ES2712181T3 - Ingeniería genética de Pseudomonas putida KT2440 para una producción rápida y de alto rendimiento de vainillina a partir de ácido ferúlico - Google Patents

Abstract

Un procedimiento biocatalítico para producir vainillina a partir de ácido ferúlico, en el que se cultiva, en presencia de ácido ferúlico, una cepa bacteriana modificada por ingeniería genética del género Pseudomonas que tiene la capacidad de convertir el ácido ferúlico en vainillina; en el que dicha cepa bacteriana modificada por ingeniería genética tiene una capacidad reducida para crecer en vainillina como única fuente de carbono; y en el que dicha cepa modificada por ingeniería genética contiene al menos la siguiente modificación genética: i) regulación por disminución de la captación celular de molibdato; y ii) regulación por disminución de la actividad enzimática codificada por el gen de la vainillina deshidrogenasa (vdh).

Description

DESCRIPCION

Ingeniena genetica de Pseudomonas putida KT2440 para una produccion rapida y de alto rendimiento de vainillina a partir de acido ferulico

La presente invencion se refiere a un procedimiento biocatalttico mejorado para producir vainillina a partir de acido ferulico basado en cepas de Pseudomonas modificadas por ingeniena genetica, asf como a dichas cepas de Pseudomonas.

Antecedentes tecnicos

La vainillina (4-hidroxi-3-metoxibenzaldehndo), el compuesto organoleptico de sabor a vainilla, es uno de los agentes aromatizantes cuantitativos mas utilizados en todo el mundo. Su demanda ha superado durante mucho tiempo la oferta de la fuente botanica Vanilla planifolia. Actualmente, la mayor parte de la vainillina se sintetiza qmmicamente a partir de guiacol, que procede de materias primas fosiles, y lignina, un componente en materiales de desecho de la industria de la pulpa de madera (Ramachandra Rao y Ravishankar, 2000). Sin embargo, la demanda de esta vainillina "identica a la de la naturaleza", que se utiliza principalmente en la industria de alimentos y bebidas, se desplaza hacia la vainillina "natural" debido a una creciente conciencia de salud y nutricion de los clientes. Por tanto, la produccion biotecnologica de vainillina "natural" se vuelve cada vez mas importante (revisado por Krings y Berger, 1998; Priefert y col., 2001).

Se han realizado esfuerzos para producir vainillina mediante celulas de Vanilla planifolia cultivadas in vitro (Davidonis y Knorr, 1991). Tambien se implemento una smtesis de novo utilizando cepas de levadura modificadas por ingeniena genetica (Hansen y col., 2009). El foco principal, sin embargo, se coloco en la biotransformacion utilizando enzimas aisladas o diferentes microorganismos procarioticos como biocatalizadores de celulas completas (Havkin-Frenkel y Belanger, 2008; Berger, 2009).

Ademas de lignina y estilbenos fenolicos, como el eugenol, la biotransformacion del acido ferulico en vainillina es el procedimiento mas intensamente estudiado para producir vainillina "natural" (revisado por Rosazza y col., 1995; Priefert y col., 2001). El precursor del acido ferulico (acido 3- (4-hidroxi-3-metoxi-fenil) prop-2-enoico), un acido hidroxicinamico, es una sustancia muy abundante ya que es un componente de muchas paredes celulares de plantas (Ishikawa y col., 1963; Escott-Watson y Marais, 1992; Ishii, 1997; Oosterveld y col., 2000). Se han evaluado muchos microorganismos diferentes para la produccion de vainillina a partir de acido ferulico que comprende cepas recombinantes de E. coli, Pseudomonas ssp., Rhodococcus ssp., Bacillus subtilis, Aspergillus niger, Pycnoporous cinnabarinus, Amycolatopsis ssp. y Streptomyces ssp. (Lesage-Meessen y col., 1996; Okeke y Venturi, 1999; Muheim y Lerch, 1999; Achterholt y col., 2000; Overhage y col., 2003; Peng y col., 2003; Plaggenborg y col., 2006; Yoon y col., 2007; Barghini y col., 2007; Hua y col., 2007; Di Gioia y col., 2010; Tilay y col., 2010; Fleige y col., 2013). Sin embargo, en la mayona de los casos, los rendimientos de vainillina fueron bajos y las reacciones de biotransformacion lentas. Los bajos rendimientos pueden atribuirse principalmente a la alta toxicidad de la vainillina (Krings y Berger, 1998). La produccion mejorada de vainillina con resinas adsorbentes mejoro los niveles de vainillina hasta 19,2 g I-1, pero el rendimiento molar de aproximadamente un 43 % fue bastante bajo (Hua y col., 2007). Otros inconvenientes fueron la ineficiente expresion genica heterologa y la inestabilidad del plasmido. Tambien se centro la atencion en la prevencion de una mayor degradacion de la vainillina en alcohol de vainillflico o acido vainillflico (Stentelaire y col., 1997; Bonnin y col., 1999; Oddou y col., 1999; Civolani y col., 2000; Overhage y col., 2000).

Las bacterias del genero Pseudomonas muestran una amplia versatilidad metabolica, ya que pueden usar una amplia gama de moleculas aromaticas como fuentes unicas de carbono (Clarke, 1982). El catabolismo del acido ferulico en la cepa HR199 de Pseudomonas sp., P. fluorescens BF13 y P. putida KT2440 se producen a traves de una via no-p-oxidativa dependiente de coenzima A como se representa en la Figura 1 (Narbad y Gasson, 1998; Gasson y col., 1998; Overhage y col., el documento 1999b; Plaggenborg y col., 2003; Calisti y col., 2008). En primer lugar, el acido ferulico se activa en feruloil-CoA catalizada por la feruloil-CoA sintetasa (EC 6.2.1.34; codificada por fcs). En segundo lugar, el tioester CoA se hidrata y se escinde en vainillina y acetil-CoA catalizada por enoil-CoA hidratasa/aldolasa (EC 4.2.1.101; codificada por ech). La vainillina deshidrogenasa (EC 1.2.1.67; codificada por vdh), oxida la vainillina a acido vaimlico, que se cataboliza adicionalmente a acido protocatechuico mediante vainillato-O-desmetilasa (EC 1.14.13.82; codificado por vanAB). Overhage y col., (1999b) tambien propusieron una segunda ruta sobre 4-hidroxi-3-metoxifenil-p-cetopropionil-CoA y vainillil-CoA catalizada por enzimas codificadas por PP_3355 (aat) y probablemente PP_3354.

Un estudio reciente ha utilizado una cepa modificada metabolica de P. fluorescens para la produccion de vainillina a partir de acido ferulico (Di Gioia y col., 2010). Mediante la delecion del gen vdh para la vainillina deshidrogenasa y la sobreexpresion de los genes estructurales fcs y ech en un vector de copias bajas, los autores pudieron producir hasta 8,41 mM de vainillina a partir de acido ferulico 10 mM, que fue el tttulo final mas alto de vainillina producida con una cepa de Pseudomonas hasta ahora.

DIANA DI GIOIA y col., (JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM, NL, vol. 156, no. 4) desvelan la ingeniena genetica de Pseudomonas fluorescens para la produccion de vainillina a partir de acido ferulico, en el que el gen que codifica la vainillina deshidrogenasa (VDH) esta inactivado y se anade un plasmido que codifica la feruloil-CoA sintetasa (fcs) y la hidratasa/aldolasa (ech).

OVERHAGE J y col., (APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, SPRINGER VERLAG, BERLfN, DE, vol. 52, n.° 6) desvelan un procedimiento biocatalttico para producir vainillina a partir de eugenol a traves del acido ferulico, en el que el gen de la vainillina deshidrogenasa (vdh) esta alterado. La vainillina no se acumula, dado que una segunda vainillina deshidrogenasa, en concreto, la coniferil-aldehndo deshidrogenasa (codificada por el gen calB) oxida la vainillina. Se ha propuesto la inactivacion de dicho gen calB.

El documento JP H05227980 A (TAKASAGO PERFUMERY CO LTD) desvela la mutacion de bacterias del genero Pseudomonas para obtener un mutante que no crece en absoluto o solo crece lentamente en un medio con vainilla como fuente de carbono. El mutante se utiliza para la preparacion de vainillina. Los enfoques de la tecnica anterior para la produccion microbiana de vainillina todavfa sufren uno o mas de los siguientes inconvenientes: baja tasa de conversion de acido ferulico, bajo rendimiento molar de vainillina, formacion significativa de subproductos.

El problema subyacente de la presente invencion era, por lo tanto, la provision de un procedimiento que evite al menos uno de los inconvenientes mencionados anteriormente.

Sumario de la invencion

Sorprendentemente, el problema mencionado anteriormente se resolvio proporcionando cepas modificada por ingeniena geneticas de bacterias del genero Pseudomonas que tienen la capacidad de catalizar el catabolismo del acido ferulico a traves de una via no p-oxidativa dependiente de coenzima A en vainillina. Via no oxidativa p a la vainillina.

En una realizacion particular, se utilizo la cepa no patogenica y completamente secuenciada KT2440 de Pseudomonas putida (ATCC 47054) (Nelson y col., 2002), que es un derivado libre de plasmido de la cepa de bioseguridad de P. putida mt-2 (Kojima y col., 1967; Williams y Murray, 1974; Nakazawa, 2002). Mediante modificacion genetica se pudo establecer una forma altamente eficiente para la biotransformacion de acido ferulico a vainillina usando celulas mutantes de P. putida en reposo sin plasmido. En particular, la manipulacion genetica de P. putida KT2440 mediante el sistema de contraseleccion de upp (Graf y Altenbuchner, 2011) condujo a celulas que podfan convertir rapidamente el acido ferulico en vainillina acompanado de rendimientos molares de hasta el 86 %, altas productividades y poca formacion de subproductos.

Dicha cepa no patogenica de Pseudomonas putida KT2440 se optimizo geneticamente para que convirtiera el acido ferulico en vainillina de una manera particular. La delecion del gen de la vainillina deshidrogenasa (vdh) no fue suficiente para prevenir la degradacion de la vainillina. La inactivacion adicional de un transportador de molibdato, identificado por mutagenesis de transposon, llevo a una cepa incapaz de crecer en vainillina como unica fuente de carbono. La byconversion se optimizo aun mas mediante la expresion cromosomica aumentada de los genes estructurales para la feruloil-CoA sintetasa (fcs) y la enoil-CoA hidratasa/aldolasa (ech) mediante la introduccion del sistema fuerte del promotor tac. Ingeniena genetica adicional condujo a altas tasas de conversion inicial y rendimientos molares de vainillina de hasta un 86 % en solo 3 horas, acompanados de niveles muy bajos de subproductos. Esto representa la productividad mas alta y el rendimiento de vainillina molar mas alto obtenidos hasta la fecha con una cepa de Pseudomonas. Junto con su alta tolerancia al acido ferulico, las nuevas cepas de Pseudomonas libres de plasmidos recien desarrolladas representan candidatos prometedores para la produccion biotecnologica de vainillina.

Descripcion de las figuras

Figura 1: Ruta propuesta para el catabolismo del acido ferulico sobre la vainillina en cepas de Pseudomonas. La ruta alternativa de 4-hidroxi-3-metoxifenil-p-hidroxipropionil-CoA a acido vainillflico se muestra a la derecha (propuesta por Overhage y col., 1999b). La reduccion de la vainillina en alcohol vainillflico se representa con una flecha discontinua. Los signos de interrogacion simbolizan reacciones catalizadas por enzimas desconocidas. Figura 2: Organizacion de los genes estructurales de la enoil-CoA hidratasa/aldolasa (ech), feruloil-CoA sintetasa (fcs) y vainillina deshidrogenasa (vdh), p-cetotiolasa (aat) y acil-CoA deshidrogenasa (PP_3354) en las cepas mutantes de P. putida utilizadas en la presente invencion. Se representa el sitio de integracion de la region del promotor tac que incluye el operador lac (Ptac) y el gen para el represor lac (laclq).

Figura 3: Crecimiento de las cepas mutantes de P. putida GN23, GN235, GN275 y GN276 en medio mmimo M9 con diferentes fuentes de carbono. Las cepas se inocularon con 0,05 DO600 como se indica con una flecha. El crecimiento se documento midiendo la DO600. Se presenta la DO600 despues de 24 horas a 30 °C para mostrar la capacidad de las cepas para crecer en glucosa, acido ferulico, acido vainillflico y vainillina, respectivamente, como unica fuente de carbono.

Figura 4: Ensayos de byconversion de acido ferulico en vainillina. Se indujeron los genes metabolicos ech y fcs durante 6 horas con IPTG 5 mM antes de que se iniciara la byconversion de acido ferulico en vainillina con 5 x 109 celulas en reposo ml'1 de las cepas de P. putida (a) GN23, (b) GN235, (c) GN276, (d) GN299, (e) GN347, (f) GN440, (g) GN441 y (h) GN442. Las concentraciones de acido ferulico (cmculos negros), vainillina (drculos blancos), alcohol vainilKlico (triangulo negro) y acido vainilKlico (triangulo blanco) se midieron mediante HPLC y se representaron graficamente sobre el tiempo de conversion. La figura muestra los valores medios de al menos tres ensayos repetidos independientemente. La desviacion estandar fue inferior al 10 %.

Figura 5: Influencia de la cantidad de inductor IPTG en la bioconversion de acido ferulico a vainillina. Se indujeron celulas de P. putida GN299 durante 6 horas con (a) IPGT 1 mM y (b) IPTG 5 mM antes de comenzar la bioconversion de acido ferulico en vainillina con 5 x 109 celulas en reposo ml-1. Las concentraciones de acido ferulico (cmculos negros), vainillina (cmculos blancos), alcohol vainillflico (triangulo negro) y acido vainillflico (triangulo blanco) se midieron mediante HPLC y se representaron graficamente sobre el tiempo de conversion. La figura muestra los valores medios de al menos tres ensayos repetidos independientemente. La desviacion estandar fue inferior al 10 %.

Figura 6: Influencia de (a) el tiempo de induccion y (b) la cantidad de celulas en reposo de P. putida GN299 en la bioconversion de acido ferulico a vainillina. (a) Se indujeron las celulas durante 2, 4 y 6 h con IPTG 5 mM antes de que se iniciara la bioconversion de acido ferulico en vainillina con 5 x 109 celulas en reposo ml-1. (b) Las celulas se indujeron durante 6 horas con IPTG 5 mM antes de que se iniciara la bioconversion de acido ferulico en vainillina con cantidades variables de celulas en reposo (5, 10 y 20 x 109 celulas ml-1). Las concentraciones de acido ferulico (barras negras), vainillina (barras blancas), alcohol vainillflico (barras de color gris oscuro) y el acido vainillflico (barras de color gris claro) se midieron por HPLC y se mostraron al principio (0 h) y al final (18 h) del ensayo de bioconversion. La figura muestra los valores medios de al menos tres ensayos repetidos independientemente. La desviacion estandar esta representada por barras de error.

Fig. 7: Influencia de la concentracion de (a) acido ferulico y (b) vainillina en la bioconversion. Se indujeron los genes metabolicos ech y fcs durante 6 horas con IPTG 5 mM antes de que se iniciara la byconversion de acido ferulico en vainillina con 5 x 109 celulas en reposo ml-1 de la cepas de P. putida GN299. (a) Se utilizaron concentraciones crecientes de acido ferulico (10, 20, 30 y 40 mM) para la conversion a vainillina. (b) Se anadieron concentraciones crecientes de vainillina (0, 10, 15, 20 y 30 mM) al comienzo del ensayo de byconversion con acido ferulico 10 mM. Las concentraciones de acido ferulico (barras negras), vainillina (barras blancas), alcohol vainillflico (barras de color gris oscuro) y el acido vainillflico (barras de color gris claro) se midieron por HPLC y se mostraron al principio (0 h) y al final (18 h) del ensayo de byconversion. La figura muestra los valores medios de al menos tres ensayos independientes. La desviacion estandar esta representada por barras de error.

Figura 8: Tolerancia de la cepa mutante de P. putida cepa GN299 hacia diferentes concentraciones de (a) acido ferulico y (b) vainillina en medio mmimo M9. Despues de la inoculacion con 0,1 DO600 en medio mmimo M9 con 0,4 % de glucosa y concentraciones crecientes de (a) acido ferulico y (b) vainillina, el crecimiento se documento midiendo la DO600. Se presenta la DO600 despues de 24 horas a 30 °C para mostrar la tolerancia de GN299 a diferentes concentraciones de acido ferulico y vainillina, respectivamente. La figura muestra los valores medios de al menos tres ensayos independientes. La desviacion estandar esta representada por barras de error.

Descripcion detallada de la invencion

A. Definiciones generales

"Regulacion alterada" debe entenderse en su sentido mas amplio (regulacion por aumento o regulacion por disminucion, amplificacion o atenuacion, aumento o disminucion de la actividad/funcion), y comprende un aumento o disminucion o un apagado completo o el encendido de un objetivo, como, por ejemplo, una actividad enzimatica (enzima diana) u otra actividad de protemas metabolicamente activas (protema diana), por diferentes medios bien conocidos por los expertos en la tecnica.

Pueden producirse manipulaciones adecuadas en las secuencias de aminoacidos que alteran el nivel de protema/enzima o restos de aminoacidos; o puede ocurrir a nivel de acidos nucleicos, alterando, por ejemplo, la informacion genetica o el elemento genetico regulador. Los procedimientos adecuados comprenden, por ejemplo, un aumento o disminucion del numero de copias del gen y/o las moleculas de las enzimas/protemas en un organismo modificado por ingeniena genetica, o la modificacion de otra caractenstica de la enzima que afecta a su actividad enzimatica o de la protema, que afecta a su actividad biologica, como por ejemplo metabolica, que luego da como resultado el efecto deseado en la via metabolica en cuestion.

La manipulacion genetica adecuada tambien puede incluir, pero sin limitacion, alterar o modificar secuencias reguladoras o sitios asociados con la expresion de un gen particular (por ejemplo, eliminando o introduciendo promotores fuertes, promotores inducibles o promotores multiples), modificando la localizacion cromosomica de un gen en particular, alterando secuencias de acido nucleico adyacentes a un gen en particular, tal como un sitio de union a ribosoma o terminador de la transcripcion, disminuyendo o aumentando el numero de copias de un gen en particular, modificando protemas (por ejemplo, protemas reguladoras, supresores, potenciadores, activadores de la transcripcion y similares) involucrados en la transcripcion de un gen en particular y/o la traduccion de un producto genico en particular, o cualquier otro medio convencional de alteracion de la regulacion de la expresion de una rutina genica en particular en la tecnica (incluido, entre otros, el uso de moleculas de acido nucleico antisentido u otros procedimientos para eliminar o bloquear la expresion de la protema diana).

Mas particularmente "alterar la regulacion", "con la regulacion alterada y "regulacion alterada" se hace referencia a alteraciones o modificaciones de al menos un gen en un microorganismo, en el que la alteracion o modificacion da como resultado un aumento de la eficiencia de la produccion de vainillina en el microorganismo en relacion con la produccion de vainillina en ausencia de la alteracion o modificacion. En algunas realizaciones, un gen que esta alterado o modificado codifica una enzima en una via biosintetica o una protema de transporte, de modo que el nivel o la actividad de la enzima biosintetica en el microorganismo se altere o modifique o la especificidad o eficiencia del transporte se altere o modifique. En algunas realizaciones, al menos un gen que codifica una enzima en una ruta biosintetica se altera o modifica de tal manera que el nivel o la actividad de la enzima se potencia o aumenta con relacion al nivel en presencia del gen de tipo natural o no alterado. La alteracion de la regulacion tambien incluye alterar la region de codificacion de uno o mas genes para producir, por ejemplo, una enzima que es resistente a la retroalimentacion o que tiene una actividad espedfica mayor o menor. Asimismo, la alteracion de la regulacion abarca ademas la alteracion genetica de los genes que codifican los factores de la transcripcion (por ejemplo, activadores, represores), que regulan la expresion de genes que codifican enzimas o protemas de transporte. Mas espedficamente, la alteracion de la regulacion puede dar como resultado una actividad enzimatica "disminuida", en la que la actividad enzimatica resultante es inferior al 100 % de la actividad enzimatica observada en el estado de no alteracion de la regulacion o esta "apagada", es decir, de forma reversible o irreversible, ya no esta presente o al menos ya no es detectable con una herramienta analttica convencional, como un ensayo de actividad enzimatica. Una forma en particular de una regulacion por aumento es la amplificacion de un gen objetivo, en particular realizando una mutacion "por aumento" que aumenta la actividad del gen, por ejemplo, mediante amplificacion genica utilizando senales de expresion fuertes y/o mutaciones puntuales que mejoran o aumentan la actividad enzimatica o la actividad metabolica de una protema.

Una forma preferida de una regulacion por disminucion es la atenuacion de un gen objetivo, en particular realizando una mutacion "por disminucion" que disminuye la actividad del gen, por ejemplo, por delecion o alteracion de genes, utilizando senales de expresion debiles y/o mutaciones puntuales que destruyen o disminuyen la actividad enzimatica o la actividad metabolica de una protema.

En particular, un gen puede manipularse de manera que uno o mas nucleotidos se delecionen del cromosoma del organismo huesped. La actividad disminuida de un producto genico tambien puede obtenerse introduciendo una o mas mutaciones geneticas que conducen a una actividad disminuida del producto genico. La actividad disminuida puede ser una reduccion de la actividad enzimatica u otra actividad metabolica en > 50 % de la actividad enzimatica no mutada o no alterada, o reduccion de la actividad en > 90 % o, mas preferentemente, una reduccion de la actividad e n> 95% o, mas preferentemente, una reduccion de la actividad en > 98 %, o incluso mas preferentemente una reduccion de la actividad en > 99 %, o incluso mas preferentemente una reduccion de la actividad en > 99,9 %. El aumento de la actividad de un producto genico tambien se puede obtener introduciendo una o mas mutaciones genicas que conduzcan a un aumento de la actividad del producto genico. El aumento de la actividad puede ser un aumento de la actividad enzimatica u otra metabolica por, por ejemplo, un factor de 1 a 1.000 de la actividad enzimatica no mutada o no alterada, o aumento de la actividad por un factor de 2 a 100 o, mas preferentemente, un aumento de la actividad por un factor de 5 a 50 o de 10 a 20.

El termino "heterologo" o "exogeno" se refiere a protemas, acidos nucleicos y las secuencias correspondientes como se describe en el presente documento, que se introducen o se producen (transcriben o traducen) por un microorganismo manipulado geneticamente (modificado por ingeniena genetica), tal como se define en el presente documento y el microorganismo anterior a dicha manipulacion no contema o no produda dicha secuencia. En particular, dicho microorganismo antes de dicha manipulacion puede no contener o expresar dicha actividad enzimatica heterologa, o puede contener o expresar una enzima endogena de actividad o especificidad comparables, que esta codificado por una secuencia codificante diferente o por una enzima de diferente secuencia de aminoacidos, y dicha enzima endogena puede convertir el mismo sustrato o sustratos que dicha enzima exogena. Un "microorganismo" se refiere a eucariotas y, en particular, a procariotas y, mas particularmente, a bacterias.

Un microorganismo "derivado de un microorganismo parental" se refiere a un microorganismo modificado por cualquier tipo de manipulacion, o combinacion de tales manipulaciones, seleccionadas entre tecnicas qrnmicas, bioqmmicas o microbianas, en particular de ingeniena genetica. En este ultimo caso, se les conoce como microorganismos "modificados por ingeniena genetica". Dicha manipulacion da como resultado al menos un cambio de una caractenstica biologica de dicho microorganismo parental. Como ejemplo, la secuencia de codificacion de una enzima heterologa puede introducirse en dicho organismo o puede eliminarse una secuencia de codificacion del microorganismo parental. Mediante dicho cambio se puede anadir, reemplazar o delecionar al menos una caractenstica de dicho microorganismo parental. Dicho cambio puede, por ejemplo, dar lugar a una caractenstica metabolica alterada de dicho microorganismo, de modo que, por ejemplo, un sustrato de una enzima expresada por dicho microorganismo (cuyo sustrato dicho microorganismo parental no utilizo o lo utilizo con diferente eficacia) se metaboliza de una manera caractenstica (por ejemplo, en diferente cantidad, proporcional o con diferente eficacia si se compara con el microorganismo parental), y/o dicho microorganismo modificado forma un producto metabolico final o intermedio de una manera caractenstica (por ejemplo, en diferente cantidad, proporcion o con diferente eficacia si se compara con el microorganismo parental).

Un microorganismo puede ser "alterado" o "modificado" ffsica o ambientalmente para expresar un producto genico a un nivel mayor o menor en relacion con el nivel de expresion del producto genico por el microorganismo de partida. Por ejemplo, un microorganismo puede tratarse o cultivarse en presencia de un agente (qmmico o genetico) que se sabe o se sospecha que aumenta o disminuye la transcripcion y/o la traduccion de un gen particular y/o la traduccion de un producto genico particular tal que la transcripcion y/o la traduccion se incrementa o disminuye. Como alternativa, un microorganismo puede cultivarse a una temperatura seleccionada para aumentar o disminuir la transcripcion y/o la traduccion de un gen particular y/o la traduccion de un producto genico en particular de manera que la transcripcion y/o la traduccion aumenten o disminuyan.

"Modificado por ingeniena genetica" se refiere a un microorganismo alterado en el sentido anterior mediante tecnicas de ingeniena genetica disponibles en la materia, como por ejemplo transformacion, mutacion, recombinacion homologa.

La expresion "capaz de utilizar" se refiere a la capacidad de un microorganismo de la invencion para convertir un sustrato, como por ejemplo acido ferulico, en al menos un producto qmmico estructuralmente y/o estericamente diferente.

Una "actividad enzimatica involucrada o asociada con la conversion fermentativa del acido ferulico en vainillina" significa cualquier actividad catalftica o reguladora de una enzima que influye en la conversion del acido ferulico en vainillina y/o subproductos, como puede determinarse mediante uno cualquiera del conjunto de parametros como se define en el presente documento a continuacion.

Los diferentes parametros de rendimiento ("Rendimiento" o YP/S; "Rendimiento-productividad espedfica"; o Espacio-Tiempo-Rendimiento (STY) son bien conocidos en la tecnica y se determinan como describen, por ejemplo, Song y Lee, 2006.

"Rendimiento" e "YP/S" (cada uno expresado en masa del producto producido/masa de material consumido) se usan en el presente documento como sinonimos.

El rendimiento-productividad espedfica describe la cantidad de un producto, como vainillina, que se produce por h y l de caldo de fermentacion por g de biomasa. La cantidad de peso celular humedo expresada como WCW describe la cantidad de microorganismo biologicamente activo en una reaccion bioqmmica. El valor se da como g producto por g de WCW por h (es decir, g/gWCW'1 h-1).

La expresion "produccion fermentativa" o "fermentacion" se refiere a la capacidad de un microorganismo (asistido por la actividad de la enzima contenida en o generada por dicho microorganismo) para producir un compuesto qmmico en cultivo celular utilizando al menos una fuente de carbono agregada a la incubacion.

Se entiende que la expresion "caldo de fermentacion" significa una solucion acuosa que se basa en un procedimiento de fermentacion y no se ha procesado o se ha procesado, por ejemplo, como se describe en el presente documento.

Un "huesped recombinante" puede ser cualquier celula procariota o eucariota, que contiene un vector de clonacion o un vector de expresion. Este termino tambien pretende incluir las celulas procariotas o eucariotas que se han modificado por ingeniena genetica para contener el gen o los genes clonados en el cromosoma o genoma de la celula huesped.

La expresion "microorganismo recombinante" incluye un microorganismo (por ejemplo, bacterias, levadura, un hongo, etc.) o cepa microbiana, (por ejemplo, bacterias, celulas de levadura, celula fungica, etc.) que se ha alterado geneticamente, modificado o disenado (por ejemplo, modificado por ingeniena genetica) de manera que muestre un genotipo y/o fenotipo alterado, modificado o diferente (por ejemplo, cuando la modificacion genetica afecta a las secuencias de acido nucleico codificantes del microorganismo) en comparacion con el microorganismo natural o el microorganismo "parental" del cual derivo.

Las enzimas particulares involucradas en la base que forma la ruta de biosmtesis de la vainillina de la presente invencion incluyen:

Feruloil-CoA sintetasa (EC 6.2.1.34; codificada por fcs).

Enoil-CoA hidratasa/aldolasa (EC 4.2.1.101; codificada por ech).

Vainillina deshidrogenasa (EC 1.2.1.67; codificada por vdh),

p-Cetotiolasa (EC 2.3.1.16 codificada por aat)

Acil-CoA-Hidrolasa (EC 3.1.2.20 codificada por PP_3354)

Transportador de molibdato (codificado por modABC)

B. Realizaciones particulares

La presente invencion se refiere en particular a las siguientes realizaciones:

1. Un procedimiento biocatalttico para producir vainillina a partir de acido ferulico, en el que

a) se cultiva una cepa bacteriana modificada por ingeniena genetica del genero Pseudomonas que tiene la capacidad de convertir el acido ferulico en vainillina en presencia de acido ferulico; y

b) opcionalmente, la vainillina asf formada se afsla del medio de cultivo; en el que dicha cepa bacteriana modificada por ingeniena genetica tiene una capacidad reducida, disminuida, para crecer en vainillina como unica fuente de carbono, en el que dicha cepa modificada por ingeniena genetica contiene al menos la siguiente modificacion genetica:

i) regulacion por disminucion, en particular inhibicion completa o cuantitativa, de la captacion de molibdato celular, que preferentemente da como resultado dicha capacidad reducida para crecer en vainillina; y ii) regulacion por disminucion de la actividad de la vainillina deshidrogenasa, en particular el gen correspondiente (vdh), por ejemplo, mediante delecion parcial o completa de la informacion genetica correspondiente.

Preferentemente, no se observa un crecimiento en la vainillina como unica fuente de carbono para una cepa modificada por ingeniena genetica.

2. delecionado

3. delecionado

4. El procedimiento de la realizacion 1, en el que la captacion celular de molibdato se regula por disminucion regulando por disminucion la protema de union al molibdato periplasmatico (modA), por ejemplo, mediante delecion parcial o completa de la informacion genetica correspondiente.

5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 4, en el que la captacion celular de molibdato se regula por disminucion mediante la delecion del operon modABC.

6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que al menos una de las siguientes actividades enzimaticas y, en particular, los genes para

iii) feruloil-CoA sintetasa y

iv) enoil-CoA hidratasa

esta regulado por aumento.

La regulacion por aumento se puede lograr, por ejemplo, aumentando el numero de copias de dichos genes de forma cromosomica o mediante la introduccion de vectores de expresion recombinantes que contengan dicha informacion genetica o modificando la expresion del gen, en particular mediante el uso de un promotor fuerte. 7. El procedimiento de acuerdo con la realizacion 6, en el que la expresion cromosomica de los genes para la feruloil-CoA sintetasa (fcs) y la enoil-CoA hidratasa (ech) esta regulada por aumento.

8. El procedimiento de acuerdo con la realizacion 7, en el que la expresion de los genes de la feruloil-CoA sintetasa (fcs) y la enoil-CoA hidratasa (ech) esta bajo el control de un elemento regulador que comprende un promotor fuerte, opcionalmente inducible, en particular el promotor tac fuerte, opcionalmente en combinacion con lacl o laclq en particular el promotor tac fuerte en combinacion con el elemento laclq.

9. El procedimiento de acuerdo con una de las realizaciones anteriores, en el que adicionalmente al menos una de las siguientes actividades enzimaticas, en particular, al menos uno de los genes correspondientes esta regulado por disminucion:

v) aldehudo deshidrogenasa PP_2680 y/o PP_0545vi) benzaldehudo deshidrogenasa PP_1948

En particular, la regulacion por disminucion se puede lograr mediante la delecion cromosomica parcial o completa de la informacion genetica correspondiente.

10. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que adicionalmente al menos una de las siguientes actividades enzimaticas, en particular, al menos uno de los genes correspondientes esta regulado por disminucion:

vii) beta-Cetotiolasa PP_3355 (aat) y

viii) acil-CoA deshidrogenasa PP_3354.

En particular, la regulacion por disminucion se puede lograr mediante la delecion cromosomica parcial o completa de la informacion genetica correspondiente.

11. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que la cepa microbiana que se va a modificar por ingeniena genetica es una cepa de Pseudomonas putida.

12. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que dicha cepa de Pseudomonas putida se modifica por ingeniena genetica regulando por disminucion la protema de adhesion superficial (lapA) en particular, regulando por disminucion del gen correspondiente. En particular, la regulacion por disminucion se puede lograr mediante la delecion parcial o completa de la informacion genetica correspondiente.

13. El procedimiento de una de las realizaciones anteriores, que se realiza aerobicamente y/o a una temperatura en el intervalo de 10 a 40 °C, o 20 a 30 °C y/o a un pH en el intervalo de 6 a 8 o de 6,5 a 7,5.

14. El procedimiento de una de las realizaciones anteriores, en el que la reaccion se lleva a cabo a una concentracion inicial de acido ferulico de 1 a 50 mM, en particular de 5 a 15 u 8 a 12 mM, como aproximadamente 10 mM, preferentemente en un medio acuoso.

15. El procedimiento de una de las realizaciones anteriores, en el que la reaccion se realiza en celulas completas de dichas cepas bacterianas o en un homogeneizado de celulas de las mismas o en una fraccion obtenida de dicho homogeneizado.

16. El procedimiento de una cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que dicha cepa bacteriana se aplica en forma libre o inmovilizada.

17. El procedimiento de una de las realizaciones anteriores se realizo de forma continua o discontinua.

18. Una cepa de Pseudomonas modificada por ingeniena genetica que contiene una modificacion genetica como se define en una cualquiera de las realizaciones 1 a 12, en las que dicha regulacion por disminucion se logra mediante la delecion de un gen o la alteracion de un gen.

19. La cepa de Pseudomonas modificada por ingeniena genetica de la realizacion 18, que se obtiene por ingeniena genetica de Pseudomonas putida, en particular de Pseudomonas putida KT2440, en la que dicha cepa modificada por ingeniena genetica esta preferentemente libre de plasmidos.

20. La cepa de Pseudomonas modificada por ingeniena genetica de la realizacion 19, seleccionada de GN23, GN235, GN237, GN275, GN276, GN299, GN347, GN440, GN441 y GN442; o una variante funcional o cepa mutante de la misma, que retiene la capacidad de convertir acido ferulico en vainillina y/o que no crece en vainillina como unica fuente de carbono y/o en la que la captacion de molibdato esta regulada por disminucion.

21. En otra realizacion, un sistema de byconversion de la invencion, por ejemplo con P. putida GN442, puede comprender resinas adsorbentes adecuadas para reducir la toxicidad del producto vainillina.

C. Otras realizaciones de la invencion

C.1 Alteracion de la regulacion de otros genes

La produccion fermentativa de vainillina con una cepa Pseudomonas recombinante como se describe en el presente documento puede mejorarse aun mas si se combina con la alteracion de la regulacion de al menos un gen adicional como esta involucrado en la via catabolica del acido ferulico no beta oxidativa como se muestra en la Figura 1 adjunta.

C.2 Protemas segun la invencion

Aunque las realizaciones preferidas de la invencion se basan en un enfoque que altera la regulacion las actividades de enzimas o proteinas mediante la delecion de secuencias de genes y/o el aumento de las tasas de expresion de enzimas particulares, la invencion no se limita a las mismas.

Ademas, puede ser posible alcanzar mejoras similares mediante la regulacion por disminucion de las actividades de enzimas/protemas mediante la realizacion de mutaciones adecuadas en una o mas secuencias de aminoacidos identificadas en el presente documento. La regulacion por aumento se puede realizar generando protemas/enzimas mutantes con actividad mejorada.

Por lo tanto, la invencion en este contexto tambien se refiere a "equivalentes funcionales" o "analogos" o "mutaciones funcionales" de las enzimas/protemas espedficamente descritas.

Por ejemplo, "equivalentes funcionales" significa enzimas, que, en una prueba utilizada para la actividad enzimatica, muestran al menos un 1 a un 10 %, o al menos un 20 %, o al menos un 50 %, o al menos un 75 %, o al menos un 90 % mayor o menor actividad de una enzima, como se define en el presente documento.

"Equivalentes funcionales", de acuerdo con la invencion, tambien significa en particular mutantes, que, en al menos una posicion de secuencia de las secuencias de aminoacidos indicadas anteriormente, tienen un aminoacido que es diferente de lo que se dice en concreto, pero, sin embargo, poseen una de las actividades biologicas mencionadas anteriormente. Los "equivalentes funcionales" comprenden as^ los mutantes obtenibles por uno o mas, como 1 a 20, 1 a 15 o 5 a 10 adiciones, sustituciones, deleciones y/o inversiones de aminoacidos, donde los cambios indicados pueden producirse en cualquier posicion de secuencia, siempre que conduzcan a un mutante con el perfil de propiedades de acuerdo con la invencion. La equivalencia funcional tambien se proporciona en particular si los patrones de reactividad coinciden cualitativamente entre el mutante y el polipeptido no modificado, es decir, si, por ejemplo, los mismos sustratos se convierten a una velocidad diferente. Ejemplos de sustituciones de aminoacidos adecuadas se muestran en la siguiente tabla:

Resto original Ejemplos de sustitucion

Ala Ser

Arg Lys

Asn Gln; His

Asp Glu

Cys Ser

Gln Asn

Glu Asp

Gly Pro

His Asn; Gln

Ile Leu; Val

Leu Ile; Val

Lys Arg; Gln; Glu

Met Leu; Ile

Phe Met; Leu; Tyr

Ser Thr

Thr Ser

Trp Tyr

Tyr Trp; Phe

Val Ile; Leu

Los "equivalentes funcionales" en el sentido anterior son tambien "precursores" de los polipeptidos descritos, asf como "derivados funcionales" y "sales" de los polipeptidos.

Los "precursores" son en ese caso precursores naturales o sinteticos de los polipeptidos con o sin la actividad biologica deseada.

La expresion "sales" significa sales de grupos carboxilo asf como sales de adicion de acido de grupos amino de las moleculas de protema de acuerdo con la invencion. Las sales de los grupos carboxilo se pueden producir de una manera conocida y comprenden sales inorganicas, por ejemplo sales de sodio, calcio, amonio, hierro y cinc, y sales con bases organicas, por ejemplo aminas, tales como trietanolamina, arginina, lisina, piperidina y similares. Sales de adicion de acido, por ejemplo sales con acidos inorganicos, tales como acido clortndrico o acido sulfurico y sales con acidos organicos, tales como acido acetico y acido oxalico, tambien estan cubiertas por la invencion.

Los "derivados funcionales" de los polipeptidos de acuerdo con la invencion tambien pueden producirse en grupos laterales de aminoacidos funcionales o en su extremo N-terminal o C-terminal usando tecnicas conocidas. Tales derivados comprenden, por ejemplo, esteres alifaticos de grupos acido carboxflico, amidas de grupos de acido carboxflico, obtenible por reaccion con amomaco o con una amina primaria o secundaria; derivados N-acilo de grupos amino libres, producidos por reaccion con grupos acilo; o derivados O-acilo de grupos hidroxi libres, producidos por reaccion con grupos acilo.

Los "equivalentes funcionales" naturalmente tambien comprenden polipeptidos que pueden obtenerse de otros organismos, asf como variantes de origen natural. Por ejemplo, se pueden establecer areas de secuencia homologa mediante comparacion de secuencia, y se pueden determinar enzimas equivalentes segun los parametros concretos de la invencion.

Los "equivalentes funcionales" tambien comprenden fragmentos, preferentemente dominios individuales o motivos de secuencia, de los polipeptidos segun la invencion, que, por ejemplo, muestran la funcion biologica deseada.

"Equivalentes funcionales" son, ademas, protemas de fusion, que tienen una de las secuencias polipeptfdicas indicadas anteriormente o equivalentes funcionales derivados de y al menos una mas, secuencias heterologas funcionalmente diferentes en asociacion funcional N-terminal o C-terminal (es decir, sin deterioro funcional mutuo sustancial de las partes de la protema de fusion). Los ejemplos no limitantes de estas secuencias heterologas son, por ejemplo, peptidos senal, anclajes de histidina o enzimas.

Los "equivalentes funcionales" que tambien se incluyen de acuerdo con la invencion son homologos de las protemas desveladas concretamente. Estos poseen valores de identidad porcentuales como se ha indicado anteriormente. Dichos valores se refieren a la identidad con las secuencias de aminoacidos desveladas concretamente, y pueden calcularse de acuerdo con el algoritmo de Pearson y Lipman, (1988).

Los valores de % de identidad tambien se pueden calcular a partir de alineaciones de BLAST, algoritmo blastp (protema-protema BLAST) o aplicando el ajuste Clustal como se indica a continuacion.

Un porcentaje de identidad de un polipeptido homologo segun la invencion significa, en particular, el porcentaje de identidad de los restos de aminoacidos con respecto a la longitud total de una de las secuencias de aminoacidos descritas concretamente en el presente documento.

En el caso de una posible glucosilacion de protemas, los "equivalentes funcionales" de acuerdo con la invencion comprenden protemas del tipo designado anteriormente en forma desglicosilada o glicosilada, asf como formas modificadas que pueden obtenerse alterando el patron de glicosilacion.

Dichos equivalentes funcionales u homologos de las protemas o polipeptidos de acuerdo con la invencion pueden producirse por mutagenesis, por ejemplo, por mutacion puntual, alargamiento o acortamiento de la protema.

Dichos equivalentes funcionales u homologos de las protemas de acuerdo con la invencion pueden identificarse seleccionando bases de datos combinatorias de mutantes, por ejemplo, acortando mutantes. Por ejemplo, se puede producir una variada base de datos de variantes de protemas mediante mutagenesis combinatoria a nivel de acido nucleico, por ejemplo, mediante ligadura enzimatica de una mezcla de oligonucleotidos sinteticos. Hay una gran cantidad de procedimientos que pueden usarse para la produccion de bases de datos de posibles homologos a partir de una secuencia de oligonucleotidos degenerada. La smtesis qmmica de una secuencia genica degenerada se puede llevar a cabo en un sintetizador de ADN automatico, y el gen sintetico se puede ligar luego en un vector de expresion adecuado. El uso de un genoma degenerado permite suministrar todas las secuencias en una mezcla, que codifican para el conjunto deseado de secuencias de protemas potenciales. Los procedimientos de smtesis de oligonucleotidos degenerados son conocidos por los expertos en la materia (por ejemplo, Narang, S.A. (1983); Itakura y col., (1984) (a) ; Itakura y col., (1984) (b); Ike y col., (1983)).

En la tecnica anterior, se conocen varias tecnicas para la deteccion de productos geneticos de bases de datos combinatorias, que se produjeron mediante mutaciones puntuales o acortamiento, y para la seleccion de bibliotecas de ADNc para productos genicos con una propiedad seleccionada. Estas tecnicas se pueden adaptar para la seleccion rapida de los bancos de genes que se produjeron mediante mutagenesis combinatoria de homologos de acuerdo con la invencion. Las tecnicas mas utilizadas para el cribado de grandes bancos de genes, que se basan en un analisis de alto rendimiento, comprenden la clonacion del banco de genes en vectores de expresion que pueden replicarse, la transformacion de las celulas adecuadas con la base de datos de vectores resultante y la expresion de los genes combinatorios en condiciones en las que la deteccion de la actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detecto. Mutagenesis Recursiva De Conjunto (REM), una tecnica que aumenta la frecuencia de mutantes funcionales en las bases de datos, se puede utilizar en combinacion con las pruebas de deteccion, para identificar homologos (Arkin y Yourvan (1992); Delgrave y col., (1993)).

C.3 Codificacion de secuencias de acido nucleico

La invencion tambien se refiere a secuencias de acido nucleico que codifican enzimas/protemas como se definen en el presente documento y que pueden aplicarse para realizar las manipulaciones de ingeniena genetica requeridas. La presente invencion tambien se refiere a acidos nucleicos con un cierto grado de "identidad" con las secuencias espedficamente desveladas en el presente documento. "Identidad" entre dos acidos nucleicos significa la identidad de los nucleotidos, en cada caso en toda la longitud del acido nucleico.

Por ejemplo, la identidad puede calcularse mediante el programa Vector NTI Suite 7.1 de la empresa Informax (EE.UU.) usando el procedimiento Clustal (Higgins DG, Sharp PM. ((1989))) con los siguientes ajustes:

Parametro de alineacion multiple:

penalizacion por abertura de huecos 10

penalizacion de extension de hueco 10

Rango de penalizacion por separacion de huecos 8

Pena de separacion de huecos apagado

% de identidad por retraso de alineacion 40

Huevos espedficos de restos apagado

Hueco de restos hidrofflicos apagado

Ponderacion de la transicion 0

(continuacion)

Parametro de alineacion por pares:

Algoritmo FAST on

Tamano de la tupla K 1

Penalizacion por huecos 3

Tamano de ventana 5

Numero de mejores diagonales 5

Como alternativa, la identidad puede determinarse de acuerdo con Chenna, y col., (2003), la pagina web: http://www.ebi.ac.Uk/Tools/clustalw/index.html# y las siguientes configuraciones

Penalizacion por abertura de huecos en ADN 15,0

Pena de extension de huecos de ADN 6,66

Matriz de ADN Identidad

Penalizacion por abertura de huecos en protemas 10,0

Penalizacion por extension de huecos en protemas 0,2

Matriz proteica Gonnet

FIN DE HUECO Protemas/ADN -1

DISTANCIA DE HUECOS Protema/ADN 4

Todas las secuencias de acido nucleico mencionadas en el presente documento (secuencias de ADN y ARN de cadena simple y cadena doble, por ejemplo, ADNc y ARNm) pueden producirse de forma conocida por smtesis qmmica a partir de los bloques de construccion de nucleotidos, por ejemplo, por condensacion de fragmentos de superposicion individual, bloques componentes de acido nucleico complementarios de la doble helice. La smtesis qmmica de oligonucleotidos puede, por ejemplo, realizarse de una manera conocida, por el procedimiento de la fosfoamidita (Voet, Voet, 2a edicion, Wiley Press, Nueva York, paginas 896-897). La acumulacion de oligonucleotidos sinteticos y el llenado de huecos por medio del fragmento Klenow de ADN polimerasa y las reacciones de ligado, asf como las tecnicas generales de clonacion, se describen en Sambrook y col., (1989), vease a continuacion.

La invencion tambien se refiere a secuencias de acido nucleico (secuencias de ADN y ARN monocatenarias y bicatenarias, por ejemplo, ADNc y ARNm), que codifican una de las protemas/enzimas anteriores y sus equivalentes funcionales, que se puede obtener, por ejemplo, usando analogos de nucleotidos artificiales.

La invencion se refiere tanto a moleculas de acido nucleico aisladas, que codifican para polipeptidos o protemas de acuerdo con la invencion o segmentos biologicamente activos de los mismos, y para fragmentos de acido nucleico, que pueden usarse, por ejemplo, como sondas de hibridacion o cebadores para identificar o amplificar acidos nucleicos codificantes de acuerdo con la invencion.

Las moleculas de acido nucleico segun la invencion pueden ademas contener secuencias no traducidas en los extremos 3' y/o 5' de la region genetica codificante.

La invencion se refiere ademas a las moleculas de acido nucleico que son complementarias a las secuencias de nucleotidos descritas concretamente o un segmento de las mismas.

Las secuencias de nucleotidos de acuerdo con la invencion hacen posible la produccion de sondas y cebadores que pueden usarse para la identificacion y/o clonacion de secuencias homologas en otros tipos celulares y organismos. Dichas sondas o cebadores generalmente comprenden una region de secuencia de nucleotidos que se hibrida en condiciones "rigurosas" (vease a continuacion) en al menos aproximadamente 12, preferentemente al menos aproximadamente 25, por ejemplo, aproximadamente 40, 50 o 75 nucleotidos sucesivos de una cadena sentido de una secuencia de acido nucleico de acuerdo con la invencion o de una cadena antisentido correspondiente.

Una molecula de acido nucleico "aislada" se separa de otras moleculas de acido nucleico que estan presentes en la fuente natural del acido nucleico y, ademas, puede estar sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo, si se esta produciendo mediante tecnicas recombinantes, o puede estar libre de precursores qmmicos u otros productos qmmicos, si se esta sintetizando qmmicamente.

Una molecula de acido nucleico de acuerdo con la invencion se puede aislar por medio de tecnicas estandar de biologfa molecular y la informacion de secuencia suministrada de acuerdo con la invencion. Por ejemplo, el ADNc puede aislarse de una biblioteca de ADNc adecuada, utilizando una de las secuencias completas descritas concretamente o un segmento de las mismas como sonda de hibridacion y tecnicas de hibridacion estandar (como se describe, por ejemplo, en Sambrook, (1989)). Ademas, una molecula de acido nucleico que comprende una de las secuencias descritas o un segmento de las mismas, puede aislarse mediante reaccion en cadena de la polimerasa, utilizando los cebadores oligonucleotfdicos que se construyeron sobre la base de esta secuencia. El acido nucleico amplificado de esta manera puede clonarse en un vector adecuado y puede caracterizarse por secuenciacion de ADN. Los oligonucleotidos de acuerdo con la invencion tambien pueden producirse mediante procedimientos estandar de smtesis, por ejemplo, utilizando un sintetizador de ADN automatico.

Las secuencias de acido nucleico segun la invencion o derivados de la misma, homologos o partes de estas secuencias, se pueden aislar, por ejemplo, mediante tecnicas de hibridacion habituales o la tecnica de PCR de otras bacterias, por ejemplo, a traves de bibliotecas genomicas o de ADNc. Estas secuencias de ADN se hibridan en condiciones estandar con las secuencias de acuerdo con la invencion.

"Hibridar" significa la capacidad de un polinucleotido u oligonucleotido para unirse a una secuencia casi complementaria en condiciones estandar, mientras que la union no espedfica no se produce entre socios no complementarios en estas condiciones. Para ello, las secuencias pueden ser complementarias al 90-100 %. La propiedad de las secuencias complementarias de poder unirse espedficamente entre sf se utiliza, por ejemplo, en transferencia de tipo Northern o transferencia de tipo Southern, o en la union del cebador en PCR o RT-PCR.

Los oligonucleotidos cortos de las regiones conservadas se usan ventajosamente para la hibridacion. Sin embargo, tambien es posible usar fragmentos mas largos de los acidos nucleicos de acuerdo con la invencion o las secuencias completas para la hibridacion. Estas condiciones estandar vanan segun el acido nucleico utilizado (oligonucleotido, fragmento mas largo o secuencia completa) o segun el tipo de acido nucleico (ADN o ARN) que se utiliza para la hibridacion. Por ejemplo, las temperaturas de fusion para ADN:tnbridos de ADN son aproximadamente 10 °C mas bajos que los de las de ADN:tnbridos de ARN de la misma longitud.

Por ejemplo, dependiendo del acido nucleico particular, las condiciones estandar promedian temperaturas entre 42 y 58 °°C en una solucion tampon acuosa con una concentracion entre 0,1 a 5 x SSC (1 X SSC = NaCl 0,15 M, citrato de sodio 15 mM, pH 7,2) o adicionalmente en presencia 50 % de e formamida, por ejemplo 42 °C en 5 x SSC, 50 % de formamida. Ventajosamente, las condiciones de hibridacion para ADN:tnbridos de ADN son 0,1 x SSC y temperaturas entre aproximadamente 20 °C y 45 °C, preferentemente entre aproximadamente 30°C y 45°C. Para ADN:tnbridos de ARN, las condiciones de hibridacion son ventajosamente 0,1 x SSC y temperaturas entre aproximadamente 30 °C y 55 °C, preferentemente entre aproximadamente 45 °C y 55 °C. Estas temperaturas indicadas para la hibridacion son ejemplos de valores de temperatura de fusion calculados para un acido nucleico con una longitud de aproximadamente 100 nucleotidos y un contenido de G C del 50 % en ausencia de formamida. Las condiciones experimentales para la hibridacion de ADN se describen en los libros de texto de genetica relevantes, por ejemplo Sambrook y col., 1989, y pueden calcularse utilizando formulas conocidas por un experto en la materia, por ejemplo, dependiendo de la longitud de los acidos nucleicos, el tipo de tubridos o el contenido de G C. Un experto en la materia puede obtener mas informacion sobre la hibridacion de los siguientes libros de texto: Ausubel y col., (eds), (1985), Brown (ed) (1991).

La "hibridacion" se puede realizar, en particular, en condiciones rigurosas. Dichas condiciones de hibridacion se describen, por ejemplo, en Sambrook (1989) o en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.

Las condiciones de hibridacion "rigurosas" significan en particular: incubacion a 42 °C durante la noche en una solucion que consiste en 50 % de formamida, 5 x SSC (NaCl 750 mM, citrato de tri-sodio 75 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x Solucion Denhardt, 10 % de sulfato de dextrano y 20 g/ml de ADN de esperma de salmon desnaturalizado cortado, seguido por el lavado de los filtros con 0,1 x SSC a 65 °C.

La invencion tambien se refiere a derivados de las secuencias de acido nucleico desveladas concretamente o derivables.

Por tanto, otras secuencias de acido nucleico de acuerdo con la invencion pueden derivarse de las secuencias espedficamente desveladas en el presente documento y pueden diferir de ella por adicion, sustitucion, insercion o delecion de nucleotidos individuales o varios, y ademas codifica los polipeptidos con el perfil de propiedades deseado.

La invencion tambien abarca secuencias de acido nucleico que comprenden las llamadas mutaciones silenciosas o que se han alterado, en comparacion con una secuencia concreta, de acuerdo con el uso del codon de un organismo original o huesped especial, asf como variantes de origen natural, por ejemplo, variantes de corte y empalme o variantes alelicas, de los mismos.

Tambien se refiere a secuencias que pueden obtenerse mediante sustituciones de nucleotidos conservadoras (es decir, el aminoacido en cuestion se reemplaza por un aminoacido de la misma carga, tamano, polaridad y/o solubilidad).

La invencion tambien se refiere a las moleculas derivadas de los acidos nucleicos desvelados concretamente mediante polimorfismos de secuencia. Estos polimorfismos geneticos pueden existir entre individuos dentro de una poblacion debido a la variacion natural. Estas variaciones naturales generalmente producen una variacion de 1 a 5 % en la secuencia de nucleotidos de un gen.

Los derivados de secuencias de acido nucleico de acuerdo con la invencion significan, por ejemplo, variantes alelicas, que tienen al menos un 60 % de homologfa a nivel del aminoacido derivado, preferentemente al menos un 80 % de homologfa, de manera bastante especialmente preferible al menos un 90 % de homologfa en todo el intervalo de secuencia (con respecto a la homologfa a nivel de aminoacidos, se debe hacer referencia a los detalles dados anteriormente para los polipeptidos). Ventajosamente, las homologfas pueden ser superiores a las regiones parciales de las secuencias.

Adicionalmente, los derivados tambien deben entenderse como homologos de las secuencias de acido nucleico de acuerdo con la invencion, por ejemplo homologo de animales, plantas, fungicos o bacterianos, secuencias acortadas, ADN o ARN monocatenario de la secuencia de ADN codificante y no codificante. Por ejemplo, los homologos tienen, a nivel de ADN, una homologfa de al menos el 40 %, preferentemente de al menos el 60 %, especialmente preferentemente de al menos el 70 %, muy especialmente preferentemente de al menos el 80 % sobre la region de ADN completa dada en una secuencia espedficamente descrita en el presente documento.

Ademas, Los derivados deben entenderse como, por ejemplo, fusiones con promotores. Los promotores que se agregan a las secuencias de nucleotidos indicadas pueden modificarse por al menos un intercambio de nucleotidos, al menos una insercion, inversion y/o delecion, aunque sin perjudicar la funcionalidad o eficacia de los promotores. Ademas, la eficacia de los promotores puede aumentarse alterando su secuencia o puede intercambiarse completamente con promotores mas efectivos, incluso de organismos de un genero diferente.

C.4 Construcciones segun la invencion

La invencion tambien se refiere a construcciones como construcciones de expresion, que contienen, bajo el control genetico de secuencias reguladoras de acidos nucleicos, una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido o protema de fusion aplicable en la invencion; asf como vectores que comprenden al menos una de estas construcciones.

"Unidad de expresion" significa, de acuerdo con la invencion, un acido nucleico con actividad de expresion, que comprende un promotor como se define en el presente documento y, despues de la asociacion funcional con un acido nucleico que se va a expresar o un gen, regula la expresion, es decir, la transcripcion y la traduccion de este acido nucleico o de este gen. En este contexto, por lo tanto, tambien se llama "secuencia reguladora de acido nucleico". Ademas del promotor, otros elementos reguladores pueden estar presentes, por ejemplo, potenciadores. "Casete de expresion" o "construccion de expresion" significa, de acuerdo con la invencion, una unidad de expresion, que esta asociada funcionalmente con el acido nucleico que se va a expresar o el gen que se va a expresar. En contraste con una unidad de expresion, un casete de expresion comprende asf no solo secuencias de acido nucleico que regulan la transcripcion y la traduccion, sino tambien las secuencias de acido nucleico que deben expresarse como protemas como resultado de la transcripcion y traduccion.

Los terminos "expresion" o "sobreexpresion" describen, en el contexto de la invencion, la produccion o aumento de la actividad intracelular de una o mas enzimas en un microorganismo, que estan codificadas por el ADN correspondiente. Para ello, es posible, por ejemplo, insertar un gen en un organismo, reemplazar un gen existente por otro gen, aumentar el numero de copias del gen o genes, usar un promotor fuerte o usar un gen que codifique una enzima correspondiente con una actividad alta, y opcionalmente estas medidas se pueden combinar.

Preferentemente, tales construcciones de acuerdo con la invencion comprenden un promotor 5' corriente arriba de la secuencia de codificacion respectiva, y una secuencia de terminacion 3' corriente abajo, y opcionalmente otros elementos reguladores habituales, en cada caso funcionalmente asociado con la secuencia de codificacion.

Un "promotor", un "acido nucleico con actividad promotora" o una "secuencia promotora" significa, de acuerdo con la invencion, un acido nucleico que, asociado funcionalmente con un acido nucleico que se va a transcribir, regula la transcripcion de este acido nucleico.

Asociacion "funcional" o "operativa" significa, en este contexto, por ejemplo, la disposicion secuencial de uno de los acidos nucleicos con actividad promotora y de una secuencia de acido nucleico que se va a transcribir y opcionalmente otros elementos reguladores, por ejemplo, secuencias de acidos nucleicos que permiten la transcripcion de acidos nucleicos y, por ejemplo, un terminador, de tal manera que cada uno de los elementos reguladores pueda cumplir su funcion en la transcripcion de la secuencia de acido nucleico. Esto no requiere necesariamente una asociacion directa en el sentido qmmico. Las secuencias de control genetico, tales como secuencias potenciadoras, tambien pueden ejercer su funcion en la secuencia objetivo desde posiciones mas remotas o incluso desde otras moleculas de ADN. Se prefieren las disposiciones en las que la secuencia de acido nucleico que se va a transcribir se coloca detras (es decir, en el extremo 3') de la secuencia promotora, de modo que las dos secuencias estan unidas covalentemente entre sf. La distancia entre la secuencia del promotor y la secuencia de acido nucleico que debe expresarse de forma transgenica puede ser menor que 200 pb (pares de bases), o menor que 100 pb o menor que 50 pb.

Aparte de promotores y terminadores, ejemplos de otros elementos reguladores que se pueden mencionar son secuencias de direccionamiento, potenciadores, senales de poliadenilacion, marcadores seleccionables, senales de amplificacion, ongenes de replicacion y similares. Las secuencias reguladoras adecuadas se describen, por ejemplo, en Goeddel (1990).

Las construcciones de acido nucleico de acuerdo con la invencion comprenden en particular secuencias seleccionadas de aquellas, espedficamente mencionadas en el presente documento o derivados y homologos de las mismas, asf como las secuencias de acido nucleico que pueden derivarse de secuencias de aminoacidos mencionadas espedficamente en el presente documento que estan asociadas ventajosamente operativa o funcionalmente con una o mas senales de regulacion para controlar, por ejemplo, aumentar, la expresion genica. Ademas de estas secuencias reguladoras, la regulacion natural de estas secuencias todavfa puede estar presente frente a los genes estructurales reales y, opcionalmente, puede haber sido alterada por ingeniena genetica, de modo que se desactiva la regulacion natural y se aumenta la expresion de los genes. La construccion de acido nucleico tambien puede ser de un diseno mas simple, es decir, sin que se inserten senales reguladoras adicionales delante de la secuencia de codificacion y sin eliminar el promotor natural con su regulacion. En cambio, la secuencia reguladora natural se silencia, de modo que la regulacion ya no tiene lugar y aumenta la expresion genica.

Una construccion de acido nucleico preferida tambien contiene ventajosamente una o mas de las secuencias potenciadoras mencionadas anteriormente, funcionalmente asociadas con el promotor, lo que permite una mayor expresion de la secuencia de acido nucleico. Secuencias adicionales ventajosas, tales como otros elementos reguladores o terminadores, tambien se pueden insertar en el extremo 3' de las secuencias de ADN. Una o mas copias de los acidos nucleicos de acuerdo con la invencion pueden estar contenidas en la construccion. La construccion tambien puede contener otros marcadores, tales como resistencias antibioticas o genes complementarios de auxotrofia, opcionalmente para seleccion en la construccion.

Ejemplos de secuencias reguladoras adecuadas estan contenidas en promotores tales como cos-, tac-, trp-, tet-, trptet-, Ipp-, lac-, lpp-lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, rhaP (rhaPBAD)SP6-, lambda-PR- o en el promotor lambda-PL, que encuentran aplicacion ventajosamente en bacterias gramnegativas. Otras secuencias reguladoras ventajosas estan contenidas, por ejemplo, en los promotores de grampositivas ace, amy y SPO2, en los promotores de levadura o hongos ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. Los promotores artificiales tambien pueden usarse para la regulacion.

Para la expresion, la construccion de acido nucleico se inserta en un organismo huesped ventajosamente en un vector, por ejemplo un plasmido o un fago, que permite la expresion optima de los genes en el huesped. Ademas de los plasmidos y fagos, los vectores tambien deben entenderse en el sentido de todos los demas vectores conocidos por los expertos en la tecnica, por ejemplo, virus, tales como SV40, CMV, baculovirus y adenovirus, transposones, elementos IS, fasmidos, cosmidos, y ADN lineal o circular. Estos vectores pueden replicarse de forma autonoma en el organismo huesped o pueden replicarse cromosomicamente. Estos vectores representan una realizacion adicional de la invencion.

Los plasmidos adecuados son, por ejemplo en E. coli, pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, PIN-MM13-B1, Agt11 o pBdCl; en los actinomicetos nocardioformes pjAM2; en Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 o pIJ361; en bacilos pUB110, pC194 o pBD214; en Corynebacterium pSA77 o pAj667; en hongos pALSI, pIL2 o pBB116; en levaduras 2alphaM, PAG-1, YEp6, YEp13 o pEMBLYe23 o en plantas pLGV23, pGHIac+, pBIN19, pAK2004 o pDH51. Los plasmidos mencionados representan una pequena seleccion de los plasmidos posibles. Otros plasmidos son bien conocidos por los expertos en la tecnica y se encontraran, por ejemplo, en el libro Cloning Vectors (Eds. Pouwels P.H. y col.,) 1985.

En una realizacion adicional del vector, el vector que contiene la construccion de acido nucleico segun la invencion o el acido nucleico segun la invencion puede insertarse ventajosamente en forma de un ADN lineal en los microorganismos e integrarse en el genoma del organismo huesped mediante recombinacion heterologa u homologa. Este ADN lineal puede comprender un vector linealizado tal como plasmido o solo la construccion de acido nucleico o el acido nucleico de acuerdo con la invencion.

Para la expresion optima de genes heterologos en organismos, es ventajoso alterar las secuencias de acido nucleico de acuerdo con el uso del codon espedfico empleado en el organismo. El uso de codones se puede determinar facilmente sobre la base de evaluaciones computarizadas de otros, genes conocidos del organismo en cuestion. La produccion de un casete de expresion segun la invencion se basa en la fusion de un promotor adecuado con una secuencia de nucleotidos codificante adecuada y una senal de terminacion o una senal de poliadenilacion. Para ello se utilizan tecnicas comunes de recombinacion y clonacion, como se describe, por ejemplo, en J. Sambrook (1989), asf como en T.J. Silhavy, y col., (1984) y en Ausubel, F.M. y col., (1987).

La construccion de acido nucleico recombinante o construccion de gen se inserta ventajosamente en un vector espedfico del huesped para la expresion en un organismo huesped adecuado, para permitir la expresion optima de los genes en el huesped. Los vectores son bien conocidos por los expertos en la tecnica y se encontraran, por ejemplo, en "Cloning Vectors" Pouwels P.H. y col., (1985).

C.5 Huespedes que pueden usarse segun la invencion

Dependiendo del contexto, el termino "microorganismo" significa el microorganismo de partida (tipo salvaje) o un microorganismo modificado por ingeniena genetica de acuerdo con la invencion, o ambos.

Las celulas huesped modificadas por ingeniena genetica pueden modificarse exclusivamente en el nivel cromosomico, pueden contener vectores, como, por ejemplo, plasmidos que llevan la informacion genetica requerida o pueden ser modificados por una combinacion de ambos.

Se utilizan procedimientos comunes de clonacion y transfeccion que son familiares para un experto en la materia, por ejemplo coprecipitacion, fusion de protoplastos, electroporacion, transfeccion retroviral y similares, con el fin de asegurar la expresion de un acido nucleico en el sistema de expresion respectivo. Los sistemas adecuados se describen, por ejemplo, en F. Ausubel y col., (1997), o Sambrook y col., (1989).

Los microorganismos parentales son tfpicamente aquellos que tienen la capacidad de producir vainillina, a partir del acido ferulico. Tfpicamente estas son bacterias del genero Pseudomonas.

Ejemplos no limitantes de cepas adecuadas del genero Pseudomonas, son aquellos, que llevan los genes ech y fcs identificados anteriormente, como:

P. putida KT2440 ATCC 47054Pseudomonas sp. cepa HR199, y

P. fluorescens BF13.

ATCC designa la Coleccion Americana de Cultivos Tipo, FERM BP designa la coleccion del Instituto Nacional de Biociencias y Tecnologfa Humana, Agencia de Ciencia y Tecnologfa Industrial, Japon.

C.6 Produccion fermentativa de vainillina

La invencion tambien se refiere a procedimientos para la produccion fermentativa de vainillina.

Una fermentacion como se usa de acuerdo con la presente invencion puede, por ejemplo, realizarse en fermentadores agitados, columnas de burbujas y reactores de bucle. Se puede encontrar una descripcion general de los posibles tipos de procedimientos, incluidos los tipos de agitadores y disenos geometricos, en "Chmiel: Bioprozesstechnik: Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik, Band 1 ". En el procedimiento de la invencion, las variantes tfpicas disponibles son las siguientes variantes conocidas por los expertos en la tecnica o explicadas, por ejemplo, en "Chmiel, Hammes y Bailey: Biochemical Engineering", tal como fermentacion discontinua, semicontinua, semicontinua repetida o continua con y sin reciclaje de la biomasa. Dependiendo de la cepa de produccion, rociando con aire, oxfgeno, dioxido de carbono, hidrogeno, se pueden efectuar mezclas de nitrogeno o gases apropiados para lograr un buen rendimiento (YP/S).

El medio de cultivo que se va a utilizar debe satisfacer los requisitos de las cepas particulares de manera adecuada. Las descripciones de los medios de cultivo para diversos microorganismos se encuentran en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D. C., EE.UU., 1981).

Estos medios que pueden usarse de acuerdo con la invencion pueden comprender una o mas fuentes de carbono, fuentes de nitrogeno, sales inorganicas, vitaminas y/o oligoelementos.

Las fuentes preferidas de carbono son azucares, tales como mono-, di- o polisacaridos. Muy buenas fuentes de carbono son, por ejemplo, glucosa, fructosa, manosa, galactosa, ribosa, sorbosa, ribulosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, almidon o celulosa. Los azucares tambien se pueden agregar a los medios a traves de compuestos complejos, tales como melaza, u otros subproductos de la refinacion de azucar. Tambien puede ser ventajoso agregar mezclas de varias fuentes de carbono. Otras posibles fuentes de carbono son aceites y grasas, tales como aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y aceite de coco, acidos grasos como el acido palmftico, acido estearico o acido linoleico, alcoholes tales como glicerol, metanol o etanol y acidos organicos tales como acido acetico o acido lactico.

Las fuentes de nitrogeno suelen ser compuestos organicos o inorganicos de nitrogeno o materiales que contienen estos compuestos. Ejemplos de fuentes de nitrogeno incluyen gas amoniaco o sales de amonio, tal como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato amonico, carbonato de amonio o nitrato de amonio, nitratos, urea, aminoacidos o fuentes complejas de nitrogeno, tal como licor de mafz, harina de soja, protema de soja, extracto de levadura, extracto de carne y otros. Las fuentes de nitrogeno se pueden utilizar por separado o como una mezcla.

Los compuestos de sales inorganicas que pueden estar presentes en los medios comprenden el cloruro, sales de fosfato o sulfato de calcio, magnesio, sodio, cobalto, molibdeno, potasio, manganeso, cinc, cobre y hierro.

Compuestos inorganicos que contienen azufre, por ejemplo sulfatos, sulfitos, di-tionitos, tetrationatos, tiosulfatos, sulfuros, pero tambien compuestos organicos de azufre, tales como mercaptanos y tioles, pueden usarse como fuente de azufre.

Acido fosforico, dihidrogenofosfato de potasio o el hidrogenofosfato dipotasico o las sales correspondientes que contienen sodio se pueden usar como fuentes de fosforo.

Se pueden anadir agentes quelantes al medio, para mantener los iones metalicos en solucion. Los agentes quelantes especialmente adecuados comprenden dihidroxifenoles, tales como catecol o protocatechuato, o acidos organicos, tales como acido cftrico.

Los medios de fermentacion utilizados de acuerdo con la invencion tambien pueden contener otros factores de crecimiento, tales como vitaminas o promotores de crecimiento, que incluyen, por ejemplo, biotina, riboflavina, tiamina, acido folico, acido nicotmico, pantotenato y piridoxina. Los factores de crecimiento y las sales a menudo provienen de componentes complejos de los medios, tal como extracto de levadura, melazas, licor de mafz y similares. Ademas, se pueden anadir precursores adecuados al medio de cultivo. La composicion precisa de los compuestos en el medio depende en gran medida del experimento particular y debe decidirse individualmente para cada caso espedfico. La informacion sobre la optimizacion de los medios se puede encontrar en el libro de texto "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (1997) Los medios de cultivo tambien pueden obtenerse de proveedores comerciales, tal como el estandar 1 (Merck) o BHI (infusion de corazon-cerebro, DIFCO), etc.

Todos los componentes del medio son esterilizados, por calentamiento (20 min a 1,5 bares y 121 °C) o por filtracion esteril. Los componentes pueden esterilizarse juntos o, si es necesario, por separado. Todos los componentes del medio pueden estar presentes al comienzo del crecimiento, u opcionalmente pueden agregarse de forma continua o mediante alimentacion por lotes.

La temperatura del cultivo es normalmente entre 15 °C y 45 °C, preferentemente de 25 °C a 40 °C y se puede mantener constante o se puede variar durante el experimento. El valor de pH del medio debe estar en el intervalo de 5 a 8,5, preferentemente aproximadamente 7,0. El valor de pH para el crecimiento se puede controlar durante el crecimiento mediante la adicion de compuestos basicos como hidroxido de sodio, hidroxido de potasio, amomaco o agua amoniacal o compuestos acidos como el acido fosforico o el acido sulfurico. Los agentes antiespumantes, por ejemplo, esteres de poliglicol de acidos grasos, pueden usarse para controlar la formacion de espuma. Para mantener la estabilidad de los plasmidos, sustancias adecuadas con accion selectiva, por ejemplo, antibioticos, se pueden anadir al medio. Oxfgeno o mezclas de gases que contienen oxfgeno, por ejemplo, el aire ambiente, se introducen en el cultivo para mantener las condiciones aerobicas. La temperatura del cultivo es normalmente de 20 °C a 45 °C. El cultivo continua hasta que se ha formado un maximo del producto deseado. Esto normalmente se logra dentro de 1 hora a 160 horas.

Las celulas pueden interrumpirse opcionalmente por ultrasonidos de alta frecuencia, por alta presion, por ejemplo, en una celda de presion francesa, por osmolisis, por la accion de los detergentes, enzimas ltticas o disolventes organicos, por medio de homogeneizadores o por una combinacion de varios de los procedimientos enumerados. La composicion particular puede adaptarse al tipo de microorganismo aplicado. En la fermentacion, las composiciones de medios utiles para fermentaciones basadas en cepas de Pseudomonas son conocidas en la tecnica. Por ejemplo, el medio LB es un medio tfpico aplicable a tales cepas.

3.6 Aislamiento de vainillina

La metodologfa de la presente invencion puede incluir ademas una etapa de recuperacion de vainillina. El termino "recuperar" incluye la extraccion, cosecha, aislamiento o purificacion del compuesto de los medios de cultivo. La recuperacion del compuesto se puede realizar de acuerdo con cualquier metodologfa convencional de aislamiento o purificacion conocida en la tecnica, lo que incluye, aunque no de forma limitativa, tratamiento con una resina convencional (por ejemplo, resina de intercambio cationico o anionico, resina de adsorcion no ionica, etc.), tratamiento con un adsorbente convencional (por ejemplo, carbon activado, acido silfcico, gel de sflice, celulosa, alumina, etc.), alteracion del pH, extraccion en disolvente (por ejemplo, con un disolvente convencional como un alcohol, acetato de etilo, hexano y similares), destilacion, dialisis, filtracion, concentracion, cristalizacion, recristalizacion, ajuste de pH, liofilizacion y similares.

Antes del aislamiento previsto, se puede eliminar la biomasa del caldo. Los procedimientos para eliminar la biomasa son conocidos por los expertos en la tecnica, por ejemplo, filtracion, sedimentacion y flotacion. En consecuencia, la biomasa puede eliminarse, por ejemplo, con centrifugadoras, separadores, decantadores, filtros o en aparatos de flotacion. Para la maxima recuperacion del producto de valor, el lavado de la biomasa es a menudo recomendable, por ejemplo en forma de diafiltracion. La seleccion del procedimiento depende del contenido de biomasa en el caldo del fermentador y de las propiedades de la biomasa, y tambien de la interaccion de la biomasa con el producto de valor.

En una realizacion, el caldo de fermentacion puede esterilizarse o pasteurizarse. En una realizacion adicional, el caldo de fermentacion se concentra. Dependiendo del requerimiento, esta concentracion se puede hacer por lotes o continuamente. El intervalo de presion y temperatura debe seleccionarse de modo que, en primer lugar, no se produzcan danos al producto y, en segundo lugar, se requiera un uso mmimo del aparato y la energfa. La seleccion habil de los niveles de presion y temperatura para una evaporacion de multiples etapas en particular permite el ahorro de energfa.

Los siguientes ejemplos solo sirven para ilustrar la invencion. Las numerosas variaciones posibles que se haran evidentes de inmediato para una persona experta en la tecnica despues de considerar la divulgacion proporcionada en el presente documento tambien entran dentro del alcance de la invencion.

Parte experimental

A) Materiales y procedimientos

Plasmidos, cepas bacterianas y condiciones de crecimiento

Las cepas y plasmidos bacterianos utilizados en la presente invencion se muestran en la Tabla 1. Las cepas de P. putida se cultivaron a 30 °C y E. coli JM109 (Yanisch-Perron y col., 1985) a 37 °C en medio LB (Bertani, 1951). Para la seleccion de plasmidos, se agregaron 50 |jg ml-1 de kanamicina (Kan). Durante el procedimiento de eliminacion y para las pruebas de tolerancia, se utilizo medio mmimo M9 para el crecimiento de las cepas de P. putida (Na2HPO4 48 mM x7 H2O, KH2PO422 mM, NaCl 8,6 mM, NH4Cl 18,7 mM), suplementado con 0,2 % de glucosa, MgSO41 mM, CaCl2 0,1 mM, clorhidrato de tiamina 6 jM y 20 jg ml-1 de 5-fluorouracilo (5-FU; preparado como una solucion madre de 100 mg ml-1 en dimetilsulfoxido [Dm So ]).

Tabla 1 Cepas bacterianas y plasmidos utilizados en la presente invencion

continuacion

Productos quimicos y otros materiales

Los productos qmmicos utilizados en la presente invencion fueron de calidad analftica y se compraron a Carl Roth GmbH Co. KG (Karlsruhe, Alemania), Sigma-Aldrich Corporation (Taufkrichen, Alemania) y Merck KGaA (Darmstadt, Alemania). En particular, 5-FU, acido ferulico, vainillina, acido vainilKlico y alcohol vainillflico se adquirieron de Sigma-Aldrich. Los oligonucleotidos de ADN sinteticos (Tabla 2a) se adquirieron de Eurofins MWG Operon GmbH (Ebersberg, Alemania). Las enzimas de restriccion y las enzimas modificadoras de ADN se adquirieron de Roche Diagnostics Deutschland GmbH (Mannheim, Alemania), New England Biolabs GmbH (Frankfurt am Main, Alemania) y Fermentas GmbH (parte de Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot, Alemania). Las PCR se realizaron con la mezcla de enzimas PCR de alta fidelidad de Fermentas GmbH en un termociclador TPersonal de Biometra GmbH (Goettingen, Alemania).

Tabla 2a Cebadores oligonucleotidicos utilizados en la presente invencion

continuacion

Construccion de vectores y manipulacion genetica de cepas de P. putida

Las etapas de clonacion se realizaron con E. coli JM109 (Yanisch-Perron y col., 1985) utilizando tecnicas estandar de ADN recombinante (Sambrook y col., 1989). La transformacion de E. coli con el ADN plasirndico se produjo a traves del procedimiento TSS (Solucion de Transformacion y Almacenamiento) (Chung y col., 1989). Las cepas de P. putida se transformaron con ADN plasmfdico mediante electroporacion (Sambrook y col., 1989). La construccion de los plasmidos y las cepas se resume en la Tabla 3.

Para las deleciones e integraciones cromosomicas en P. putida KT2440, se utilizo el sistema de contraseleccion upp/5-FU como se ha descrito anteriormente (Graf y Altenbuchner, 2011). En primer lugar, las regiones aguas arribas y aguas abajo, incluidos los codones de inicio y parada del gen diana, se amplificaron por PCR utilizando el ADN cromosomico de P. putida KT2440 (numero de acceso de GenBank AE015451) como molde. Estos fragmentos se clonaron mediante el ligado de 3 fragmentos en pJOE6261.2. El vector de integracion resultante se uso luego para la electroporacion de P. putida AUPP4 u otras cepas con delecion de upp. Uno de los clones Kanr 5-FUs obtenidos se incubo en medio LB durante 24 horas a 30 °C en condiciones de agitacion (200 rpm). Despues de ello, se sembraron diferentes diluciones en placas mmimas que conteman 20 |jg ml-1 de 5-FU y 0,2 % de glucosa. Se verificaron diez clones de5-FUr y Kans mediante PCR de las colonias, utilizando oligonucleotidos que se unen a las secuencias aguas arribas y aguas abajo del gen que se va a delecionar.

La construccion del vector de integracion de laclq-PtacpNG283.5 comenzo con la amplificacion por PCR de ech utilizando los cebadores oligonucleotfdicos s6936/s6937 y el ADN cromosomico de P. putida KT2440 como molde. El fragmento de PCR purificado (897 pb) se clono a traves de Ndel/BamHI en pJOE5304.1 dando como resultado pNG281.1, un vector con el casete laclq-Ptac-ech. A continuacion, este casete se amplifico por PCR con s6936/s6965 (fragmento A; 2376 pb). Asimismo, la region aguas arriba de ech se amplifico por PCR con s6938/s6939 (fragmento B; 952 pb). Los fragmentos A y B se cortaron con BamHI/Mfel y EcoRI/BamHI, respectivamente, y se clonaron mediante ligado de 3 fragmentos en el corte con BamHI de pJOE6261.2, dando pNG283.5.

Mutagenesis de transposones y apareamiento

Los cultivos durante la noche de E. coli S17.1/pCro2a (contiene mini-Tn5495) (Onaca y col., 2007) y P. putida GN235 cultivados en LB con kanamicina y sin kanamicina, respectivamente, se mezclaron por igual (200 j l cada uno) y 100 j l de esa mezcla se vertieron en una placa de agar LB sin antibioticos. Despues de la incubacion durante 24 horas a 30 °C, las celulas cultivadas se rasparon de la placa con 3 ml de medio lfquido LB. En cada caso, se sembraron en placas 100 j l de una dilucion 10-2 (que proporciono aproximadamente 50-100 colonias) en un total de 50 LB de placas de agar que conteman 50 jg ml-1 de kanamicina y jg ml-1 jM de acido nalidfxico (para la contraseleccion del donante de E. coli). Las placas se incubaron luego durante 40 horas a 30 °C. De cada placa, las colonias se replicaron en placas de agar mmimo M9, una con 0,2 % (p/v) de glucosa y la otra con 0,1 % (p/v) de vainillina. La incubacion se produjo durante la noche a 30 °C. Las colonias que se hicieron crecer en placas M9 con glucosa pero no en placas M9 con vainillina se seleccionaron en una placa de agar LB con 50 jg ml-1 kanamicina y jg ml-1 de acido nalidfxico, en una placa de agar M9 con vainillina al 0,1% y en una placa de agar M9 con acido vainillflico al 0,1% y se incuba durante la noche a 30 °C. Se aislo el ADN cromosomico de los clones que habfan crecido en LBkan/nal y en M9 con acido vainillflico pero no en M9 con vainillina (DNeasy Blood and Tissue Kit, Qiagen, Hilden, Alemania) y se digirieron con las enzimas de restriccion BsrGI, EcoRI y Sail, respectivamente. Los fragmentos cromosomicos se purificaron (kit NucleoSpin Extract II, Macherey-Nagel, Duren, Alemania), se ligaron durante la noche a 4 °C, se precipitaron con isopropanol durante 2 h en hielo, se lavaron con etanol y se resuspendieron en 10 j l de H2O (bidest.). E. coli JM109 se transformo con los fragmentos cromosomicos ligados. La seleccion se realizo en placas de agar LB que conteman 50 jg ml-1 de kanamicina. Los plasmidos se aislaron a partir de clones resistentes a kanamicina y se verificaron mediante digestion con enzimas de restriccion. Despues de la secuenciacion de los plasmidos con los cebadores s4052 y s4037 (Onaca y col., 2007) (GATC Biotech, Constanza, Alemania), las secuencias obtenidas finalmente se sometieron a una busqueda BLAST.

Ensayo de bioconversion de acido ferulico en vainillina

Los cultivos durante la noche de las cepas de P. putida se diluyeron 1:50 en medio LB fresco y se cultivaron durante 2 horas a 30 °C en matraces agitados (200 rpm). La induccion de los genes metabolicos del acido ferulico se produjo mediante la adicion de acido ferulico 5 mM o IPTG 5 mM dependiendo de la cepa. Despues de un crecimiento adicional durante 6 horas a 30 °C en condiciones de agitacion, se recogieron 25 x 109 celulas mediante centrifugacion (10 minutos, 3.500 g, a temperatura ambiente), se lavaron y se resuspendieron con 5 ml de tampon de fosfato de sodio 50 mM (pH 7,2). Se anadio un total de 10 mM de acido ferulico (solucion madre 1 M en DMSO) a la suspension celular. La bioconversion se realizo en tubos largos de cultivo de vidrio a 30 °C en condiciones de agitacion (200 rpm). Se tomaron muestras de 200 j l despues de un tiempo de conversion de 1,2, 3, 4, 5 y 18 horas. Despues de un paso de centrifugacion (10 min, 16.000 g, temperatura ambiente) para sedimentar las celulas. Se recolectaron 100 j l del sobrenadante y se almacenaron a -70 ° C hasta su analisis por HPLC.

Procedimientos analiticos

Las muestras del ensayo de byconversion se diluyeron 1:10 con acido acetico al 0,2 % antes de la aplicacion de HPLC. El acido ferulico, la vainillina, el acido vainillflico y el alcohol vainillflico se cuantificaron con un sistema HPLC Merck-Hitachi (Merck, Darmstadt, Alemania) equipado con una columna RP Purospher®-Star RP-18e (250 mm x 4,6 mm, 5 jm), una columna protectora LiChroCART® (4 mm x 4 mm, 5 jm), un desgasificador L7612, una bomba de gradiente L6200A, un modulo de interfaz D6000A, un detector UV visible L4200, una valvula de inyeccion Rheodyne 7125 con un bucle de muestra de 100 j l y el software D7000 HPLC System Manager. Para las mediciones se uso un procedimiento modificado como se ha descrito anteriormente (Sinha y col., 2007): Se usaron metanol, acetonitrilo y 0,2 % de acido acetico (3:3:14) como la fase movil. El caudal fue de 1 ml min'1 y la absorbancia se midio a 231 nm durante 20 min. Las soluciones de acido ferulico, vainillina, acido vainillflico y alcohol vainillflico con siete concentraciones diferentes (0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 y 1 mM) se usaron para calibracion.

B. Experimentos

Ejemplo 1: Construccion y caracterizacion de un mutante de P. putida KT2440 incapaz de crecer en vainillina como unica fuente de carbono

Como se informo anteriormente (Overhage y col., 1999b; Plaggenborg y col., 2003), P. putida KT2440 puede crecer en acido ferulico como unica fuente de carbono. El acido ferulico se metaboliza en pocos pasos en vainillina, catalizada por la feruloil-CoA-sintetasa (PP_3356, fcs) y la enoil-CoA-hidratasa/aldolasa (Pp_3358, ech). La vainillina a su vez se degrada mas a acido vainillflico por la vainillina deshidrogenasa (PP_3357, vdh). El ultimo paso tiene que evitarse si se desea acumulacion de vainillina. La organizacion cromosomica de estos genes en P. putida KT2440 y otras cepas construidas en la presente invencion se muestra en la Figura 2.

Con respecto a las aplicaciones industriales, los inventores construyeron la cepa GN23 de P. putida con una delecion en el operon lapABC que incluye el gen para la protema de adhesion a la superficie (Pp_0168, lapA) utilizando el procedimiento de contraseleccion upp descrito anteriormente (Graf y Altenbuchner, 2011). La protema de adhesion a la superficie es responsable y esencial para la formacion de biopelmulas como se ha mostrado anteriormente para otra cepa mutante . putida KT2440 AlapA (Graf y Altenbuchner, 2011).

En un segundo paso, el gen vdh cromosomico de P. putida GN23 se deleciono dejando solo el codon de inicio y terminacion de vdh (Fig. 2). La cepa resultante, designada como GN235, todavfa era capaz de crecer en acido ferulico como unica fuente de carbono que demuestra la expresion funcional de fcs. GN235 tambien conservo la capacidad de crecer en vainillina y acido vainillflico (Fig. 3).

Usando la mutagenesis de transposones de GN235, se descubrio un mutante (GN275) que no pudo crecer en acido ferulico o vainillina como unica fuente de carbono. Sin embargo, se retuvo el crecimiento sobre acido vainillflico (Fig. 3). La identificacion del gen interrumpido por el transposon revelo modA (PP_3828), que codifica una protema de union a molibdato periplasmica, que es parte de un transportador ABC de molibdato. Todo el operon, que incluye modABC (PP_3827 - Pp_3832), se deleciono sin marcadores con el procedimiento de contraseleccion de upp que resulto en la cepa GN276. El fenotipo de esta cepa fue el mismo que el transposon mutante (Fig. 3).

Ejemplo 2: Ensayos de bioconversion de las cepas GN23, GN235 y GN276

Se utilizaron celulas en reposo de las cepas GN23 y GN235 para los ensayos de byconversion. Se anadieron 10 mM de acido ferulico a las celulas en reposo y las concentraciones de acido ferulico, vainillina, alcohol vainillflico y acido vainillflico se midieron por HPLC tomando muestras a intervalos regulares durante el tiempo de reaccion. El ensayo se detuvo despues de un tiempo de conversion de 18 h. Ambas cepas, GN23 y GN235, mostraron una conversion rapida de acido ferulico acompanada de una acumulacion temporal de acido vainillflico en las primeras 5 h (Fig. 4a, b). Adicionalmente, la acumulacion de vainillina, alcohol vainillflico y acido vainillflico no se pudo observar en ninguno de ellos.

Un ensayo de byconversion de acido ferulico con GN276 (Fig. 4c) mostro una tasa de conversion disminuida del acido ferulico. Considerando que con GN23 todo el acido ferulico aplicado (10 mM) se convirtio despues de 18 h, todavfa se podna medir 2,4 mM usando GN276. En contraste con GN23 y ^g N235, GN276 se acumularon 4,8 mM de vainillina despues de 5 h de tiempo de conversion. La concentracion de vainillina aumento ligeramente a 5,2 mM despues de 13 h mas de conversion. Al final de la conversion (18 h), tambien se acumularon alcohol vainillflico y acidos vainillflicos hasta 1,5 mM y 0,3 mM, respectivamente. Para mejorar la tasa de conversion de acido ferulico fueron necesarios otros pasos.

Ejemplo 3: El aumento de la expresion de ech-fcs cromosomicos conduce a altas tasas de conversion y altos rendimientos molares de vainillina

La feruloil-CoA-sintetasa (fcs) y la enoil-CoA-hidratasa/aldolasa (ech) catalizan la conversion del acido ferulico en vainillina. Los inventores asumieron que la tasa de conversion del acido ferulico debe ser directamente proporcional al numero de estas dos enzimas metabolicas en la celula, si los cofactores requeridos, ATP y CoA-SH, Estan disponibles en exceso o se han regenerado. Utilizando el sistema de contraseleccion upp, el promotor de tac fuerte (P^tac) y laclq se integraron inmediatamente aguas arriba de ech y fcs en el cromosoma de GN276 para controlar la expresion de estos dos genes (Fig. 2).

La cepa resultante fue designada GN299. Despues de la induccion de expresion de ech y fcs con IPTG, se realizaron ensayos de byconversion con esta cepa. Despues de 5 h, casi todo el acido ferulico 10 mM se convirtio en alcohol vainillflico 1,1 mM, acido vainillflico 0,2 mM y vainillina 8,3 mM, correspondiente a un rendimiento molar del 83 % (Fig. 4d). Despues de 18 h de conversion, la concentracion de vainillina disminuyo ligeramente a 7,6 mM acompanada con un aumento de alcohol vainillflico y acido vainillflico a 1,6 mM y 0,4 mM, respectivamente.

Ejemplo 4: La optimizacion del ensayo de bioconversion revelo un umbral para la vainillina

Se usaron celulas en reposo de P. putida GN299 para experimented de bioconversion. Se variaron varios parametros con el objetivo de obtener un alto rendimiento del producto reproducible combinado con un alto mdice de conversion inicial.

En primer lugar, los inventores analizaron la influencia de la concentracion del inductor (1 y 5 mM de IPTG) y del tiempo de induccion (2, 4 y 6 h) para la expresion de las enzimas metabolicas necesarias para la bioconversion de acido ferulico a vainillina (Fig. 5 6a). Los inventores descubrieron que la conversion de acido ferulico fue mucho mas lenta usando menos de 5 mM de IPTG (Fig. 5). Sin embargo, los rendimientos de vainillina despues de un tiempo de conversion de 18 h fueron similares (no se muestra). Con respecto a la influencia del tiempo de induccion (Fig. 6a), las mayores tasas de conversion y rendimientos de vainillina se encontraron despues de 6 h de induccion de las enzimas metabolicas.

Adicionalmente, la cantidad de celulas en reposo tambien se vario (5, 10 y 20 x 109 celulas ml-1). Los mejores resultados se apuntaron con la concentracion mas baja de 5 x 109 celulas ml-1 (Fig. 6b). Las concentraciones celulares mas altas llevaron a niveles elevados de alcohol vainillflico y acido vainillflico acompanados de una disminucion en el rendimiento molar de vainillina despues de una conversion prolongada (18 h).

En la presente invencion, los inventores descubrieron que hay un umbral para la produccion de vainillina. Las celulas inducidas y en reposo se incubaron con cantidades crecientes de acido ferulico en el caldo de byconversion (10, 20, 30 y 40 mM). Utilizando hasta 30 mM de acido ferulico, las cepas no produjeron mas de 13,5 mM de vainillina (Fig. 7a). Con acido ferulico 40 mM, no se produjo nada de vainillina. Los mejores rendimientos se lograron utilizando acido ferulico 10 mM para el ensayo de byconversion. La cinetica de crecimiento de las cepas mutantes de P. putida KT2440 en medio m 9 tamponado (pH 7,0) con glucosa y cantidades crecientes de acido ferulico (0 - 50 mM) no mostro influencia de la concentracion de acido ferulico (Fig. 8a).

El efecto del umbral de vainillina se confirmo mediante la incubacion de celulas en reposo con acido ferulico 10 mM y cantidades crecientes adicionales de vainillina (10, 15, 20 y 30 mM). Las celulas incubadas con vainillina 10 mM adicional produjeron solamente vainillina 3,2 mM adicional despues de 18 h (Fig. 7b). Por otra parte, mayores cantidades de vainillina dieron como resultado una ligera disminucion de la concentracion de vainillina y un aumento de las concentraciones de alcohol vainillflico y acido vainillflico. La cinetica de crecimiento de las cepas mutantes de P. putida KT2440 en medio M9 mmimo con glucosa y cantidades crecientes de vainillina (0 - 25 mM) mostro una influencia significativa de la concentracion de vainillina (Fig. 8b). Con hasta 12,5 mM de vainillina, las cepas mostraron un crecimiento moderado. Con mas de 15 mM de vainillina, el crecimiento se hallaba fuertemente impedido.

Ejemplo 5: Delecion de nuevos genes y consecuencias sobre la produccion de vainillina y la formacion de subproductos

Los ensayos de byconversion realizados con GN299 mostraron la formacion de alcohol vainillflico y acido vainillflico que inevitablemente reducen el rendimiento del producto. Por lo tanto, se analizo el efecto de la inactivacion de varios genes potencialmente implicados en el metabolismo del acido ferulico. Los genes elegidos para este enfoque analftico fueron PP_3354 (p-cetotiolasa) y PP_3355 (acil-CoA deshidrogenasa), PP_2680 y PP_0545 (aldehndo deshidrogenasas), y PP_1948 (benzaldehndo deshidrogenasa).

En primer lugar, una segunda via del acido ferulico al acido vainillflico (Fig. 1) propuesta por (Overhage y col., 1999b) se interrumpio en la cepa GN299 mediante la eliminacion combinada de PP_3354 y PP_3355 que codifica una acil-CoA deshidrogenasa y una p-cetotiosa (aat) como se muestra en la Figura 2. La cepa resultante GN347 se utilizo para los ensayos de byconversion (Fig. 4e). Despues de 5 h, se convirtio acido ferulico 9 mM en vainillina 7,7 mM, alcohol vainillflico 1 mM y acido vainillflico 0,2 mM. Despues de 18 h, se convirtieron 0,5 mM de acido ferulico. La concentracion de vainillina disminuyo a 7,5 mM, mientras que el alcohol vainillflico y el acido vainillflico aumentaron ligeramente a 1,4 mM y 0,3 mM, respectivamente. En comparacion con GN299, la tasa de conversion y el rendimiento de vainillina en las primeras 5 h disminuyeron.

Dado que la delecion de vdh no pudo evitar la degradacion de la vainillina en acido vainillflico, otras aldehndo deshidrogenasas pueden catalizar esta reaccion. Desde un enfoque proteomico se pudo demostrar que dos aldetndo deshidrogenasas (codificadas por PP_2680 y PP_0545) y la benzaldehndo deshidrogenasa (PP_1948) estaban reguladas por aumento en P. putida KT2440 que creda en vainillina (Simon, Pfannstiel y Huber, datos en bruto no publicados, manuscrito en preparacion). La inactivacion secuencial de PP_2680 y PP_0545 en GN299 por delecion sin marcador dio como resultado las cepas GN440 y GN441, respectivamente. La benzaldehndo deshidrogenasa tambien puede aceptar vainillina como sustrato, ya que es un derivado del benzaldehndo. Por lo tanto, el gen correspondiente (PP_1948) se elimino en GN441, dando como resultado la cepa GN442. Las cepas mutantes GN440, GN441 y GN442 se utilizaron en ensayos de byconversion (Fig. 4f-h). Las cepas mostraron resultados muy similares. Despues de 4 horas, aproximadamente 9,5 mM de acido ferulico se convirtieron en 8,6 mM de vainillina con celulas en reposo de GN440 y GN441. Las concentraciones medidas de alcohol vainillflico y acido vainillflico fueron aproximadamente 0,8 mM y 0,1 mM, respectivamente. La cepa GN442 mostro los mismos resultados, sin embargo, ya despues de 3 h de conversion. Despues de 18 h de conversion, casi todo el acido ferulico se convirtio con las tres cepas. De nuevo, la concentracion de vainillina disminuyo a 7,9 mM, mientras que el alcohol vainilUlico y el acido vainillfiico aumentaron a aproximadamente 1,5 mM y 0,4 mM, respectivamente.

B. Discusion de los experimentos

En contraste con las cepas AN103 y BF13 de P. fluorescens (Martinez-Cuesta y col., 2005; Di Gioia y col., 2010), los hallazgos de los inventores con P. putida GN235 confirman que la simple inactivacion de vdh no es suficiente para prevenir la degradacion de la vainillina. Esto se ha comunicado anteriormente con un mutante defectivo en vdh de Pseudomonas sp. cepa HR199 y un mutante de Pseudomonas KT2440 (Overhage y col., 1999a; Plaggenborg y col., 2003). KT2440vdhQKm y GN235 aun podfan crecer en vainillina como unica fuente de carbono. La principal diferencia, sin embargo, fue que P. putida GN235 tambien fue capaz de crecer en acido ferulico, debido a una expresion funcional de los genes adyacentes de vdh, a saber, ech y fcs. La delecion limpia de la expresion sostenida de vdh de ech y fcs, que probablemente no fue el caso en el mutante KT2440vdhQKm. Una mutagenesis de transposon aleatoria realizada con GN235 revelo un mutante con un transposon en el locus genetico de modA, que codifica una protema de union a molibdato periplasmica. Se sabe que los iones molibdato desempenan un papel como cofactores en las oxidorreductasas de las especies de Pseudomonas (Koenig y Andreesen, 1990; Blaschke y col., 1991; Frunzke y col., 1993). Dado que la cepa GN276 de AmodABC no pudo crecer en la vainillina como unica fuente de carbono, se puede suponer que el molibdato desconocido que depende de las oxidorreductasas puede aceptar la vainillina como un sustrato que complementa la inactivacion de vdh. La inhibicion de la captacion de molibdato podna inactivar estas enzimas y la vainillina no se oxida a acido vainillflico., que es degradado aun mas. Dado que el acido ferulico no se convirtio completamente con GN276, nuevas mejoras fueron necesarias.

Una expresion concurrente de los genes estructurales ech y fcs en un plasmido de baja copia en una cepa de P. fluorescens negativa para vdh condujo a un rendimiento molar de vainillina de 63 % en 5 h usando celulas en reposo de experimentos en matraz agitados y hasta 84% en 24 h utilizando celulas en reposo de un reactor de tanque agitado (Di Gioia y col., 2010). Para evitar posibles problemas de inestabilidad de plasmidos y uso de antibioticos, el promotor fuerte tac se introdujo en el cromosoma de P. putida GN276 para controlar la expresion de ech y fcs (GN299). Esto mejoro el rendimiento molar de vainillina hasta un 83 % en solo 5 h. Suponemos que el aumento de la tasa de expresion de ech y fcs a traves de la induccion con IPTG condujo a concentraciones mas altas de las enzimas metabolicas codificadas que al utilizar el sistema promotor original. En contraste con el acido ferulico, el inductor IPTG no se metaboliza y las tasas de expresion pueden permanecer en un nivel alto. La reduccion de la cantidad de inductor llevo a una disminucion en el rendimiento del producto y la productividad, lo que puede explicarse por menores concentraciones de enzimas. Tambien se comprobo el efecto del tiempo de induccion, mostrando que menos de 6 h resulto en rendimientos de producto mas bajos, probablemente debido a niveles de enzimas mas bajos. Tambien se verificaron tiempos de induccion mas largos, pero no mejoro los rendimientos del producto (datos no mostrados). El aumento de la concentracion celular en el ensayo condujo a niveles mas altos de los subproductos del acido vainillflico y el alcohol vainillflico y no acelero el tiempo de conversion. Los inventores supusieron que las densidades celulares mas altas se acompanan con niveles mas altos de equivalentes de reduccion que a su vez pueden favorecer la formacion de alcohol vainillflico.

Otras mejoras del procedimiento de conversion demostraron que el aumento de la concentracion de acido ferulico en el caldo de byconversion produce una reduccion del rendimiento molar de vainillina, si se utilizan concentraciones superiores a 10 mM de acido ferulico. Una concentracion de acido ferulico de 40 mM incluso inhibio cualquier conversion a vainillina. Un efecto toxico del acido ferulico, sin embargo, pudo excluirse, como los experimentos de crecimiento con cantidades crecientes de acido ferulico con hasta 50 mM han demostrado.

Por otra parte, P. putida GN299 mostro un umbral de vainillina de aproximadamente 13,5 mM en los ensayos de byconversion. El aumento de la concentracion de vainillina por encima de este umbral llevo a la formacion de mas alcohol vainillflico y acido vainillflico e inhibio la conversion del acido ferulico. Tal inhibicion del producto tambien se observo con cepas de E. coli recombinantes que convierten el acido ferulico en vainillina (Overhage y col., 2003). El caracter toxico de la vainillina se confirmo con experimentos de crecimiento de P. putida GN299 en presencia de concentraciones crecientes de vainillina, donde solo se toleraron hasta 12,5 mM de vainillina. En contraste con P. fluorescens BF13, sin embargo, que mostro una reduccion del 98 % en el rendimiento molar al aumentar la concentracion de acido ferulico de 5 mM a 12,5 mM (Di Gioia y col., 2010), P. putida no mostro tales reducciones sensibles. De hecho, las celulas en reposo de P. putida GN442 se podnan reutilizar despues de la conversion durante 18 h. La distraccion de la vainillina al resuspender las celulas en un nuevo tampon con acido ferulico 10 mM y la incubacion adicional a 30 °C durante 18 h dio como resultado la produccion de vainillina 5 mM (acido ferulico 4,5 mM, 0,5 mM de alcohol vainillflico, 0 mM de acido vainillflico). Por lo tanto, la distraccion inmediata del producto toxico vainillina por las resinas adsorbentes permitina que las celulas de P. putida conviertan mas acido ferulico como podna mostrarse previamente para otros sistemas (Yoon y col., 2007; Hua y col., 2007; Lee y col., 2009).

La inactivacion de la ruta alternativa del acido ferulico al acido vainillflico propuesta por Overhage y col., (1999b) por delecion de PP_3355 (aat) y PP_3354 en GN299 no tuvo ningun efecto positivo en la formacion de la formacion no deseada de los subproductos alcohol vainillflico y acido vainillflico. Se observo que la tasa de conversion incluso disminuyo. Una posible explicacion para este comportamiento podna ser una vida media mas corta del ARNm provocada por la eliminacion de los dos genes y, por lo tanto, un nivel disminuido de las enzimas metabolicas. Sin embargo, la inactivacion de las aldehudo deshidrogenasas reguladas, codificadas por PP_2680 y PP_0545, y la benzaldehudo deshidrogenasa (PP_1948) en GN299 condujo a mayores tasas de conversion iniciales y altos rendimientos molares. Los resultados con esta cepa (GN442) representan la mayor productividad de una cepa de Pseudomonas en la bioconversion de acido ferulico a vainillina encontrada en la literatura hasta el momento. Sin embargo, las deleciones no tuvieron un efecto significativo en la formacion de los subproductos en comparacion con GN299. En experimentos con reactores de tanque agitado, se pudo demostrar previamente que elevar las concentraciones de oxfgeno disuelto no dio lugar a la formacion de mas acido vainillflico, excluyendo un procedimiento de oxidacion qmmica (Di Gioia y col., 2010). Se propuso que otras deshidrogenasas de especificidad de sustrato pueden actuar en cepas de Pseudomonas que aun deben determinarse (Overhage y col., 1999b).

Todos nuestros experimentos de bioconversion mostraron que los tiempos prolongados de bioconversion hasta 18 h redujeron el rendimiento molar de vainillina debido a la formacion de los subproductos. Por lo tanto, una conversion rapida y completa como sea posible del acido ferulico a vainillina es deseable en las primeras horas. La reduccion de la vainillina a alcohol vainillflico parece representar un mecanismo de desintoxicacion, ya que tambien se observo con celulas de E. coli recombinantes que convierten el acido ferulico en vainillina (Overhage y col., 2003). Otro enfoque para reducir la formacion de alcohol vainillflico fue disminuir la cantidad de NADH2 mediante delecion de los genes ^p P_4011 y PP_4012, que codifican la isocitrato deshidrogenasa, como se propuso para E. coli recombinante (Lee y col., 2009).

La sorprendente mejora (rapida y casi completa) conversion de acido ferulico como se observa de acuerdo con la presente invencion en comparacion con los resultados de (Di Gioia y col., 2010) se ilustra mediante los datos de productividad resumidos en la siguiente Tabla 4:

Tabla 4 Comparacion de productividades

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Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento biocatalftico para producir vainillina a partir de acido ferulico,

   en el que se cultiva, en presencia de acido ferulico, una cepa bacteriana modificada por ingeniena genetica del genera Pseudomonas que tiene la capacidad de convertir el acido ferulico en vainillina;

   en el que dicha cepa bacteriana modificada por ingeniena genetica tiene una capacidad reducida para crecer en vainillina como unica fuente de carbono; y

   en el que dicha cepa modificada por ingeniena genetica contiene al menos la siguiente modificacion genetica: i) regulacion por disminucion de la captacion celular de molibdato; y

   ii) regulacion por disminucion de la actividad enzimatica codificada por el gen de la vainillina deshidrogenasa (vdh).

   2. El procedimiento de una de la reivindicacion 1, en el que la captacion celular de molibdato se regula por disminucion regulando por disminucion el gen que codifica una protema de union a molibdato periplasmatica (modA) 3. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que la captacion celular de molibdato se regula por disminucion mediante la delecion de una secuencia de nucleotidos que comprende el operon modABC.

   4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos una de las actividades enzimaticas codificadas por los genes para

   iii) feruloil-CoA sintetasa (fcs) y

   iv) enoil-CoA hidratasa (ech)

   esta regulado por aumento.

   5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que la expresion cromosomica de los genes para la feruloil-CoA sintetasa (fcs) y la enoil-CoA hidratasa (ech) esta regulada por aumento.

   6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que la expresion de los genes para la feruloil-CoA sintetasa (fcs) y la enoil-CoA hidratasa (ech) esta bajo el control de un elemento regulador que comprende un promotor fuerte.

   7. El procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el que adicionalmente al menos una de las siguientes actividades enzimaticas codificadas por los genes

   v) aldefudo deshidrogenasa PP_2680 y/o PP_0545

   vi) benzaldefudo deshidrogenasa PP_1948 esta regulada por disminucion.

   8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que adicionalmente al menos una de las siguientes actividades enzimaticas codificadas por los genes:

   vii) beta-cetotiolasa PP_3355 (aat)

   viii) acil-CoA deshidrogenasa PP_3354.

   esta regulado por disminucion.

   9. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la cepa microbiana que se va a modificar por ingeniena genetica es una cepa de Pseudomonas putida.

   10. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha cepa de Pseudomonas putida esta modificada por ingeniena genetica regulando por disminucion una actividad proteica codificada por el gen para la protema de adhesion superficial (lapA).

   11. El procedimiento de una de las reivindicaciones precedentes, en el que la reaccion se realiza en celulas completas de dichas cepas bacterianas o en un homogeneizado de celulas de las mismas o en una fraccion obtenida de dicho homogeneizado.

   12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha cepa bacteriana se aplica en forma libre o inmovilizada.

   13. El procedimiento de una de las reivindicaciones precedentes se realiza de forma continua o discontinua.

   14. El procedimiento de una de las reivindicaciones precedentes, en el que la vainillina asf formada se afsla del medio de cultivo.

   15. Una cepa de Pseudomonas modificada por ingeniena genetica que contiene una modificacion genetica como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y en la que dicha regulacion por disminucion se logra mediante la delecion de un gen o la alteracion de un gen.