ES2638070T3 - Procedimiento para tratar afecciones neurológicas con glucósidos cardiacos - Google Patents

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Abstract

Un extracto que contiene oleandrina que comprende oleandrina, pero excluyendo neriifolina, en donde dicho extracto ha sido obtenido a partir de una masa vegetal de adelfa mediante extracción de fluidos supercríticos, para su uso en el tratamiento de una afección neurológica.

Description

imagen1
DESCRIPCIÓN
Procedimiento para tratar afecciones neurológicas con glucósidos cardiacos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un extracto que contiene oleandrina para su uso en el tratamiento de afecciones 5 neurológicas. La invención además se dirige a la composición que comprende dicho extracto.
Antecedentes de la invención
Las enfermedades y afecciones neurológicas afectan a la función del cerebro. Se han realizado muchos esfuerzos para desarrollar terapias curativas o paliativas para estas enfermedades y afecciones; sin embargo, no se ha desarrollado ninguna terapia integral o universalmente curativa, aunque existen numerosos enfoques
10 farmacoterapéuticos que han demostrado ser efectivos contra diferentes enfermedades y afecciones.
La enfermedad de Hutington (EH) es una enfermedad hereditaria del cerebro que afecta al sistema nervioso. Está causada por un gen defectuoso que pasa de padres a hijos. El gen EH interfiere con la producción de una proteína particular conocida como “huntingtina” que es crucial para el desarrollo adecuado del cerebro. Las señales clásicas de EH incluyen alteraciones emocionales, cognitivas y motoras. La enfermedad de Huntington está caracterizada por 15 movimientos involuntarios descontrolados (coreicos), pero a veces causa rigidez sin movimientos anormales, cambios en el uso de los miembros (apraxia), pérdida del control de las funciones corporales y demencia, incluyendo un deterioro progresivo de la memoria, velocidad de pensamiento, juicio y falta de altera ante los problemas y planificación. No existe una cura conocida para la enfermedad de Huntington. Aunque existen diferentes medicamentos para ayudar a controlar los síntomas asociados con la EH como los problemas emocionales y del 20 movimiento, no existe un tratamiento para detener o revertir el curso de la enfermedad. La enfermedad de Hutington ha sido reconocida como una enfermedad con una anormalidad general de la membrana. Se ha observado un nivel significativamente elevado (aumento por 10 veces) de Na,K-ATPasa en las membranas de eritrocitos y ganglios basales de los pacientes de Hutington en comparación con los de las personas normales (Butterfield DA, Oeswein JQ, Prunty ME, Hisle KC, Markesbery WR). La mayor actividad de adenosina trifosfato sodio, potasio en las
25 membranas de eritrocitos en la enfermedad de Huntington. Ann Neurology, 4:60-62, 1978) membranas de fibroblasto obtenidas de la piel de los pacientes de la enfermedad de Hutington (Shroeder F, Goetz IE, Roberts E, Membrane anomalies in Huntington´s disease fibroblasts. J. Neurochem. 43: 526-539, 1984).
La enfermedad de Alzheimer es una forma de demencia, una enfermedad neurodegenerativa que daña las funciones intelectuales del cerebro (memoria, orientación, cálculo, etc.), pero normalmente conserva sus funciones 30 motoras. En la enfermedad de Alzheimer, la mente se deteriora gradualmente, causando pérdida de memoria, confusión, desorientación, juicio deficiente y otros problemas que pueden afectar a la capacidad de una persona para llevar a cabo sus actividades cotidianas. El tipo, gravedad, secuencia y progresión de los cambios mentales varían enormemente. No se conoce una cura para la enfermedad de Alzheimer ni una forma conocida de ralentizar su progresión. Para algunas personas en las etapas tempranas o medias de la enfermedad, los medicamentos como 35 la tacrina pueden aliviar algunos síntomas cognitivos. Aricept (donepezilo) y Exelon (rivastigmina) son bloqueadores de acetilcolinesterasa que están indicados para el tratamiento de demencia leve a moderada del tipo Alzheimer. Estos medicamentos (llamados inhibidores de colinesterasa) funcionan aumentando los niveles del cerebro del neurotransmisor acetilcolina, ayudando a restaurar la comunicación entre las células cerebrales. Algunos medicamentos pueden ayudar a controlar los síntomas conductuales como el insomnio, agitación, deambuleo,
40 ansiedad y depresión. Estos medicamentos están dirigidos a hacer que el paciente esté más cómodo. Aunque no se conoce ningún medicamento que cure el Alzheimer, los inhibidores de colinesterasa pueden mejorar el desempeño de las actividades cotidianas, o disminuir los problemas del comportamiento. Los medicamentos para curar la enfermedad de Alzheimer probados actualmente incluyen estrógenos, agentes antinflamatorios no esteroideos, vitamina E, selegilina (Carbez, Eldepryl) y el producto botánico gingko biloba.
45 Bajo condiciones normales, las neuronas mantienen su potencial y función de membrana en reposo mediante bombeos vinculados a la membrana, homeostáticos y dependientes de la energía de Na,K-ATPasa. La isquemia desencadena alteraciones en la homeostasis iónica que potencialmente conllevan daños irreversibles a los tejidos. Se ha sugerido que la actividad de Na,K-ATPasa juega un papel en el proceso neuropatológico y apoptótico en algunos modelos de isquemia focal y lesiones cerebrales traumáticas. Se ha reportado que la función de la Na,K
50 ATPasa en lesiones cerebrales isquémicas provocadas por accidentes cerebrovasculares está asociada con diferentes mecanismos moleculares. La inhibición de la actividad catalítica de la Na,K-ATPasa, por ejemplo, lleva a una reducción del consumo de ATP durante la isquemia y reperfusión. Adicionalmente, la eliminación de Ca2+ cistosólico puede causar la muerte de las células neuronales. Así, la inhibición de Na,K-ATPasa, por ejemplo, mediante glucósidos cardiacos, puede resultar en un aumento de los niveles intercelulares de Ca2+ y en un descenso
55 en la extrusión de Ca2+ intracelular mediante el intercambiador Na-Ca. En línea con esto, los niveles relativamente menores de Ca2+ intracelular en las neuronas CA1 del hipocampo se han observado tres días tras la isquemia transitoria y la elevación de los niveles de calcio se cree que proporciona protección contra la muerte neuronal retrasada a través de una gama amplia de tiempos de tratamiento post isquemia.
imagen2
Uno de los mecanismos farmacológicos de acción de los glucósidos cardiacos implica su capacidad para vincularse al bombeo de intercambio iónico, Na,K-ATPasa y de inhibir la actividad de esta encima particular. Na,K-ATPasa, la proteína transmembrana que cataliza el transporte activo de Na+ y K+ a través de la membrana de plasma, es un receptor farmacológico bien establecido para los glucósidos cardiacos. Esta encima hidroliza el ATP y utiliza la
5 energía libre para impulsar el transporte de K+ a la célula y de Na+ fuera de las células, contra sus gradientes electroquímicos (Hauptman, P. J., Garg, R., y Kelly, R. A. Cardiac glycosides in the next millennium. Prog. Cardiovasc. Dis. 41: 247-254, 1999).
Na,K-ATPasa está compuesto por dos subunidades de heterodímero, la subunidad α catalítica y la subunidad β glicosilada. También está la subunidad γ, pero no ha sido estudiada con detalle. La subunidad α tiene zonas de 10 vinculación para ATP, Na+, K+, y glucósidos cardiacos. La subunidad β funciona para estabilizar la subunidad α catalítica y puede jugar un papel regulatorio también. Se han identificado cuatro isoformas α diferentes (α1, α2, α3, α4) y tres isoformas β diferentes (β1, β2, β3) en las células de los mamíferos. La expresión relativa de cada tipo de subunidad se altera notablemente en los estados normal y enfermo. Adicionalmente, la afinidad aparente de los glucósidos cardiacos con las diferentes isoformas α es bastante diferente. La vinculación de glucósidos cardiacos a
15 la isoforma α1 es menor que la que se produce con las isoformas α2 y α2 que son 250 veces o más más sensibles a la inhibición por este tipo de medicamento (Blanco, G. y Mercer, R. W. Isozymes of the Na, K-ATPase: heterogeneity in structure, diversity in function. Am. J. Physiol. 275 (Renal Physiol. 44): F633-F650, 1998). Sakai et al. (FEBS Letters 563: 151-154, 2004) reporta que la expresión de la isoforma de la subunidad α3 aumenta en las células cancerígenas colorrectales humanas en comparación con las células colorrectales normales.
20 Existe una gama amplia en el agua relativa a diferencia de la solubilidad de lípidos de los glucósidos cardiacos. Aunque la mayoría de los glucósidos cardiacos pueden vinculares a e inhibir la actividad de la Na,K-ATPasa, esos glucósidos cardiacos que son relativamente más solubles en agua (hidrofílicos) que los solubles en lípidos (lipofílicos
o hidrofóbicos) tienen solo una capacidad limitada para cruzar la barrera de lípidos del cerebro conocida como la barrera hematoencefálica. La barrera hematoencefálica (BHE) es una separación de sangre en circulación y fluido
25 cerebroespinal (CSF) mantenida por plexo coroideo en el sistema nervioso central (SNC). Las células endoteliales restringen la difusión de objetos microscópicos (por ejemplo, bacteria) y moléculas grandes o hidrofílicas en el CSF, mientras que permiten la difusión de pequeñas moléculas hidrofóbicas (O2, hormonas, glucósidos cardiacos solubles en lípidos, etc.).
La Nerium Oleander es una planta ornamental ampliamente distribuida en Asia subtropical, el suroeste de Estados
30 Unidos y el Mediterráneo. Sus propiedades médicas y toxicológicas han sido reconocidas durante largo tiempo. Se ha utilizado, por ejemplo, en el tratamiento de hemorroides, úlceras, lepra, mordeduras de serpiente e incluso para inducir el aborto. La oleandrina es un componente importante, aunque no el único del extracto de adelfa, y es un glucósido cardiaco.
La extracción de glucósidos de plantas de las especies Nerium ha proporcionado ingredientes farmacológica y
35 terapéuticamente activos de la Nerium Oleander. Entre estos están la oleandrina, neriifolia y otros compuestos de glucósidos cardiacos. Los extractos de oleandrina obtenidos mediante extracción por agua caliente de Nerium oleander, vendidos bajo la marca comercial ANVIRZELTM, contienen la forma concentrada o forma en polvo de un extracto mediante agua caliente de Nerium Oleander. Un ensayo de Fase I de un extracto de adelfa por agua caliente (por ejemplo, AnvirzelTM) ha sido completado (Mekhail et al., Am. Soc. Clin. Oncol., vol. 20, p. 82b, 2001). Se
40 concluyó que los extractos de adelfa, que proporcionarían alrededor de 57 ug de oleandrina/día, pueden administrarse de forma segura en dosis de hasta 1,2 ml / m2 / d. No se encontraron toxicidades que limitaran las dosis.
El huachansu es un extracto obtenido de la piel del sapo y comprende bufadienolidas, como bufalina, un glucósido cardiaco. El HunChanSu es un medicamento aprobado para el tratamiento del cáncer en China. Ha sido utilizado
45 para tratar diferentes tipos de cáncer, incluyendo el cáncer hepático, gástrico, de pulmón, de piel y de esófago. US 2006/234955 describe el uso de glucósidos cardiacos, incluyendo la oleandrina, en el tratamiento de numerosas enfermedades, incluyendo la enfermedad de Alzheimer.
Compendio de la invención
La invención proporciona un extracto que contiene oleandrina que comprende oleandrina, pero excluye la neriifolia,
50 en donde dicho extracto ha sido obtenido a partir de una masa vegetal de adelfa mediante extracción de fluidos supercríticos, para su uso en el tratamiento de una afección neurológica.
La invención también está dirigida a una composición que comprende dicho extracto para su uso en el tratamiento de una afección neurológica.
Las realizaciones preferidas de la invención son aparentes a partir de las reivindicaciones dependientes.
55 A partir de ahora, cuando se mencione el glucósido, se referirá al extracto que contiene oleandrina comprendiendo oleandrina, pero excluyendo neriifolia de la presente invención.
El tratamiento de una enfermedad o trastorno neurológico que tenga una etiología asociada con una actividad de Na,K-ATPasa alterada con una composición comprendiendo glucósido cardiaco, comprende:
imagen3
determinar que el sujeto tiene una enfermedad o trastorno neurológico que tiene una etiología asociada con una proporción de subunidad de isoforma α3 a α1 Na,K-ATPasa alterada o con una actividad Na,K-ATPasa alterada; e
indicar administrar al sujeto una composición comprendiendo glucósido cardiaco.
5 Algunas realizaciones de la invención incluyen aquellas en donde: 1) se le ha prescrito y se le administra al sujeto una dosis terapéuticamente relevante de la composición que comprende glucósido cardiaco; 2) al sujeto se le administra la composición que comprende glucósido cardiaco según un régimen de dosificación prescrito; 3) al sujeto se le administra una composición que comprende un extracto que comprende glucósido cardiaco; 4) el extracto además comprende uno o más agentes efectivos terapéuticamente adicionales obtenidos junto con el
10 glucósido cardiaco durante la extracción; 5) el extracto además comprende uno o más agentes terapéuticamente efectivos adicionales obtenidos junto con el glucósido cardiaco durante la extracción; 6) la composición además comprende uno o más agentes terapéuticamente efectivos no glucósido cardiaco, es decir, un agente que no es un glucósido cardiaco.
El tratamiento de una afección neurológica en un sujeto en necesidad de la misma comprende:
15 determinar si la afección neurológica del sujeto es o no una enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington u otra afección neurológica;
indicar la administración de glucósido cardiaco;
administrar una dosis inicial de glucósido cardiaco al sujeto según un régimen de dosificación prescrito durante un periodo de tiempo;
20 determinar periódicamente la idoneidad de la respuesta clínica del sujeto y/o respuesta terapéutica al tratamiento con glucósido cardiaco; y
si la respuesta clínica del sujeto y/o la respuesta terapéutica del sujeto es adecuada, continuar el tratamiento con glucósido cardiaco según sea necesario hasta que se consiga el resultado clínico deseado; o
si la respuesta clínica del sujeto y/o la respuesta terapéutica del sujeto son inadecuadas en la dosis inicial y el
25 régimen de dosificación inicial, aumentar o disminuir la dosis hasta que se consiga la respuesta clínica y/o respuesta terapéutica deseada en el sujeto.
Prevenir o reducir la incidencia de aparición de una afección neurológica en una población de sujetos en riesgo de la misma comprende:
administrar una dosis efectiva de glucósido cardiaco de forma recurrente durante un periodo de tiempo extendido a
30 uno o más sujetos en una población de sujetos en riesgo de sufrir una afección neurológica como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, accidente cerebrovascular u otra afección neurológica, previniendo o reduciendo así la incidencia de la afección neurológica en la población.
También se incluyen las realizaciones en donde: a) el procedimiento además comprende indicar la administración de glucósido cardiaco a uno o más sujetos; b) el procedimiento además comprende administrar una dosis efectiva de 35 glucósido cardiaco al sujeto según un régimen de dosificación prescrito durante un periodo de tiempo; c) el procedimiento además comprende determinar periódicamente la idoneidad de la respuesta clínica y/o respuesta terapéutica al tratamiento con glucósido cardiaco de uno o más sujetos; d) si la respuesta clínica y/o respuesta terapéutica del sujeto es adecuada, entonces el procedimiento además comprende continuar el tratamiento con glucósido cardiaco según sea necesario hasta que se consiga el resultado clínico deseado; e) si la respuesta clínica 40 y/o respuesta terapéutica del sujeto son inadecuadas en la dosis inicial y en el régimen de dosificación inicial, entonces el procedimiento además comprende aumentar o disminuir la dosis hasta que se consiga la respuesta clínica y/o respuesta terapéutica deseada en el sujeto; f) el glucósido cardiaco se administra a sujetos plurales en una población; g) el criterio recurrente es diariamente, en días alternos, cada dos días, cada tres días, cada cuatro días, cada cinco días, cada seis días, semanalmente, en semanas alternas, cada dos semanas, cada tres semanas, 45 mensualmente, bimensualmente, quincenalmente, en meses alternos cada segundo mes, trimestralmente, en trimestres alternos, trimestralmente, por temporadas, cada seis meses y/o anualmente; h) el periodo extendido es una o más semanas, uno o más meses, uno o más trimestres y/o uno o más años; i) la dosis efectiva se administra una o más veces al día; j) el procedimiento además comprende identificar una población de sujetos en riesgo de sufrir una afección neurológica como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington, accidente 50 cerebrovascular u otra afección neurológica; y/o k) la población de sujetos en riesgo se caracteriza por la edad avanzada del sujeto, historial familiar de la afección neurológica, la presencia y expresión del gen ApE4 en el sujeto, sexo femenino (el doble de mujeres contraen Alzheimer en comparación con los hombres), enfermedad cardiovascular (por ejemplo, presión sanguínea alta y niveles altos de colesterol), diabetes (especialmente de Tipo 2
o aparición tardía en adultos de esta enfermedad), síndrome de Down, lesiones en la cabeza, niveles bajos de 55 educación formal, tabaquismo, consumo excesivo de alcohol y/o abuso de drogas.
imagen4
El tratamiento de accidente cerebrovascular retardado en un sujeto comprende:
dentro de un periodo de retraso aceptable tras haber sufrido el sujeto el accidente cerebrovascular, administrar una dosis inicial de glucósido cardiaco según un régimen de dosificación inicial;
determinar la idoneidad de la respuesta clínica y/o respuesta terapéutica del sujeto al tratamiento con glucósido 5 cardiaco; y
si la respuesta clínica y/o la respuesta terapéutica del sujeto es adecuada, continuar con el tratamiento de glucósido cardiaco según sea necesario hasta que se consiga el resultado clínico deseado; o
si la respuesta clínica y/o respuesta terapéutica del sujeto son inadecuadas en la dosis inicial y el régimen de dosificación inicial, aumentar o disminuir la dosis hasta que se consiga la respuesta clínica y/o respuesta terapéutica
10 adecuadas en el sujeto.
Algunas realizaciones incluyen aquellas en donde: 1) el periodo de retraso es de 10 horas o menos, 8 horas o menos, 6 horas o menos, 4 horas o menos, 3 horas o menos, 2 horas o menos, 1 hora o menos, 45 minutos o menos, 30 minutos o menos, 20 minutos o menos o 10 minutos o menos; 2) la determinación de la idoneidad de la respuesta clínica y/o terapéutica del paciente se realiza mediante evaluaciones de cualquier debilidad en el rostro,
15 brazo y/o pierna en un lado del cuerpo, entumecimiento del rostro, brazo y/o pierna en un lado del cuerpo, incapacidad para comprender el lenguaje hablado, incapacidad para hablar o hablar claramente, incapacidad para escribir, vértigo o desequilibrio al andar, visión doble, y un dolor de cabeza inusualmente fuerte; o 3) una combinación de los mismos.
El glucósido cardiaco puede utilizarse en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una afección
20 neurológica en un sujeto. En algunas realizaciones, la fabricación de dicho medicamento comprende: proporcionar un glucósido cardiaco; incluir una dosis de glucósido cardiaco en una forma de administración farmacéutica; y envasar la forma de administración farmacéutica. En algunas realizaciones, la fabricación puede realizarse según se describe en la Solicitud internacional PCT Nº PCT/US06/29061. La fabricación también puede incluir uno o más etapas adicionales como: enviar la forma de administración farmacéutica a un proveedor (venta al por menor, venta
25 al por mayor y/o distribuidor); vender o proporcionar la forma de administración farmacéutica a un sujeto que padezca una afección neurológica; incluir con el medicamento una etiqueta y prospecto, que proporciona instrucciones de uso, dosificación, administración, contenido y perfil toxicológico de la forma de administración farmacéutica. En algunas realizaciones, el tratamiento de una condición neurológica comprende: determinar que un sujeto tiene una enfermedad o trastorno neurológico; indicar la administración de glucósido cardiaco al sujeto según
30 un régimen de dosificación; administrar al sujeto una o más formas de administración farmacéutica que contenga glucósido cardiaco, en donde una o más formas de administración farmacéutica se administra según el régimen de dosificación.
En algunas realizaciones, el sujeto que padece la afección neurológica, es decir, el sujeto en necesidad de tratamiento es parte de una población de dichos sujetos. El procedimiento para mejorar el estado clínico de un
35 número estadísticamente significativo de sujetos de una población de sujetos que padecen una afección neurológica, el procedimiento comprendiendo:
administrar a la población de sujetos un glucósido cardiaco o una composición que contenga glucósido cardiaco; y determinar el estado clínico de los sujetos. En algunas realizaciones, el número estadísticamente significativo es de al menos el 5 % de la población.
40 En algunas realizaciones, la afección neurológica es la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington, accidente cerebrovascular u otra afección neurológica, tal como se ha descrito en la presente memoria. El medicamento puede fabricarse mediante la inclusión del glucósido cardiaco en una forma de administración farmacéutica que contenga uno o más excipientes farmacéuticos aceptables.
El tratamiento del sujeto con glucósido cardiaco se continua según sea necesario. La dosis o régimen de
45 dosificación puede ajustarse según sea necesario hasta que el paciente alcance el resultado clínico deseado, como una reducción o alivio de síntomas neurológicos específicos asociados con la enfermedad. La determinación de la idoneidad de la respuesta clínica y/o respuesta terapéutica puede llevarse a cabo por un médico familiarizado con la condición neurológica que se está tratando.
En algunas realizaciones, la afección neurológica se seleccione de un grupo consistente de enfermedad neurológica,
50 afección neurológica y accidente cerebrovascular. En algunas realizaciones, la enfermedad neurológica es una enfermedad neurodegenerativa. En algunas realizaciones, la enfermedad neurodegenerativa se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, encefalopatía espongiforme bovina, esclerosis múltiple, neuropatía diabética, autismo y lipofuscinosis ceroide neuronal juvenil. En algunas realizaciones, el accidente cerebrovascular es isquémico o una
55 lesión isquémica provocada por un accidente cerebrovascular.
Según la invención 1) el glucósido cardiaco es oleandrina; 2) El glucósido cardiaco está presente en un extracto; 3) el glucósido cardiaco puede estar presente en una formulación farmacéutica o composición; 4) el glucósido cardiaco ha sido obtenido a partir de una masa vegetal de la adelfa; 5) la masa vegetal de la adelfa puede comprender las especies Nerium, como Nerium Oleander, o las especies Thevetia, como Thevetia neriifolia (conocida como adelfa amarilla); 6) el glucósido cardiaco cruza la barrera hematoencefálica (BHE) tras la administración al sujeto; 7)
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5 el extracto de glucósido cardiaco fue preparado mediante extracción de fluidos supercríticos (SCF) opcionalmente en la presencia de un modificador; 8) el glucósido cardiaco tiene una tasa de eliminación para el tejido cerebral no mayor que 4 L/r; y/o 9) tras la administración del mismo por cualquiera de las vías descritas en la presente memoria, el glucósido cardiaco es retenido en el tejido cerebral durante un periodo de al menos 8 horas.
El glucósido cardiaco excluye la neriifolia.
10 En algunas realizaciones: 1) el extracto SCF además comprende al menos otro agente farmacológicamente activo a parte del glucósido cardiaco, dicho otro agente farmacológicamente activo habiendo sido obtenido junto con el glucósido cardiaco durante el proceso de extracción utilizado para preparar el extracto; 2) el extracto SCF además comprende al menos otro agente farmacológicamente activo no glucósido cardiaco; 3) el otro agente farmacológicamente activo puede contribuir a la eficacia terapéutica del glucósido cardiaco cuando el extracto se
15 administra a un sujeto; 4) el otro agente farmacológicamente activo funciona de forma aditiva o sinérgica para contribuir a la eficacia terapéutica del glucósido cardiaco; y/o 5) el extracto ha sido obtenido de la piel del sapo o las secreciones del mismo.
En algunas realizaciones, la afección neurológica tiene una etiología asociada con cambios específicos en la actividad Na,K-ATPasa ya sea por una mayor actividad enzimática como la asociada con el autismo juvenil (Clin.
20 Biochem. 2009; 42(10-11), 949-957), una disminución de la actividad enzimática como la observada en la neuropatía diabética (Neuroscience 2009), enfermedad de Batten (Exp. Cell Res. 2008, 314(15):2895-2905), demencia relacionada con la edad y enfermedad de Alzheimer (J. Alzheimers Dis. 2008, 14(1): 85-93; Neurobiol. Aging 2007, 28(7):987-994), o mutaciones específicas en la estructura de la subunidad Na, K-ATPase como la asociada con la enfermedad de Parkinson (Human Gen. 2009, 126(3):431-447).
25 Las etapas individuales de los tratamientos pueden realizarse en instalaciones independientes o en la misma instalación.
La invención incluye todas las combinaciones de aspectos, realizaciones y sub-realizaciones de la invención descrita en la presente memoria.
Breve descripción de los dibujos
30 Las siguientes figuras forman parte de la presente descripción y describen realizaciones ejemplares de la invención reivindicada.
Las FIGS. 1A-1C representa los resultados de la evaluación comparativa de oleandrina versus neriifolia en un ensayo de “accidente cerebrovascular” con neuroprotección basado en cerebro seccionado (Ejemplo 8), en donde un número de neuronas corticales sanas se determina tras 5 a 6 minutos de privación de oxígeno y glucosa (OGD)
35 en la presencia o ausencia de esos agentes. Se presentan los resultados de tres experimentos independientes.
La FIG. 1D representa los datos de respuesta de concentración obtenidos de la evaluación comparativa de la oleandrina versus la neriifolina, el control, en un ensayo de “accidente cerebrovascular” con neuroprotección basado en cerebro seccionado (Ejemplo 11), en donde el número de neuronas corticales sanas se determina tras 5 a 6 minutos de privación de oxígeno y glucosa (OGD) en la presencia o ausencia de esos agentes.
40 La FIG. 1E representa los resultados de un ensayo de respuesta de concentración para un extracto SCF que contiene oleandrina en un ensayo de “accidente cerebrovascular” con neuroprotección basado en cerebro seccionado como el descrito en la presente memoria (Ejemplo 11), en donde no se utilizó como control la privación de oxígeno y glucosa.
Las FIGS. 2A-2C representan los resultados de la evaluación comparativa de oleandrina versus neriifolina en un
45 ensayo de “no accidente cerebrovascular” con neuroprotección basado en cerebro seccionado (Ejemplo 8), en donde el número de neuronas corticales sanas se determina sin OGD en la presencia o ausencia de esos agentes.
Las FIGS. 3A-3C representan los resultados de la evaluación comparativa de oleandrina versus extracto de oleandrina en un ensayo de “Alzheimer” con neuroprotección basado en cerebro seccionado (Ejemplo 9), en donde el número de neuronas corticales sanas se determina tras la degeneración inducida por APP/Aβ en la ausencia o
50 presencia de diferentes cantidades de esos agentes.
Las FIGS. 4A-4D representan los resultados de experimentos duplicados de la evaluación comparativa de oleandrina en un ensayo de “enfermedad de Huntington” basado en un co-cultivo de neuronas cortico estriatal con neuroprotección (Ejemplo 10), en donde el rescate de porcentaje, relativo al control, de neuronas corticales y neuronas estriatales transfectaron con una forma mutante de la proteína Huntingtina (htt) se determina en la
55 ausencia o presencia de diferentes cantidades de oleandrina.
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La FIG. 4E representa la curve de respuesta de concentración para oleandrina en términos de su capacidad relativa para rescatar la lesión neuronal y muerte debido a la transfección de la enfermedad de Huntington (resultados del ensayo in vitro; Ejemplo 10).
La FIG. 5 representa el resultado de un ensayo de “accidente cerebrovascular” basado en cerebro seccionado con neuroprotección y retardo en el tiempo como se describe en la presente memoria (Ejemplo 13), en donde el tejido del cerebro afectado se trata con una solución que contiene glucósido cardiaco (extracto SCF que contiene oleandrina) tras haber pasado aproximadamente 2 horas, aproximadamente 4 horas o aproximadamente 6 horas tras el OGD.
La FIG. 6 representa un gráfico de la relación concentración-tiempo en plasma y tejido cerebral de oleandrina durante un periodo de 24 horas tras la administración i.p. de un extracto SCF que contiene oleandrina (triángulos, código identificador: PBI-05204) y oleandrina (círculos) en ratones CD1. Se muestra la concentración media de oleandrina ±SD en el cerebro (ng/g) y plasma (ng/ml) para cinco ratones. PBI-05204 (38 mg/kg conteniendo 0,8 mg/kg de oleandrina, 50 µl) y oleandrina (3 mg/kg, 100 µl) fueron disueltos en un medio DMSO:PEG400, 50:50 v/v (PBI-05204, 28,6 mg/ml) o 25:75 v/v (oleandrina, 1 mg/ml). Los grupos de control recibieron el medio DMSO:PEG400 solo. A 0,5, 1, 2, 4, 8 y 24 horas, el plasma y el tejido cerebral se recogieron para el análisis LC/MS/MS. Se observó una penetración CNS rápida y sostenida tras la administración de PBI-05204 y oleandrina.
Las FIGS. 7A y 7B representan los resultados de un ensayo basado en cerebro seccionado con neuroprotección como se describe en la presente memoria. La FIG. 7ª representa una curva de concentración-respuesta mostrando la relación para la oleandrina (círculos rellenos en gris). Un compendio de 6 series normalizadas a la diferencia entre los controles positivo interno (no OGD) y negativo (OGD) para cada serie establecida al 100 %; se muestran las medias ±SEM. La relación de concentración de neriifolina (cuadrados abiertos) se vuelve a imprimir aquí tomada de Wang et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006), 103(27), 10461-10466) para su comparación. La FIG. 7B representa una curva de respuesta de concentración mostrando la relación para PBI-05204 (cuadrados rellenos de color negro). Un compendio de 13 series normalizadas a la diferencia entre controles positivo interno (no OGD) y negativo (OGD) para cada serie establecida al 100 %; se muestran las medias ±SEM. Los datos de la FIG. 7ª para oleandrina se vuelven a trazar en la FIG. 7B asumiendo una composición al 3 % para oleandrina en el extracto PBI-05204.
Descripción detallada de la invención
La invención proporciona un extracto que contiene oleandrina que comprende oleandrina, pero excluye la neriifolina, en donde dicho extracto ha sido obtenido a partir de una masa vegetal de adelfa mediante extracción de fluido supercrítico, para su uso en el tratamiento de una afección neurológica. El tratamiento se realiza mediante la administración de una dosis efectiva del extracto que contiene oleandrina a un sujeto que necesite el mismo. El glucósido cardiaco se administra de acuerdo al régimen de dosificación más adecuado para el sujeto, la idoneidad de la dosis y el régimen de dosificación serán determinados clínicamente según las prácticas clínicas convencionales y los resultados de tratamiento clínico para la afección neurológica a tratar.
En algunas realizaciones, la enfermedad neurológica o afección neurológica a tratar tiene una etiología asociada con la actividad de vinculación de Na,K-ATPasa o con la desregulación de Na,K-ATPasa en una célula o tejido. En algunas realizaciones, la enfermedad neurodegenerativa o la afección neurológica a ser tratada tiene una etiología asociada con la actividad de vinculación de HIF-1α o con la desregulación de HIF-1α en una célula o tejido. Dicha desregulación puede producirse, por ejemplo, como una alteración significativa hasta cierto punto de la actividad enzimática. Esto, a su vez, puede resultar en un cambio en la función enzimática, contenido enzimático o incluso la distribución en un tejido afectado.
Un sujeto tratado exhibirá una respuesta terapéutica. El término “respuesta terapéutica” significa que un sujeto que sufre la enfermedad o afección disfrutará de al menos uno de los siguientes beneficios clínicos como resultado del tratamiento con glucósido cardiaco: mejoría de la enfermedad o afección, reducción de la aparición de síntomas asociados con la enfermedad o afección, remisión parcial de la enfermedad o afección, remisión completa de la enfermedad o afección, o mayor tiempo hasta la progresión. En otras palabras, la respuesta terapéutica puede ser una respuesta completa o parcial.
Una respuesta terapéutica también puede describirse como aquella en la que la calidad de vida del paciente afectado con la enfermedad neurodegenerativa mejora. La mejora de la calidad de vida puede producirse, por ejemplo, mediante la reducción de la aparición, frecuencia o gravedad de los síntomas asociados con la enfermedad (por ejemplo, temblores, movimientos musculares involuntarios, pérdida o pérdida parcial de la coordinación nerviomúsculo, retención de memoria, etc.).
“Prevenir la incidencia de una afección neurológica en una población de sujetos en riesgo” significa que la afección neurológica no se producirá durante un periodo de tiempo predeterminado en una población predeterminada demográficamente de sujetos que están en riesgo de sufrir una afección neurológica. La prevención durante el periodo de tiempo predeterminado se produce como resultado de haber administrado a los sujetos en esa población un glucósido cardiaco según los procedimientos de la invención. Como un ejemplo, cuando la composición que contiene glucósido cardiaco se administra durante un periodo predeterminado de tiempo a sujetos en una población
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de sujetos en riesgo de sufrir un accidente cerebrovascular, el accidente cerebrovascular no se producirá en esos sujetos durante el periodo de tiempo predeterminado. En particular, la composición que contiene glucósido cardiaco se administra crónicamente durante un periodo de un año a una población de sujetos en riesgo de sufrir la enfermedad de Alzheimer, y los sujetos en esa población no presentan síntomas asociados con la enfermedad de Alzheimer durante ese periodo de un año.
“Reducir la incidencia de aparición de una afección neurológica en una población de sujetos en riesgo” se relaciona en significado con “prevenir la incidencia”, excepto que “reducir la incidencia de aparición” permite que aparezca la afección neurológica en una población predeterminada demográficamente de sujetos pero a un índice de aparición o a un nivel de gravedad que se reduce en comparación con una población predeterminada demográficamente similar de sujetos en riesgo a los que no se les ha administrado la composición que contiene glucósido cardiaco según los procedimientos de la invención.
Como se usa en la presente memoria, “tiempo hasta la progresión” es el periodo, longitud o duración de tiempo tras diagnosticarse la enfermedad (o tratarse) hasta que la enfermedad comienza a empeorar. Es el periodo de tiempo durante el cual el nivel de una enfermedad se mantiene sin progresión adicional de la enfermedad, y el periodo de tiempo finaliza cuando la enfermedad comienza a progresar de nuevo. La progresión de una enfermedad se determina mediante la “estadificación” del sujeto que sufre la afección neurológica antes de o al inicio de la terapia. Por ejemplo, la salud neurológica del sujeto se determina antes de o al inicio de la terapia. Luego se trata al sujeto con glucósido cardiaco, y la salud neurológica se monitoriza periódicamente. En un momento posterior, los síntomas de la afección neurológica pueden empeorar, marcando la progresión de la enfermedad y el final del “tiempo hasta la progresión”. El periodo de tiempo durante el cual la enfermedad no progresó o durante el cual el nivel o gravedad de la enfermedad no empeoró es el “tiempo hasta la progresión”.
Un régimen de dosificación incluye una dosis terapéuticamente relevante (o dosis efectiva) de uno o más glucósidos cardíacos administrados según un programa de dosificación. Una dosis terapéuticamente relevante, por tanto, es una dosis terapéutica en la cual se observa una respuesta terapéutica de la enfermedad o trastorno al tratamiento con glucósido cardiaco y a la cual puede administrarse a un sujeto el glucósido cardiaco sin una cantidad excesiva de efectos secundarios no deseados o perjudiciales. Una dosis terapéuticamente relevante es no letal para un sujeto, incluso si puede causar algunos efectos secundarios al paciente. Es una dosis a la cual el nivel de beneficio clínico para el sujeto al que se le administra el glucósido cardiaco supera el nivel de efectos secundarios perjudiciales que experimenta el sujeto debido a la administración del glucósido cardiaco. Una dosis terapéuticamente relevante variará de sujeto a sujeto según una variedad de principios farmacológicos, farmacodinámicos y farmacocinéticos establecidos. Sin embargo, una dosis terapéuticamente relevante (relativa, por ejemplo, a la oleandrina) normalmente no superará los 25, 100, 250, 500 o 1.000 microgramos de glucósido cardiaco/día o puede estar en el rango de 25-500 0 25 – 1.000 microgramos de glucósido cardiaco/día. Se conoce en la técnica que la cantidad real de un medicamento requerido para proporcionar un resultado terapéutico objetivo en un sujeto puede variar de sujeto a sujeto según los principios básicos de la farmacia.
Una dosis terapéuticamente relevante puede administrarse según cualquier régimen de dosificación normalmente usando en el tratamiento de enfermedades o trastornos neurológicos o neurodegenerativos. Una dosis terapéuticamente relevante puede administrarse una vez, dos veces, tres veces o más diariamente según el programa de dosificación. Puede administrarse en días alternos, cada tres días, cada cuatro días, cada cinco días, semi semanalmente, semanalmente, bisemanalmente, cada tres semanas, cada cuatro semanas, mensualmente, bimensualmente, semi mensualmente, cada tres meses, cada cuatro meses, semi anualmente, anualmente o según una combinación de cualquiera de los precedentes para conseguir un programa de dosificación adecuado. Por ejemplo, una dosis terapéuticamente relevante puede administrarse una vez al día durante una o más semanas.
Los siguientes ejemplos incluyen evidencias de la eficacia de los glucósidos cardiacos en afecciones neurológicas como enfermedades neurológicas, trastornos neurológicos y accidentes cerebrovasculares. El ejemplo 3 detalla un procedimiento para tratar la enfermedad de Alzheimer con glucósido cardiaco o una combinación de glucósido cardiaco con uno o más agentes terapéuticos adicionales. El ejemplo 4 detalla un procedimiento para tratar una lesión cerebral isquémica provocada por un accidente cerebrovascular con glucósido cardiaco o una combinación de glucósido cardiaco con uno o más agentes terapéuticos.
En general, un sujeto que sufra una afección neurológica se trata como sigue. Un sujeto que presenta una afección neurológica se evalúa para determinar si la afección neurológica es o no enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, accidente cerebrovascular u otra afección neurológica. Se indica la administración de glucósido cardiaco. Las dosis iniciales de glucósido cardiaco se administran al sujeto según un régimen de dosificación prescrito durante un periodo de tiempo. La respuesta clínica del sujeto y el nivel de respuesta terapéutica se determinan periódicamente. Si el nivel de respuesta terapéutica es demasiado bajo a una dosis, la dosis se aumenta según un programa de aumento de dosis predeterminado hasta alcanzar el nivel de respuesta terapéutica en el sujeto. El tratamiento del sujeto con glucósido cardiaco se continua según sea necesario. La dosis o régimen de dosificación puede ajustarse según sea necesario hasta que el paciente alcance el resultado(s) clínico deseado como el cese de la enfermedad, reducción de los síntomas asociados con la enfermedad, y/o una reducción en la progresión del proceso de la enfermedad.
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El ejemplo 8 proporciona una descripción detallada de un ensayo in vitro utilizado para evaluar la eficacia de los glucósidos cardiacos para el tratamiento de lesiones neuronales isquémicas causadas por un accidente cerebrovascular. El ensayo es un ensayo basado en un cerebro seccionado para privación de oxígeno y glucosa (OGD) utilizado para indicar una pérdida del ≥ 50 % de neuronas corticales sanas en 24 horas. El Neriifolin con
5 glucósido cardiaco (3 µM) se utilizó como un control positivo. Se probó la oleandrina en secciones de cerebro tratadas con OGD (modelo de accidente cerebrovascular, FIGS. 1A-1C) y secciones de cerebro no tratadas con OGD (modelo sin accidente cerebrovascular, FIGS. 2A-2C). Los datos indican que la oleandrina proporciona una neuroprotección sustancial cuando las secciones de cerebro (neuronas) se exponen a soluciones de oleandrina con una concentración que varía de 0,1 a 3 µM. Aunque no se han realizado mediciones directas en el cerebro humano tras una dosis sistémica de oleandrina, puede asumirse a partir de los datos obtenidos en un estudio de fase I de extracto de adelfa y a partir de los datos obtenidos previamente en estudios con roedores en los cuales la capacidad de la oleandrina para cruzar específicamente la barrera hematoencefálica fue examinada, que un nivel de dosis para llegar a esta concentración de oleandrina en el cerebro humano sería probablemente de aproximadamente 1-10 ng, aproximadamente 1-6 ng, o aproximadamente 4 ng.
15 La evidencia de la existencia de uno o más componentes farmacológicamente activos, distintos a la oleandrina, en el extracto SCF fue obtenida comparando las curvas de concentración-respuesta para una solución que contenía oleandrina pura versus una que contenía el extracto SCF. La FIG. 1D muestra los resultados de un ensayo concentración-respuesta para una solución acuosa que contiene oleandrina pura en un ensayo de “accidente cerebrovascular” basado en cerebro seccionado con neuroprotección como se describe en el ejemplo 11. La concentración de oleandrina en la solución acuosa se varió de 0,0069 a 230 µg/ml. La FIG. 1E muestra los resultados de un ensayo concentración-respuesta para un extracto de especies Nerium SCF que contenía oleandrina en un ensayo de “accidente cerebrovascular” basado en cerebro seccionado con neuroprotección como se describe en la presente memoria (ejemplo 11). Los datos demuestran que el extracto es más eficaz que la oleandrina pura, lo que significa que el extracto contiene uno o más agentes farmacológicamente activos que
25 proporcionan neuroprotección.
El ejemplo 11 proporciona una descripción detallada de un ensayo in vitro utilizado para evaluar la eficacia del extracto, o la composición del mismo, para el tratamiento de lesiones neuronales isquémicas provocadas por accidente cerebrovascular. El ensayo es un ensayo basado en cerebro seccionado para privación de oxígeno y glucosa (OGD) utilizado para inducir una pérdida del ≥50 % de neuronas corticales sanas en 24 horas. El extracto SCF principal no fraccionado de las especies Nerium, es decir Nerium Oleander, se utilizó como un control positivo.
Por consiguiente, la invención protege las neuronas contra la pérdida de actividad causada por una reducción de oxígeno o una reducción de oxígeno y glucosa, exponiendo las neuronas con privación de oxígeno o privación de oxígeno y glucosa a una cantidad efectiva de extracto que contiene oleandrina para minimizar la pérdida de actividad, y/o proteger la función de las neuronas causada al exponer las condiciones de privación de oxígeno y/o
35 privación de oxígeno y glucosa.
El ejemplo 9 proporciona una descripción detallada de un ensayo in vitro utilizado para evaluar la eficacia de los glucósidos cardiacos para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. El ensayo es un ensayo basado en cerebro seccionado para degeneración de las neuronas piramidales corticales inducida por APP/Aβ (APP: proteína precursora de amiloide). Tras la división mediante una enzima secretasa, la APP se reduce a péptidos Aβ que se cree son un factor causante de la formación de placa beta-amiloide. Las proteínas Aβ se asocian con la formación de placa beta-amiloide y se creen ser un distintivo si no hay un factor etiológico en la enfermedad de Alzheimer. La transfección biolística se utiliza para introducir marcadores vitales como YFP (una proteína marcadora amarillo fluorescente) y para introducir construcciones de genes de la enfermedad en las mismas poblaciones neuronales en las secciones del cerebro. La YFP se co-transfecta con isoformas APP llevando a la degeneración progresiva de las 45 neuronas piramidales corticales durante el curso de tres a cuatro días tras la preparación y transfección de la sección del cerebro. Los datos (FIGS. 3A-3C) indican que la oleandrina y un extracto SCF que contenga oleandrina proporcionó una neuroprotección dependiente de la concentración a secciones de cerebro transfectadas con APP rescatando así los niveles casi a los mismos niveles proporcionados por los medicamentos inhibidores BACE, es decir, medicamentos inhibidores beta secretasa. La enzima beta secretasa divide la proteína precursora de APP en proteínas Aβ tóxicas. El extracto SCF con oleandrina pareció proporcionar una mayor neuroprotección que la oleandrina sola. Los datos en las FIGS. 3A-3C son de significancia porque algunos compuestos o estrategias terapéuticas en la bibliografía han mostrado alguna protección significativa de las neuronas en este ensayo in vitro representativo de la enfermedad de Alzheimer. Los datos indican que los glucósidos cardiacos como la oleandrina serán efectivos como agentes individuales, o cuando estén presentes en extractos usados como terapia única o
55 combinados con otros productos como los inhibidores BASE para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
Por tanto, la invención protege las neuronas contra la pérdida de actividad causada por la enfermedad de Alzheimer, el procedimiento comprendiendo: exponer las neuronas que exhiban características de la enfermedad de Alzheimer a una cantidad efectiva de oleandrina o extracto que contenga oleandrina para minimizar la pérdida de actividad, reducir la velocidad de pérdida de actividad, detener la pérdida de actividad, ralentizar el inicio de pérdida de actividad, y/o el funcionamiento crítico de las neuronas causado por la enfermedad de Alzheimer.
El ejemplo 10 proporciona una descripción detallada de un ensayo utilizado para evaluar la eficacia de los
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glucósidos cardiacos para el tratamiento de la enfermedad de Huntington. La proteína htt mutante se introduce mediante electroporación en co-cultivos combinadas, de alta densidad de neuronas corticales, neuronas estriatales y glia. Las neuronas estriatales y corticales se transfectaron con proteínas fluorescentes de diferente color facilitando así la identificación por separado de los diferentes tipos de neuronas en el co-cultivo. Las proteínas de color fluorescente son fluorescentes y “emiten” color tras la activación con una fuente de luz de longitud de onda apropiada. Los datos (FIGS. 4A-4D) indican que la oleandrina y el extracto SFC con oleandrina son más efectivos que el KW6002 (un antagonista receptor 2a de adenosina) en términos de proporcionar un mayor número de neuronas supervivientes. Por tanto, la invención proporciona un procedimiento para proteger las neuronas contra la pérdida de actividad causada por la enfermedad de Huntington, el procedimiento comprendiendo: exponer a las neuronas que exhiben características de la enfermedad de Huntington a una cantidad efectiva de oleandrina o extracto que contenga oleandrina para minimizar la pérdida de actividad, reducir la velocidad de la pérdida de actividad, detener la pérdida de actividad, ralentizar el inicio de la perdida de actividad, y/o la función normal de las neuronas causada por la enfermedad de Huntington.
El ejemplo 13 detalla un ensayo con cerebro seccionado ejemplar usado como un modelo para evaluar la eficacia del glucósido cardiaco en el tratamiento de un accidente cerebrovascular en un sujeto tras la finalización del periodo de retraso tras el accidente cerebrovascular. El ensayo con cerebro seccionado con privación de oxígeno y glucosa fue realizado como se describe en la presente memoria; sin embargo, en vez de tratar las secciones del cerebro profilácticamente con glucósido cardiaco, fueron tratadas con el glucósido cardiaco tras periodos de retraso de 0, 1, 2, 4 y 6 horas. Los datos resumidos en la FIG. 5, demuestran que el glucósido cardiaco, como la oleandrina o un extracto SCF con oleandrina, es efectivo para proporcionar una neuroprotección significativa para periodos de retraso de hasta 1, hasta 2, hasta 3, hasta 4, hasta 5, hasta aproximadamente 6 horas tras el accidente cerebrovascular.
Por tanto, la invención proporciona un tratamiento retrasado en el tiempo para un accidente cerebrovascular en un sujeto mediante la administración de una dosis de glucósido cardiaco a un sujeto tras haber sufrido el sujeto el accidente cerebrovascular. Dentro de un periodo de retraso aceptable tras haber sufrido el sujeto el accidente cerebrovascular, se administra una dosis inicial de glucósido cardiaco según un régimen de dosificación inicial. Luego, se determina la idoneidad de la respuesta clínica del sujeto y/o la respuesta terapéutica del sujeto al tratamiento con glucósido cardiaco. Si la respuesta clínica y/o respuesta terapéutica del sujeto es adecuada, se continua el tratamiento con glucósido cardiaco según sea necesario hasta obtener el resultado clínico deseado. Alternativamente, si la respuesta clínica y/o la respuesta terapéutica del sujeto son inadecuadas a la dosis inicial y el régimen de dosificación inicial, la dosis se aumenta o disminuye hasta que se consiga la respuesta clínica y/o la respuesta terapéutica deseada del sujeto. El aumento o disminución de la dosis puede realizarse junto con un cambio en el régimen de dosificación, como un cambio en la frecuencia de dosificación o en el periodo total de administración de la dosis.
Algunos de los ensayos en secciones del cerebro del presente se realizan bajo condiciones en donde el tejido del cerebro se trata con glucósido cardiaco antes del OGD. Bajo esas condiciones, los datos establecen la utilidad de los glucósidos cardiacos usados profilácticamente para proporcionar neuroprotección contra el daño causado por un accidente cerebrovascular.
Si un facultativo tiene la intención de tratar a un sujeto con una afección neurológica con una combinación de un glucósido cardiaco y uno o más agentes terapéuticos, y se conoce que la afección neurológica particular, que el sujeto padece, es al menos parcialmente receptiva terapéuticamente al tratamiento con el agente o agentes terapéuticos mencionados, entonces la invención del presente procedimiento comprende: administrar al sujeto en necesidad del tratamiento una dosis terapéuticamente relevante de glucósido cardiaco y una dosis terapéuticamente relevante del agente o agentes terapéuticos mencionados, en donde el glucósido cardiaco se administra según un primer régimen de dosificación y el agente o agentes terapéuticos mencionados se administran según un segundo régimen de dosificación. En algunas realizaciones, los regímenes de dosificación primero y segundo son iguales. En algunas realizaciones, los regímenes de dosificación primero y segundo son diferentes.
Si la afección neurológica a tratar es la enfermedad de Alzheimer, el agente o agentes terapéuticos pueden seleccionarse del grupo consistente en inhibidores BACE o inhibidores de acetilcolinesterasa. En algunas realizaciones, el agente o agentes terapéuticos pueden seleccionarse del grupo consistente en NamendaTM (HCI memantine), AriceptTM (donepezilo), RazadyneTM (galantamina), ExelonTM (rivastigmina), y CognexTM (tacrina).
Si la afección neurológica que va a ser tratada es la enfermedad de Huntington, el agente o agentes terapéuticos pueden seleccionarse del grupo consistente en productos naturales, anticonvulsivos, antagonistas en el receptor NMDA (N-metil-D-aspartato) y bloqueadores del canal de sodio. Los agentes ejemplares incluyen Vitamina E, baclofeno (un derivado de CoQ10), lamotrigina (un anticonvulsivo), remacemida (un anestésico que es un antagonista de NMDA de baja afinidad), y riluzol (un bloqueador del canal de Na). La eficacia de cada uno de estos agentes se considera baja (Mestre T. et al, Chochrane Database Systematic Reviews 8 de julio 2009; 8(3): CD006455) por si solos; sin embargo, se espera que la administración de una forma de dosificación conteniendo oleandrina o extracto que contenga oleandrina a sujetos que reciban uno o más de estos agentes, proporcionará al sujeto que sufra la afección neurológica, un efecto clínico mejorado en comparación con la administración de estos agentes sin oleandrina.
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Si la afección neurológica que está siendo tratada es un daño cerebral isquémico debido a un accidente cerebrovascular (accidente cerebrovascular isquémico), entonces los tratamientos descritos en la bibliografía (Gutierrez M. et al. “Cerebral protection, brain repair, plasticity and cell therapy in ischemic stroke” Cerebrovasc. Dis. 2009; 27 Suppl 1:177-186), por ejemplo, trombólisis intravenosa, pueden emplearse además de la oleandrina o procedimiento de extracción de oleandrina de la invención. En algunas realizaciones, el agente o agentes terapéuticos adicionales pueden seleccionarse del grupo consistente en medicamentos como Alteplasa (un agente trombolítico).
El agente o agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse en dosis y según los regímenes de dosificación que sean reconocidos clínicamente como terapéuticamente efectivos o en dosis que sean reconocidos clínicamente como sub-terapéuticamente efectivos. El beneficio clínico y/o el efecto de los agentes terapéuticos proporcionados por la administración de una combinación de glucósido cardiaco y una o más terapias adicionales puede ser aditivo
o sinérgico, dicho nivel de beneficio o efecto siendo determinado mediante la comparación de la administración de la combinación a administración del glucósido cardiaco individual y uno o más agentes terapéuticos. El agente o agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse en dosis y según los regímenes de dosificación sugeridos o descritos por la Administración de Alimentos y Medicamentos, la Organización Mundial de la Salud, la Agencia Europea del Medicamento (E.M.E.A.), la Administración de Productos Terapéuticos (TGA, Australia), la Organización de Salud Pan-Americana (PAHO), la Autoridad de Seguridad de Medicinas y Dispositivos Médicos (Medsafe, Nueva Zelanda) o los diferentes Ministerios de Salud de todo el mundo.
El glucósido cardiaco posee actividad de vinculación Na,K-ATPasa y/o actividad de vinculación HIF-1α (factor alfa inducible por hipoxia). El glucósido cardiaco es capaz de cruzar la barrera hematoencefálica y ser retenido en el tejido cerebral durante un periodo de tiempo extendido tras la administración. En este aspecto, el glucósido cardiaco debería retenerse en el cerebro durante al menos 8 horas tras la administración del glucósido cardiaco debido a la vinculación de tejido y a la baja tasa de eliminación.
El glucósido cardiaco puede estar presente en forma pura o como una mezcla con uno o más compuestos. El glucósido cardiaco de la invención está presente como un extracto. El extracto se prepara mediante extracción de fluidos supercríticos (SCF) con dióxido de carbono (CO2) o un formato modificado químicamente de dicho extracto (por ejemplo, un extracto que incluye etanol o se fabricó usando SCF CO2 y etanol; Ejemplo 1). El extracto se obtiene a partir de material vegetal. El material vegetal puede ser masa vegetal como la obtenida a partir de las especies Nerium, como las hojas de Nerium oleander, o de las especies Thevetia, como la Thevetia neriifolia o la Thevetia puruviana (también conocidas como adelfa amarilla). El proceso de extracción puede ser realizado sobre un polvo seco de hojas de Nerium oleander preparado según un proceso descrito en una solicitud provisional EE.UU. pendiente actualmente Nº de serie 60/653.210 presentada el 15 de febrero del 2015 en nombre de Addington (publicada como US 2006-0188536, reivindicando la prioridad de 60/653.210) o la solicitud EE.UU. con Nº de serie 11/340.016 presentada el 26 de enero, 2006 en nombre de Addington, la solicitud EE.UU. Nº de serie 11/191.650 presentada el 28 de julio del 2006 (ahora Patente EE.UU. Nº 7.402.325 emitida el 22 de julio del 2008) en nombre de Addington, o la Solicitud de patente internacional PCT Nº PCT/US06/29061 presentada el 26 de julio del 2016.
Como se usa en la presente memoria, el término “oleandrina” se toma para significar todas las formas conocidas de oleandrina a menos que se especifique lo contrario. El material vegetal de la Nerium oleander puede obtenerse, por ejemplo, en proveedores de plantas comerciales como Aldridge Nursery, Atascosa, Texas.
Nuestro trabajo ha mostrado que la oleandrina tiene una buena capacidad para cruzar la BBB (barrera hematoencefálica) y una vez en los tejidos cerebrales, de residir allí durante un periodo de tiempo prolongado. Es decir, el tiempo de residencia de la oleandrina en el cerebro es más largo de lo esperado dada la eliminación de esta molécula del plasma de animales experimentales. Como tal, el tiempo de residencia relativamente largo de la oleandrina en el cerebro proporciona una ventaja distintiva de este glucósido cardiaco soluble en lípidos en comparación con los glucósidos cardiacos solubles en agua como la digoxina.
El extracto de la presente invención se obtiene mediante extracción de fluidos supercríticos modificados (por ejemplo, etanol) o no modificados de una masa vegetal que contenga glucósido cardiaco. El extracto de fluidos supercríticos puede comprender al menos otro agente farmacológicamente activo glucósido cardiaco y/o al menos otro agente farmacológicamente activo no glucósido cardiaco que contribuya a la eficacia terapéutica del glucósido cardiaco cuando el extracto se le administre a un sujeto. Puede contribuir aditivamente o sinérgicamente a la eficacia terapéutica del glucósido cardiaco. Como se usa en la presente memoria, el término “agente farmacológicamente activo no glucósido cardiaco” (o componente) significa un compuesto que no es un glucósido cardiaco.
El extracto puede prepararse mediante varios diferentes procesos. El extracto puede prepararse según el proceso desarrollado por el Dr. Huseyin Ziya Ozel (Patente EE.UU. Nº 5.135.745) que describe un procedimiento para la preparación del extracto de la planta en agua. El extracto acuoso según se reporta contiene varios polisacáridos con pesos moleculares que varían desde los 2KD a los 30KD, oleandrina y oleandrigenina, odorosida y neritalosida. Los polisacáridos que se describen incluyen homopoligalacturonanos o arabinogalacturonanos ácidos. La Patente EE.UU. Nº 5.869.060 a Selvaraj et al. describe extractos en agua caliente de las especies Nerium y los procedimientos de producción de los mismos, por ejemplo, el ejemplo 2. El extracto resultante puede ser liofilizado
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para producir un polvo. La Patente EE.UU. Nº 6.565.897 (Publicación pre-concesión EE.UU. Nº 20020114852 y la Publicación Internacional de PCT Nº WO 2000/016793 a Selvaraj et al.) describe un proceso de extracción con agua caliente para la preparación de un extracto sustancialmente estéril. Erdemoglu et al. (J. Ethnopharmacol. (2003) Nov. 89(1), 123-129) describe los resultados de la comparación de extractos acuosos y etanólicos de plantas, incluyendo Nerium oleander, en base a sus actividades anti-nociceptivas y antiinflamatorias. Los extractos con disolventes orgánicos de Nerium oleander son descritos por Adome et al. (Afr. Health Sci. (2003) Ago. 3(2), 77-86; extracto etanólico), el-Shazly et al. (J. Egypt Soc. Parasitol. (1996), Ago. 26(2), 461-473; extracto etanólico), Begum et al. (Phytochemistry (1999) Feb. 50(3), 435-438; extracto metanólico), Zia et al. (J. Ethnopharmacol. (1995) Nov. 49(1), 33-39; extracto metanólico), y Vlasenko et al. (Farmatsiia. (1972) Sep-Oct. 21(5), 46-47; extracto alcohólico). La Publicación de solicitud de patente pre-concedida EE.UU. Nº 20040247660 a Singh et al. describe la preparación de una formulación liposomal estabilizada mediante proteína de oleandrina para su uso en el tratamiento del cáncer. La Publicación de solicitud de patente pre-concedida a Singh et al. describe la preparación de formulaciones de nanopartículas estabilizadas mediante proteínas de oleandrina a partir de extracto en agua caliente.
La extracción SCF utilizada para obtener el extracto que contiene oleandrina de la invención puede realizarse en la presencia de un modificador en el fluido supercrítico, como etanol, para mejorar la extracción del compuesto(s) deseado(s) de una masa vegetal. Los modificadores generalmente poseen volatilidad entre la del fluido supercrítico y del compuesto que está siendo extraído, y deben ser miscibles con el fluido supercrítico. En algunas realizaciones, el modificador es un líquido en condiciones ambientales. A título de ejemplo, y sin limitación, un modificador puede seleccionarse del grupo consistente en etanol, metanol, propanol, acetona, acetato etílico, cloruro de metileno, etc.
El extracto es una mezcla de compuestos farmacológicamente activos, como la oleandrina u otros glucósidos cardiacos, oleasida, y otros materiales vegetales. El extracto de oleandrina a partir de un proceso de fluido supercrítico contiene en peso un rango teórico de 0,9 % a 2,5 % de oleandrina. Han sido obtenidos los extractos SCF que comprenden diferentes cantidades de oleandrina. En una realización el extracto SCF comprende aproximadamente el 2 % en peso de oleandrina.
El extracto SCF puede comprender una mezcla de varios componentes. Algunos de esos componentes incluyen oleandrina, oleasida A, oleandrigenina, neritalosida, odorosida (Wang X, Plomley JB, Newman RA y Cisneros A. LC/MS/MS analiza un extracto de oleandrina para el tratamiento del cáncer, Analytical Chem. 72: 3547-3552, 2000), y otros componentes no identificados. Los componentes no identificados extraíbles mediante SCF del extracto SCF pueden incluir al menos otro componente farmacológicamente activo glucósido cardiaco que contribuye a la eficacia de la oleandrina en el extracto SCF. Es decir, al menos otro componente extraíble por SCF funciona aditivamente o sinérgicamente con la oleandrina para proporcionar la eficacia observada.
Se ha determinado que el extracto que comprende oleandrina u oleandrina y uno o más componentes farmacéuticamente activos adicionales (glucósido cardiaco y/o no glucósido cardiaco) pueden proporcionar neuroprotección. Por tanto, el extracto SCF de la invención comprende (o consta esencialmente de) oleandrina y uno o más componentes biológicamente activos adicionales, que ellos mismos pueden ser un glucósido cardiaco o un no glucósido cardiaco, que proporciona neuroprotección.
Se obtuvo evidencia adicional de la existencia de uno o más componentes biológicamente activos, distintos a la oleandrina, en el extracto SCF comparando las curvas de concentración-respuesta para una solución acuosa que contenía oleandrina pura versus una que contenía extracto SCF. La FIG. 1D representa los resultados de un ensayo de concentración-respuesta para una solución acuosa conteniendo oleandrina pura en un ensayo de “accidente cerebrovascular” basado en secciones de cerebro con neuroprotección como se describe en el ejemplo 11. La concentración de oleandrina en la solución acuosa se varió de 0,0069 a 230 µg/ml.
La FIG. 1E representa los resultados de un ensayo de concentración-respuesta para un extracto SCF que contiene oleandrina en un ensayo de “accidente cerebrovascular” basado en secciones de cerebro con neuroprotección como se describe en la presente memoria. Los datos demuestran que el extracto es más eficaz que la oleandrina pura, lo que significa que el extracto contiene uno o más agentes farmacológicamente activos que proporcionan neuroprotección.
Es posible que los extractos también difieran en su rendimiento relativo como se determina por la eficacia de los ensayos incluidos en la presente memoria. Incluso así, si un glucósido cardiaco se presenta en una cantidad o concentración lo suficientemente alta en el extracto para poder preparar una dosis terapéuticamente relevante, entonces el extracto se considera parte de la invención.
El glucósido cardiaco puede formularse en cualquier formato de dosificación farmacéuticamente adecuado. Los formatos de dosificación parenteral, ótico, oftálmico, nasal, inhalable, bucal, sublingual, enteral, tópico, oral, peroral e inyectable son particularmente útiles.
Los formatos de dosificación particulares incluyen formatos de dosificación sólidos o líquidos. Los formatos de dosificación adecuados ejemplares incluyen tableta, cápsula, píldora, comprimido, pastilla, sobre, solución, suspensión, dispersión, vial, bolsa, botella, líquido inyectable, líquido administrable i.v. (intravenoso), i.m. (intramuscular) o i.p. (intraperitoneal) y otros formatos de dosificación conocidos para el experto en las técnicas de
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las ciencias farmacéuticas.
La cantidad de glucósido cardiaco incorporada en una dosis de la invención será al menos uno o más formatos de dosificación y pueden seleccionarse según los principios conocidos de la Farmacia. Una cantidad efectiva o cantidad terapéuticamente relevante de compuesto terapéutico se contempla específicamente. Por el término “cantidad efectiva”, se comprende que, con respecto a, por ejemplo, fármacos, se contempla una cantidad farmacéuticamente efectiva. Una cantidad farmacéuticamente efectiva es la cantidad de ingrediente activo que es suficiente para la respuesta terapéutica requerida o deseada, o, en otras palabras, la cantidad que es suficiente para obtener una respuesta biológica apreciable cuando se le administra a un paciente. La respuesta biológica apreciable puede producirse como resultado de la administración de dosis únicas o múltiples de una sustancia activa. Una dosis puede comprender uno o más formatos de dosificación. Se comprenderá que el nivel de dosis específico para cualquier paciente dependerá de una variedad de factores incluyendo la indicación que está siendo tratada, la gravedad de la indicación, la salud, edad, género, peso, dieta del paciente, la respuesta farmacológica del mismo, el formato de dosificación empleado y otros tales factores.
La dosis deseada para la administración oral es de hasta 5 formatos de dosificación, aunque pueden administrarse tan solo uno y tantos como diez formatos de dosificación. Los formatos de dosificación ejemplares contienen 0,6 mg del extracto SCF por formato de dosificación, para un total de 0,6 a 60 mg (1 a 10 niveles de dosis) por dosis.
El glucósido cardiaco puede estar presente en un formato de dosificación en una cantidad suficiente para proporcionar a un sujeto una dosis inicial de oleandrina de 12 a 1200 ug, o más o menos. Un formato de dosificación puede comprender de 0,01 a 100 mg de oleandrina, extracto de oleandrina o extracto de Nerium oleander que contenga oleandrina.
Para su uso en el tratamiento de mamíferos, el glucósido cardiaco puede incluirse en un formato de dosificación. Algunas realizaciones del formato de dosificación no tienen recubrimiento entérico y liberan su carga de glucósido cardiaco en un periodo de 0,5 a 1 hora o menos. Algunas realizaciones del formato de dosificación tienen recubrimiento entérico y liberan su carga de glucósido cardiaco de forma descendente del estómago, como desde el yeyuno, íleon, intestino delgado, y/o intestino grueso (colon). Los formatos recubiertos entéricamente liberarán glucósidos cardiacos en la circulación sistémica en un plazo de 1 a 10 horas tras la administración por vía oral.
En base a datos preliminares de dosificación en animales, se anticipa que entre el 50 y el 75 % de una dosis administrada de extractor de adelfa estará oralmente biodisponible proporcionando por tanto de 0,25 a 0,4 mg, 0,1 a 50 mg, 0,1 a 40 mg, 0,2a 40 mg, 0,2 a 30 mg, 0,2 a 20 mg, 0,2 a 10 mg, 0,2 a 5 mg, 0,2 a 2,5 mg, 0,2 a 2 mg, 0,2 a 1,5 mg, 0,2 a 1 mg, 0,2 a 0,8 mg, 0,2 a 0,7 mg, o 0,25 a 0,5 mg de oleandrina por formato de dosificación. Dado un volumen medio de sangre en los adultos humanos de 5 litros, la concentración anticipada en plasma de oleandrina estará en el rango de 0,05 a 2 ng/ml, 0,005 a 10 ng/ml, 0,005 a 8 ng/ml, 0,01 a 7 ng/ml, 0,02 a 7 ng/ml, 0,03 a 6 ng/ml, 0,04 a 5 ng/ml, o 0,05 a 2,5 ng/ml. La dosis recomendada de oleandrina, presente en el extracto SCF, es generalmente de 0,25 a 50 mg dos veces al día, o 0,9 a 5 mg dos veces al día o cada 12 horas. La dosis puede ser de 0,5 a 100 mg/día, 1 a 80 mg/día, 1,5 a 60 mg/día, 1,8 a 60 mg/día, 1,8 a 40 mg/día. La dosis máxima tolerada puede ser de 100 mg/día, 80 mg/día, 60 mg/día, 40 mg/día, 38,4 mg/día, 30 mg/día de extracto de adelfa que contenga oleandrina y la dosis mínima efectiva puede ser de 0,5 mg/día, 1 mg/día, 1,5 mg/día, 1,8 mg/día, 2 mg/día
o 5 mg/día.
Debería tenerse en cuenta que un compuesto del presente puede poseer una o más funciones en la formulación de la invención. Por ejemplo, un compuesto puede servir como tensioactivo y un disolvente miscible en agua o ambos un tensioactivo y un disolvente inmiscible en agua.
Una composición líquida puede comprender uno o más portadores líquidos farmacéuticamente aceptables. El portador líquido puede ser acuoso, no acuoso, polar, no polar y/u orgánico. Los portadores líquidos incluyen, como ejemplo y sin limitación, un disolvente miscible en agua, un disolvente no miscible en agua, solución reguladora y mezclas de los mismos.
Como se utiliza en la presente memoria, los términos “disolvente soluble en agua” o “disolvente miscible con agua”, términos que se utilizan indistintamente, se refieren a un líquido orgánico que no forma una mezcla bifásica con agua o es suficientemente soluble en agua para proporcionar una mezcla de disolvente acuoso que contenga al menos el cinco por ciento de disolvente sin separación de las fases líquidas. El disolvente es adecuado para su administración a personas o animales. Ejemplos de disolventes solubles en agua incluyen, pero sin limitación, PEG (polietilenglicol), PEG 400 (polietilenglicol con un peso molecular de aproximadamente 400), etanol, acetona, alcanol, alcohol, éter, propilenglicol, glicerina, triacetina, polipropilenglicol, PVP (poli(pirrolidona de vinilo), dimetilsufóxido, N,N-dimetilformamida, formamida, N,N-dimetilacetamida, piridina, propanol, N-metilacetamida, butanol, soluphor (2-pirrolidona), pharmasolve (N-metil-2-pirrolidona).
Como se utiliza en la presente memoria, los términos “disolvente insoluble en agua” o “disolvente inmiscible con agua), términos que se utilizan indistintamente, se refieren a un líquido orgánico que forma una mezcla bifásica con agua o proporciona una separación de fase cuando la concentración del disolvente en el agua supera el cinco por ciento. El disolvente es adecuado para la administración a humanos o animales. Ejemplos de disolventes insolubles en agua incluyen, como ejemplo y sin limitación, triglicéridos de cadena media/larga, aceite, aceite de ricino, aceite de maíz, vitamina E, derivados de la vitamina E, ácido oleico, ácido graso, aceite de oliva, softisan 645 (caprilato de diglicéridos/caprato/estearato/adipato estearato de hidróxido), migliol, captex (Captex 350: tricaprilato de glicérido/caprato/triglicérido de laurato; Captex 355: tricapilato de glicérido/triglicérido de caprato; Captex 355 EP/NF:
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5 tricaprilato de glicérido/triglicérido de cadena media de caprato).
Los disolventes adecuados se listan en la “Conferencia Internacional sobre armonización de requisitos técnicos para el registro de productos farmacéuticos para uso humano (o ICH, por sus siglas en inglés), directrices para el sector Q3C Impurezas: disolventes residuales” (1997), que realiza recomendaciones sobre qué cantidades de disolventes residuales se consideran seguros en fármacos. Los disolventes ejemplares se listan como disolventes de clase 2 o
10 clase 3. Los disolventes de Clase 3 incluyen, por ejemplo, ácido acético, acetona, anisol, 1-butanol, 2-butanol, acetato de butilo, éter metil tert-butílico, cumeno, etanol, éter etílico, acetato etílico, formiato etílico, ácido fórmico, heptano, acetato de isobutilo, acetato de isopropilo, acetato de metilo, metilo-1-butanol, cetona de metoxietilo, cetona de metilisobutilo, 2-metilo-1-propanol, pentano, 1-pentanol, 1-propanol, 2 propanol, o acetato de propilo.
Otros materiales que pueden usarse como disolventes inmiscibles con agua en la invención incluyen: Captex 100:
15 dicaprato de propilenglicol; Captex 200: dicaprilato de propilenglicol/dicaprato; Captex 200 P: dicaprilato de propilenglicol/dicaprato; Dicaprilocaprato de propilenglicol; Captex 300: tricaprilato de glicerilo/caprato; Captex 300 EP/NF: tricaprilato de glicerilo/triglicéridos de cadena media de caprato; Captex 350: tricaprilato de glicerilo/caprato/laureato; Captex 355: tricaprilato de glicerilo/caprato; Captex 355 EP/NF: tricaprilato de glicerilo/triglicéridos de cadena media de caprato; Captex 500: triacetina; Captex 500 P: triacetina (grado
20 farmacéutico); Captex 800. Glicol de propileno Di (2-etitexanoato); Captex 810 D: tricaprilato de glicerilo/caprato/linoleato; Captex 1000: tricaprato de glicerilo; Captex CA: triglicéridos de cadena media; Captex MCT-170: triglicéridos de cadena media; Capmul GMO: monooleato de glicerilo; Capmul GMO-50 EP/NF: monooleato de glicerio; Capmul MCM: mono-y diglicéridos de cadena media; Capmul MCM C8: monocaprilato de glicerio; Capmul MCM C10: monocaprato de glicerio; Capmul PG-8: monocaprilato de glicol de propileno; Capmul
25 PG-12: monolaurato de glicol de propileno; Caprol 10G10O: decaoleato de decaglicerol; Caprol 3GO: monooleato de triglicerol; Caprol ET: éster de poliglicerol de ácidos grasos combinados; Caprol MPGO: dioleato de hexaglicerol; Caprol PGE 860: mono-, dioleato de decaglicerol.
Como se utiliza en la presente memoria, un “tensioactivo” se refiere a un compuesto que comprende fracciones hidrofílicas polares o cargadas además de fracciones hidrofóbicas (lipofílicas) no polares; es decir, un tensioactivo es
30 anfifílico. El término tensioactivo puede referirse a uno o a una mezcla de compuestos. Un tensioactivo puede ser un agente solubilizante, un agente emulsionante o un agente dispersante. Un tensioactivo puede ser hidrofílico o hidrofóbico.
El tensioactivo hidrofílico puede ser cualquier tensioactivo hidrofílico adecuado para su uso en compuestos farmacéuticos. Dichos tensioactivos pueden ser aniónicos, catiónicos, zwiteriónicos, o no iónicos, aunque los
35 tensioactivos hidrofílicos no iónicos se prefieren actualmente. Como se ha explicado anteriormente, estos tensioactivos hidrofílicos no iónicos generalmente tendrán valores HLB mayores de aproximadamente 10. Las mezclas de tensioactivos hidrofílicos también están dentro del alcance de la invención.
De forma similar, el tensioactivo hidrofóbico puede ser cualquier tensioactivo hidrofóbico para su uso en compuestos farmacéuticos. En general, los tensioactivos hidrofóbicos adecuados tendrán un valor HLB menor de
40 aproximadamente 10. Las mezclas de tensioactivos hidrofóbicos también están dentro del alcance de la invención.
Ejemplos de solubilizadores adecuados adicionales incluyen: alcoholes y polioles, como etanol, isopropanol, butanol, alcohol bencílico, glicol de etileno, glicol de propileno, butanodioles e isómeros de los mismos, pentaeritritol, sorbitol, manitol, transcutol, isosorbida de dimetil, glicol de polietileno, glicol de polipropileno, alcohol polivinílico, metilcelulosa de hidroxipropilo y otros derivados de la celulosa, ciclodextrinas y derivados de la ciclodextrina; éteres de glicoles de 45 polietileno con un peso molecular medio de aproximadamente 200 a aproximadamente 6000, como alcohol tetrahidro furfurílico éter PEG (glicofurol, disponible comercialmente de BASF bajo el nombre comercial Tetraglycol)
o PEG de metóxilo (Union Carbide); amidas, como 2-pirrolidona, 2-piperidona, caprolactama, N-pirrolidona de alquilo, N-hidroxipirrolidona de alquilo, N-piperidona de alquilo, N-caprolactama de alquilo, dimetilacetamida y polivinipirrolidona; ésteres, como propionato etílico, tributilcitrato, trietilcitrato acetílico, citrato de tributilo acetílico, 50 trietilcitrato, oleato etílico, caprilato etílico, butirato etílico, triacetina, monoacetato de glicol de propileno, diacetato de glicol de propileno, caprolactona e isómeros de la misma, valerolactona e isómeros de la misma, butirolactona e isómeros de la misma; y otros solubilizadores conocidos en la técnica como acetamida de dimetil, isorsobida de dimetil (Arlasolve DMI (ICI), pirrolidonas N-metil (Pharmasolve (ISP)), monooctanoina, éter nonoetílico de glicol de dietileno (disponible de Gattefosse bajo el nombre comercial Transcutol), y agua. Las mezclas de solubilizadores
55 también están dentro del alcance de la invención.
A menos que se indique, los compuestos mencionados en la presente memoria están disponibles fácilmente en proveedores comerciales estándares.
La composición de líquido transparente es visualmente transparente a simple observación, ya que contendrá menos del 5 %, menos del 3 % o menos del 1 % en peso de sólidos suspendidos en base al peso total de la composición.
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Aunque no es necesario, una composición o kit de la presente invención puede incluir un agente quelante, conservante, antioxidante, absorbentes, agente acidificante, agente alcalinizante, agente antiespumante, agente regulador, colorante, electrolito, sal, estabilizador, modificador de tonicidad, diluyente, otro excipiente farmacéutico o una combinación de los mismos.
5 Como se utiliza en la presente memoria, el término “antioxidante” tiene la intención de significar un agente que inhibe la oxidación y se utiliza por tanto para evitar el deterioro de las preparaciones debido al proceso de oxidación. Dichos compuestos incluyen, como ejemplo y sin limitación, ácido ascórbico, palmitato ascórbico, Vitamina E, derivados de la Vitamina E, butilhidroxianisol, butilhidroxitolueno, ácido hipofosfórico, monotioglicerol, galato propílico, ascorbato de sodio, bisulfito de sodio, sulfoxilato de formaldehido de sodio, metalbisulfito de sodio y otros
10 materiales similares conocidos para los expertos en la técnica.
Como se utiliza en la presente memoria, el término agente quelante tiene la intención de significar un compuesto que realiza quelación en los iones de metal de la solución. Ejemplos de agente quelantes incluyen EDTA (etilenodiaminetetraacetato de tetrasodio), DTPA (dietilenotriamina-pentaacetato de pentasodio), HEDTA (sal de trisodio de N-(hidroxietilo)-etileno-ácido diaminetriacético), NTA (nitrilotriacetato de trisodio), etanoldiglicina de
15 disodio (Na2EDG), dietanolgicina de sodio (DEGNa), ácido cítrico y otros compuestos conocidos para los expertos en la técnica.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “absorbente” tiene la intención de significar un agente capaz de retener otras moléculas en su superficie mediante medios físicos o químicos (quimisorción). Dichos compuestos incluyen, como ejemplo y sin limitación, carbón en polvo y activado y otros materiales conocidos para aquellos
20 expertos en la técnica.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “agente alcalinizante” tiene la intención de significar un compuesto usado para proporcionar un medio alcalino. Dichos compuestos incluyen, como ejemplo y sin limitación, solución de amoniaco, carbonato de amoniaco, dietanolamina, monoetanolamina, hidróxido de potasio, borato de sodio, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, hidróxido de sodio, trietanolamina, y trolamina y otros conocidos
25 para aquellos expertos en la técnica.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “agente acidificante” tiene la intención de significar un compuesto usado para proporcionar un medio ácido. Dichos compuestos incluyen, como ejemplo y sin limitación, ácido acético, aminoácido, ácido cítrico, ácido fumárico, y otros ácidos alfa-hidróxidos, ácido hidroclórico, ácido ascórbico, ácido nítrico y otros conocidos por aquellos expertos en la técnica.
30 Como se utiliza en la presente memoria, el término “agente antiespumante” tiene la intención de significar un compuesto o compuestos que evita o reduce la cantidad de espuma que se forma en la superficie de la composición. Agentes antiespumantes adecuados incluyen como ejemplo, y sin limitación, la dimeticona, SIMETICONA, octoxinol y otros conocidos por aquellos expertos en la técnica.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “agente regulador” tiene la intención de significar un compuesto
35 usado para resistir un cambio en el pH tras la dilución o adición de ácido o alcalino. Dichos compuestos incluyen, como ejemplo y sin limitación, metafosfato de potasio, fosfato de potasio, acetato de sodio monobásico y anhidro y dehidrato de citrato de sodio y otros materiales conocidos para aquellos expertos en la técnica.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “conservante” tiene la intención de significar un compuesto utilizado para evitar el crecimiento de microorganismos. Dichos compuestos incluyen, como ejemplo y sin limitación,
40 cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, ácido benzoico, alcohol bencílico, cloruro de cetilpiridinio, clorobutanol, fenol, alcohol feniletílico, nitrato de fenilmercurio, acetato de fenilmercurio, timerosal, metacresol, miristilgamma, cloruro de picolinium, benzoato de potasio, sorbato de potasio, benzoato de sodio, propionato de sodio, ácido sórbico, timol, y parabenos metílicos, etílicos, propílicos o butílicos y otros conocidos por aquellos expertos en la técnica.
45 Como se utiliza en la presente memoria, el término “colorante” tiene la intención de significar un compuesto utilizado para impartir color a las preparaciones farmacéuticas. Dichos compuestos incluyen, como ejemplo y sin limitación, FD&C Rojo Nº 3, FD&C Rojo nº20, FD&C Amarillo Nº 6, FD&C Azul Nº 2, FD&C Verde Nº 5, FD&C Naranja Nº 5, FD&C Rojo Nº 8, caramelo, óxido de hierro (negro, rojo, amarillo), otros tintes FD&C y agentes colorantes naturales como extracto de piel de uva, polvo de remolacha roja, beta-caroteno, anato, carmín, cúrcuma, paprika, una
50 combinación de los mismos y otros materiales conocidos para aquellos expertos en la técnica.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “estabilizante” tiene la intención de significar un compuesto utilizado para estabilizar un agente activo contra los procesos físicos, químicos o bioquímicos que de otra forma reducirían la actividad terapéutica del agente. Los estabilizantes adecuados incluyen, como ejemplo y sin limitación, albúmina, ácido siálico, creatinina, glicina y otros aminoácidos, niacinamida, acetiltriptofonato de sodio, óxido de
55 cinc, sucrosa, glucosa, lactosa, sorbitol, manitol, glicerol, glicoles de polietileno, caprilato de sodio y sacarina de sodio y otros conocidos para aquellos expertos en la técnica.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “modificador de tonicidad” tiene la intención de significar un compuesto o compuestos que pueden ser utilizados para ajustar la tonicidad de la formulación líquida. Los modificadores de tonificad adecuados incluyen glicerina, lactosa, manitol, dextrosa, cloruro de sodio, sulfato de sodio, sorbitol, trehalosa y otros conocidos para aquellos expertos en la técnica.
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La composición de la invención también puede incluir aceites como aceites fijos, aceite de cacahuete, aceite de
5 sésamo, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz y aceite de oliva; ácidos grasos como ácido oleico, ácido esteárico, y ácido isosteárico; y ésteres de ácidos grasos como oleato etílico, miristato isopropílico, glicéridos de ácidos grasos y glicéridos de ácidos grasos acetilados. La composición puede incluir también alcohol como etanol, isopropanol, alcohol hexadecilo, glicerol y glicol de propileno; cetales de glicerol como 2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4metanol; otros como poli(glicol de etileno) 450; hidrocarburos de petróleo como aceite mineral y petrolatum; agua; un
10 tensioactivo farmacéuticamente adecuado, agente suspensor o agente emulsificante; o mezclas de los mismos.
Debería comprenderse que los compuestos usados en la técnica de la formulación farmacéutica generalmente sirven una variedad de funciones y fines. Así, si un compuesto nombrado en la presente memoria se menciona solo una vez o se utiliza para definir más de un término del presente, su fin o función no debería considerarse como limitados únicamente a ese fin o fines o función o funciones nombrados.
15 Uno o más de los componentes de la formulación pueden estar presentes en su formato de sal de base libre o farmacéuticamente o analíticamente aceptable. Como se utiliza en la presente memoria, “sal farmacéuticamente o analíticamente aceptable” se refiere a un compuesto que ha sido modificado haciéndolo reaccionar con un ácido según sea necesario para formar un par vinculado iónicamente. Ejemplos de sales aceptables incluyen las sales convenciones no tóxicas formadas, por ejemplo, a partir de ácidos inorgánicos u orgánicos no tóxicos. Las sales no
20 tóxicas adecuadas incluyen aquellas derivadas de ácidos inorgánicos como ácido hidroclórico, hidrobrómico, sulfúrico, sulfónico, sulfámico, fosfórico, nitríco y otros conocidos para aquellos expertos en la técnica. Las sales preparadas a partir de ácidos orgánicos como los amino ácidos, ácido acético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, pamóico, maléico, hidrximaléico, fenilacético, glutámico, benzoico, salicílico, sulfanílico, 2-acetoxibenzóico, fumárico, toluenesulfónico, metanesulfónico, disulfónico de étano,
25 oxálico, isetiónico, y otros conocidos por aquellos expertos en la técnica. Las listas de otras sales adecuadas pueden encontrarse en Remington´s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, p. 1418.
La frase “farmacéuticamente aceptable” se emplea en la presente memoria para referirse a estos compuestos, materiales, composiciones y/o formatos de dosificación que están, dentro del ámbito del juicio médico acertado,
30 adecuados para el uso en contacto con tejidos de seres humanos y animales y sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica o cualquier otro problema o complicación, proporcional con una relación de beneficio/riesgo.
Un formato de dosificación puede fabricarse por cualquier medio convencional conocido en el sector farmacéutico. Un formato de dosificación líquida puede prepararse proporcionando al menos un portador de líquido y oleandrina o extracto que contiene oleandrina en un contenedor. Pueden incluirse uno o más excipientes en el formato de
35 dosificación líquida. Un formato de dosificación sólida puede prepararse proporcionando al menos un portador sólido y oleandrina o extracto que contenga oleandrina. Pueden incluirse uno o más excipientes en el formato de dosificación sólida.
Un formato de dosificación puede estar envasado usando equipamiento y materiales de envasado convencionales. Puede incluirse en un paquete, botella, vía, bolsa, jeringa, sobre, envase, envase de blíster, caja, ampolla u otro
40 contenedor.
La invención incluye un procedimiento para mejorar el estado clínico de un número estadísticamente significativo de sujetos pertenecientes a una población de sujetos que padezcan una afección neurológica, el procedimiento comprendiendo: administrar a la población de sujetos un glucósido cardiaco, o composición que contenga glucósido cardiaco; y determinar el estado clínico de los sujetos. En algunas realizaciones, el número estadísticamente
45 significativo es de al menos el 5 %, de al menos el 10 %, de al menos el 20 %, de al menos el 30 %, de al menos el 40 %, de al menos el 50%, de al menos el 60%, de al menos el 70 % de al menos el 80 %, de al menos el 90 % de la población. En algunas realizaciones, la composición comprende oleandrina o un extracto que comprenda oleandrina. El extracto opcionalmente comprende uno o más compuestos farmacológicamente activos adicionales que cooperan con la oleandrina para mejorar el estado clínico de los sujetos.
50 Como se utiliza en la presente memoria, un “derivado” es: a) una sustancia química que está relacionada estructuralmente con una primera sustancia química y es teóricamente derivable de ella; b) un compuesto que está formado a partir de un primer compuesto similar o un compuesto que puede imaginarse que surja a partir de otro primer compuesto; i un átomo del primer compuesto se sustituye con otro átomo o grupo de átomos; c) un compuesto derivado u obtenido a partir de un compuesto principal y conteniendo elementos esenciales del
55 compuesto principal; o d) un compuesto químico que puede producirse a partir de un primer compuesto de estructura similar en una o más etapas.
En vista de la anterior descripción y de los ejemplos siguientes, una persona experta en la técnica podrá poner en práctica la invención como se reivindica, sin demasiada experimentación. Lo anterior se comprenderá mejor con
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referencia a los siguientes ejemplos que detallan ciertos procedimientos para la preparación de las realizaciones de la presente invención. Todas las referencias hechas a estos ejemplos son con fines ilustrativos. Los siguientes ejemplos no deberían considerarse exhaustivos, sino meramente ilustrativos de solo algunas de las muchas realizaciones contempladas por la presente invención.
La oleandrina puede adquirirse de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).
Ejemplo 1
Extracción con fluidos supercríticos de hojas de adelfa en polvo.
Método A con dióxido de carbono
Las hojas de adelfa en polvo se prepararon recolectando, lavando y secando el material de hojas de adelfa, luego pasando el material de hoja de adelfa a través de un aparato de molienda y deshidratación como l descrito en las Patentes EE.UU. números 5.236.132, 5.598.879, 6.517.015 y 6.715.705. La etapa del material inicial utilizado era de 3,94 kg.
El material inicial se combinó con CO2 puro a una presión de 300 bar (30 MPa, 4351 psi) y a una temperatura de 50ºC (122ºF) en un dispositivo extractor. Se utilizó un total de 197 kg de CO2, para dar una proporción disolvente a materia prima de 50:1. La mezcla de CO2 y materia prima luego se pasó a través de un dispositivo separador, que cambió la presión y temperatura de la mezcla y separó el extracto del dióxido de carbono.
El extracto (65 g) fue obtenido como un material pardusco, pegajoso, y viscoso con una agradable fragancia. El color estaba causado probablemente por la clorofila. Para una determinación exacta de la producción, los tubos y el separador se enjuagaron con acetona y la acetona se evaporó para dar 9 g adicionales de extracto. La cantidad total de extracto fue de 74 g. En base a la etapa del material inicial, la producción de extracto fue de 1,88 %. El contenido de oleandrina en el extracto se calculó usando una cromatografía de líquidos a alta presión y una espectometría de masa para ser de 560,1 mg, o una producción del 0,76 %.
Método B. Con mezcla de dióxido de carbono y etanol
Las hojas de adelfa en polvo se prepararon recolectando, lavando y secando el material de hoja de adelfa, luego pasando el material de hoja de adelfa a través de un aparato de molienda y deshidratación como los descritos en las Patentes EE.UU. números 5.236.132, 5.598.879, 6.517.015 y 6.715.705. El peso del material inicial usado era de 3,85 kg.
El material inicial se combinó con CO2 puro y un 5 % de etanol como modificador a una presión de 280 bar (28 MPa, 4061 psi) y una temperatura de 50ºC (122ºF) en un dispositivo extractor. Se utilizó un total de 160 kg de CO2 y 8 kg de etanol, para dar una proporción de disolvente y materia prima de 43,1 a 1. La mezcla de CO2, etanol y materia prima luego se pasó a través de un dispositivo separador, que cambió la presión y temperatura de la mezcla y separó el extracto del dióxido de carbono.
El extracto (207 g) fue obtenido tras la eliminación del etanol como una masa verde oscuro, pegajosa y viscosa, que obviamente contenía algo de clorofila. En base al peso del material inicial, la producción del extracto fue del 5,38 %. El contenido de oleandrina en el extracto se calculó usando una cromatografía de líquidos a alta presión y una espectometría de masa para ser 1,89 g o una producción del 2,1 %.
Ejemplo 2 (no según la invención)
Extracción con agua caliente de hojas de adelfa en polvo.
La extracción con agua caliente se utiliza normalmente para extraer oleandrina y otros componentes activos de las hojas de adelfa. Ejemplos de procesos de extracción con agua caliente pueden encontrarse en las Patentes EE.UU. números 5.135.745 y 5.869.060.
Una extracción con agua caliente se realizó usando 5 g de hojas de adelfa en polvo. Se añadieron diez volúmenes de agua hirviendo (por peso del material inicial de adelfa) a las hojas de adelfa en polvo y la mezcla se removió constantemente durante 6 horas. Luego se filtró la mezcla y el residuo de la hoja se recogió y extrajo de nuevo bajo las mismas condiciones. El material de extracto seco pesaba aproximadamente 1,44 g. 31,21 g del material extraído se disolvió en agua y se sometió a un análisis de contenido de oleandrina usando una cromatografía de líquidos a alta presión y una espectometría de masa. Se determinó que la cantidad de oleandrina era de 3,68 mg. Se calculó que el rendimiento de oleandrina era del 0,26 %. La siguiente table muestra una comparación entre las producciones de oleandrina para las dos extracciones con dióxido de carbono supercrítico del ejemplo 1 y la extracción con agua caliente.
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Medio de extracción
Producción de oleandrina en base al peso total del extracto
Dióxido de carbono supercrítico: Ejemplo 1, Procedimiento A
0,76 %
Dióxido de carbono supercrítico: Ejemplo 1, Procedimiento B
2,1 %
Extracción con agua caliente: Ejemplo 2*
0,26 %
*No según la presente invención
Ejemplo 3
Tratamiento de afección neurológica incluyendo, pero sin limitación, la enfermedad de Alzheimer.
Procedimiento A. Terapia con glucósido cardiaco
5 A un paciente que presenta la enfermedad de Alzheimer se le prescribe glucósido cardiaco, y las dosis terapéuticamente relevantes se le administran al sujeto según un régimen de dosificación prescrito durante un periodo de tiempo. El nivel del sujeto de respuesta terapéutica se determina periódicamente. Si el nivel de respuesta terapéutica es demasiado bajo en una dosis, la dosis se aumenta según el programa de aumento de dosis predeterminado hasta que se consiga el nivel de respuesta terapéutica deseado en el sujeto. El tratamiento del
10 sujeto con glucósido cardiaco se continua según sea necesario y la dosis o el régimen de dosificación puede ajustarse según sea necesario hasta que el paciente alcance el resultado clínico deseado.
Procedimiento B. Terapia combinada: glucósido cardiaco con otro agente
El Procedimiento A anterior, se sigue excepto que al sujeto se le prescribe y administra uno o más agentes terapéuticos adicionales para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer o de los síntomas de la misma. Luego
15 uno o más agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse antes, tras o con el glucósido cardiaco. El aumento de la dosis (o disminución) del agente o agentes adicionales puede realizarse también. Los agentes adicionales terapéuticos incluyen NamendaTM (memantine HCI), AriceptTM (donepezilo), RazadyneTM (galantamina), ExelonTM (rivastigmina) y CognexTM (tacrina).
Ejemplo 4
20 Tratamiento de afección neurológica incluyendo, pero no limitado a la enfermedad de Huntington.
Procedimiento A. Terapia con glucósido cardiaco
Se le prescribe a un sujeto que presenta la enfermedad de Huntington glucósido cardiaco, y se administran al sujeto las dosis terapéuticamente relevantes según un régimen de dosificación prescrito durante un periodo de tiempo. El nivel de respuesta terapéutica del sujeto se determina periódicamente. Si el nivel de respuesta terapéutica es
25 demasiado bajo en una dosis, la dosis se aumenta a un programa de aumento de dosis predeterminado hasta que se consiga el nivel de respuesta terapéutica deseado en el sujeto. El tratamiento del sujeto con glucósido cardiaco se continua según sea necesario y la dosis o régimen de dosificación puede ajustarse según sea necesario hasta que el paciente alcance el resultado clínico deseado. Las dosis administradas pueden ser similares a las del Ejemplo 3 o a las descritas en la presente memoria.
30 Procedimiento B. Terapia combinada: glucósido cardiaco con otro agente.
El Procedimiento A anterior se sigue, excepto que al sujeto se le prescribe y administra uno o más agentes terapéuticos adicionales para el tratamiento de la enfermedad de Huntington o de los síntomas de la misma. Los agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse antes, tras o con el glucósido cardiaco. El aumento de la dosis (o la disminución de la misma) de uno o más agentes terapéuticos adicionales también puede realizarse. Los
35 agentes terapéuticos adicionales adecuados incluyen Vitamina E, Baclofen (un derivado de CoQ10), Lamotrigine (un anticonvulsivo), remacemida (un anestésico que es un antagonista NMDA de baja afinidad), y riluzol (bloqueador de canal de Na).
Ejemplo 5
Tratamiento de afección neurológica incluyendo, pero sin limitación, el accidente cerebrovascular isquémico.
40 Procedimiento A. Terapia con glucósido cardiaco
A un paciente que presenta un accidente cerebrovascular isquémico se le prescribe glucósido cardiaco, y se administran al sujeto las dosis terapéuticamente relevantes según un régimen de dosificación prescrito durante un periodo de tiempo. El nivel de respuesta terapéutica del sujeto se determina periódicamente. Si el nivel de respuesta terapéutica es demasiado bajo en una dosis, la dosis se aumenta a un programa de aumento de dosis
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predeterminado hasta que se consiga el nivel de respuesta terapéutica deseado en el sujeto. El tratamiento del sujeto con glucósido cardiaco se continua según sea necesario y la dosis o régimen de dosificación puede ajustarse según sea necesario hasta que el paciente alcance el resultado clínico deseado. Las dosis administradas pueden ser similares a las del Ejemplo 3 o a las descritas en la presente memoria.
Procedimiento B. Terapia combinada: glucósido cardiaco con otro agente.
El Procedimiento A anterior se sigue, excepto que al sujeto se le prescribe y administra uno o más agentes terapéuticos adicionales para el tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico o los síntomas del mismo. Los agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse antes, tras o con el glucósido cardiaco. También puede realizarse el aumento (o disminución) de la dosis de los agentes terapéuticos adicionales.
Ejemplo 6
Análisis HPLC de soluciones que contienen oleandrina
Se analizaron muestras (oleandrina estándar, extracto SCF y extracto con agua caliente) en HPLC (Waters) usando las siguientes condiciones: Simetría columna C18 (5,0 µm, 150x4,6 mm I.D.; Waters); Fase móvil de MeOH:agua =
54: 46 (v/v) y tasa de flujo a 1:0 ml/min. La longitud de onda de detección se estableció a 217 nm. Las muestras se prepararon disolviendo el compuesto o extracto en una cantidad fija de disolvente HPLC para conseguir una concentración objetivo-aproximada de oleandrina.
Ejemplo 7
Determinación de expresión α3 y α1 en tejido neuronal normal
Puede seguirse el procedimiento establecido en la Solicitud internacional PCT Nº PCT/US08/82641, presentada el 6 de noviembre de 2008 en nombre de Phoenix Biotechnology, Inc.
Ejemplo 8
Evaluación de glucósido cardiaco en un ensayo in vitro para accidente cerebrovascular y no accidente cerebrovascular
Procedimiento A: preparación de secciones cerebrales corticales y OGD
Las secciones cerebrales corticales se prepararon a partir de crías de rata PND 7 Sprague-Dawley. El córtex cerebral se diseccionó, se cortó en secciones de 400-: µm de grosor y se transfirieron a un contenedor que contenía fluido cerebroespinal artificial frío con 1 uM MK-801 antes de ser traspasado a la placa; MK-801 no se incluyó en ningún procedimiento posterior. Para imitar una lesión isquémica usando privación transitoria de oxígeno y glucosa (OGD), las secciones de un hemisferio de cada cerebro se expusieron a fluido cerebroespinal con borboteo N2 libre de glucosa durante 7,5 minutos en un entorno de O2 bajo (0,5 %). Las secciones OGD fueron traspasadas a la placa una al lado de la otra con secciones de control del hemisferio contralateral en membranas permeables de nitrocelulosa o Millicell (Millipore), que fueron preparadas de forma idéntica excepto por no haberse sometido a OGD. Treinta minutos tras la transferencia a placa, los pares de secciones de cerebro se transfectaron, transferidas a placas de 24 pocillos, e incubadas a 37º C bajo el CO2 al 5 % en cámaras humidificadas. En cada experimento, se utilizó una privación de oxígeno y glucosa (OGD) de 5 a 6 minutos para inducir una pérdida de >50 % de neuronas corticales sañas en 24 horas (comparar las primeras dos barras de la FIG. 1). Una concentración fijada (3 µM) de neriifolina se utilizó como el control positivo interno. Para la oleandrina, todas las tres concentraciones de 0,3 a 3 µM parecieron proporcionar neuroprotección en los primeros dos experimentos (Figuras 1A y 1B), de forma que las concentraciones de oleandrina probadas se disminuyeron en la tercera vez (Figura 1C) y se sugirió que la concentración umbral para la neuroprotección está entre 0,1 y 0,3 µM.
Procedimiento B. Sin accidente cerebrovascular: ensayo de sección cerebral
Se probaron oleandrina y PBI-05204 en secciones de cerebro “sin accidente cerebrovascular”; es decir, unos que fueron seccionados y transfectados con YFP, pero no se sometieron a trauma adicional mediante OGD. Consulte el procedimiento experimental indicado anteriormente. Hemos observado que un número de compuestos neuro protectores, incluyendo neriifolina, puede proporcionar niveles modestos de neuroprotección en dichas secciones cerebrales, presumiblemente protegiendo contra el trauma causado por el proceso de seccionamiento y cultivo. Como se puede ver en las Figuras 2A-2C, la oleandrina pareció poder proporcionar neuroprotección a dichas secciones cerebrales “no OGD” a niveles similares que la neriifolina lo que significa que los glucósidos cardiacos proporcionan neuroprotección incluso en la ausencia de privación de oxígeno o glucosa.
Ejemplo 9
Evaluación de un glucósido cardiaco en un ensayo APP in vitro para la enfermedad de Alzheimer
En el modelo de sección de cerebro de rata para la degeneración inducida por APP/Abeta de transfección biolística
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de neuronas piramidales corticales se utilizó no solo para introducir marcadores vitales como YFP, sino también para introducir construcciones genéticas de la enfermedad en las mismas poblaciones neuronales en las secciones cerebrales. Así, el modelo de sección cerebral APP/Aβ co-transfecta YFP con isoformas APP, llevando a la degeneración progresiva de neuronas piramidales corticales durante el curso de 3-4 días tras la preparación y transfección de la sección cerebral. Como puede verse en estas tres series en las Figuras 3A-3C, la oleandrina y el PBI-05204 parecen poder proporcionar una neuroprotección dependiente de dosis a secciones cerebrales transfectadas con APP, rescatando a niveles casi cercanos a los proporcionados por los fármacos inhibidores de BACE.
Ejemplo 10
Evaluación de glucósido cardiaco en un ensayo co-cultivo corticostriatal in vitro para enfermedad de Huntington
En este ensayo, en vez de usar secciones cerebrales intactas, el htt mutante se introduce mediante electroporación en co-cultivos combinados de alta densidad de neuronas corticales, neuronas estriatales y glia dispuestos en placas de 96 pozuelos. El objetivo de esta plataforma de ensayo es combinar la relevancia biológica/clínica de un sistema de cultivo primario complejo que recapitula aspectos clave de la interconectividad de poblaciones neuronales relevantes para la enfermedad in vivo, con la capacidad de realizar campañas de examen a gran escala completamente automatizadas. En este ensayo, durante 1-2 semanas, las construcciones htt mutantes transfectadas in vitro inducen la generación progresiva de las neuronas estriatales y corticales que se cuantificaron posteriormente utilizando algoritmos automatizados de adquisición de imagen y detección de objetos en la plataforma Cellomics Arrayscan VTI. Cada punto de dato se extrajo a partir de 6 pozuelos con 16 imágenes en cada pozuelo capturadas automáticamente, y se analizó en el Cellomics Arrayscan usando los protocolos desarrollados durante una campaña de examen a gran escala realizada en asociación con la Iniciativa para la Cura de la Enfermedad de Huntington. En una serie completa, se recogieron unas 25.000 imágenes y se analizaron en cada ciclo, cuatro ciclos por semana.
Plataforma de ensayo con co-cultivo cortico-estriatal
Se prepararon por adelantado cultivos de glial pura de placas neuronales para establecer placas con 96 pozuelos con lechos gliales confluentes. El tejido cortical y estriatal se disoció por separado y “nucleoafectado” con construcciones de ADN apropiadas y son distinguibles más tarde mediante la expresión de proteínas fluorescentes diferentes como YFP, CFP y mCherry. Estas neuronas corticales y estriatales transfectadas por separado luego se mezclan a conciencia y se transfieren a una placa en las placas de 96 pocillos que contienen las monocapas gliales emplacadas anteriormente.
Tanto la oleandrina y el PBI-05204 (el extracto de CO2 supercrítico de Nerium oleander) fueron probadas en esta plataforma de co-cultivo cortico-estriatal y preliminarmente estos compuestos parecen ser las coincidencias más fuertes que hemos observado hasta la fecha de >400 moléculas de medicamentos de etapa tardía que han sido evaluados en este sistema de ensayo. Con fines comparativos, un gráfico de respuesta de dosis para KW6002 (un antagonista receptor 2a de adenosina), se incluye el compuesto que incluimos rutinariamente como el control positivo para este co-cultivo (véase la FIG. 4E). La eficacia de la oleandrina está a la par con KW6002, mientras que su potencia parece ser 100 veces mayor.
Ejemplo 11
Evaluación de glucósido cardiaco y un extracto de la invención en un ensayo in vitro para accidente cerebrovascular y no accidente cerebrovascular.
Procedimiento A. Accidente cerebrovascular: preparación de secciones cerebrales corticales y OGD
Se prepararon secciones cerebrales corticales a partir de crías de rata PND 7 Sprague-Dawley. El córtex cerebral se diseccionó, se cortó en secciones de 400 µm de grosor y se transfirieron a un contenedor que contenía fluido cerebroespinal artificial frío con 1 uM MK-801 antes de ser traspasado a la placa; MK-801 no se incluyó en ningún procedimiento posterior. Para imitar una lesión isquémica usando privación transitoria de oxígeno y glucosa (OGD), las secciones de un hemisferio de cada cerebro se expusieron a fluido cerebroespinal con borboteo N2 libre de glucosa durante 7,5 minutos en un entorno de O2 bajo (0,5 %). Las secciones OGD fueron traspasadas a la placa una al lado de la otra con secciones de control del hemisferio contralateral en membranas permeables de nitrocelulosa o Millicell (Millipore), que fueron preparadas de forma idéntica excepto por no haberse sometido a OGD. Treinta minutos tras la transferencia a placa, los pares de secciones de cerebro se transfectaron, transferidas a placas de 24 pocillos, e incubadas a 37º C bajo el CO2 al 5 % en cámaras humidificadas. En cada experimento, se utilizó una privación de oxígeno y glucosa (OGD) de 5 a 6 minutos para inducir una pérdida de >50 % de neuronas corticales sañas en 24. Una concentración fijada (3 µM) de neriifolina se utilizó como el control positivo interno. Para la oleandrina, todas las tres concentraciones de 0,3 a 3 µM parecieron proporcionar neuroprotección en los primeros dos experimentos, de forma que las concentraciones de oleandrina probadas se disminuyeron en la tercera vez y se sugirió que la concentración umbral para la neuroprotección está entre 0,1 y 0,3 µM. El extracto no fraccionado, por ejemplo, de especies Nerium, o una fracción del mismo también puede usarse como se describe para la oleandrina.
Procedimiento B. Sin accidente cerebrovascular: ensayo de sección cerebral
Se probaron oleandrina y PBI-05204, un extracto SCF no fraccionado de Nerium oleander, en secciones de cerebro “sin accidente cerebrovascular”; es decir, unos que fueron seccionados y transfectados con YFP, pero no se sometieron a trauma adicional mediante OGD. Consulte el procedimiento experimental indicado anteriormente. 5 Hemos observado que un número de compuestos neuro protectores, incluyendo neriifolina, puede proporcionar niveles modestos de neuroprotección en dichas secciones cerebrales, presumiblemente protegiendo contra el trauma causado por el proceso de seccionamiento y cultivo. Los datos demuestran que la oleandrina y el extracto parecieron poder proporcionar neuroprotección a dichas secciones cerebrales “no OGD” a niveles similares que la neriifolina lo que significa que los glucósidos cardiacos proporcionan neuroprotección incluso en la ausencia de
10 privación de oxígeno o glucosa.
Ejemplo 12
Análisis HPLC de extracto SCF
El fin de este ensayo es identificar el extracto que contiene glucósido cardiaco. Se analizó una muestra de cada extracto como sigue. El extracto (1-3 mg) se disolvió en 1-5 ml de metanol acuoso (80 % de metanol en agua). La
15 muestra diluida (10-25 µL) se analizó con una columna Agilent Zorbax SB-C18 usando 80 % de metanol en agua como la fase móvil, una tasa de flujo de 0,7 ml/min y monitorización efluente DAD-UV en las siguientes longitudes de onda: 203, 210, 217, 230, 254, 280, 310 y 300 nm. Se confirma la identificación positiva mediante la formación de picos en un cromatógrafo cuando se comparan los tiempos de retención y el espectro de las muestras del extracto con las muestras de referencia.
20 Ejemplo 13
Ensayo en sección cerebral con retraso de tiempo para la determinación de neuroprotección.
Este ensayo fue realizado según el Ejemplo 11 a excepción de los siguientes cambios. Se permitió una duración de tiempo especificada entre el OGD y la introducción de un agente neuro protector propuesto. Se determinó la capacidad del PBI-05204 para proporcionar neuroprotección a las secciones cerebrales si el tratamiento se retrasó
25 en relación con el momento del tratamiento OGD. Los datos mostraron que un retraso de 2 horas de extractos de Nerium oleander se toleraba bien, mostrando niveles similares de neuroprotección a los obtenidos con la aplicación de PBI-05204 inmediatamente tras el tratamiento OGD. El beneficio neuro protector se redujo con un retaso de 4 a 6 horas tras la administración de PBI-05204, pero a niveles de neuroprotección que seguían siendo significativos y fisiológicamente relevantes.
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Claims (10)

  1. imagen1
    REIVINDICACIONES
    1. Un extracto que contiene oleandrina que comprende oleandrina, pero excluyendo neriifolina, en donde dicho extracto ha sido obtenido a partir de una masa vegetal de adelfa mediante extracción de fluidos supercríticos, para su uso en el tratamiento de una afección neurológica.
    5 2. El extracto que contiene oleandrina para su uso según la reivindicación 1, en donde la extracción SFC se realiza en presencia de un modificador, siendo dicho modificador seleccionado del grupo que consiste en etanol, metanol, propanol, acetona, acetato etílico y cloruro de metileno.
  2. 3. El extracto que contiene oleandrina para su uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la afección neurológica es un accidente cerebrovascular isquémico o una lesión cerebral isquémica
    10 provocada por un accidente cerebrovascular, o en donde la afección neurológica es una enfermedad neurodegenerativa seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, encefalopatía bovina espongiforme, esclerosis múltiple, neuropatía diabética, autismo y lipofuscinosis ceroide neuronal juvenil.
  3. 4. El extracto que contiene oleandrina para su uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, 15 en donde el extracto además comprende uno o más agentes terapéuticamente efectivos adicionales.
  4. 5.
    El extracto que contiene oleandrina para su uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el extracto comprende entre 0,1 y 50 mg de oleandrina por formato de dosificación.
  5. 6.
    El extracto que contiene oleandrina para su uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el extracto comprende de 12 a 1200 µg de oleandrina por formato de dosificación.
    20 7. El extracto que contiene oleandrina para su uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes administrado en una dosis efectiva de forma recurrente seleccionada entre diariamente, en días alternos, cada dos días, cada tres días, cada cuatro días, cada cinco días, cada seis días, semanalmente, en semanas alternas, cada dos semanas, cada tres semanas, mensualmente, bimensualmente, semi mensualmente, en meses alternos, cada dos meses, trimestralmente, en trimestres alternos, trimestralmente, por temporadas, semi anualmente y/o
    25 anualmente.
  6. 8. El extracto que contiene oleandrina para su uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes administrado en una dosis efectiva durante un periodo extendido de una o más semanas, uno o más meses, uno o más trimestres, y/o uno o más años.
  7. 9. El extracto que contiene oleandrina para su uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes 30 en donde la dosis efectiva se administra una o más veces al día.
  8. 10. El extracto que contiene oleandrina para su uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes para su uso en el tratamiento de una población de sujetos en riesgo que se caracteriza por la edad avanzada del sujeto, el historial familiar de la afección neurológica, la predisposición genética a la ocurrencia de la afección neurológica, la presencia y expresión del gen ApoE4 en el sujeto, sexo femenino, enfermedad cardiovascular,
    35 diabetes, síndrome de Down, lesión en la cabeza, bajos niveles de educación formal, tabaquismo, consumo excesivo de alcohol y/o abuso de estupefacientes.
  9. 11. El extracto que contiene oleandrina para su uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde la masa vegetal de la adelfa comprende las especies Nerium, preferiblemente Nerium oleander, o de las especies Thevetia, preferiblemente Thevetia neriifolia.
    40 12. Una composición que comprende el extracto que contiene oleandrina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en el tratamiento de una afección neurológica.
  10. 13. La composición para su uso según la reivindicación 12, en donde la afección neurológica es un accidente cerebrovascular isquémico o una lesión cerebral isquémica provocada por un accidente cerebrovascular, o en donde la afección neurológica es una enfermedad neurodegenerativa seleccionada del grupo que consiste en
    45 enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, encefalopatía bovina espongiforme, esclerosis múltiple, neuropatía diabética, autismo y lipofuscinosis ceroide neuronal juvenil.
    22
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