ES2694291T3

ES2694291T3 - Nuevos extractos de valeriana y usos de los mismos

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Publication number: ES2694291T3
Application number: ES13709193.0T
Authority: ES
Inventors: Axel BRATTSTRÖM
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-03-30
Filing date: 2013-03-13
Publication date: 2018-12-19
Anticipated expiration: 2033-03-13
Also published as: EP2830641B1; PL2830641T3; EP2830641A1; CN104302303A; RU2014135293A; WO2013143843A1; US20150157682A1; RU2596789C2

Abstract

Extracto de valeriana para uso en el tratamiento y profilaxis de trastornos relacionados con GABAA seleccionados del grupo que consiste en ansiedad, depresión, inquietud e insomnio, en donde la relación de ácido valerénico (VA) a ácido acetoxivalerénico (AVA) en el extracto es de al menos 2:1 en peso.

Description

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DESCRIPCION

Nuevos extractos de valeriana y usos de los mismos

[0001] La presente invencion se refiere a un extracto de valeriana para uso en el tratamiento y profilaxis de trastornos relacionados con GABA seleccionados del grupo que consiste en ansiedad, depresion, inquietud e insomnio, en donde la relacion de acido valerenico (VA) a acido acetoxivalerenico (AVA) en el extracto es de al menos 2:1 en peso. La invencion tambien ensena composiciones farmaceuticas que comprenden tales extractos as^ como metodos para preparar estos extractos.

Antecedentes de la invencion

[0002] La valeriana es uno de los remedios herbales mas comunmente utilizados para el tratamiento del insomnio y la ansiedad. El acido valerenico (VA) es uno de los muchos compuestos activos de la valeriana. El potencial antiansiedad del VA ha sido verificado por experimentos in vitro en el receptor de acido gamma-aminobutmco tipo A (GABAa) asf como por experimentos in vivo en ratones y ratas. La accion del VA en los receptores GABAa in vitro es mediada preferiblemente por las subunidades p3 como lo confirman los experimentos in vivo que demuestran actividad ansiolttica, porque una mutacion puntual en la subunidad p3 abolio la respuesta ansiolttica a VA pero no a diazepam.

[0003] GABA es el principal neurotransmisor inhibitorio en el cerebro. Es esencial para el equilibrio general de la excitacion e inhibicion neuronal y, por lo tanto, vital para la funcion normal del cerebro. Un desequilibrio puede causar trastornos relacionados con GABAcomo ansiedad, depresion, inquietud, sedacion e insomnio. Los receptores GABAa son el sitio de accion para una variedad de agentes farmacologicamente importantes, como benzodiazepinas, barbituricos, esteroides neuroactivos, anestesicos y anticonvulsivos.

[0004] Se ha demostrado que los extractos de valeriana (VE) modulan de forma alosterica receptores GABAa y que esta accion esta relacionada con el VA. Supuestamente, los receptores GABAa que contienen subunidades p2 o p3 son responsables de esta accion. Los derivados del VA, es decir, el acido acetoxivalerenico (AVA) o el acido hidroxivalerenico (HVA) no modulan de forma alosterica los receptores GABAa. Sin embargo, el AVA en concentraciones mas altas puede bloquear el canal de GABAa abierto como el HVA y, ademas, se ha demostrado que el HVA desplaza al acido 3H valerenico de los sitios de union de la membrana cerebral, indicando por lo tanto que ambos derivados de VA pueden actuar en el sitio de union identico aunque fallan en la modulacion alosterica.

[0005] Hoy en dfa, el VA y sus derivados son los marcadores mas utilizados para el analisis cualitativo y cuantitativo de las rafces de valeriana, los rizomas y las VE. Los productos de valeriana generalmente estan estandarizados a un porcentaje de VA, definido como la cantidad de VA y AVA y, a veces, tambien se incluye HVA. Mientras que el VA es estable en el extracto, el AVA se convierte en HVA con el tiempo y dependiendo de las condiciones de almacenamiento. La mayona de los extractos de valeriana disponibles en la actualidad utilizados para tratamiento medico presentan una relacion de VA a AVA de aproximadamente 1:3 a 1:1 en peso.

[0006] El objetivo de la presente invencion es proporcionar extractos de valeriana y composiciones farmaceuticas mejoradas basadas en estos extractos de valeriana. Otro objetivo preferido es proporcionar medicamentos mejorados para su uso en el tratamiento y la profilaxis de trastornos relacionados con GABA, en particular los trastornos de ansiedad, depresion, inquietud e insomnio relacionados con GABAa.

[0007] Los objetos anteriores se resuelven con un extracto de valeriana para su uso en el tratamiento y la profilaxis de trastornos relacionados con GABA seleccionados del grupo que consiste en ansiedad, depresion, inquietud e insomnio, en donde la relacion de acido valerenico (VA) a acido acetoxivalerenico (AVA) en el extracto es de al menos 2:1 en peso.

[0008] Sorprendentemente, se encontro que los extractos de valeriana presentan una relacion de VA a AVA de al menos 2:1 en peso objetivo y afectan al receptor GABA de manera mas eficiente que los extractos comunmente usados en la tecnica, que regularmente presentan una relacion de 1:3 a 1:1 en peso. La relacion del extracto de la invencion tiene ademas la ventaja de que el contenido global de acido valerenico y derivados del acido valerenico se puede reducir significativamente, evitando asf los efectos secundarios tfpicos que acompanan a la intoxicacion.

[0009] En una realizacion mas preferida, el extracto para uso de acuerdo con la invencion es uno, en donde la relacion de acido valerenico (VA) a acido acetoxivalerenico (AVA) en el extracto es de al menos 3:1, preferiblemente al menos 4:1, mas preferiblemente al menos 10:1, muy probablemente al menos aproximadamente 12:1 en peso.

[0010] El termino "extracto de valeriana" como se usa en el presente documento se define como cualquier producto de extraccion a partir de rafces y rizomas de valeriana que comprende al menos sesquiterpenos de valeriana (al menos VA y AVA), asf como cantidades detectables de al menos uno, preferiblemente mas de flavonoides, triterpenos, lignanos, alcaloides y aminoacidos, preferiblemente sesquiterpenos de valeriana y cantidades detectables de flavonoides, triterpenos, lignanos, alcaloides y aminoacidos.

[0011] Preferiblemente, el extracto de valeriana es el resultado de la extraccion a partir de rafces y/o rizomas de valeriana con solventes lipofflicos, preferiblemente con solventes al menos parcialmente lipofflicos, mas

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preferiblemente un solvente seleccionado del grupo que consiste en eter de petroleo, acetato de etilo y/o alcoholes acuosos, los asf llamados hidroalcoholes, preferiblemente metanol o etanol acuoso, mas preferiblemente etanol acuoso. El termino extracto lipofflico, como se usa en este documento, se refiere a un extracto de valeriana producido con un disolvente lipofflico o un disolvente al menos parcialmente lipofflico, por ejemplo, los disolventes mencionados anteriormente, que son adecuados para solvatar acido valerenico. Un disolvente lipofflico o parcialmente lipofflico para practicar la presente invencion excluye el agua pura, pero incluye cualquier disolvente y mezclas de disolventes que solvaten y extraigan sustancialmente acido valerenico. El disolvente puede ser mas lipofflico, por ejemplo eter de petroleo, o menos lipofflico, por ejemplo. hidroalcoholes. Por ejemplo, se prefiere un disolvente de 70% de etanol acuoso o de 50% de metanol acuoso para extraer acido valerenico. Sin embargo, un disolvente mas polar, es decir, hidrofilo, por ejemplo, es poco probable que el hidroalcohol al 30% extraiga suficiente acido valerenico para producir un extracto de valeriana para la practica de la presente invencion. La preparacion de extractos de valeriana que contienen acido valerenico se ha publicado abundantemente en la tecnica, por ejemplo, en European Pharmacopoeia Supplement 5.7. Valerian dry hydroalcoholic extract (1898). Hoy en dfa, los extractos de valeriana para uso medico se preparan regularmente mediante extraccion con hidroalcoholes con un contenido de alcohol entre 40 y 80%. El experto en la materia puede seleccionar facilmente disolventes adecuados para preparar el extracto de valeriana para su uso en la presente invencion.

[0012] Los inventores han realizado una amplia seleccion de plantas de valeriana y hasta ahora han identificado una planta de valeriana que produce de forma natural acido valerenico en un contenido mucho mas alto que sus derivados. Esta planta unica se multiplico para permitir la produccion de cantidades de extracto de VE que permiten validacion experimental in vivo de su utilidad y ventajas farmaceuticas.

[0013] Alternativamente, los extractos de valeriana para uso en la presente invencion se pueden preparar ya sea reduciendo el contenido de AVA, por ejemplo, mediante el fraccionamiento de un extracto estandar, o bien aumentando artificialmente el contenido de acido valerenico, por ejemplo, anadiendo un extracto estandar con VA sintetico, aislado y/o concentrado.

[0014] El extracto para uso de acuerdo con la presente invencion es particularmente adecuado para modular receptores GABAa, mas preferiblemente receptores GABAa que contienen subunidades p2 o p3. En una realizacion preferida, la invencion se refiere al extracto de valeriana de la invencion para uso en el tratamiento y profilaxis de trastornos relacionados con GABAa, preferiblemente trastornos relacionados con receptores GABAa que contienen subunidades p2 o p3.

[0015] En un aspecto adicional, la presente invencion esta dirigida al uso del extracto de valeriana anterior para la preparacion de un medicamento para uso en el tratamiento y profilaxis de trastornos relacionados con GABAa, seleccionados preferiblemente del grupo que consiste en ansiedad, depresion, inquietud e insomnio.

[0016] Otro aspecto de la presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende un extracto de valeriana de la invencion. Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion comprenden tipicamente una cantidad terapeutica o profilacticamente efectiva de un extracto de valeriana de acuerdo con la invencion y opcionalmente sustancias auxiliares tales como excipientes y/o vehfculos farmaceuticamente aceptables. Ademas, la composicion farmaceutica puede comprender componentes de extracto y/o agentes medicamente activos adicionales.

[0017] Mas preferiblemente, la composicion farmaceutica tambien comprende al menos un extracto seleccionado del grupo de extractos producidos a partir de toronjil [melisa], lupulo y flor de la pasion. En una realizacion preferida, la composicion farmaceutica comprende ademas extractos producidos a partir de toronjil [melisa], lupulo y flor de la pasion.

[0018] Un aspecto adicional de la presente invencion es un metodo para preparar un extracto de valeriana que comprende las etapas de:

a) seleccionar rafces y/o rizomas de valeriana, en donde la relacion de acido valerenico (VA) a acido acetoxivalerenico (AVA) es al menos 2:1 o al menos 3:1, preferiblemente al menos 4:1, mas preferiblemente al menos 10:1, muy probablemente al menos aproximadamente 12:1 en peso.

b) extraer el acido valerenico (VA) y el acido acetoxivalerenico (AVA) de las rafces y/o los rizomas utilizando un disolvente adecuado,

c) opcionalmente, procesar adicionalmente el extracto crudo para que sea adecuado para la administracion humana.

[0019] Preferiblemente, el disolvente adecuado es lipofflico, mas preferiblemente al menos parcialmente lipofflico, siendo lo mas preferible un disolvente como se menciono anteriormente. El experto en la materia puede seleccionar rutinariamente rafces y/o rizomas de valeriana que tengan la relacion requerida de AV con respecto a AVA. Se mencionaron ejemplos de tales plantas de valeriana, anteriormente y en los ejemplos a continuacion. Ademas, el experto en la materia conoce los disolventes adecuados para la extraccion de valeriana, por ejemplo, eter de petroleo, acetato de etilo e hidroalcoholes.

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[0020] El extracto lipofflico puede y, con mayor frecuencia, se procesa adicionalmente para hacerlo adecuado para la administracion humana, es decir, se cuantifica, por ejemplo, se estandariza con respecto a VA, AVA y otros componentes de la valeriana, y es formulado para la dosis terapeutica o profilacticamente efectiva, para la estabilidad en almacenamiento y la ruta particular de administracion, preferiblemente administracion oral.

[0021] Un metodo preferido adicional para preparar un extracto de valeriana de la invencion comprende las etapas de:

a) proporcionar rafces y/o rizomas de valeriana,

c) adaptar el contenido de acido valerenico (VA) y acido acetoxivalerenico (AVA) en el extracto de modo que la relacion de acido valerenico (VA) a acido acetoxivalerenico (AVA) sea al menos 2:1 o al menos 3:1, preferiblemente al menos 4:1, mas preferiblemente al menos 10:1, muy probablemente al menos aproximadamente l2:1 en peso y

d) opcionalmente, continuar procesando el extracto para hacerlo adecuado para la administracion humana.

[0022] Preferiblemente, el disolvente adecuado es lipofflico, mas preferiblemente al menos parcialmente lipofflico, siendo lo mas preferible un disolvente como se menciono anteriormente. Por ejemplo, el contenido de VA y aVa en el extracto se puede adaptar a la relacion deseada mediante la adicion de VA y/o la reduccion de AVA. Por ejemplo, se puede agregar al extracto VA sintetico, aislado y/o concentrado hasta que se alcance la relacion deseada de A a VA de la invencion. El modo de administracion preferido es oral. Preferiblemente, las rafces de valeriana y/o los rizomas son de Valeriana officinalis L.

[0023] En el presente documento tambien se describe un metodo para el tratamiento y la profilaxis de trastornos relacionados con GABAa, que comprende la etapa de administrar un extracto de valeriana a un paciente que lo necesite, en donde la relacion de acido valerenico (VA) a acido acetoxivalerenico (AVA) en el extracto es de al menos 2:1 o al menos 3:1, preferiblemente al menos 4:1, mas preferiblemente al menos 10:1, muy probablemente al menos aproximadamente 12:1 en peso.

[0024] Para uso terapeutico o profilactico, los extractos de la invencion pueden administrarse en cualquier forma de dosificacion convencional de cualquier manera convencional. Las vfas de administracion incluyen, pero no se limitan a, por via intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutanea, por infusion, sublingual, transdermica, oral, rectal y topica. El modo preferido de administracion es oral, preferiblemente en una forma de dosificacion solida o lfquida.

[0025] Los extractos pueden administrarse solos o en combinacion con adyuvantes que mejoran la estabilidad de los componentes extrafdos, facilitan la administracion de composiciones farmaceuticas que los contienen, proporcionan una mayor disolucion o dispersion, apoyan la biodisponibilidad, proporcionan una terapia adjunta, y similares, incluyendo otros ingredientes activos. Ventajosamente, tales terapias de combinacion utilizan dosis mas bajas de los productos terapeuticos convencionales, evitando asf la posible toxicidad y los efectos secundarios adversos provocados cuando esos agentes se utilizan como monoterapias.

[0026] Como se menciono anteriormente, las formas de dosificacion de los compuestos descritos en el presente documento incluyen vetnculos y adyuvantes farmaceuticamente aceptables conocidos por los expertos en la tecnica. Estos vefflculos y adyuvantes incluyen, por ejemplo, intercambiadores de iones, alumina, estearato de aluminio, lecitina, protemas sericas, sustancias reguladoras, agua, sales o electrolitos y sustancias basadas en celulosa. Ademas, la maltodextrina se puede usar para producir un extracto seco de flujo libre que es particularmente adecuado para el procesamiento posterior en tabletas y capsulas. Las formas de dosificacion preferidas incluyen tabletas, capsulas, comprimidos, lfquido, solucion, suspension, emulsion, pastillas, jarabe, polvo reconstituible, granulos, supositorios y parches transdermicos. Tambien se contemplan formas de dosificacion de liberacion controlada con o sin porciones de liberacion inmediata. Se conocen metodos para preparar tales formas de dosificacion (vease, por ejemplo, H. C. Ansel and N. G. Popovish, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th ed., Lea and Febiger (1990)). Los niveles y requisitos de dosificacion son bien reconocidos en la tecnica y pueden ser seleccionados por los expertos en la tecnica a partir de los metodos y tecnicas disponibles adecuados para un paciente particular. En realizaciones preferidas, la cantidad de extracto de valeriana administrada contiene 0,2-0,5 mg/kg de peso corporal VA, mientras que el contenido de AVA debe mantenerse lo mas pequeno posible. Aunque una dosis por dfa puede ser suficiente, se pueden administrar hasta 5 dosis por dfa. Para dosis orales, se pueden requerir hasta 200 mg/dfa. Como apreciara el experto en la materia, pueden requerirse dosis mas bajas o mas altas dependiendo de factores particulares. Por ejemplo, las dosis especfficas y los regfmenes de tratamiento dependeran de factores como el perfil de salud general del paciente, la gravedad y el curso del trastorno o la disposicion del paciente, y el criterio del medico tratante, que incluye potenciales de interaccion con otros medicamentos necesarios.

[0027] Por ejemplo, los extractos de la presente invencion pueden administrarse de la misma manera que otros extractos de valeriana y composiciones farmaceuticas de los mismos. Preferiblemente, se administran por via oral, mas preferiblemente como formas de dosificacion solidas o lfquidas.

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[0028] A continuacion, la presente invencion se ilustra por medio de ejemplos que se refieren a realizaciones preferidas de la invencion.

Figuras

[0029]

Las Figs. 1a, b y c son graficos de columnas que muestran los resultados de la prueba de laberinto mas elevada para las sustancias de referencia (Fig. 1a, grafico superior) y los dos extractos de valeriana (VE 1, Fig. 1b, grafico medio; y VE 2, Fig. 1c, grafico inferior). En la coordenada y se representa el tiempo en % que los animales pasan en el brazo abierto. La Fig. 1a muestra los valores en % de las sustancias de referencia diazepam (DZP) e imipramina (IMI) en comparacion con NaCl (solucion salina 0.9) como control. La Fig. 1b presenta los resultados en % obtenidos para VE 1 y la Fig. 1c presenta los resultados en % para VE 2. Los valores numericos indicados para VE 1 y 2 en las Figs. 1b y 1c, respectivamente, se refieren a la suma de los acidos valerenicos VAy AVAadministrados por kg de peso corporal.

Las Figs. 2a, b y c son graficos de columnas que muestran los resultados de la prueba de suspension de cola para las sustancias de referencia (Fig. 2a, grafico superior) y ambos extractos de valeriana (VE 1, Fig. 2b, grafico medio; y VE 2, Fig. 2c, grafico inferior). En la coordenada y se representa el tiempo de la inmovilidad. La figura 2a muestra los valores de tiempo para las sustancias de referencia diazepam (DZP) e imipramina (IMI) en comparacion con NaCl como control. La Fig. 2b presenta los resultados obtenidos para VE 1 y la Fig. 2c muestra los datos para VE 2. Los valores numericos indicados para VE 1 y 2, respectivamente, se refieren a la suma de los acidos valerenicos VA y AVA administrados por kg de peso corporal.

Las Figs. 3a, b y c son graficos de columnas que muestran los resultados de la medicion de la temperatura corporal interna para las sustancias de referencia (Fig. 2a, grafico superior) y los dos extractos de valeriana (VE 1, Fig. 3b, grafico del medio; y VE 2, Fig. 3c, grafico inferior). En la coordenada y se representan las temperaturas del cuerpo del nucleo. La Fig. 3a presenta los valores de temperatura para las sustancias de referencia diazepam (DZP) e imipramina (IMI) en comparacion con NaCl como control. La Fig. 3b presenta los resultados obtenidos para VE 1 y la Fig. 3c muestra los datos para VE 2. Los valores numericos indicados para VE 1 y 2, respectivamente, se refieren a la suma de los acidos valerenicos VA y AVA administrados por kg de peso corporal.

Las Figs. 4a, b, c y d son graficos de columnas que muestran los resultados de la prueba de verificacion de laberinto en cruz elevado del ejemplo 5 para el extracto de valeriana 1 (VE 1). En la coordenada y se representa el tiempo en % que los animales pasan en el brazo abierto (graficos superior e inferior en el lado izquierdo, 4a, 4c), asf como el numero de cambios de brazo durante el penodo de observacion de 7 minutos (superior e inferior). Graficos inferiores en el lado derecho, 4b, 4d). Se indica la cantidad de acido acetoxivalerenico agregado a VE-1 (mg AVA), n es igual al numero de animales utilizados.

Las Figs. 5a y b son graficos de columnas que muestran la temperatura interna del cuerpo de los animales durante el experimento de verificacion EPM 5 para los diferentes extractos de valeriana. Se indica la cantidad de acido acetoxivalerenico agregado a VE-1 (mg AVA), n es igual al numero de animales utilizados.

En las figuras, * indica una desviacion significativa de p <0.05 para la columna que sigue.

Ejemplos

Animales

[0030] Para los experimentos de comportamiento, se mantuvieron ratones CD-1 machos (Charles River, Sulzfeld, Alemania) bajo condiciones de laboratorio controladas con un ciclo de luz/oscuridad de 12:12 (luces encendidas a las 06.00 am), temperatura 20 ± 2 ° C y humedad del aire entre 55 y 60 %. Los animales teman acceso libre a pellas comerciales (ssniff R / M-H, ssniff Spezialdiaten GmbH, Soest, Alemania) y agua del grifo. Los animales se alojaron en grupos de 10 enjaulas Macrolon III. Despues de la llegada, los animales recibieron un penodo de2 semanas para la habituacion. Al comienzo de los experimentos, los ratones teman 8 semanas de edad. El numero de animales por grupo fue entre 12 y 18.

[0031] Para el experimento de union se utilizaron ratas RjHan macho: WI (Janvier, Le Genest-Saint-Isle, Francia). Las ratas se mantuvieron bajo condiciones de laboratorio controladas como se describio anteriormente. Los animales se alojaron en grupos de 5 en jaulas Macrolon IV.

[0032] El trabajo que se informa aqrn se realizo de acuerdo con las regulaciones de la CE y la National Act on the Use of Experimental Animals (Alemania). El protocolo fue aprobado por el Saxony-Anhalt Committee on Animal Care.

Ejemplo 1 - Preparacion y analisis de extractos de valeriana (VE)

[0033] Para probar el efecto de diferentes relaciones de VA:AVA en modelos in vivo relacionados con GABAa se prepararon dos extractos de valeriana diferentes (VE 1 y VE 2) de la siguiente manera. Se usaron rafces y rizomas de valeriana de la cepa seleccionada, asf como material de referencia estandar (European Pharmacopoeia, Supplement 5.7. Valerian dry hydroalcoholic extract (1898) de Polonia. La cepa seleccionada se selecciono a partir de las cepas

que se presentan de forma natural en el campo, mediante un analisis rutinario de la relacion de VA:AVA. Se encontro que las cepas de valeriana naturales que presentan una relacion de VA:AVA de mas de 2:1 son mas abundantes de lo que se esperaba originalmente. La especie seleccionada tambien se deposito en el Herbario (coleccion de hierbas) del Institute for Biology of the Martin-Luther-University en Halle, Alemania, con fines de publicacion (numero de 5 deposito HAL 115562). La propagacion posterior proporciono la cantidad necesaria de material de partida. El material de partida se agito con hidroalcohol, es decir, hidroetanol (70% V/V) en una relacion de 1:5 a 45 ° C durante 31^ d^as y luego se separo por filtracion con una presion de 2 bar. Las tinturas obtenidas se concentraron mediante un evaporador rotatorio. Las sondas de ambos extractos se analizaron mediante Cromatograffa Lfquida de Ultrarrendimiento (UPLC) (El metodo se basa en Ph Eur-MonographyValerian dry hydroalcoholic extract [6.8./1898]).

10 El contenido exacto de VA y AVA, la suma de VA y AVA, asf como la relacion VA:AVA se enumeran en la tabla a continuacion.

Tabla 1

Designacion: Contenido de VA (mg/l) Contenido de AVA (mg/l) VA + AVA (mg/l) Relacion VA:AVA

Extracto de valeriana 1: 1165.5 98.3 1263.7 1:0.084

Extracto de valeriana 2: 199.5 308.8 508.3 1:1.548

[0034] El extracto de valeriana 1 tema una relacion VA:AVA de aproximadamente 12:1 y el extracto de valeriana 2

15 tema una relacion de aproximadamente 1:1.5. El contenido de HVA era demasiado bajo para medirlo

cuantitativamente.

[0035] Se disolvieron los extractos de valeriana (VE1 y VE 2), diazepam (Faustan®, AWD pharma GmbH & Co KG,

Dresden, Alemania) e imipramina (Sigma, Dusseldorf, Alemania) como sustancias de referencia en solucion salina y se administraron por via oral con una aguja de alimentacion por sonda para raton. Para el control se administro el

20 disolvente (solucion salina al 0,9%). El volumen de aplicacion fue de 0,1 ml /10 g de peso corporal.

[0036] El contenido individual y total de VAy AVA, asf como la dosis administrada a los animales de experimentacion se enumeran en la tabla a continuacion.

Tabla 2

: [Extracto de valeriana 1] [Extracto de valeriana 2]

VA + AVA (mg): VA AVA Dosis (ml) p.o. VA AVA Dosis (ml) p.o.

0.1: 0.0922 0.00776 0.16 0.03925 0.06075 0.20

0.5: 0.4610 0.0388 0.40 0.19630 0.30380 0.98

1.0: 0.9220 0.0776 0.79 0.39250 0.60750 1.97

2.0: 1.8440 0.1522 1.58 0.78500 1.21500 3.93

VA: acido valerenico; AVA: acido acetoxivalerenico; HVA: acido hidroxivalerenico [inferior al nivel de cuantificacion]

25 Ejemplo 2 - Prueba de laberinto en cruz elevado (EPM)

[0037] La ansiedad situacional se midio en la prueba de laberinto en cruz elevado. El laberinto estaba hecho de poli(cloruro de vinilo) negro y tema dos brazos abiertos y dos brazos cerrados (50 x 10 x 40 cm) montados a 50 cm del suelo. El piso de los brazos era liso. El nivel de luz era de 30 lux. Se coloco un raton en la plataforma central del aparato frente a un brazo cerrado. Se uso una camara en el techo de la sala de pruebas para marcar y grabar el 30 comportamiento de los animales desde una sala adyacente durante un penodo de 7 minutos. Se registro el numero de entradas en los brazos abiertos, el tiempo dedicado a los brazos abiertos y el tiempo dedicado a los brazos cerrados. Para evaluar el efecto ansiolftico, se determino el tiempo empleado en el brazo abierto, que se prolonga con sustancias ansiolfticas. Ademas, tambien se analizaron los cambios totales en los movimientos, que reflejan la

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actividad locomotora. (Rodgers RJ. Animal models of anxiety: where next? Behav Pharmacol 1997; 8: 477-96). El laberinto fue limpiado despues de cada prueba.

Ejemplo 3 - Prueba de suspension de cola

[0038] El efecto similar a los antidepresivos del extracto de valeriana se midio utilizando el ensayo de suspension de cola (L. Steru, R. Chermat, B. Thierry y P. Simon, The tail suspension test: a new method for screening antidepressants in mice. Psychopharmacology (Berl), 85 (1985), pp. 367-370). La prueba se llevo a cabo inmediatamente despues de medir la ansiedad en el laberinto elevado. Los ratones se suspendieron por sus colas utilizando una cinta adhesiva colocada aproximadamente a 1 cm de la punta de la cola y colgada aproximadamente a 30 cm por encima de la mesa. Los animales se suspendieron durante 6 minutos, y la duracion de la inmovilidad se anoto manualmente durante el ensayo. La inmovilidad se definio como la ausencia de movimientos de extremidades o cuerpos, con la excepcion de los causados por la respiracion, cuando los ratones colgaban pasivamente y completamente inmoviles. La inmovilidad medida desde el minuto 2 hasta el minuto 6 se uso para evaluar los efectos del farmaco.

Ejemplo 4 - Temperatura corporal interna (BCT)

[0039] Despues de la prueba de suspension de cola, la temperatura interna del cuerpo se midio con un termometro digital (ama digit) fabricado por Amarell GmbH (Kreuzwertheim, Alemania). Para ello, la sonda lubricada (0 1 mm) se inserto suavemente 3 cm en el recto. La temperatura rectal permite diferenciar los resultados relacionados con las acciones nerviosas centrales de los extractos y los efectos de sobredosis (Haffner F .; Die pharmakologische Wertbestimmung des Baldrians. Munch medWschr7: 271-272 [1929]).

Ejemplo 5 - Prueba de verificacion en laberinto en cruz elevado (EPM)

[0040] Para verificar los resultados de la prueba EPM del Ejemplo 2, que indica que la relacion entre VA:AVA es importante para la actividad ansiolttica de VE, el extracto VE-1 con el alto contenido de VA y el bajo contenido de AVA (12:1) fue utilizado nuevamente para replicar la actividad ansiolttica de 0.5 mg de acidos valerenicos. Luego se agrego AvA (HWI Analytik GmbH, Rulzheim, Alemania) al extracto para cambiar las relaciones de VA:AVA de 12:1 (VE-1), a 1:0.5, 1:1 y 1:1.5 (VE 1-A; VE 1-B; VE 1-C), respectivamente. La cantidad de extracto se adapto detal manera que la suma de los VA, es decir, VA mas AVA, fuera siempre la misma. En la tabla 3 a continuacion se dan las diferentes cantidades de extracto con respecto a sus relaciones VA:AVA.

Tabla 3a - VA y AVA en diferentes composiciones de VE y la cantidad calculada para administracion oral

: VA:AVA VA mg/ml AVA mg/ml Base AVA + suministro AVA (mg/ml) VA + AVA total (mg/ml)

LU >: 12:1 1.165 0.0983 1.2633

VE 1A: 1:0.5 1.165 0.583 0.0983 0.48 1.748

VE 1B: 1:1 1.165 1.165 0.0983 1.07 2.33

VE 1C: 1:1.5 1.165 1.75 0.0983 1.65 2.915

Tabla 3b

: VA total + AVA (mg/ml) 0.5 mg/kg 2.0 mg/kg

< m: 0.4998 0.400 ml 1.580 ml

VE 1-A: 1.748 0.286 ml 1.144 ml

VE 1-B: 2.33 0.215 ml 0.858 ml

VE 1-C: 2.915 0.172 ml 0.686 ml

5

10

15

20

25

30

35

[0041] Las VE (0,5 y 2,0 mg/kg, con respecto a la suma total de VA y AVA) se administraron por v^a oral utilizando una aguja de alimentacion por sonda para raton (calibre 24, FST, Heidelberg, Alemania). Como control se administro una solucion salina al 0,9%. El volumen dado fue de 0,1 ml /10 g de peso corporal. Despues de la EPM, la temperatura interna del cuerpo (BCT) se midio con un termometro digital (ama digit) fabricado por Amarell GmbH (Kreuzwertheim, Alemania). Para ello, la sonda lubricada (0 1 mm) se inserto suavemente 3 cm en el recto.

Ejemplo 6 - Verificacion de la temperatura del cuerpo (BCT)

[0042] El BCT para los animales que participan en la prueba EPM del ejemplo 5 se mantuvo para todos los grupos experimentales en el rango de control (Figura 4), incluso si los valores para los grupos que habfan recibido 2 mg/kg fueron algo diferentes (0.5 mg/kg de extracto F4,82 = 0.725, p = 0.725; 2,0 mg/kg de extracto F4,78 = 2.48, p = 0.051). En algunos animales, la BCT se redujo a menos de 34 ° C (0,5 mg/kg = 1; 2,0 mg/kg = 3). Los resultados de estos animales fueron ignorados para la evaluacion de los datos.

Ejemplo 7 - Ensayo de union

[0043] 3H-GABA (SA - 1,43 TBq/mmol) y 3H-flunitrazepam (SA -1,85 TBq/mmol) se obtuvo de PerkinElmer (Boston, EE. UU.), diazepam y clordiazepoxido, de AWD.pharma GmbH (Dresden, Alemania). Las VE probadas fueron identicas a los extractos VE-1 y VE-2 utilizados en los otros ejemplos.

[0044] Para el ensayo de union de 3H-GABA el tejido (cortex frontal de rata diseccionado) se homogeneizo en un regulador Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, que contema NaCl 120 mM, KCI 5 mM, CaCl2 2 mM y de MgCh 1 mM; para 3H- flunitrazepam se homogeneizo en regulador Tris-HCI 50 mM, pH 7,4, que contema EGTA 1 mM, EDTA 10 mM y MgCh 3 mM, se centrifugo (50000 g, 15 min) y se lavo dos veces con el regulador correspondiente. El sedimento resultante se resuspendio con regulador. Se incubaron partes alfcuotas de la suspension de membrana cruda (50 |jg de protema) durante 45 min a 37 ° C con 3H-GABA 2.5 nM o 3H-flunitrazepam 1 nM a 0-4 ° C durante 60 min. La union espedfica se calculo restando la union no espedfica, definida como la que se observa en presencia de GABA 1 jM no marcado o diazepam o clordiazepoxido 1 jM, de la union total obtenida con radioligando solo. En paralelo, se utilizaron VE-1, VE-2 y AVA para todos los ensayos de union. La incubacion se termino mediante la adicion de un regulador enfriado con hielo y una filtracion rapida a traves de filtros de fibra de vidrio. Los filtros se lavaron, se secaron, se anadio un coctel de centelleo y se hizo un recuento de la radioactividad utilizando un contador p (Beckman Coulter, Alemania). Los valores CE50se determinaron mediante la adicion de farmacos no marcados (GABA, clordiazepoxido, diazepam, AVA, VE-1 y VE-2) en un amplio rango de concentracion (10'1° a 10'4 M).

[0045] La evaluacion estadfstica de los datos obtenidos en el laberinto en cruz elevado se llevo a cabo utilizando la prueba H de Kruskal-Wallies, seguida de la prueba U de Mann-Whitney de dos colas. La temperatura corporal interna se analizo utilizando ANOVA. El umbral de significacion se establecio en p <0,05.

[0046] Los dos extractos de valeriana probados no se unieron a los receptores de benzodiazepinas en las membranas sinaptosomicas del cortex frontal de la rata, mientras que el diazepam y el clordiazepoxido sf lo hicieron (Tabla 4). En contraste, ambas VE se unen a los receptores GABA, por lo que la afinidad de union se expreso mas con VE-1 en comparacion con VE-2 (Tabla 5).

Tabla 4

Valores CE50 de competencia de diazepam, clodiazepoxido, VE-1 y VE-2 en sitios de union marcados con 3H-

flunitrazepam de membranas sinaptosomicas crudas del cortex frontal de rata

: Diazepam Clordiazepoxido VE-1 VE-2

CE50 (jM): 0.40 ± 0.05 0.64 ± 0.08 > 50 > 50

Tabla 5

Valores CE50 de competencia de GABA, AVA, VE-1 y VE-2 en sitios de union marcados 3H-GABA de membranas sinaptosomicas crudas del cortex frontal de rata (los valores para las VE se refieren a VA en los extractos)

: GABA AVA VE-1 VE-2

CE50 (jM): 1.82 ± 0.21 - 5.61 ± 1.68 10.04 ± 1.34

5

10

15

20

25

30

[0047] Todas las pruebas de comportamiento se realizaron en el penodo de luz entre las 8:00 a.m. y las 2:00 p.m. Los animales fueron ordenados al azar para su prueba.

Resumen sobre los experimented 1 a 4

[0048] Los experimented in vivo anteriores demuestran que la relacion de VA a AVA es un parametro importante para extractos de valeriana activos en GABAa. Aunque el contenido total de VA y AVA fue el mismo para los dos extractos de valeriana utilizados en los experimentos anteriores, solo el extracto de valeriana 1, que tema un contenido de VA significativamente mayor que el del extracto de valeriana 2, demostro efectos ansiolfticos. Ademas, un mayor contenido en VA comparado con AVA no solo es mas efectivo, sino que tambien permite reducir la dosis y, por lo tanto, evitar o reducir la intoxicacion relacionada con la valeriana. Por lo tanto, los extractos de valeriana de la presente invencion son mas efectivos y seguros al mismo tiempo.

Resumen sobre los experimentos 5 a 7

[0049] Para los grupos de animales en la prueba de verificacion de EPM tratados con 0,5 mg/kg de extracto + AVA se

encontro un efecto significativo (X24,87 = 24.37, p <0.001). Los animales de control (tratados con solucion salina) pasaron 15.15 ± 1.76 % de tiempo en el brazo abierto. Los animales que habfan recibido VE-1 (cantidad total de VA de 0.5 mg/kg, VA:AVA 12:1) rnostraron tieimpos extendidos en el brazo abierto (20.16 ± 1.24%, U2,18,17 89.0, p =

0.035). Esto debe interpretarse como un efecto ansiolftico (figura 4). Los resultados de los otros grupos de animales, que habfan recibido vE con diferentes proporciones de acidos valerenicos (VA:AVA = 1: 0.5 o 1: 1.5) estaban en el rango del grupo de control de solucion salina o demostraron el efecto opuesto, es decir, una accion ansiogenica (VA:AVA = 1: 1; U 2,18,18 = 79.5, p = 0.008).

[0050] Los grupos tratados con 2.0 mg/kg de extracto + AVA tambien difirieron significativamente (X24,86 = 11.05, p = 0.026). El VE -1 en una cantidad elevada (cantidad total de AV de 2,0 mg/kg; AV: AVA = 12:1) indujo mas bien una actividad ansiogenica (9,61 ± 2,02%, U 2 18 17 = 93.0, p = 0.049. Se obtuvo un resultado similar con VE -1 A (VA:AVA = 1: 0.5) (9.06 ± 1.64%, U 2,18,17 = 86.0. p = 0.027) mientras que los resultados para las otras dos VE se mantuvieron en el rango similar para la solucion salina.

[0051] La actividad locomotora (cambios totales en brazo) fue similar en todos los grupos experimentales (0,5 mg/kg de extracto X2 = 4.89, p = 0.298; 2.0 mg/kg de extracto X2 = 6.27, p = 0.18, Fig. 4).

[0052] El BCT permanecio en el rango de control para todos los grupos experimentales (Figura 5), incluso si los valores para los grupos que habfan recibido 2 mg/kg eran algo diferentes (0,5 mg/kg de extracto F = 0,725, p = 0,725; 2,0 mg/kg de extracto F = 2,48, p = 0,051). En algunos animales, la BCT se redujo a menos de 34 ° C (0,5 mg/kg = 1; 2,0 mg/kg = 3). Los resultados de estos animales fueron descartados para la evaluacion de los datos.

[0053] Los dos extractos de valeriana probados no se unieron a los receptores de benzodiazepina en las membranas sinaptosomicas del cortex frontal de la rata, mientras que el diazepam y el clordiazepoxido sf lo hacen. En contraste, ambos VE se unen a los receptores GABA, por lo que la afinidad de union se expreso mas con VE-1 en comparacion con VE-2.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

REIVINDICACIONES

1. Extracto de valeriana para uso en el tratamiento y profilaxis de trastornos relacionados con GABAa seleccionados del grupo que consiste en ansiedad, depresion, inquietud e insomnio, en donde la relacion de acido valerenico (VA) a acido acetoxivalerenico (AVA) en el extracto es de al menos 2:1 en peso.
2. El extracto para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la relacion de acido valerenico (VA) a acido acetoxivalerenico (AVA) en el extracto es al menos 3:1, preferiblemente al menos 4:1, mas preferiblemente al menos 10:1, muy probablemente al menos aproximadamente 12:1 en peso.
3. El extracto para uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en donde el disolvente para producir el extracto se selecciona del grupo que consiste en eter de petroleo, acetato de etilo y/o alcoholes acuosos (hidroalcoholes), preferiblemente hidroalcoholes con un contenido de alcohol entre 40-80%, (v/v) mas preferiblemente metanol o etanol acuoso, siendo lo mas preferible etanol acuoso.
4. Composicion farmaceutica que comprende un extracto de valeriana, en donde la relacion de acido valerenico (VA) a acido acetoxivalerenico (AVA) en el extracto es de al menos 2:1 en peso.
5. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 4, en donde la relacion de acido valerenico (VA) a acido acetoxivalerenico (AVA) en el extracto es al menos 3:1, preferiblemente al menos 4:1, mas preferiblemente al menos 10:1, siendo lo mas probable al menos aproximadamente 12:1 en peso.
6. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 4 o 5, en donde el disolvente para producir el extracto se selecciona del grupo que consiste en eter de petroleo, acetato de etilo y/o alcoholes acuosos (hidroalcoholes), preferiblemente hidroalcoholes con un contenido de alcohol entre 40-80%, (v/v), mas preferiblemente metanol o etanol acuoso, siendo lo mas preferible etanol acuoso.
7. La composicion farmaceutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, que comprende ademas al menos un extracto seleccionado del grupo de extractos producidos a partir de toronjil [melisa], lupulo y flor de la pasion, que comprende ademas preferiblemente extractos producidos a partir de toronjil [melisa], lupulo y flor de la pasion.
8. Metodo para preparar un extracto de valeriana que comprende los pasos de:

a) seleccionar rafces y/o rizomas de valeriana, en donde la relacion de acido valerenico (VA) a acido acetoxivalerenico (AVA) es de al menos 2:1 en peso,

b) extraer el acido valerenico (VA) y el acido acetoxivalerenico (AVA) de las rafces y/o los rizomas utilizando un disolvente adecuado,

c) opcionalmente, procesar adicionalmente el extracto crudo para que sea adecuado para la administracion humana.
9. Metodo para preparar un extracto de valeriana que comprende los pasos de:

a) proporcionar rafces y/o rizomas de valeriana,

b) extraer el acido valerenico (VA) y el acido acetoxivalerenico (AVA) de las rafces y/o los rizomas utilizando un disolvente adecuado,

c) adaptar el contenido de acido valerenico (VA) y acido acetoxivalerenico (AVA) en el extracto de manera que la relacion de acido valerenico (VA) a acido acetoxivalerenico (AVA) sea al menos 2:1 en peso,

d) opcionalmente, procesar adicionalmente el extracto para que sea adecuado para la administracion humana.
10. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 8 o 9, en donde el contenido de acido valerenico (VA) y acido acetoxivalerenico (AVA) en el extracto se adapta de modo que la relacion de acido valerenico (VA) a acido acetoxivalerenico (AVA) sea al menos 3:1, preferiblemente al menos 4:1, mas preferiblemente al menos 10:1, siendo lo mas probable al menos aproximadamente 12:1 en peso.
11. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 8 o 10, en donde el disolvente para producir el extracto se selecciona del grupo que consiste en eter de petroleo, acetato de etilo y/o alcoholes acuosos (hidroalcoholes), preferiblemente hidroalcoholes con un contenido de alcohol entre 40 y 80 %, (v/v), mas preferiblemente metanol o etanol acuoso, siendo lo mas preferible etanol acuoso.