ES2926041T3 - Ensalada de maíz tetraploide - Google Patents

Abstract

La solicitud se refiere al campo del fitomejoramiento, en particular al mejoramiento de ensalada de maíz (Valerianella locusta). Se proporcionan plantas de ensalada de maíz tetraploides (y semillas de las que se pueden cultivar estas plantas) y hojas de ensalada de maíz que son más gruesas y compactas que las plantas de ensalada de maíz diploides de las que se deriva el tetraploide. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Ensalada de maíz tetraploide

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con el campo de la reproducción y mejora de plantas. Se proporcionan plantas tetraploides de ensalada de maíz (Valerianella locusta (L.) Betcke) que tienen características mejoradas, así como métodos para hacer plantas tetraploides de ensalada de maíz a partir de plantas diploides. También se proporcionan semillas a partir de las cuales se pueden cultivar plantas tetraploides, así como partes de plantas tetraploides cosechadas, procesadas y/o embaladas (por ejemplo, hojas), plántulas o plantas enteras.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Ensalada de maíz (o canónigos), Valerianella locusta (L.) Betcke (sinónimo antes Valerianella olitoria (L.) Poll.; fam. Valerianaceae) es una hortaliza de hoja que se cultiva en varios países europeos, tales como los Países Bajos, Italia, Alemania y Francia, así como en partes de Norteamérica y Australia. La V. locusta silvestre es nativa de Europa, Asia occidental templada y partes del norte de África. De las casi 80 especies clasificadas en el género Valerianella, sólo V. locusta se cultiva para el consumo humano. Las hojas o plantas enteras o plántulas enteras se utilizan en ensaladas frescas, a menudo mezcladas con hojas de lechuga (Lactuca sativa) y/u otras verduras frescas (por ejemplo, hojas de rúcula - Eruca sativa, berro de agua, berro de jardín, berro Raphanus como en el documento EP1290938B1etc.). La producción se lleva a cabo tanto en cultivo en invernadero como en campo, opcionalmente bajo cubierta (por ejemplo, túneles de plástico o mallas de sombra). También se han descrito sistemas de cultivo sin suelo y sistemas de cultivo hidropónico (véase, por ejemplo, Fontana y Nicola, 2009, J of Food, Agriculture and Env. Vol. 7: 405-410 o Benoit, F. y Ceustermans, N. 1989. Acta Hort. (ISHS) 242:297-304).

La producción es posible durante todo el año, con numerosas variedades que se adaptan a condiciones climáticas específicas, por ejemplo, en verano o en invierno.

Las plantas producen rosetas, presentando hasta 8 pares de hojas opuestas, estando cada par en ángulo recto con el par anterior. Generalmente se distinguen variedades de hoja larga y de hoja corta (tipo "roseta"). Los objetivos de mejora en la ensalada de maíz apuntan principalmente a la producción de líneas o variedades del tipo roseta, con hojas redondas y de color verde oscuro, debido a la preferencia de los consumidores. La ensalada de maíz también se conoce como canónigos. Es un cultivo autógamo (autofecundado), diploide (el número de cromosomas no está claro; se han reportado números de 2n = 14, 16 y 18, siendo 2n = 16 el reporte más común, ver Love y Kjellqvist 1974, Lagascalia 4:153-211), con una estrecha base genética en el germoplasma de cría actualmente disponible (Muminovic et al. 2004, Plant Breeding 123: 460-466). La memoria descriptiva que sigue se referirá a 2n = 16, pero se entiende que las realizaciones se aplican igualmente en caso de que 2n resulte ser un número diferente, por ejemplo, 14 o 18.

La cosecha de las hojas de ensalada de maíz o de las plantas enteras puede comenzar a partir de aproximadamente 25 a 110 días después de la siembra, dependiendo de la variedad, pero principalmente de las condiciones de crecimiento (véase, por ejemplo, Peron y Rees, Acta Hort. 467, ISHS 1998, tabla 3 en la página 264). Además, la transformación y el embalado posteriores a la cosecha determinan el tiempo de cosecha. En el caso de las bolsas (de plástico) selladas, por ejemplo, la cosecha puede ser cuando las plantas tienen aproximadamente 3-4 pares de hojas, mientras que para la venta en cestas (de plástico) o paquetes sellados pueden estar presentes aproximadamente 4-6 pares de hojas, y para la venta en bandejas abiertas aproximadamente 7-8 pares de hojas. La recolección puede ser manual y/o mecanizada, seguida de una limpieza manual y/o mecánica (mediante una serie de lavadoras o enjuagadoras) y del embalaje (Peron y Rees, Acta Hort. 467, ISHS 1998, pp259-268 Geyer y Herppich, Gemuese, 1999 Vol. 35, 657-660(Feldsalat schonend, qualitatsgerecht und hygienisch aufbereiten).

Las hortalizas de hoja tales como la ensalada de maíz deben estar frescas y turgentes para atraer a los consumidores, sin amarillear, dañar o pudrirse (que a menudo se desarrolla como resultado de daños en los tejidos). Por lo tanto, el daño mínimo durante la cosecha y el procesamiento postcosecha y la larga vida útil son importantes para la comercialización. Igualmente, la sensación en boca (crujiente) es un criterio de calidad importante.

El documento WO99/03329 divulga la lechuga multihoja diploide y la lechuga de cordero, en la que las plantas tienen un número sustancialmente mayor de hojas, pero el tamaño de la planta de lechuga de cordero es comparable al de las plantas normales de lechuga de cordero (véase el Ejemplo 3).

El documento US2009/176227 se refiere a un método para la producción de plantas poliploides de orquídeas utilizando esquejes y cultivo de tejidos.

El documento US2006/143741 se refiere a una variedad tetraploide de Ryegrass Perenne, denominada T3.

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que la tetraploidización de las variedades o líneas de cultivo de ensalada de maíz puede utilizarse para obtener plantas de ensalada de maíz que tengan hojas significativamente más gruesas y/o más firmes que la planta diploide de la que se derivan, sin aumentar significativamente el tamaño de la planta y/o la longitud de la hoja, como se establece en las reivindicaciones adjuntas. Por el contrario: las plantas y hojas autotetraploides de la ensalada de maíz son más compactas que las plantas diploides y/o las hojas diploides. Este hallazgo fue sorprendente, ya que se sabe que la tetraploidización aumenta el tamaño del órgano. Por ejemplo, Sugiyama (Annals of Botany 2005, 96: 931-938) estudiaron el efecto de la tetraploidización de dos especies de Lolium, concluyendo que la tetraploidía tenía un efecto predominante en el aumento del tamaño de las hojas (tanto en su longitud como en su anchura) en comparación con los diploides, lo que se debía a un aumento de la tasa de elongación celular en los autotetraploides (mientras que la división celular no se veía afectada). Sugimoto-Shirasu y Roberts revisan la relación de la endorreplicación a nivel celular y cómo la ploidía influye en el tamaño de las células. En los animales la poliploidía da lugar a células más grandes, sin afectar al tamaño de los órganos (hay menos células en cada órgano), mientras que las plantas no parecen obedecer esta regla y los autores mencionan que "las plantas tetraploides son invariablemente más grandes que sus parientes diploides" (Current Opinion in Plant Biology 2003, 6: 544-553(véase la página 550, columna LH, primer párrafo).

Además, fue sorprendente que la tetraploidización no se asociara con problemas comunes, como alteraciones de la fertilidad, alteraciones durante la meiosis, mixoploidía o aneuploidía. La fertilidad y la producción de semillas de la ensalada de maíz tetraploide fueron normales.

Es, por tanto, un objetivo proporcionar plantas de ensalada de maíz y partes de plantas (y semillas a partir de las cuales se pueden cultivar dichas plantas) que sean compactas y tengan hojas gruesas, como se establece en las reivindicaciones adjuntas. Otro objetivo de la invención es proporcionar plantas y/u hojas de ensalada de maíz frescas que tengan una sensación crujiente en la boca. También se proporciona el uso de la autotetraploidización para generar plantas de ensalada de maíz que tengan hojas más gruesas y/o compactas y/o crujientes (en comparación con las hojas de las plantas diploides de las que se derivaron).

DEFINICIONES GENERALES

"Ensalada de maíz" se refiere en el presente documento a plantas, semillas y/o partes de plantas (por ejemplo, hojas cosechadas, plántulas, tejidos u órganos, células, etc.) de la especie Valerianella locusta.

Las "plantas de cultivo" o "plantas cultivadas" o "plantas no naturales" son líneas o variedades cultivadas que difieren de las poblaciones de plantas silvestres en su rendimiento agronómico, tal como el rendimiento, la uniformidad de la planta, la estabilidad, etc. Por tanto, las plantas cultivadas excluyen a las poblaciones de plantas silvestres, que se dan de forma natural y que evolucionaron sin la intervención humana.

"Planta diploide" se refiere a una planta, partes vegetativas de la planta o semilla a partir de la cual se puede cultivar una planta diploide, que tiene dos conjuntos de cromosomas (homólogos), designados aquí como 2n. Tradicionalmente, la ensalada de maíz es una especie diploide con 2n = 16 cromosomas, es decir, con 8 pares de cromosomas en las células vegetativas. Las células haploides (gametos masculinos y femeninos) tienen n = 8 cromosomas. Ejemplos de variedades diploides de ensalada de maíz son, por ejemplo, las variedades "Vit" y "Valentin".

"Planta tetraploide" se refiere a una planta, partes vegetativas de la planta o semilla a partir de la cual se puede cultivar una planta tetraploide, que tiene cuatro juegos de cromosomas, designados aquí como 4n. Una planta de ensalada de maíz tetraploide tiene 4n = 32 cromosomas, es decir, 2 * 8 pares de cromosomas (homólogos) en las células vegetativas. Las células haploides (gametos masculinos y femeninos) tienen 2n = 16 cromosomas. Los ejemplos son A-1, B-1, B-2 y B-3 descritos en el presente documento.

Los "autotetraploides" tienen conjuntos cromosómicos derivados de una sola especie, por ejemplo, mediante la duplicación del genoma de una planta diploide.

Una "planta tetraploide inducida" o "célula tetraploide inducida" se genera mediante la intervención humana que da lugar a la duplicación cromosómica / genómica de una célula diploide, tal como por ejemplo mediante el cultivo in vitro (y la duplicación cromosómica espontánea en el cultivo), el tratamiento químico para inducir la duplicación cromosómica, por ejemplo, utilizando colchicina (u otros agentes antimitóticos), orizalina (u otros herbicidas que inducen la duplicación cromosómica), gas de óxido nitroso, trifluralina, pronamida, etc, y/o tratamientos físicos (por ejemplo, temperatura, radiación, etc.).

La "plantación" se refiere a la siembra (siembra directa) o al trasplante de plantones/plántulas en un campo a máquina o a mano. La plantación también puede abarcar la siembra o el trasplante de plantones/plántulas en sistemas de cultivo sin suelo o hidropónicos.

El verbo "comprender" y sus conjugaciones se usan en su sentido no limitativo para indicar que se incluyen los elementos que siguen a la palabra, pero no se excluyen los elementos que no se mencionan específicamente. Además, la referencia a un elemento por medio del artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que haya más de un elemento, a menos que el contexto exija claramente que haya uno y sólo uno de los elementos. Así, el artículo indefinido "un" o "una" suele significar "al menos una", por ejemplo, "una planta" se refiere también a varias plantas, etc. Del mismo modo, "una hoja" se refiere a una pluralidad de hojas.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "planta" incluye la planta entera o cualquier parte o derivado de la misma, preferiblemente con la misma composición genética que la planta de la que se obtiene, tal como órganos vegetales (por ejemplo, hojas cosechadas o no cosechadas, etc.), células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de tejidos celulares vegetales a partir de los cuales pueden regenerarse plantas enteras, callos vegetales, grupos de células vegetales, trasplantes vegetales, plántulas, células vegetales intactas en plantas, clones vegetales o micropropagaciones, o partes de plantas (por ejemplo, tejidos u órganos cosechados), tales como esquejes vegetales, embriones, polen, óvulos, frutos, flores, hojas, semillas, plantas propagadas clonalmente, raíces, tallos, puntas de raíces, injertos y similares. También se incluye cualquier fase de desarrollo, tal como las plántulas, los esquejes antes o después de enraizar, las plantas maduras o las hojas, etc.

"Material vegetal cosechado" se refiere en el presente documento a plantas enteras y/o partes de plantas (por ejemplo, hojas separadas de todas o parte de las raíces) que han sido recogidas para su posterior procesamiento, tal como uno o más de los lavados, enjuagues, secados, mezclados con otro material vegetal y/o otro material comestible, envasado, etc. y/o que ya han sido sometidos a uno o más pasos de procesamiento.

Las "semillas cosechadas" se refieren a las semillas cosechadas de una línea o variedad, por ejemplo, producidas tras la autofecundación o la fecundación cruzada y recogidas.

Los "productos de hoja fresca" se refieren a los productos que comprenden o consisten en hojas frescas (crudas; no cocidas ni cocidas al vapor), racimos de hojas, plántulas o partes de hojas o plántulas. Por ejemplo, contenedores (bolsas, cestas, paquetes, flow packs, etc.) que contengan ensalada de maíz, por ejemplo, mezclas de ensalada.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "variedad" o "cultivar" designa una agrupación de plantas dentro de un único taxón botánico del rango más bajo conocido, agrupación que, independientemente de que se cumplan plenamente las condiciones para la concesión de un derecho de obtentor, puede definirse por la expresión de los caracteres resultantes de un genotipo o de una combinación de genotipos determinados, que se distingue de cualquier otra agrupación de plantas por la expresión de al menos uno de dichos caracteres y que se considera como una unidad en lo que respecta a su aptitud para ser reproducida sin cambios.

La "línea vegetal" es, por ejemplo, una línea de mejora que puede utilizarse para desarrollar una o más variedades.

"Promedio" se refiere en el presente documento a la media aritmética.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Plantas de acuerdo con la invención

En una realización de la invención se proporciona una planta de la especie Valerianella locusta en la que la planta es (auto)tetraploide y comprende el genoma duplicado de la planta diploide de la que deriva. Así, las células vegetativas de la planta (por ejemplo, las hojas) contienen el doble de ADN nuclear, es decir, 4n = 32 cromosomas, como puede determinarse mediante citometría de flujo u otros métodos (véase Dolezel y Bartos, Annals of Botany 200595(1):99-110). Las plantas tetraploides se generan duplicando los cromosomas de las líneas o variedades cultivadas de V. locusta diploide, es decir, no por tetraploidización de V. locusta silvestre, ya que el material cultivado tiene buenas características agronómicas y tiene las características establecidas en las reivindicaciones adjuntas.

Mediante la tetraploidización de las plantas cultivadas de V. locusta , las plantas se modifican en una serie de características (en relación con el diploide del que derivan por duplicación de cromosomas). En una realización de la invención, la planta tetraploide tiene hojas más gruesas y/o más firmes y/o más pesadas (más líquido y menos sólidos solubles por unidad de superficie foliar) que la planta diploide de la que deriva. En los análisis que se describen a continuación se utilizan preferentemente hojas maduras de la misma edad y cultivadas en las mismas condiciones. Se entiende que para fines estadísticos se utilizan varias hojas de un número de plantas por línea o cultivar para tener en cuenta la variación entre plantas y entre hojas dentro de una línea o cultivar.

La planta tetraploide tiene un grosor medio de las hojas (de las hojas individuales y/o de una pluralidad de hojas) que es de al menos aproximadamente 105 %, preferiblemente de al menos aproximadamente 110 %, preferiblemente de al menos aproximadamente 115 %, 120 %, 125 %, 130 %, 135 %, 140 %, 150 % (o más) del grosor promedio de las hojas de la planta diploide de la que se derivó mediante la duplicación cromosómica. El grosor promedio de las hojas (o el grosor promedio de una pluralidad de hojas) puede determinarse por diversos medios. Por ejemplo, una pluralidad de hojas (por ejemplo, al menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o más) pueden colocarse una encima de otra, entre portaobjetos, y el grosor puede medirse utilizando un calibrador. El grosor promedio de las hojas se compara con el del control diploide (el diploide del que se derivó el tetraploide), medido de la misma manera. Como alternativa, se puede utilizar el método microscópico para medir el grosor de las hojas y compararlo con el control diploide. Por ejemplo, el grosor de las secciones transversales de las hojas puede medirse al microscopio.

Las hojas de los tetraploides son, en una realización, también más firmes (más fuertes) que las de los diploides de los que derivan. La resistencia mecánica de la hoja puede medirse, por ejemplo, midiendo la resistencia a la tracción en el punto de máxima anchura de la hoja con un analizador de textura, por ejemplo, el TA-XT2 (Texture Technologies, Scarsdale, NY). La resistencia a la rotura por tracción se mide como fuerza en Newtons (N) mm-2 del área transversal de la hoja. Como alternativa, se puede utilizar un penetrómetro para medir la resistencia de la hoja. La fuerza media de las hojas tetraploides es significativamente más alta que la de los controles diploides, preferiblemente es al menos 105%, 110 % o más del control (siendo ajustado al 100 %). Asimismo, el tacto manual puede utilizarse para comparar la firmeza de las hojas, y las hojas tetraploides se sienten más firmes que las diploides de control. La firmeza también se puede cuantificar manualmente, por ejemplo, tocando las hojas entre dos dedos y puntuando la firmeza, por ejemplo, en una escala de 1 a 10 (siendo 10 muy firme, y teniendo la variedad diploide Valentin una puntuación de firmeza de 4. Los tetraploides de acuerdo con la invención tienen una firmeza media de la hoja en una escala de 1 a 10 que es al menos 1, 2, 3 o más puntos superiores a la del diploide del que derivan.

Las hojas de las plantas tetraploides de acuerdo con la invención son preferiblemente no sólo más gruesas que las diploides, sino que también son más pesadas por unidad de superficie y tienen menos sólidos que las diploides. El peso fresco promedio de las hojas por unidad de superficie (por ejemplo, por tapón) aumenta significativamente en comparación con los controles diploides, situándose en 102 %, 103 %, 105 %, 110 %, 120 %, 125 %, 130 % (o más) del peso del control diploide. El peso fresco puede medirse simplemente pesando hojas o partes de hojas de tamaño definido recién muestreadas. Tras el secado, se puede determinar el contenido sólido de la hoja/parte de la hoja. Cabe destacar que las hojas/partes de hojas tetraploides tienen un porcentaje significativamente mayor de líquido y un porcentaje significativamente menor de sólidos por unidad de superficie en comparación con los controles diploides, lo que indica que las células son significativamente mayores, con más citosol y menos partes de la pared celular. Esto se confirma con la microscopía SEM. Así, en una realización, el porcentaje de materia sólida por unidad de superficie es significativamente menor en las hojas tetraploides en comparación con los controles diploides, por ejemplo, el porcentaje de materia sólida es del 95 % o menos del control diploide (por ejemplo, 94 %, 93 %, 90 %, 89 %, 85 %, o menos, del control diploide).

Las células epidérmicas superiores (adaxiales) y/o las células de la empalizada son en promedio significativamente más grandes en las hojas tetraploides en comparación con las diploides de las que se derivaron. Opcionalmente, también las células epidérmicas inferiores son significativamente mayores en los tertaploides. "Más grande" se refiere en el presente documento especialmente a la altura de la célula, desde la pared celular superior hasta la inferior. Así, los tetraploides tienen células epidérmicas superiores que tienen una altura celular promedio de al menos 105 %, preferiblemente al menos 110 %, 115 %, 119 %, o más, del diploide del que se derivó el tertaploide, y/o células de empalizada que tienen una altura celular promedio de al menos 110%, 115 %, 120 %, o más, del diploide del que se derivó el tertaploide. Opcionalmente, también las células epidérmicas inferiores tienen una altura celular que es al menos 110 %, o más, del diploide del que se derivó el tertaploide. El tamaño de las células puede medirse, por ejemplo, mediante microscopía electrónica de barrido (SEM).

Las plantas y/o hojas tetraploides son "más compactas" que los controles diploides. "Más compacta" significa que la longitud promedio de la hoja del tetraploide es significativamente más corta que la del diploide del que se derivó y/o que la relación anchura : longitud es significativamente mayor en el tetraploide en comparación con el diploide del que se derivó el tetraploide. "Significativamente más corto" se refiere a que la longitud de la hoja es igual o inferior a 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 % o menos, de la longitud del control diploide. Asimismo, una relación anchura/longitud significativamente mayor se refiere a una relación que es al menos 105 %, 110 %, preferiblemente al menos 115 %, 120 %, o más, de la relación del control diploide. Así, la planta tetraploide compacta de acuerdo con la invención tiene hojas más cortas, y opcionalmente más anchas, que la diploide de la que se derivó. La longitud y la anchura (media) de las hojas pueden medirse manualmente (como se describe en los ejemplos) o mediante medidores de superficie automáticos (utilizando, por ejemplo, hojas o segmentos de hojas fotocopiados, véase Tsuda, 1999, Annals of Botany 84: 799-801). La longitud y la anchura de la hoja se miden preferentemente separando las hojas del tallo y midiendo la longitud de toda la hoja, incluyendo el peciolo (la parte que une el limbo al tallo), es decir, desde la base del peciolo hasta la punta de la hoja.

Así, la planta tetraploide de acuerdo con la invención no tiene hojas más largas que la planta diploide de la que se derivó, y tiene hojas significativamente más cortas y opcionalmente más anchas.

La "planta diploide de la que se derivó la planta tetraploide" o "control diploide" se refiere aquí a la planta diploide cuyos cromosomas se duplicaron por intervención humana, dando lugar a la planta tetraploide de acuerdo con la invención. También se proporciona en el presente documento la progenie de cualquiera de las plantas tetraploides de la invención, que son tetraploides estables (es decir, que conservan un genoma diploide duplicado), tal como las generaciones obtenidas por autofecundación (autofecundación) y/o los tetraploides obtenidos por fecundación cruzada (cruce) de un tetraploide con otro tetraploide (dando lugar a "tetraploides híbridos"). Los tetraploides híbridos son, pues, tetraploides que contienen cromosomas procedentes de diferentes líneas o variedades diploides (pero estos tetraploides híbridos siguen siendo autotetraploides, ya que sólo están presentes los cromosomas de V. locusta ).

Las técnicas moleculares, tal como las huellas dactilares AFLP (Muminovic et al. Plant Breeding, Volume 123 Issue 5, Pages 460 - 466), la huella dactilar RFLP, los marcadores SNP o la secuenciación del genoma completo, pueden utilizarse para determinar qué plantas diploides han sido duplicadas con el fin de generar las tetraploides y/o los tetraploides híbridos de acuerdo con la invención. También se pueden hacer plantas de ensalada de maíz triploides, cruzando un tetraploide con un diploide.

Básicamente, se puede utilizar cualquier línea de reproducción diploide o cultivar/variedad para generar una planta tetraploide de acuerdo con la invención, tal como, por ejemplo, pero sin limitarse a las variedades comerciales. Algunos ejemplos de variedades comerciales que pueden utilizarse son las variedades Hild (Baron, Granon, Eurion, Medaillon, Rodion, Elan, Vit, Valentin, Verte de Cambrai Caombrain/Hilmar), las variedades Rijk Zwaan (Cirilla RZ, Dione RZ, Pulsar RZ), las variedades ENZA (Accent, Favor, Juwallon, Juwahit, Juvert), las variedades Clause (Trophy, Gala) y otras. La planta diploide puede ser una variedad o línea de reproducción de V. locusta seleccionada entre un tipo de roseta, un tipo de hoja larga, una planta adaptada para el cultivo de invierno o de verano, o una variedad adaptada para el cultivo durante todo el año. Las variedades adaptadas al cultivo de invierno o de verano pueden cosecharse en los meses de invierno o de verano europeos o norteamericanos, respectivamente. Las variedades para el cultivo durante todo el año se pueden cosechar durante todo el año.

Para la tetraploidización se utiliza preferentemente una línea o variedad de cría estable de V. locusta que tenga buenas características agronómicas y/o de calidad. Por lo tanto, preferiblemente la línea o variedad utilizada tiene buena calidad y/o características agronómicas, como resistencia a las enfermedades y/o plagas (por ejemplo, Phoma valerianellae, Peronospora valerianellae, Acidovorax valerianellae, Erisyphe sp., Pseudomonas sp.), no susceptible a la formación de cuchara en las hojas, alto rendimiento, color verde oscuro, uniformidad, poca prominencia de las venas, etc. En particular, se prefieren los tetraploides que tengan hojas de color verde oscuro, ya que el color oscuro es atractivo para los consumidores.

En una realización de la invención, los tetraploides tienen un color de hoja verde más oscuro que los diploides de los que se derivaron. Los tetraploides con hojas de color verde más oscuro pueden hacerse utilizando líneas diploides o variedades con hojas de color verde claro, verde medio u oscuro para la tetraploidización. Los tetraploides de acuerdo con la invención tienen, en una realización, una puntuación de color que es al menos 0,5, preferiblemente al menos 1, 1,5, 2, o más, puntuaciones más altas que las del diploide de control, por ejemplo, en una escala de 1 (verde claro) a 10 (verde oscuro). Los tetraploides de acuerdo con la invención tienen preferentemente una puntuación de color de la hoja de al menos aproximadamente 6, más preferentemente al menos aproximadamente 7 u 8, más preferentemente al menos aproximadamente 9 o 10. La variedad diploide Vit, por ejemplo, tiene una puntuación de 7,7 en una escala de 1-10.

Tras la tetraploidización, la planta 4n seleccionada puede utilizarse como tal para la producción de semillas, es decir, el tetraploide se autofecunda (para producir un S1) y se recogen las semillas. Para aumentar la producción de semillas, las semillas S1 pueden plantarse, autofecundarse y las semillas S2 pueden recogerse de las plantas S1. Asimismo, las generaciones S2, s 3, S4 u otras derivadas del tetraploide seleccionado pueden utilizarse para la producción de semillas y/o cultivos.

Alternativamente, los tetraploides pueden autofecundarse y/o cruzarse con otros tetraploides una o más veces. En una realización particular, las plantas se autofecundan una o más veces, para producir líneas estables. Las plantas pueden utilizarse en los programas normales de cría de ensalada de maíz y pueden introducirse nuevas mejoras mediante la cría y la selección. De este modo, las plantas pueden ser evaluadas por sus características morfológicas y agronómicas y se pueden fabricar tetraploides con buen rendimiento agronómico y/o rasgos de calidad utilizando los métodos tradicionales de cría. Preferentemente, las características fenotípicas distintivas de los tetraploides (grosor de la hoja y/o compacidad y/o firmeza y/o crujiente) se conservan en la progenie.

Las plantas tetraploides de acuerdo con la invención son, en una realización, particularmente adecuadas para el cultivo de verano.

Las plantas tetraploides de acuerdo con la invención se generan por intervención humana, utilizando cualquier técnica de duplicación de cromosomas, tal como el tratamiento de células, tejidos o plántulas con agentes antimitóticos (por ejemplo, colchicinas) o herbicidas despolimerizadores de microtúbulos, y la regeneración de células y plantas tetraploides. Las técnicas de duplicación de cromosomas y de regeneración de plantas son bien conocidas en la técnica.

En otra realización que no está de acuerdo con la invención y que se presenta sólo con fines ilustrativos, se proporciona una planta tetraploide derivada de semillas depositadas bajo el número de acceso NCIMB 41651 y/o NCIM^b 41652, o de su progenie. Las plantas cultivadas a partir de semillas con el número de acceso NCIMB 41651 y NCIMB 41652 o derivadas de ellas (por ejemplo, la progenie producida por autofecundación y/o cruce) son líneas tetraploides divulgadas por el presente documento pero que no de acuerdo cona la invención y se presentan únicamente con fines ilustrativos. Estas dos líneas, así como su progenie obtenida por autofecundación y/o por cruce de una de ellas con otra tetraploide (por ejemplo, los híbridos que se obtienen cruzando estas líneas entre sí) son especialmente adecuadas para el cultivo de verano. Las semillas y las plantas cosechadas y/o las partes de las plantas derivadas de las semillas depositadas son también una realización en el presente documento, que no son de acuerdo con la invención y están presentes sólo con fines ilustrativos.

En un aspecto se divulga una semilla de una planta de ensalada de maíz tetraploide, de la cual una muestra representativa de semilla fue depositada bajo el número de acceso NCIMB 41651 o NClMB 41652. También se divulga una planta de ensalada de maíz o una parte de la planta producida por el cultivo de estas semillas. Además, se divulga un cultivo de tejidos producido a partir de células o protoplastos de estas plantas, en el que las células o protoplastos se producen a partir de una parte de la planta, por ejemplo, seleccionada del grupo que consiste en hoja, polen, embrión, cotiledón, tallo, raíz, célula meristemática, punta de la raíz, pistilo, antera, flor, brote o semilla. También se divulga una planta regenerada a partir del cultivo de tejidos, en la que la planta tiene todas las características fisiológicas y morfológicas de NCIMB 41651 o NCIMB 41652.

Las semillas de cualquiera de las plantas tetraploides de acuerdo con la invención pueden ser tratadas (por ejemplo, recubiertas, imprimadas, etc.) y/o embaladas utilizando cualquier técnica conocida. Los paquetes de semillas comprenden preferentemente una sola línea o variedad tetraploide endogámica, o una sola línea "tetraploide híbrida" (véase más arriba).

Productos de acuerdo con la invención

Los productos frescos y/o cocidos al vapor y/o (parcialmente) cocidos que comprenden o consisten en plantas tetraploides (o plántulas) y/o partes de plantas tetraploides (por ejemplo, hojas) son también una realización de la invención. Así, en una realización se proporciona una pluralidad de hojas cosechadas y/o plantas cosechadas y/o partes de una planta de acuerdo con la invención. Estas plantas/partes cosechadas son, en una realización, embaladas. Opcionalmente, antes del embalaje, el material vegetal se lava y/o se enjuaga una o más veces para eliminar los restos. El material tetraploide puede mezclarse con otros ingredientes, por ejemplo, otras verduras, tal como otro material para ensaladas de maíz, material de Lactuca sativa (por ejemplo, lechuga de hoja pequeña o de hoja múltiple), hojas de rúcula, etc. También se proporcionan ensaladas y comidas listas para consumir que comprenden o consisten en plantas/partes tetraploides. Dichas ensaladas y comidas listas para consumir pueden ser vegetarianas o incluir carne y/o marisco.

En otra realización se proporciona un contenedor o paquete que comprende una pluralidad de hojas frescas cosechadas. Los contenedores o embalajes pueden ser abiertos o cerrados, pueden ser cajas de cartón, bolsas, cestas, bandejas, flow pack, película, etc. Preferiblemente, las hojas cosechadas y los productos que las componen se mantienen fríos durante el procesamiento y/o el embalaje posteriores a la cosecha y/o la cadena de suministro posterior (hasta, por ejemplo, el estante del supermercado), preferiblemente por debajo de 20 °C, más preferiblemente por debajo de 15 °C, más preferiblemente por debajo de 10 °C, por ejemplo, entre 0 y 7 u 8 °C, lo más preferiblemente entre 2 y 4 °C (véase, por ejemplo, Geyer y Herppich, supra). El embalaje de protección puede utilizarse para controlar la humedad y/o la composición de los gases. Preferiblemente, la humedad relativa (HR) en el embalaje es de al menos aproximadamente 90 % o 95 %, más preferiblemente un 100 %. La atmósfera puede ser controlada, por ejemplo, a través del embalaje EMAP (Equilibrium Modified Atmosphere Packaging) o del embalaje EMAP anaeróbico (AEMAP). Cada producto tiene su temperatura ideal, su nivel de O2,CO2y HR, que pueden determinarse con métodos conocidos.

En otra realización, las plantas de acuerdo con la invención y los productos que comprenden o consisten en plantas tetraploides frescas y/o partes de plantas (por ejemplo, hojas) tienen una vida útil más larga y/o una sensación en boca más crujiente que los que comprenden o consisten en plantas de ensalada de maíz diploides frescas y/o partes de plantas (por ejemplo, hojas), especialmente en comparación con los diploides de los que se derivaron los tetraploides. En general, la vida útil de las hortalizas de hoja verde frescas es de 5 a 7 días desde el embalaje, pero la vida útil depende de un gran número de factores, tal como la línea o variedad de la planta y las condiciones de manipulación y embalaje tras la cosecha, así como las condiciones de almacenamiento y transporte.

Por "vida útil más larga" se entiende que el producto se mantiene comercializable (es decir, que conserva una calidad mínima determinada) durante un período de tiempo significativamente más largo (después de la cosecha, bajo las mismas condiciones de embalaje y almacenamiento) que el producto equivalente elaborado con el diploide del que se derivó el tetraploide. Un período significativamente más largo es de al menos 1 día, preferiblemente de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 días más, o más.

Como las plantas tetraploides tienen hojas más gruesas en comparación con los controles diploides, la vida útil más larga en comparación con los controles diploides sólo puede lograrse en cadenas de procesamiento mínimas, en las que se utiliza una manipulación cuidadosa para minimizar el daño a los tejidos. La persona experta puede establecer cadenas de manipulación de la cosecha y de la postcosecha que den como resultado una vida útil más larga, por ejemplo, incluyendo más pasos de manipulación manual y reduciendo los pasos mecánicos.

Un producto se convierte en no comercializable cuando los indicadores de calidad, tales como el color, el deterioro/la putrefacción del tejido y/o la firmeza del tejido dejan de ser aceptables para el consumidor. La calidad postcosecha puede compararse, por ejemplo, puntuando los indicadores de calidad postcosecha (tales como el color de la hoja, la podredumbre y/o la firmeza del tejido) en diversos momentos tras el almacenamiento de las hojas o plántulas cosechadas (por ejemplo, almacenadas durante 2, 4, 6, 8 días a temperaturas frescas). Véase, por ejemplo, Nicola, Hoebrechts y Fontana, Acta Hort. 633, ISHS 2004, p509-515.

Una sensación en boca "más crujiente" o "más crocante" o "más firme" en comparación con los controles diploides puede ser probada utilizando un panel de sabor, en el que se pide a las personas que puntúen la sensación en boca en una escala definida, por ejemplo, siendo 1 la no crujiente/firme y 10 la más crujiente/firme. Así, por ejemplo, las hojas derivadas de la planta A-1 (NCIMB 41651) son, en promedio, más crujientes que las hojas de la variedad A. Asimismo, las hojas derivadas de la planta B-3 (NCIMB 41652) son, en promedio, más crujientes que las hojas de la variedad B. Así pues, en general, las hojas de los tetraploides son más crujientes que las del diploide del que proceden.

También es posible la propagación vegetativa de los tetraploides, por ejemplo, a través de cultivos de células o tejidos. Los cultivos de tejidos, tales como los callos y los cultivos en suspensión, han sido descritos, por ejemplo, por Schrall y Becker (Acta Horticulturae 1980, Vol. 96: 75-83). Una propagación vegetativa (cultivo de protoplastos, células o tejidos) de un tetraploide de acuerdo con la invención es, por lo tanto, también una realización en el presente documento, así como las plantas regeneradas a partir de ellas, la progenie o las semillas de las mismas.

Se han descrito otros SCS (sistemas de cultivo sin suelo) con base en medios de cultivo que pueden aplicarse a los tetraploides, véase Fontana y Nicola (supra).

En otra realización de la invención se proporciona un método para producir plantas tetraploides (o partes de las mismas) de la especie Valerianella locusta , que comprende:

a) proporcionar una célula vegetal diploide, un tejido, un órgano, una semilla o una plántula de la especie Valerianella locusta,

b) inducir la duplicación de cromosomas en dicha célula vegetal, tejido, órgano, semilla o plántula, c) producir una planta tetraploide a partir de b).

Las plantas o partes vegetativas de estas derivadas del paso c) son también tetraploides. Se entiende que este método es adecuado para proporcionar plantas (y partes de plantas) con las características descritas anteriormente (hojas más gruesas, plantas más compactas, etc. en comparación con el diploide original utilizado en el paso a). Las plantas obtenidas en el paso c) pueden utilizarse para cultivar una ensalada de maíz en el campo o en el invernadero y para cosechar plantas o partes de las mismas.

La célula vegetal diploide, el tejido, el órgano, la semilla o la plántula del paso a) puede ser de cualquier línea o variedad diploide de V . locusta, preferentemente de una V. locusta cultivada, más preferentemente de una línea o variedad que tenga buenas características agronómicas.

Las semillas pueden ser, por ejemplo, semillas germinadas. La duplicación de los cromosomas puede ser inducida por diversos métodos, por ejemplo, mediante el tratamiento con oryazlin como se describe en los ejemplos. En el paso c) las plantas se regeneran in vitro o se dejan crecer (por ejemplo, a partir de semillas o plántulas germinadas). Las plantas tetraploides pueden seleccionarse utilizando, por ejemplo, citometría de flujo y/o mediante la selección de plantas con hojas gruesas (por ejemplo, mediante la selección manual palpando las hojas). Los diploides o quimeras pueden ser descartados.

También se pueden producir haploides o dobles haploides a partir de los tetraploides de acuerdo con la invención. El método para producir haploides o dobles haploides comprende:

a) proporcionar una célula vegetal haploide o una línea celular de una planta tetraploide de la

especie Valerianella locusta,

b) opcionalmente, inducir la duplicación de cromosomas en dicha célula vegetal o línea celular para producir una célula vegetal o línea celular doblemente haploide,

c) producir una planta haploide a partir de la célula o línea celular de a) o una planta doblemente haploide a partir de la célula o línea celular de b), y, opcionalmente

d) cruzamiento posterior y/o autofecundación con la planta de c) y/o con la progenie de la misma.

La célula o línea celular haploide puede ser, por ejemplo, un cultivo de anteras del tetraploide.

Las plantas, las partes de las plantas y las semillas producidas por los métodos anteriores están incluidas en el presente documento.

INFORMACIÓN SOBRE DEPÓSITOS

La línea tetraploide derivada de la variedad diploide A se denominó A-1 y corresponde a la línea NUN 0008, de la que Nunhems B.V. depositó 2.500 semillas en virtud del Budapest Treaty el 4 de septiembre de 2009 en el NCIM^b (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Escocia). A estas semillas se les asignó el número de depósito NCIMB 41651.

Las tres líneas tetraploides derivadas de la variedad diploide B se denominaron B-1, B-2 y B-3. La línea B-3 corresponde a la línea E09_T0981-17, de la cual 250 semillas fueron depositadas por Nunhems B.V. en virtud del Tratado de Budapest el 4 de septiembre de 2009 en el NCIMB (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Escocia). A estas semillas se les asignó el número de depósito NCIMB 41652.

El acceso a las semillas se rige por los artículos y normas aplicables del Budapest Treaty y el solicitante opta por la solución "experta" de la regla 32 del European Patent Convention (CPE 2000).

Los siguientes ejemplos no limitantes describen la producción de V. locusta tetraploide de acuerdo con la invención.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 - Tetraploidización y citometría de flujo

Las variedades comerciales diploides (2n) de V. locusta A y B fueron tratadas con orizalina para inducir la duplicación cromosómica. La variedad A se puede obtener comercialmente de Hild Samen GmbH, Kirchenweinbergstr. 115, D-71672 Marbach, Alemania, con el nombre de "Vit"). La variedad B se puede obtener comercialmente de Hild Samen bajo el nombre de "Valentin".

La variedad A es una variedad de "roseta" de hojas ovaladas, de color verde oscuro, adecuada para el cultivo de otoño e invierno bajo cubierta de vidrio o plástico. La variedad B es del tipo "roseta" con hojas verdes oscuras, fuertes, anchas y redondas con un tallo corto, adecuado para el cultivo de verano.

Se utilizó el siguiente protocolo. Las semillas de las variedades A y B se dejaron germinar a 21 grados Celsius en papel de germinación de semillas. Una vez que más del 50 % de las semillas han germinado, las semillas germinadas se transfieren a un tamiz. Los tamices se sumergieron durante 4-6 horas a temperatura ambiente en una solución de oricalina (5 mg por litro de agua del grifo). Los tamices se lavaron en agua del grifo tres veces durante unos 15 minutos. Las semillas germinadas se transfirieron al suelo, se cubrieron con vermiculita y se dejaron germinar más. Se tomaron muestras de hojas por planta y se analizaron por citometría de flujo para determinar los niveles de ploidía. Los análisis de citrometría de flujo fueron realizados por Plant Cytometry Services (Europalaan 74, 5481 j G Schijndel, Países Bajos).

Se seleccionó una línea tetraploide, designada A-1, derivada de la variedad diploide A, para su posterior análisis. Se seleccionaron tres líneas tetraploides, designadas B-1, B-2 y B-3, derivadas de la variedad B, para su posterior análisis.

Ejemplo 2 - Análisis fenotípico de tetraploides frente a diploides

2.1 Características de la hoja

2.1.1 - Material y métodos

Las semillas de las variedades A y B, así como de A-1, B-1, B-2 y B-3 se sembraron en una cámara climática. Tras dos semanas de imbibición en frío a 5 °C en la oscuridad, las semillas se dejaron germinar a 18 °C con 12 horas de día y noche bajo iluminación artificial durante dos semanas. Tras 2 semanas de germinación de las semillas y desarrollo de las plántulas, las plantas se vernalizaron a 5 °C, 12 horas día/noche bajo iluminación artificial durante 4 semanas. A principios de julio se plantaron en el campo bajo una red verde para su desarrollo final. Las plantas se evaluaron visual y manualmente para determinar sus características fenotípicas.

En la madurez (etapa de pares de hojas 7-8), de 20 plantas por variedad/línea se tomaron hojas frescas entre las 8:00 y las 9:00 am. Las hojas se lavaron cuidadosamente para eliminar la arena y mantenerlas frescas. Se utilizó una toalla de papel para eliminar el agua (superficial).

Se extrajeron dos tapones de hoja de 1,2 cm de diámetro de cada una de las dos hojas por variedad/línea y se pesaron para determinar el peso fresco promedio (pesos de los tapones de hoja 1-10 en la Tabla 1). Los tapones se tomaron de una mitad de la hoja, evitando la vena principal.

La otra mitad de las hojas se cortó para eliminar la vena principal (y la mitad de la que se habían tomado los tapones de las hojas). Esta mitad se utilizó para determinar el grosor promedio de las hojas (cuadro 3) y el porcentaje de materia sólida (cuadro 2), es decir, el porcentaje del peso fresco que está compuesto por materia seca (sólidos). Para determinar la materia seca, las 10 mitades de hoja se colocaron en una estufa de secado durante 3,5 horas a 120 °C y se pesaron posteriormente.

Para determinar el grosor promedio de las hojas (Tabla 3), se colocaron las 10 mitades de las hojas una encima de otra y entre dos portaobjetos de plástico. El grosor de las 10 hojas se midió dos veces con un calibrador (digital) (medidas 1 y 2 en el cuadro 3). Todas las muestras se midieron de la misma manera aplicando una ligera presión (hasta que se sintió resistencia).

2.1.2 - Resultados

Evaluación visual/manual

La evaluación visual y manual mostró que las plantas de los tetraploides A-1, B-1, B-2 y B-3 eran más compactas y tenían hojas aparentemente más gruesas que las de los diploides de los que derivaban (A y B). El grosor y la dureza de la hoja eran una característica fenotípica que podía utilizarse (tomando la hoja entre el pulgar y el dedo) para distinguir los tetraploides de los diploides. Una línea, B-4 (derivada de la variedad B) no parecía tener hojas más gruesas que B y las plantas no eran más compactas que B. Por lo tanto, se sospechaba que esta línea de plantas B-4 no era en realidad un tetraploide sino un diploide. Esto se confirmó posteriormente mediante citometría de flujo y las plantas se descartaron de los análisis posteriores.

Para comprobar si la evaluación visual y manual inicial podía verificarse y cuantificarse, se realizaron diversas mediciones como se ha descrito anteriormente.

Peso fresco

El peso fresco promedio de las hojas de los tetraploides fue significativamente mayor que el de los diploides de los que se derivaron (Tabla 1; prueba t de student, de dos colas, varianza igual tipo dos muestras). En las mediciones de tapones, el peso fresco promedio de la línea tetraploide A-1 fue 125 % del de la línea diploide A, y el peso fresco medio de las líneas tetraploides B-1, B-2 y B-3 fue 126 %, 122 % y 122 % del de la línea diploide B, respectivamente (Tabla 1).

Tabla 1 - peso fresco promedio se aumenta significativamente en tetraploides

*significativo

Estos datos confirmaron el hallazgo de que las hojas de los tetraploides son más gruesas y, por tanto, significativamente más pesadas por unidad de superficie que las de los controles diploides.

Porcentaje de materia seca

El porcentaje (promedio) de materia seca fue significativamente menor en los tetraploides que en los diploides de los que procedían (Tabla 2; prueba t de student, como en el caso anterior), lo que indica que había más líquido por área foliar, probablemente debido a que las células eran más grandes y había relativamente menos paredes celulares por unidad de área.

Tabla 2 - contenido de materia seco

*significativo

Grosor de la hoja

También el grosor de la hoja se incrementó significativamente en los tetraploides en comparación con los diploides, véase la Tabla 3. Como no se pudieron realizar mediciones en hojas individuales, se realizaron mediciones en 10 hojas por línea, como se ha descrito anteriormente.

Tabla 3 - grosor de hoja aumentó significativamente en tetraploides (prueba t de student, como anteriormente)

2.1.3 - Conclusiones

Las mediciones del peso fresco y del grosor de las hojas confirmaron que la tetraploidización da lugar a un tejido foliar significativamente más grueso y pesado por unidad de superficie. Dado que la materia seca fue significativamente menor, este aumento se debe a la presencia de células más grandes en los tetraploides, y no a la presencia de más células.

Ejemplo 3 - Análisis microscópico

Se cortaron secciones transversales de las hojas y se tomaron fotografías con un microscopio binocular. En las fotografías se midió el grosor de las hojas a una distancia de 500 y 1000 pm del extremo de la hoja. Las hojas de los tetraploides eran significativamente más gruesas que las de los diploides de los que derivaban, como se muestra a continuación:

Tabla 4

Ejemplo 4 - Compactación de tetraploides

Para determinar la compacidad, se retiraron 10 hojas maduras de un mínimo de 5 plantas por línea. Las hojas se colocaron en papel milimetrado y se midieron. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 5 y la Tabla 6.

Tabla 5

Tabla 6

Como puede observarse, los tetraploides tienen hojas significativamente más cortas y una relación anchura/longitud significativamente mayor que los diploides de los que derivan (la significación se determinó mediante la prueba t, de dos colas, tipo varianza desigual de dos muestras).

El tetraploide A-1 también tiene una hoja significativamente más ancha que A. El tetraploide B-3 tiene hojas significativamente más cortas en comparación con B, aunque sin que la anchura de la hoja sea significativamente diferente.

Ejemplo 5 - Microscopía electrónica de barrido (SEM)

5.1 Material y métodos

Para determinar si el aumento del grosor de la hoja a través de la tetraploidización se debe efectivamente a células más grandes (y no a más células), se tomaron imágenes de SEM y se midió el tamaño de las células (es decir, la altura de la célula, la distancia de la pared celular superior a la inferior por célula; en píxeles).

De las hojas maduras de igual tamaño se cortó un trozo de 3x3 mm junto a la vena principal. La pieza se introdujo en la ranura de un talón ranurado y se fijó con pegamento conductor rico en carbono, sobresaliendo la parte superior 1 mm. El talón se congeló en nitrógeno líquido. Después de la transferencia a la precámara de un JEOL 6330 cryo FESEM, se fracturó la parte superior de la pieza de la hoja a -120°C. Posteriormente se realizó un paso de sublimación a -90°C y se aplicó una capa de oro-paladio a la muestra. Dentro del microscopio se estudió la superficie de la hoja y, cuando la fractura era perpendicular a la superficie de la hoja, se tomaron fotografías.

Con el software ImageJ se examinaron las fotos y se hicieron mediciones de la altura de las células. Se midió la altura de las células de la epidermis superior e inferior y de la capa de parénquima en empalizada situada directamente debajo de la epidermis superior. Todas las medidas representan las dimensiones de las células perpendiculares a la superficie de la hoja. Utilizando la técnica mencionada se produce una pequeña contracción, pero como las muestras se preparan simultáneamente las diferencias son representativas de las diferencias entre las muestras no tratadas.

212 píxeles representaban 100 pm, lo que se utiliza para convertir los píxeles en valores reales.

5.2 Resultados

Los resultados se muestran en la Tabla 7 (diploide A y tetraploide A-1) y en la Tabla 8 (diploide B y tetraploide B-3).

Tabla 7 - Altura celular del teido foliar del di loide A del tetra loide A-1

(continuación)

Como puede observarse, las células de la epidermis inferior y superior y del tejido de empalizada son, en promedio, significativamente mayores en el tetraploide, en comparación con el diploide del que se derivó el tetraploide. Las células de la epidermis superior en el diploide oscilaban entre 57 y 116 píxeles, mientras que en el tetraploide oscilaban entre 70 y 116 píxeles. En la epidermis inferior, las células diploides tenían una altura de 64 a 95 píxeles, y las tetraploides de 90 a 115 píxeles. La mayor diferencia se observó en el tamaño de las células en empalizada (longitudinales), con 69 a 100 píxeles en el diploide A frente a 102 a 120 píxeles en el tetraploide A-1. Las células de A-1 son, por tanto, 119 %, 130 % y 134 % del tamaño (altura) de A, para la epidermis superior, la epidermis inferior y las células de la empalizada, respectivamente. Las células en empalizada son el lugar del tejido foliar con mayor número de cloroplastos por célula y donde se produce la principal fotosíntesis. Como los tetraploides también parecen tener un color verde más oscuro en comparación con los diploides de los que derivan, y las células en empalizada son más grandes, parece que los terapeutas tienen un mayor número de cloroplastos que los diploides. El color verde oscuro es un rasgo de calidad deseado por los consumidores.

T l - Al r l l r l i f li r l i l i B l r l i B-

(continuación)

La tabla 8 ofrecía una imagen similar para el diploide B y el tetraploide B-3, excepto que no se encontraron diferencias significativas en el tamaño medio de las células de la epidermis inferior. Sin embargo, como en la Tabla 7, tanto las células de la epidermis superior como las de la empalizada eran significativamente mayores en el tetraploide en comparación con el diploide del que derivan (el promedio de las células de la epidermis superior y de la empalizada de B-3 era 119 % y 120 % de la de B).

Por lo tanto, se puede concluir que la tetraploidización conduce a células significativamente más grandes (en promedio) de la epidermis superior y del tejido de empalizada, y en ciertos casos también de la epidermis inferior. Por tanto, este aumento del tamaño de las células en las capas celulares adaxiales (epidermis superior y células de la empalizada) es lo que hace que las hojas sean más gruesas y firmes. El aumento del tamaño de las células es probablemente el responsable de una sensación en boca más crujiente/crocante cuando se consume y probablemente también da a las hojas un color verde más oscuro.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una planta de la especie Valerianella locusta, en la que dicha planta es un tetraploide derivado de una línea o variedad de cultivo diploide de Valerianella locusta y en la que la longitud media de la hoja del tetraploide es igual o inferior al 95 % de la planta diploide de la que se derivó.

2. La planta de acuerdo con la reivindicación 1, en la que las hojas tienen una relación anchura/longitud significativamente mayor que las hojas de la planta diploide de la que deriva el tetraploide.

3. La planta de acuerdo con la reivindicación 2, en la que dichas hojas tienen una relación promedio de anchura: longitud que es al menos 105 %, preferiblemente al menos 110 % de la relación de anchura: longitud del diploide del que se derivó.

4. La planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha planta tiene hojas significativamente más gruesas que la planta diploide de la que deriva.

5. La planta de acuerdo con la reivindicación 4, en la que dicha planta tiene un grosor promedio de la hoja que es al menos 105 %, preferiblemente al menos 110 %, del grosor promedio de la hoja de la planta diploide de la que se derivó.

6. La planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha planta fue generada por intervención humana, preferentemente por duplicación cromosómica inducida.

7. Una planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la planta diploide de la que se deriva dicho tetraploide es una variedad o línea de V. locusta seleccionada de: un tipo de roseta, un tipo de hoja larga, una variedad o línea adaptada para el cultivo de invierno, una variedad o línea adaptada para el cultivo de verano, una variedad para el cultivo durante todo el año.

8. Una planta tetraploide de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, obtenida mediante el cruce de una planta tetraploide depositada con el número de acceso NCIMB41651 o NCIMB41652, o su progenie, con otra planta tetraploide.

9. Una pluralidad de hojas cosechadas y/o plantas cosechadas y/o partes de una planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Las hojas cosechadas o las plantas o partes de plantas cosechadas de la reivindicación 9, en las que dichas hojas y/o plantas y/o partes de plantas tienen una vida útil más larga y/o una sensación en boca más crujiente que las derivadas de la planta diploide de la que se derivó el tetraploide.

11. Semillas a partir de las cuales se puede cultivar una planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

12. Un cultivo de células o tejidos de una planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

13. Un método para producir plantas tetraploides de la especie Valerianella locusta, que comprende:

a. proporcionar una célula vegetal diploide cultivada, un tejido, un órgano, una semilla o una plántula de una línea o variedad de reproducción de la especie Valerianella locusta,

b. inducir la duplicación de cromosomas en dicha célula vegetal, tejido, órgano, semilla o plántula, c. producir una planta tetraploide a partir de b).

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, comprende además cultivar las plantas tetraploides obtenidas de c) y cosechar las plantas y/o partes de plantas.