ES2708782T3 - Cuantificación del genoma de anelovirus como biomarcador de la inmunosupresión - Google Patents
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Abstract
Método para caracterizar el estado inmunosuprimido o no inmunosuprimido de un sujeto, que comprende las etapas siguientes: a. determinar la carga anelovírica a partir de una muestra biológica de dicho sujeto, y b. determinar a partir de la comparación de la etapa a) el estado inmunosuprimido o no inmunosuprimido.
Description
DESCRIPCION
Cuantificacion del genoma de anelovirus como biomarcador de la inmunosupresion.
La presente invencion se refiere al uso de la medida de la carga adenovrnca para la determinacion de la inmunosupresion. Mas espedficamente, la invencion se refiere a un metodo para el diagnostico de la inmunosupresion en un sujeto basado en la carga viral de anelovirus.
El sistema inmunitario defiende a un organismo frente a agresiones tales como infeccion de patogenos, transformacion celular, y dano ffsico o qmmico. Cuando el sistema inmunitario es menos activo que el normal, se produce la inmunodeficiencia o inmunosupresion, dando como resultado infecciones potencialmente mortales o cancer. La inmunosupresion es una afeccion en la que la capacidad del sistema inmunitario para combatir enfermedades, por ejemplo enfermedades infecciosas o cancer, esta comprometida o totalmente ausente. La inmunosupresion adopta diversas formas, y puede afectar al sistema inmunitario innato o al adaptativo, o a ambos, dependiendo de la fuente de la deficiencia. Habitualmente da como resultado infecciones recurrentes o potencialmente mortales.
La inmunosupresion puede ser el resultado de enfermedades, o se puede producir mediante farmacos o por una infeccion, dando como resultado una mayor susceptibilidad a infecciones secundarias por patogenos tales como bacterias y virus.
Muchas enfermedades se caracterizan asf por el desarrollo de inmunosupresion progresiva en el paciente. La presencia de una respuesta inmunitaria alterada en pacientes con neoplasias (por ejemplo leucemia, linfoma, mieloma multiple) esta bien documentada. Tambien se ha observado inmunosupresion progresiva en ciertas infecciones cronicas tales como SIDA, septicemia, lepra, infecciones por citomegalovirus, malaria, lupus, y similares. La inmunodeficiencia es tambien un efecto adverso potencial de muchos tratamientos terapeuticos (por ejemplo radioterapia o quimioterapia). En tal situacion de inmunosupresion no deliberada, los pacientes son tratados habitualmente con inmunoestimulantes (por ejemplo citocinas), a fin de estimular el sistema inmunitario del paciente. Sin embargo, los inmunoestimulantes carecen de especificidad, por cuanto activan el sistema inmunitario en general. Si no se administran con cautela, pueden disparar una sobreactivacion del sistema inmunitario, dando como resultado una mala tolerancia.
Como alternativa, la inmunosupresion puede resultar de un intento deliberado de debilitar el sistema inmunitario. En general, la inmunosupresion inducida deliberadamente se lleva a cabo mediante administracion de farmacos inmunosupresores, a fin de evitar que el cuerpo rechace un transplante de organo, o para el tratamiento de enfermedades autoinmunes. Los tratamientos inmunosupresores, sin embargo, cuando son inapropiados o inadecuados, pueden conducir a un estado de sobreinmunosupresion en el que el paciente es extremadamente vulnerable a infecciones. De hecho, las infecciones oportunistas y las neoplasias siguen siendo una causa significativa de muerte tras el transplante, y son consecuencias obvias de la sobreinmunosupresion.
Debido a la gran diversidad de causas, y debido a que cada una de esas causas puede afectar al sistema inmunitario en un aspecto diferente, se han desarrollado diferentes diagnosticos para la inmunosupresion. Existen algunas medidas no espedficas y espedficas de patogenos de la funcion inmunitaria mediada por celulas (Fishman et al. N Engl J Med. 2007, Fishman et al. Liver Transpl. 2011). Los ensayos de la funcion inmunitaria mediada por celulas incluyen el analisis del subconjunto de linfocitos, particularmente el recuento de celulas T CD4+ o la medida de la relacion de celulas T CD4+/CD8+, el ensayo de la funcion neutrofflica, el ensayo de la activacion de NK, el ensayo de proliferacion de linfocitos (Hutchinson et al. Nephrol Dial Transplant 2003).
Sin embargo, esos ensayos no son suficientemente sensibles para detectar ligeros cambios en el sistema inmunitario. Adicionalmente, cada uno de esos ensayos se centra en evaluar la integridad de la ruta o mecanismo espedficos del sistema inmunitario. Ninguno de ellos se basa en la evaluacion del resultado final, que es la capacidad del sistema inmunitario para responder a o controlar infecciones.
Actualmente no hay ningun metodo universal para el diagnostico de la inmunosupresion que se pudiese usar universalmente, esto es, para cualquier causa sospechosa de inmunosupresion. De este modo, continua existiendo la necesidad de un ensayo rapido, fiable y no invasivo que evalue de forma precisa el estado inmunitario de un paciente. Especialmente, un metodo de diagnostico que permitiese la evaluacion de la capacidad del sistema inmunitario para responder a las infecciones se podna usar para ajustar de forma fina los tratamientos inmunosupresores a las necesidades apropiadas de los pacientes, y evitar la sobreinmunosupresion.
Moen, E.M. et al. J. Med. Virol. 70:177-182, 2003 ensenan una tendencia dirigida a incrementar la viremia de TTV y TLMV en pacientes que reciben inmunosupresion tras el transplante de rinon. Los inventores han encontrado que la carga anelovmca es un marcador fiable del estado inmunitario, y de este modo se puede usar para el diagnostico de la inmunosupresion.
Descripcion detallada
Los anelovirus (ANV) son virus que infectan a mas del 90% de los individuos. Son frecuentes las infecciones mixtas con varias cepas y especies de ANV, y la mayona de los sujetos hospedan por lo menos una de ellas, pero no se ha atribuido ninguna consecuencia patologica a la infeccion por ANV. En particular, en la tecnica anterior no se ha identificado ninguna correlacion clara entre la carga anelovmca y el estado inmunitario del sujeto. Los pacientes en tratamiento inmunosupresor mostraron en general un incremento en la carga de cepas vmcas espedficas (por ejemplo TLMV y TTV). Sin embargo, las variaciones entre individuos fueron tales que la unica informacion relevante solamente se pudo obtener examinando los cambios en la carga vmca de cada individuo. En particular, no se pudo sacar ninguna conclusion a partir de la comparacion de los grupos de pacientes, tratados o no tratados. De este modo, los metodos de la tecnica anterior no permitieron la determinacion del estado inmunosupresivo de un sujeto y el diseno de un tratamiento espedfico del mismo (Moen et al., J Med Virol, 70(1): 177-182, 2003; Moen et al., AIDS, 16(12): 1679-1682, 2002; Christensen et al., J Infect Dis, 181: 1796-1799, 2000; Shibayama et al., AIDS, 15: 563-570, 2001; Touinssi et al., J Clin Virol, 21: 135 141, 2001).
Por el contrario, los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que la carga anelovmca se puede usar como un marcador para la inmunosupresion. Mientras que los estudios previos se basaron en la PCR, y de este modo eran muy dependientes del diseno de los cebadores, dando como resultado variantes perdidas de este virus enormemente variable (Moen et al., J Virol Methods, 104(1): 59-67, 2002), los presentes inventores usaron Secuenciacion de Alto Rendimiento (HTS). Esta tecnica condujo a la identificacion de un intervalo amplio e imparcial de secuencias de ANV, permitiendo a los presentes inventores demostrar la existencia de una correlacion entre la carga anelovmca y la inmunosupresion, con un grado elevado de confianza. En particular, los inventores han encontrado que los sujetos inmunosuprimidos tienen una mayor carga anelovmca en comparacion con los sujetos sanos. La medida de la carga global de los virus de la familia de anelovirus se puede usar asf como un marcador del estado inmunitario del sujeto. De forma mas precisa, segun la invencion, una carga anelovmca elevada en un sujeto indica que dicho sujeto esta inmunosuprimido.
De este modo, en un primer aspecto, la invencion se refiere a un metodo para caracterizar el estado inmunosuprimido o no inmunosuprimido de un sujeto, que comprende las etapas siguientes:
a) determinar la carga anelovmca a partir de una muestra biologica de dicho sujeto, y
b) evaluar a partir de la determinacion de la etapa a) el estado inmunosuprimido o no inmunosuprimido. El termino “inmunosupresion” (o “inmunodepresion” o “inmunodeficiencia”), como se usa aqrn, se refiere a la reduccion o supresion de la funcion del sistema inmunitario, es decir, la inmunosupresion representa generalmente un estado en el que se reduce o esta ausente una funcion del sistema inmunitario espedfica y/o no espedfica del sujeto. Se puede debilitar la respuesta inmunitaria completa, o una poblacion particular de los linfocitos inmunologicamente activos se puede ver afectada de forma selectiva. En algunos casos, el efecto puede ser preferentemente sobre celulas T en lugar de sobre celulas B. Si se ven afectadas las celulas B, puede ser sobre una subclase espedfica de celulas productoras de anticuerpo. La inmunosupresion espedfica del antfgeno puede ser el resultado de la eliminacion o supresion de un clon particular de celulas espedficas de un antfgeno, o el resultado de una regulacion aumentada de la respuesta inmunitaria por celulas supresoras espedficas del antfgeno. Tambien puede ser el resultado de una mayor produccion de anticuerpo antiidiotfpico. La inmunosupresion puede resultar de ciertas enfermedades tales como SIDA o linfoma, o de ciertos farmacos tales como algunos de los usados para tratar el cancer. La inmunosupresion tambien se puede inducir deliberadamente con farmacos, como en la preparacion para el transplante de medula osea o de otros organos, para evitar el rechazo del transplante. De este modo, la inmunosupresion segun la invencion puede ser de cualquier origen, tal como, por ejemplo, pero sin limitarse a, tratamiento inmunosupresivo, efectos secundarios inmunosupresivos de farmacos o terapia, incluyendo radioterapia, rasgos o enfermedades geneticas inmunosupresoras heredadas, enfermedades inmunosupresoras adquiridas tales como SIDA, canceres tales como leucemia o linfoma.
Por “estado inmunosuprimido” se refiere aqrn a una afeccion en la que la funcion del sistema inmunitario de un sujeto esta reducida o ausente. De este modo, segun la invencion, se considera que los terminos “inmunosuprimido”, “inmunodeprimido”, o “inmunocomprometido” tienen todos ellos el mismo significado. En una realizacion particular, el “estado inmunosuprimido” del sujeto significa la capacidad del sujeto para controlar la infeccion vmca, es decir, la capacidad del sujeto para prevenir la amplificacion vmca a partir de dicha infeccion vmca.
Es diffcil de evaluar de forma precisa el estado inmunosuprimido de un sujeto con los metodos de la tecnica anterior. Esto puede conducir a situaciones en las que se administra a un paciente que lo necesita una dosis demasiado elevada de un tratamiento inmunosupresivo. Tambien es posible que no se administre a un paciente
una dosis suficientemente elevada de un tratamiento inmunoestimulante, debido a que no se determino correctamente el estado inmunosuprimido de dicho paciente. Las consecuencias para la salud del paciente son potencialmente graves en tal situacion. Por ejemplo, los tratamientos inmunosupresores, cuando son inapropiados o inadecuados, pueden conducir a un estado de sobreinmunosupresion, lo que deja al paciente muy susceptible a las infecciones. Por otro lado, es importante ser capaces de identificar de forma fiable pacientes cronicamente inmunosuprimidos, a fin de proporcionarles el tratamiento mas adecuado.
El metodo de la invencion permite la determinacion precisa del estado inmunosuprimido del sujeto, permitiendo que se personalice un tratamiento espedfico a las necesidades del paciente. La determinacion previa del estado inmunosuprimido del paciente con el metodo de la invencion conduce asf a un tratamiento mas seguro que los tratamientos disenados en base a los metodos de la tecnica anterior.
De este modo, la presente invencion tambien se refiere a un metodo para disenar un tratamiento de inmunomodulacion para un sujeto, comprendiendo dicho metodo:
a) determinar a partir de una muestra biologica de un sujeto la carga anelovrnca, y
b) evaluar a partir de la determinacion de la etapa a) el estado inmunosuprimido o no inmunosuprimido, y c) disenar el tratamiento de inmunomodulacion segun dicho estado inmunosuprimido o no inmunosuprimido evaluado en la etapa b).
La invencion tambien se refiere a un metodo de tratamiento de una afeccion asociada con inmunodeficiencia. Como se usa aqm, “condiciones asociadas con inmunodeficiencia” o “trastornos de inmunodeficiencia” se refieren a un grupo diverso de afecciones caracterizadas principalmente por una mayor susceptibilidad a diversas infecciones oportunistas con enfermedad grave aguda, recurrente o cronica severa. En una primera realizacion, esta mayor susceptibilidad a infeccion resulta de la inmunosupresion debida a uno o mas defectos en el sistema inmunitario. En este caso, la inmunosupresion no es deliberada. Los trastornos de inmunodeficiencia engloban, sin limitacion, “smdromes de inmunodeficiencia”, en los que todas las caractensticas son el resultado del defecto inmunitario, y “smdromes con inmunodeficiencia”, en los que algunas caractensticas, incluso las mas prominentes, no pueden ser explicadas por el defecto inmunitario. A tftulo de ejemplo y no de limitacion, las enfermedades y afecciones asociadas con inmunodeficiencia o inmunosupresion comprenden: infeccion por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y smdrome de inmunodeficiencia adquirida (SlDA), hipogammaglobulinemia, canceres hematologicos tales como leucemia y linfoma, linfocitopenia (linfopenia) de cualquier origen, lupus eritematoso, caquexia, abuso de opioides, mastocitosis, fiebre reumatica, tripanosomiasis, abuso de alcohol.
El grupo de trastornos de inmunodeficiencia tambien engloba enfermedades y afecciones asociadas con inmunosupresion que surgen de una disminucion o prevencion artificial, habitualmente controlada, de una respuesta inmunitaria del sujeto. De este modo, la supresion en los sujetos es inducida deliberadamente. Puede estar causada por tratamiento inmunosupresor, o puede aparecer como un efecto secundario de una terapia de otras indicaciones (por ejemplo, efecto secundario de la quimioterapia contra el cancer). Estas ultimas afecciones incluyen afecciones tales como ablacion total de la medula osea, transplante de la medula osea, transplante de organos, tratamiento con farmacos inmunosupresores tales como, entre otros, tacrolimus, ciclosporina, metotrexato, micofenolato, azatiprina, interferones, e inmunoglobulinas tales como anti-CD20 y anti-CD3; y tratamientos con: agentes quimioterapeuticos, corticosteroides, farmacos anti-TNF, radiacion.
De este modo, la presente invencion tambien se refiere a un metodo para tratar una afeccion asociada con inmunodeficiencia en un sujeto, comprendiendo dicho metodo:
a) determinar el estado inmunosuprimido o no inmunosuprimido de dicho sujeto segun los metodos de la invencion, y
b) adaptar un tratamiento de inmunomodulacion al mencionado sujeto.
De este modo, la presente invencion se refiere a un tratamiento de inmunomodulacion para su uso en el tratamiento de una afeccion asociada con inmunodeficiencia en un sujeto, en el que el uso comprende las etapas siguientes:
a) el estado inmunosuprimido o no inmunosuprimido de dicho sujeto se determina segun los metodos de la invencion, y
b) dicho tratamiento de inmunomodulacion se adapta al mencionado sujeto.
En otras palabras, la invencion se refiere al uso de un tratamiento de inmunomodulacion en la preparacion de un medicamento para tratar una afeccion asociada con inmunodeficiencia en un sujeto, en el que:
a) el estado inmunosuprimido o no inmunosuprimido de dicho sujeto se determina segun los metodos de la invencion, y
b) dicho tratamiento de inmunomodulacion se adapta al mencionado sujeto.
Por “tratamiento de inmunomodulacion” se quiere decir aqu cualquier tratamiento destinado a inducir, potenciar, inhibir o suprimir una funcion inmunitaria. Segun una realizacion preferida, un tratamiento de inmunomodulacion es un tratamiento inmunosupresor. Segun otra realizacion preferida, un tratamiento de inmunomodulacion es un tratamiento inmunoestimulante.
Por “tratamiento inmunosupresor” se quiere decir aqu cualquier tratamiento destinado a inhibir o suprimir una funcion inmunitaria de un sujeto que sena adversa a un resultado clmico deseado. Los tratamientos inmunosupresores incluyen, por ejemplo, tratamientos que estan destinados a inducir la deficiencia de la funcion inmunitaria en un sujeto a fin de tratar dicho sujeto con un transplante de celulas o de un organo. Tambien incluyen, por ejemplo, tratamientos que inducen deficiencia de la funcion inmunitaria como efecto secundario, tal como quimioterapia o radioterapia. Los tratamientos inmunosupresores a los que se refiere la invencion usan glucocorticoides, farmacos antiproliferativos y antimetabolicos (rapamicina, everolimus, micofenolato mofetilo, acido micofenolico), inhibidores de calcineurina (ciclosporina, FK506, voclosporina), agonistas de S1P-R (FTY720), malononitrilamidas (FK7778), y anticuerpos (por ejemplo, globulina antitimodtica), incluyendo anticuerpos monoclonales (por ejemplo muromonab-CD3, daclizumab, basiliximab, rituximab, alemtuzumab, infliximab, adalimumab, efalizumab).
Un “tratamiento inmunoestimulante”, segun la presente invencion, es cualquier tipo de tratamiento destinado a inducir o potenciar la funcion inmunitaria. Los tratamientos inmunoestimulantes incluyen tratamientos que estimulan la respuesta inmunitaria espedfica, tratamientos que estimulan la respuesta inmunitaria no espedfica, y tratamientos que estimulan las respuestas inmunitarias tanto espedficas como no espedficas. Tales tratamientos inmunoestimulantes se administran habitualmente para tratar afecciones asociadas con inmunosupresion no deliberada. Los tratamientos inmunoestimulantes a los que se refiere la invencion usan pequenas moleculas sinteticas (poli I:C, levamisol, inosina pranobex) a microorganismos vivos (Corynebacterium parvum), e incluyen mezclas complejas de componentes bacterianos con aceites minerales (adyuvante de Freund) o sales inorganicas (hidroxido/fosfato de aluminio y magnesio), y, mas recientemente, protemas recombinantes que modulan la inmunidad (por ejemplo, citocinas, anticuerpos contra receptores celulares). Segun la presente invencion, los tratamientos antivirales tambien son considerados tratamientos inmunoestimulantes. Los tratamientos antivirales incluyen, por ejemplo, oseltamivir (Tamiflu), zanamivir (Relenza), interferon, que inhibe la smtesis vmca en celulas infectadas, particularmente alfa-interferon, usado en el tratamiento de hepatitis B y C.
De este modo, en una realizacion del metodo de la invencion, el tratamiento de inmunomodulacion es un tratamiento inmunosupresor. En otra realizacion del metodo de la invencion, el tratamiento de inmunomodulacion es un tratamiento inmunoestimulante.
Dicha adaptacion del tratamiento de inmunomodulacion puede ser una reduccion o supresion del mencionado tratamiento de inmunomodulacion, o la continuacion del mencionado tratamiento de inmunomodulacion a la misma dosis o a una mayor. La persona experta apreciara que el tratamiento se continuara si no se logra el efecto deseado sobre el sistema inmunitario del sujeto. Por ejemplo, cuando el tratamiento se administra para estimular la funcion del sistema inmunitario a fin de compensar un deficit de la misma, el tratamiento se continua si el paciente muestra un fenotipo inmunosuprimido. Igualmente, un tratamiento inmunosupresor se continuara si el sujeto presenta un estado no inmunosuprimido. Por otro lado, el tratamiento se reducira o se suprimira si se ha logrado el efecto deseado sobre el sistema inmunitario del sujeto. Este es el caso, por ejemplo, cuando el tratamiento busca obtener inmunosupresion a fin de llevar a cabo, por ejemplo, un transplante de organo, mientras el sujeto muestra un estado de inmunosupresion.
En una realizacion preferida, la afeccion asociada con inmunodeficiencia es rechazo de transplante.
De este modo, la invencion se refiere a un metodo para tratar o prevenir el rechazo de transplante en un sujeto transplantado, comprendiendo dicho metodo:
a) determinar el estado inmunosuprimido o no inmunosuprimido de dicho sujeto transplantado segun los metodos de la invencion, y
b) adaptar un tratamiento inmunosupresor al mencionado sujeto transplantado.
De este modo, la presente invencion proporciona un tratamiento inmunosupresor para su uso en el tratamiento o prevencion de rechazo de transplante en un sujeto transplantado, en el que dicho uso comprende las etapas siguientes:
a) determinar el estado inmunosuprimido o no inmunosuprimido de dicho sujeto transplantado segun los metodos de la invencion, y
b) adaptar dicho tratamiento inmunosupresor al mencionado sujeto transplantado.
En otras palabras, la invencion se refiere al uso de un tratamiento inmunosupresor en la preparacion de un medicamento para tratar o prevenir rechazo de transplante en un sujeto transplantado, en el que:
a) el estado inmunosuprimido o no inmunosuprimido de dicho sujeto transplantado se determina segun los metodos de la invencion, y
b) dicho tratamiento inmunosupresor se adapta al mencionado sujeto transplantado.
En otra realizacion preferida, la afeccion asociada con inmunodeficiencia es una infeccion.
De este modo, esta realizacion se refiere a un metodo para tratar una infeccion en un sujeto infectado, comprendiendo dicho metodo:
a) determinar el estado inmunosuprimido o no inmunosuprimido de dicho sujeto infectado segun los metodos de la invencion, y
b) adaptar un tratamiento inmunoestimulante al mencionado sujeto infectado.
De este modo, la presente invencion proporciona un tratamiento inmunoestimulante para su uso en el tratamiento de una infeccion en un sujeto infectado, en el que el uso comprende las etapas siguientes:
a) determinar el estado inmunosuprimido o no inmunosuprimido de dicho sujeto transplantado segun los metodos de la invencion, y
b) adaptar dicho tratamiento inmunoestimulante al mencionado sujeto.
En otras palabras, la invencion se refiere al uso de un tratamiento inmunoestimulante en la preparacion de un medicamento para tratar una infeccion en un sujeto infectado, en el que:
a) el estado inmunosuprimido o no inmunosuprimido de dicho sujeto transplantado se determina segun los metodos de la invencion, y
b) dicho tratamiento inmunoestimulante se adapta al mencionado sujeto transplantado.
Un anelovirus segun la invencion es un virus sin cubierta, con un genoma de ADN monocatenario circular pequeno, que se replica a traves de intermedios bicatenarios, y que puede contener hasta 4 marcos de lectura abiertos: ORF1, o Rf2, ORF3 y ORF4. Los marcos de lectura abiertos (ORF) 1 (largo) y 2 (corto) solapan parcialmente. ORF3 y ORF4 son mas pequenos. Los anelovirus se subagrupan en torque teno virus (tTv ), torque teno mini virus (TTMV), y torque teno midi virus (TTMDV), con hospedantes conocidos que incluyen seres humanos, primates no humanos y animales domesticos (Biagini et al., J Gen Virol, 88: 2696-2701, 2007; Hino y Miyata, Rev Med Virol, 17: 45-57, 2007; Leary et al., J Gen Virol, 80: 2115-2120., 1999).
Por “anelovirus”, se hace referencia aqrn a cualquier virus que pertenezca a la familia de virus Anelloviridae, incluyendo, pero sin limitarse a, los Teno virus (TTVs), los Torque Teno midivirus (TTMDVs), y los Torque Teno minivirus, tambien conocidos antiguamente como minivirus similares a Torque Teno (TTMVs). La cepa prototfpica de Torque Teno Virus (TTV-1a) tiene un tamano genomico de 3853 nucleotidos. La cepa prototfpica de Torque Teno Minivirus, antiguamente conocida como minivirus similar a TTV (TTMV-NLC030), tiene un tamano genomico de 2915 nucleotidos. Finalmente, se ha descrito el Torque Teno Midivirus, con un genoma de 3242 nucleotidos para la cepa prototfpica (TTMDV-MD1-073). Los anelovirus son muy variables en secuencia. Por ejemplo, las secuencias nucleotfdicas de los genomas de longitud completa de TTV pueden variar en un 40%, y las de TTMDV en un 33%.
La “carga viral”, segun la invencion, es el numero de secuencias de acidos nucleicos de un virus presentes en una muestra biologica. La carga viral refleja la gravedad de una infeccion vmca. Preferentemente, la carga viral se refiere a la proporcion de secuencias de acidos nucleicos en una muestra biologica que pertenecen al mencionado virus. Mas preferentemente, la carga viral representa el numero de copias del mencionado virus en una muestra biologica. La carga viral se puede determinar, por ejemplo, estimando la cantidad del virus en una muestra biologica procedente de un sujeto.
Como se usa aqrn, el termino “sujeto” se refiere a un vertebrado, preferentemente un mairnfero, y lo mas
preferentemente a un ser humano.
Por “muestra biologica”, se hace referencia aqu a cualquier muestra que se tome de un sujeto, que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, sangre, suero, plasma, esputo, orina, heces, piel, fluido cerebroespinal, saliva, secreciones gastricas, semen, fluido seminal, lagrimas, tejido o fluido espinal, fluido cerebral, muestra de ganglio trigeminal, una muestra de ganglio sacro, tejido adiposo, tejido linfoide, tejido placentario, tejido del aparato reproductor superior, tejido del tubo digestivo, tejido de genitales masculinos, y tejido del sistema nervioso central fetal. Preferentemente, la muestra biologica es sangre o deriva de sangre, tal como plasma o suero.
Segun la invencion, la carga anelovmca en un sujeto significa la carga vmca de cualquier virus de la familia Anelloviridae hospedado por dicho sujeto. De este modo, la determinacion de la carga anelovmca en un sujeto segun la invencion comprende estimar el numero de secuencias de cualquier virus de la familia Anelloviridae en una muestra biologica procedente de dicho sujeto. En particular, no hay ninguna seleccion, segun la invencion, de especies anelovmcas espedficas a medir en dicha muestra biologica. Preferentemente, determinar la carga anelovmca comprende determinar la cantidad de copias vmcas activas y/o inactivas. Comprende determinar la cantidad de copias vmcas circulantes, integradas, o latentes. Mas preferentemente, la carga anelovmca corresponde a copias circulantes de anelovirus.
Los niveles de anelovirus se pueden determinar midiendo los niveles de ADN anelovmco, ARN anelovmco, o protemas anelovmcas. El metodo segun la invencion puede comprender asf otra etapa preliminar, entre la toma de la muestra procedente del paciente y la etapa a) como se define anteriormente, que corresponde a la transformacion de la muestra biologica en una muestra de ADN bicatenario (ADNbc), o en una muestra de ARNm (o ADNc correspondiente), o en una muestra proteica, que entonces esta lista para el uso para la deteccion in vitro de anelovirus en la etapa a). Dicho ADNbc puede corresponder a todo el genoma del anelovirus, o solamente a una porcion del mismo. Una vez que se dispone de un ADNbc, ARNm (o ADNc correspondiente) o una muestra proteica listos para el uso, la deteccion del anelovirus se puede llevar a cabo, dependiendo del tipo de transformacion y de la muestra disponible lista para el uso, a nivel del ADN genomico (es decir, basado en la presencia de por lo menos una secuencia que consiste en por lo menos una parte del genoma del anelovirus), a nivel del ARNm (es decir, basado en el contenido de ARNm de la muestra), o a nivel proteico (es decir, basado en el contenido proteico de la muestra).
Preferentemente, los niveles de anelovirus se determinan midiendo los niveles de ADN anelovmco.
Los metodos para detectar un acido nucleico en una muestra biologica incluyen, entre otros, la hibridacion con una sonda marcada, la amplificacion, incluyendo amplificacion mediante PCR, la secuenciacion, y todos los otros metodos conocidos por la persona de pericia en la tecnica. La cantidad de transcritos de acido nucleico se puede medir mediante cualquier tecnologfa conocida por la persona experta. En particular, la medida se puede llevar a cabo directamente sobre una muestra de a Rn mensajero (ARNm) extrafda, o sobre ADN complementario (ADNc) retrotranscrito preparado a partir de ARNm extrafdo, mediante tecnologfas bien conocidas en la tecnica. A partir de la muestra de ARNm o de ADNc, la cantidad de transcritos de acido nucleico se puede medir usando cualquier tecnologfa conocida por una persona experta en la tecnica, incluyendo micromatrices nucleicas, PCR cuantitativa, e hibridacion con una sonda marcada.
En una primera realizacion de la invencion, los niveles de ADN anelovmco se miden mediante secuenciacion. Como se usa aqrn, el termino “secuenciacion” se usa en un sentido amplio, y se refiere a cualquier tecnica conocida por la persona experta, incluyendo, pero sin limitarse a, secuenciacion de terminacion de cadena o didesoxi de Sanger, secuenciacion de genoma completo, secuenciacion mediante hibridacion, pirosecuenciacion, electroforesis capilar, secuenciacion dclica, secuenciacion de extension de una sola base, secuenciacion en fase solida, secuenciacion de alto rendimiento, secuenciacion distintiva masivamente paralela (MPSS), secuenciacion mediante terminador reversible marcado con colorante, secuenciacion de extremos pareados, secuenciacion de termino cercano, secuenciacion con exonucleasas, secuenciacion mediante ligacion, secuenciacion de lectura corta, secuenciacion de una sola molecula, secuenciacion mediante smtesis, secuenciacion en tiempo real, secuenciacion mediante terminador inverso, secuenciacion por nanoporos, secuenciacion 454, secuenciacion mediante analizador del genoma de Solexa, secuenciacion SOLiD(R), secuenciacion MS-PET, espectrometna de masas, y combinaciones de las mismas.
Opcionalmente, el ADN se fragmenta aleatoriamente, generalmente mediante metodos ffsicos, antes de la secuenciacion. El ADN anelovmco se puede secuenciar mediante cualquier tecnica conocida en la tecnica, incluyendo secuenciacion mediante ligacion, pirosecuenciacion, secuenciacion mediante smtesis, o secuenciacion de una sola molecula. La secuenciacion tambien incluye tecnicas a base de PCR, tales como, por ejemplo, PCR cuantitativa o PCR en emulsion.
La secuenciacion se lleva a cabo sobre todo en ADN contenido en la muestra biologica, o sobre porciones del ADN contenido en la muestra biologica. Estara claro inmediatamente para la persona experta que dicha muestra contiene por lo menos una mezcla de ADN anelovmco y de ADN procedente del sujeto hospedante. Ademas, es probable que el ADN adenovmco represente solamente una fraccion pequena del ADN total presente en la
muestra.
Un primer enfoque que aborda estos retos es secuenciar y cuantificar secuencias que se sabe que son espedficas del genoma del anelovirus. De hecho, los inventores han identificado dos secuencias de consenso, representadas por SEC ID No. 4 y SEC ID No. 5, en base a la comparacion entre todas las secuencias anelovmcas. Estas dos secuencias de consenso, que son capaces de hibridarse a todos los genomas anelovmcos, son asf muy convenientes como cebadores para secuenciar dicho ADN del anelovirus.
De este modo, segun esta realizacion, el metodo de la invencion comprende usar para la secuenciacion los cebadores de secuencias representadas por SEC ID No. 4 y SEC ID No. 5. En una realizacion preferida, el metodo de la invencion comprende una etapa de cuantificar el numero de lecturas.
En todavfa una realizacion preferida adicional, el metodo de la invencion comprende otra etapa adicional de normalizar dicho numero de lecturas con respecto a una referencia. Dicha referencia puede ser cualquier secuencia de ADN conveniente que se pueda identificar y cuantificar, por ejemplo una secuencia de ADN hospedante o una secuencia exogena. Para la secuenciacion cuantitativa, es particularmente ventajoso anadir ab initio en las muestras una cantidad conocida de acidos nucleicos de referencia, acidos nucleicos de referencia los cuales pasaran a traves de todas las etapas de preparacion de la muestra antes de la secuenciacion. Las etapas de preparacion de la muestra pueden comprender medios para proteger el acido nucleico vmco y destruir los acidos nucleicos del hospedante, por ejemplo usando diferentes nucleasas.
Aunque los mencionados cebadores se pueden usar en disolucion, es preferible que los mencionados cebadores esten enlazados a un soporte solido.
Para permitir su acoplamiento covalente al soporte, el cebador generalmente se funcionaliza. De este modo, se puede modificar mediante un grupo terminal tiolico, ammico o carboxflico en la posicion 5' o 3'. En particular, la adicion de un grupo tiolico, ammico o carboxflico hace posible, por ejemplo, acoplar el oligonucleotido a un soporte que posea funciones de disulfuro, de maleimida, de amina, carboxflica, de ester, epoxfdica, de bromuro de cianogeno, o aldehudica. Estos acoplamientos se forman mediante el establecimiento de enlaces de disulfuro, de tioeter, de ester, de amida o de amina entre el cebador y el soporte. Se puede usar cualquier otro metodo conocido por la persona experta en la tecnica, tal como, por ejemplo, reactivos de acoplamiento bifuncionales. Ademas, para mejorar la hibridacion con el oligonucleotido acoplado, puede ser ventajoso que el oligonucleotido contenga una secuencia “brazo” y una secuencia “espaciadora” de bases. El uso de un brazo hace posible, en efecto, unir el cebador a una distancia escogida desde el soporte, permitiendo que se mejoren sus condiciones de interaccion con el ADN. El brazo consiste ventajosamente en una cadena de carbono lineal, que comprende 1 a 18, y preferentemente 6 o 12 grupos (CH2), y una amina que permite la union a la columna. El brazo esta enlazado a un fosfato del oligonucleotido o de un “espaciador” compuesto de bases que no interfieren con la hibridacion. De este modo, el “espaciador” puede comprender bases purmicas. Como ejemplo, el “espaciador” puede comprender la secuencia GAGG. El brazo esta compuesto ventajosamente de una cadena de carbono lineal que comprende 6 o 12 atomos de carbono.
Para implementar la presente invencion, se pueden usar diferentes tipos de soporte. Estos pueden ser soportes cromatograficos funcionalizados, a granel o empaquetados previamente en una columna, superficies plasticas funcionalizadas o perlas de latex funcionalizadas, magneticas o de otro modo. Preferentemente se usan soportes cromatograficos. Como ejemplo, los soportes cromatograficos capaces de ser usados son agarosa, acrilamida, o dextrano, asf como sus derivados (tales como sefadex, sefarosa, superosa, etc.), polfmeros tales como poli(estireno/divinilbenceno), o sflice injertada o no injertada, por ejemplo. Las columnas de cromatograffa pueden operar en el modo de difusion o de perfusion.
De este modo, en una realizacion particular, los cebadores anteriores representados por SEC ID No 4 y 5 comprenden ademas:
- un grupo funcional para el acoplamiento covalente al extremo 5' o 3', tal como, pero sin limitarse a, un grupo que comprende un grupo terminal tiolico, ammico o carboxflico;
- una molecula o secuencia espaciadora se anade en el extremo 5' o 3', molecula o secuencia espaciadora la cual es como se caracteriza anteriormente;
- opcionalmente, unas secuencias adicionales como secuencias mdice o etiquetadoras para llevar a cabo las etapas de pre y posamplificacion adicionales y generales que no dependen de las secuencias diana que se deben cuantificar.
Otro enfoque es usar un metodo que permita el genotipado cuantitativo con alta precision de acidos nucleicos obtenidos a partir de la muestra biologica. En una realizacion de este enfoque, la precision se logra mediante analisis de un gran numero (por ejemplo, millones o miles de millones) de moleculas de acido nucleico sin
ninguna amplificacion usando protocolos que se basan en el conocimiento previo de las secuencias diana (es dedr, en este caso, secuencias de anelovirus). Una realizacion usa secuenciacion de ADN masivamente paralela, tal como, pero sin limitarse a, la realizada por la plataforma Illumina Genome Analyzer (Bentley et al. Nature; 456: 53-59, 2008), la plataforma 454 de Roche (Margulies et al. Nature; 437: 376-380, 2005), la plataforma SOLiD de ABI (McKernan et al., Genome Res; 19: 1527-1541, 2009), la plataforma de secuenciacion de una sola molecula de Helicos (Harris et al. Science; 320: 106-109, 2008), la secuenciacion en tiempo real usando moleculas de polimerasa individuales (Science; 323: 133-138, 2009), la secuenciacion Ion Torrent (documento WO 2010/008480; Rothberg et al., Nature, 475: 348-352, 2011), y la secuenciacion con nanoporos (Clarke J et al. Nat Nanotechnol.; 4: 265-270, 2009). En una realizacion, la secuenciacion masivamente paralela se lleva a cabo sobre un subconjunto aleatorio de moleculas de acidos nucleicos en la muestra biologica.
En realizaciones espedficas, el metodo de la invencion se adapta para ejecutarlo en un secuenciador de ADN ABI PRISM(R) 377, un analizador genetico ABI PRISM(R) 310, 3100, 3100-Avant, 3730, o 3730x1, un analizador de ADN ABI PRISM(R) 3700, o un sistema SOLiD(TM) de Applied Biosystems (todos ellos de Applied Biosystems), un sistema Genome Sequencer 20 (Roche Applied Science), un HiSeq 2500, un HiSeq 2000, un Genome Analyzer IIx, un MiSeq Personal Sequencer, un HiScanSQ (todos de Illumina), el Genetic Analysis System, que incluye el Single Molecule Sequencer, Analysis Engine y Sample Loader (todos de HeliScope), el secuenciador Ion Proton™, o el secuenciador Ion PGM™ (ambos de Ion Torrent). En una realizacion preferida de la invencion, las secuencias anelovmcas se identifican en los datos de secuenciacion global mediante comparacion con secuencias de anelovirus depositadas publicamente. Esta comparacion se basa ventajosamente en el nivel de identidad de secuencia con una secuencia de anelovirus conocida, y permite detectar variantes incluso distantes.
La expresion “identidad de secuencia” se refiere a la identidad entre dos peptidos o entre dos acidos nucleicos. La identidad entre secuencias se puede determinar comparando una posicion en cada una de las secuencias que se pueden alinear con fines comparativos. Cuando una posicion de las secuencias comparadas esta ocupada por la misma base o aminoacido, entonces las secuencias son identicas en esa posicion. Un grado de identidad de secuencia entre las secuencias de acidos nucleicos es una funcion del numero de nucleotidos identicos en posiciones compartidas por estas secuencias. Un grado de identidad entre secuencias de aminoacidos es una funcion del numero de secuencias de aminoacidos identicas que se comparten entre estas secuencias. Puesto que dos polipeptidos pueden cada uno (i) comprender una secuencia (es decir, una porcion de la secuencia polinucleotfdica completa) que es similar entre dos polinucleotidos, y (ii) pueden comprender ademas una secuencia que es divergente entre dos polinucleotidos, las comparaciones de identidades de secuencia entre dos o mas polinucleotidos a lo largo de una “ventana de comparacion” se refieren al segmento conceptual de por lo menos 20 posiciones nucleotfdicas contiguas en el que una secuencia polinucleotfdica se puede comparar con una secuencia nucleotfdica de referencia de por lo menos 20 nucleotidos contiguos, y en el que la porcion de la secuencia polinucleotfdica en la ventana de comparacion puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, espacios vados) de 20 por ciento o menos en comparacion con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para el alineamiento optimo de las dos secuencias.
Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoacidos o dos secuencias de acidos nucleicos, las secuencias se alinean para la comparacion optima. Por ejemplo, se pueden introducir espacios vados en la secuencia de la primera secuencia de aminoacidos o de una primera secuencia de acido nucleico para el alineamiento optimo con la segunda secuencia de aminoacidos o segunda secuencia de acido nucleico. Entonces se comparan los restos de aminoacidos o los nucleotidos en las posiciones de aminoacidos o posiciones nucleotfdicas correspondientes. Cuando una posicion en la primera secuencia es ocupada por el mismo resto de aminoacido o nucleotido que la posicion correspondiente a la segunda secuencia, las moleculas son identicas en esa posicion. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias. Por tanto, % de identidad = numero de posiciones identicas/numero total de posiciones que solapan X 100.
En esta comparacion, las secuencias pueden tener la misma longitud, o ser de longitud diferente. El alineamiento optimo de las secuencias para determinar una ventana de comparacion se puede realizar mediante el algoritmo de homologfa local de Smith y Waterman (J. Theor. Biol., 91(2): 370-380, 1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homologfas de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol, 48(3): 443-453, 1972), mediante la busqueda de la similitud via el metodo de Pearson y Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85(5): 2444-2448, 1988), mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetic Computer Group, 575, Science Drive, Madison, Wisconsin), o mediante inspeccion. Se selecciona el mejor alineamiento (es decir, que ve como resultado el porcentaje mas elevado de identidad a lo largo de la ventana de comparacion) generado por los diversos metodos.
La expresion “identidad de secuencia” significa asf que dos secuencias polinucleotfdicas o polipeptfdicas son identicas (es decir, en una base de nucleotido a nucleotido o de aminoacido a aminoacido) a lo largo de la ventana de comparacion. La expresion “porcentaje de identidad de secuencia” se calcula comparando dos secuencias alineadas optimamente a lo largo de la ventana de comparacion, determinando el numero de
posiciones en las que aparece la misma base de acido nucleico (por ejemplo, A, T, C, G, U, o I) en ambas secuencias, para dar el numero de posiciones coincidentes, dividiendo el numero de posiciones coincidentes entre el numero total de posiciones en la ventana de comparacion (es decir, el tamano de la ventana), y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. Se puede aplicar el mismo procedimiento a las secuencias polipeptfdicas. El porcentaje de identidad de secuencia de una secuencia de acido nucleico o de una secuencia de aminoacidos tambien se puede calcular usando el software BLAST (version 2.06 de septiembre de 1998), con el parametro por defecto o definido por el usuario.
De este modo, una secuencia que presente por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, o 100% de identidad con una secuencia anelovmca conocida es identificada como una secuencia anelovmca. Segun esta realizacion, la determinacion de la carga anelovmca incluye asf numerar las secuencias del anelovirus identificadas mediante la secuenciacion en la muestra biologica del sujeto.
En una realizacion preferida, los niveles de ADN anelovmco se determinan midiendo el numero de secuencias de ADN anelovmco presentes en la muestra biologica.
En una realizacion preferida adicional, el numero de secuencias anelovmcas se normaliza con respecto al numero total de secuencias identificadas mediante secuenciacion en la muestra biologica. Por “normalizando con respecto al numero total de secuencias”, se quiere decir aqrn que el numero de secuencias anelovmcas se divide entre el numero total de secuencias, es decir, tanto de origen anelovmco como no anelovmco, presentes en la muestra biologica. Segun esta realizacion, una relacion de secuencias anelovmcas a secuencias totales mayor que 0.2 x 10-4 indica que el sujeto esta inmunosuprimido. En todavfa otra realizacion preferida el sujeto esta inmunosuprimido si dicha relacion es mayor que 0.5 x 10-4, mayor que 1 x 10-4, mayor que 5 x 10-4, mayor que 10 x 10-4, mayor que 15 x 10-4, mayor que 20 x 10-4, mayor que 25 x 10-4, o mayor que 25 x 10-4.
En otra realizacion, la determinacion de la carga anelovmca incluye ademas la etapa de asignar cada secuencia anelovmca identificada mediante secuenciacion a un genoma anelovmco espedfico, y numerar las copias de los genomas anelovmcos identificados de este modo. Asignar una secuencia a un genoma anelovmco espedfico quiere decir aqrn el procedimiento de identificar el genoma anelovmco al que pertenece dicha secuencia. Ventajosamente, este procedimiento se lleva a cabo comparando dicha secuencia con las secuencias anelovmcas depositadas en bases de datos publicas.
Por “genomas anelovmcos” se quiere decir aqrn los genomas de cualquier virus que pertenezca a la familia Anelloviridae de virus, que comprende los Torque Teno virus (TTVs), Torque Teno midivirus (TTMDVs), Torque Teno minivirus, tambien conocidos antiguamente como minivirus similares a Torque Teno (TTMVs).
En una realizacion, se refiere a genomas de TTVs, que comprenden alfatorquevirus, betatorquevirus, gammatorquevirus, deltatorquevirus, epsilontorquevirus, etatorquevirus, iotatorquevirus, thetatorquevirus, zetatorquevirus. En una realizacion preferida, se refiere al genoma de la cepa prototfpica de Torque Teno virus, TTV-1a. Un ejemplo de un genoma de TTV es una secuencia tal como, por ejemplo, en el numero de acceso Genebank AB017610, y representada en SEC ID No 1.
En otra realizacion, se refiere a genomas de TTMDVs. En una realizacion preferida, se refiere al genoma de la cepa prototfpica de Torque Teno midivirus, a saber, el genoma del aislado MD1-073. Por ejemplo, un genoma de TTMDV puede tener una secuencia tal como, por ejemplo, en el numero de acceso Genbank AB290918, y representada en SEC ID No 2.
En otra realizacion, se refiere a genomas de TTMVs. En una realizacion preferida, se refiere al genoma de la cepa prototfpica de Torque Teno minivirus, a saber, el genoma del aislado TTMV- NLC-030. Un genoma de TTMV se ilustra mediante una secuencia tal como, por ejemplo, en el numero de acceso Genbank AB038631, y representada en SEC ID No 3.
Es posible normalizar el numero de genomas anelovmcos con respecto a por lo menos una secuencia, a fin de reducir la tasa de error cuando se comparan las cargas anelovmcas de dos muestras biologicas distintas. Por “normalizar con respecto a una secuencia”, se quiere decir que el numero de genomas anelovmcos identificados en la muestra biologica se divide entre el numero de copias de dicha secuencia. Dicha secuencia puede ser, por ejemplo, una secuencia no humana cuyo numero de copias es conocido. Como alternativa, dicha secuencia es una secuencia humana. Preferentemente, el numero de genomas anelovmcos se normaliza con respecto al genoma humano completo. Por “genoma humano” se hace referencia aqrn a una secuencia de consenso de referencia, tal como la secuencia que corresponde al Genome Reference Consortium built GRCh37 (NCBI build 37.1/assembly hg19).
En una realizacion preferida, la relacion de genomas anelovmcos a genoma humano es mayor que 0.2%.
Como alternativa, el numero de secuencias anelovmcas en una muestra dada se compara frente a un control
interno. Dicho control interno permite la evaluacion de la calidad y del grado de secuenciacion de las moleculas de acidos nucleicos en dicha muestra. Preferentemente, dicho control interno consiste en una molecula de acido nucleico que tiene una secuencia conocida, estando dicha molecula de acido nucleico presente en ldicha muestra en una concentracion conocida. Mas preferentemente, dicha molecula de acido nucleico es la molecula de ADN circular monocatenario genomico de un virus de secuencia y concentracion conocidas en dicha muestra. Tal virus conocido puede ser, por ejemplo, un virus de la familia Circoviridae. La relacion del numero de secuencias de la muestra al control permite estimar el numero absoluto de genomas anelovmcos de secuencia y concentracion conocidas.
En otra realizacion, para determinar la carga anelovmca se usan tecnicas de amplificacion. Tales tecnicas de amplificacion incluyen, en particular, metodos isotermicos y tecnicas a base de pCr . Las tecnicas isotermicas incluyen metodos tales como, por ejemplo, amplificacion a base de secuencias de acido nucleico (NASBA), amplificacion isotermica mediada por bucle (LAMP), amplificacion dependiente de helicasas (HDA), amplificacion en drculo rodante (RCA), y amplificacion por desplazamiento de hebra (SDA), reaccion de amplificacion exponencial (EXPAR), amplificacion de acidos nucleicos isotermica y quimerica iniciada por cebadores (ICANs), tecnologfa de amplificacion de ARN mediada por senal (SMART), y otras (vease, por ejemplo, Asiello y Baeumner, Lab Chip; 11(8): 1420-1430, 2011). Preferentemente, la tecnica de pCr usada mide cuantitativamente cantidades de partida de ADN, ADNc, o ARN. Los ejemplos de tecnicas a base de PCR segun la invencion incluyen tecnicas tales como, pero sin limitarse a, PCR cuantitativa (Q-PCR), reaccion en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR), PCR con transcriptasa inversa cuantitativa PCR (QRT-PCR), o PCR digital. Estas tecnicas son tecnologfas bien conocidas y facilmente disponibles para aquellos expertos en la tecnica, y no necesitan una descripcion precisa.
En una realizacion preferida, la determinacion de la carga anelovmca se lleva a cabo mediante PCR cuantitativa. En otra realizacion preferida, la determinacion de la carga anelovmca se lleva a cabo mediante PCR digital. La PCR digital implica multiples analisis de PCR sobre acidos nucleicos extremadamente diluidos de manera que las amplificaciones mas positivas reflejan la senal a partir de una sola molecula molde. La PCR digital permite asf contar las moleculas molde individuales. La proporcion de amplificaciones positivas entre el numero total de PCRs analizadas permite una estimacion de la concentracion del molde en la muestra original o no diluida. Esta tecnica se ha propuesto para permitir la deteccion de una variedad de fenomenos geneticos (Vogelstein et al., Proc Natl Acad Sci USA 96: 9236-924, 1999). Puesto que la cuantificacion de la molecula molde mediante PCR digital no se basa en relaciones de respuesta frente a la dosis entre colorantes informadores y concentraciones de acidos nucleicos, su precision analftica es, por lo menos teoricamente, superior a la de la pCr en tiempo real. Por tanto, la PCR digital permite potencialmente discriminar grados mas finos de diferencias cuantitativas entre loci diana y de referencia.
En otra realizacion, el metodo de la invencion comprende una etapa adicional (a') de comparar la carga anelovmca de la etapa (a) con por lo menos una carga anelovmca de referencia. Segun esta realizacion, la determinacion del fenotipo inmunosuprimido o no inmunosuprimido se lleva a cabo gracias a la carga anelovmca obtenida con por lo menos una carga anelovmca de referencia en la etapa (a').
Segun la invencion, la “carga anelovmca de referencia” es una medida predeterminada de la carga anelovmca, obtenida a partir de una muestra biologica procedente de un sujeto con un estado inmunitaria conocido. Preferentemente, la carga anelovmca de referencia es una medida predeterminada de la carga anelovmca, obtenida de una muestra biologica procedente de un sujeto con un estado inmunosuprimido conocido. En una realizacion preferida, la carga anelovmca de referencia es una medida predeterminada de la carga anelovmca, obtenida a partir de una muestra biologica procedente de un sujeto que se sabe que esta inmunosuprimido. En otra realizacion, la carga anelovmca de referencia es una medida predeterminada de la carga anelovmca, obtenida a partir de una muestra biologica procedente de un sujeto que se sabe que no esta inmunosuprimido. Preferentemente, por lo menos un perfil de expresion de referencia es una carga anelovmca de referencia inmunosuprimida. Como alternativa, por lo menos una carga anelovmca de referencia puede ser una carga anelovmca de referencia no inmunosuprimida. Mas preferentemente, la determinacion de la presencia o ausencia de un fenotipo inmunosuprimido se lleva a cabo mediante comparacion con por lo menos una carga anelovmca de referencia inmunosuprimida y por lo menos una no inmunosuprimida. El diagnostico o pronostico se puede llevar a cabo asf usando una carga anelovmca de referencia inmunosuprimida y una carga anelovmca de referencia no inmunosuprimida. Ventajosamente, para obtener un diagnostico o pronostico mas solido, dicho diagnostico o pronostico se lleva a cabo usando varias cargas anelovmcas de referencia inmunosuprimidas y varias cargas anelovmcas de referencia no inmunosuprimidas.
Segun la invencion, cualquier secuencia del genoma anelovmico se puede seleccionar como diana para la amplificacion, a fin de determinar la carga anelovmca. Dicha secuencia se puede conservar entre las cepas vmcas, o puede estar solamente presente en un grupo espedfico de cepas. En este ultimo caso, es necesario amplificar igualmente otra secuencia presente en los otros grupos de las cepas de anelovirus. Preferentemente, la secuencia anelovmca amplificada esta conservada entre la familia Anelloviridiae, en cuyo caso se puede usar
un solo conjunto de cebadores para amplificar, en una unica reaccion, todas las cepas vmcas presentes en la muestra biologica. Mas preferentemente, se amplifica mas de una secuencia conservada en la familia Anelloviridiae, incrementando as ^la sensibilidad del ensayo.
En una realizacion espedfica, una secuencia de referencia es tambien seleccionada como diana para la amplificacion, y se usa como control o como un estandar. Preferentemente, esta secuencia de referencia se escoge dentro del genoma humano.
En una realizacion preferida, la determinacion de la carga anelovmca se lleva a cabo usando Q-PCR; por lo menos una secuencia de consenso del genoma anelovmco es seleccionada como diana para la amplificacion. Los cebadores se escogen por el experto en la tecnica dependiendo de la especificidad deseada de la etapa de amplificacion mediante PCR, usando parametros estandar tales como el tamano del acido nucleico, los contenidos de GC, y las temperaturas de las reacciones. En una realizacion mas preferida, cualquier secuencia anelovmca comprendida entre las secuencias de consenso representadas por SEC ID No. 4 y s Ec ID No. 5 es seleccionada como diana para la amplificacion. Incluso mas preferentemente, la secuencia anelovmca comprendida entre las secuencias de consenso representadas por SEC ID No. 4 y SEC ID No. 5 es seleccionada como diana para la amplificacion.
Se han identificado aqrn dos secuencias de consenso, representadas por SEC ID No. 4 y SEC ID No. 5, en base a la comparacion entre todas las secuencias anelovmcas. Preferentemente, cuando se lleva a cabo la amplificacion, los cebadores de la amplificacion comprenden cualesquiera cebadores capaces de unirse a un polinucleotido que tenga dichas secuencias de consenso SEC ID No. 4 o SEC ID No. 5, con la condicion de que los mencionados cebadores sean diferentes de SEC ID No.6 y SEC ID No.7. Los mencionados cebadores comprenden entre 10 y 30 nucleotidos, preferentemente entre 15 y 25 nucleotidos, mas preferentemente entre 20 y 25 nucleotidos. Los cebadores de la invencion consisten en por lo menos 12, 15, 20 o 25 bases de SEC ID No.
4 o 5. Los parametros para determinar la secuencia de cebadores exacta en base a la secuencia diana son bien conocidos por las personas de pericia en la tecnica.
Aunque los mencionados cebadores se pueden usar en disolucion, es preferible que los mencionados cebadores esten enlazados a un soporte solido.
Para permitir su acoplamiento covalente al soporte, los cebadores generalmente estan funcionalizados. De este modo, se puede modificar mediante un grupo terminal tiolico, ammico o carboxflico en la posicion 5' o 3'. En particular, la adicion de un grupo tiolico, ammico o carboxflico hace posible, por ejemplo, acoplar el oligonucleotido a un soporte que posee funciones de disulfuro, maleimida, amina, carboxilo, ester, epoxido, bromuro de cianogeno, o aldehndo. Estos acoplamientos se forman mediante establecimiento de enlaces de disulfuro, de tioeter, de ester, de amida o de amina entre el cebador y el soporte. Se puede usar cualquier otro metodo conocido por una persona experta en la tecnica, tal como, por ejemplo, reactivos de acoplamiento bifuncionales.
Ademas, para mejorar la hibridacion con el oligonucleotido acoplado, puede ser ventajoso que el oligonucleotido contenga un “brazo” y una secuencia “espaciadora” de bases. El uso de un brazo hace posible, en efecto, unir el cebador a una distancia escogida desde el soporte, permitiendo que se mejoren sus condiciones de interaccion con el ADN. El brazo consiste ventajosamente en una cadena de carbono lineal, que comprende 1 a 18, y preferentemente 6 o 12 grupos (CH2), y una amina que permite la union a la columna. El brazo esta enlazado a un fosfato del oligonucleotido o de un “espaciador” compuesto de bases que no interfieren con la hibridacion. De este modo, el “espaciador” puede comprender bases purmicas. Como ejemplo, el “espaciador” puede comprender la secuencia GAGG. El brazo esta compuesto ventajosamente de una cadena de carbono lineal que comprende 6 o 12 atomos de carbono.
Para la implementacion de la presente invencion, se pueden usar diferentes tipos de soporte. Estos pueden ser soportes cromatograficos, a granel o empaquetados previamente en una columna, superficies plasticas funcionalizadas o perlas de latex funcionalizadas, magneticas o de otro modo. Preferentemente se usan soportes cromatograficos. Como ejemplo, los soportes cromatograficos capaces de ser usados son agarosa, acrilamida, o dextrano, asf como sus derivados (tales como sefadex, sefarosa, superosa, etc.), polfmeros tales como poli(estireno/divinilbenceno), o sflice injertada o no injertada, por ejemplo. Las columnas de cromatograffa pueden operar en el modo de difusion o de perfusion.
En otra realizacion de la invencion, la cantidad de ADN anelovmco se determina usando hibridacion espedfica de la secuencia. Los terminos “hibridacion” e “hibridando” se refieren al emparejamiento de dos moleculas de acidos nucleicos monocatenarias complementarias (ARN y/o ADN), para dar una molecula bicatenaria. Como se usa aqrn, se pueden hibridar dos moleculas de acidos nucleicos, aunque el emparejamiento de bases no sea completamente complementario. En consecuencia, las bases con apareamiento erroneo no evitan la hibridacion de dos moleculas de acidos nucleicos, con la condicion de que se usen condiciones apropiadas, bien conocidas en la tecnica.
Las sondas son escogidas por la persona experta en la tecnica dependiendo de la especificidad deseada de la especificidad de la etapa de deteccion, usando parametros estandar tales como el tamano del acido nucleico y los contenidos de GC, las condiciones restrictivas de hibridacion, y las reacciones de temperature. Por ejemplo, cuando se desea obtener muchos resultados positivos en un intervalo de dianas homologas, se usan condiciones poco restrictivas, mientras que para obtener resultados positivos solamente si el acido nucleico diana espedfico esta presente en la muestra, se prefieren condiciones de gran restriccion.
Preferentemente, la sonda de la invencion es capaz de hibridarse con un polinucleotido que tenga una secuencia representada mediante SEC ID No.4 o SEC ID No. 5, con la condicion de que dicha sonda no tenga una secuencia representada por SEC ID No. 6 o SEC ID No. 7. Otro aspecto de la invencion es la provision de un polinucleotido que consista en por lo menos 12, 15, 20 o bases consecutivas representadas por SEC ID No. 4 o SEC ID No. 5.
Las sondas que se hibridan se pueden marcar con un marcador radioactivo, un marcador fluorescente, o un marcador qmmico. El ADN ramificado (ADNr), implica oligonucleotidos con estructuras ramificadas que permiten que cada oligonucleotido individual posea 35 a 40 marcadores (por ejemplo, enzimas de fosfatasa alcalina). Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, hibridaciones de ADN-ADN o ADN-ARN, amplificacion mediante PCR, y tecnicas de bioensayos o inmunoensayos de protemas, que incluyen tecnologfas a base de membranas, de disoluciones o de chips para la deteccion y/o cuantificacion de secuencias de acidos nucleicos o de protemas. Tales metodos de hibridacion de una sonda marcada con una molecula de ADN son bien conocidos por la persona de pericia en la tecnica. Por ejemplo, cuando se desea obtener muchos resultados positivos en un intervalo de dianas homologas, se usan condiciones poco restrictivas, mientras que para obtener resultados positivos solamente si el acido nucleico diana espedfico esta presente en la muestra, se prefieren condiciones de gran restriccion. Como se usa aqrn, la expresion “condiciones de hibridacion restrictivas” se refiere a condiciones en las que la sonda se hibridara solamente a aquella secuencia diana exactamente complementaria, y que permiten la deteccion de la secuencia diana espedfica. Las condiciones de hibridacion afectan a la estabilidad de los hfbridos, por ejemplo temperatura, concentracion salina, pH, concentracion de formamida, y similares. Estas condiciones se optimizan para maximizar la union espedfica y minimizar la union no espedfica del cebador o sonda a su secuencia de acido nucleico diana. Las condiciones restrictivas dependen de la secuencia, y seran diferentes en circunstancias diferentes. Las secuencias mas largas se hibridaran espedficamente a mayores temperaturas. En general, las condiciones restrictivas se seleccionan para que sean alrededor de 5°C menores que el punto de fusion termino (Tm) para las secuencias espedficas a una fuerza ionica y pH definidos. La Tm es la temperatura (a una fuerza ionica y pH definidos) a la que el 50% de una secuencia diana complementaria se hibrida a una sonda o cebador perfectamente emparejado. Tfpicamente, las condiciones restrictivas seran aquellas en las que la concentracion de sal sea menor que alrededor de 1.0 M de Na+, tfpicamente una concentracion de alrededor de 0.01 a 1.0 M de Na+ (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3, y la temperatura es por lo menos alrededor de 30°C para sondas o cebadores cortos (por ejemplo 10 a 50 nucleotidos), y por lo menos alrededor de 60°C para sondas o cebadores largos (por ejemplo mayores que 50 nucleotidos). Las condiciones restrictivas se pueden lograr tambien con la adicion de agentes desestabilizantes, tal como formamida. Las condiciones poco restrictivas ejemplares incluyen la hibridacion con una disolucion amortiguadora de 20-30% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C y un lavado en 2XSSC a 40°C. Las condiciones de gran restriccion ejemplares incluyen la hibridacion en 40-50% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C, y un lavado en 0.1*SSC a 60°C. La determinacion de las condiciones particulares de hibridacion con respecto a un acido nucleico espedfico es rutinaria y bien conocida en la tecnica, por ejemplo como se describe en Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3a Ed., 2001; y Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols; 5a Ed., 2002.
En una realizacion preferida, la carga anelovmca se determina mediante el uso de una micromatriz nucleica.
Segun la invencion, una “micromatriz nucleica” consiste en diferentes sondas de acidos nucleicos que estan unidas a un sustrato, que puede ser una micromatriz, un portaobjetos de vidrio, o una perla del tamano de una microesfera. Una micromatriz puede estar constituida por polfmeros, plasticos, resinas, polisacaridos, sflice o materiales a base de sflice, carbono, metales, vidrios inorganicos, o nitrocelulosa. Las sondas pueden ser acidos nucleicos tales como ADNc (“micromatriz de ADNc”) u oligonucleotidos (“micromatriz oligonucleotidica”), y los oligonucleotidos pueden tener alrededor de 25 a alrededor de 60 pares de bases o menos de longitud.
Para determinar la cantidad de una muestra nucleica diana, dicha muestra se marca, se pone en contacto con la micromatriz en condiciones de hibridacion, lo que conduce a la formacion de complejos entre los acidos nucleicos diana que son complementarios a las secuencias de la sonda unidas a la superficie de la micromatriz. Entonces se detecta la presencia de complejos hibridados marcados. Existen para el experto en la tecnica muchas variantes de la tecnologfa de hibridacion en micromatrices.
La practica de la invencion emplea, excepto que se indique de otro modo, tecnicas convencionales o qrnmica proteica, virologfa molecular, microbiologfa, tecnologfa de ADN recombinante, y farmacologfa, que estan dentro de la pericia de la tecnica. Tales tecnicas se explican completamente en la bibliograffa. (Veanse Ausubel et al.,
Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols; 5a Ed., 2002; Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985; y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3a Ed., 2001). Las nomenclatures usadas en relacion con, y los procedimientos y tecnicas de laboratorio de, biologfa molecular y celular, bioqmmica de protemas, enzimolog^a, y qmmica medica y farmaceutica, descritos aqrn, son bien conocidos y se usan habitualmente en la tecnica.
Los siguientes ejemplos se proporcionan aqrn con fines solamente ilustrativos, y no pretenden ser limitantes excepto que se especifique de otro modo.
Ejemplos
Ejemplo 1
ANV como marcador de la inmunosupresion
Se cribaron muestras de plasma procedentes de pacientes que sufren diversas formas de inmunosupresion congenita, y procedentes de pacientes sin ninguna inmunosupresion conocida: el procedimiento de extraccion se optimizo para el aislamiento de los genomas de ADN o ARN vmcos sin descartar la identificacion de acidos nucleicos bacterianos y fungicos. Se extrajo un volumen de 150 |il de cada muestra usando el kit Nucleospin RNA virus (Macherey-Nagel), que permite la recuperacion tanto de ADN como de ARN, y entonces se amplifico mediante el ensayo de amplificacion por desplazamiento multiple (MDA) a base de polimerasa del bacteriofago phi29_usando cebadores aleatorios.
Esta tecnica permite la smtesis de ADN a partir de muestras de ADN, y tambien a partir de fragmentos de ADNc procedentes de genomas vmcos reunidos previamente antes de MDA con la polimerasa de Phi29.
De forma breve, se siguio el protocolo del QuantiTect Whole Transcriptome Kit (Qiagen), excepto que la etapa de la smtesis de ADNc se llevo a cabo con cebadores hexamericos aleatorios.
- Se incubo una mezcla con 8 |il de ARN, 1 |il de cebador (50 |iM) y 1 |il de dNTPs (10 mM), a 75°C durante 5 min., y se enfrio en hielo durante 5 min.
- Despues, se anadieron 10 |il de mezcla de enzimas 2X. Esta mezcla enzimatica estaba compuesta de 2 |il de amortiguador RT 10 X para SSIII (Invitrogen Inc.), 4 |il de 25 mM de MgCh, 2 |il de 0.1 M de DTT, 1 |il de 40 U/|il de RNaseOUT (Invitrogen Inc.), 1 |il de transcriptasa inversa SuperScript III (Invitrogen Inc.), y 0.5 |il de DMSO (Sigma-Aldrich).
- La mezcla final se incubo a 25°C durante 10 min., despues a 45°C durante 90 min., y finalmente a 95°C durante 5 min.
- Todos los ADNc se almacenaron a -20°C, o se usaron inmediatamente.
- Las dos etapas siguientes (ligacion y WGA) se llevaron a cabo con el QuantiTect® Whole Transcriptome kit (Qiagen) segun las instrucciones del fabricante.
Esto proporciona concatemeros de ADN de alto peso molecular.
El ADN de alto peso molecular (5 |ig), que resulta de la amplificacion isotermica del conjunto de los ADN genomicos y ADNc obtenidos a partir de los ARN genomicos como se describe anteriormente, se fragmento en fragmentos de 200 a 350 nt, a los que se ligaron adaptadores. Los adaptadores incluyeron una etiqueta nucleotidica que permite multiplexar varias muestras por lmea o canal. La secuenciacion se llevo a cabo en un secuenciador GAII o HiSeq 2000 de Illumina.
La clasificacion del flujo de secuencias de Illumina se realizo en primer lugar mediante un procedimiento de comparacion de bases de datos sustractivo. Para este fin, toda la secuencia del genoma humano (NCBI build 37.1/assembly hg19) se escaneo con las lecturas usando SOAPaligner. Tambien se llevo a cabo un estudio rapido y muy restrictivo mediante BLASTN, para eliminar lecturas adicionales del hospedante. Los mejores parametros a usar se han determinado previamente. Se ha ensayado un numero de programas de ensamblaje dedicados a lecturas de tamano corto o medio (Velvet, SOAPdenovo, CLC), para determinar su eficiencia en nuestro proyecto. Se han establecido los parametros optimos. La comparacion de las lecturas individuales y contigos con datos genomicos y taxonomicos ya conocidos se realizo en bases de datos vmcas, bacterianas y generalistas especializadas dedicadas, mantenidas localmente (bases de datos vmcas y bacterianas de GenBank, nr). Las bases de datos mencionadas anteriormente se escanearon usando BLASTN y BLASTX. El preprocesamiento de datos para reducir los efectos de pequenos errores de observacion (o asignacion taxonomica) se baso en el ancestro mmimo comun o a partir del mejor resultado, identificado a partir de los
mejores resultados entre lecturas individuals o contigos con un valor e significativo.
Los resultados con relacion a lecturas individuals con valores e por debajo de 10-4 que tuvieron la mejor concordancia para un miembro conocido de la familia de Anelloviridae (ANV) se muestran en la tabla 1.
Como se muestra en la tabla 1, hemos identificado lecturas de ANV en 14/14 pacientes inmunodeficientes. De forma interesante, para un subconjunto de tres pacientes caracterizados con una supresion de celulas T inmunes importante, 20 a 54% del numero total de lecturas fueron lecturas de anelovirus. Por el contrario, otros pacientes inmunocomprometidos que mostraron menores estados de inmunosupresion representaron < 0.2% de lecturas del anelovirus.
En 34 pacientes que no se conocfa que estaban inmunocomprometidos, no se identifico ninguna lectura (o se identificaron menos de 5 lecturas), excepto en un conjunto de 4 pacientes: tres de ellos (100036, 100039, 080114/116) estaban desarrollando una encefalitis en el momento de la toma de muestras, una afeccion medica asociada frecuentemente con inmunosupresion.
Tabla 1: Numero de lecturas individuales o de lecturas ensambladas en contigos identificados para pacientes con inmunosupresion o sin inmunosupresion conocida
Ejemplo 2
Identificacion de secuencias conservadas entre genomas de los ANV
Se construyo una base de datos de secuencias de ANV. Estaba compuesta por 7,003 secuencias nucleotidicas asignadas a la familia de Anelloviridae. 6938 secuencias proceden de la base de datos publica de NCBI (NT, 1° de octubre de 2011). 65 secuencias proceden del ensamblaje de novo de lecturas de NGS derivadas de nuestro propio trabajo (vease la tabla 1) que se asignaron a la familia de Anelloviridae. Estas secuencias tienen una longitud minima de 1000 nucleotidos.
En un analisis preliminar usando un conjunto corto de secuencias, las secuencias que estan proximas a un sitio de union a un factor transcripcional (denominado caja TATA) parecen conservadas entre las cepas. Para extender aun mas este analisis, y a fin de reducir el tamano de la base de datos, se llevo a cabo un filtro basado en la presencia de la caja TATA. Este motivo es rico en A/T, y estaba situado en direccion 5' del sitio de comienzo de la transcripcion.
Se construyo una secuencia de consenso de la caja TATA, usando las siguientes secuencias: ATAAAA, ATAAAT, ATATAA, ATATAT.
Este motivo se uso como un anclaje a fin de:
1. Filtrar la base de datos de anelovirus. Con este consenso se llevo a cabo una busqueda con una matriz de peso espedfico de la posicion. Se descarto la secuencia sin una coincidencia exacta.
2. Alinear previamente secuencias nucleotidicas largas. Las secuencias seleccionadas previamente se alinearon al comienzo del consenso de TATA (+1).
Esta etapa de filtracion redujo la base de datos a:
• 42 secuencias obtenidas del NCBI.
• 8 secuencias obtenidas de nuestros propios experimentos de NGS y del ensamblaje de novo.
Se realizo un segundo alineamiento con MUSCLE (parametros por defecto). Se identificaron dos regiones conservadas en la posicion [+20: 53] y en la posicion [+121: 151] con respecto al consenso de la caja TATA. A continuacion se muestran los detalles de estas alineaciones. Cada lmea corresponde a una posicion nucleotidica espedfica. Las columnas representan respectivamente los recuentos de A, C, G y T en esta posicion. Las lmeas con una estrella corresponden a una posicion bien conservada. La ambiguedad nucleotfdica se mostro usando un corchete. La ultima columna es el nucleotido de consenso en cada posicion usando la nomenclatura de la IUAPAC.
Tabla 2: Nomenclatura de IUAPAC
Primera region: ANV-PTQ-1
Segunda region: ANV-PTQ-2
De este modo, hemos identificado las dos secuencias de consenso siguientes que estan conservadas entre las cepas anelovmcas.
ANV-PTQ-25' ASCGVAGTCAAGGGGCMWWTCGGGCDSGSKSGGTRA 3' (SEC ID No.4)
ANV-PTQ-1 5' GAATGGYWGAGTTTYWCBHCGCCSGTYSGYRGA 3' (SEC ID No.5)
De este modo, los cebadores se pueden definir dentro de las siguientes secuencias, y se pueden usar para desarrollar las PCR para evidenciar un amplio intervalo de genoma de los ANV.
Ejemplo 3
Se enrolaron por lo menos 50 y hasta 200 pacientes inmunocomprometidos del hospital Necker (Pans) que sufren una enfermedad infecciosa. La inmunosupresion en estos pacientes es debida a un defecto congenito, a tratamientos inmunosupresores tras transplante de organo solido o de medula osea, o a evolucion de un cancer.
Claims (24)
1. Metodo para caracterizar el estado inmunosuprimido o no inmunosuprimido de un sujeto, que comprende las etapas siguientes:
a. determinar la carga anelovmca a partir de una muestra biologica de dicho sujeto, y
b. determinar a partir de la comparacion de la etapa a) el estado inmunosuprimido o no inmunosuprimido.
2. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la carga anelovmca se determina midiendo el nivel de ADN de anelovirus.
3. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el nivel de ADN de anelovirus se mide mediante hibridacion con una sonda marcada, amplificacion por PCR o secuenciacion.
4. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el nivel de ADN de anelovirus se mide secuenciando dicho ADN de anelovirus.
5. Metodo segun la reivindicacion 4, que es un metodo de secuenciacion cuantitativo que usa unos cebadores de secuencias representadas mediante SEC ID No 4 y 5.
6. Metodo segun la reivindicacion 4 o 5, en el que dichos cebadores ademas comprenden por lo menos uno de entre:
- un grupo funcional para el acoplamiento covalente en el extremo 5' o 3', tal como un grupo terminal que comprende un grupo tiolico, ammico o carboxflico,
- una molecula o secuencia espaciadora en el extremo 5' o 3',
- unas secuencias adicionales como secuencias mdice o de etiqueta para llevar a cabo etapas de pre y posamplificacion adicionales y generales que no dependen de las secuencias diana que se deben cuantificar.
7. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el nivel de ADN de anelovirus se mide mediante secuenciacion masiva en paralelo.
8. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la determinacion de la carga anelovmca incluye la etapa de medir el numero de secuencias anelovmcas en dicha muestra biologica.
9. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la determinacion de la carga anelovmca ademas incluye la etapa de calcular la relacion de secuencias anelovmcas con respecto al numero total de secuencias presentes en dicha muestra biologica.
10. Metodo segun la reivindicacion 9, en el que el sujeto esta inmunosuprimido si dicha relacion es mayor que 0.2 x 10"4.
11. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la determinacion de la carga anelovmca ademas incluye las etapas de asignar cada secuencia de anelovirus a un genoma de anelovirus espedfico y numerar las copias de los genomas de anelovirus identificados de este modo.
12. Metodo segun la reivindicacion 11, en el que la determinacion de la carga anelovmca ademas incluye la etapa de normalizar el numero de genomas de anelovirus con respecto a por lo menos una secuencia humana o no humana.
13. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la carga anelovmca se determina mediante PCR cuantitativa.
14. Metodo segun la reivindicacion 13, en el que la determinacion de la carga anelovmca incluye la amplificacion de por lo menos una secuencia de anelovirus de consenso.
15. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14, en el que la determinacion de la carga anelovmca incluye la amplificacion de cualquier secuencia anelovmca comprendida entre las secuencias de consenso representadas por SEC ID No. 4 y SEC ID No. 5.
16. Metodo para disenar un tratamiento de inmunomodulacion para un sujeto, comprendiendo dicho metodo las etapas siguientes:
a. determinar a partir de una muestra biologica de un sujeto el estado inmunosuprimido o no inmunosuprimido mediante el metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, y
b. disenar el tratamiento de inmunomodulacion segun dicho estado inmunosuprimido o no inmunosuprimido determinado en la etapa a).
17. Farmaco inmunomodulador para su uso en el tratamiento de una afeccion asociada con inmunodeficiencia en un sujeto, en el que el uso comprende las etapas siguientes:
a. determinar el estado inmunosuprimido o no inmunosuprimido de dicho sujeto mediante el metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, y
b. adaptar dicho tratamiento de inmunomodulacion a sicho sujeto,
y en el que
• dicho farmaco inmunomodulador es un farmaco inmunosupresor seleccionado de entre la lista que consiste en glucocorticoides, farmacos antiproliferativos y antimetabolicos, preferentemente rapamicina, everolimus, micofenolato mofetilo, acido micofenolico; inhibidores de calcineurina, preferentemente ciclosporina, FK506, voclosporina; agonistas de S1P-R, preferentemente FTY720; malononitrilamidas, preferentemente FK7778; y anticuerpos (por ejemplo, globulina antitimocftica), incluyendo anticuerpos monoclonales (por ejemplo, muromonab-CD3, daclizumab, basiliximab, rituximab, alemtuzumab, infliximab, adalimumab, efalizumab); o
• dicho farmaco inmunomodulador es un farmaco inmunoestimulante seleccionado de entre la lista que consiste en pequenas moleculas sinteticas, preferentemente poli I:C, levamisol, inosina pranobex; microorganismos vivos, preferentemente Corynebacterium parvum; mezclas complejas de componentes bacterianos con aceites minerales, preferentemente adyuvante de Freund, o sales inorganicas, preferentemente hidroxido/fosfato de aluminio y magnesio; protemas recombinantes que modulan la inmunidad (por ejemplo, citocinas, anticuerpos contra receptores celulares); tratamientos antivirales, incluyendo oseltamivir, zanamivir, interferon, particularmente alfa-interferon.
18. Farmaco inmunomodulador para su uso segun la reivindicacion 17, en el que la afeccion asociada con inmunodeficiencia es un rechazo de transplante.
19. Farmaco inmunomodulador para su uso segun la reivindicacion 17, en el que la afeccion asociada con inmunodeficiencia es una infeccion.
20. Cebador que consiste en una secuencia representada por SEC ID No. 4.
21. Cebador que consiste en una secuencia representada por SEC ID No. 5.
22. Cebador segun cualquiera de las reivindicaciones 20 y 21, en el que dicho cebador esta en disolucion.
23. Cebador segun cualquiera de las reivindicaciones 20 y 21, en el que dicho cebador esta enlazado a un soporte solido.
24. Cebador segun cualquiera de las reivindicaciones 20 a 21, en el que dicho cebador esta marcado con un marcador radioactivo, un marcador fluorescente o un marcador qmmico.
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