ES2712892T3 - Anticuerpos anti-E7 del HPV - Google Patents

Anticuerpos anti-E7 del HPV Download PDF

Info

Publication number
ES2712892T3
ES2712892T3 ES11704189T ES11704189T ES2712892T3 ES 2712892 T3 ES2712892 T3 ES 2712892T3 ES 11704189 T ES11704189 T ES 11704189T ES 11704189 T ES11704189 T ES 11704189T ES 2712892 T3 ES2712892 T3 ES 2712892T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
hpv
protein
monoclonal antibody
detection
epitope
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES11704189T
Other languages
English (en)
Inventor
Pidder Jansen-Dürr
Werner Zwerschke
Haymo Pircher
Daniela Ehehalt
Barbara Lener
Kerstin Dreier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Austria Wirtsch GmbH
Oesterreichische Akademie Der Wss
Innovationsagentur GmbH
Osterreichische Akademie der Wissenschaften
Original Assignee
Austria Wirtsch GmbH
Oesterreichische Akademie Der Wss
Innovationsagentur GmbH
Osterreichische Akademie der Wissenschaften
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP10001569A external-priority patent/EP2357197A1/en
Application filed by Austria Wirtsch GmbH, Oesterreichische Akademie Der Wss, Innovationsagentur GmbH, Osterreichische Akademie der Wissenschaften filed Critical Austria Wirtsch GmbH
Application granted granted Critical
Publication of ES2712892T3 publication Critical patent/ES2712892T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/084—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/025—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Una línea celular de hibridoma, que tiene el número de acceso DSM ACC3035.

Description

DESCRIPCION
Anticuerpos anti-E7 del HPV
La presente invencion se refiere a anticuerpos monoclonales anti-E7 del HPV (papilomavirus humano) capaces de reconocer espedficamente un epftopo de la region N terminal de una protema E7 del HPV 18, a composiciones y a kits diagnosticos que comprenden dichos anticuerpos, asf como a procedimientos para el diagnostico con una base inmunohistoqmmica y de ELISA de las infecciones por HPV utilizando dichos anticuerpos.
Las infecciones de transmision sexual por papilomavirus humanos (HPV) son el principal factor etiologico del cancer cervicouterino. Se han descrito mas de cuarenta, en particular mas de treinta y cinco genotipos del HPV, que pueden infectar las celulas del epitelio pavimentoso y glandular de la mucosa cervicouterina. Sobre la base de los datos epidemiologicos y bioqmmicos, los HPV de ADN bicatenario se dividen en HPV de alto riesgo asociados con lesiones intraepiteliales pavimentosas con un elevado potencial de progresion hacia un carcinoma epidermoide invasivo, y HPV de bajo riesgo asociados con una hiperplasia benigna. Se han detectado infecciones por los genotipos de alto riesgo en practicamente todas las lesiones neoplasicas del cuello del utero, y al menos 15 tipos de HPV de alto riesgo estan asociados con el cancer cervicouterino. El HPV 16 es el mas genotipo prevalente en todo el mundo, con una incidencia del carcinoma epidermoide de aproximadamente el 55%, seguido del HPV 18 (de aproximadamente el 17 %) y del HPV 45 (del 4-9 %).
La persistencia del HPV oncogenico es necesaria para el desarrollo del precancer y del cancer cervicouterino. Sin embargo, los factores que determinan la persistencia vmca y la progresion oncogenica no se comprenden en su totalidad. Los acontecimientos iniciales de la carcinogenesis cervicouterina despues de una infeccion vmca dependen del hecho de que los tipos del HPV de alto riesgo experimenten unos cambios esped ficos que anulan el control de la transcripcion de la expresion genica vmca en los queratinocitos infectados. La inactivacion de estas funciones de control celular permite una transcripcion desregulada de los genes vmcos tempranos E6 y E7, desencadenando asf la proliferacion celular, la inhibicion de la apoptosis, la reprogramacion de la diferenciacion y la inestabilidad cromosomica. Estos cambios pueden dar apoyo a la integracion episomica de los genomas del HPV en los cromosomas de la celula hospedadora y contribuir a una sobreexpresion adicional de los genes vmcos E6 y E7, dando como resultado un aumento en los niveles de la oncoprotema E7 durante las etapas tempranas de la carcinogenesis cervicouterina.
El hecho de que las oncoprotemas vmcas E6 y E7 son cruciales durante la carcinogenesis se comprobo adicionalmente por el hecho de que la protema E7 de alto riesgo, en cooperacion con la E6 de alto riesgo, puede inmortalizar eficazmente los queratinocitos primarios humanos in vitro. Ademas, es necesaria la coherente sobreexpresion de los oncogenes E6 y E7 para inducir y mantener el fenotipo transformado de las celulas de cancer cervicouterino.
Por lo tanto, la sobreexpresion de las oncoprotemas E7 de los tipos carcinogenos del HPV es un rasgo caractenstico del cancer cervicouterino. Esta conclusion esta apoyada por un estudio reciente en el que se usaron anticuerpos purificados por afinidad contra las protemas E7 del HPV de alto riesgo para detectar las oncoprotemas E7 del HPV 16, del 18 y del 45 en biopsias de pacientes con un carcinoma epidermoide cervicouterino invasivo (Ressler et al., 2007, Clin Cancer Res, 13: 7067-7072), lo que indica que las oncoprotemas E7 de alto riesgo de estos principales tipos del HPV de alto riesgo son expresadas de forma continua en el carcinoma cervicouterino invasivo.
Actualmente, el cribado clinico del cancer cervicouterino se basa fundamentalmente en la evaluacion citologica de las celulas contenidas en frotis cervicouterinos, denominada citologia cervicouterina (o prueba de Papanicolaou; Papanicolaou, 1942, Science, 95: 438-439), que se obtienen de forma rutinaria a partir de las mujeres que participan en programas de cribado. El resultado de los analisis citologicos depende de la deteccion de celulas anormales por parte de patologos experimentados. Aunque la implementacion de este simple y eficaz ensayo ha ayudado a reducir considerablemente la mortalidad por el cancer cervicouterino, el diagnostico citologico cervicouterino se caracteriza todavfa por un elevado mdice de resultados falsos positivos y falsos negativos (Foucar, 2005, Semin Diagn Pathol, 22 (2): 147-155).
En una metodologfa alternativa, se ha introducido la deteccion del ADN del HPV de alto riesgo en la practica clmica. En estas condiciones se aplica un ensayo de deteccion de ADN sensible (por ejemplo, Hybrid capture 2TM; Digene Inc., Estados Unidos) para determinar la presencia del ADN del HPV de alto riesgo en las muestras de un paciente. Aunque este ensayo es idoneo para la deteccion de infecciones por papilomavirus del tipo de alto riesgo, no puede discriminar entre infecciones temporales, que remiten espontaneamente en la mayona de los casos, y la aparicion de un cancer cervicouterino. Mas recientemente se han desarrollado sistemas diagnosticos que detectan la presencia del ARNm de E6/E7 en frotis cervicouterinos, como un marcador indirecto de la expresion de las oncoprotemas vmcas E6 y E7. Sin embargo, se ha demostrado que el nivel de ARNm de E6/E7 no cambia significativamente durante la progresion del carcinoma, lo que sugiere que la deteccion del ARN puede no ser la mejor herramienta para el cribado del cancer cervicouterino (Hafner et al., 2008, Oncogene, 27 (11): 1610-1617). Segun esta nocion, la infeccion subyacente por el HPV podna no ser detectada mediante un analisis de PCR en todos los tumores analizados por Ressler et al., 2007.
Por lo tanto, la deteccion de la protema E7 parece ser la herramienta diagnostica superior. En la materia ya se conocen diversos anticuerpos, pero o bien muestran una baja sensibilidad o especificidad, o bien se ha descrito que presentan una reaccion cruzada con las protemas E7 de varios tipos de HPV. Tambien, dado que los anticuerpos policlonales solo pueden ser producidos en una cantidad limitada por un animal, existen diferencias entre los lotes. La dificultad para producir anticuerpos monoclonales muy espedficos y sensibles contra las protemas E7 se debe fundamentalmente a la baja inmunogenicidad de las protemas E7.
El documento WO 07/059492, por ejemplo, desvela procedimientos, ensayos y kits para la deteccion del ADN o de las protemas del HPV, que emplea, entre otros, anticuerpos monoclonales y policlonales contra la protema E7 del HPV 16, capaces de detectar de forma fiable la mas bien alta cantidad de alrededor de 1 |jg de la protema E7 recombinante del HPV 16.
El documento WO 05/026731 desvela anticuerpos monoclonales disponibles comercialmente contra la E7 del HPV 18 que no muestran reactividad cruzada con las protemas E7 de la E7 del HPV 16, pero una sensibilidad significativamente menor contra la E7 del HPV 18 en comparacion con los anticuerpos policlonales.
El documento WO 06/085822 se refiere a la expresion de segmentos definidos de las oncoprotemas E7 del HPV 16 y 18 en un fago para su uso como inmunogenos, con objeto de establecer anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales de raton. Sin embargo, los ejemplos muestran unicamente anticuerpos contra la e7 del HPV 16. Consecuentemente, el problema tecnico subyacente en la presente invencion es superar las dificultades mencionadas anteriormente y proporcionar un medio muy espedfico y mas sensible para un diagnostico rentable, rapido y fiable de las infecciones de alto riesgo por el HPV.
La presente invencion resuelve su problema subyacente segun las ensenanzas de las reivindicaciones independientes. Consecuentemente, la presente invencion proporciona una lmea celular de hibridoma, que tiene el numero de acceso DSM ACC3035 y un anticuerpo monoclonal, obtenible a partir del sobrenadante de la lmea celular de hibridoma, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal anti-E7 del HPV, que es capaz de reconocer espedficamente un epftopo de la region N terminal de la protema E7 del HPV 18, en el que el epftopo comprende la secuencia de aminoacidos establecida en la SEQ ID n° 5 u 8.
El termino "anticuerpo", segun se emplea en el presente documento, se refiere preferentemente a una inmunoglobulina completa, como una IgG, una IgA, una IgM, una IgD o una IgE, pero en otra realizacion tambien puede referirse a un fragmento de un anticuerpo, como un F(ab), un F(abc), un Fv, un Fc o un F(ab)2 o un anticuerpo fusionado, un fragmento de anticuerpo fusionado u otro derivado del anticuerpo de la presente invencion, siempre que todavfa muestre la especificidad y la sensibilidad de la inmunoglobulina completa de la presente invencion. Se entiende que el termino "especificidad" o "que reconoce/se une espedficamente" se refiere a la propiedad de un anticuerpo de reconocer o unirse espedficamente preferentemente unicamente a un epftopo espedfico, y preferentemente no muestra o no muestra sustancialmente una reactividad cruzada con otro epftopo. Preferiblemente "especificidad" o "que reconoce/se une espedficamente" significa que el anticuerpo reconoce o se une espedficamente preferentemente unicamente a un epftopo espedfico, y preferentemente no muestra o no muestra sustancialmente una reactividad cruzada con otro epftopo, en el que dicho epftopo es unico para una protema, de forma que el anticuerpo no muestra o no muestra sustancialmente una reactividad cruzada con otro epftopo ni con otra protema.
El termino "sensibilidad", segun se emplea en el presente documento, se refiere al ftmite de deteccion de un anticuerpo, que preferentemente es bajo, es decir, al menos por debajo de una concentracion de 1 jg de la protema que va a ser detectada.
En general, el termino "epftopo" se refiere a una region antigenica de una protema dada que consiste en entre 4 y 50, preferentemente en entre 5 y 15, preferentemente en entre 8 y 11 aminoacidos, o mas. Esta region antigenica o epftopo es reconocida espedficamente por el (los) sitio(s) de union al antfgeno del anticuerpo.
En el contexto de la presente descripcion, se entiende que el termino "region C terminal" se refiere como mucho a los 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 aminoacidos C terminales de la protema E7 del HPV.
La presente descripcion tambien desvela un anticuerpo monoclonal anti-E7 del HPV que reconoce espedficamente un epftopo del dominio en dedo de cinc de la region C terminal de la protema E7 del HPV, preferentemente dicho epftopo es un epftopo conformacional.
Los anticuerpos monoclonales segun la presente invencion se usan preferentemente para la deteccion de las protemas E7 del HPV nativas, es decir, no desnaturalizadas.
En el contexto de la presente descripcion, el termino "epftopo conformacional" se refiere a un epftopo tridimensional que el anticuerpo reconoce o al que se une espedficamente por oposicion a un epftopo lineal. Los epftopos lineales estan determinados unicamente por la secuencia de aminoacidos, mientras que los epftopos conformacionales estan determinados por las caractensticas de la superficie tridimensional, es decir, la estructura terciaria. Por lo tanto, los aminoacidos de un epftopo conformacional que definen la antigenicidad de una protema no tienen por que ser necesariamente los aminoacidos consecutivos de la protema, sino que pueden estar distantes entre sf en la secuencia primaria de la protema para formar el epftopo conformacional, unicamente si la protema esta plegada en su estructura terciaria. Sobre todo, dichos epftopos conformacionales no pueden ser reconocidos por el anticuerpo, si la protema esta desnaturalizada, es decir, no esta plegada en su estructura terciaria.
Las protemas E7 del HPV contienen un dominio en dedo de cinc en su parte C terminal, que forma una estructura ngida muy ordenada, debido fundamentalmente a 4 residuos de cistema. Estos residuos de cistema se coordinan con el cinc y representan por lo tanto un epftopo conformacional. Sorprendentemente, se ha averiguado que los anticuerpos monoclonales que son capaces de reconocer o de unirse a dicho epftopo conformacional, son capaces de detectar una protema E7 del HPV de una forma muy espedfica y muy sensible.
El anticuerpo monoclonal divulgado es capaz de reconocer espedficamente un epftopo de la region C terminal, preferentemente el dominio en dedo de cinc, de la protema E7 de los subtipos del HPV 16, en particular de los tipos del HPV 16, 31, 33, 35, 52, 58 o de los subtipos del HPV 18, en particular de los tipos del HPV 18, 39, 45, 59, 68, 70 o de ambos subtipos del HPV 16 y del 18. Preferiblemente, el epftopo reconocido es un epftopo conformacional. Preferiblemente, el epftopo reconocido comprende la secuencia de aminoacidos establecida en la SEQ ID n° 1 (no segun la presente invencion) que es un motivo de la secuencia del epftopo comun presente en los epftopos desvelados. El motivo del epftopo caracterizado por la SEQ ID n° 1 representa un motivo de epftopo consenso para los subtipos del HPV 16 y 18, y es: Val Cys Pro Xaa Cys, siendo Xaa cualquier aminoacido.
El termino "motivo de epftopo consenso" segun se emplea en el presente documento se refiere a las partes espedficas de un epftopo que son compartidas por las protemas E7 del HPV de los subtipos 16 y/o 18. A pesar de compartir dicho motivo de epftopo consenso, las regiones C terminales de los subtipos del HPV 16 y/o 18, en particular los epftopos espedficos contenidos en las mismas y que contienen este motivo de epftopo son, debido a las secuencias espedficas de aminoacidos y/o a una conformacion espedfica de la secuencia de aminoacidos, sustancialmente lo suficientemente diferentes, de forma que los anticuerpos espedficos son capaces de reconocer espedficamente una protema E7 en particular de un tipo espedfico de HPV, es decir, son capaces de identificar espedficamente un tipo de HPV en particular.
El anticuerpo monoclonal divulgado es capaz de reconocer espedficamente un epftopo de la region C terminal, preferentemente el dominio en dedo de cinc, de los subtipos del HPV 16, en particular del 16, del 31, del 33, del 35, del 52 y del 58. Preferiblemente, el epftopo reconocido es un epftopo conformacional. Preferiblemente, el epftopo reconocido comprende la secuencia de aminoacidos establecida en la SEQ ID n° 2, que es un motivo de secuencia comun presente en los epftopos de los subtipos del HPV 16. El motivo del epftopo caracterizado por la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID n° 2 representa un motivo de epftopo consenso espedfico para los subtipos del HPV 16 y es: Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Val Cys Pro Xaa Cys, siendo Xaa cualquier aminoacido.
El anticuerpo monoclonal divulgado es capaz de reconocer espedficamente la protema E7 del HPV 16. Preferiblemente, el epftopo reconocido comprende, preferentemente consiste en, la secuencia de aminoacidos establecida en la SEQ ID n° 3. El epftopo caracterizado por la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID n° 3 representa un epftopo conformacional espedfico del dominio en dedo de cinc en la parte C terminal de la protema E7 del HPV 16 y es: Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys. Estos aminoacidos representan las posiciones 85 hasta 97 de la protema E7 del HPV 16. El epftopo conformacional esta representado adicionalmente por la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID n° 7 y es: Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro. Estos aminoacidos representan las posiciones 86 hasta 98 de la protema E7 del HPV 16. La secuencia de aminoacidos de la SEQ ID n° 6 representa un epftopo conformacional espedfico de la SEQ ID n° 3 y 7 y es: Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys. Estos aminoacidos representan las posiciones 86 hasta 97 de la protema E7 del HPV 16. Todas estas secuencias de epftopos comprenden dos de los cuatro residuos de cistema que coordinan el ion de cinc con el dominio en dedo de cinc en dos motivos CXXC. El cartografiado de epftopos usando micromatrices con peptidos de 13 mer sinteticos derivados de la E7 del HPV 16 identificaron este epftopo para que fuera reconocido por el anticuerpo monoclonal divulgado de una forma muy espedfica (vease la figura 10). Una alineacion de las secuencias de la E7 del HPV sugirio que especialmente los aminoacidos secuencia arriba y secuencia abajo del motivo muy conservado 90VCPXC94 del epftopo de la SEQ ID n° 3, 6 y 7 proporcionan el reconocimiento espedfico de la protema E7 del HPV 16 por parte del anticuerpo monoclonal divulgado.
Un analisis mutacional demostro que los peptidos que conternan una mutacion puntual en el sitio de coordinacion del cinc no podfan ser detectados por el anticuerpo monoclonal contra la protema E7 del HPV 16, mientras que los mutantes de delecion de otras regiones podfan ser detectados facilmente. Esto indica claramente que un dominio en dedo de cinc intacto, que representa un epftopo conformacional, es necesario para el reconocimiento espedfico de la protema E7 del HPV 16 por parte del anticuerpo monoclonal divulgado. Esto esta mejor ilustrado por la incapacidad del anticuerpo monoclonal divulgado contra la E7 del HPV 16 para reconocer la E7 del HPV 16 mutante C58G, en la que el residuo de cistema de la posicion 58 esta cambiado por glicina, que contiene la secuencia necesaria para el reconocimiento del epftopo lineal, pero ha perdido la capacidad para proporcionar a este epftopo un dominio en dedo de cinc conformacional.
Segun la naturaleza conformacional del epftopo de la SEQ ID n° 3 y 7, en particular de la SEQ ID n° 6, el anticuerpo monoclonal que reconoce este epftopo debe ser usado a unas concentraciones mucho mayores (por ejemplo, de 15 pg/ml para detectar 10 ng de protema purificada) en aplicaciones como una inmunotransferencia Western o el reconocimiento de la protema en lisados celulares, en los que las protemas estan desnaturalizadas, que los anticuerpos policlonales conocidos contra la E7 del HPV 16.
Este epftopo, preferentemente el epftopo conformacional C terminal, esta en una region de la protema E7 que habitualmente muestra una baja inmunogenicidad. Sorprendentemente, podna demostrarse que el anticuerpo monoclonal que reconoce el epftopo segun se proporciona en la SEQ ID n° 3 y 7, en particular en la SEQ ID n° 6, es capaz de detectar espedficamente la protema E7 del HPV 16 de una forma muy sensible y no presenta reactividad cruzada con las protemas E7 de otros tipos de HPV, preferentemente en unas aplicaciones no desnaturalizantes. En particular, el anticuerpo monoclonal contra la E7 del HPV 16 presenta reactividad cruzada con las protemas E7 del HPV 18 o del HPV 45, cuando estas protemas estaban sobreexpresadas en celulas U-2OS. Tambien, el anticuerpo monoclonal contra la E7 del HPV 16 detectaba fuertemente las celulas CaSki positivas para la protema endogena E7 del HPV 16 en experimentos de inmunofluorescencia. Por el contrario, no se observo ninguna senal en celulas U-2OS no transfectadas o en celulas HeLa positivas para el HPV 18. Para caracterizar de forma mas precisa la reaccion cruzada del anticuerpo monoclonal contra la E7 del HPV 16, se empleo un ensayo de ELISA usando las protemas E7 de diferentes tipos de HPV. Tampoco se encontro ninguna reactividad cruzada contra las protemas E7 de otros tipos de HPV, tales como otros genotipos del HPV de alto riesgo y los dos tipos mas habituales de bajo riesgo del HPV, el HPV 6 y el HPV 11.
Ademas, la preincubacion del anticuerpo monoclonal contra la E7 del HPV 16 con la protema purificada E7 del HPV 16 impidio la deteccion de la E7 del HPV 16 asociada a la celula, dado que el anticuerpo ya estaba unido espedficamente a la protema E7 del HPV 16 preincubada.
En comparacion con la tecnica anterior, el anticuerpo monoclonal divulgado es al menos 20 veces, en particular al menos 100 veces, mas sensible, sin ninguna perdida de especificidad. Dado que las infecciones por el HPV 16 suponen mas del 50 % de los casos de carcinoma cervicouterino en todo el mundo, el anticuerpo altamente espedfico es adecuado para que sirva como una herramienta diagnostica muy eficaz y fiable. Ventajosamente, podna demostrarse que el anticuerpo monoclonal divulgado anti-E7 del HPV 16 es capaz de detectar unas cantidades tan bajas tales como de 1 pg, en particular de 500 fg, de la protema E7 del HPV 16, en un ensayo de basado en un ELlSA (ensayo de inmunoadsorcion enzimatica), mientras que los anticuerpos divulgados en el documento WO 07/059492 solo podnan detectar unas concentraciones de la protema E7 del HPV 16 de aproximadamente 1 pg. El anticuerpo monoclonal anti-E7 del HPV 16 divulgado puede usarse por lo tanto a unas concentraciones mucho menores, por ejemplo, de 10 pg/pl, lo que hace que su aplicacion como una herramienta diagnostica sea tambien mas rentable.
Mediante el uso del anticuerpo monoclonal divulgado contra la E7 del HPV 16 tambien podna demostrarse que la localizacion subcelular de la protema E7 del HPV 16 vana durante el ciclo celular entre predominantemente citoplasmatica y predominantemente nuclear.
Se ha demostrado que los niveles de la protema E7 aumentan desde unos niveles indetectables hasta sustanciales durante la carcinogenesis. Con los anticuerpos monoclonales altamente sensibles segun la invencion es posible detectar no solamente las celulas tumorales del carcinoma epidermoide y de adenocarcinomas, sino tambien las celulas de neoplasia intraepitelial cervicouterina precancerosa de gran malignidad y del carcinoma in situ (CIN Ill y CIS), asf como las de la neoplasia glandular intraepitelial cervicouterina de grado III y del adenocarcinoma in situ (CIGN III y AIS), de las que se notifico que teman un alto potencial de progresar hacia un cancer invasivo. Esto podna permitir ventajosamente un diagnostico temprano de los CIN III, CIS, CIGN III, ACIS y AIS precancerosos de gran malignidad antes de su progresion a tumores malignos, ya que los anticuerpos monoclonales segun la presente invencion pueden discriminar entre lesiones precancerosas de poca malignidad de las celulas epidermoides y de origen glandular (CIN l-ll, CIGN l-ll), por un lado, y precanceres (CIN III, CIS, CIGN III) y canceres (CxCa, AdCa) de gran malignidad de las celulas epidermoides y de origen glandular, por otro lado. Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales segun la presente invencion pueden servir como una nueva herramienta para identificar precanceres y canceres de gran malignidad de las celulas epidermoides y de origen glandular.
Por lo tanto, la presente descripcion desvela un anticuerpo monoclonal que reconoce espedficamente un epftopo que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID n° 1, 2, 3 y 4, preferentemente que comprende o que consiste en la SEQ ID n° 3 y 7, en particular en la SEQ ID n° 6.
Preferiblemente, el anticuerpo monoclonal divulgado que es capaz de reconocer espedficamente la protema E7 del HPV 16, preferentemente capaz de reconocer un epftopo con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID n° 3 y 7, en particular de la SEQ ID n° 6, comprende, preferentemente consiste en, una cadena pesada que tiene la secuencia de ADNc de la SEQ ID n° 9 o una cadena ligera que tiene la secuencia de ADNc de la SEQ ID n° 10, o ambas. Por lo tanto, la presente descripcion desvela un anticuerpo monoclonal o un fragmento de la misma, en la que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de aminoacidos codificada por al menos una de la SEQ ID n° 9 o 10. Esto tambien engloba las versiones mutadas de la SEQ ID n° 9 o 10, es decir, las secuencias que comprenden adiciones, deleciones y/o sustituciones de nucleotidos individuales o multiples en comparacion con la SEQ ID n° 9 o 10 siempre que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo codificado por la secuencia mutada todavfa muestre la especificidad y la sensibilidad de la inmunoglobulina completa.
La presente descripcion tambien desvela una lmea celular de hibridoma, preferentemente una lmea celular de hibridoma de un mamfero, lo mas preferido de conejo, capaz de producir el anteriormente identificado anticuerpo monoclonal, en particular el anticuerpo capaz de reconocer espedficamente la protema E7 del HPV 16, preferentemente capaz de reconocer un epftopo de la region C terminal del HPV 16, en particular un epftopo conformacional, preferentemente un epftopo con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID n° 3 y 7, en particular de la SEQ ID n° 6. La lmea celular de hibridoma tiene el numero de acceso DSM ACC 3034. La presente descripcion tambien desvela el anticuerpo monoclonal, que es obtenible a partir del sobrenadante de una lmea celular de hibridoma.
El termino "lmea celular de hibridoma" segun se emplea en el presente documento se refiere a una lmea celular obtenida mediante la fusion de celulas de mieloma, preferentemente de celulas linfoides inmortalizadas de mairftfero, en particular de conejo, con los linfocitos B del bazo de un mairftfero, preferentemente de un conejo que ha sido inmunizado con el antigeno deseado, es decir, una protema purificada E7 del HPV. Dicha lmea celular inmortal de hibridoma es capaz de producir un tipo de anticuerpo espedfico y definido que es secreteado en el medio de cultivo celular o en el sobrenadante. El termino "monoclonal" se refiere a la lmea celular a partir de la cual se obtiene el anticuerpo, en la que todas las celulas son clones de una unica celula parental. Esto permite ventajosamente unos procedimientos de produccion y de purificacion estandarizados para obtener anticuerpos monoclonales de la misma calidad.
Adicionalmente, dichas lmeas celulares de hibridoma pueden ser cultivadas indefinidamente en el medio de cultivo celular adecuado, proporcionando asf una fuente infinita del anticuerpo monoclonal, sin variaciones entre los lotes. Esto es particularmente ventajoso para una aplicacion de anticuerpos monoclonales en rutinas de diagnostico cftnico, ya que pueden omitirse las largas pruebas de nuevos lotes de anticuerpos y los procedimientos diagnosticos pueden producir unos resultados constantes y fiables.
El anticuerpo monoclonal divulgado es capaz de reconocer espedficamente un epftopo de la region C terminal, preferentemente el dominio en dedo de cinc, de los subtipos del HPV 18, en particular del 18, del 39, del 45, del 59, del 68 y del 70. Preferiblemente, el epftopo reconocido es un epftopo conformacional. Preferiblemente, el epftopo comprende la secuencia de aminoacidos establecida en la SEQ ID n° 4 (no segun la presente invencion), que es un motivo de secuencia comun presente en los epftopos de los subtipos del HPV 18 y es: Phe Val Cys Pro Xaa Cys Ala Xaa Xaa Gln, siendo Xaa cualquier aminoacido.
El motivo de epftopo caracterizado por la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID n° 4 (no segun la presente invencion) representa un motivo de epftopo consenso de los subtipos del HPV 18.
En otro aspecto, la presente descripcion desvela un anticuerpo monoclonal anti-E7 del HPV, que es capaz de reconocer espedficamente un epftopo de la region N terminal de una protema E7 del papilomavirus humano. Este anticuerpo monoclonal divulgado es capaz de reconocer espedficamente un epftopo de la region N terminal de la protema E7 de los subtipos del HPV 16, en particular de los tipos del HPV 16, 31, 33, 35, 52, 58 o de los subtipos del HPV 18, en particular de los tipos del HPV 18, 39, 45, 59, 68, 70, o de ambos subtipos del HPV 16 y 18.
El termino "region N terminal" segun se emplea en el presente documento se refiere a los aminoacidos 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 mas N terminales de la protema E7 del HPV.
En una realizacion, el anticuerpo monoclonal reconoce espedficamente un epftopo de la region N terminal de la protema E7 de los subtipos del HPV 18, en particular de los tipos del HPV 18, 39, 45, 59, 68, 70, preferentemente del HPV 18, del HPV 45 o de ambos. Preferiblemente, el anticuerpo que reconoce espedficamente la region N terminal de la protema E7 del HPV 18 muestra una reactividad cruzada con el HPV 11, 45, 56, 58, 59 y 70. En particular, el anticuerpo que reconoce espedficamente la region N terminal de la protema E7 del HPV 18 muestra un alto nivel de reactividad cruzada con el HPV 18, 45 y 56, un nivel intermedio de reactividad cruzada con el HPV 6 y 39 y un bajo nivel de reactividad cruzada con el HPV 11, 33, 52, 58 y 59 con las respectivas protemas e7 sobreexpresadas de forma temporal por las celulas U-2OS en un ensayo de inmunofluorescencia. En un ensayo basado en un ELISA, sin embargo, podna demostrarse que el anticuerpo monoclonal segun la presente invencion, que es capaz de reconocer espedficamente un epftopo de la region N terminal de la protema E7 del HPV 18, unicamente presenta una reactividad cruzada sustancialmente con la protema E7 del HPV 45. Tambien, el anticuerpo monoclonal segun la presente invencion, capaz de reconocer espedficamente un epftopo de la region N terminal, era capaz de detectar fuertemente la protema endogena E7 de las celulas HeLa positivas para el HPV 18, mientras que no se obtuvo ninguna senal en las celulas U-2OS no transfectadas o en las celulas CaSki positivas para el HPV 16, tanto en experimentos de inmunofluorescencia como de inmunotransferencia western.
El epftopo espedfico N terminal reconocido comprende, preferentemente consiste en, la secuencia de aminoacidos establecida en la SEQ ID n° 5 y es: Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu. Estos aminoacidos representan las posiciones 5 hasta 13 de la protema E7 del HPV 18. Una realizacion adicional del epftopo N terminal esta representada por la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID n° 8 y es: Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu.
Estos aminoacidos representan las posiciones 4 hasta 13 de la protema E7 del HPV 18.
Ventajosamente, podna demostrarse que el anticuerpo monoclonal anti-E7 del HPV 18 segun la presente invencion es capaz de detectar unas cantidades tan bajas tales como de 1 pg, en particular de 500 fg, de la protema E7 del HPV 18 en un ensayo basado en un ELISA.
La presente invencion tambien se refiere a una lmea celular de hibridoma, preferentemente a una lmea celular de hibridoma de mairnfero, lo mas preferido de conejo, capaz de producir el anticuerpo monoclonal capaz de reconocer espedficamente un epftopo de la region N terminal de la protema E7 del HPV 18, capaz de reconocer un epftopo con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID n° 5 o 8. La presente invencion se refiere a la lmea celular de hibridoma, que tiene el numero de acceso DSM ACC 3035. La presente invencion tambien se refiere al anticuerpo monoclonal, que es obtenible a partir del sobrenadante de una lmea celular de hibridoma segun la presente invencion.
Los anticuerpos monoclonales segun la presente invencion son anticuerpos monoclonales de mamffero, preferentemente de conejo (RabMabs), preferentemente producidos por una lmea celular de hibridoma de conejo. Debido a un sistema inmunitario mas sofisticado, los conejos son capaces de producir anticuerpos mas elaborados que los ratones. Esta ventaja, combinada con la posibilidad de crear lmeas celulares de hibridoma de conejo, hace posible la obtencion de anticuerpos monoclonales de alta calidad.
Para diversas aplicaciones, los anticuerpos monoclonales segun la presente invencion pueden ser marcados por sf mismos de una forma detectable con un grupo radioactivo, enzimatico o fluorescente. Hay disponible una diversidad de tecnicas para el marcaje de biomoleculas tales como anticuerpos, que son bien conocidas por la persona experta en la materia. Los marcadores usados habitualmente comprenden, entre otros, fluorocromos, como fluorescema, rodamina, Texas Red, Cy3 o Cy5, enzimas como peroxidasa, peroxidasa de rabano picante, p-galactosidasa, fosfatasa alcalina o acetilcolinesterasa, isotopos radioactivos, digoxigenina, metales coloidales, compuestos quimioo bioluminiscentes. Preferiblemente, los anticuerpos monoclonales segun la presente invencion estan marcados con biotina. En otra realizacion preferida, los anticuerpos de la presente invencion son detectados mediante procedimientos secundarios, como una inmunofluorescencia indirecta. Consecuentemente, los anticuerpos secundarios marcados de una forma detectable pueden ser empleados para detectar espedficamente los anticuerpos monoclonales segun la presente invencion.
La presente invencion tambien se refiere a una composicion diagnostica que comprende los anticuerpos monoclonales segun la presente invencion como agente activo. Dicha composicion diagnostica puede comprender, en una realizacion preferida, el anticuerpo monoclonal de la presente invencion en una forma soluble o en una fase ftquida. En otra realizacion preferida, los presentes anticuerpos estan unidos, fijados y/o conectados a un soporte solido. En otra realizacion preferida, la presente composicion diagnostica comprende los anticuerpos monoclonales segun la invencion formulados con un portador, un diluyente, un tampon o una solucion de conservacion diagnosticamente aceptable. La composicion diagnostica de la presente invencion comprende, en una realizacion preferida, los anticuerpos monoclonales individualmente o en combinaciones, segun las necesidades de la aplicacion prevista. Preferiblemente, dicha composicion diagnostica se usa para la deteccion inmunologica, preferentemente inmunohistologica, de inmunofluorescencia o basada en un ELlSA, de la protema E7 del HPV en una muestra biologica, para permitir el diagnostico de infecciones por el HPV.
La presente invencion tambien se refiere a un kit diagnostico que comprende los anticuerpos monoclonales segun la invencion como primer agente y otros anticuerpos dirigidos contra las protemas E7 del HPV como segundo agente. Los anticuerpos usados como segundo agente son preferentemente anticuerpos policlonales de cabra, capaces de reconocer las protemas E7 de los HPV de alto riesgo 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58 y 59.
El kit diagnostico de la presente invencion comprende, en una realizacion preferida, los anticuerpos monoclonales individualmente o en combinaciones segun las necesidades de la aplicacion prevista.
El kit diagnostico segun la presente invencion se usa preferentemente para la deteccion inmunologica, preferentemente inmunohistologica, de inmunofluorescencia o basada en un ELISA, de la protema E7 del HPV, permitiendo asf el diagnostico de infecciones por el HPV. Preferiblemente, el kit diagnostico de la presente invencion comprende adicionalmente opcionalmente uno o mas tampones, soluciones de conservacion y/u otros reactivos o materiales necesarios con fines medicos, cientfficos o diagnosticos. Adicionalmente, las partes del kit diagnostico puede ser envasadas individualmente en viales o en frascos, o en combinacion en recipientes o en unidades multirrecipiente.
El uso de los anticuerpos monoclonales segun la presente invencion en un procedimiento in vitro, en particular en un procedimiento in vitro inmunologico, preferentemente inmunohistoqmmico o basado en inmunofluorescencia o en un procedimiento in vitro basado en un ELISA, preferentemente en un ELISA directo o en sandwich, tambien esta contemplado por la presente invencion. Tambien, los anticuerpos monoclonales segun la presente invencion podnan usarse ventajosamente en una tira reactiva, por ejemplo, en una prueba de flujo lateral, para la deteccion de las protemas E7 del HPV.
Por lo tanto, la presente invencion se refiere a un procedimiento in vitro para la deteccion de la protema E7 del HPV 18, que comprende i) la incubacion de una muestra biologica con el anticuerpo monoclonal segun la presente invencion y ii) la medicion y/o la deteccion de la protema E7 del HPV 18 en la muestra biologica mediante la medicion y/o la deteccion del anticuerpo unido espedficamente a la protema E7.
La presente invencion tambien proporciona un procedimiento in vitro para el diagnostico inmunologico, preferentemente inmunohistoqmmico o basado en inmunofluorescencia, de infecciones por el HPV 18, que comprende a) la incubacion de una muestra biologica con los anticuerpos monoclonales segun la presente invencion y b) la medicion y/o la deteccion de la protema E7 del HPV 18 en la muestra biologica mediante la medicion y/o la deteccion del anticuerpo unido espedficamente a la protema E7, y permitiendo asf el diagnostico de una infeccion por el HPV 18. Ventajosamente, la aplicacion de los anticuerpos monoclonales segun la presente invencion en dicho procedimiento diagnostico permite una deteccion muy sensible y fiable de las infecciones por los HPV de alto riesgo, ya que los anticuerpos monoclonales segun la presente invencion muestran una proporcion entre senal y ruido muy alta con un fondo despreciable.
Se entiende que el termino "muestra biologica" segun se emplea en el presente documento se refiere a cualquier tipo de tejido biologico, celulas y/u organos, preferentemente biopsias o frotis cervicouterinos, preferentemente una citologfa cervicouterina.
La presente invencion tambien se refiere a un procedimiento in vitro para el diagnostico basado en un ELISA de infecciones por el HPV 18, que comprende aa) el recubrimiento de un soporte con anticuerpos de captura dirigidos contra las protemas E7 del HPV, bb) la adicion de una muestra biologica, preferentemente de un lisado celular, al soporte recubierto, cc) la incubacion del soporte con el anticuerpo monoclonal de deteccion segun la presente invencion y dd) la identificacion de la protema E7 del HPV 18 unida espedficamente por los anticuerpos de captura mediante la medicion y/o la deteccion del anticuerpo monoclonal de deteccion unido espedficamente a la protema E7, y permitiendo asf el diagnostico de una infeccion por el HPV 18. El anticuerpo monoclonal contra el N terminal de la E7 del HPV 18 segun la presente invencion se usa, preferentemente, como anticuerpo de deteccion o de captura en este procedimiento. Cuando se usa como anticuerpo de deteccion en este procedimiento, los anticuerpos segun la presente invencion estan preferentemente biotinilados, dado que esto da lugar a un aumento en la especificidad y en la sensibilidad de la deteccion de la E7 del HPV.
Preferiblemente, se usan anticuerpos policlonales de cabra como los anticuerpos de captura para el procedimiento diagnostico basado en un ELISA, que son capaces de reconocer las protemas E7 de los tipos del h Pv 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58 y 59 de alto riesgo. Dado que estos anticuerpos policlonales de cabra unicamente se unen a las protemas E7 de los tipos del HPV de alto riesgo, la aplicacion de los anticuerpos anti-E7 del HPV 18 como anticuerpo de deteccion permite ventajosamente la deteccion de los tipos de alto riesgo del HPV 18, 45, 56, 58, 59 y 70.
Como soporte solido, se usan preferentemente placas de ELISA, pero la persona experta en la materia puede elegir tambien portadores o materiales diferentes.
Los lisados celulares que se van a probar con el procedimiento basado en el ELISA son preparados preferentemente a partir de muestras biologicas, preferentemente de biopsias o de frotis cervicouterinos, preferentemente una citologfa cervicouterina.
Las realizaciones preferidas adicionales son el asunto en cuestion de las subreivindicaciones.
La lista de secuencias muestra:
la SEQ ID n° 1 (no segun la presente invencion) muestra la secuencia de aminoacidos de un motivo de epftopo consenso C terminal de la protema E7 de los subtipos del HPV 16 y de los subtipos del HPV 18 y
la SEQ ID n° 2 (no segun la presente invencion) muestra la secuencia de aminoacidos de un motivo de epftopo consenso C terminal de la protema E7 de los subtipos del HPV 16 y
la SEQ ID n° 3 (no segun la presente invencion) muestra la secuencia de aminoacidos del epftopo conformacional C terminal de la protema E7 del HPV 16, que comprende en particular las posiciones 85 hasta 97 de la protema E7 del HPV 16 y
la SEQ ID n° 4 (no segun la presente invencion) muestra la secuencia de aminoacidos de un motivo de epftopo consenso C terminal de la protema E7 de los subtipos del HPV 18 y
la SEQ ID n° 5 muestra la secuencia de aminoacidos del epftopo N terminal de la protema E7 del HPV 18, que comprende en particular las posiciones 5 hasta 13 de la protema E7 del HPV 18 y
la SEQ ID n° 6 (no segun la presente invencion) muestra la secuencia de aminoacidos del epftopo conformacional C terminal de la protema E7 del HPV 16 que comprende las posiciones 86 hasta 97 de la protema E7 del HPV 16 y
la SEQ ID n° 7 (no segun la presente invencion) muestra la secuencia de aminoacidos del epftopo conformacional C terminal de la protema E7 del HPV 16 que comprende las posiciones 86 hasta 98 de la protema E7 del HPV 16 y
la SEQ ID n° 8 muestra la secuencia de aminoacidos del epftopo N terminal de la protema E7 del HPV 18 que comprende las posiciones 4 hasta 13 de la protema E7 del HPV 18 y
la SEQ ID n° 9 (no segun la presente invencion) muestra la secuencia de ADNc de la cadena pesada del anticuerpo anti-E7 del HPV 16 de la presente invencion y
la SEQ ID n° 10 (no segun la presente invencion) muestra la secuencia de ADNc de la cadena ligera del anticuerpo anti-E7 del HPV 16 de la presente invencion.
La presente invencion esta ilustrada adicionalmente por los siguientes ejemplos no limitantes y las figuras anexas. Las figuras muestran:
la Figura 1 muestra la sensibilidad de los anticuerpos monoclonales de la presente invencion para la deteccion de las protemas recombinantes E7 mediante un ELISA. Las placas de ELlSA se recubrieron con una mezcla (1:1) de los anticuerpos policlonales de cabra contra la E7 del HPV 16 y la E7 del HPV 18. Despues se anadieron las protemas recombinantes E7 a diferentes concentraciones. Posteriormente se anadieron los anticuerpos monoclonales anti-E7 del HPV 16 (1A, no segun la presente invencion) y anti-E7 del HPV 18 (1B) de la presente invencion para la deteccion de las protemas recombinantes unidas por los anticuerpos policlonales de cabra, seguido de una incubacion con el correspondiente anticuerpo secundario para su visualizacion.
La Figura 2 muestra la sensibilidad de los anticuerpos monoclonales biotinilados de la presente invencion para la deteccion de las protemas recombinantes E7 mediante un ELISA (2 A, B) y la representacion logantmica de las concentraciones de protema detectadas por los anticuerpos de la presente invencion (C, D). Las placas de ELISA se recubrieron con una mezcla (1:1) de los anticuerpos policlonales de cabra contra la E7 del h Pv 16 y la E7 del HPV 18. Despues se anadieron las protemas recombinantes E7 a diferentes concentraciones. Posteriormente se anadieron los anticuerpos monoclonales biotinilados anti-E7 del HPV 16 (2A, C, no segun la presente invencion) y anti-E7 del HPV 18 (2B, D) de la presente invencion para la deteccion de las protemas E7 unidas por los anticuerpos policlonales de cabra, seguido de una incubacion con un conjugado de estreptavidina-Poli-HRP para su visualizacion. El lfmite de deteccion se define como la media de la senal de fondo (doce mediciones) mas tres veces la desviacion tfpica.
La Figura 3 muestra que los anticuerpos monoclonales biotinilados de la presente invencion no detectan las protemas recombinantes de los tipos de bajo riesgo del HPV (6, 11) en un ELISA. Las placas de ELISA se recubrieron con una mezcla (1:1) de los anticuerpos policlonales de cabra dirigidos contra la E7 del HPV 16 y la E7 del HPV 18. Despues se anadieron las diferentes protemas recombinantes E7 de los tipos de alto riesgo del HPV (16, 18) y de los tipos de bajo riesgo del h Pv (6, 11). Posteriormente se anadieron los anticuerpos monoclonales biotinilados anti-E7 del HPV 16 (3A, no segun la presente invencion) y anti-E7 del HPV 18 (3B) de la presente invencion para la deteccion de las protemas E7 unidas por los anticuerpos policlonales de cabra, seguido de una incubacion con un conjugado de estreptavidina-Poli-HRP para su visualizacion.
La Figura 4 muestra la deteccion de la protema endogena E7 de celulas CaSki (positivas para el HPV 16) (4A) y de celulas HeLa (positivas para el HPV 18) (4B) en el trasfondo de celulas U-2OS negativas para el HPV con los anticuerpos monoclonales biotinilados de la presente invencion mediante un ELISA. Por lo tanto, las placas de ELISA se recubrieron con una mezcla (1:1) de los anticuerpos policlonales de cabra contra la E7 del h Pv 16 y la E7 del HPV 18. Se anadieron los lisados celulares con una concentracion celular total de 100.000 celulas por pocillo, que consisten en celulas U-2OS negativas para el HPV como trasfondo, y se anadieron diferentes cantidades de celulas CaSki positivas para la E7 del HPV 16 o de celulas HeLa positivas para el la E7 del HPV 18. Posteriormente se anadieron los anticuerpos monoclonales biotinilados anti-E7 del HPV 16 (4A, no segun la presente invencion) y anti-E7 del HPV 18 (4B) de la presente invencion para la deteccion de las protemas E7 unidas por los anticuerpos policlonales de cabra, seguido de una incubacion con un conjugado de estreptavidina-Poli-HRP para su visualizacion. El lfmite de deteccion se define como la media de la senal de fondo (12 mediciones) mas tres veces la desviacion tfpica.
La Figura 5 muestra la deteccion de la protema E7 en cinco muestras clmicas (una positiva para el HPV 16, una positiva para el HPV 18 y tres negativas para el HPV) con los anticuerpos monoclonales biotinilados de la presente invencion mediante un ELISA. Las placas de ELISA se recubrieron con una mezcla (1:1) de los anticuerpos policlonales de cabra contra la E7 del HPV 16 y la E7 del HPV 18. Se anadieron los lisados de las muestras clmicas (100 pg/pocillo). Posteriormente se anadieron los anticuerpos monoclonales biotinilados anti-E7 del HPV 16 (5A, no segun la presente invencion) y anti-E7 del HPV 18 (5B) de la presente invencion para la deteccion de las protemas E7 unidas por los anticuerpos policlonales de cabra, seguido de una incubacion con un conjugado de estreptavidina-Poli-HRP para su visualizacion.
La Figura 6 (no segun la presente invencion) muestra la deteccion de la protema E7 en muestras de LBC de mujeres sanas enriquecidas en celulas CaSki (positivas para el HPV 16) y en celulas U-2OS (negativas para el HPV). La citologfa basada en ftquidos se prepare a partir de un frotis cervical de una Papll pro-band, que no produjo ninguna senal con el anticuerpo anti-E7 del HPV 16. Segun se indica, se anadieron 10.000 celulas de cada una de las CaSki y las U-2OS a la muestra. Las celulas positivas para la E7 del HPV 16 fueron detectadas espedficamente mediante una inmunohistoqmmica con el anticuerpo anti-E7 del HPV 16 a lo largo de una amplia variedad de diluciones de anticuerpo, segun se indica.
La Figura 7 (no segun la presente invencion) muestra la especificidad del anticuerpo monoclonal contra la E7 del HPV 16 que emplea un ELISA directo mediante el uso de 2,5 y de 10 ng de las proternas E7 del HPV de diferentes tipos de HPV recubiertas aleatoriamente detectadas por el anticuerpo monoclonal biotinilado contra la E7 del HPV 16 (14 ng/100 pl) con el tampon como control.
La Figura 8 (no segun la presente invencion) la figura 8A muestra la deteccion de las proternas E7 del HPV 16 de tipo natural y con varias mutaciones expresadas de forma temporal en celulas U-2OS por parte del anticuerpo monoclonal contra la E7 del HPV 16 (2 ng/pl) seguido de un anticuerpo secundario marcado con alexaFlour488 en experimentos de inmunofluorescencia indirecta, (vector = vector de control vado, WT = de tipo natural). La Figura 8B muestra la deteccion de la proterna E7 del HPV 16 de tipo natural y mutada, por parte de anticuerpos policlonales conocidos anti E7 del h Pv 16 que no reconocen espedficamente el epftopo conformacional en el dominio en dedo de cinc, y que por lo tanto tambien reconocen las mutaciones relativas a los residuos de cistema.
La Figura 9 (no segun la presente invencion) muestra un modelo de la estructura de la proterna E7 del HPV 16 deducida a partir de la estructura de la RMN de la E7 del HPV 45, que contiene dos laminas p (p1 y p2) y dos helices a (a1 y a2) como estructuras secundarias. Se indican las cadenas laterales de las cuatro cisternas (C58, C61, C91, C94) de los dos motivos CXXC que se coordinan con el cinc ubicados a su vez conectando la p1 y la p2 y en la helice a2 C terminal. Se indica el epftopo 86TLGIVCPICSQK97 (SEQ ID n° 6) en el dedo de cinc carboxilo terminal de la E7 reconocido por el anticuerpo monoclonal. Ademas, se indica la localizacion de las mutaciones C terminales A52YNIVT56, A65LRL67, A75DIR77, A79LEDLL83, C58G y C91G. No se indican los N terminales no estructurados ni las mutaciones H2P y C24G.
La Figura 10 (no segun la presente invencion) muestra un cartografiado de epftopos mediante el uso de peptidos sinteticos de 13 mer de la E7 del HPV 16 en micromatrices que fueron detectados por el anticuerpo monoclonal contra la E7 del HPV 16, dos anticuerpos de conejo no relacionados y unicamente el anticuerpo secundario (anti-Cy5 de conejo). Espedficamente, los peptidos 43 y 44 son reconocidos por el anticuerpo monoclonal anti-E7 del HPV 16 que comprende el epftopo espedfico.
La Figura 11 muestra la especificidad del anticuerpo monoclonal contra la E7 del HPV 18 mediante el empleo de un ensayo de ELISA. Las placas de ELISA se recubrieron con una mezcla (1:1) de los anticuerpos policlonales de cabra contra la E7 del HPV 16 y la E7 del HPV 18. Despues se anadieron 100 pg de la proterna E7 recombinante de diferentes tipos de HPV. Posteriormente se anadieron los anticuerpos monoclonales biotinilados anti-E7 del HPV 18 de la presente invencion para la deteccion de las proternas E7 unidas por los anticuerpos policlonales de cabra, seguido de una incubacion con un conjugado de estreptavidina-Poli-HRP para su visualizacion.
La Figura 12 muestra una inmunotransferencia western con la proterna E7 del HPV 16 y 18 (10 ng) purificada, cargada cada una en un gel de SDS al 12,5 % y sondeada con el anticuerpo contra la e 7 del HPV 18, en la que unicamente la proterna E7 del HPV 18 es reconocida por el anticuerpo (panel izquierdo) y los extractos celulares de celulas HeLa positivas para el HPV 18, de celulas CaSki positivas para el HPV 16 y de celulas U-2OS transfectadas bien con un vector vado o bien con un vector de expresion para la E7 del HPV 18. Los lisados celulares se separaron mediante una SDS-PAGE y se sondearon en una inmunotransferencia western con el anticuerpo contra la E7 del HPV 18 (panel derecho). Unicamente la proterna E7 del HPV 18 es reconocida por el anticuerpo.
La Figura 13 muestra un cartografiado de epftopos mediante el uso de peptidos sinteticos de 11 mer de la E7 del HPV 18 que fueron detectados por el anticuerpo monoclonal contra la E7 del HPV 18, dos anticuerpos de conejo no relacionados y unicamente el anticuerpo secundario (anti-Cy5 de conejo). Espedficamente, los peptidos 1 a 3 son reconocidos por el anticuerpo monoclonal anti-E7 del HPV 18 que comprende el epftopo espedfico.
Ejemplo 1
Generacion y purificacion de anticuerpos monoclonales de conejo (RabMabs)
Se usaron las proternas E7 purificadas del HPV 16 y del HPV 18 (pureza > 95 %; 4 mg de cada una) (Fiedler et al., J Gen Virol, 2005, 86, 3235-3241 y Fiedler et al., J Virol Methods, 2006, 134, 30-35) para inmunizar conejos, y se prepararon clones de hibridoma de conejo. Los hibridomas seleccionados se pusieron en cultivo y se produjeron los sobrenadantes (2 I de cada uno), que normalmente produdan 2 mg del respectivo RabMab. El sobrenadante del hibridoma se diluyo con 1/3 de tampon de union (fosfato de sodio 20 mM, a un pH de 7) y se filtro a traves de un filtro de 0,45 pm. La columna (HiTrapTM Protein G HP de 5 ml; GE Healthcare) se lavo con 5-10 volumenes de columna de tampon de union a 5 ml/min. Se aplico el sobrenadante filtrado y la columna se lavo con 5-10 volumenes de columna de tampon de union; se eluyo con 6 x 2 ml de tampon de elucion (glicina-HCI 0,1 M, a un pH de 2,7) en tubos de recoleccion con 80 |jl de Tris-Hci 3 M, a un pH de 9. Despues de la elucion, la columna se lavo con 5-10 volumenes de columna de tampon de union, seguido de 5-10 volumenes de columna de etanol al 20%. Las fracciones que contienen la IgG se agruparon y se dializaron durante una noche a 4 °C contra el tampon de dialisis (fosfato de potasio 166 mM, glicina 83 mM, a un pH de 7,2). Despues de la dialisis, las muestras se concentraron usando tubos de concentracion (Amicon Ultra, MWCO 10.000 Millipore). Finalmente, la muestra se clarifico mediante una centrifugacion (13.000 rpm, 4 °C, 10 min) y se determino la concentracion de la IgG usando una DO a 280 nm. Las almuotas se conservaron en nitrogeno lfquido.
Los clones de hibridoma que producen los anticuerpos deseados se seleccionaron despues de una prueba adicional, y un clon de hibridoma que produce los anticuerpos monoclonales anti-E7 del HPV 16 (no segun la presente invencion) se ha depositado el 16 de diciembre de 2009 en el DSMZ, Braunschweig, Alemania, con el numero de acceso DSM ACC 3034, y se ha depositado un segundo clon de hibridoma que produce los anticuerpos monoclonales anti-E7 del HPV 18 el 16 de diciembre de 2009 en el DSMZ con el numero de acceso DSM ACC 3035.
Ejemplo 2
Prueba de reactividad cruzada de los anticuerpos contra la E7
Sobreexpresion en celulas U-2OS
Se transfectaron de forma temporal celulas U-2OS (negativas para el HPV) con vectores para la sobreexpresion de las protemas E7 seleccionadas. Para la microscopfa de inmunofluorescencia confocal, las celulas se fijaron en PFA/ PBS al 4 % (p/v) y se permeabilizaron con citrato de sodio al 0,1 % (p/v) / Triton X-100 al 0,3 % (v/v). Despues de bloquear con albumina serica bovina / PBS al 1 % (p/v), las celulas se incubaron durante 1 h con el monoclonal anti-E7 del HPV 16 (no segun la presente invencion) o el anti-E7 del HPV 18 de la presente invencion (25 jg/ml) a la temperatura ambiente, y se analizaron mediante una microscopfa confocal.
Los resultados demostraron que el anticuerpo anti-E7 del HPV 16 no presentaba reactividad cruzada con las protemas E7 de otros tipos del HPV, tales como el HPV 18 y el HPV 45, y que el anticuerpo anti-E7 del HPV 18 de la presente invencion era capaz de detectar las protemas E7 del HPV 18 y 45, 11, 56, 58, 59 y 70.
Ensayo de ELISA directo (no segun la presente invencion)
Para caracterizar de forma mas precisa la reactividad cruzada del anticuerpo monoclonal contra la E7 del HPV 16, se uso un ensayo de ELISA directo. Se analizaron diferentes cantidades de protemas recombinantes E7 del HPV recubiertas aleatoriamente de diferentes tipos de HPV con respecto a la reactividad del anticuerpo monoclonal contra la E7 del HPV 16.
El ensayo se llevo a cabo como sigue:
se recubrieron los pocillos de placas de microtitulacion (Maxisorp F, Nunc, Viena) durante una noche (4 °C) con diferentes cantidades (2,5 y 10 ng) de las protemas recombinantes E7 del HPV sin marcar producidas en bacterias en 100 j l de tampon de recubrimiento (NaHcO30,1 M, a un pH de 9,6). Despues de lavar tres veces con PBS, a un pH de 7,4, que contiene Tween 20 al 0,05%, los pocillos se bloquearon con 300 j l de diluyente/bloqueante de casema universal (UCDB, SDT, Baesweiler, Alemania) durante 2 horas a la temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron tres veces. Se anadieron 100 j l de anticuerpo monoclonal primario biotinilado contra la E7 del HPV 16 (la dilucion apropiada en UCDB) a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a la temperatura ambiente. Despues de tres etapas de lavado, se anadieron a cada pocillo 100 j l de un conjugado de estreptavidina-PoliHRP40 (SDT, Baesweiler, Alemania, 0,2 jg/ml en UCDB), seguido de 1 hora de incubacion a la temperatura ambiente. Despues de lavar seis veces, se visualizo la union con exito del anticuerpo mediante la adicion de 100 j l de un sustrato cromogenico (es(HS)TMB, SDT, Baesweiler, Alemania) a cada pocillo y un seguimiento de la incubacion durante 30 min en la oscuridad a la temperatura ambiente. La reaccion se detuvo mediante la adicion de 50 j l de H2SO42 N y se cuantifico mediante la medicion de la absorbancia (450 nm) en un lector de multimarcador (VICTOR TM X5, Perkin Elmer, Viena, Austria).
Segun se muestra en la figura 7, el anticuerpo monoclonal contra la E7 del HPV 16 detecto muy fuertemente la protema E7 del HPV 16, pero no presento reactividad cruzada con todos los demas tipos del HPV, incluyendo los otros diez genotipos de alto riesgo del HPV y los dos virus HPV de bajo riesgo mas comunes, el HPV 6 y el HPV 11. Ensayo de ELISA
Para caracterizar de una forma mas precisa la reactividad cruzada del anticuerpo monoclonal contra la E7 del HPV 18 se uso un ensayo de ELISA (vease el ejemplo 5 para el protocolo de ELISA). Se anadieron 100 pg de las respectivas protemas recombinantes E7 del HPV a los pocillos y se detectaron con el anticuerpo anti-E7 del HPV 18 segun la presente invencion.
Este experimento demostro que el anticuerpo monoclonal anti-E7 del HPV 18 segun la presente invencion es muy espedfico para las protemas E7 del HPV 18 y 45 (vease la figura 11), pero no reconoce las protemas E7 de otros tipos de HPV de alto riesgo.
Inmunotransferencia Western
La especificidad del anticuerpo anti-E7 del HPV 18 de la presente invencion tambien fue analizada mediante una inmunotransferencia Western. La protema recombinante E7 purificada de los tipos del HPV 16 y 18 se separo mediante una SDS-PAGE y se analizo mediante una inmunotransferencia Western usando el anticuerpo anti-E7 del HPV 18. No se obtuvo ninguna senal para la protema recombinante E7 del HPV 16, mientras que se obtuvieron senales positivas para la E7 recombinante del HPV 18 (Figura 12). De forma analoga, se obtuvieron senales espedficas con el anticuerpo anti-E7 del HPV 18, cuando se analizaron los extractos de las celulas U-2OS transfectadas de forma temporal, que expresan las versiones marcadas con FLAG de la E7 del HPV 18. Finalmente, las protemas endogenas E7 de las celulas HeLa positivas para el HPV 18, pero no de las celulas CaSki positivas para el HPV-16, eran detectables mediante una inmunotransferencia Western (Figura 12).
Ejemplo 3
Deteccion inmunohistoqmmica de la protema E7 del HPV en biopsias de cancer cervicouterino
Para determinar el estado del HPV en las biopsias cervicouterinas de 30 pacientes, se uso en primer lugar un analisis de PCR para determinar los diferentes genotipos del HPV. 26 (el 87 %) de las biopsias eran positivas para el ADN del HPV, nueve (el 30 %) unicamente conteman el ADN del HPV 16, y tres (el 10 %) unicamente el ADN del HPV 18. Ocho (el 23 %) eran positivas para el HPV 16 y el 18, y seis (el 23 %) conteman el HPV 16, el 18 y otros tipos de HPV. En las cuatro biopsias restantes, el tipo de HPV aparentemente no era detectable mediante el analisis de PCR. Como controles negativos se usaron 22 biopsias cervicouterinas que contienen epitelio normal, pavimentoso y glandular. Para probar si los anticuerpos monoclonales de raton anti-E7 del HPV 16 (no segun la presente invencion) y anti-E7 del HPV 18 segun la invencion podfan detectar las protemas E7 del HPV en secciones en parafina de estas biopsias, se empleo el siguiente rotocolo para la inmunohistoqmmica.
La inmunohistoqmmica se llevo a cabo con secciones tisulares incluidas en parafina derivadas de las biopsias cervicouterinas. Se montaron secciones de 2 pm en portaobjetos, se desparafinizaron con xileno (2 x 12 minutos), se rehidrataron y se procesaron para la recuperacion del antigeno mediante un tratamiento durante 1 hora en una vaporera en Target Retrieval Solution (DAKO S1700) para la deteccion de la E7 del HPV. La actividad de la peroxidasa endogena se bloqueo mediante una incubacion en H2O2 al 20 % / metanol durante 30 minutos. Las secciones se lavaron y se incubaron durante 15 minutos en tampon de bloqueo (10 % de suero de cabra o de conejo de DAKOCytomation Alemania, respectivamente, BSA al 5% en 1x de tampon Tris). La solucion de bloqueo se retiro. Las secciones se incubaron bien con los anticuerpos monoclonales biotinilados de conejo anti-E7 del HPV 16 (no segun la presente invencion) o bien anti-E7 del 18 de la presente invencion (a las diluciones apropiadas) durante 1 h a la temperatura ambiente en BSA al 5 % / 1x de TBS en una camara humeda. Las muestras se aclararon con 1x de Tris / Tween 20 al 0,1 % y se incubaron con IgG secundarias (DAKOCytomation, Alemania) durante 45 min a la temperatura ambiente en una camara humeda. Despues de lavar, las muestras se incubaron con un conjugado de estreptavidina peroxidasa (Sigma, Viena) durante 30 minutos a la temperatura ambiente. Los anticuerpos unidos se visualizaron con una solucion de DAB (Sigma, Viena) como sustrato. La contratincion se llevo a cabo con Hemalaun (Merck, Viena). Los espedmenes se deshidrataron y se montaron usando Entellan (Merck, Viena). La microscopfa de campo claro con fotograffas se llevo a cabo usando un microscopio Olympus CH30 y una camara Sony dSC-W15 Cyber-shot.
En la totalidad de las 23 biopsias probadas, positivas para el ADN del HPV 16 mediante el analisis de PCR, el anticuerpo anti-E7 del HPV 16 reconocio practicamente todas las celulas tumorales epiteliales de los islotes del tumor, pero no tino las celulas de los tejidos conectivos adyacentes. No se detecto la protema E7 del HPV 16 en los espedmenes cervicouterinos normales, ni en el tejido conectivo ni el epitelio glandular cervicouterino ni en el epitelio pavimentoso cervicouterino normal.
Para determinar si la protema E7 del HPV 18 podfa ser detectada por el anticuerpo anti-E7 del HPV 18 de la presente invencion, se llevaron a cabo experimentos de inmunohistoqmmica usando las biopsias probadas, positivas para el ADN del HPV 18 mediante el analisis de PCR. De una forma similar al anticuerpo anti-E7 del HPV 16, el anticuerpo anti-E7 del HPV 18 tino practicamente todas las celulas tumorales de los respectivos tumores, pero no tino las celulas del tejido conectivo adyacente. No se detecto tincion en los espedmenes cervicouterinos normales. Sorprendentemente, el anticuerpo anti-E7 del HPV 16 (no segun la presente invencion), asf como el anticuerpo anti-E7 del HPV 18 de la presente invencion, pudo detectar la respectiva protema en las cuatro biopsias en las que el ADN del HPV era indetectable mediante el analisis de PCR, lo que sugiere que las celulas de estas biopsias estaban de hecho infectadas por el HPV, lo que no fue detectado mediante el analisis de PCR.
Ejemplo 4 (no segun la presente invencion)
Deteccion de las protemas E7 del HPV 16 de alto riesgo en una citologia basada en liquidos
Tomando como base los resultados obtenidos con las secciones en parafina, se probo si el anticuerpo anti-E7 del HPV 16 puede usarse en una citolog^a basada en Kquidos (LBC). Para establecer el procedimiento, se enriquecieron muestras de LBC de mujeres sanas con celulas CaSki (positivas para el HPV 16) y con celulas U-2OS (negativas para el HPV) y se procesaron segun el siguiente protocolo: se recogieron las celulas CaSki y las celulas U-2OS y se resuspendieron en ThinPrep-Buffer (Cytyc SA, Ginebra, Suiza). Los frotis cervicouterinos se resuspendieron en ThinPrep-Buffer, se mezclaron con las celulas cultivadas y se colocaron entre 10 y 100 pl de la mezcla con una pipeta en un portaobjetos de vidrio ThinPrep (Cytyc SA, Ginebra, Suiza). Las celulas se dejaron secar durante una noche a la temperature ambiente. Las celulas se fijaron usando PFA al 4 % a la TA durante 30 min en una cubeta y se lavaron con una agitacion suave 2 x 5 min a la TA con TBS Tween 20 al 0,05 %. Para la recuperacion del antigeno, las celulas se incubaron con citrato de sodio 10 mM a un pH de 6,0 Triton X100 al 0,3 % durante 15 min a la TA en una cubeta, se lavaron 2 x 5 min a la TA con TBS Tween 20 al 0,05 %. Despues del bloqueo de la peroxidasa, los portaobjetos se incubaron durante 30 min con 200 pl de suero de cabra normal (DakoCytomation) en una camara humeda (dilucion a 1:10 en BSA-TBS al 1 % Tween 20 al 0,05 %). Cada portaobjetos se incubo con 200 pl del anticuerpo primario a la dilucion apropiada en BSA-TBS al 1 % Tween 20 al 0,05 % durante 1 hora a la TA en una camara humeda. Los portaobjetos se lavaron y se incubaron con el anticuerpo secundario biotinilado (DakoCytomation) a la dilucion apropiada en BSA-TBS al 1 % Tween 20 al 0,05 % durante 1 hora a la TA. Los portaobjetos se lavaron y se incubaron con 200 pl de conjugado de peroxidasa (Sigma; dilucion a 1:500 en BSA-TBS al 1 % Tween 20 al 0,05 %) en una camara humeda y posteriormente se aclararon con agua destilada. Para la visualizacion se uso el kit de sustrato de la peroxidasa SK-4200AEC (Vector, Viena, Austria). La hematoxilina sirvio como contratincion.
Este procedimiento produjo una tincion muy espedfica de las celulas CaSki positivas para el HPV 16 con el anticuerpo anti-E7 del HPV 16, mientras que no se tineron ni las celulas cervicouterinas de las probandos sanas ni las celulas U-2OS, lo que sugiere una especificidad muy alta del anticuerpo (vease la figura 6).
Ejemplo 5
Diagnostico del HPV basado en un ELISA
Lisis celular
Las celulas de los cultivos celulares se lavaron con PBS y se resuspendieron en tampon de lisis enfriado en hielo (PBS-Tween al 0,1 %, que contiene 1 comprimido del coctel inhibidor de la proteasa exento de EDTA completo (Roche) por 50 ml de tampon de lisis). Los lisados se congelaron a -80 °C, se descongelaron a la temperatura ambiente y se centrifugaron (4 °C, 13.000 rpm, 20 min). Los sobrenadantes fueron procesados en el procedimiento de ELISA.
En el caso de muestras clmicas, se recogieron los frotis cervicouterinos del cuello del utero usando una brocha. La brocha se puso inmediatamente en el tubo de recoleccion que contiene 1 ml de tampon de lisis sin inhibidores de la proteasa (PBS-Tween 20 al 0,1 %). Despues de acortar el mango de la brocha y de cerrar el tubo de recoleccion, la muestra se almaceno inmediatamente a -80 °C hasta su uso. La muestra se descongelo a la temperatura ambiente y se anadieron inmediatamente 20 pl de una solucion madre 50x de inhibidor de la proteasa (completa, exenta de EDTA, Roche) por tubo de recoleccion. Despues de resuspender el resto de la muestra de la brocha mezclandola en el tampon de lisis, el resto del lfquido de la brocha se limpio en el borde del tubo y la brocha se desecho. La muestra se centrifugo a 4 °C, 13.000 rpm durante 20 min. Los sobrenadantes fueron procesados en el procedimiento de ELISA.
Protocolo de ELISA
Se anadieron 100 pl de tampon de recubrimiento (NaHCO30,1 M, a un pH de 9,6) que contiene una mezcla de anticuerpos policlonales de cabra anti-HPV de alto riesgo a cada pocillo de una placa de 96 pocillos (F96 Maxisorp Nunc-lmmuno Plate) y se incubaron durante una noche a 4 °C. Los pocillos se lavaron 3x con el tampon de lavado (PBS, Tween 20 al 0,05 %; a un pH de 7,4); se anadieron 300 pl de tampon de bloqueo (diluyente/bloqueante de casema universal, SDT) a cada pocillo y se incubaron durante 2 horas a la temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron 3x con tampon de lavado, a continuacion se anadio la protema recombinante E7 o el lisado celular (200 pl; diluido en tampon de lisis: PBS, Tween al 0,1 %, inhibidores de la proteasa) y se incubaron durante 30 minutos a la temperatura ambiente. Los pocillos se aspiraron y se anadieron de nuevo 200 pl de la protema o del lisado celular y se incubaron durante 30 minutos a la temperatura ambiente, Los pocillos se lavaron 3x con tampon de lavado. Se anadieron 100 pl de los anticuerpos monoclonales biotinilados de deteccion (los anticuerpos anti-E7 del HPV 16 no segun la presente invencion o los anti-E7 del HPV 18 de la presente invencion) en su dilucion apropiada en diluyente/bloqueante de casema universal a cada pocillo, se incubaron durante 1 hora a la temperatura ambiente y se lavaron 3x con tampon de lavado. Se anadieron 100 pl de un conjugado de SA-PoliHRP (SDT) en su dilucion apropiada en diluyente/bloqueante de casema universal a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a la temperatura ambiente. A continuacion, los pocillos se lavaron 6x con tampon de lavado. Se anadieron 100 pl de reactivo de deteccion (es(HS)TMB, SDT) a cada pocillo, se incubaron durante 30 min en la oscuridad a la temperatura ambiente. Se anadieron 50 pl de solucion de detencion (H2SO42 N) a cada pocillo y se determino la absorbancia (450 nm) mediante un lector de ELISA.
Resultados
Para determinar la sensibilidad de los anticuerpos monoclonales de deteccion, se probaron cantidades decrecientes de la respectiva protema recombinante E7 con el protocolo de ELISA. En estas condiciones, 10 pg de la E7 del HPV 16 eran facilmente detectables por el anticuerpo monoclonal anti-E7 del HPV 16 (no segun la presente invencion) y se obtuvo una sensibilidad similar para el anticuerpo E7 del HPV 18 con las protemas E7 del HPV 18 y E7 del HPV 45 (vease la figura 1).
Cuando los anticuerpos monoclonales de deteccion de la presente invencion estaban biotinilados y se incubaban con el conjugado de estreptavidina-poli-HRP en lugar de un anticuerpo secundario, pudo conseguirse una amplificacion adicional de la senal. En estas condiciones optimizadas, el ftmite de deteccion espedfico de los anticuerpos monoclonales se redujo hasta 500 fg - 1 pg en el caso de la E7 del HPV 16 (no segun la presente invencion) y hasta 250 fg - 500 fg para la protema E7 del HPV 18 (vease la figura 2).
Con estas condiciones tambien pudo demostrarse que las protemas de los HPV de bajo riesgo como el HPV 6 o el HPV 11 no son detectadas por el anticuerpo anti-E7 del HPV 16 (no segun la presente invencion) o el anti-E7 del HPV 18 de la presente invencion (vease la figura 3).
Para determinar si este formato de ELISA es adecuado para la deteccion de las protemas E7 en celulas tumorales, se mezclaron celulas negativas para el HPV (U-2OS) con cantidades decrecientes de celulas HeLa (positivas para el HPV 18) y de celulas CaSki (positivas para el HPV 16, no segun la presente invencion), respectivamente. Las mezclas de celulas se lisaron y se analizaron mediante un ELISA (vease mas arriba). Estos experimentos revelaron que pueden ser detectadas 2.500 - 5.000 celulas CaSki, asf como 500 - 1.000 celulas HeLa (en el trasfondo de celulas U-2OS negativas para el HPV) por el respectivo anticuerpo (vease la figura 4).
Para determinar si las protemas E7 tambien podfan ser detectadas en muestras clmicas con estas condiciones, se probaron frotis cervicouterinos. Para este fin se tomaron dos citologfas cervicouterinas consecutivas de pacientes o de probandos sanos. Una muestra se uso para la clasificacion citologica segun Papanicolaou y la posterior determinacion del subtipo de HPV mediante un analisis de PCR. La segunda muestra fue procesada para el protocolo de ELISA (vease mas arriba). En total se procesaron cinco muestras (una positiva para el HPV 16, una positiva para el HPV 18 y tres negativas para el HPV), que produjeron unas claras senales por encima del fondo usando los anticuerpos segun la presente invencion para las muestras positivas para el HPV 16 (no segun la presente invencion) y el 18, mientras que las muestras negativas para el HPV no produjeron una senal detectable. Estos datos demuestran que la sensibilidad del presente ensayo que emplea los anticuerpos de la presente invencion es lo suficientemente alta como para permitir la deteccion fiable de las protemas E7 de alto riesgo en muestras clmicas, y permite por lo tanto un diagnostico fiable de las infecciones por el HPV 18 de alto riesgo (vease la figura 5).
Ejemplo 6 (no segun la presente invencion)
Analisis mutacional del epftopo conformacional reconocido por el anticuerpo monoclonal contra la E7 del HPV 16 Para investigar adicionalmente la especificidad del anticuerpo monoclonal contra la E7 del HPV 16 hacia su epftopo en el dominio C terminal, se transfectaron de forma temporal celulas U-2OS con vectores de expresion para las E7 mutantes del HPV 16 que se dirigen al N terminal no estructurado, asf como los elementos determinantes de la estructura principal del dominio C terminal. Un analisis preliminar de inmunotransferencia western demostro que los niveles de la protema en todas las E7 mutantes del HPV 16 eran similares o mayores al nivel de la protema E7 de tipo natural del HPV 16. Para investigar si el anticuerpo monoclonal anti E7 del HPV 16 es capaz de reconocer las E7 mutantes del HPV 16, se llevo a cabo un ensayo de inmunofluorescencia con las celulas U-2OS transfectadas de forma temporal. Las protemas E7 mutantes del HPV 16 analizadas eran: H2P (cambio del residuo de histidina n° 2 por prolina), C24G (cambio del residuo de cistema n° 24 por glicina), deleciones en la lamina p1 (A52YNIVT56), en la lamina p2 (A65LRL67) y en la helice a1 (A75DIR77 y A79LEDLL83), asf como mutaciones puntuales en el sitio de coordinacion del cinc del dominio en dedo de cinc (C58G, C91G y C58G/C91G). Las posiciones de las mutaciones en la protema E7 del HPV 16 tambien estan indicadas en la figura 9.
Segun se muestra en la figura 8A, el anticuerpo monoclonal contra la E7 del HPV 16 reconoda todos los mutantes de delecion, pero no era capaz de reconocer las mutaciones puntuales concernientes a los residuos de cistema del sitio de coordinacion del cinc. Esto indica que el epftopo reconocido esta localizado en la estructura en dedo de cinc, y lo que es mas importante, es necesario un dominio intacto en dedo de cinc, que no puede formarse si uno o mas residuos de cistema estan mutados, para el reconocimiento eficaz de la protema E7 del HPV 16 por parte del anticuerpo monoclonal anti E7 del HPV 16. Por el contrario, segun se muestra en la Figura 8B, los anticuerpos policlonales conocidos contra la E7 del HPV 16 que no reconocen el epftopo conformacional espedfico reconocido por el anticuerpo monoclonal contra la E7 del HPV 16 tambien pueden detectar las mutaciones concernientes a los residuos de cistema del dominio en dedo de cinc.
Para los experimentos de inmunofluorescencia indirecta se uso el siguiente protocolo:
las celulas se fijaron con PFA al 4 % (p/v) / 1x de PBS, se permeabilizaron con citrato de sodio al 0,1 % (p/v) / Triton-X-100 al 0,3% (v/v), se bloquearon con 1x de PBS / bSa al 1 % y se incubaron durante 1 hora a 37 °C con el

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una lmea celular de hibridoma, que tiene el numero de acceso DSM ACC3035.
2. Un anticuerpo monoclonal, obtenible a partir del sobrenadante de la lmea celular de hibridoma segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal anti-E7 del HPV, que es capaz de reconocer espedficamente un epftopo de la region N terminal de la protema E7 del HPV 18, en el que el epftopo comprende la secuencia de aminoacidos establecida en la SEQ ID n° 5 u 8.
3. El anticuerpo monoclonal segun la reivindicacion 2, en el que dicho anticuerpo esta marcado con un grupo radioactivo, enzimatico o fluorescente.
4. Una composicion diagnostica, que comprende el anticuerpo monoclonal segun la reivindicacion 2 o 3 como agente activo.
5. Un kit diagnostico, que comprende el anticuerpo monoclonal segun la reivindicacion 2 o 3 como primer agente, y anticuerpos dirigidos contra las protemas E7 del HPV como segundo agente.
6. Un procedimiento in vitro para la deteccion de la protema E7 del HPV 18, que comprende
i) la incubacion de una muestra biologica con el anticuerpo monoclonal segun la reivindicacion 2 o 3 y ii) la medicion y/o la deteccion de la protema E7 del HPV 18 en la muestra biologica mediante la medicion y/o la deteccion del anticuerpo unido espedficamente a la protema E7.
7. Un procedimiento in vitro para el diagnostico con una base inmunologica, preferentemente inmunohistoqmmica o inmunofluorescente, de infecciones por el HPV 18, que comprende
a) la incubacion de una muestra biologica con el anticuerpo monoclonal segun la reivindicacion 2 o 3 y b) la deteccion de la protema E7 del HPV 18 en la muestra biologica mediante la deteccion del anticuerpo unido espedficamente a la protema E7 y permitiendo asf el diagnostico de una infeccion por el HPV 18.
8. Un procedimiento in vitro para el diagnostico basado en un ELISA de infecciones por el HPV 18, que comprende aa) el recubrimiento de un soporte con anticuerpos de captura dirigidos contra las protemas E7 del HPV, bb) la adicion de una muestra biologica al soporte recubierto,
cc) la incubacion del soporte con el anticuerpo de deteccion monoclonal segun la reivindicacion 2 o 3, dd) la identificacion de la protema E7 del HPV 18 unida espedficamente por los anticuerpos de captura mediante la deteccion del anticuerpo monoclonal de deteccion unido espedficamente a la protema E7, y permitiendo asf el diagnostico de una infeccion por el HPV 18.
9. Uso del anticuerpo monoclonal segun la reivindicacion 2 o 3 para la preparacion de una composicion diagnostica para la deteccion in vitro de la protema E7 del HPV 18 en una muestra biologica.
10. Uso del anticuerpo monoclonal segun la reivindicacion 9, en el que el anticuerpo esta unido, fijado y/o conectado a un soporte solido.
11. Un procedimiento para la preparacion de una composicion diagnostica, que comprende la etapa de formular el anticuerpo monoclonal segun la reivindicacion 2 o 3 con un portador, un diluyente, un tampon o una solucion de conservacion aceptable.
12. Uso de una composicion diagnostica que comprende el anticuerpo monoclonal segun la reivindicacion 2 o 3 para la deteccion inmunologica, preferentemente basada en un ELISA, de la protema E7 del HPV 18 en una muestra biologica, en el que el anticuerpo esta unido, fijado y/o conectado a un soporte solido.
ES11704189T 2010-02-16 2011-02-16 Anticuerpos anti-E7 del HPV Active ES2712892T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10001569A EP2357197A1 (en) 2010-02-16 2010-02-16 Anti-HPV E7 antibodies
EP10011978 2010-09-30
PCT/EP2011/000728 WO2011101122A1 (en) 2010-02-16 2011-02-16 Anti-hpv e7 antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2712892T3 true ES2712892T3 (es) 2019-05-16

Family

ID=43919806

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES15182048T Active ES2778654T3 (es) 2010-02-16 2011-02-16 Anticuerpos anti-E7 del VPH
ES11704189T Active ES2712892T3 (es) 2010-02-16 2011-02-16 Anticuerpos anti-E7 del HPV

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES15182048T Active ES2778654T3 (es) 2010-02-16 2011-02-16 Anticuerpos anti-E7 del VPH

Country Status (6)

Country Link
US (2) US9249212B2 (es)
EP (2) EP2993183B1 (es)
CA (2) CA2788006C (es)
DK (2) DK2536758T3 (es)
ES (2) ES2778654T3 (es)
WO (1) WO2011101122A1 (es)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2567972A1 (en) 2011-09-12 2013-03-13 Adriacell S.p.A. Antibodies against E7 protein of Human Papilloma Virus (HPV)
WO2013038016A2 (en) * 2011-09-16 2013-03-21 Fujirebio Diagnostics Ab Monoclonal antibodies for detection of high-risk human papillomavirus oncoprotein e7
CN103483447B (zh) * 2012-06-08 2015-11-25 厦门大学 抗hpv l1蛋白的广谱单克隆抗体或其抗原结合片段及它们的用途
US10351897B2 (en) 2014-02-14 2019-07-16 Bioventures, Llc Acetaminophen adducts and methods of use thereof
CN105316361B (zh) * 2014-08-01 2017-11-28 广东拓谱康生物科技有限公司 携带人乳头瘤病毒16型突变型E7m58抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用
CN105504049B (zh) * 2014-09-26 2019-07-05 艾托金生物医药（苏州）有限公司 宫颈癌相关的hpv e7蛋白单克隆抗体及其应用
EP3015863A1 (en) * 2014-10-31 2016-05-04 Mikrogen GmbH Immunological test for the detection of E7 oncoproteins in biological samples
WO2016090163A2 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Anti-acetaminophen antibodies and acetaminophen protein adducts
CN105131113B (zh) * 2015-08-26 2019-09-06 艾托金生物医药（苏州）有限公司 用于宫颈癌检测和分级的单隆抗体及其应用
CN106610378A (zh) * 2016-02-26 2017-05-03 弗雷米德生物医药技术（天津）有限公司 一种hpv16型e7蛋白的检测试剂盒
US10191046B2 (en) * 2016-05-23 2019-01-29 Se-Hwan Paek Immunobiosensor and sensor system including the same
CN107556379B (zh) * 2016-07-01 2021-05-28 艾托金生物医药（苏州）有限公司 识别高危hpv e7蛋白的单克隆抗体及其应用
US11072660B2 (en) 2016-10-03 2021-07-27 Juno Therapeutics, Inc. HPV-specific binding molecules
US20190112673A1 (en) 2017-05-10 2019-04-18 Genomic Vision Association between integration of high-risk hpv genomes detected by molecular combing and the severity and/or clinical outcome of cervical lesions
SG11202002728VA (en) 2017-10-03 2020-04-29 Juno Therapeutics Inc Hpv-specific binding molecules
PE20201345A1 (es) 2018-04-05 2020-11-25 Juno Therapeutics Inc Receptores de celulas t, y celulas disenadas que expresan los mismos
CN113316648A (zh) 2018-11-30 2021-08-27 基因组影像公司 病毒性hpv或hiv基因组的整合与hpv相关宫颈病变或艾滋病病理学疾病的严重程度和/或临床结果之间的关联
CN114276439B (zh) * 2021-11-03 2023-10-24 源道隆（苏州）医学科技有限公司 可结合人乳头瘤病毒的抗体50a11及其应用
CN114935649B (zh) * 2022-06-15 2023-07-25 广东赛尔生物科技有限公司 一种hpv病毒检测试剂盒

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2794371B1 (fr) 1999-10-07 2004-06-18 Biovector Therapeutics Fragments proteiquespolyepitopiques, leur obtention et leurs utilisations notamment en vaccination
US7026443B1 (en) * 1999-12-10 2006-04-11 Epimmune Inc. Inducing cellular immune responses to human Papillomavirus using peptide and nucleic acid compositions
US20070166699A1 (en) 2003-09-17 2007-07-19 Amynon Biotech Gmbh Combination of anti-hpv-16 and 18 antibodies and uses thereof
US20070037180A1 (en) 2005-02-10 2007-02-15 Olle Nilsson Site-specific immunization in order to establish antibodies with specificity for the E7 oncoprotein of high-risk HPV's
US7732166B2 (en) 2005-11-15 2010-06-08 Oncohealth Corporation Detection method for human pappilomavirus (HPV) and its application in cervical cancer

Also Published As

Publication number Publication date
DK2536758T3 (en) 2019-03-04
EP2993183A1 (en) 2016-03-09
EP2993183B1 (en) 2020-02-26
US20130029322A1 (en) 2013-01-31
DK2993183T3 (da) 2020-03-30
WO2011101122A1 (en) 2011-08-25
US9902763B2 (en) 2018-02-27
CA2788006A1 (en) 2011-08-25
EP2536758A1 (en) 2012-12-26
CA3012796A1 (en) 2011-08-25
ES2778654T3 (es) 2020-08-11
CA2788006C (en) 2021-08-31
US9249212B2 (en) 2016-02-02
US20160237143A1 (en) 2016-08-18
CA3012796C (en) 2021-08-31
EP2536758B1 (en) 2019-01-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2712892T3 (es) Anticuerpos anti-E7 del HPV
US7314630B2 (en) Compounds and methods of early diagnosis of cervical cancer and genital condyloma with HPV, CHSP60 tumor suppressor H-Ras, K-Ras and PTEN derived peptides modified
ES2462040T3 (es) Método de extracción de proteínas a partir de células
ES2456341T3 (es) Método de extracción eficaz de proteínas a partir de células
ES2720483T3 (es) Sistemas y procedimientos de anticuerpos anti p40
US20150153345A1 (en) Antibodies specific to e6 proteins of hpv and use thereof
CA2827618C (en) Compositions and methods of use for the determination of he4a
WO2016045563A1 (zh) 宫颈癌相关的hpv e7蛋白单克隆抗体及其应用
WO2005063286A1 (en) Antibodies for oncogenic strains of hpv and methods of their use
US20070166699A1 (en) Combination of anti-hpv-16 and 18 antibodies and uses thereof
US9884894B2 (en) Fine epitope peptide capable of inducing cross-reactive antibodies among homologous proteins in human papilloma virus E6 protein
US20150023979A1 (en) Antibodies Against E7 Protein of Human Papilloma Virus (HPV)
CN105524166A (zh) 识别hpv18阳性宫颈上皮癌细胞的单克隆抗体及其应用
WO2011069614A1 (en) Antibody that binds to h-1 parvovirus
EP2357197A1 (en) Anti-HPV E7 antibodies
PT842430E (pt) Diagnostico do virus do herpes simples
CN107868127A (zh) 一种用于检测病理组织切片中癌蛋白表达的单克隆抗体
ES2213185T3 (es) Particulas de tipo virus hpv11 sinteticas.
KR20120114451A (ko) 일본뇌염바이러스에 대한 단일클론항체, 이 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이를 이용한 항원 검출 방법
ES2694296T3 (es) Anticuerpos monoclonales anti-pVHL y usos de los mismos
Li et al. Antibodies against epstein-barr virus glycoprotein gp42 for the diagnosis of nasopharyngeal carcinoma
US8715681B2 (en) Minimal motifs of linear B-cell epitopes in L1 protein from human papillomavirus type 58 and their applications
CN109891246B (zh) 包括汉城病毒与普马拉病毒来源的重组核衣壳蛋白及汉坦病毒来源的重组糖蛋白的肾综合症出血热诊断用组合物及包括其的诊断试剂盒
WO2012072515A2 (en) Lmp1 a diagnostic and prognostic marker for epstein-barr virus (ebv)-associated lymphoma