ES2709891T3 - Tomate con vida útil mejorada - Google Patents

Abstract

Planta de tomate que muestra resistencia a paraquat y cuyos frutos tienen una vida útil mejorada en comparación con los frutos de una planta de tomate de tipo silvestre, cuya planta es obtenible mediante introgresión del rasgo de vida útil aumentado a partir del mutante LePQ58 (número de registro del depósito NCIMB 41531) en una planta de tomate con una vida útil normal, en la que la vida útil aumentada comprende un fruto que muestra maduración normal y una firmeza a las 4 semanas después de la cosecha que disminuye, cuando se compara con la etapa de fruto cosechado rojo maduro, en menos de un 50%, preferiblemente en menos de un 43%, más preferiblemente en menos de un 38%, incluso más preferiblemente en menos de un 32%, lo más preferiblemente en menos de un 25% y en la que la planta de tomate no se obtiene exclusivamente mediante un proceso esencialmente biológico.

Description

DESCRIPCION

Tomate con vida util mejorada

Campo de la invencion

La presente descripcion se refiere a una planta de tomate, los frutos de la cual tienen una vida util mejorada en comparacion con los frutos de tomate existentes. La presente descripcion se refiere ademas a la progenie de tales plantas y al material de propagacion para obtener tales plantas con una vida util mejorada. La presente descripcion tambien se refiere a germoplasma que comprende la informacion genomica que lleva al rasgo de vida util mejorada tal como se describe en el presente documento y al uso de este germoplasma.

La produccion comercial de tomate tiene por objeto la productividad combinada con calidad. La calidad puede definirse en distintos terminos como aroma, gusto, textura, sensacion en boca, aspecto, forma, color, solidos solubles, compuestos nutricionales, resistencia a enfermedades y vida util. Durante la maduracion de frutos, estos rasgos de calidad pueden desarrollarse en diversos modos dependiendo de la variedad en combinacion con las condiciones de crecimiento y tratamientos despues de la cosecha. Por lo tanto, el producto final, es decir, el fruto que se consume, es a menudo un compromiso entre todos estos rasgos.

Optimizar los rasgos del desarrollo de frutos contribuye en la rentabilidad del cultivador comercial. El fitomejoramiento ha proporcionado tradicionalmente a los cultivadores variedades cultivadas para una alta productividad. Tales variedades se han seleccionado para permitir al cultivador maximizar la produccion de biomasa de frutos en condiciones medioambientales espedficas.

Sin embargo, recientemente, el mercado fresco del tomate ha cambiado en el sentido de que, ademas de las variedades tradicionales, se demandan productos con rasgos de calidad mejorados como aroma, gusto y textura. Esto ha llevado a la revision de los objetivos de fitomejoramiento hacia rasgos de calidad mejorados que se combinan preferentemente con alta productividad.

Un rasgo clave a este respecto es la vida util. Variedades cuyos frutos cosechados se pueden almacenar durante un penodo mas largo de tiempo sin perder textura ni firmeza pueden cosecharse en una etapa de desarrollo mas tardfa. Esto tiene la enorme ventaja de que los rasgos de calidad pueden desarrollarse durante el crecimiento de la cosecha. Ademas, los frutos que pueden madurarse sin perder textura y firmeza pueden ser de interes para el mercado recien cortado.

El valor combinado de los rasgos de calidad expresados puede diferir sustancialmente entre variedades comerciales. Un obstaculo principal en la mejora de la calidad completa de los frutos de tomate cosechados esta causado por el hecho de que el desarrollo de rasgos de calidad tales como aroma, color y gusto es a menudo incongruente con el deseo de cosechar frutos con una vida util larga. Se requiere una vida util larga para evitar demasiados golpes durante la cosecha y almacenamiento. Puesto que la maduracion del fruto en terminos de coloracion y ablandamiento continua despues de la cosecha, una solucion a este problema se encuentra a menudo cosechando los frutos de tomate en la etapa verde maduro o pinton despues de la cual se vuelven de color rojo durante su almacenamiento. La gran ventaja de tal practica es que los frutos aun estan muy firmes en la cosecha y, por lo tanto, tienen una gran resistencia frente a los golpes. Los frutos llegaran al consumidor con un color rojo y sin ningun dano. Aunque esto resulta una solucion practica a la limitacion de vida util, en casos en los que los productos necesitan almacenarse durante penodos prolongados de tiempo, por ejemplo, cuando hay involucradas largas distancias de transporte, este enfoque aun resulta inadecuado.

Un problema adicional y muy importante es que, aunque la coloracion y el ablandamiento se desarrollan despues de la cosecha, el aroma y el gusto no lo hacen. Por lo tanto, el rasgo de calidad de vida util parece entrar en conflicto con los rasgos de calidad de aroma y gusto. Por lo tanto, es deseable mejorar tomates de tal como que los rasgos de calidad como aroma y gusto puedan desarrollarse antes de la cosecha en combinacion con una vida util larga. Una ventaja adicional de vida util larga en tomate se refiere al insumo laboral requerido para cosechar los frutos. Los frutos con una vida util normal necesitan recolectarse tanto como sea posible en la misma etapa de desarrollo para evitar demasiada variacion con respecto a la calidad despues de la cosecha del fruto debido a la variacion en su madurez. Esto puede ser, a veces, incluso dos veces al dfa. En caso de haber tomates de vida util larga disponibles no hay necesidad de tal intensiva labor de cosecha, independientemente de la etapa de desarrollo en la cosecha, los frutos maduraran y permaneceran firmes. Ademas del insumo laboral reducido, la flexibilidad en tiempo de cosecha permite personalizar la entrega del producto a la demanda del mercado.

Puesto que el etileno es un fuerte estimulador de maduracion, intentos previos para mejorar la vida util de frutos de tomate implican la seleccion de variantes geneticas con frutos que, o bien producen menos etileno, o son menos sensibles al etileno. Esto ha dado como resultado la identificacion de un numero de mutantes de maduracion pleiotropicos con una vida util mejorada que se han caracterizado a distintos niveles de detalle (Giovannoni, J (200a) Current Opinion in Plant Biology 10, 283-289). Por ejemplo, el mutante Nunca-maduro (NR, por sus siglas en ingles) ha mostrado estar mutado en un gen receptor de etileno que dio como resultado insensibilidad al etileno. Debido a esta mutacion, los frutos permanecen firmes durante el almacenamiento despues de la cosecha pero la maduracion y el desarrollo de color y gusto asociados queda bloqueado.

Ademas, se han identificado los mutantes inhibidor-de-maduracion (rin, por sus siglas en ingles), sin-maduracion (nor, por sus siglas en ingles) y sin-maduracion-incoloro (cnr, por sus siglas en ingles) que estan modificados en genes que codifican factores de transcripcion implicados en la produccion de, o respuesta a, etileno.

Aunque los mutantes como rin tienen un determinado valor practico para una mejor vida util, aun existe margen de mejora. En una situacion preferente, debe lograrse una vida util mejorada sin comprometer los rasgos positivos de calidad asociados a la maduracion, como pigmentacion, aroma y textura.

Para el crecimiento y desarrollo de frutos de tomate puede discernirse un numero de fases consecutivas. La fase mas temprana es el desarrollo floral. Despues de la polinizacion como segunda fase, tiene lugar el desarrollo del fruto temprano que se caracteriza por una elevada frecuencia de division celular. Durante la tercera fase, el fruto aumenta rapidamente de tamano principalmente debido a la expansion celular. Al final de la tercera fase el fruto alcanza la etapa de verde maduro. Durante la cuarta fase tiene lugar la maduracion del fruto que se caracteriza por un cambio en color y aroma, asf como firmeza y textura del fruto.

La formacion del caractenstico color rojo del fruto de tomate se debe a la acumulacion de licopeno y caroteno. En general, se distinguen distintas fases de coloracion: verde maduro, pinton, rosado y rojo. La tfpica pigmentacion de color rojo se inicia en la etapa pinton. La etapa de rojo maduro o etapa de fruto cosechado rojo maduro es la etapa en la que el fruto ha alcanzado su color maduro en la mayor parte del fruto. Ademas, la actividad enzimatica lleva a la degradacion de la region laminar media de las paredes celulares lo que lleva a la perdida celular que se manifiesta como ablandamiento y perdida de textura del fruto. El ablandamiento del fruto se mide a menudo como la resistencia externa a la compresion, lo que puede cuantificarse, por ejemplo, mediante un penetrometro.

Estudios moleculares y bioqmmicos detallados han mostrado que actividades como la endo-poligalacturonasa y la pectin-metil-esterasa estan implicadas en el ablandamiento del fruto. La inhibicion antisentido de genes que codifican estas enzimas, en general, no dio como resultado una mejora de la firmeza del fruto, lo que demuestra que otras actividades estan implicadas en el proceso de ablandamiento completo. A este respecto, se han identificado expansinas relacionadas con la maduracion del fruto que estan implicadas en el proceso de ablandamiento del fruto. La inhibicion antisentido de una expansina asociada con la maduracion dio como resultado, de hecho, una pequena reduccion de la tasa de ablandamiento del fruto.

Como alternativa a este enfoque para aumentar la vida util de frutos de tomate, se suprimio la desoxihipusina sintasa (DHS) transgenicamente (Wang, T. et al (2005) Plant Physiology 138, 1372-1382). Los frutos de plantas transgenicas mostraron una maduracion normal en terminos de coloracion, pero una reduccion en ablandamiento y senescencia despues de la cosecha con respecto al nivel de supresion de DHS. Algunos de los eventos estan libres de arrugamiento de la piel del fruto hasta 44 dfas despues de la cosecha del fruto en la etapa pinton. Sin embargo, eventos de DHS suprimida en gran medida mostraron efectos pleiotropicos tales como esterilidad masculina debido al hecho de que la DHS modula varios factores de iniciacion de traduccion 5A (eIF-5A).

Ademas, se ha descrito una mutacion de origen natural denominada Deterioro Retardado del Fruto (DFD) que se caracteriza por una vida util muy larga de hasta meses (Saladie, M. et al (2007) Plant Physiology 144, 1012-1028). Este mutante tiene una alta resistencia a la compresion externa del fruto y una perdida de agua minima pero los tejidos internos experimentan un ablandamiento normal. Esto demuestra que el ablandamiento del tejido del fruto y firmeza del fruto no estan necesariamente unidos.

La conclusion de estos estudios es que probablemente hay distintos procesos fisiologicos implicados en el proceso de ablandamiento del fruto completo. La modificacion de genes unicos conocidos por estar implicados en la maduracion aun no ha dado como resultado un fruto con una maduracion normal, pero sf con ablandamiento de tejido mmimo. La conclusion podna ser que no es fisiologicamente factible modificar la maduracion de este modo. Como alternativa, como hay muchos factores geneticos implicados en el proceso de maduracion, puede requerirse modificar estos genes simultaneamente o el factor cntico aun no se ha identificado.

Como el tomate es un fruto climaterico, la fase de maduracion se caracteriza por una produccion de etileno aumentada y estallido respiratorio. La respiracion es la oxidacion metabolica de azucares que lleva a la liberacion de CO2. Como subproducto de esta actividad respiratoria, se forman especies de oxfgeno reactivas (ROS) que son muy reactivas y pueden causar un dano significativo a las estructuras celulares llevando a estres oxidativo. Se sugiere que las ROS tienen un papel importante en la mejora de la senescencia tanto en hojas como en frutos. Durante la fase climaterica se forman compuestos de aroma (volatiles, azucares, acidos) y de color que aportan al fruto de tomate su tfpico gusto y aspecto.

La fase de senescencia es la fase de maduracion final que se caracteriza por un ablandamiento adicional del tejido del fruto, respiracion aumentada y perdida de agua que facilita adicionalmente la dispersion de semillas. La infeccion por patogenos oportunistas como la botritis se puede producir relativamente de forma facil en esta etapa.

Como el tomate es climaterico, el fruto se puede recoger en la etapa de verde maduro o pinton/rosado despues de la cual, los procesos de coloracion y ablandamiento continuan teniendo lugar despues de la cosecha. Si se requiere, los frutos inmaduros cosechados pueden exponerse a etileno exogeno para aumentar el proceso de maduracion. Dado el importante papel de estimulacion del etileno en el proceso de maduracion, se han centrado los esfuerzos de aumentar la vida util en la biosmtesis de etileno, percepcion o genes efectores para ralentizar la maduracion del fruto. Tanto mediante la seleccion de variacion natural, asf como mediante ingeniena genetica se han modificado componentes de etileno exitosamente, lo que ha dado como resultado una vida util extendida mediante la ralentizacion del proceso de maduracion. Es lado negativo de tal enfoque es que los rasgos de calidad deseables relacionados con la maduracion del fruto tambien se desarrollan mas lentamente.

Por lo tanto, es objeto de la invencion proporcionar rasgos que extiendan la vida util de los frutos evitando o inhibiendo la senescencia del fruto pero que permitan finalizar los procesos de maduracion tanto como sea posible. La senescencia es un proceso de desarrollo de origen natural al final del ciclo de vida de una planta o un organo vegetal tal como una hoja o un fruto. Factores de estimulacion bien conocidos de la senescencia son la edad de desarrollo, laceracion, desprendimiento, oscuridad, deficiencia nutricional y hormonas. Aunque el etileno es la hormona vegetal conocida por estimular la senescencia, otras hormonas como el jasmonato tambien pueden contribuir en este proceso. Durante la etapa final del desarrollo de la hoja, el metabolismo se reprograma para volver a movilizar los recursos en estructuras reproductivas como semillas.

El amarilleo de las hojas que es el smtoma mas visible de senescencia es una consecuencia de la desintegracion de la clorofila durante una etapa relativamente tardfa de la senescencia que puede aumentarse mediante etileno una vez que la hoja es receptiva. La senescencia tambien se considera la etapa terminal de la maduracion del fruto. El proceso se caracteriza por ablandamiento del tejido extensivo, perdida de agua y deterioro que pueden servir como dispersion de semillas. Ademas de la biosmtesis y respuesta de etileno, el metabolismo despues de la cosecha de fruto suelto se caracteriza por un fuerte aumento de respiracion que, como consecuencia, lleva a la produccion de especies de oxfgeno reactivas (ROS).

El estres oxidativo se conoce por contribuir significativamente con la senescencia, pero en comparacion con el etileno no se ha estudiado exhaustivamente en cuanto a maduracion de fruto. Un estudio describe una correlacion de deterioro de fruto y nivel de enzimas que eliminan ROS, lo que al menos sugiere un papel funcional de estas enzimas en la senescencia de fruto (Mondal, K. et al (2004) Biologia Plantarum 48, 49-53).

El metodo usado para desarrollar el nuevo tomate de la presente invencion se refiere a la inhibicion de senescencia seleccionando plantas con un nivel mas alto de resistencia a estres oxidativo causado por el herbicida paraquat. Dado la compleja regulacion especial y temporal de la senescencia se puede esperar que haya muchos genes reguladores y efectores implicados en la senescencia. Aunque estudios geneticos han descubierto un numero de genes implicados tanto en la senescencia de hoja como de fruto, la mayona de los factores geneticos implicados en la senescencia permanecen actualmente aun sin conocer. Por lo tanto, se razono que se necesita un enfoque mas imparcial para ser mas exitoso a este respecto. Tal enfoque comprende la exposicion de poblaciones que contienen variantes geneticas a estres oxidativo.

Se aplico estres oxidativo mediante aplicacion del herbicida paraquat (dicloruro de N,N'-Dimetil-4,4'-bipiridinio). El paraquat tiene un potencial redox bajo y, por lo tanto, se reduce facilmente cuando se aplica a plantas. Esto da como resultado la formacion de un ion radical de paraquat que genera radicales de superoxido. Los radicales de superoxido causan significativo dano oxidativo y finalmente muerte celular. Se anticipo que las plantas que son resistentes al paraquat y tienen un alto nivel de resistencia al estres oxidativo tambien tendran una vida util mejorada.

En la investigacion que llevo a la invencion, se selecciono una poblacion mutante, de este modo, aplicando el herbicida de paraquat. Se identifico en esta un nuevo mutante que mostro resistencia a paraquat y se encontro una mejor vida util en plantas de tomate de tipo silvestre.

De este modo, la invencion se refiere a una planta de tomate que muestra resistencia a paraquat y los frutos de la cual tienen una vida util mejorada en comparacion con los frutos de una planta de tomate de tipo silvestre, cuya planta es obtenible mediante introgresion del rasgo de vida util mejorado a partir del mutante LepQ58 (numero de registro de deposito NCIMB 41531) en una planta de tomate con una vida util normal, en la que la vida util aumentada comprende un fruto que muestra maduracion normal y una firmeza a las 4 semanas despues de la cosecha que disminuye, cuando se compara con la etapa de fruto cosechado rojo maduro, en menos de un 50%, preferiblemente en menos de un 43%, mas preferiblemente en menos de un 38%, incluso mas preferiblemente en menos de un 32%, lo mas preferiblemente en menos de un 25% y en la que la planta de tomate no se obtiene exclusivamente mediante un proceso esencialmente biologico.

El rasgo de vida util mejorado de la invencion se define en el presente documento como una firmeza de fruto cosechado rojo maduro que aumenta en al menos un 31%, preferiblemente en al menos un 42%, mas preferiblemente en al menos un 52%, incluso mas preferiblemente en al menos un 60%, lo mas preferiblemente en al menos un 70% en comparacion con un fruto que tiene antecedentes geneticos similares que carece del rasgo de la invencion.

Ademas, los frutos de la invencion muestran una maduracion normal, por la que la coloracion a su ritmo e intensidad son similares a las del control. La firmeza del fruto es una resistencia a la compresion externa y se mide con un penetrometro, preferiblemente el modelo FT327, QA Supplies, Norfolk Virginia, tal como se describe en los ejemplos. Una planta de tomate de "tipo silvestre" es una planta de tomate cuyo fruto no porta el rasgo de la invencion. Un control es una planta de tomate que tiene los mismos o similares antecedentes geneticos aparte del rasgo de la invencion. Maduracion normal, tal como se usa en la presente solicitud, significa que la coloracion a su ritmo e intensidad son similares a la del control.

En la presente solicitud, las palabras "mejorado", "aumentado" y "extendido" tal como se usan junto con la palabra "vida util" son intercambiables y todas significan que tiene una mejor vida util, tal como se expresa en una firmeza de fruto cosechado en rojo maduro que es al menos un 31% mas firme que un fruto que tiene antecedentes geneticos similares y/o una firmeza a las 4 semanas despues de la cosecha que disminuye en menos de un 50% y una maduracion similar a la del control.

"Introgresion" del rasgo tal como se usa en la presente solicitud significa que el rasgo se transfiere desde un progenitor a una planta progenie. Dependiendo de la herencia del rasgo, la planta progenie puede ser una planta de primera o futura generacion. Es un prerrequisito, sin embargo, que la planta progenie haya adquirido realmente el rasgo de la invencion y, de este modo, expresa fenotfpicamente el rasgo de vida util mejorado. Esto puede someterse a ensayo manteniendo los frutos de tomate producidos por las plantas progenie durante al menos 4 semanas despues de la cosecha y sometiendo a ensayo la firmeza y coloracion del fruto tal como se ha descrito anteriormente.

En el presente documento se describen adicionalmente plantas o partes de plantas, que tienen en su genoma informacion genetica que es responsable de la extension de la vida util y se encuentra en el genoma de la planta de tomate LePQ58, las semillas de la cual se depositan en el NCIMB con el numero de registro 41531.

En el presente documento se describen adicionalmente las semillas de la planta de tomate de la invencion y partes de la planta. En una realizacion, las partes de la planta son adecuadas para la reproduccion sexual. Tales partes se seleccionan, por ejemplo, del grupo que consiste en microesporas, polen, ovarios, ovulos, sacos embrionarios y ovocitos. Ademas, se describen partes de planta en el presente documento que son adecuadas para la reproduccion vegetativa, en particular, esquejes, rafces, tallos, celulas, protoplastos.

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente descripcion proporciona un cultivo tisular de la planta de tomate de la invencion. El cultivo tisular comprende celulas regenerativas. Tal cultivo tisular puede derivarse de hojas, polen, embriones, cotiledon, hipocotilos, celulas meristematicas, rafces, puntas radiculares, anteras, flores, semillas y tallos. De acuerdo con otro aspecto, la presente divulgacion proporciona plantas de tomate que tienen la misma o similar vida util aumentada como plantas de tomate de la invencion, de las cuales se deposito semilla representativa en el NCIMB Numero de registro NCIMB 41531, cuyas plantas se cultivan a partir de semillas de planta de la invencion o regeneradas a partir de plantas de esta, o a partir de un cultivo tisular.

La invencion tambien se refiere a la progenie de la planta de tomate de la invencion, cuya progenie produce frutos que tienen la vida util aumentada. Tal progenie puede producirse mediante reproduccion sexual o vegetativa de una planta de la invencion o una planta progenie de esta. La planta regenerada tiene la misma o similar vida util extendida como la planta reivindicada, de la cual se deposito semilla representativa en el NCIMB con el numero de registro NCIMB 41531. Esto significa que tal progenie tiene las mismas caractensticas que las reivindicadas para la planta de tomate de la invencion, es decir, la vida util aumentada. Ademas de esto, la planta puede modificarse en una u otras mas caractensticas. Tales modificaciones adicionales, por ejemplo, se efectuan mediante mutagenesis o mediante transformacion con un transgen.

Adicionalmente, la descripcion describe la mejora de plantas de tomate que muestra una vida util mejorada debido a genes de vida util larga conocidos, pero que disminuyen en aspectos relacionados con la maduracion tales como maduracion lenta e intensidad de color reducida en comparacion con frutos de tomate de tipo salvaje, haciendolo distintos del rasgo de la invencion.

La diferencia entre al rasgo de vida util mejorado de la invencion y otros genes de vida util pueden, junto con ls observacion fenotfpica de diferencia en habito de maduracion, establecerse geneticamente de forma sencilla llevando a cabo un ensayo de alelismo. Esto comprende el cruce de los dos eventos, que ser o se debe hacer homocigotico y determinando el fenotipo del tubrido resultante, asf como la posterior generacion de F2. En caso de alelismo de los eventos, la vida util mejorada resultara aparente en todas las plantas tanto del F1 como F2, es decir, el rasgo no se segregara. En caso de que los fenotipos se determinan mediante loci distintos, este no sera el caso, y en el F1 y/o F2 se observara segregacion.

En el presente documento se describe adicionalmente una planta de tomate que muestra vida util mejorada, obtenible mediante cruce de un primera planta parental de tomate con una segunda planta parental de tomate, en la que uno de los progenitors es una planta cultivada a partir de las cuales se ha depositado una muestra representativa en el NCIMB con el numero de registro 41531, o una planta progenie de esta, y seleccionando a partir de la progenie las plantas de tomate cruzadas que muestran vida util mejorada. La progenie a partir de la cual se realiza la seleccion es adecuadamente la progenie F2.

Esta descripcion describe ademas semilla hubrida y un metodo para producir semilla hubrida que comprende una primera planta parental con una segunda planta parental y cosechar la semilla hubrida resultante, en la que dicha primera planta parental o dicha segunda planta parental es la planta de la invencion. En caso de que el rasgo sea recesivo, ambas plantas parentales necesitan ser homocigoticas para el rasgo de vida util mejorada para que la semilla hubrida porte el rasgo de la invencion. No necesitan ser uniformes para los otros rasgos.

En una realizacion, la invencion se refiere a una planta de tomate que comprende el rasgo de vida util mejorada, cuya planta es obtenible mediante:

a) cruce de una planta, cuya semilla representativa se deposito con el NCIMB con el numero de registro NCIM 41531, con una planta que no muestra el rasgo para obtener una poblacion F1;

b) autofertilizacion de plantas a partir de la poblacion F1 para obtener una poblacion F2;

c) seleccion en dicha F2 de plantas que muestran resistencia al paraquat y producen frutos que tienen la vida util mejorada tal como se ha definido anteriormente; y

d) repeticion opcional de las etapas b) y c).

Resulta claro que el progenitor que proporciona el rasgo de la invencion no es necesariamente una planta cultivada directamente a partir de las semillas depositadas. El progenitor tambien puede ser una planta de progenie de la semilla o una planta de progenie de las semillas que se identifican por tener la informacion genetica del rasgo de la invencion por otros medios, tales como marcadores moleculares.

La progenie de las plantas tal como se reivindican tambien forma parte de la presente invencion. "Progenie" tal como se usa en el presente documento pretende abarcar todas las plantas que tienen la misma extension de vida util o una similar que las plantas originales descritas en el presente documento y que se obtienen a partir de esta de cualquier modo, tal como mediante cruce, cultivo de haploides, fusion protoplastos u otras tecnicas. Tal progenie no es solo la primera sino tambien todas las generaciones futuras siempre y cuando se retenga la extension de vida util. Tambien se describe en el presente documento germoplasma y el uso de germoplasma que contiene regiones genomicas que confieren la vida util aumentada de la invencion para la introgresion en otro germoplasma en un programa de fitomejoramiento.

Semillas representativas de la nueva planta de tomate (lolaxun lycoperslcun) se depositaron el 17 de diciembre de 2007 con el NCIMB Ltd., Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA Escocia, Reino Unido y con el numero de registro NCIMB 41531.

La presente invecion se ilustrara adicionalmente en los Ejemplos que siguen, que no estan previstos para limitar la invencion de ningun modo.

La invencion se ilustra en las siguientes figuras:

La Figura 1 muestra un ejemplo de un mutante M2 de tomate que ha sobrevivido al tratamiento usando paraquat. Las plantas que lo rodean han muerto completamente por el herbicida.

La Figura 2 es un ejemplo de una seleccion de progenie M3 de mutantes M2 de tomate que ha sobrevivido al tratamiento usando paraquat. En esta imagen se muestran tres bloques de plantas. A la derecha se muestra una poblacion mutante completamente sensible (LePQ28) que ha sido completamente destruida por el paraquat. En la mitad se muestra una poblacion M3 completamente resistente (LePQ19) de las cuales las plantas tienen un habito normal y que han sobrevivido al tratamiento con paraquat. A la izquierda se muestra una poblacion M3 resistente (LePQ15) de la cual las plantas han sobrevivido al tratamiento con paraquat pero que tienen un fenotipo blanqueado empequenecido.

La Figura 3 muestra un ensayo de hoja desprendida para determinar la tasa de senescencia de los mutantes de tomate resistentes al paraquat. 1: control en peso, 2: LePQ19, 3: LePQ37, 4: LePQ48, 5: LePQ58, 6: LePQ96. La Figura 4 muestra la diferencia en color verde de frutos verde maduro de LePQ48 (izquierda), LePQ58 (medio) y LePQ96 (derecha).

La Figura 5 muestra el ensayo de vida util de frutos de tomate de plantas de control (1) y fruto de mutantes LePQ19 (2), LePQ49 (3), LePQ58 (4)y LePQ96 (5). Los frutos se cultivaron en la etapa de rojo maduro. La imagen se ha tomado despues de 56 dfas de almacenamiento de los frutos a temperatura ambiente.

Ejemplos

Ejemplo 1

Modificacion genetica de tomate usando ems

Se incubaron aproximadamente 5.000 semillas de lmea de tomate TO 029 (tomate redondo) en solucion aireada de ems, bien al 0,05% (p/v) o bien al 0,07% (p/v), durante 24 horas a temperatura ambiente. Despues del tratamiento con ems las semillas M1 se aclararon en agua y se plantaron en un invernadero a 24 °C con un regimen de 16 horas de luz, 8 horas de oscuridad para cultivar las plantas maduras e inducir la floracion para producir semillas M2.

Despues de su maduracion, se cosecharon las semillas M2, se masificaron y almacenaron hasta un uso posterior. La frecuencia de mutacion se estimo sobre la base del numero relativo de plantas individuales con un fenotipo blanqueado que se ven alteradas en la biosmtesis de clorofila.

Ejemplo 2

Seleccion de mutantes de tomate resistentes al paraquat

Se sembraron semillas M2 en suelo abonado y se cultivaron plantulas hasta que brotaron las primeras verdaderas hojas. En esta etapa, las plantas se pulverizaron con una dosis de paraquat que es letal para plantas de tomate que son sensibles. Dependiendo de las condiciones, pero en general, despues de 3 dfas, se hicieron visibles los primeros smtomas necroticos sobre las hojas. Aproximadamente 7 dfas despues del tratamiento con herbicida, las plantas de tomate sensibles son completamente necroticas. En esta etapa, las plantas mutantes que sobrevivieron se macaron y consideraron presuntamente resistentes al paraquat. Se selecciono un numero total de 40.000 plantas M2 lo que dio como resultado 29 mutantes resistentes al paraquat putativos (Figura 1).

Las plantas de tomate presuntamente resistentes al paraquat se cultivaron hasta su madurez para producir semillas M3 mediante la autofertilizacion.

Ejemplo 3

Ensayo de progenie M3 de mutantes M1 de tomate presuntamente resistentes al paraquat

Se cosecharon semillas M3 a partir de las 29 plantas de tomate presuntamente resistentes al paraquat. Para cada mutante, se sembraron 32 semillas en suelo abonado y se cultivaron plantulas en el invernadero usando condiciones de crecimiento de tomate estandar. Depues de la aparicion de las primeras hojas verdaderas, las plantas se pulverizaron con una dosis de paraquat que es letal para plantas de tomate de control que son sensibles al paraquat. La progenie que contema plantas resistentes al paraquat se considero que se obtema a partir de verdaderos mutantes M2 resistentes al paraquat.

Se observaron algunas diferencias en respuesta y fenotipo entre las distintas poblaciones de M3 tal como se ilustra en la Figura 2. Algunas plantas de progenie mostraron un fenotipo completamente resistente y algunas se volvieron sensibles. Otro grupo de progenie mostro un fenotipo blanqueado empequenecido. La progenie que mostro un fenotipo completamente sensible se asume que proviene de una planta M2 que sobrevivio al tratamiento con paraquat que no fue el resultado de una mutacion. De las 29 poblaciones de M3, 6 mostraron fenotipo empequenecido y blanqueado, pero de las cuales todas sobrevivieron al tratamiento con paraquat. De las otras 23 poblaciones de M3, 5 poblaciones conteman plantas que estaban sobreviviendo al tratamiento. Todos los otros eventos fueron sensibles.

Los 5 eventos de tomate resistentes al paraquat que mostraron un habito de planta normal se considero que proveman de una mutacion en los mutantes ^m2 que permitio una supervivencia despues del tratamiento herbicida. Estos eventos se marcaron: LePQ19, LePQ37, LePQ48, LePQ58 y LePQ96.

Ejemplo 4

Ensayo de senescencia de la hoja de mutantes de tomate resistentes al paraquat

Para evaluar si los mecanismos de resistencia al paraquat que se han seleccionado a partir de la poblacion mutante tienen un efecto sobre la senescencia de la hoja, se llevo a cabo un ensayo de la hoja deprendida. Se cultivaron en el invernadero plantas M3 de los 5 mutantes resistentes al paraquat distintos y una planta de control de tipo silvestre (lmea de partida para la poblacion mutante). Cuando las plantas empezaron a florecer, se deprendieron 8-10 hojas de las plantas y se incubaron en un recipiente cerrado en oscuridad a temperatura ambiente. Para evitar que las hojas se secaran, las hojas se colocaron en algodon en rama saturado con agua.

Despues de una incubacion de dos semanas la senescencia de las hojas desprendidas se volvio evidente. Uno de los eventos del paraquat, es decir: LeePQ58 mostro un retraso en el amarilleo de las hojas lo que indica una respuesta de senescencia reducida (Figura 3).

Ejemplo 5

Caractenstica de fruto verde natural de mutantes de tomate resistentes al paraquat que muestran una senescencia de hoja reducida

Se compare el efecto de las distintas mutaciones de resistencia al paraquat en tomate con respecto a su grado de verdeo durante la fase de expansion del fruto de desarrollo del fruto. Frutos verdes maduros del mutante LePQ58 mostraron una clara diferencia con respecto al tipo silvestre y otros mutantes resistentes al paraquat con respecto a la intensidad del color verde que desarrollaron los frutos. Los frutos LePQ58 mostraron un color verde mas oscuro en la fase de verde maduro que los controles de tipo silvestre y los otros mutantes resistentes al paraquat tal como se muestra en la Figura 4.

Ejemplo 6

Vida util de fruto de mutantes de tomate resistentes al paraquat

Para evaluar si los mecanismos de resistencia al paraquat que se han seleccionado a partir de la poblacion mutante tienen un efecto sobre la senescencia del fruto, se llevo a cabo un ensayo de vida util. Se cultivaron en el invernadero plantas M3 de los 5 mutantes resistentes al paraquat distintos y una planta de control de tipo silvestre (lrnea de partida para la poblacion mutante).

Despues de que se hubiera producido el cuajado del fruto y fases iniciales de maduracion del fruto se recogieron los frutos de la planta en la tapa de rojo maduro y se almacenaron a temperatura ambiente. Los frutos recogidos de las plantas de control y los mutantes LePQ19, LePQ37, LePQ48, LePQ96 empezaron a ablandarse despues de aproximadamente l4 dfas de almacenamiento mientras que los frutos de LePQ58 permanecieron firmes durante todo este penodo. El almacenamiento prolongado resulto en un encogimiento adicional del fruto, agrietamiento de la piel y la aparicion de infecciones fungicas de origen fortuito. Los frutos del mutante LePQ58 no mostraron ningun signo de ablandamiento despues de un penodo de 56 dfas (Figura 5).

Por lo tanto, se concluyo que el mutante LePQ58 tiene una vida util aumentada del fruto cuando se cosecha en la fase de rojo maduro en comparacion con el control LePQ19, LePQ37, LePQ48 y LePQ96.

Ejemplo 7

Firmeza de fruto despues de la cosecha del mutante LePQ18 de tomate de vida util larga

Se cultivaron plantas de LePQ58 mutante y un control negativo en el invernadero para producir frutos para determinar la firmeza de fruto despues de la cosecha. Como control negativo se usan plantas de la misma poblacion que la que se aislo a partir del mutante LePQ58 pero que son sensibles al paraquat. Se cosecharon frutos en la etapa de rojo maduro y se almacenaron durante el experimento a 21 °C en el invernadero. Directamente despues de la cosecha, asf como 4 y 6 semanas despues de la cosecha se determino la firmeza de los frutos usando un penetrometro (modelo FT327, QA Supplies, Norfolk Virginia). Para cada medicion se uso un numero de frutos para determinar la presion (Kg/cm2) requerida para ser impuesta por el penetrometro para romper la piel del fruto. Tal medicion se considera que refleja la firmeza del fruto completa. Los resultados se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1

Determinacion de firmeza de fruto despues de la cosecha para LePQ58. Se determino a las 0, 4, 6 semanas despues de la cosecha la firmeza de LepQ58 y frutos de control expresados en Kg/cm2 usando un penetrometro. Se proporciona el valor promedio del numero indicado de frutos

Los resultados muestran que los frutos cosechados a partir de LePQ58 son capaces de resistir presiones superiores impuestas por el penetrometro en todos los puntos de tiempo despues de la cosecha, es decir, 0, 4 y 6 semanas, de lo cual se puede deducir que los frutos de LePQ58 tienen una firmeza superior en comparacion con el control negativo. Se muestra adicionalmente que el declive en firmeza del fruto durante el penodo de almacenamiento despues de la cosecha es inferior para frutos de LePQ58 que para frutos del control negativo. Como la coloracion de los frutos de LePQ58 y el control negativo son similares tanto en ritmo como intensidad se concluye que LePQ58 es un mutante de maduracion firme.

En un segundo experimento, la firmeza del fruto de LePQ58 se comparo con la firmeza del fruto de una variedad hforida de F1 denominada Mecano. Mecano produce frutos de maduracion firmes y se considera el estandar de mercado con respecto a vida util.

Se determinaron los frutos cosechados de LePQ58, Mecano y el control negativo con respecto a su firmeza despues de la cosecha despues de 4 semanas de almacenamiento usando el penetrometro tal como se ha descrito anteriormente. Los resultados se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2

Determinacion de firmeza de fruto despues de la cosecha para LePQ58 en comparacion con el Mecano hforido F1. Se determino a las 4 semanas despues de la cosecha la firmeza de LePQ58, Mecano y frutos de control expresados en Kg/cm2 usando un penetrometro. Se proporciona el valor promedio del numero indicado de frutos.

Los resultados muestran que el LePQ58 tiene una firmeza del fruto superior 4 semanas despues de la cosecha en comparacion con los frutos de Mecano. Los frutos de Mecano, por el otro lado, tienen una firmeza del fruto alta en comparacion con el control negativo. A partir de este experimento se concluye que los frutos de LePQ58 tienen una firmeza despues de la cosecha superior en comparacion con el estandar de mercado actual.

Ejemplo 8

Perdida de peso de fruto despues de la cosecha del mutante LePQ18 de tomate de vida util larga

La perdida de peso como resultado de la evaporacion se considera un rasgo de calidad importante de frutos de tomate almacenados. Se cosecharon frutos del mutante LePQ58, asf como el control negativo en la etapa de rojo maduro y se almacenaron durante el experimento a 21 °C. Como control negativo se usaron plantas de esta poblacion de la cual se aislo el mutante LePQ58 pero que son sensibles al paraquat. Se determino el peso en fresco de 4 frutos de LePQ58 y el control negativo directamente despues de su cosecha y despues de 4 semanas de almacenamiento. El resultado del experimento se resume en la Tabla 3.

Tabla 3

Determinacion de perdida de peso de fruto despues de la cosecha para LePQ58 en comparacion con el control negativo. Se determino a las 0 y 4 semanas despues de la cosecha el peso en fresco de los frutos de LePQ58 y el control negativo

Los resultados muestran que los frutos de LePQ58 perdieron un 13% de su peso en fresco durante 4 semanas de almacenamiento de temperatura ambiente mientras que los frutos de control negativo perdieron un 50% de su peso en fresco. Por lo tanto, el mutante LePQ58 se considera que ha mejorado en gran medida con respecto a su resistencia a la perdida de peso despues de la cosecha debido a la evaporacion.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Planta de tomate que muestra resistencia a paraquat y cuyos frutos tienen una vida util mejorada en comparacion con los frutos de una planta de tomate de tipo silvestre, cuya planta es obtenible mediante introgresion del rasgo de vida util aumentado a partir del mutante LePQ58 (numero de registro del deposito NCIMB 41531) en una planta de tomate con una vida util normal, en la que la vida util aumentada comprende un fruto que muestra maduracion normal y una firmeza a las 4 semanas despues de la cosecha que disminuye, cuando se compara con la etapa de fruto cosechado rojo maduro, en menos de un 50%, preferiblemente en menos de un 43%, mas preferiblemente en menos de un 38%, incluso mas preferiblemente en menos de un 32%, lo mas preferiblemente en menos de un 25% y en la que la planta de tomate no se obtiene exclusivamente mediante un proceso esencialmente biologico.

2. Planta de tomate tal como se reivindica en la reivindicacion 1, en donde la vida util aumentada comprende adicionalmente un fruto que muestra maduracion normal que tiene una firmeza de fruto cosechado rojo maduro que aumenta en al menos un 31%, preferiblemente en al menos un 42%, mas preferiblemente en al menos un 52%, incluso mas preferiblemente en al menos un 60%, lo mas preferiblemente en al menos un 70% en comparacion con un fruto que tiene antecedentes geneticos similares que carece del rasgo de la invencion.

3. Una planta de tomate que comprende el rasgo de vida util mejorado tal como se reivindica en la reivindicacion 1 o 2, cuya planta es obtenible mediante:

a) cruce de una planta, cuya semilla representativa se deposito con el NCIMB con el numero de registro NCIM 41531, con una planta que no muestra el rasgo para obtener una poblacion F1;

b) autofertilizacion de plantas de la poblacion FI para obtener una poblacion F2;

c) seleccion en dicha F2 de plantas que muestran resistencia al paraquat y producen frutos que tienen la vida util mejorada tal como se ha definido en la reivindicacion 1 o 2; y

d) repeticion opcional de las etapas b) y c).

4. Fruto de tomate de una planta tal como se reivindica una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Progenie de una planta tal como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, cuya progenie produce frutos que tienen la vida util aumentada tal como se define en la reivindicacion 1 o 2.

6. Material de propagacion de una planta tal como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde una planta de tomate regenerada a partir del material de propagacion produce frutos que tienen la vida util aumentada tal como se define en la reivindicacion 1 o 2.

7. Material de propagacion tal como se reivindica en la reivindicacion 6, en donde el material se selecciona entre microesporas, polen, ovarios, ovulos, embriones, sacos, ovocitos, esquejes, rafces, tallos, celulas, protoplastos, cultivos tisulares que comprenden celulas regenerativas, en particular que proviene de hojas, polen, embriones, cotiledon, hipocotilos, celulas meristematicas, rafces, puntas radiculares, anteras, flores, semillas y tallos.