el mismo mecanismo de ensayo esten presentes en el mismo dispositivo de microfluidos. Alternativamente, el segundo compartimiento 212 puede representar un formato de ensayo completamente diferente; el unico requisito es que este segundo formato de ensayo pueda ser multiplexado con uno de los ensayos descritos en este documento.
Ejemplos
Se proporcionan ejemplos a continuacion. Sin embargo, se debe entender que el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados no estan limitado en su aplicacion a la experimentacion especifica, resultados y procedimientos de laboratorio. Mas bien, los ejemplos se proporcionan simplemente como una de varias realizaciones y pretenden ser ejemplos, no exhaustivos.
Ejemplo 1
La Figura 13 contiene fotografias de una realizacion de un dispositivo de microfluidos de sistema abierto construido de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados. El dispositivo de microfluidos que se muestra en la Figura 13 contiene una arquitectura basica similar a aquella del dispositivo 10a de microfluidos que se muestra en la Figura 6. El compartimiento etiquetado como "celda optica" en la Figura 13 representa la camara 28 de lectura del dispositivo 10a de microfluidos, mientras que los "pozos de reaccion conteniendo reactivos liofilizados" representan el primer, segundo y tercer compartimientos 14a, 24 y 26 del dispositivo 10a de microfluidos.
La muestra se agrega manualmente a un primer pozo de reaccion y se incuba con el componente o componentes de ensayo contenidos alli, y luego la mezcla de reaccion/incubacion resultante se transfiere manualmente a otro pozo para la incubacion con el componente o componentes de ensayo contenidos alli. La mezcla final de reaccion/incubacion se transfiere manualmente a la celula optica para la activacion del sensibilizador. Un diluyente se puede agregar manualmente a la mezcla de reaccion/incubacion en cualquier punto (o puntos multiples); es decir, se puede agregar un diluyente a cualquier pozo o pozos de reaccion y/o a la celda optica.
Ejemplo 2
La Figura 14 contiene fotografias de una realizacion de un dispositivo de microfluidos de sistema cerrado construido de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados. El dispositivo de microfluidos que se muestra en la Figura 14 contiene una arquitectura basica similar a la del dispositivo 110a de microfluidos que se muestra en la Figura 11. El compartimiento etiquetado como "celda optica" en la Figura 14 representa la camara 122a de lectura del dispositivo 110a de microfluidos, mientras que las "esferas de reactivo liofilizadas empacadas en los pozos de reaccion" representan las composiciones 124a, 126a, 128a y 130a dispuestas en el primero, segundo y tercer compartimientos 118a, 120a y 136 del dispositivo 110a de microfluidos. Ademas, el compartimiento etiquetado como "diluyente" representa el compartimiento 132a adicional que contiene el reactivo 134a.
Ademas, la Figura 14 ilustra la presencia de estructuras adicionales que se colocan mas adelante de los reactivos del ensayo y que permiten la separacion de ciertos componentes de una muestra a partir de una muestra entera y/o el suministro de dichos componentes al compartimiento o compartimientos del ensayo. Estos componentes incluyen una camara de separacion de plasma (que se puede incluir como parte de la camara 114a de aplicacion de muestra en la Figura 11) y un canal de medicion (que se puede incluir como parte del canal 116a de entrada en la Figura 11).
Ejemplo 3
Este ejemplo proporciona una combinacion de epitopos para uso en inmunoensayos de cTnl que utilizan tres anticuerpos/fragmentos de union, de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados reivindicados. En ciertas realizaciones, se desea que los tres epitopos esten localizados dentro del interior (seccion central) de la secuencia de cTnl, ya que el extremo N y el extremo C de la molecula de cTnl estan sujetos a proteolisis tanto por proteasas presentes en el miocardio necrotico como en el plasma del paciente.
En el inmunoensayo de cTnl ilustrado en la Figura 15, el primer y segundo anticuerpo/fragmentos de union se unen a epitopos superpuestos dentro de la region B de la Figura 4 (es decir, la SEQ ID NO: 3), mientras que el tercer anticuerpo/fragmento de union se une a una epitopo dentro de la region C de la Figura 4 (es decir, la SEQ ID NO: 4). En particular, el primer anticuerpo/fragmento de union se une especificamente al epitopo de la SEQ ID NO: 8, y el segundo anticuerpo/fragmento de union se une especificamente al epitopo de la SEQ ID NO: 9. Los epitopos de las SEQ ID NOS: 8 y 9 son ambos epitopos lineales que estan formados por una secuencia de aminoacidos continua de cTnI. Las SEQ ID NOS: 8 y 9 se superponen entre si desde un punto de vista lineal, y un anticuerpo/fragmento de union que se une especificamente a la SEQ ID NO: 9 no pueden unirse a cTnI cuando un anticuerpo/fragmento de union que reconoce especificamente la SEQ ID NO: 8 se une a la misma; igualmente, y un anticuerpo/fragmento de union que se une especificamente a la SEQ ID NO: 8 no puede unirse a cTnI cuando un anticuerpo/fragmento de union que reconoce especificamente la SEQ ID NO: 9 se une a la misma. El tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente al epitopo lineal de la SEQ ID NO: 10. La SEQ ID NO: 10 no se superpone con ninguna de las SEQ ID NO: 8 o 9, por lo que un anticuerpo/fragmento de union unido al epitopo de la SEQ ID NO: 8 o 9 no interfiere con la union de otro anticuerpo/fragmento de union al epitopo de la SEQ ID NO: 10; por lo tanto, el tercer anticuerpo/fragmento de union y uno del primero y segundo anticuerpos/fragmentos de union pueden unirse ambos a una unica molecula de cTnI.
Ejemplo 4
Este ejemplo proporciona otra combinacion de epitopos para uso en inmunoensayos de cTnl que utilizan tres anticuerpos/fragmentos de union, de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados reivindicados. En el inmunoensayo de cTnI ilustrado en la Figura 16, el primer y segundo anticuerpo/fragmentos de union se unen a epitopos superpuestos dentro de la region B de la Figura 4 (es decir, la SEQ ID NO: 3), mientras que el tercer anticuerpo/fragmento de union se une a un epitopo dentro de la region C de la Figura 4 (es decir, la SEQ ID NO: 4). En particular, el primer anticuerpo/fragmento de union se une especificamente al epitopo de la SEQ ID NO: 9, y el segundo anticuerpo/fragmento de union se une especificamente al epitopo de la SEQ ID NO: 11. Los epitopos de las SEQ ID NO: 9 y 11 son ambos epitopos de aminoacidos lineales que estan formados cada uno por una secuencia continua de aminoacidos de cTnI. Las SEQ ID NOS: 9 y 11 se superponen entre si desde un punto de vista lineal, y un anticuerpo/fragmento de union que se une especificamente a la SEQ ID NO: 11 no puede unirse a cTnI cuando un anticuerpo/fragmento de union que reconoce especificamente la SEQ ID NO: 9 se une a la misma; del mismo modo, un anticuerpo/fragmento de union que se une especificamente a la SEQ ID NO: 9 no puede unirse a cTnI cuando un anticuerpo/fragmento de union que reconoce especificamente la SEQ ID NO: 11 esta unido a la misma. El tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente al epitopo lineal de la SEQ ID NO: 10. La SEQ ID NO: 10 no se superpone con ninguna de las SEQ ID NO: 9 u 11, de modo que un anticuerpo/fragmento de union unido al epitopo de la SEQ ID NO: 9 u 11 no interfiere con la union de otro anticuerpo/fragmento de union al epitopo de la SEQ ID NO: 10; por lo tanto, el tercer anticuerpo/fragmento de union y uno del primero y segundo anticuerpo/fragmentos de union pueden ambos unirse a una unica molecula de cTnI.
Ejemplo 5
Este ejemplo proporciona aun otra combinacion de epitopo para uso en inmunoensayos de cTnI que utilizan tres anticuerpos/fragmentos de union, de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados. En el inmunoensayo de cTnI ilustrado en la Figura 17, el primer anticuerpo/fragmento de union se une especificamente al epitopo de la SEQ ID NO: 12 en la region A del epitopo de la Figura 4 (es decir, la SEQ ID NO: 2), el segundo anticuerpo/fragmento de union especificamente se une al epitopo de la SEQ ID NO: 13 en la region F del epitopo de la Figura 4 (es decir, la SEQ ID NO: 7), y el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente al epitopo de la SEQ ID NO: 14 en la region B del epitopo de la Figura 4 (es decir, SEQ ID NO: 3). Mientras que los epitopos de las SEQ ID NOS: 12 y 13 no pueden superponerse desde una perspectiva estructural lineal, estos dos epitopos pueden solaparse en la estructura conformacional tridimensional de la molecula de cTnI.
Esta combinacion de epitopos proporciona una forma alternativa de obtener una mayor sensibilidad para el inmunoensayo de cTnI. En este caso, un anticuerpo de captura/fragmento de union se une especificamente al epitopo de la SEQ ID NO: 12, que se encuentra en la seccion N-terminal procesada inestable de la molecula de cTnI, mientras que el otro anticuerpo de captura/fragmento de union se une especificamente al epitopo de la SEQ ID NO: 13, que se encuentra en la seccion C-terminal procesada e inestable de la molecula de cTnI. Sin embargo, el anticuerpo detector/fragmento de union se une al epitopo de la SEQ ID NO: 14, que se encuentra en la seccion central estable de la molecula.
Ejemplo 6
Este ejemplo proporciona una combinacion de epitopos para su uso en inmunoensayos de BNP que utilizan tres anticuerpos/fragmentos de union, de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados. La Figura 18 representa la secuencia de 32 aminoacidos de BNP (asignada a la SEQ ID NO: 15) y los tres epitopos de este ejemplo no limitativo.
En particular, el primer anticuerpo/fragmento de union se une especificamente al epitopo de la SEQ ID NO: 16, y el segundo anticuerpo/fragmento de union se une especificamente al epitopo de la SEQ ID NO: 17. Los epitopos de las SEQ ID NOS: 16 y 17 son ambos epitopos lineales que estan formados por una secuencia de aminoacidos continua de BNP. Las SEQ ID NOS: 16 y 17 se superponen entre si, y un anticuerpo/fragmento de union que se une especificamente a la SEQ ID NO: 17 no se puede unir a BNP cuando un anticuerpo/fragmento de union que reconoce especificamente a la SEQ ID NO: 16 esta unida a la misma; igualmente, un anticuerpo/fragmento de union que se une especificamente a la SEQ ID NO: 16 no puede unirse a BNP cuando un anticuerpo/fragmento de union que reconoce especificamente la SEQ ID NO: 17 esta unido a la misma. El tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente al epitopo lineal de la SEQ ID NO: 18. La SEQ ID NO: 18 no se superpone con ninguna de las SEQ ID NOS: 16 o 17, por lo que un anticuerpo/fragmento de union unido al epitopo de la SEQ ID NO: 16 o 17 no interfiere con la union de otro anticuerpo/fragmento de union al epitopo de SEQ ID NO: 18. Por lo tanto, el tercer anticuerpo/fragmento de union y uno del primero y segundo anticuerpo/fragmentos de union pueden ambos unirse a una unica molecula de BNP.
Por lo tanto, de acuerdo con el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados, se han proporcionado composiciones que comprenden un sistema quimioluminiscente, asi como kits y dispositivos de microfluidos que contienen los mismos y sus metodos de uso, que satisfacen plenamente los objetivos y las ventajas expuestas en este documento anteriormente.
Realizaciones ilustrativas
Las realizaciones ilustrativas se proporcionan a continuacion en el presente documento. Sin embargo, se debe entender que el concepto o conceptos inventivos actualmente divulgados y reivindicados no esta limitado en su aplicacion a la experimentacion especifica, resultados y procedimientos de laboratorio. Mas bien, las realizaciones ilustrativas se proporcionan simplemente como una de varias realizaciones y pretenden servir como ejemplos, no exhaustivos.
Realizacion ilustrativa 1: un kit que contiene un sistema de deteccion quimioluminiscente para un analito especifico, comprendiendo el kit:
(a) una primera composicion que comprende un compuesto quimioluminiscente activable por oxigeno singlete y un primer anticuerpo o fragmento de union del mismo asociado con el mismo, en el que el primer anticuerpo o fragmento de union del mismo es un anticuerpo de deteccion que se une especificamente a un primer epitopo del analito, por lo que el compuesto quimioluminiscente activable por oxigeno singlete es capaz de unirse indirectamente al analito a traves del primer anticuerpo o fragmento de union del mismo;
(b) una segunda composicion que comprende un compuesto quimioluminiscente activable por oxigeno singlete y un segundo anticuerpo o fragmento de union del mismo asociado con el mismo, en donde el segundo anticuerpo o fragmento de union del mismo es un anticuerpo de deteccion que se une especificamente a un segundo epitopo del analito, por lo que el compuesto quimioluminiscente activable por oxigeno singlete es capaz de unirse indirectamente al analito a traves del segundo anticuerpo o fragmento de union del mismo, y en donde el primer y segundo epitopos se superponen al menos parcialmente de tal manera que el primer y segundo anticuerpo o fragmentos de union del mismo no pueden unirse a una solo molecula del analito; y
(c) una tercera composicion que comprende un tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo, siendo el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo un anticuerpo de captura que se une especificamente a un tercer epitopo del analito que no se superpone con el primer y segundo epitopos, por lo que una unica molecula de analito puede unirse al tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo y uno del primer y segundo anticuerpos o fragmentos de union del mismo, y en donde el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo es capaz de asociarse con un sensibilizador capaz de generar oxigeno singlete en su estado excitado, por lo que la asociacion del tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo con el sensibilizador permite la union indirecta del sensibilizador al analito.
Realizacion ilustrativa 2: el kit de la realizacion ilustrativa 1, que comprende ademas el sensibilizador.
Realizacion ilustrativa 3: el kit de la realizacion ilustrativa 2, en el que la tercera composicion comprende ademas el sensibilizador asociado con el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo.
Realizacion ilustrativa 4: el kit de la realizacion ilustrativa 2 o 3, en el que el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo esta biotinilado, y en el que el sensibilizador tiene estreptavidina asociada con el mismo.
Realizacion ilustrativa 5: El kit de la realizacion ilustrativa 4, que comprende ademas un dispositivo de microfluidos en el que estan dispuestos (a) - (c).
Realizacion ilustrativa 6: el kit de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 1 -5, que comprende ademas un diluyente.
Realizacion ilustrativa 7: el kit de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 1-6, en el que los compuestos quimioluminiscentes activables por oxigeno singlete de la primera y la segunda composiciones son los mismos.
Realizacion ilustrativa 8: el kit de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 1-6, en el que los compuestos quimioluminiscentes activables por oxigeno singlete de la primera y segunda composiciones son diferentes.
Realizacion ilustrativa 9: el kit de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 1-8, en el que al menos una de las composiciones primera y segunda comprende ademas al menos una molecula fluorescente que es excitada por el compuesto quimioluminiscente activado.
Realizacion ilustrativa 10: El kit de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 1-9, en el que al menos uno de (a) - (c) se define ademas como estando en forma de un reactivo liofilizado.
Realizacion ilustrativa 11: El kit de la realizacion ilustrativa 10, en el que (a) y (b) se liofilizan juntos.
Realizacion ilustrativa 12. El kit de la realizacion ilustrativa 10 u 11, que comprende ademas un excipiente para la reconstitucion del reactivo liofilizado.
Realizacion ilustrativa 13: el kit de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 1-12, en el que al menos uno de los anticuerpos primero, segundo y tercero o fragmentos de union de los mismos es un anticuerpo policlonal.
Realizacion ilustrativa 14: el kit de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 1-13, en el que al menos uno de los anticuerpos primero, segundo y tercero o fragmentos de union de los mismos es un anticuerpo monoclonal.
Realizacion ilustrativa 15: el kit de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 1-14, en el que el analito es troponina I.
Realizacion ilustrativa 16: El kit de la realizacion ilustrativa 15, en el que al menos uno de:
(a) el primer y segundo anticuerpos o fragmentos de union de los mismos se unen especificamente a los epitopos superpuestos dentro de la SEQ ID NO: 2, y el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo dentro de una de las SEQ ID NOS: 3-7;
(b) el primer y segundo anticuerpos o fragmentos de union de los mismos se unen especificamente a los epitopos superpuestos dentro de la SEQ ID NO: 3, y el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo dentro de una de las SEQ ID NOS: 2 y 4-7;
(c) el primer y segundo anticuerpos o fragmentos de union de los mismos se unen especificamente a los epitopos superpuestos dentro de la SEQ ID NO: 4, y el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo dentro de una de las SEQ ID NOS: 2-3 y 5- 7;
(d) el primer y segundo anticuerpos o fragmentos de union de los mismos se unen especificamente a epitopos superpuestos dentro de la SEQ ID NO: 5, y el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo dentro de una de las SEQ ID NOS: 2-4 y 6- 7;
(e) el primer y segundo anticuerpos o fragmentos de union de los mismos se unen especificamente a epitopos superpuestos dentro de la SEQ ID NO: 6, y el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo dentro de una de las SEQ ID NOS: 2-5 y 7; y
(f) el primer y segundo anticuerpo o fragmentos de union de los mismos se unen especificamente a epitopos superpuestos dentro de la SEQ ID NO: 7, y el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo dentro de una de las SEQ ID NOS: 2-6.
Realizacion ilustrativa 17: El kit de la realizacion ilustrativa 15 o 16, en el que al menos uno de:
(i) el primer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo de una de las SEQ ID NOS: 8, 9 y 11, el segundo anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo de una de las SEQ ID NO: 8, 9, y 11, y el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo de la SEQ ID n O : 10; y
(ii) el primer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo de la SEQ ID NO: 12 o 13, el segundo anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo de la SEQ ID NO: 12 o 13, y el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo de la SEQ ID NO: 14.
Realizacion ilustrativa 18: un dispositivo de microfluidos, que comprende:
al menos un compartimiento que contiene:
(i) una primera composicion que comprende un compuesto quimioluminiscente activable por oxigeno singlete y un primer anticuerpo o fragmento de union del mismo asociado con el mismo, en donde el primer anticuerpo o fragmento de union del mismo es un anticuerpo de deteccion que se une especificamente a un primer epitopo de un analito especifico, por lo que el compuesto quimioluminiscente activable por oxigeno singlete es capaz de unirse indirectamente al analito a traves del primer anticuerpo o fragmento de union del mismo;
(ii) una segunda composicion que comprende un compuesto quimioluminiscente activable por oxigeno singlete y un segundo anticuerpo o fragmento de union del mismo asociado con el, en donde el segundo anticuerpo o fragmento de union del mismo es un anticuerpo de deteccion que se une especificamente a un segundo epitopo del analito, por lo que el compuesto quimioluminiscente activable por oxigeno singlete es capaz de unirse indirectamente al analito a traves del segundo anticuerpo o fragmento de union del mismo, y en donde el primer y segundo epitopos se superponen al menos parcialmente de tal manera que el primer y segundo anticuerpo o fragmentos de union del mismo no pueden unirse a una solo molecula de analito; y
(iii) una tercera composicion que comprende un tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo, el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo es un anticuerpo de captura que se une especificamente a un tercer epitopo del analito que no se superpone con el primer y segundo epitopos, por lo que una unica molecula de analito puede unirse al tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo y uno de los primeros y segundos anticuerpos o fragmentos de union del mismo; y
(iv) un sensibilizador capaz de asociarse con el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo, pudiendo el sensibilizador generar oxigeno singlete en su estado excitado, y en el que la asociacion del tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo con el sensibilizador permite la union indirecta del sensibilizador con el analito.
Realizacion ilustrativa 19: El dispositivo de microfluidos de la realizacion ilustrativa 18, en el que (i)- (iv) estan dispuestos en el mismo compartimiento.
Realizacion ilustrativa 20: el dispositivo de microfluidos de la realizacion ilustrativa 19, en el que el sensibilizador esta asociado con el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo.
Realizacion ilustrativa 21: El dispositivo de microfluidos de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 18-20, que comprende ademas un canal de entrada a traves del cual se puede disponer una muestra, en donde al menos un compartimiento es capaz de estar en comunicacion fluida con el canal de entrada.
Realizacion ilustrativa 22: el dispositivo de microfluidos de la realizacion ilustrativa 18, ademas definido como que comprende al menos dos compartimientos, en el que un primer compartimiento contiene (i), (ii) y (iii), y en el que un segundo compartimiento contiene (iv).
Realizacion ilustrativa 23: el dispositivo de microfluidos de la realizacion ilustrativa 22, que comprende ademas un canal de entrada a traves del cual se puede disponer una muestra, en donde el primer compartimiento es capaz de estar en comunicacion fluida con el canal de entrada, y en donde el segundo compartimiento es capaz de estar en comunicacion fluida con al menos uno de los canales de entrada y el primer compartimiento.
Realizacion ilustrativa 24: el dispositivo de microfluidos de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 18-23, en el que el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo esta biotinilado, y en el que el sensibilizador tiene estreptavidina asociada con el mismo.
Realizacion ilustrativa 25: el dispositivo de microfluidos de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 18-24, en el que los compuestos quimioluminiscentes activables por oxigeno singlete de la primera y segunda composiciones son los mismos.
Realizacion ilustrativa 26: el dispositivo de microfluidos de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 18-24, en el que los compuestos quimioluminiscentes activables por oxigeno singlete de la primera y segunda composiciones son diferentes.
Realizacion ilustrativa 27: el dispositivo de microfluidos de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 18-25, en el que al menos una de las primera y segunda composiciones comprende ademas al menos una molecula fluorescente que es excitada por el compuesto quimioluminiscente activado.
Realizacion ilustrativa 28: el dispositivo de microfluidos de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 18-27, en el que al menos uno de (i), (ii), (iii) y (iv) se define ademas como que esta en forma de reactivo liofilizado.
Realizacion ilustrativa 29: el dispositivo de microfluidos de la realizacion ilustrativa 28, en el que (a) y (b) estan liofilizados juntos.
Realizacion ilustrativa 30: el dispositivo de microfluidos de la realizacion ilustrativa 28 o 29, que comprende ademas al menos un compartimiento adicional capaz de estar en comunicacion fluida con el canal de entrada y al menos un compartimiento, en el que al menos un compartimiento adicional contiene un excipiente para la reconstitucion de al menos un reactivo liofilizado.
Realizacion ilustrativa 31: el dispositivo de microfluidos de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 18-30, que comprende ademas al menos un compartimiento adicional capaz de estar en comunicacion fluida con al menos uno del canal de entrada y al menos un compartimiento, y en el que al menos un compartimiento adicional contiene un diluyente.
Realizacion ilustrativa 32: el dispositivo de microfluidos de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 18-30, que comprende ademas al menos un compartimiento adicional que permite la separacion de los componentes de la muestra antes de la incubacion con cualquiera de (i)-(iv).
Realizacion ilustrativa 33: el dispositivo de microfluidos de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 18-32, en el que al menos uno de los anticuerpos primero, segundo y tercero o fragmentos de union de los mismos es un anticuerpo policlonal.
Realizacion ilustrativa 34: el dispositivo de microfluidos de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 18-33, en el que al menos uno de los anticuerpos primero, segundo y tercero o fragmentos de union de los mismos es un anticuerpo monoclonal.
Realizacion ilustrativa 35: El dispositivo de microfluidos de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 18-34, en el que el analito es troponina I.
Realizacion ilustrativa 36: el dispositivo de microfluidos de la realizacion ilustrativa 35, en el que al menos uno de:
(a) el primer y segundo anticuerpos o fragmentos de union de los mismos se unen especificamente a los epitopos superpuestos dentro de la SEQ ID NO: 2, y el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo dentro de una de las SEQ ID NOS: 3-7;
(b) el primer y segundo anticuerpos o fragmentos de union de los mismos se unen especificamente a los epitopos superpuestos dentro de la SEQ ID NO: 3, y el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo dentro de una de las SEQ ID NOS: 2 y 4-7;
(c) el primer y segundo anticuerpos o fragmentos de union de los mismos se unen especificamente a los epitopos superpuestos dentro de la SEQ ID NO: 4, y el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo dentro de una de las SEQ ID NOS: 2-3 y 5- 7;
(d) el primer y segundo anticuerpos o fragmentos de union de los mismos se unen especificamente a epitopos superpuestos dentro de la SEQ ID NO: 5, y el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo dentro de una de las SEQ ID NOS: 2-4 y 6- 7;
(e) el primer y segundo anticuerpos o fragmentos de union de los mismos se unen especificamente a epitopos superpuestos dentro de la SEQ ID NO: 6, y el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo dentro de una de las SEQ ID NOS: 2-5 y 7; y
(f) el primer y segundo anticuerpos o fragmentos de union de los mismos se unen especificamente a epitopos superpuestos dentro de la SEQ ID NO: 7, y el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo dentro de una de las SEQ ID NO: 2-6.
Realizacion ilustrativa 37: El dispositivo de microfluidos de la realizacion ilustrativa 35 o 36, en el que:
(i) el primer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo de una de las SEQ ID NOS: 8, 9 y 11, el segundo anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo de una de las SEQ ID NOS: 8, 9, y 11, y el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo de la SEQ ID NO: 10; y
(ii) el primer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo de las SEQ ID NO: 12 o 13, el segundo anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo de la SEQ ID NO: 12 o 13, y el tercer anticuerpo o el fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo de la SEQ ID NO: 14.
Realizacion ilustrativa 38: un metodo para detectar la presencia y/o concentracion de un analito especifico en una muestra, que comprende las etapas de:
(a) combinar, ya sea simultanea o total o parcialmente secuencialmente:
(i) una muestra sospechosa de contener el analito especifico;
(ii) una primera composicion que comprende un compuesto quimioluminiscente activable por oxigeno singlete y un primer anticuerpo o fragmento de union asociado con el mismo, en el que el primer anticuerpo o fragmento de union del mismo es un anticuerpo de deteccion que se une especificamente a un primer epitopo de un analito especifico;
(iii) una segunda composicion que comprende un compuesto quimioluminiscente activable por oxigeno singlete y un segundo anticuerpo o fragmento de union del mismo asociado con el, en donde el segundo anticuerpo o fragmento de union del mismo es un anticuerpo de deteccion que se une especificamente a un segundo epitopo del analito, y en donde el primer y segundo epitopos se superponen, al menos parcialmente, de manera que el primer y segundo anticuerpo o fragmentos de union de los mismos no pueden unirse a una unica molecula de analito;
(iv) una tercera composicion que comprende un tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo, siendo el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo un anticuerpo de captura que se une especificamente a un tercer epitopo del analito que no se superpone con el primer y segundo epitopos, por lo que una unica molecula del analito puede unirse al tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo y uno del primeros y segundo anticuerpos o fragmentos de union del mismo; y
(v) un sensibilizador capaz de asociarse con el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo, pudiendo el sensibilizador generar oxigeno singlete en su estado excitado;
(b) permitir la union de (ii), (iii) y/o (iv) al analito dentro de la muestra, en donde se forma un primer complejo en sandwich que comprende una molecula de analito y (ii) y (iv), y se forma un segundo complejo en sandwich que comprende otra molecula de analito y (iii) y (iv), y en donde (v) se asocia con (iv) en el primer y segundo complejo en sandwich, lo que hace que el sensibilizador se acerque mucho a los compuestos quimioluminiscentes de (ii) y (iii);
(c) activar el sensibilizador para generar oxigeno singlete, en el que la activacion del sensibilizador presente en el primer y segundo complejos en sandwich provoca la activacion de los compuestos quimioluminiscentes presentes en el primer y segundo complejos en sandwich;
(d) determinar la cantidad de quimioluminiscencia generada por los compuestos quimioluminiscentes activados presentes en el primero y segundo complejos en sandwich;
(e) opcionalmente repetir las etapas (b) - (d); y
(f) detectar la presencia y/o concentracion del analito analizando la cantidad de quimioluminiscencia asi producida, en donde la cantidad de quimioluminiscencia es directamente proporcional a la cantidad de analito en la muestra.
Realizacion ilustrativa 39: el metodo de la realizacion ilustrativa 38, en el que el sensibilizador es un fotosensibilizador, y en el que la etapa (c) se define adicionalmente como la activacion del fotosensibilizador mediante la irradiacion con luz.
Realizacion ilustrativa 40: el metodo de la realizacion ilustrativa 38 o 39, en el que la muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre completa, plasma, suero, saliva, esputo, liquido cefalorraquideo (CSF), piel, fluido intersticial, lagrimas, moco, orina, frotis y combinaciones de los mismos.
Realizacion ilustrativa 41: el metodo de la realizacion ilustrativa 40, que comprende ademas una etapa de exposicion de la muestra a una etapa de separacion antes de combinar con cualquiera de (ii) - (v).
Realizacion ilustrativa 42: el metodo de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 38-41, en el que el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo esta biotinilado, y en el que el sensibilizador tiene estreptavidina asociada con el mismo.
Realizacion ilustrativa 43: el metodo de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 38-42, en el que los compuestos quimioluminiscentes activables por oxigeno singlete de la primera y la segunda composiciones son los mismos. Realizacion ilustrativa 44: el metodo de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 38-43, en el que los compuestos quimioluminiscentes activables por oxigeno singlete de la primera y segunda composiciones son diferentes.
Realizacion ilustrativa 45: el metodo de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 38-44, en el que al menos una de la primera y segunda composiciones comprende ademas al menos una molecula fluorescente que es excitada por el compuesto quimioluminiscente activado.
Realizacion ilustrativa 46: el metodo de la realizacion ilustrativa 45, que comprende ademas una etapa de medicion de la cantidad de luz emitida por las moleculas fluorescentes para determinar la cantidad de analito en la muestra. Realizacion ilustrativa 47: el metodo de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 38-46, que comprende ademas una etapa de dilucion de la mezcla de (i) - (v) antes de la etapa (c).
Realizacion ilustrativa 48: el metodo de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 38-47, en el que al menos uno de los anticuerpos primero, segundo y tercero o fragmentos de union de los mismos es un anticuerpo policlonal.
Realizacion ilustrativa 49: el metodo de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 38-48, en el que al menos uno de los anticuerpos primero, segundo y tercero o fragmentos de union de los mismos es un anticuerpo monoclonal. Realizacion ilustrativa 50: El metodo de cualquiera de las realizaciones ilustrativas 38-49, en el que el analito es troponina I.
Realizacion ilustrativa 51: El metodo de la realizacion ilustrativa 50, en el que:
(a) el primer y segundo anticuerpos o fragmentos de union de los mismos se unen especificamente a los epitopos superpuestos dentro de la SEQ ID NO: 2, y el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo dentro de una de las SEQ ID NOS: 3-7;
(b) el primer y segundo anticuerpos o fragmentos de union de los mismos se unen especificamente a los epitopos superpuestos dentro de la SEQ ID NO: 3, y el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo dentro de una de las SEQ ID NOS: 2 y 4-7;
(c) el primer y segundo anticuerpos o fragmentos de union de los mismos se unen especificamente a los epitopos superpuestos dentro de la SEQ ID NO: 4, y el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo dentro de una de las SEQ ID NOS: 2-3 y 5- 7;
(d) el primer y segundo anticuerpos o fragmentos de union de los mismos se unen especificamente a epitopos superpuestos dentro de la SEQ ID NO: 5, y el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo dentro de una de las SEQ ID NOS: 2-4 y 6- 7;
(e) el primer y segundo anticuerpos o fragmentos de union de los mismos se unen especificamente a epitopos superpuestos dentro de la SEQ ID NO: 6, y el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo dentro de una de las SEQ ID NOS: 2-5 y 7; y
(f) el primer y segundo anticuerpos o fragmentos de union de los mismos se unen especificamente a epitopos superpuestos dentro de la SEQ ID NO: 7, y el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo dentro de una de las SEQ ID NOS: 2-6.
Realizacion ilustrativa 52: el metodo de las realizaciones ilustrativas 50 o 51, en el que:
(i) el primer anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo de una de las SEQ ID NOS: 8, 9 y 11, el segundo anticuerpo o fragmento de union del mismo se une especificamente a un epitopo de una

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un kit que contiene un sistema de deteccion quimioluminiscente para un analito especifico, comprendiendo el kit:
(a) una primera composicion que comprende un compuesto quimioluminiscente activable por oxigeno singlete y un primer anticuerpo o fragmento de union del mismo asociado con el mismo, en el que el primer anticuerpo o fragmento de union del mismo es un anticuerpo de deteccion que se une especificamente a un primer epitopo del analito, por lo que el compuesto quimioluminiscente activable por oxigeno singlete es capaz de unirse indirectamente al analito a traves del primer anticuerpo o fragmento de union del mismo;
(b) una segunda composicion que comprende un compuesto quimioluminiscente activable por oxigeno singlete y un segundo anticuerpo o fragmento de union del mismo asociado con el mismo, en donde el segundo anticuerpo o fragmento de union del mismo es un anticuerpo de deteccion que se une especificamente a un segundo epitopo del analito, por lo que el compuesto quimioluminiscente activable por oxigeno singlete es capaz de unirse indirectamente al analito a traves del segundo anticuerpo o fragmento de union del mismo, y en donde el primer y segundo epitopos se superponen al menos parcialmente de tal manera que el primer y segundo anticuerpo o fragmentos de union del mismo no pueden unirse a una solo molecula del analito; y
(c) una tercera composicion que comprende un tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo, siendo el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo un anticuerpo de captura que se une especificamente a un tercer epitopo del analito que no se superpone con el primer y segundo epitopos, por lo que una unica molecula de analito puede unirse al tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo y uno del primer y segundo anticuerpos o fragmentos de union del mismo, y en donde el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo es capaz de asociarse con un sensibilizador capaz de generar oxigeno singlete en su estado excitado, por lo que la asociacion del tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo con el sensibilizador permite la union indirecta del sensibilizador al analito,
y ademas comprende el sensibilizador,
en donde el primer anticuerpo o fragmento de union y el segundo anticuerpo o fragmento de union exhiben diferentes afinidades por el analito, uno de los dos anticuerpos o fragmento de union tiene una afinidad mas baja por el analito, mientras que el otro anticuerpo o fragmento de union tiene una mayor afinidad por el analito.
2. El kit de la reivindicacion 1, en el que la tercera composicion comprende ademas el sensibilizador asociado con el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo.
3. El kit de las reivindicaciones 1 o 2, en el que al menos una de las composiciones primera y segunda comprende ademas al menos una molecula fluorescente que es excitada por el compuesto quimioluminiscente activado.
4. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que al menos uno de (a) - (c) se define ademas como estando en la forma de un reactivo liofilizado.
5. El kit de la reivindicacion 4, que comprende ademas un excipiente para la reconstitucion del reactivo liofilizado.
6. Un dispositivo de microfluidos, que comprende:
al menos un compartimiento que contiene:
(i) una primera composicion que comprende un compuesto quimioluminiscente activable por oxigeno singlete y un primer anticuerpo o fragmento de union del mismo asociado con el mismo, en donde el primer anticuerpo o fragmento de union del mismo es un anticuerpo de deteccion que se une especificamente a un primer epitopo de un analito especifico, por lo que el compuesto quimioluminiscente activable por oxigeno singlete es capaz de unirse indirectamente al analito a traves del primer anticuerpo o fragmento de union del mismo;
(ii) una segunda composicion que comprende un compuesto quimioluminiscente activable por oxigeno singlete y un segundo anticuerpo o fragmento de union del mismo asociado con el, en donde el segundo anticuerpo o fragmento de union del mismo es un anticuerpo de deteccion que se une especificamente a un segundo epitopo del analito, por lo que el compuesto quimioluminiscente activable por oxigeno singlete es capaz de unirse indirectamente al analito a traves del segundo anticuerpo o fragmento de union del mismo, y en donde el primer y segundo epitopos se superponen al menos parcialmente de tal manera que el primer y segundo anticuerpo o fragmentos de union del mismo no pueden unirse a una solo molecula de analito; y
(iii) una tercera composicion que comprende un tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo, el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo es un anticuerpo de captura que se une especificamente a un tercer epitopo del analito que no se superpone con el primer y segundo epitopos, por lo que una unica molecula de analito puede unirse al tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo y uno de los primeros y segundos anticuerpos o fragmentos de union del mismo; y
(iv) un sensibilizador capaz de asociarse con el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo, pudiendo el sensibilizador generar oxigeno singlete en su estado excitado, y en el que la asociacion del tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo con el sensibilizador permite la union indirecta del sensibilizador con el analito, en donde el primer anticuerpo o fragmento de union y el segundo anticuerpo o fragmento de union exhiben diferentes afinidades por el analito, uno de los dos anticuerpos o fragmento de union tiene una afinidad mas baja por el analito, mientras que el otro anticuerpo o fragmento de union tiene una mayor afinidad por el analito.
7. El dispositivo de microfluidos de la reivindicacion 6, que comprende ademas un canal de entrada a traves del cual se puede disponer una muestra, en el que al menos un compartimiento es capaz de estar en comunicacion fluida con el canal de entrada.
8. El dispositivo de microfluidos de la reivindicacion 7, definido ademas como que comprende al menos dos compartimientos, en el que un primer compartimiento contiene (i), (ii) y (iii), y en el que un segundo compartimiento contiene (iv).
9. El dispositivo de microfluidos de la reivindicacion 8, que comprende ademas un canal de entrada a traves del cual se puede disponer una muestra, en el que el primer compartimiento puede estar en comunicacion fluida con el canal de entrada, y en el que el segundo compartimiento puede estar en comunicacion fluida con al menos uno de los canales de entrada y el primer compartimiento.
10. El dispositivo de microfluidos de cualquiera de las reivindicaciones 6-9, que comprende ademas al menos un compartimiento adicional capaz de estar en comunicacion fluida con al menos uno de los canales de entrada y al menos un compartimiento, y en el que al menos un compartimiento adicional contiene un diluyente.
11. Un metodo para detectar la presencia y/o concentracion de un analito especifico en una muestra, que comprende las etapas de:
(a) combinar, ya sea simultanea o total o parcialmente secuencialmente:
(i) una muestra sospechosa de contener el analito especifico;
(ii) una primera composicion que comprende un compuesto quimioluminiscente activable por oxigeno singlete y un primer anticuerpo o fragmento de union asociado con el mismo, en el que el primer anticuerpo o fragmento de union del mismo es un anticuerpo de deteccion que se une especificamente a un primer epitopo de un analito especifico;
(iii) una segunda composicion que comprende un compuesto quimioluminiscente activable por oxigeno singlete y un segundo anticuerpo o fragmento de union del mismo asociado con el, en donde el segundo anticuerpo o fragmento de union del mismo es un anticuerpo de deteccion que se une especificamente a un segundo epitopo del analito, y en donde el primer y segundo epitopos se superponen, al menos parcialmente, de manera que el primer y segundo anticuerpo o fragmentos de union de los mismos no pueden unirse a una unica molecula de analito;
(iv) una tercera composicion que comprende un tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo, siendo el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo un anticuerpo de captura que se une especificamente a un tercer epitopo del analito que no se superpone con el primer y segundo epitopos, por lo que una unica molecula del analito puede unirse al tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo y uno del primeros y segundo anticuerpos o fragmentos de union del mismo; y
(v) un sensibilizador capaz de asociarse con el tercer anticuerpo o fragmento de union del mismo, pudiendo el sensibilizador generar oxigeno singlete en su estado excitado;
(b) permitir la union de (ii), (iii) y/o (iv) al analito dentro de la muestra, en donde se forma un primer complejo en sandwich que comprende una molecula de analito y (ii) y (iv), y se forma un segundo complejo en sandwich que comprende otra molecula de analito y (iii) y (iv), y en donde (v) se asocia con (iv) en el primer y segundo complejo en sandwich, lo que hace que el sensibilizador se acerque mucho a los compuestos quimioluminiscentes de (ii) y (iii);
(c) activar el sensibilizador para generar oxigeno singlete, en el que la activacion del sensibilizador presente en el primer y segundo complejos en sandwich provoca la activacion de los compuestos quimioluminiscentes presentes en el primer y segundo complejos en sandwich;
(d) determinar la cantidad de quimioluminiscencia generada por los compuestos quimioluminiscentes activados presentes en el primero y segundo complejos en sandwich;
(e) opcionalmente repetir las etapas (b) - (d); y
(f) detectar la presencia y/o concentracion del analito analizando la cantidad de quimioluminiscencia asi producida, en donde la cantidad de quimioluminiscencia es directamente proporcional a la cantidad de analito en la muestra,
en donde el primer anticuerpo o fragmento de union y el segundo anticuerpo o el fragmento de union exhiben diferentes afinidades por el analito, uno de los dos anticuerpos o fragmentos de union tienen una menor afinidad por el analito, mientras que el otro anticuerpo o fragmento de union tiene una mayor afinidad por el analito.
12. El metodo de la reivindicacion 11, en el que el sensibilizador es un fotosensibilizador, y en el que la etapa (c) se define adicionalmente como la activacion del fotosensibilizador a traves de la irradiacion con luz.
13. El metodo de la reivindicacion 12, que comprende ademas una etapa para exponer la muestra a una etapa de separacion antes de combinarla con cualquiera de (ii) - (v).
14. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en el que los compuestos quimioluminiscentes activables por oxigeno singlete de la primera y segunda composiciones son iguales.
15. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 11-14, en el que los compuestos quimioluminiscentes activables por oxigeno singlete de la primera y segunda composiciones son diferentes.
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