ES2694240T3 - Modulación de bomba de Na-K - Google Patents

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Abstract

Una proteína FXYD seleccionada del grupo que consiste en FXYD1 (SEQ ID NO: 1), FXYD3 (SEQ ID NO: 3), FXYD4 (SEQ ID NO: 4) y FXYD7 (SEQ ID NO: 7) o un fragmento o variante de la misma para su uso en el tratamiento del infarto de miocardio, en la que el fragmento o variante tiene la capacidad de promover la desglutationilación de la bomba de Na/K, en la que el fragmento o variante comprende una cisteína reactiva correspondiente a Cys62 de FXYD1, y en la que la variante presenta al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 7, respectivamente, a lo largo de la longitud de la variante.

Description

DESCRIPCION
Modulacion de bomba de Na-K 5 Campo tecnico
La presente invencion se refiere a la modulacion de la inhibicion oxidativa de la actividad de la bomba de Na+-K+. En particular, la presente invencion se refiere a la modulacion de la inhibicion oxidativa de la actividad de la bomba Na+- K+ por las protefnas FXYD. La presente invencion tambien se refiere a protefnas FXYD y derivados de las mismas, 10 utiles en el tratamiento de mamfferos, particularmente seres humanos, que tienen afecciones que implican la inhibicion oxidativa de la bomba de Na+-K+.
Antecedentes
15 Las protefnas FXYD 1-7 son una familia de protefnas que abarcan una sola transmembrana que reciben el nombre de su motivo de aminoacido FXYD compartido en el dominio extracelular. Las protefnas FXYD son conocidas por un efecto que se cree que tienen sobre las protefnas de membrana con las que se asocian, en particular, la membrana Na+-K+ ATPasa. Las protefnas FXYD no forman parte de la bomba de Na+-K+ per se, sino que actuan como moduladores especfficos de tejido de la funcion de la bomba de Na+-K+. Garty H y Karlish S (Annu. Rev. Physiol. 20 2006, 68: 431-59) revisan el papel de las protefnas FXYD en el transporte de iones. Las protefnas FXYD se han visto ampliamente implicadas en la regulacion de la funcion de la bomba de Na+-K+, y se sabe que, de hecho, modifican las propiedades funcionales de la bomba. En particular, se entiende que FXYD1, unica entre las protefnas FXYD, ya que puede fosforilarse en residuos de serina C-terminal, regula la bomba de Na+-K+ en respuesta a la fosforilacion. Sin embargo, un problema con este entendimiento es que las protefnas FXYD 2-7 no tienen sitios de 25 fosforilacion funcional y la mayorfa de los tejidos no expresan FXYD1, por lo que la fosforilacion de las protefnas FXYD no puede ser un esquema universalmente aplicable para la regulacion de la bomba de Na+-K+ por las protefnas FXYD.
Los gradientes transmembrana para Na+ y K+ mantenidos por la bomba de Na+-K+ son crfticos para la generacion de 30 potenciales de membrana y, por lo tanto, para la excitabilidad de las celulas. Tambien impulsan procesos secundarios de co y contra-transporte para otros iones, asf como para una gran cantidad de compuestos organicos, crfticos para el metabolismo celular. La bomba y la superfamilia mas amplia de ATPasas transportadoras de cationes a la que pertenece son dianas terapeuticas importantes. Sin embargo, a pesar de haber sido descubierta hace mas de 50 anos, la modulacion de la actividad de la bomba de Na+-K+ sigue siendo poco conocida.
35
Los inventores han ilustrado previamente un papel para la senalizacion oxidativa en la regulacion de la bomba de Na+-K+, ya que la subunidad p1 del heterodfmero a/p de la bomba de Na+-K+ tiene un residuo de cistefna "reactivo" capaz de glutationilarse y que dicha glutationilacion inhibe reversiblemente la funcion de la bomba de Na+-K+. La glutationilacion puede ser inducida por oxidantes qufmicos o mediada por la activacion de la NADPH oxidasa 40 dependiente del receptor de membrana y la protefna cinasa.
El estres oxidativo es un factor importante en varias enfermedades que incluyen infarto de miocardio, ictus y cancer. El aumento del estres oxidativo y los altos niveles de miocitos Na+ y Ca+ contribuyen al dano miocardico y las anomalfas contractiles en la isquemia y la reperfusion.
45
En respuesta al estres oxidativo, la subunidad p1 de la bomba de Na+-K+ se glutationila en el infarto y la inhibicion de la bomba causada por este puede contribuir a los niveles elevados de Na+ y Ca2+. El estres oxidativo tambien se ha relacionado con el dano isquemico cerebral con el ictus, y se han examinado estrategias antioxidantes. Ademas, se sabe que el estres oxidativo es un factor importante en la lesion por isquemia-reperfusion.
50
Sigue existiendo la necesidad de metodos mejorados para la modulacion de la actividad de la bomba de Na/K, tal como para su uso en un contexto terapeutico en el que la inhibicion de la actividad de la bomba esta asociada con el detrimento de la salud.
55 Resumen
El alcance de la presente invencion se define en las reivindicaciones adjuntas.
La presente invencion se basa en el sorprendente hallazgo de que las protefnas FXYD modulan la inhibicion
oxidativa de la bomba de Na+/K+ al alterar la glutationilacion de la bomba de Na+/K+.
En el presente documento se divulgan metodos para modular la actividad de la bomba de Na+/K+ mediante la alteracion de la glutationilacion de la bomba de Na+/K+. En formas de realizacion preferidas, la presente divulgacion 5 pretende proporcionar metodos para el tratamiento del infarto de miocardio, ictus, cancer y lesion por isquemia- reperfusion.
En un aspecto, la divulgacion proporciona un metodo de tratamiento o prevencion de una afeccion asociada con el exceso de glutationilacion de una bomba de Na+/K+, comprendiendo el metodo poner en contacto dicha bomba con 10 una cantidad eficaz de una protefna FXYD.
Una protefna FXYD o un fragmento o variante de la misma, para su uso en un metodo de tratamiento o prevencion de una afeccion asociada con una glutationilacion excesiva de una bomba de Na+/K+.
15 En una forma de realizacion, la afeccion asociada con una glutationilacion excesiva de la bomba de Na/K se selecciona del grupo que consiste en infarto de miocardio, ictus, cancer y lesion por isquemia-reperfusion.
En un aspecto de la presente divulgacion, se proporciona un metodo para modular la actividad de la bomba de Na+/K+, comprendiendo el metodo poner en contacto la bomba de Na+/K+ con una protefna FXYD o un fragmento o 20 variante de la misma, en el que la glutationilacion de dicha bomba de Na+/K+ se altera por dicha protefna FXYD o fragmento o variante de la misma.
Una protefna FXYD o un fragmento o variante de la misma para su uso en un metodo para modular la actividad de la bomba de Na+/K+.
25
En un aspecto de la presente divulgacion, se proporciona un metodo para tratar infarto de miocardio, ictus o lesion por isquemia-reperfusion mediante la modulacion de la actividad de la bomba de Na+/K+ en un sujeto, comprendiendo el metodo administrar a dicho individuo una cantidad terapeuticamente eficaz de una protefna FXYD o un fragmento o variante de la misma, en el que dicha protefna FXYD o fragmento o variante de la misma promueve 30 la desglutationilacion de dicha bomba de Na+/K+ modulando de este modo la actividad de la bomba de Na+/K+.
Una protefna FXYD o un fragmento o variante de la misma para su uso en un metodo para tratar infarto de miocardio, ictus o lesion por isquemia-reperfusion.
35 En una forma de realizacion, el tratamiento puede comenzar en aproximadamente 24 horas despues del infarto, ictus o lesion por reperfusion. Preferiblemente, el tratamiento se inicia en aproximadamente 12 horas despues del infarto, ictus o lesion de reperfusion, mas preferiblemente el tratamiento se inicia en aproximadamente 6 horas despues del infarto, ictus o lesion de reperfusion, incluso mas preferiblemente el tratamiento se inicia en aproximadamente 3 horas despues del infarto, ictus o lesion por reperfusion, mucho mas preferiblemente el 40 tratamiento se inicia aproximadamente en el momento del infarto, ictus o lesion por reperfusion.
En una forma de realizacion, la protefna FXYD se selecciona del grupo que consiste en FXYD1, FXYD3, FXYD4, FXYD6 y FXYD7.
45 En una forma de realizacion, el fragmento o variante comprende una cistefna reactiva correspondiente a Cys62 de FXYD1.
En un aspecto de la presente divulgacion, se proporciona el uso de una protefna FXYD o un fragmento o variante de la misma para la fabricacion de un medicamento para la modulacion de la actividad de la bomba de Na+/K+ en un 50 sujeto.
En un aspecto de la presente divulgacion, se proporciona el uso de una protefna FXYD o un fragmento o variante de la misma para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento del infarto de miocardio, ictus o lesion por isquemia-reperfusion.
55
En una forma de realizacion, la protefna FXYD se selecciona del grupo que consiste en FXYD1, FXYD3, FXYD4, FXYD6 y FXYD7.
En una forma de realizacion, el fragmento o variante comprende una cistefna reactiva correspondiente a Cys62 de
FXYD1.
En un aspecto de la presente divulgacion, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende una protefna FXYD o un fragmento o variante de la misma junto con al menos un adyuvante, excipiente o tampon 5 farmaceuticamente aceptable.
En un aspecto de la presente divulgacion, se proporciona un metodo para tratar el cancer mediante la modulacion de la actividad de la bomba de Na+/K+ en un sujeto, comprendiendo el metodo administrar a dicho individuo una cantidad terapeuticamente eficaz de una protefna FXYD de perdida de funcion en el que dicha protefna FXYD de 10 perdida de funcion aumenta o mantiene la glutationilacion de dicha bomba de Na+/K+, modulando de este modo la actividad de la bomba de Na+/K+.
Una protefna FXYD de perdida de funcion o un fragmento o variante de la misma para su uso en un metodo para tratar el cancer.
15
En una forma de realizacion, la protefna FXYD de perdida de funcion es una protefna FXYD o un fragmento o variante de la misma que no comprende una cistefna reactiva correspondiente a Cys62 de FXYD1.
En una forma de realizacion, la protefna FXYD de perdida de funcion no comprende aminoacidos basicos 20 adyacentes a la cistefna correspondiente a Cys62 de FXYD1.
En una forma de realizacion, la protefna FXYD de perdida de funcion es FXYD2 o FXYD5 o un fragmento o variante de FXYD2 o FXYD5. En una forma de realizacion, la protefna FXYD de perdida de funcion es un fragmento o variante de FXYD3.
25
En una forma de realizacion, la protefna FXYD de perdida de funcion se administra en un tratamiento de combinacion con radioterapia o quimioterapia.
En una forma de realizacion, el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama, cancer de 30 prostata, cancer de pancreas y cancer de intestino.
En un aspecto de la presente divulgacion, se proporciona el uso de una protefna FXYD de perdida de funcion para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento del cancer.
35 En un aspecto de la presente divulgacion, se proporciona una protefna FXYD de perdida de funcion aislada que no comprende una cistefna reactiva correspondiente a Cys62 de FXYD1.
En una forma de realizacion, la protefna FXYD de perdida de funcion no comprende una cistefna correspondiente a Cys62 de FXYD1. En otra forma de realizacion, la protefna FXYD de perdida de funcion no comprende al menos un 40 aminoacido basico adyacente a una cistefna correspondiente a Cys62 de FXYD1.
En una forma de realizacion, la perdida aislada de la protefna FXYD de perdida de funcion aislada es una variante de FXYD1, FXYD3, FXYD4, FXYD5, FXYD6 o FXYD7.
45 Breve descripcion de los dibujos
Una forma de realizacion preferida de la presente invencion se describira ahora, solo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos en los que:
50 La Figura 1 ilustra la glutationilacion de FXYD1 en el miocardio. A. FXYD1 se detecta en el lisado celular,
asf como la subfraccion glutationilada marcada con biotina de lisado celular en miocitos cardfacos. Esto tiene lugar en el valor inicial (control: C), y aumenta con la exposicion al oxidante qufmico ONOO\ El control negativo se realizo usando miocitos no cargados con biotina-GSH. No se detecto FXYD1 si se anadio DTT (1 mmol) al lisado antes de la precipitacion con estreptavidina. B. Histograma que muestra la densitometrfa 55 media de las inmunotransferencias de FXYD1 en la extraccion por pull-down con estreptavidina de los
miocitos cargados con biotina-GSH expuestos a ONOO- o control (n = 3). C. Efecto de Ang II (100 y 500 nM) en la glutationilacion de FXYD1 detectada por inmunotransferencia (IB) con el anticuerpo GSH contra el inmunoprecitado de FXYD1 (IP). D. Efecto de la Forskolina (Fsk) (100 nM) sobre la glutationilacion de FXYD1 detectada por la tecnica del anticuerpo GSH en miocitos con y sin incubacion en SOD pegilada. E.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Glutationilacion de FXYD1 en miocardio a partir de un modelo ovino de infarto. Se tomaron muestras del miocardio alejado del infarto; la zona peri-infarto, y la zona de infarto. Los histogramas resumen la densitometrfa de las inmunotransferencias normalizadas frente al control (n = 3 para cada experimento). * p <0,05.
La Figura 2 ilustra la glutationilacion de FXYD1 y los efectos funcionales. A. Inmunotransferencia de FXYD1 (panel superior) y la subunidad p1 (panel inferior) de microsomas de ovocitos que se cargaron directamente en geles (carriles 7-12) o se sometieron a inmunoprecipitacion con perlas de estreptavidina (carriles 1-6). Los experimentos se realizaron 2 dfas despues de la inyeccion de ARNc de subunidad a1 y p1 de Na,K-ATPasa de Xenopus en solitario o junto con ARNc de FXYD1. Todos los ovocitos se inyectaron con biotina-GSH como se describe en los metodos, y con ONOO- como se indica. cg, nucleo glucosilado; fg, subunidad p totalmente glucosilada. B. Cuantificacion de la glutationilacion de la subunidad p de Na,K- ATPasa. Se muestran las unidades arbitrarias obtenidas mediante el escaneo densitometrico de los datos mostrados en A, normalizados por la cantidad total de protefnas expresadas. Los datos de ovocitos que expresan a1p1 se establecieron arbitrariamente en 1. Se muestran medias ±SEde5 experimentos independientes. *p<0,005. C. FXYD1 revierte la inhibicion de la bomba de Na,K en presencia de ONOO'. La corriente maxima de Na,K-ATPasa (Imax) se midio mediante la tecnica de pinza de tension de dos electrodos. Se muestran las medias ± SE de 20 ovocitos de 2 lotes diferentes. * p<0,05 frente a control. Las corrientes medidas en ovocitos no inyectados representaron 51 nA ± 3,5 y 40 nA ± 2,7 en ausencia y presencia de ONOO', respectivamente, y no se restaron. D. Efecto de FXYD1 sobre la inhibicion de la bomba de Na+-K+ inducida por forskolina en miocitos cardfacos. El histograma muestra la corriente de la bomba de Na+-K+ (Ip) de los miocitos expuestos a forskolina con o sin FXYD1 recombinante (500 nM) que se incluye en la solucion de pipeta de parche. El numero de miocitos en cada grupo experimental vario de 6 a 10. * indica p< 0,05 en todos los paneles.
La Figura 3 ilustra el efecto de FXYD3 recombinante en la regulacion de la bomba de Na+-K+ en los miocitos cardfacos. A. La protefna FXYD3 recombinante co-inmunoprecipita con la subunidad a1 nativa en los miocitos cardfacos. Inmunotransferencia de FXYD3 (IB) de FXYD3; subunidad a1; GSH; e inmunoprecipitado de control no inmune (IP) de los miocitos incubados en FXYD3 recombinante (500 nM) y expuestos a ONOO- o control durante 10 minutos, segun se indique. B. La exposicion de los miocitos cardfacos a FXYD3 recombinante disminuye la co-inmunoprecipitacion de FXYD1 nativo con la subunidad a1 de la bomba de Na+-K+. Inmunotransferencia de FXYD1 y subunidad a1 de inmunoprecipitado de subunidad a1 de miocitos cardfacos aislados expuestos a FXYD3 o FXYD3 cysless mutado. C. Efecto de FXYD3 recombinante o FXYD3 cysless en la glutationilacion inducida por ONOo- de la subunidad p1 de la bomba de Na+-K+ (GSS-p1). Los miocitos se expusieron a FXYD3 recombinante 500 nM (o mutante cysless) durante 15 minutos antes de la exposicion a ONOO- o control (C) durante 10 minutos. D. Efecto de FXYD3 recombinante o FXYD3 cysless en la glutationilacion inducida por Ang II de la subunidad p1 de la bomba de Na+-K+ (GSS-p1). Los miocitos se expusieron a FXYD3 recombinante 500 nM (o mutante cysless) durante 15 minutos antes de la exposicion a Ang II 100 nM o control (C) durante 10 minutos. E. Efecto de FXYD3 recombinante o FXYD3 cysless en la disminucion inducida por Ang II en la corriente de la bomba de Na+-K+ (Ip) medida en miocitos cardfacos aislados. Las protefnas recombinantes se incluyeron en la solucion de pipeta de parche a una concentracion de 500 nM. El numero de miocitos en cada grupo experimental vario de 5 a 10. F. Efecto de FXYD3 o FXYD3 cysless en una disminucion inducida por el agonista adrenergico p3 (CL316.243: CL) en la glutationilacion de la subunidad de la bomba de Na+-K+ p1. Los histogramas resumen la densitometrfa de las inmunotransferencias normalizadas frente al control (n = 3 para cada experimento). * indica p< 0,05 en todos los paneles.
La Figura 4 ilustra la identificacion del residuo de cistefna implicado en la glutationilacion de FXYD 1 y la regulacion de la bomba de Na+-K+ a traves de estudios mutacionales. Los ovocitos de Xenopus que expresan subunidades a1 y p1 de Na,K-ATPasa de de Xenopus en solitario o junto con FXYD1 de tipo salvaje o mutado (FXYDC1, FXYDC2 o FXYDC1C2) se inyectaron con biotina-GSH para la deteccion de glutationilacion y ONOO-, segun se indique. A. Inmunotransferencia de FXYD1 de microsomas de ovocitos que se cargaron directamente en geles (panel superior) o inmunoprecipitados con perlas de estreptavidina (panel inferior). B. Histograma que muestra la densitometrfa media de la inmunotransferencia de GSS- FXYD1 normalizada frente al control (GSS-FXYD1 en ovocitos que expresan subunidades nativas FXYD1/a1/p1 y se exponen a ONOO-). A. Inmunotransferencia de la subunidad p1 de microsomas de ovocitos que se cargaron directamente en geles (panel superior) o inmunoprecipitados con perlas de estreptavidina (panel inferior). D. Histograma que muestra la densitometrfa media de la inmunotransferencia de GSS-p1 normalizada por la cantidad total de protefnas expresadas. Por razones tecnicas, no fue posible comparar la glutationilacion de FXYD1 y las subunidades p para todas las condiciones en el mismo experimento. Por lo tanto, las cuantificaciones no incluyen la glutationilacion de subunidades p en ovocitos que expresan subunidades a1p1 sin FXYD1. Los datos de ovocitos que expresan subunidades a, p y FXYD1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
o a, p y FXYD1C1C2 se ajustaron arbitrariamente a 1. Se muestran medias ± SE de 4 experimentos independientes. * p <0,05. E. Identificacion de la cistefna FXYD implicada en la reversion de la inhibicion maxima de la corriente de la bomba. Las corrientes medidas en ovocitos no inyectados representaron 69,5 nA ± 2,5 y 62,5 nA ± 1,9 en ausencia y presencia de ONOO-, respectivamente, y no se restaron. Se muestran las medias ± SE de 20 ovocitos de 4 lotes diferentes. *p<0,05 frente a control. C1 = C60/A; C2 = C62/A; C1C2 = C60/A,C62/A.
La Figura 5 ilustra los aminoacidos que rodean a la cistefna candidata que desempenan un papel en la glutationilacion de la protefna FXYD. Los ovocitos de Xenopus que expresan subunidades a1 y p1 de Na,K- ATPasa de Xenopus en solitario o junto con FXYD1, FXYD2, FXYD7, FXYD1 mutante (K63/G) o FXYD2 mutante (G49/K) se inyectaron con biotina-GSH y ONOO- como se indica. A. Papel funcional de la lisina adyacente a la cistefna candidata en la reversion de la inhibicion maxima de la corriente de la bomba. Se muestran las medias ± SE de 15 ovocitos de 3 lotes diferentes. * p<0,02 frente a control. Las corrientes medidas en ovocitos no inyectados representaron 59,5 nA ± 4 y 51 nA ± 3,7 en ausencia y presencia de ONOO-, respectivamente, y no se restaron. La mutacion Lys/Gly suprime la glutationilacion de FXYD1 (B) y promueve un aumento en la glutationilacion de la subunidad p1 de Na,K-ATPasa (C). La mutacion Gly/Lys en FXYD2 conduce a una disminucion en la glutationilacion de la subunidad p1 de Na,K-ATPasa (C). Los microsomas de ovocitos se cargaron directamente en geles (B, C paneles superiores) o se inmunoprecipitaron con perlas de estreptavidina (B, C, paneles inferiores) y se analizaron transferencias de Western con un anticuerpo FXYD1 (B). Despues de la separacion de la membrana de nitrocelulosa mostrada en B, la transferencia se analizo con un anticuerpo de subunidad p de Na,K-ATPasa (C). D. Cuantificacion de la glutationilacion de la subunidad p de Na,K-ATPasa. Se muestran las unidades arbitrarias obtenidas mediante el escaneo densitometrico de los datos mostrados en C, normalizados por la cantidad total de protefnas expresadas. Los datos de ovocitos que expresan a, p y FXYD1 KG se ajustaron arbitrariamente a 1. Se muestran medias ± SE de 3 experimentos independientes. * p <0,05.
La Figura 6 ilustra que los estfmulos oxidativos disminuyen la interaccion de FXYD1 con a1 y aumentan la interaccion con las subunidades p1 de la bomba de Na+-K+ en el miocardio. A. Efecto de Ang II (100 nM y 500 nM) en la densitometrfa de la inmunotransferencia de subunidad a1 (IB) frente al inmunoprecipitado de FXYD1 (IP) en miocitos cardfacos de conejo. B. Efecto de Ang II (100 nM y 500 nM) en la densitometrfa de la inmunotransferencia de subunidad p1 (IB) en el inmunoprecipitado de FXYD1 (IP) en miocitos cardfacos de conejo. C. Inmunotransferencia de la subunidad a1 (C) y la subunidad p1 (D) del inmunoprecipitado FXYD1 del lisado de miocardio de un modelo de infarto de oveja. Se uso miocardio de region alejada del infarto; asf como la zona peri-infarto y de infarto. En todos los experimentos, se muestra la inmunotransferencia de FXYD1 frente al inmunoprecipitado de FXYD1. Los histogramas resumen la densitometrfa de las inmunotransferencias normalizadas frente al control (n = 3 para cada experimento). * p <0,05.
La Figura 7 ilustra que la glutationilacion de la subunidad p de Na,K-ATPasa promueve una disminucion en la asociacion de la subunidad a y p de Na,K-ATPasa. A. Interaccion a1/p1 en ovocitos de Xenopus. Dos dfas despues de la inyeccion de los ARNc de las subunidades a1 y p1 de Na,K-ATPasa de Xenopus en solitario o junto con los ARNc de FXYD1 o FXYD1 mutante (FXYD1C2), los ovocitos se inyectaron con biotina-GSH y ONOO- como se indica. Los microsomas de ovocitos se cargaron directamente en geles (paneles a, b) o se inmunoprecipitaron con un anticuerpo a (paneles c, d) o con perlas de estreptavidina (paneles e) y las transferencias Western se analizaron con un anticuerpo de la subunidad p de Na,K-ATPasa (paneles b, d y e). Despues de la separacion de la membrana de nitrocelulosa, la transferencia se analizo con un anticuerpo de subunidad a de Na,K-ATPasa (paneles a, c). B. Cuantificacion de la cantidad de subunidad p1 de Na,K-ATPasa asociada con la subunidad a1 de Na,K-ATPasa. Se muestran las unidades arbitrarias obtenidas mediante el escaneo densitometrico de los datos mostrados en A, normalizados por la cantidad total de protefnas expresadas y por la cantidad de subunidad a de Na,K-ATPasa inmunoprecipitada. Los datos de ovocitos que expresan subunidades a y p, a y p □ y FXYD1 de tipo salvaje o mutante sin inyeccion de ONOO- se ajustaron arbitrariamente en 1. Se muestran medias ± SE de 3-4 experimentos independientes. * p <0,05. C. Efecto de FXYD3 recombinante o FXYD3 cysless en la disminucion inducida por ONOO- en la co-inmunoprecipitacion de subunidad a1/p1. Los miocitos cardfacos de conejo se expusieron a ONOO- como se indica. Los histogramas resumen la densitometrfa de las inmunotransferencias normalizadas frente al control (n = 3). * p <0,05. D. El efecto del estres oxidante asociado con el infarto de miocardio en la interaccion de la subunidad a1/p1. Su co-inmunoprecipitacion se redujo en las zonas de infarto y peri-infarto del miocardio. Los histogramas resumen la densitometrfa de las inmunotransferencias normalizadas frente al control (n = 3). * Indica una diferencia significativa frente al control (p <0,05).
La Figura 8 ilustra el impacto de las cistefnas mutadas en FXYD1, tambien conocido como "phospholemman" (PLM) en la modificacion dependiente de ONOO- de la actividad de Na,K-ATPasa. Los
ovocitos de Xenopus que expresan subunidades ai y p1 de Na,K-ATPasa de Xenopus en solitario o junto con PLM (FXYD1) de tipo salvaje o mutado se inyectaron o no con ONOO-, segun se indica. A. Union de [3H]ouabafna a ovocitos intactos. Los valores obtenidos en ovocitos no inyectados fueron 370 dpm ± 27, respectivamente y no se restaron. Los datos son medias ± SE de 14 ovocitos de 2 lotes diferentes. B.
5 Numero de recambios de Na,K-ATPasa. El numero de recambios (cargas transportadas/s/molecula) se
calculo como la relacion entre la corriente maxima de la bomba de Na,K y el numero de sitios de union de ouabafna. *p<0,03 frente a control.
La Figura 9 ilustra el impacto de diferentes protefnas FXYD en la modificacion dependiente de ONOO- de la actividad de Na,K-ATPasa. Los ovocitos de Xenopus que expresan subunidades ai y pi de Na,K-ATPasa 10 de Xenopus en solitario o junto con PLM de tipo salvaje o mutado, FXYD2 o FXYD7 se inyectaron o no con
ONOO-, segun se indica. A. Union de [3H]ouabafna a ovocitos intactos. Los valores obtenidos en ovocitos no inyectados 378 dpm ± 23 y 364 dpm ± 24 y no se restaron. Los datos son medias ± SE de 14 ovocitos de 2 lotes diferentes. B. Numero de recambios de Na,K-ATPasa. *p<0,05 frente a control.
La Figura 10 es un alineamiento de secuencia de secuencias parciales de protefnas FXYD humanas 1-7 15 que indican la posicion de las cistefnas en la posicion 60 y 62 de FXYD1 (sombreado claro) y los
aminoacidos basicos en las posiciones 61 y 63 de FXYD1 (sombreado oscuro).
Definiciones
20 El termino "cantidad terapeuticamente eficaz" como se usa en el presente documento incluye en su significado una cantidad suficiente de un compuesto o composicion para proporcionar un efecto terapeutico deseado. La cantidad exacta requerida variara de un sujeto a otro dependiendo de factores tales como la especie que se esta tratando, la edad y el estado general del sujeto, las comorbilidades, la gravedad de la afeccion que se trata, el agente particular que se administra y el modo de administracion. Por lo tanto, para cualquier caso dado, un experto en la tecnica 25 puede determinar una "cantidad terapeuticamente eficaz" apropiada utilizando solo metodos de rutina.
Los terminos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en el presente documento e incluyen seres humanos e individuos de cualquier especie de importancia social, economica o de investigacion, incluyendo, pero sin limitacion, miembros del genero ovino, bovino, equino, porcino, felino, canino, primates, roedores.
30
Los terminos "tratar" y "tratamiento", como se usan en el presente documento, incluyen administrar una terapia para prevenir, curar, aliviar, mejorar o prevenir los sfntomas asociados con un trastorno, enfermedad, lesion o afeccion.
El termino "combinado con" y terminos similares, tal como "junto con" como se usa en el presente documento, en 35 relacion con un regimen terapeutico, significa que cada uno de los farmacos y otro agente o agentes terapeuticos, tales como agonistas y antagonistas o sustancias adicionales usadas en el tratamiento o prevencion de una enfermedad o afeccion, se utiliza en el tratamiento de un sujeto, y que cada uno de los farmacos y otros agentes terapeuticos en el regimen terapeutico "combinado" pueden administrarse al sujeto simultaneamente con uno o mas de los otros agentes en el regimen terapeutico, o pueden administrarse al sujeto en un momento diferente a uno o 40 mas de los otros agentes en el regimen terapeutico. Se entendera que el termino "combinado con" y terminos similares tal como "junto con" como se usa en el presente documento en relacion con un regimen terapeutico incluye dentro de su significado la administracion de cada uno de los farmacos y otros agentes terapeuticos a traves de diferentes modos (por ejemplo, uno puede administrarse por via oral y otro por inyeccion). El termino "combinado con" y terminos similares, tales como "junto con", cuando se usan en relacion con un regimen terapeutico pueden 45 significar que uno cualquiera o mas de los farmacos u otros agentes pueden combinarse ffsicamente antes de la administracion al sujeto, y se entendera que el termino tambien incluye la administracion de uno o mas farmacos y otros agentes terapeuticos como agentes separados que no estan en una combinacion ffsica anterior.
El termino "que comprende" como se usa en el presente documento, significa que incluye principalmente, pero no 50 necesariamente unicamente. Ademas, las variaciones de la palabra "que comprende", tales como "comprender" y "comprende", tienen significados correspondientemente variados.
El termino, "Ip", como se usa en el presente documento, es una abreviatura de la corriente transmembranosa celular medible generada por la bomba de Na+-K+ en situaciones experimentales usando una tecnica de pinza de parche.
55
El termino "derivado" cuando se usa en relacion con una protefna FXYD de la presente invencion, incluye cualquier protefna FXYD funcionalmente equivalente que incluya cualquier molecula de fusion producida integralmente (por ejemplo, por medios recombinantes) o anadida despues de la sfntesis (por ejemplo, por medios qufmicos). Dichas fusiones pueden comprender protefnas FXYD de la invencion conjugadas con un polipeptido (por ejemplo,
puromicina u otro polipeptido), una molecula pequena (por ejemplo, psoraleno) o un anticuerpo.
El termino "modulador", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier entidad que pueda aumentar o disminuir la glutationilacion de la bomba de Na+/K+. Los moduladores pueden ser "activadores", que disminuyen el 5 nivel de glutationilacion y, por lo tanto, facilitan el aumento de la actividad de la bomba de Na+/K+. En algunas formas de realizacion, los moduladores son "inhibidores" que son entidades que no afectan al nivel de glutationilacion de la bomba de Na+/K+, pero inhiben los moduladores endogenos para que lo hagan. En formas de realizacion preferidas, los moduladores son protefnas FXYD o derivados de las mismas.
10 Los terminos "protefna FXYD" y "protefnas FXYD" como se usan en el presente documento, se refieren a cualquier protefna, polipeptido u oligopeptido que comprende al menos una porcion de una protefna FXYD, variante u homologo de la misma, y que conserva la capacidad de asociarse con la bomba de Na+/K+.
En el contexto de esta memoria descriptiva, el termino "polipeptido" significa un polfmero formado por aminoacidos 15 unidos entre sf por enlaces peptfdicos. El polipeptido puede ser de cualquier longitud. Excepto cuando el contexto indique lo contrario, se entendera que el termino polipeptido tambien incluye peptidos y protefnas.
El termino "contacto", como se usa en el presente documento, se refiere a la exposicion de tejidos, organos o celulas a una o mas protefnas FXYD o profarmacos de la divulgacion para que puedan modular la actividad de la bomba de 20 Na+/K+. El contacto puede ser in vitro, por ejemplo, anadiendo la protefna FXYD o profarmaco a tejidos cultivados o celulas con fines de diagnostico o investigacion o para probar la susceptibilidad del tejido o las celulas a la protefna FXYD o profarmaco. El contacto puede ser in vivo, por ejemplo, administrar la protefna FXYD o el profarmaco a un sujeto, tal como para el tratamiento o la prevencion de una afeccion no deseada.
25 El termino "al menos uno" cuando se usa en el contexto de un grupo de elementos seleccionables incluye uno cualquiera, dos o mas, hasta todos los miembros del grupo, seleccionados individualmente e incluye cualquier combinacion de los miembros del grupo. De manera similar, el termino "al menos dos" cuando se usa en el contexto de un grupo de elementos seleccionables incluye cualquier seleccion de dos o mas miembros del grupo en cualquier combinacion.
30
En el contexto de esta memoria descriptiva, los terminos "Na+-K+ ATPasa", bomba de Na/K, bomba de Na+-K+ y Na,K ATPasa se usan indistintamente.
En el contexto de esta memoria descriptiva, los terminos "PLM", "phospholemman" y "FXYD1" se usan 35 indistintamente.
Descripcion detallada
La invencion se describira ahora con mas detalle, incluyendo, solo a modo de ilustracion, con respecto a los 40 siguientes ejemplos.
En el presente documento se divulgan composiciones y metodos para la modulacion de la glutationilacion de la bomba de Na+/K+, particularmente en el tratamiento de afecciones tales como infarto de miocardio, cancer e ictus. Los metodos generalmente comprenden el uso de composiciones que comprenden una protefna FXYD o una 45 protefna FXYD sola para el tratamiento de una afeccion en la que la modulacion de la actividad de la bomba de Na+/K+ por la alteracion de la glutationilacion de Na+/K+ puede ser beneficiosa.
Modulacion de la actividad de la bomba de Na+IK+
50 Todas las celulas se caracterizan por una diferencia en el potencial electrico entre el interior de la celula y el exterior, separados por la membrana celular. El gradiente electrico y qufmico generado a traves de la membrana celular por la funcion de la bomba de Na+/K+ es crftico para una serie de procesos que incluyen el acoplamiento de excitacion- contraccion en las celulas musculares y el transporte facilitado de metabolitos, por ejemplo, glucosa y aminoacidos a la celula. Por consiguiente, la modulacion de la actividad de la bomba de Na+/K+ desempena un papel crftico en la 55 funcion celular.
Proteinas FXYD
Las protefnas FXYD son una familia de protefnas de membrana de tipo I pequenas que reciben su nombre por una
secuencia de firma FXYD invariable en el dominio extracelular. Las protefnas FXYD ("fixit") de mamffero, expresadas de manera especffica de tejido (Sweadner y Rael, 2000), se numeran cronologicamente segun las fechas en que se clonaron y consisten en phospholemman (FXYD1) (Palmer et al., 1991 y por ejemplo, FXYD1 humana UniProtKB/Swiss-Prot N.° de acceso 000168 (SeQ ID NO. 1)) la subunidad y de Na,K-ATPasa (FXYD2) (Mercer et 5 al., 1993 y, por ejemplo, FXYD2 humana UniProtKB/Swiss-Prot N.° de acceso P54710 (SEQ iD No. 2)), marcador tumoral mamario 8, Mat-8 (FXYD3) (Morrison et al., 1995 y, por ejemplo, FXYD3 humana N.° de acceso de Genbank CAG46994 (SEQ ID No.3)), factor inducido por la hormona corticosteroide CHIF (FXYD4) (Attali et al., 1995 y, por ejemplo, FXYD4 humana N.° de acceso de Genbank CAI17065 (SEQ ID No. 4)), protefna "relacionada con el canal ionico" Ric (FXYD5) (Fu y Kamps, 1997 y, por ejemplo, FXYD5 humana N.° de acceso de Genbank AAQ89350 (SEQ 10 ID No. 5)), fosfohipolina (FXYD6) (Yamaguchi et al., 2001 y, por ejemplo, FXYD6 humana N.° de acceso de Genbank CAG38488 (SEQ ID No. 6)) y FXYD7 (Beguin et al., 2002 y, por ejemplo, FXYD7 humana N.° de acceso de Genbank NP_071289 (SEQ ID No. 7).
Los ejemplos de secuencias de acidos nucleicos que codifican protefnas FXYD son FXYD1 humana EMBL-EBI N.° 15 de acceso U72245 (SEQ ID No. 8), FXYD2 humana EMBL-EBI N.° de acceso U50743 (SEQ ID No. 9), FXYD3 humana N.° de acceso de Genbank CR542197 (SEQ ID No. 10), FXYD4 humana N.° de acceso de Genbank NM_173160 (SEQ ID No. 11), FXYD5 humana N.° de acceso de Genbank NM_001164605 (SEQ ID No. 12), FXYD6 humana N.° de acceso de Genbank NM_022003 (SEQ ID No. 13) y FXYD7 humana N.° de acceso de Genbank NM_022006 (SEQ ID No. 14).
20
La Figura 10 ilustra parte de un alineamiento de secuencia multiple realizado utilizando las secuencias completas de las SEQ ID No's 1-7 (FXYD1 humana con respecto a FXYD7). La Figura 10 indica la posicion de las cistefnas en la posicion 60 y 62 de FXYD1 (sombreado claro) y los aminoacidos basicos en las posiciones 61 y 63 de FXYD1 (sombreado oscuro). Se entendera que la numeracion de aminoacidos como se indica en la Figura 10 y la Lista de 25 secuencias se deriva de las secuencias asociadas con los numeros de acceso mencionados anteriormente. La numeracion de aminoacidos en variantes u homologos de FXYD puede variar debido a la presencia de, por ejemplo, un peptido lfder; sin embargo, se entendera que los residuos correspondientes a las cistefnas en las posiciones 60 y 62 de FXYD1 se ubicaran en el dominio citoplasmico cerca del segmento transmembrana.
30 Se entendera que la divulgacion incluye variantes de protefnas FXYD descritas en el presente documento. Tfpicamente, una variante es una variante de secuencia o una variante de origen natural, como una variante de corte y empalme o un homologo de secuencia. Tfpicamente, la variante conserva la capacidad de interactuar con la bomba de Na-K. Las variantes incluyen las preparadas por metodos recombinantes o sinteticos conocidos en la tecnica.
35
Las variantes u homologos pueden tener una o mas sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones de aminoacidos en la secuencia de aminoacidos. Las variantes u homologos de las protefnas FXYD divulgadas en el presente documento presentan preferiblemente al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, o al menos aproximadamente un 90 % de identidad con una protefna 40 FXYD nativa, mas preferiblemente al menos aproximadamente un 92 %, o al menos aproximadamente un 97 % de identidad, y mucho mas preferiblemente al menos aproximadamente un 97 % de identidad a lo largo de la variante u homologo de una protefna FXYD nativa.
Algunas protefnas FXYD nativas o fragmentos de las mismas pueden ser incapaces de promover la des- 45 glutationilacion de la bomba de Na+-K+. Por ejemplo, el Ejemplo 6 muestra que FXYD2 no altera la funcion de la bomba de Na+-K+. En la Figura 10 se puede observar que FXYD2, FXYD5 y FXYD6 nativas carecen de al menos una de una cistefna reactiva correspondiente a cys62 de FXYD1 y aminoacidos basicos adyacentes a esa cistefna reactiva. Por lo tanto, se contempla que FXYD5 y FXYD6 carecerfan de la capacidad de promover la desglutationilacion de la bomba de Na+-K+.
50
Por consiguiente, se puede crear, por lo tanto, una variante de la protefna FXYD de perdida de funcion por mutacion de uno o mas de los aminoacidos basicos adyacentes a la cistefna reactiva a un aminoacido no basico o por mutacion de una cistefna reactiva correspondiente a cys62 de FXYD1. Se puede crear una variante de la protefna FXYD con ganancia de funcion a partir de FXYD2, FXYD5 o FXYD6 mediante la mutacion de uno o mas 55 aminoacidos adyacentes a la cistefna reactiva a un aminoacido basico o, en el caso de FXYD5, la insercion de una cistefna en una posicion correspondiente a cys62 de FXYD1. En algunas formas de realizacion, se puede crear una variante de FXYD5 con ganancia de funcion mediante la insercion de una cistefna en una posicion correspondiente a cys62 de FXYD1 y la insercion de un aminoacido basico en una posicion correspondiente a lys63 de FXYD1.
Las variantes pueden modificarse, por ejemplo, mediante la eliminacion o adicion de aminoacidos que influyen en la capacidad de la variante para modular la bomba de Na-K, la estructura secundaria y la naturaleza hidropatica del polipeptido.
5 Las sustituciones de aminoacidos incluyen, pero no estan necesariamente limitadas a, sustituciones de aminoacidos conocidas en la tecnica como "conservativas". Una sustitucion "conservativa" es aquella en la que un aminoacido se sustituye por otro aminoacido que tiene propiedades similares, de tal manera que un experto en la tecnica de la qufmica de peptidos esperarfa que la estructura secundaria y la naturaleza hidropatica del polipeptido se mantuvieran sustancialmente inalteradas. Las sustituciones de aminoacidos se pueden hacer generalmente en base 10 a la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipatica de los residuos. Por ejemplo, los aminoacidos cargados negativamente incluyen acido aspartico y acido glutamico; los aminoacidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y los aminoacidos con grupos de cabeza polar sin carga que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina y valina; glicina y alanina; asparagina y glutamina; y serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Otros grupos de aminoacidos que pueden representar cambios 15 conservativos incluyen: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his. Una variante puede contener tambien, o como alternativa, cambios no conservativos.
Tfpicamente, una protefna FXYD de variante se diferencia de una protefna FXYD nativa por sustitucion, eliminacion 20 o adicion de cinco aminoacidos o menos, tal como por cuatro, o tres, o dos, o un aminoacido.
Tfpicamente, una protefna FXYD de la invencion es una protefna aislada. Se entendera que el termino "aislado" en este contexto significa que la protefna se ha eliminado o no esta asociada con alguno o ninguno de los demas componentes con los que se encontrarfa en el sistema natural. Por ejemplo, un peptido "aislado" puede eliminarse 25 de otras secuencias de aminoacidos dentro de una secuencia polipeptfdica FXYD, o puede eliminarse de componentes naturales, tales como protefnas no relacionadas. Por motivos de claridad, una protefna FXYD "aislada" incluye una protefna FXYD que se ha sintetizado qufmicamente e incluye un polipeptido u oligopeptido que se ha preparado mediante metodos recombinantes. Como se describe en el presente documento, la protefna FXYD aislada de la invencion puede incluirse como parte componente de un polipeptido o protefna de fusion de mayor 30 longitud.
Por consiguiente, una protefna FXYD de la invencion puede comprender de al menos aproximadamente 6 aminoacidos al menos a aproximadamente 65 aminoacidos. Preferiblemente, una protefna FXYd de la invencion puede comprender aproximadamente 7- 10, 11- 15, 16- 20, 21- 25, 26- 30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50, 51-55, 56-60 35 o 61-65 aminoacidos.
Una protefna FXYD de la invencion puede incluirse como parte componente de una secuencia de aminoacidos mas larga. Por ejemplo, una protefna FXYD de la invencion puede estar presente en forma de una protefna de fusion o polipeptido donde la protefna FXYD esta unida con una o mas secuencias de aminoacidos a las que no estarfa unida 40 en la naturaleza.
En este contexto, se entendera que una protefna de fusion o polipeptido puede comprender una pluralidad de protefnas FXYD de la invencion, tal como un polipeptido donde dos o mas protefnas FXYD estan presentes en un unico polipeptido.
45
Una protefna de fusion o polipeptido que comprende una o mas protefnas FXYD de la invencion puede comprender adicionalmente una o mas secuencias no relacionadas. Tal secuencia se denominara generalmente en el presente documento, en el contexto de una protefna de fusion o polipeptido, como un "companero de fusion". Tfpicamente, un companero de fusion es una secuencia de aminoacidos, y puede ser un polipeptido. Un companero de fusion puede 50 seleccionarse, por ejemplo, para facilitar la produccion del peptido o peptidos. Los ejemplos de dichos companeros de fusion incluyen aquellos capaces de mejorar la expresion recombinante del peptido o de un polipeptido que comprende el peptido; aquellos capaces de facilitar o ayudar a la purificacion del peptido o un polipeptido que comprende el peptido tal como una etiqueta de afinidad. Como alternativa, o ademas, se puede seleccionar un companero de fusion para aumentar la solubilidad del peptido o de un polipeptido que comprende el peptido, para 55 aumentar la inmunogenicidad del peptido, para permitir que el peptido o polipeptido que comprende el peptido se dirija a un compartimento intracelular especffico o deseado.
Los metodos para la preparacion de protefnas de fusion son conocidos en la tecnica. Tfpicamente, una protefna de fusion puede prepararse mediante tecnicas estandar tales como conjugacion qufmica, sfntesis de peptidos o medios
recombinantes. Una protefna de fusion puede incluir uno o mas enlazadores, tal como uno o mas enlazadores peptfdicos, entre las partes componentes de la protefna, tal como entre uno o mas peptidos componentes, y/o entre uno o mas companeros de fusion y/o peptidos componentes. Tales enlazadores peptfdicos pueden elegirse para permitir que las partes componentes de la protefna de fusion mantengan o alcancen una estructura secundaria y 5 terciaria apropiada.
Las protefnas FXYD de la invencion se pueden preparar por cualquier medio adecuado, tal como por aislamiento de una forma natural, por sfntesis qufmica o por medios recombinantes. El experto en la tecnica conocera los metodos estandar para dicha preparacion, tal como mediante el aislamiento de una secuencia de aminoacidos mas larga de 10 origen natural mediante escision enzimatica, tal como mediante sfntesis qufmica, tal como mediante tecnologfa de ADN recombinante.
Una protefna FXYD sintetizada se puede purificar por cromatograffa lfquida preparativa de alto rendimiento u otras tecnicas comparables disponibles en la tecnica. Si se desea, la composicion de las protefnas FXYD sinteticas se 15 puede confirmar mediante analisis de aminoacidos o secuenciacion. Adicionalmente, la secuencia de aminoacidos de un polipeptido, o cualquier parte del mismo, puede alterarse durante la sfntesis directa y/o combinarse usando metodos qufmicos con secuencias de otras protefnas, o cualquier parte de la misma, para producir un polipeptido variante.
20 La protefna FXYD de la invencion, o una protefna de fusion o polipeptido que comprende una protefna FXYD de la invencion como una parte componente de la misma puede ser un peptido soluble, una protefna de fusion o un polipeptido.
En el presente documento tambien se divulgan polinucleotidos que codifican una o mas protefnas FXYD de la 25 invencion y polinucleotidos que codifican una o mas protefnas de fusion o polipeptidos que comprenden protefnas FXYD de la invencion, como se describe en el presente documento. En ciertas formas de realizacion, pueden usarse secuencias de polinucleotidos o fragmentos de las mismas que codifican peptidos de la invencion, o protefnas de fusion o equivalentes funcionales de las mismas, en moleculas de ADN recombinante para dirigir la expresion de un polipeptido en celulas huesped apropiadas. Debido a la degeneracion inherente del codigo genetico, pueden 30 producirse otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma o una secuencia de aminoacidos funcionalmente equivalente y estas secuencias pueden usarse para clonar y expresar un polipeptido dado.
Como reconoceran los expertos en la tecnica, los polinucleotidos pueden ser monocatenarios (codificantes o antisentido) o bicatenarios, y pueden ser moleculas de ADN (genomicas, ADNc o sinteticas) o de ARN. Las 35 moleculas de ARN incluyen moleculas de ARNHn, que contienen intrones y se corresponden con una molecula de ADN de manera individual, y moleculas de ARNm, que no contienen intrones. Las secuencias codificantes o no codificantes adicionales pueden, pero no es necesario, estar presentes dentro de un polinucleotido de la presente divulgacion, y un polinucleotido puede estar unido, pero no es necesario, a otras moleculas y/o materiales de soporte. Los polinucleotidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endogena que 40 codifica una protefna FXYD o una porcion de la misma) o pueden comprender una variante, o un equivalente funcional biologico o antigenico de dicha secuencia. Las variantes de polinucleotidos pueden contener una o mas sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones, como se describe adicionalmente a continuacion, preferiblemente de manera que la inmunogenicidad del polipeptido codificado no disminuya, en relacion con una protefna FXYD nativa. El efecto sobre la inmunogenicidad del polipeptido codificado puede evaluarse generalmente 45 como se describe en el presente documento. El termino "variantes" tambien incluye genes homologos de origen xenogenico.
Para expresar un polipeptido deseado, las secuencias de nucleotidos que codifican el peptido, la protefna de fusion o el polipeptido, o equivalentes funcionales, se pueden insertar en un vector de expresion apropiado, es decir, un 50 vector que contiene los elementos necesarios para la transcripcion y la traduccion de la secuencia codificante insertada. Los metodos que son bien conocidos por los expertos en la tecnica pueden usarse para construir vectores de expresion que contienen secuencias que codifican un polipeptido de interes y elementos de control de la transcripcion y la traduccion apropiados. Estos metodos incluyen tecnicas de ADN recombinante in vitro, tecnicas sinteticas y recombinacion genetica in vivo. Dichas tecnicas se describen en Sambrook, J. et al. (1989) Molecular 55 Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., y Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York. N.Y.
Por lo tanto, la divulgacion proporciona vectores que comprenden una secuencia de polinucleotidos divulgada en el presente documento. En una forma de realizacion, el vector puede ser un vector de expresion. La divulgacion
tambien proporciona una celula huesped que comprende un polinucleotido o vector divulgado en el presente documento. Tambien se divulgan metodos para la preparacion de un peptido de la invencion, comprendiendo tal metodo cultivar una celula huesped que comprende un polinucleotido o vector de expresion divulgado en el presente documento en condiciones que conducen a la expresion del peptido codificado. En una forma de realizacion, el 5 metodo comprende ademas purificar el peptido expresado.
Las protefnas FXYD son importantes en los procesos de enfermedad. Una mutacion de FXYD2 se ha relacionado con hipomagnesemia renal humana dominante (Meij et al., 2000), mientras que la sobreexpresion de FXYD1 cerebral esta implicada en el sfndrome de Rett (Deng et al., 2007), y la sobreexpresion de FXYD5 desempena un 10 papel en la cancerogenesis. FXYD3 se sobreexpresa en tumores de organos, incluyendo de mama, pancreas y prostata, y se sobreexpresa en tumores de otros organos, incluyendo de rinon y colon, y en celulas Caco-2 no diferenciadas, lo que sugiere un papel especffico de tejido de FXYD3 en la tumorogenesis y la diferenciacion celular. El nivel de expresion de FXYD3 en los tumores del colon se correlaciona inversamente con la respuesta a la radioterapia, es decir, la respuesta es mas peor con niveles mas altos de expresion.
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Las protefnas FXYD se han implicado en la regulacion de la funcion de la bomba de Na/K. El mayor interes en la bibliograffa publicada, en terminos de una funcion reguladora, se ha centrado en FXYD1, que es unica entre las protefnas FXYD al tener residuos de aminoacidos de serina en su terminal citoplasmatico que son dianas de las protefnas cinasas, es decir, pueden fosforilarse. En este esquema, se cree que las protefnas FXYD inhiben la 20 actividad de la bomba y que esta inhibicion se alivia con la fosforilacion de FXYD1.
Sorprendentemente, como se describe en el presente documento, el presente inventor ha demostrado que la inclusion de FXYD1 en soluciones de pipeta de parche esta asociada con un aumento de la corriente de la bomba de Na/K, lo que esta en desacuerdo con la opinion predominante de que FXYD1 inhibe la bomba en los miocitos 25 cardfacos. El inventor planteo la hipotesis de que una cistefna conservada en las protefnas FXYD puede ser "reactiva" (la mayorfa de las cistefnas no lo son) y por tanto inclufa FXYD1 en soluciones de pipetas de parche y activaba un estfmulo oxidativo dependiente de la cinasa. Como se demuestra en el presente documento, la FXYD1 exogena suprimio la disminucion dependiente de cinasa en la actividad de la bomba.
30 Una investigacion adicional realizada por el inventor como se describe en el presente documento demostro que la inversion de la inhibicion de la bomba inducida por oxidacion esta mediada por la interaccion exogena de FXYD con la glutationilacion, que se ha demostrado que esta causalmente relacionada con la inhibicion de la bomba. Por lo tanto, la FXYD3 exogena suprimio la glutationilacion de la subunidad p1 de la bomba de Na/K inducida por el estfmulo oxidante (exposicion de los miocitos a la angiotensina II). El uso de un mutante de FXYD3 en el que las 35 cuatro cistefnas de FXYD3 habfan mutado a serina no logro el mismo efecto (abolicion). En estudios funcionales sobre miocitos sujetos a tension, una disminucion inducida por la angiotensina II en la corriente de la bomba de Na/K electrogena se suprimio por la FXYD3 de tipo salvaje incluida en las soluciones de pipetas. Nuevamente, este efecto no fue evidente cuando se uso el mutante de FXYD3 libre de cistefna.
40 Por consiguiente, a partir de estos estudios, se proporciona en el presente documento un metodo para modular la actividad de la bomba de Na/K poniendo en contacto la bomba con una protefna FXYD para influir en la glutationilacion de la bomba. Dependiendo de la influencia deseada en la glutationilacion de la bomba, la protefna FXYD que entra en contacto con la bomba puede estar destinada a reducir la glutationilacion de la bomba, eliminando o reduciendo de este modo el grado de inhibicion de la bomba para aumentar la actividad de la bomba, o 45 puede ser para contrarrestar la desglutationilacion de la bomba, manteniendo o exacerbando asf la inhibicion de la actividad de la bomba. Por lo tanto, se indica brevemente, cuando se desea que la actividad de la bomba se aumente (tal como al disminuir la inhibicion de la bomba inducida por glutationilacion), esto se puede lograr, por ejemplo, al poner en contacto la bomba con una protefna FXYD capaz de promover la desglutationilacion de la bomba. Los ejemplos de tales situaciones en un contexto terapeutico incluyen infarto de miocardio, ictus u otras 50 afecciones de lesion tisular que surgen de isquemia o reperfusion. Alternativamente, cuando se desea inhibir la actividad de la bomba (tal como manteniendo la bomba en un estado de inhibicion inducida por el glutation), esto se puede lograr poniendo en contacto la bomba con una protefna FXYD incapaz de promover la desglutationilacion de la bomba y desplazando la protefna FXYD nativa de tipo salvaje funcional. Como se explica en el presente documento, una protefna FXYD incapaz de (o con capacidad reducida para) la desglutationilacion de la bomba de 55 Na/K se conoce como una protefna FXYD de perdida de funcion. Los ejemplos de tales situaciones en un contexto terapeutico incluyen el tratamiento del cancer, y en particular el tratamiento del cancer de mama, prostata o pancreas donde las protefnas FXYD se expresan en exceso y, como se describe en el presente documento, pueden ayudar a las celulas cancerosas a superar los efectos inhibitorios de otro modo de la glutationilacion inducida por estres oxidativo.
En una forma de realizacion, se puede administrar un derivado de protefna FXYD sin cistefna reactiva o residuos de aminoacidos basicos adyacentes crfticos para desplazar una protefna FXYD de tipo salvaje y eliminar su proteccion de la funcion de la bomba de Na+-K+ de una carga oxidativa aumentada en las celulas cancerosas. Esto puede 5 facilitarse mediante el acoplamiento de la protefna FXYD a un peptido para dirigir selectivamente compuestos solubles en membrana a celulas cancerosas. Esto puede mejorar la eficacia y reducir los efectos no deseados en tejidos no diana. En una forma de realizacion adicional, el direccionamiento de las celulas cancerosas de la protefna FXYD puede mejorar la eficacia de los tratamientos convencionales administrados en combinacion o junto con la protefna FXYD, tal como la radioterapia o los enfoques quimioterapeuticos que tambien aumentan las cargas 10 oxidativas en las celulas.
Cada una de estas aplicaciones generales proporcionadas por la presente invencion, concretamente, la promocion de la desglutationilacion por protefnas FXYD y la inhibicion de la desglutationilacion por protefnas FXYD de perdida de funcion, se describiran ahora con mas detalle.
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Protefnas FXYD en el tratamiento del infarto - reversion de la inhibicidn de la bomba de Na+-K+ oxidativa
Como se describe en el presente documento, el infarto de miocardio esta asociado con un aumento marcado en la glutationilacion de FXYD1 (vease la Figura 1), una disminucion de su asociacion "normal" con la subunidad a de la 20 bomba de Na-K y un aumento en la asociacion de la subunidad p1 (vease la Figura 6), consistente con un papel de FXYD1 en la desglutationilacion de la subunidad pi. El inventor tambien ha descrito previamente que el infarto de miocardio esta asociado con la glutationilacion de la subunidad p1 de la bomba de Na-K y que esta glutationilacion esta relacionada causalmente con la inhibicion de la bomba.
25 Por consiguiente, la protefna FXYD administrada de forma exogena facilita la desglutationilacion de la subunidad p1 de la bomba de Na+-K+, la activacion de funcion y la reversion de los efectos adversos de la sobrecarga celular de Na+ y Ca2+. El suministro de antioxidantes exogenos o los intentos por aumentar GSH intracelular (como se ha estudiado ampliamente) puede no haber sido util ya que las tasas espontaneas de desglutationilacion, impulsadas por un potencial redox favorable solo, son muy lentas. Un efecto de tipo oxidorreductasa, basado en el residuo de 30 cistefna reactiva que cataliza la desglutationilacion identificada en la presente invencion, es mas eficaz.
En un aspecto, la divulgacion proporciona en este documento un metodo para el tratamiento o prevencion de una afeccion asociada con la inhibicion inducida por glutationilacion de una bomba de Na/K, comprendiendo el metodo poner en contacto una bomba de Na/K con una cantidad terapeuticamente eficaz de una protefna FXYD. De esta 35 manera, la protefna FXYD facilita la desglutationilacion de la bomba de Na+-K+.
Se puede usar cualquier protefna FXYD adecuada. En el contexto de la restauracion de la actividad de la bomba o la disminucion de la inhibicion de la bomba inducida por glutation, una protefna FXYD adecuada es cualquier protefna FXYD o derivado de la misma que tenga la capacidad de promover la desglutationilacion de la bomba de Na/K. 40 Como se describe en el presente documento, actualmente se conocen siete protefnas FXYD humanas, cuyos ejemplos se representan por las secuencias de aminoacidos y acidos nucleicos en las SEQ ID Nos:1-14. Se contempla cualquier protefna FXYD humana o protefnas homologas de especies no humanas, tales como otras especies de mamfferos, asf como cualquiera de sus isoformas funcionales, capaces de realizar la desglutationilacion de la bomba de Na/K para su uso en este aspecto de la divulgacion. Preferiblemente, la protefna FXYD es FXYD1, 45 FXYD3, FXYD4, o FXYD7.
La practica de la presente invencion empleara, a menos que se indique otra cosa, tecnicas convencionales de biologfa molecular (incluyendo tecnicas recombinantes), microbiologfa, biologfa celular, y bioqufmica, que estan dentro de las habilidades de la tecnica. Dichas tecnicas se ilustran completamente en la bibliograffa, tal como, 50 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3a edicion (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology", 4.sup.a edicion (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds.); y "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994). 55
La protefna FXYD puede aislarse de una fuente natural o puede producirse por medios sinteticos. Los metodos para el aislamiento de protefnas y sus precursores de fuentes de origen natural se conocen en la tecnica e incluyen metodos y referencias citadas anteriormente. Los metodos para la produccion de protefnas y sus precursores por medios sinteticos tambien se conocen en la tecnica e incluyen la sfntesis de peptidos, tal como por sfntesis qufmica,
y la expresion recombinante de protefnas y polipeptidos, tal como se describe en las referencias citadas anteriormente.
Como se describe en el presente documento (vease el Ejemplo 5), los estudios mutacionales sobre protefnas FXYD 5 expresadas en ovocitos de Xenopus identificaron una cistefna especffica "reactiva" (es decir, susceptible a la glutationilacion), implicada en la desglutationilacion de la bomba de Na+/K+ y la inversion de la inhibicion de la bomba como la cistefna correspondiente a Cys62 de FXYD1. Una protefna FXYd util en los metodos divulgados en el presente documento para promover la desglutationilacion de la bomba de Na/K tfpicamente comprende una cistefna reactiva en una posicion correspondiente a Cys62 de FXYD1. Se incluyen en la divulgacion derivados y variantes de 10 protefnas FXYD que mantienen o han impartido sobre ellos la capacidad de promover la desglutationilacion de una bomba de Na/K. Los ejemplos de derivados y variantes incluyen fragmentos de protefnas FXYD. Por ejemplo, la FXYD1 humana tiene una longitud de 92 aminoacidos, que comprende una region extracelular, una region transmembrana y una region citoplasmica. Como apreciaran los expertos en la tecnica, los fragmentos de muchas protefnas conservan las propiedades funcionales de la protefna de longitud completa o de origen natural. En las 15 circunstancias actuales, se preve que un fragmento de una protefna FXYD que es capaz de promover la desglutationilacion de una bomba de Na/K, donde el fragmento conserva una cistefna reactiva, tal como Cys62 de FXYD1, o una cistefna correspondiente a la misma, tambien sera funcional en los metodos divulgados en el presente documento. De manera similar, los fragmentos de otras protefnas FXYD en las que se conserva una cistefna reactiva tambien estan dentro del alcance de la divulgacion. La reduccion del tamano de la protefna FXYD de tal 20 manera puede ser beneficiosa, por ejemplo, debido a una mayor facilidad de fabricacion en comparacion con una entidad terapeutica mas larga. En un ejemplo, la protefna FXYD puede ser un fragmento de FXYD resultante de la eliminacion de algunos, la mayorfa o la totalidad del dominio extracelular de la protefna de tipo salvaje. En otro ejemplo, la protefna FXYD puede ser un fragmento de FXYD resultante de la eliminacion de parte del dominio citoplasmico entre la cistefna reactiva cerca del segmento transmembrana identificado en el presente documento y el 25 extremo carboxilo terminal.
Las protefnas FXYD utiles tambien incluyen aquellas que son derivados de protefnas de tipo salvaje e incluyen derivados que les han impartido una capacidad o una capacidad aumentada para promover la desglutationilacion de una bomba de Na/K. Un ejemplo de tal derivado se ilustra a continuacion.
30
Los estudios mutacionales sobre protefnas FXYD indican que los aminoacidos basicos adyacentes a la cistefna reactiva, en particular los aminoacidos basicos en las posiciones correspondientes a Arg61 y Lys63 de FXYD1, incluyen en la glutationilacion de las protefnas FXYD y, por lo tanto, en la capacidad de una protefna FXYD para promover la desglutationilacion de una bomba de Na/K. Se demuestra en el presente documento que la protefna 35 FXYD2 de tipo salvaje, por ejemplo, es incapaz de promover la desglutationilacion de una bomba de Na/K. Se cree que esta incapacidad se debe, al menos en parte, a la ausencia de aminoacidos basicos adyacentes a la cistefna, que en presencia de aminoacidos basicos, sera una cistefna reactiva. FXYD2 incluye el aminoacido no basico glicina en una posicion correspondiente a Lys63 de FXYD1. Se preve que la mutacion de esa glicina en un aminoacido basico, tal como lisina o arginina, imparta a la protefna FXYD2 variante resultante una capacidad de promover la 40 desglutationilacion de la bomba de Na/K.
Las protefnas FXYD son lipfdicas y, por lo tanto, solubles en membrana. Por lo tanto, se puede usar la administracion de protefnas FXYD en el contexto de la lesion isquemica aguda, por ejemplo, FXYD1 en el tratamiento de, por ejemplo, infarto y lesion por isquemia-reperfusion. Las protefnas pueden administrarse por via 45 intravenosa, o infundirse directamente en una arteria relacionada con el infarto, por ejemplo, en el contexto de una intervencion aguda con procedimientos de angioplastia. En otras formas de realizacion, se puede administrar una infusion de una protefna FXYD en una escala de tiempo de minutos a horas.
En algunas formas de realizacion, los fragmentos de protefnas FXYD que conservan la capacidad de asociarse con 50 la bomba de Na+-K+ pueden ser utiles. Dichas protefnas FXYD tendrfan preferiblemente propiedades optimas en terminos de modulacion del estado de glutationilacion de la bomba de Na+-K+, asf como la capacidad para insertarse en membranas y asociarse con protefnas diana que se anticipa que son utiles en los metodos divulgados en el presente documento. Ademas, el tamano de la protefna FXYD puede reducirse eliminando una porcion sustancial del dominio extracelular, asf como una porcion sustancial del dominio citoplasmico.
55
En algunas formas de realizacion, las protefnas FXYD de la presente invencion pueden producirse o conjugarse con protefnas, polipeptidos, oligopeptidos, anticuerpos o fragmentos de los mismos, partfculas radiactivas, nanopartfculas o micropartfculas.
Proteinas FXYD en el tratamiento del cancer - inhibicion oxidativa de la bomba de Na+-K+
Se sabe que muchos tejidos cancerosos, tales como tejidos de cancer de mama y cancer de prostata, tienen altos niveles de estres oxidativo y han desarrollado defensas antioxidantes aumentadas, especfficamente del sistema de 5 oxidorreductasa citosolica. Estos son dianas establecidas en el tratamiento del cancer. A traves de la identificacion en el presente documento de la capacidad de las proteinas FXYD para promover la desglutationilacion de la bomba de Na/K, reduciendo de este modo la inhibicion de la actividad de la bomba en condiciones de estres oxidativo, el presente inventor ha identificado un vinculo entre las defensas antioxidantes de las celulas cancerosas y la sobreexpresion aparente de proteinas FXYD. La interrupcion de ese sistema de defensa antioxidante en la celula 10 cancerosa, al interrumpir la capacidad de la protefna FXYD para promover la desglutationilacion de la bomba, se propone en el presente documento como un metodo para inhibir el crecimiento, la diseminacion o la metastasis de las celulas cancerosas.
Como se divulga en el presente documento, la demostracion de que un residuo de cistefna en particular es "reactivo" 15 y desempena un papel en la reversion de la inhibicion de la bomba de Na-K oxidativa indica una ventaja de supervivencia para las celulas cancerosas para sobreexpresar proteinas FXYD y permite el direccionamiento especffico de ese papel dentro de las defensas antioxidantes de las celulas.
Por consiguiente, tambien se divulga en el presente documento un metodo para tratar el cancer, comprendiendo el 20 metodo poner en contacto una bomba de Na/K de una celula cancerosa con una cantidad terapeuticamente eficaz de una protefna FXYD de perdida de funcion. De esta manera, la protefna FXYD de perdida de funcion facilita el reemplazo de una protefna FXYD endogena que se considera que permite la desglutationilacion de la bomba de Na+-K+, permitiendo de este modo que la bomba de Na/K conserve la actividad a pesar del estres oxidativo tfpico de las celulas cancerosas.
25
Como se usa en el presente documento, el termino "protefna FXYD de perdida de funcion" se refiere a cualquier protefna FXYD que no tenga la capacidad de promover la desglutationilacion de la bomba de Na/K o en la que esa capacidad se reduce en comparacion con una protefna FXYD de tipo salvaje. Esa incapacidad o incapacidad relativa puede ser una incapacidad natural de la protefna FXYD para promover la desglutationilacion, tal como se ilustra en 30 el presente documento por FXYD2, o puede deberse a una o mas mutaciones producidas en la protefna FXYD.
Como ejemplo, se demuestra en el presente documento que una cistefna reactiva, correspondiente a cys62 de FXYD1, esta implicada en la capacidad de una protefna FXYD para estar glutationilada y, por lo tanto, en la capacidad de la protefna FXYD para promover la desglutationilacion de la bomba de Na/K.
35
Como otro ejemplo, se demuestra en el presente documento que los aminoacidos basicos adyacentes a una cistefna reactiva correspondiente a cys62 de FXYD1, tales como Arg61 y Lys63 en FXYD1, son influyentes en la reactividad de la cistefna y por lo tanto, en la capacidad de una protefna FXYD para estar glutationilada y, por tanto, en la capacidad de la protefna FXYD para promover la desglutationilacion de la bomba de Na/K.
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Con referencia a la Figura 10, se puede observar que FXYD2, FXYD5 y FXYD6 nativas carecen de al menos una de una cistefna reactiva correspondiente a cys62 de FXYD1 y aminoacidos basicos adyacentes a esa cistefna reactiva. Como se muestra en el Ejemplo 6, FXYD2 no tiene efecto en la funcion de la bomba de Na+-K+. Por lo tanto, se contempla que FXYD5 y FXYD6 carecerfan de la capacidad de promover la desglutationilacion de la bomba de Na+- 45 K+.
Se puede crear, por lo tanto, una protefna FXYD de perdida de funcion por mutacion de uno o mas de los aminoacidos basicos adyacentes para la cistefna reactiva a un aminoacido no basico.
50 La protefna FXYD de perdida de funcion puede o no conservar otras funciones biologicas o caracterfsticas de una protefna FXYD.
Las proteinas FXYD generalmente se describen en el presente documento, tal como en la seccion que describe las proteinas utiles en el metodo divulgado en el presente documento para la prevencion o tratamiento de infarto de 55 miocardio, ictus y reperfusion. Se entendera que las proteinas FXYD de perdida de funcion previstas como utiles para inhibir la desglutationilacion de la bomba de Na/K, tal como en el tratamiento del cancer, incluyen proteinas FXYD, derivados y variantes de las mismas que se describen en la seccion que detalla las proteinas FXYD funcionales (es decir, aquellas capaces de promover la desglutationilacion de una bomba de Na/K) con la condicion de que las proteinas FXYD de perdida de funcion no tengan la capacidad de promover la desglutationilacion de la
bomba de Na/K o en las que esa capacidad se reduce en comparacion con una protefna FXYD de tipo salvaje.
En el caso de una protefna FXYD de perdida de funcion mutante, cualquier reduccion de la capacidad para promover la desglutationilacion de la bomba de Na/K en comparacion con la protefna FXYD de tipo salvaje esta 5 incluida en el termino, aunque preferiblemente habra una reduccion de esa capacidad mayor de aproximadamente el 50 %. Mas preferiblemente, la reduccion sera mayor de aproximadamente el 60 %, o mayor de aproximadamente el 70 % o mayor de aproximadamente el 80 %. En las formas de realizacion mas preferidas, la reduccion de la capacidad es sustancialmente completa, tal como mayor de aproximadamente el 90 %. Aun mas preferiblemente, la protefna FXYD de perdida de funcion presentara una ausencia completa de la capacidad para promover la 10 desglutationilacion de la bomba de Na/K, que para fines practicos se considera una reduccion mayor de aproximadamente el 95 % en comparacion con una protefna FXYd de tipo salvaje.
La identificacion del sitio FXYD reactivo permite un enfoque utilizando una protefna FXYD de "perdida de funcion", tal como las protefnas FXYD que carecen de una cistefna reactiva o uno o mas aminoacidos basicos adyacentes a 15 la cistefna que, cuando se administran, reemplazan las FXYD nativas. Se anticipa que una protefna de "perdida de funcion" sera mas eficaz que un efecto que se desarrolla a lo largo de los dfas con tecnicas convencionales, como el silenciamiento de genes, que puede dar tiempo a que se desarrollen mecanismos compensatorios.
Se propone que una aplicacion de "perdida de funcion" sea util en el tratamiento del cancer mediante el desarrollo de 20 una molecula de "perdida de funcion" terapeutica, tal como una molecula con el sitio activo eliminado por mutacion de la cistefna o residuos de aminoacidos basicos adyacentes crfticos (veanse los Ejemplos 5 y 6). Tal molecula puede desplazar la FXYD3 de tipo salvaje y reducir o eliminar su efecto "tipo oxidorreductasa". Como consecuencia, se esperara que el estres oxidativo intrfnseco en una celula cancerosa pueda causar la inhibicion de la bomba de Na+-K+ y disminuir la viabilidad celular. Los datos presentados en el presente documento (veanse el Ejemplo 5 y la 25 Figura 4) indican que es posible tal desplazamiento y perdida de funcion.
En general, los estudios en animales indican que la desactivacion de los genes FXYD no es fatal y solo se observan pequenas anomalfas fenotfpicas. Esto sugiere que las protefnas FXYD son de particular importancia en condiciones de estres oxidativo y puede no ser perjudicial administrar un mutante FXYD de "perdida de funcion" incluso si al 30 hacerlo la funcion de FXYD en tejidos no diana se elimina de forma transitoria. Por otro lado, los efectos agudos de administrar un mutante de FXYD de "perdida de funcion" pueden compensarse con menos facilidad que los efectos a largo plazo con adaptaciones que se han desarrollado antes del nacimiento, y se debe considerar un direccionamiento selectivo de los tejidos y/o la proteccion del tejido diana.
35 Como se describe en el presente documento (vease el Ejemplo 5), los estudios mutacionales sobre protefnas FXYD expresadas en ovocitos de Xenopus identificaron una cistefna especffica "reactiva" (es decir, susceptible a la glutationilacion), implicada en la desglutationilacion de la bomba de Na+/K+ y la inversion de la inhibicion de la bomba como la cistefna correspondiente a Cys62 de FXYD1.
40 Por consiguiente, en algunas formas de realizacion, la cistefna correspondiente a Cys62 de FXYD1 en protefnas FXYD de la presente invencion puede mutarse a cualquier otro residuo, de modo que la protefna FXYD no afecte a la glutationilacion de la bomba de Na+/K+. En formas de realizacion preferidas, la cistefna reactiva puede mutarse a cualquiera de alanina, arginina, asparagina, aspartato, glutamina, glutamato, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano o valina.
45
Como se describe en el presente documento (vease el Ejemplo 6), los estudios de mutacion en las protefnas FXYD indican que los aminoacidos basicos adyacentes a la cistefna reactiva, en particular los aminoacidos basicos en las posiciones correspondientes a Arg61 y Lys63 de FXYD1 tambien son influyentes en la glutationilacion de protefnas FXYD.
50
Por consiguiente, en algunas formas de realizacion, al menos uno de los aminoacidos basicos correspondientes a Arg61 y Lys63 de FXYD1 en las protefnas FXYD de la presente invencion puede mutar a cualquier aminoacido no basico. El aminoacido no basico puede ser uno cualquiera de alanina, asparagina, aspartato, glutamina, glutamato, glicina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano o valina.
55
En algunas formas de realizacion, las protefnas FXYD de la presente invencion pueden producirse o conjugarse con protefnas, polipeptidos, oligopeptidos, anticuerpos o fragmentos de los mismos, partfculas radiactivas, nanopartfculas o micropartfculas.
Tambien se preve que una protefna FXYD pueda asociarse con un compuesto que se dirige especfficamente a los tejidos cancerosos, basandose en las propiedades especfficas del tumor, pero no en los tejidos no diana. Por ejemplo, un enfoque desarrollado para dirigirse al cancer de prostata con un compuesto que se espera que sea toxico para todas las celulas del cuerpo (tapsigargina) puede adaptarse para su uso con los mutantes de FXYD de 5 "perdida de funcion". Con este enfoque, la protefna FXYD se acopla a un peptido soluble en agua (y, por lo tanto, impermeable a la membrana (por ejemplo, HSSKLQ) para crear un profarmaco FXYD que esta inactivo porque no puede cruzar las membranas celulares. El peptido esta disenado para ser un sustrato selectivo para las proteasas especfficas del cancer de prostata (por ejemplo, la serina proteasa de tipo quimotripsina, el antfgeno especffico de prostata (ampliamente conocido de la "prueba de PSA") secretado por las celulas cancerosas y solo 10 enzimaticamente activo es el lfquido tisular que rodea las celulas. Cuando el peptido HSSKLQ se escinde del profarmaco FXYD, la molecula lipofila activa puede entrar en la membrana celular y luego modular la actividad de la bomba de Na+-K+. Si el mutante activo de FXYD es un sustrato importante para las propias proteasas relevantes, puede ser posible modificar el mutante de FXYD con sustituciones de aminoacidos (por ejemplo, de serinas) para que sea resistente a la proteasa.
15
En otra forma de realizacion, la inhibicion de los efectos de FXYD endogenos puede lograrse dirigiendose a la cistefna reactiva en el dominio citosolico de una protefna FXYD. Las mutaciones de perdida de funcion mencionadas anteriormente pueden introducirse o sintetizarse en un fragmento peptfdico del dominio citosolico de una protefna FXYD para generar un bloqueador peptfdico. Estos bloqueadores de peptidos pueden ser capaces de atravesar la 20 membrana cuando se unen al peptido tat, conocido en la tecnica para administrar otros compuestos bloqueadores en las celulas.
Como se describe en el presente documento, el estres oxidativo y el papel de FXYD3 como una "membrana- oxidorreductasa" parece ser el enlace comun entre FXYD3 y la bomba de Na+-K+ como dianas terapeuticas en el 25 tratamiento del cancer. Sobre esa base, se espera que una intervencion terapeutica que mejore el estres oxidativo pueda aumentarse con la inhibicion de la bomba de Na+-K+. De acuerdo con esto, la ouabafna aumenta el dano por irradiacion a lfneas celulares de tumores humanos, pero no las lfneas celulares normales, y se ha sugerido que los glucosidos cardfacos podrfan mejorar el fndice terapeutico de la radioterapia (Mijatovic et al., 2007). Dado que gran parte del efecto de la radioterapia esta mediado por el aumento del estres oxidativo que induce, una molecula de 30 "perdida de funcion" disenada para eliminar el FXYD3 podrfa ser particularmente eficaz para mejorar el beneficio de la radioterapia. Sin embargo, una molecula de "perdida de funcion" tambien podrfa ser un adyuvante util para los agentes quimioterapeuticos, ya que muchos de ellos tambien aumentan el estres oxidativo.
Regimen de tratamiento
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El medico tratante puede determinar el regimen de tratamiento mas adecuado para cualquier paciente en particular y dependera de una diversidad de factores incluyendo: el trastorno que se trata y la gravedad del trastorno; actividad del compuesto o agente empleado; la composicion empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el tiempo de administracion; la via de administracion; la tasa de secuestro del agente o 40 compuesto; la duracion del tratamiento; farmacos usados en combinacion o coincidentes con el tratamiento, junto con otros factores relacionados bien conocidos en medicina.
Los presentes inventores preven que puede experimentarse una alteracion clfnicamente significativa de la glutationilacion de la bomba de Na+-K+ si se administraran protefnas FXYD a pacientes con una afeccion asociada 45 con la inhibicion oxidativa de la bomba de Na+/K+.
En un aspecto de la presente invencion, la administracion de una o mas protefnas FXYD puede ser como un "complemento", en el que un paciente puede tratarse con un farmaco convencional. Por ejemplo, una protefna FXYD puede administrarse antes, durante o despues de un tratamiento con, por ejemplo, con un agente quimioterapeutico 50 o radioterapia. En consecuencia, se apreciara que en este contexto el termino "complemento" se refiere a un entero terapeutico adicional (la protefna FXYD); no significa que la protefna FXYD deba anadirse como el ultimo medicamento. El orden y la composicion de los farmacos especfficos y las clases de farmacos en la terapia de combinacion pueden ser determinados por el experto en la tecnica, y pueden incluir, por ejemplo, cuando el regimen terapeutico implica la administracion de multiples clases de farmacos, las protefnas FXYD pueden administrarse en 55 cualquier etapa durante el regimen.
Como un ejemplo adicional de un regimen de tratamiento del metodo divulgado en el presente documento, el estado de un paciente que sufre un infarto de miocardio puede estabilizarse, al menos parcialmente, antes de la administracion de una o mas protefnas FXYD. Ademas, el estado de un paciente se puede estabilizar, al menos
parcialmente, antes del comienzo de un metodo divulgado en el presente documento. Cualquiera de estos regfmenes de tratamiento puede hacer referencia al primer estabilizador de un paciente.
Como un ejemplo adicional de un regimen de tratamiento, una protefna FXYD puede ser el primer farmaco que se 5 administra en el tratamiento del infarto de miocardio sin ninguna medicacion o estabilizacion previa. Las protefnas FXYD propuestas para la presente invencion pueden administrarse como composiciones terapeutica o preventivamente. En una aplicacion terapeutica, las composiciones se administran a un paciente que ya tiene una afeccion asociada con la inhibicion oxidativa de la bomba de Na+/K+, en una cantidad suficiente para tratar al paciente de manera eficaz.
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El nivel de dosis terapeuticamente eficaz para cualquier paciente en particular dependera de una diversidad de factores incluyendo: el trastorno que se trata y la gravedad del trastorno; actividad del compuesto o agente empleado; la composicion empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el tiempo de administracion; la via de administracion; la tasa de secuestro del agente o compuesto; la duracion del 15 tratamiento; farmacos usados en combinacion o coincidentes con el tratamiento, junto con otros factores relacionados bien conocidos en medicina. Un experto en la tecnica podrfa determinar, mediante experimentacion rutinaria, una cantidad eficaz de la protefna FYXD, y otros agentes cuando sea apropiado, que se requeriran para tratar la afeccion. Generalmente, se espera que una dosificacion eficaz este en el intervalo de aproximadamente 0,00001 mg a aproximadamente 1000 mg por kg de peso corporal por 24 horas; tfpicamente, en el intervalo de 20 aproximadamente 0,0001 mg a aproximadamente 1000 mg por kg de peso corporal por 24 horas; tfpicamente, de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 750 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 500 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 500 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 250 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 250 mg por kg de 25 peso corporal por 24 horas. Mas tfpicamente, se espera que una dosis eficaz este en el intervalo de aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 200 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 100 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 50 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de aproximadamente 1,0 mg a aproximadamente 25 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de aproximadamente 5,0 mg a aproximadamente 50 mg por kg de peso 30 corporal por 24 horas; de aproximadamente 5,0 mg a aproximadamente 20 mg por kg de peso corporal por 24 horas; de aproximadamente 5,0 mg a aproximadamente 15 mg por kg de peso corporal por 24 horas. Como alternativa, la dosificacion eficaz puede ser de hasta aproximadamente 500 mg/m2. Generalmente, se espera que una dosificacion eficaz este en el intervalo de aproximadamente 25 a aproximadamente 500 mg/m2, preferiblemente de aproximadamente 25 a aproximadamente 350 mg/m2, mas preferiblemente de aproximadamente 25 a 35 aproximadamente 300 mg/m2, aun mas preferiblemente de aproximadamente 25 a aproximadamente 250 mg/m2, incluso mas preferiblemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 250 mg/m2, y todavfa incluso mas preferiblemente de aproximadamente 75 a aproximadamente 150 mg/m2.
En algunas formas de realizacion, el tratamiento comenzara tan pronto como sea posible despues de un infarto o un 40 ictus o aproximadamente al mismo tiempo que la reperfusion. Por ejemplo, el tratamiento puede iniciarse junto con una terapia convencional para facilitar la reperfusion, tal como la angioplastia. En otras formas de realizacion, el tratamiento comenzara en aproximadamente 15 minutos a una hora, o de aproximadamente una hora a aproximadamente tres horas, o de aproximadamente tres horas a aproximadamente seis horas, o de aproximadamente seis horas a aproximadamente nueve horas, o de aproximadamente nueve horas a 45 aproximadamente 12 horas, o de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 15 horas, o de aproximadamente 15 horas a aproximadamente 18 horas, o de aproximadamente 18 horas a aproximadamente 21 horas, o de aproximadamente 21 horas a aproximadamente 24 horas despues de un infarto, ictus o lesion por reperfusion.
Ademas, sera evidente para un experto en la tecnica que la cantidad y el espaciado optimos de las dosificaciones 50 individuales y, cuando se usa la terapia de combinacion, la cantidad y el espaciado optimos de administracion de los diversos agentes de la terapia de combinacion, se determinaran por la naturaleza y extension de la enfermedad o patologfa que se trata, la forma, la ruta y el sitio de administracion, y la naturaleza del individuo en particular que se trata. Ademas, dichas condiciones optimas pueden determinarse mediante tecnicas convencionales.
55 Tambien sera evidente para un experto en la tecnica que el transcurso optimo de tratamiento, tal como el numero de dosis de la composicion o composiciones administradas al dfa durante un numero definido de dfas, puede determinarse por los expertos en la tecnica usando el transcurso convencional de las pruebas de determinacion de tratamiento.
Composiciones farmaceuticas
En general, las composiciones adecuadas pueden prepararse de acuerdo con metodos que son conocidos por los expertos en la tecnica y, por consiguiente, pueden incluir un vehfculo, diluyente, excipiente y/o adyuvante 5 farmaceuticamente aceptable.
Estas composiciones se pueden administrar por rutas estandar. En general, las composiciones pueden administrate por via parenteral (por ejemplo, intravenosa, intraespinal, subcutanea o intramuscular). Preferiblemente la administracion es por via parenteral.
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Los vehfculos, diluyentes, excipientes y adyuvantes deben ser "aceptables" en terminos de ser compatibles con los otros ingredientes de la composicion, y no ser perjudiciales para el receptor de los mismos. Los ejemplos de vehfculos o diluyentes farmaceuticamente aceptables son agua desmineralizada o destilada; solucion salina; aceites de origen vegetal tales como aceite de cacahuete, aceite de cartamo, aceite de oliva, aceite de semilla de algodon, 15 aceite de mafz, aceite de sesamo, aceite de manf o aceite de coco; aceites de silicona, incluyendo polisiloxanos, tales como metil polisiloxano, fenil polisiloxano y metilfenil polisolpoxano; siliconas volatiles; aceites minerales tales como parafina lfquida, parafina blanda o escualano; derivados de celulosa tales como metilcelulosa, etilcelulosa, carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa sodica o hidroxipropilmetilcelulosa; DMSO, N,N-dimetilacetamida (DMA), alcanoles inferiores, por ejemplo, etanol o isopropanol; aralcanoles inferiores; polialquilenglicoles inferiores o 20 alquilenglicoles inferiores, por ejemplo polietilenglicol, polipropilenglicol, etilenglicol, propilenglicol, 1,3-butilenglicol o glicerina; esteres de acidos grasos tales como palmitato de isopropilo, miristato de isopropilo u oleato de etilo; polivinilpirrona; agar; carragenina; goma de tragacanto o goma de acacia y vaselina. Tfpicamente, el vehfculo o vehfculos formaran del 10 % al 99,9 % en peso de las composiciones.
25 La composicion puede incluir agentes que aumentan la biodisponibilidad o la duracion terapeutica del compuesto o compuestos activos.
Las composiciones de la invencion pueden estar en una forma adecuada para administracion parenteral, tal como inyeccion o infusion subcutanea, intramuscular o intravenosa.
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Para la administracion como solucion o suspension inyectable, los diluyentes o vehfculos no toxicos parenteralmente aceptables pueden incluir solucion de Ringer, solucion salina isotonica, solucion salina tamponada con fosfato, etanol y 1,2 propilenglicol.
35 Los adyuvantes tfpicamente incluyen emolientes, emulsionantes, agentes espesantes, conservantes, bactericidas y agentes tamponantes.
Dado que las protefnas FXYD son solubles en lfpidos, las composiciones tambien pueden administrarse en forma de liposomas. Los liposomas generalmente se derivan de fosfolfpidos u otras sustancias lipfdicas, y estan formados por 40 cristales lfquidos hidratados mono o multilamelares que se dispersan en un medio acuoso. Se puede usar cualquier lfpido no toxico, fisiologicamente aceptable y metabolizable capaz de formar liposomas. Las composiciones en forma de liposomas pueden contener estabilizantes, conservantes, excipientes y similares. Los lfpidos preferidos son los fosfolfpidos y las fosfatidilcolinas (lecitinas), tanto naturales como sinteticos. Los metodos para formar liposomas son conocidos en la tecnica, y en relacion con esto, se hace referencia especffica a: Prescott, Ed., Methods in Cell 45 Biology, Volume XIV, Academic Press, Nueva York, N. Y. (1976), pag. 33 y posteriores.
La presente invencion se describira ahora con mayor detalle con referencia a los siguientes ejemplos especfficos, que no deben interpretarse como limitantes de ningun modo del alcance de la invencion.
50 Ejemplos
Ejemplo 1: FXYD1 se somete a glutationilacion por estfmulos oxidativos acoplados al receptor y en condiciones fisiopatologicas
55 Para determinar si FXYD1 tiene residuos de cistefna reactivos susceptibles a la glutationilacion, los miocitos se cargaron con GSH marcado con biotina (biotina-GSH). Se lisaron y las protefnas glutationiladas marcadas con biotina se precipitaron usando perlas de estreptavidina. El inmunoprecipitado se inmunotransfirio con un anticuerpo FXYD1. La Figura 1A muestra que FXYD1 fue facilmente detectable en el lisado celular total, consistente con su expresion abundante en los miocitos cardfacos. Tambien se detecto en la subfraccion glutationilada marcada con
biotina, pero no en el control de inmunoprecipato de IgG no inmune (negativo). La exposicion de los miocitos a peroxinitrito 100 pM (ONOO') durante 10 minutos antes de la lisis aumento sustancialmente la cantidad de FXYD1 en la subfraccion de la protefna glutationilada (Figura 1B), pero no tuvo efecto en la deteccion de FXYD1 en el lisado celular total. La Figura 1A muestra que la FXYD1 glutationilada marcada con biotina no se detecto cuando el lisado 5 se incubo con 1 mmol/l de DTT antes de la precipitacion con estreptavidina. Esta sensibilidad a 1 mmol/l de DTT es compatible con un enlace disulfuro mixto entre FXYD1 y GSH (Chow et al., 1992).
Para examinar si una senal oxidativa acoplada al receptor podrfa aumentar la glutationilacion de FXYD1 desde la glutationilacion inicial se detecto mediante inmunoprecipitacion FXYD1 e inmunotransferencia con un anticuerpo 10 contra un epftopo de cistefna glutationilada (anticuerpo GSH). La exposicion de los miocitos a Ang II, que se sabe que activa la NADPH oxidasa cardfaca (White et al., 2009), aumento la glutationilacion de FXYD1 (Figura 1C). De manera similar, el activador directo de la adenil ciclasa forskolina, que recientemente se ha demostrado que activa la NADPH oxidasa cardfaca y aumenta la glutationilacion de la subunidad p1 de la bomba de Na+-K+ (Figtree et al. 2009; White et al, 2010), aumento la glutationilacion de FXYD1. Esto se suprimio cuando los miocitos se incubaron 15 con superoxido dismutasa pegilada permeable a la membrana (SOD; Figura 1D) para disolver el superoxido.
Para determinar si las afecciones fisiopatologicas conocidas por estar asociadas con un aumento del estres oxidativo pueden inducir la glutationilacion de FXYD1, se examino el miocardio de un modelo de infarto de oveja (Figtree et al., 2009). Como se muestra en la Figura 1E, FXYD1 del miocardio en la zona de infarto y peri-infarto 20 mostro un aumento de glutationilacion en comparacion con el miocardio normal.
Ejemplo 2: FXYD1 reduce la modificacion oxidativa de la subunidad de la bomba de Na+-K+, y suprime la inhibicidn de la bomba inducida por oxidante
25 Las subunidades a1 y p1 de la bomba de Na+-K+ de Xenopus se sobreexpresaron con FXYD1 de perro en ovocitos de Xenopus. Los ovocitos se inyectaron con biotina-GSH para permitir la deteccion de la glutationilacion. La Figura 2A muestra transferencias Western de microsomas cargados directamente en geles en los carriles 7-12 y/o inmunoprecipitados con perlas de estreptavidina en los carriles 1-6. La oxidacion se habfa inducido por inyeccion de ovocitos con ONOO- como se indica. Los carriles 7-12 muestran que FXYD1 se detecto en microsomas de ovocitos 30 inyectados con ARNc, pero no se detecto en microsomas de ovocitos no inyectados. Como se muestra en las inmunotransferencias en los carriles 7-12 en los paneles inferiores, la mayorfa de las subunidades p1 se glucosilaron en el nucleo despues de 2 dfas de expresion, lo que refleja la sfntesis continua del ARNc inyectado. Sin embargo, tambien aparecio una poblacion de subunidades totalmente glucosiladas. Consistente con una baja expresion endogena de subunidades de ovocitos (Geering, 1991), apenas fue detectable una senal para subunidades p1 en 35 microsomas de ovocitos no inyectados.
De acuerdo con los resultados obtenidos en los miocitos cardfacos, la inmunotransferencia de la subfraccion glutationilada en los carriles 1-6 muestra que ONOO’ indujo la glutationilacion de la FXYD1 expresada (Figura 2A, 2B). Dado que la glutationilacion de la subunidad p1 causa inhibicion de la bomba de Na+-K+ (Figtree et al., 2009), se 40 examino el efecto de FXYD1 en la glutationilacion de la subunidad p1 sobre la funcion. Se midio la corriente maxima de la bomba de Na+-K+ electrogena (Imax) en los ovocitos de Xenopus que sobreexpresan las subunidades a1 y p1 de la bomba de Na+-K+ con o sin expresion de FXYD1. ONOO‘ indujo una disminucion en Imax como se muestra en la Figura 2C. La coexpresion de FXYD1 no tuvo efecto en Imax. Sin embargo, como se muestra en la Figura 2C, suprimio la disminucion inducida por ONOO-, en paralelo con el efecto de la coexpresion de FXYD1 en la 45 glutationilacion de la subunidad p1 mostrada en los paneles A y B.
FXYD1 se inserta facilmente en las bicapas de lfpidos de una composicion que imita las membranas sarcolemicas y se alinea en la orientacion correcta (Crowell et al., 2003). Para examinar si FXYD1 exogena tiene un efecto funcional sobre la inhibicion de la bomba de Na+-K+ inducida por una senal de oxidante en los miocitos cardfacos, la corriente 50 de la bomba de Na+-K+ electrogena (Ip, identificada como la corriente de la membrana sensible a la ouabafna) se midio en los miocitos ventriculares en pinzamiento de tension con pipetas de parche de punta ancha para facilitar la perfusion del compartimento intracelular. Las soluciones de pipetas de parche inclufan Na+ 10 mM, una concentracion cercana a los niveles intracelulares fisiologicos e inclufan FXYD1 recombinante 500 nM o estaban libres de FXYD1. La forskolina, incluida en el superfusado despues del establecimiento de la configuracion de 55 celulas completas, se uso para inducir una senal de oxidante (Figtree et al, 2009). Como se muestra en la Figura 2D, la inclusion de FXYD1 en las soluciones de pipeta de parche suprimio una disminucion inducida por forskolina en Ip.
Ejemplo 3: FXYD3 recombinante se asocia con la subunidad a1 de la bomba de Na+-K+ y desplaza FXYD1 nativa en los miocitos cardiacos
La asociacion de FXYD1 exogeno con subunidades de bomba de Na+-K+ puede mediar el efecto de FXYD1 que se muestra en la Figura 2D. Sin embargo, esto es diffcil de verificar mediante tecnicas de inmunodeteccion ya que la FXYD1 exogena no se puede distinguir de la FXYD1 nativa. Los aminoacidos conservados en todos los dominios 5 transmembrana de FXYD, incluidas dos glicinas, median su interaccion con la bomba de Na+-K+ (Morth et al, 2007, Shinoda, 2009). Una protema FXYD que no es nativa de los miocitos cardfacos se probo para determinar la asociacion con bombas de Na+-K+ sarcolemicas. Los miocitos se expusieron a 500 nMol/l de FXYD3 humana recombinante durante 15 min. La Figura 3A muestra que se coinmunoprecipito con la subunidad a1 de la bomba nativa. Tambien se examino si la FXYD3 exogena podna estar glutationilada. Los miocitos incubados con FXYD3 10 durante 15 minutos se expusieron a soluciones de control o soluciones que conteman ONOO". Como se muestra en la Figura 3A, FXYD3 se sometio a glutationilacion al inicio, como se indica por la deteccion de FXYD3 en el lisado celular extrafdo por pull-down con un anticuerpo contra GSH. La glutationilacion se aumento por ONOO- A continuacion, se probo si la FXYD3 exogena desplaza a la FXYD1 nativa. La Figura 3B muestra que la exposicion de los miocitos a FXYD3 disminuyo notablemente la co-inmunoprecipitacion de FXYD1 con la subunidad a1 de la 15 bomba de Na+-K+.
Ejemplo 4: FXYD3 reduce la glutationilacion de la subunidad de la bomba de Na+-K+ en los miocitos cardlacos y suprime la inhibicion de la bomba inducida por Ang II
20 Las 4 cistemas en FXYD3 se mutaron a serina. Dos de estas cistemas estan en el segmento transmembrana y dos estan en el dominio citoplasmico. La mutacion de las cistemas FXYD3 en el dominio de la membrana no afecta a la asociacion con la subunidad a1 de la bomba de Na+-K+ que esta mediada por Gly41 transmembrana, conservada en todas las protemas FXYD (Arimochi et al., 2007). La Figura 3B muestra que la exposicion de los miocitos a FXYD3 libre de Cys indujo una disminucion en la co-inmunoprecipitacion de FXYD1 endogena con la subunidad a1 de la 25 bomba de Na+-K+, similar a la inducida por FXYD3 de tipo salvaje, lo que indica que FXYD3 libre de Cys desplaza la FXYD1 nativa.
Para examinar si las protemas FXYD3 afectan a la glutationilacion de la subunidad p1 de la bomba de Na+-K+, los miocitos incubados con FXYD3 no tuvieron un efecto significativo en la glutationilacion inicial de la subunidad p1. 30 Como se muestra en la Figura 3C, la incubacion de miocitos con FXYD3 no tuvo un efecto significativo en la glutationilacion inicial de la subunidad p1. Sin embargo, suprimio el aumento de la glutationilacion inducida por ONOO- En contraste, la preincubacion con la protema recombinante mutante FXYD3 Cysless no tuvo ningun efecto sobre la glutationilacion inducida por ONOO’. Se realizaron experimentos similares utilizando Ang II para inducir una senal de oxidante. De nuevo, como se muestra en la Figura 3D, la preincubacion con FXYD3 suprimio un aumento 35 inducido por Ang II en la glutationilacion, mientras que la protema mutante Cysless en realidad aumento la glutationilacion, consistente con el reemplazo de la protema FXYD1 nativa (que contema Cys) indicada en la Figura 3B.
En estudios de la bomba de Na+-K+ funcionales paralelos, se midio la Ip en miocitos con pinzamiento de parche. 40 Como se muestra en la Figura 3E, Ang II indujo una disminucion en Ip que se suprimio por la inclusion de FXYD3 en la solucion de pipeta de parche. En contraste, FXYD3 Cysless no tuvo efecto en la disminucion inducida por Ang II. Tambien se examino lo contrario y se encontro que FXYD3 afecta a la desglutationilacion de la subunidad p1 de la bomba de Na+-K+ por asociacion con una senal acoplada al receptor que induce la estimulacion de la bomba de Na+- K+. El efecto de FXYD3 sobre la desglutationilacion de la subunidad p1 de la bomba de Na+-K+ se midio a partir del 45 valor inicial inducido por los agonistas del receptor adrenergico p3 CL316.243 (Garcia et al., 2008; Bundgaard et al, 2010). La Figura 3E muestra que CL316.243 indujo una disminucion en la glutationilacion de la subunidad p1 cuando los miocitos se habfan preincubado con FXYD3, pero un aumento cuando los miocitos se habfan preincubado con FXYD3 Cysless.
50 Ejemplo 5: Un residuo de cistelna FXYD1 reactiva especlfico modifica la glutationilacion de la subunidad /3i de la bomba de Na+-K+ y la actividad de la bomba
Hay dos residuos de cistema en el dominio citoplasmico en FXYD con aminoacidos basicos adyacentes. Uno, correspondiente a Cys60 (C1) en FXYD1, se conserva parcialmente entre todas las protemas FXYD, mientras que el 55 otro, correspondiente a Cys62 (C2) se conserva por completo (Cornelius y Mahmmoud, 2003). Estas cistemas se examinaron para determinar su "reactividad", es decir, su susceptibilidad a la glutationilacion. Los mutantes Cys60/Ala (FXYD1C1), Cys62/Ala (FXYD1C2) y Cys60/Ala, Cys62Ala (FXYD1C1C2) se produjeron y se examinaron para determinar la reactividad cuando se expresaron en ovocitos de Xenopus. Las Figuras 4A y B muestran que FXYD1 de tipo salvaje y el mutante FXYD1C1 eran facilmente detectables en la fraccion glutationilada marcada con
biotina de microsomas de ovocitos inyectados con ONOO-, pero indetectables en microsomas de ovocitos que expresan los mutantes FXYD1C2 o FXYD1C1C2. Tambien se examino el efecto de la expresion de los mutantes de FXYD1 sobre la glutationilacion de la subunidad p1 de la bomba de Na+-K+ inducida por la exposicion de ovocitos a ONOO'. Las Figuras 4C y D muestran que el efecto de coexpresar FXYD1 de tipo salvaje para reducir la 5 glutationilacion de la subunidad p1 de la bomba (tambien se muestra en la Figura 2A) se conservo para el mutante FXYD1C1, pero se elimino para los mutantes FxYd1C2 y FXYD1C1C2.
Dado que la glutationilacion de la subunidad p1 causa la inhibicion de la bomba de Na+-K+, los efectos de los mutantes de FXYD sobre la glutationilacion de la subunidad p1 se examinaron y como se muestra en las Figuras 4C 10 y D se reflejan por los efectos sobre la funcion. La Figura 4E muestra que el efecto de FXYD1 de tipo salvaje para suprimir una disminucion en Imax inducida por ONOO- cuando se coexpreso con las subunidades a1/p1 se conservo para el mutante FXYD1C1, pero se elimino para el mutante FXYD1C2 y el mutante doble FXYD1C1C2. Como se ha descrito previamente (Figtree et al., 2009), los estudios de union de 3H-ouabafna en ovocitos intactos indicaron que ONOO- no tuvo efecto sobre el numero de bombas funcionales de Na+-K+ en la superficie celular (Figura 8), lo que 15 indica que la inhibicion de la bomba inducida por ONOO- cuando las subunidades a1/p1 se expresaron en solitario, o se expresaron conjuntamente con los mutantes FXYD1C2 o FXYDC1C2, se debe a una disminucion en el numero de recambios de la bomba de Na+-K+ (Figura 8). Se concluye que una cistefna reactiva identificada especffica, C62, en FXYD1 afecta a la glutationilacion de la cistefna reactiva en la subunidad p1, Cys46, y que este efecto de FXYD1 se refleja en la funcion de la bomba.
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Ejemplo 6: Los aminoacidos basicos adyacentes a las cistefnas candidatas son necesarios para la glutationilacidn de protelnas FXYD
Se cree que los aminoacidos basicos adyacentes, cargados positivamente a pH fisiologico, facilitan la formacion del 25 enlace disulfuro entre una protefna cistefna y el tripeptido glutation cargado negativamente, es decir, la glutahationilacion (Ghezzi, 2005). De acuerdo con esto, Arg61 y Lys63 adyacentes a la Cys62 reactiva en FXYD1 son basicos. Sin embargo, la cistefna correspondiente en FXYD2 tiene un solo aminoacido basico adyacente. La Figura 5A muestra que, cuando se sobreexpresa en ovocitos de Xenopus, FXYD2 no tuvo ningun efecto funcional sobre la disminucion de Imax inducida por la exposicion de los ovocitos a ONOO-.
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El equivalente de Cys62 en FXYD7 tiene los mismos aminoacidos adyacentes que Cys62 en FXYD1, pero en el orden inverso (Cornelius y Mahmmoud, 2003). La Figura 5A muestra que, cuando se sobreexpreso en ovocitos de Xenopus, FXYD7 reprodujo la capacidad de FXYD1 para suprimir la disminucion en Imax inducida por ONOO-, lo que sugiere que la carga, en lugar de la secuencia de aminoacidos adyacentes, es importante para facilitar la 35 glutationilacion de cistefnas reactivas. Se examino el efecto de mutar Lys63 en FXYD1 a la Gly neutra. Cuando se sobreexpreso en ovocitos de Xenopus, el mutante FXYD1 KG no pudo reproducir el efecto de FXYD1 de tipo salvaje para eliminar una disminucion en Imax inducida por ONOO-, la glutationilacion del mutante como se muestra en la Figura 5B no se detecto y no hubo efecto de esta para disminuir la glutationilacion de la subunidad p1 de la bomba de Na+-K+ como se muestra en las Figuras 5C y D. En contraste, cuando la Gly neutra adyacente al equivalente de 40 Cys62 en FXYD2 se muto a la Lys basica, el mutante FXYD2 GK reprodujo el efecto de FXYD1 para eliminar tanto la inhibicion de la bomba de Na+-K+ como se muestra en la Figura 5A, como la glutationilacion de la subunidad p1 de la bomba como se muestra en las Figuras 5C y D. Los anticuerpos contra FXYD2 de Xenopus, que son eficientes en la inmunoprecipitacion (Beguin et al., 1997) pero no en transferencias Western, no permitieron establecer el estado de glutationilacion de FXYD2.
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Ejemplo 7: Los estlmulos oxidativos disminuyen la interaccion de FXYD1 con ai y aumentan la interaccion con las subunidades /3i de la bomba de Na+-K+
Los efectos de las protefnas FXYD en la bomba de Na+-K+ normalmente se atribuyen a su asociacion con las 50 subunidades a, pero las imagenes de la estructura tridimensional indican que las protefnas FXYD tambien interactuan con las subunidades p. Se examino el efecto de los estfmulos oxidativos sobre la alteracion de la interaccion de FXYD1 con las subunidades de la bomba de Na+-K+ como se refleja en la coinmunoprecipitacion. La Figura 6A muestra que la exposicion de los miocitos a Ang II disminuyo la coinmunoprecipitacion de FXYD1 con las subunidades a1 de la bomba de Na+-K+. En contraste, su coinmunoprecipitacion con las subunidades p1 se aumento 55 como se muestra en la Figura 6B. Tambien se examino el efecto del aumento del estres oxidativo asociado con el infarto de miocardio que afecta la interaccion de FXYD1 con las subunidades de la bomba de Na+-K+. La Figura 6C muestra que la coinmunoprecipitacion de FXYD1 con las subunidades a1 disminuyo en las zonas de infarto y borde del miocardio, mientras que lo contrario fue el caso de su coinmunoprecipitacion con las subunidades p1 como se muestra en la Figura 6D.
Ejemplo 8: Las proteinas FXYD aumentan la interaction entre las subunidades ai y Pi de la bomba de Na+-K+
La glutationilacion de la subunidad pi de la bomba de Na+-K+ disminuye su coinmunoprecipitacion con la subunidad 5 a1 (Figtree et al., 2009). Dado que las proteinas FXYD afectan a la glutationilacion de la subunidad pi (Figuras 2 y 3), se examino su efecto sobre la interaccion de las subunidades ai/pi. Las subunidades ai/pi se sobreexpresaron en ovocitos con o sin FXYDi o un mutante de FXYDi Cys62/Ala. El panel e en la Figura 7A muestra que ONOO- indujo un aumento en la glutationilacion de la subunidad pi cuando las subunidades ai/pi se sobreexpresaron en solitario o se expresaron conjuntamente con el mutante de FXYDi. Sin embargo, la coexpresion con FXYDi de tipo i0 salvaje redujo notablemente la glutationilacion de la subunidad pi. El panel d muestra que el aumento en la glutationilacion de la subunidad pi inducida por ONOO- cuando las subunidades ai/pi se sobreexpresaron en solitario estaba asociado con una disminucion en su coinmunoprecipitacion con la subunidad ai. Esta disminucion se revirtio cuando se coexpreso FXYDi de tipo salvaje, mientras que la coexpresion del mutante FXYDi no tuvo ningun efecto. El efecto de FXYDi y el mutante de FXYDi sobre la coinmunoprecipitacion de pi- con las subunidades ai se i5 resume en la Figura 7B. La Figura 7C muestra que el estres oxidativo inducido por ONOO- produjo una disminucion en la co-inmunoprecipitacion de las subunidades ai/pi tambien en los miocitos cardfacos. La proteina Cysless FXYD3 recombinante no tuvo ningun efecto sobre la disminucion de la coinmunoprecipitacion inducida por ONOO-, sino que la FXYD3 de tipo salvaje lo impidio. La Figura 7D muestra el efecto del estres oxidante asociado con el infarto de miocardio en la interaccion de las subunidades ai/pi. Su coinmunoprecipitacion se redujo en las zonas de 20 infarto y peri-infarto del miocardio.
Ejemplo 9: Metodos
9.1 Estudios sobre tejidos y celulas de mamfferos 25
Se aislaron miocitos ventriculares de conejos blancos de Nueva Zelanda. Se usaron solo el dfa del aislamiento y se almacenaron a temperatura ambiente en solucion tampon de Krebs-Henseleit hasta su uso. Se han descrito previamente detalles de la anestesia, escision del corazon y tecnicas de aislamiento celular.
30 El miocardio se obtuvo a partir de un modelo ovino de infarto de miocardio (infarto de miocardio) (Figtree et al, 2009). Los animales se anestesiaron con 20 mg/kg de tiopental sodico como induccion, se intubaron y se ventilaron con i,5 l/min de oxfgeno, 2 l/min de oxido nitroso e isoflurano (i,5 % al i,8 %). Se proporciono fluido de mantenimiento a traves del acceso venoso periferico con solucion de Hartmann (a una velocidad de i ml/kg de peso corporal por hora). El electrocardiografo se controlo con electrodos conectados a las extremidades. Se indujo IM con reperfusion 35 a traves de un procedimiento de cateterizacion cardfaca, e implico una oclusion de la arteria coronaria descendente anterior izquierda, inmediatamente distal al vaso diagonal dominante, utilizando un cateter de balon coaxial. La arteria se ocluyo durante 90 minutos y, posteriormente, el balon se desinflo para reperfusion. Las ovejas se sometieron a eutanasia >24 horas despues de la induccion de IM, y el tejido se recolecto inmediatamente para los estudios de proteinas.
40
9.2 Inmunodeteccion de proteinas S-glutationiladas en miocitos ventriculares de conejo
Para detectar la S-glutationilacion de proteinas especfficas relacionadas con la bomba, los miocitos aislados se cargaron con glutation biotinilado (GSH) (500 pmol/l; i hora). El ester GSH biotinilado se hizo mezclando 25 mmol/l 45 de sulfo-NHS-biotina con 25 mmol/l de ester etflico de GSH en 50 mmol/l de NaHCO3 a pH 8,5 durante 2 h, seguido de la adicion de i25 mmol/l de NH4HCO3 a pH 8,5 durante i h. Despues de la incubacion en ester de GSH biotinilado, las celulas se lavaron 3 veces con tampon de fosfato frfo y se lisaron en tampon (50 mmol/l de Tris-HCl, pH 7,4, Nonidet P-40 al i %, i50 mmol/l de NaCl, 50 pmol/l de acido dietilentriaminapentaacetico, 2 mmol/l de fluoruro de fenilmetilsulfonilo) que contenfa i0 mmol/l de W-etilmaleimida para bloquear reacciones tiol adicionales. 50 La etiqueta de biotina se utilizo para precipitar las proteinas S-glutationiladas utilizando modificaciones de los metodos descritos anteriormente. Se mezclaron aproximadamente 0,5 mg de proteina con perlas de estreptavidina- sepharose durante i h. Las perlas se lavaron cinco veces con tampon de lisis con SDS al 0,i %, y el precipitado final se incubo durante i5 minutos con 40 pl de tampon de elucion (tampon de lisis + 20 mmol/l de DTT) para liberar las proteinas S-glutationiladas. Despues de anadir el tampon Laemmli, la proteina de GSS extrafda por pull-down 55 mediante esta tecnica se separo por electroforesis en gel, se transfirio a una membrana y se analizo con los anticuerpos apropiados.
Se realizaron experimentos separados usando un anticuerpo contra la proteina glutationilada (anticuerpo anti-GSH). Los miocitos se trataron con tampon de lisis enfriado con hielo que contenfa i50 mmol/l de NaCl, 50 mmol/l de Tris-
HCl (pH 8,0), Triton X-100 al 1 %, EDTA 2 mM e inhibidores de proteasas (sin EGTA completo, Roche Diagnostics). Despues de 5 minutos a 4 C, el lisado se aclaro mediante centrifugacion a 16.000 g durante 20 minutos. El sobrenadante (0,25-1 mg de protefna) se preaclaro y se incubo con el anticuerpo apropiado y luego con protefna A/G mas perlas de agarosa. Las protefnas unidas a las perlas recogidas se sometieron a SDS-PAGE y se analizaron 5 con anticuerpos.
Los estudios descritos anteriormente se realizaron en miocitos de control, o miocitos expuestos a oxidantes qufmicos, o estfmulos oxidativos activados por senalizacion celular. Los protocolos para la exposicion a Ang II se disenaron para estudios paralelos con pinza de parche (White et al, 2009) que tenfan una duracion limitada. Las 10 concentraciones de Ang II se eligieron para asegurar la union de saturacion dentro de este perfodo de tiempo.
9.3 Medicion de la corriente electrogena de la bomba de Na+-K+ (Ip) en miocitos cardiacos de conejo
La corriente electrogena de la bomba de Na+-K+ (que surge de la relacion de intercambio 3:2 de Na+:K+) se midio en 15 miocitos individuales utilizando la tecnica de pinzamiento de parche de celulas completas. Las soluciones se disenaron para minimizar las corrientes de membrana sin bomba. Para los estudios que utilizan Ang II para activar la senalizacion oxidativa, se llenaron pipetas de parche de punta ancha (4-5 pm) con soluciones que contenfan (en mmol/l): HEPES 5; MgATP 2; acido etilenglicol-bis(p-aminoetil eter)-N,N,N',N'-tetraacetico (EGTA) 5; glutamato de potasio 70, glutamato sodico 10 y cloruro de tetrametilamonio (TMA-Cl) 80, y L-arginina 0,010. Se valoraron a un pH 20 de 7,20 a 35 °C con KOH. Se uso un potencial de mantenimiento de -40 mV para inactivar canales de Na+ sensibles a la tension. Mientras se establecio la configuracion de celulas completas, los miocitos se sobrefundieron con una solucion que contenfa (en mmol/l): NaCl 140; KCl 5,6; CaCl2 2,16; MgCh 1; glucosa 10; NaH2PO4 0,44; acido N-2- hidroxietil piperazin-N'-2-eteno-sulfonico (HEPES) 10. Se valoro a un pH de 7,40 a 35 °C con NaOH. Dos o tres minutos despues de que se establecio la configuracion de celulas completas, se cambio a un superfusado que fue 25 disenado para bloquear la corriente de membrana que surge de los gradientes transmembrana de K+ y Ca2+. Estaba nominalmente libre de Ca2+ y contenfa 0,2 mmol/l de CdCl2 y 2 mmol/l de BaCl2.
Para los estudios que usaron forskolina para activar la senalizacion oxidativa, se usaron superfusados identicos a los descritos anteriormente mientras se establecfa la configuracion de celulas completas, pero se cambio a un 30 superfusado libre de Na+ (NaCl reemplazado con NMGCl) para medir el cambio inducido por ouabafna en la corriente de retencion utilizada para identificar Ip, y se uso el potencial de equilibrio para Cl' (-14 mV), calculado a partir de las concentraciones de Cl- en superfusados y soluciones de pipeta, como potencial de ensayo. Se eligio para eliminar la corriente de Cl- dependiente de cAMP que podrfa contaminar la medicion de la corriente de la bomba relativamente pequena.
35
Se usaron amplificadores de pinza de tension Axoclamp 2A y 2B, soportados por pClamp version 7 y Axotape version 2 (Axon Instruments, Ca, USD) para registrar corrientes. La corriente de la bomba de Na+-K+ (Ip) se identifico como la diferencia entre las corrientes de retencion, muestreada a 1 Hz antes y despues del bloqueo de la bomba de Na+-K+ con 100 pmol/l de ouabafna. Dado que las corrientes de la bomba son pequenas, su identificacion es 40 susceptible a la contaminacion por corrientes de cualquier fuente, y es fundamental que solo se incluyan los experimentos con corrientes de retencion estables. Se han informado los criterios para la identificacion de corrientes estables y los cambios inducidos por la ouabafna en estas de las muestras obtenidas con un cursor electronico. El efecto de ouabafna no es reversible dentro del marco de tiempo. Las corrientes de retencion estables pueden medirse de manera fiable y no se intento eliminar el efecto de ouabafna. Ip se normalizo para determinar la 45 capacitancia de membrana.
9.4 Sfntesis y purificacion de protefnas FXYD
Se usaron genes que codifican protefnas FXYD como se publicaron en GenBank. El vector de expresion de la 50 protefna de fusion pMMHA de E. coli se uso para dirigir la sfntesis de la protefna de fusion His9-TrpALE-FXYD. El companero de fusion de T rpALE, de la secuencia de aminoacidos lfder de T rp, es muy eficaz para formar cuerpos de inclusion y, por lo tanto, esta protegida de la proteolisis. La protefna de fusion se expreso en la cepa BL21 (DE3) de E. coli a niveles de hasta el 20 % de la protefna total. Despues de la lisis de los cuerpos de inclusion de E. coli, se aislaron por centrifugacion y se disolvieron. Entonces se precipito la protefna de fusion. Las protefnas FXYD intactas 55 se liberaron del companero de fusion utilizando CNBr. El uso de la escision qufmica elimina dificultades, tales como la mala especificidad y la inactivacion enzimatica, que se encuentran a menudo con el tratamiento con proteasas de protefnas de membrana en detergentes. Se logra un alto grado de pureza de la protefna, como se indica por el analisis de aminoacidos N-terminales, la espectrometrfa de masas MALDI TOF y la espectroscopia de RMN de la solucion (KJ Crowell et al., 2003).
9.4 Estudios de ovocitos de Xenopus
9.4.1 Mutagenesis y ADNc.
5
Se introdujeron mutaciones puntuales en ADNc de FXYD1 de perro (Crambert et al., 2002) y FXYD2 de Xenopus (Beguin et al., 1997) por el metodo basado en PCR con cebadores de oligonucleotidos sinteticos mutagenicos. Todos los productos se clonaron en un vector pSD5 y se secuenciaron. Los ADNc de Na,K-ATPasa ai y p1 de Xenopus, FxYDI de perro (Crambert et al., 20O2), fXyD2 de Xenopus (Beguin et al., 1997) y FXYD7 de raton 10 (Beguin et al., 2002) se subclonaron en un vector pSD5. Los ARNc se prepararon por traduccion in vitro.
9.4.2 Expresion en ovocitos de Xenopus.
Los ovocitos en estadio V-VI se obtuvieron de Xenopus laevis como se describe (Geering et al., 1996). Los ovocitos 15 se inyectaron con el ARNc de la subunidad a1 de Xenopus (10 ng) y el ARNc de la subunidad p1 (1 ng) en solitario o junto con ARNc de FXYD1 de tipo salvaje o mutante (2 ng) o con ARNc de FXYD2 de tipo salvaje o mutante (2 ng) o con ARNc de FXYD7 (2 ng). La expresion de protefnas y la asociacion de protefnas FXYD mutantes se verificaron incubando ovocitos inyectados con ARNc en solucion de Barth modificada en presencia de 1 mCi/ml de [35S]metionina (PerkinElmer Life Sciences) durante 24 h. Los microsomas se prepararon y se sometieron a 20 inmunoprecipitaciones en condiciones no desnaturalizantes como se describe (Geering et al., 1996) con un anticuerpo contra la subunidad a de Na,K-ATPasa, y las protefnas se resolvieron mediante SDS-PAGE y se revelaron mediante fluorograffa.
9.4.3 Deteccion de S-glutationilacion 25
Dos dfas despues de la inyeccion, se estudio la S-glutationilacion de la subunidad p1 de la bomba de Na+-K+ y las protefnas FxYd como se ha descrito previamente (Figtree et al., 2009). Brevemente, despues de la inyeccion de 50 nl de ester de GSH biotinilado 25 mM y la incubacion durante 45 minutos a 19 °C, se activo la S-glutationilacion por inyeccion de ovocitos con peroxinitrito 1 mM.
30
Despues de 15 min a 19 °C, se prepararon microsomas de ovocitos con tampones que contenfan N-etilmaleimida 10 mM. El contenido de protefna se determino por el metodo de Lowry. Las protefnas microsomales (10 pg) se sometieron a SDS-PAGE o se extrajeron por pull-down con perlas de estreptavidina-Sepharose (200 pg) y luego se transfirieron durante una noche a 40 V a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con un 10 % 35 de leche deshidratada desnatada en solucion salina tamponada con Tris que contenfa un 0,1 % de Tween-20 y se incubaron con el anticuerpo primario Xenopus p1 (1/1000), el anticuerpo FXYD1 de perro (1/1000) (Crambert et al., 2002), FXYD7 de raton (1/1000) (Beguin et al., 2002)) o FXYD2 de Xenopus (1/250) (Beguin et al., 1997). Despues de la union del anticuerpo primario, los anticuerpos secundarios acoplados a la peroxidasa (1/10.000, Amersham Biosciences) se unieron y el complejo se revelo con el kit de quimioluminiscencia ECL (Amersham Biosciences) de 40 acuerdo con el protocolo del fabricante. Los anticuerpos de FXYD2 son eficientes en los experimentos de inmunoprecipitacion (Beguin et al., 1997) pero resultaron no ser suficientes para reconocer FXYD2 de Xenopus en transferencias Western. En estos experimentos, la expresion de FXYD2 de Xenopus se confirmo mediante experimentos de inmunoprecipitacion en ovocitos marcados con 35S-metionina (datos no mostrados).
45 9.5 Medicion de la corriente maxima de la bomba de Na+-K+ (Imax)
Las mediciones electrofisiologicas de Imax se realizaron 2 dfas despues de la inyeccion de ovocitos utilizando la tecnica de pinza de tension de dos electrodos. Los ovocitos se cargaron con Na+ mediante incubacion durante una noche en un medio sin K+. El potencial de membrana se ajusto a -50 mV y la corriente de la bomba de Na,K se midio 50 a temperatura ambiente como la corriente externa inducida por la adicion de K+ 10 mM.
Para la determinacion de los efectos del peroxinitrito (ONOO') en Imax, se inyectaron ovocitos con 50 nl de peroxinitrito 1 mM 15 min antes de las mediciones.
55 Como se ha descrito anteriormente (Figtree et al., 2009), el glutation endogeno fue suficiente para ver el efecto del peroxinitrito en I max.
9.6 Union de pHJouabafna sobre ovocitos intactos
El numero total de Na,K-ATPasa expresada en la superficie celular se determino mediante la union de 3H-ouabafna dos dfas despues de la inyeccion de ovocitos como se ha descrito previamente (Figtree et al., 2009). Brevemente, los ovocitos se cargaron con Na+ en una solucion libre de K+ que contenfa NaCl 90 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 1 mM, Hepes 10 mM, pH 7,4 durante 2 horas a 19 °C. Luego se incubaron los ovocitos a 19 °C durante 2 h en la solucion 5 libre de K+ que contenfa ester de GSH biotinilado 1 mM. Despues de la incubacion, los ovocitos se inyectaron, o no, con 50 ml de peroxinitrito 1 mM, pH 7,4 a temperatura ambiente y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min. Despues, los ovocitos se incubaron en una solucion libre de K+ que contenfa [21,22-3H]ouabafna 0,3 pM (Amersham, actividad especffica 15 Ci/mmol) y ouabafna frfa 0,7 pM durante 30 min. La union de ouabafna no especffica se determino en presencia de ouabafna frfa 300 pM y represento aproximadamente el 5 % de la union 10 total. Los ovocitos se lavaron extensamente con un tampon que contenfa NaCl 90 mM, imidazol 30 mM, pH 7,4, se transfirieron individualmente a tubos de centelleo y se solubilizaron con 100 pl de SDS al 5 %. Los ovocitos solubilizados se contaron despues de la adicion de 2 ml de Scintillator 299 (Packard).
9.7 Numero de recambios de Na,K-ATPasa.
15
El numero de recambios se calculo como la relacion entre la corriente maxima de Na,K-ATPasa (Imax) y el numero del numero de bomba determinado por la union de ouabafna.
9.8 Analisis de datos
20
Cada inmunotransferencia presentada es representativa de al menos tres experimentos separados. Las densidades de banda se cuantificaron por densitometrfa (Fujifilm, LAS-3000). Los datos se expresan como la media ± SE. Las comparaciones estadfsticas se hicieron con una prueba t de Student o ANOVA unidireccional, segun corresponda. P <0,05 se considero estadfsticamente significativo.
25
Analisis de los Ejemplos
Se sabe que la actividad de la bomba de Na+/K+ esta modulada por una serie de factores que incluyen glucosidos cardfacos, catecolaminas, hormonas y protefnas tales como FXYD.
30
El papel de las protefnas FXYD en la funcion de la membrana se atribuye en gran medida a su ubicacion conjunta con la bomba de Na+-K+ de membrana y el intercambiador de Na+ -Ca2+. La estrecha asociacion de las protefnas FXYD con las subunidades a y p del heterodfmero de la bomba de Na+-K+ se destaca por la reciente definicion de la estructura tridimensional del complejo a/p/FXYD en cristales de Na+-K+-ATPasa de rinon (Morth et al., 2007) y de 35 glandula rectal de tiburon (Shinoda et al., 2009). A pesar de esta estrecha asociacion, las protefnas FXYD no son una parte integral del heterodfmero a/p de la bomba de Na+-K+, ya que el heterodfmero en solitario presenta tanto actividad catalftica como capacidad de transporte de iones.
La FXYD1, expresada principalmente en el corazon y el musculo esqueletico, es unica entre las protefnas FXYD por 40 ser un sustrato importante para las protefnas cinasas A y C (Presti et al., 1985), y la fosforilacion de los residuos de aminoacidos identificados en FXYD1 se visto ampliamente implicada en el control de la funcion de la bomba de Na+- K+. Sin embargo, estudios mutacionales no han confirmado una relacion causal entre la fosforilacion de estos residuos y los efectos sobre la funcion de la bomba de Na+-K+. Ademas, los residuos no se conservan entre las otras 6 protefnas FXYD de mamfferos que no tienen sitios de fosforilacion funcional. Si bien la presencia de estas 45 protefnas FXYD puede modular la funcion de la bomba de Na+-K+, por lo tanto, no pueden estar directamente implicadas en la regulacion dependiente de la protefna cinasa, y, si existe un papel funcional generalmente aplicable de la localizacion conjunta de protefnas FXYD con la bomba de Na+ K+, tiene que ser independiente de cualquier fosforilacion directa de las protefnas.
50 Se ha identificado un mecanismo que conserva el papel ampliamente aceptado de las protefnas cinasas en la regulacion de la bomba de Na+-K+, pero es independiente de la fosforilacion de las protefnas FXYD o de las subunidades de la bomba de Na+-K+. La senal oxidativa de la activacion dependiente de PKC, inducida por la angiotensina II (Ang II) de NADPH oxidasa en los miocitos cardfacos, o la exposicion directa de los miocitos a oxidantes qufmicos indujo la glutationilacion de la subunidad p1 del heterodfmero de la bomba (Figtree et al., 2009; 55 White et al., 2009). La glutationilacion es una modificacion oxidativa reversible en la que el tripeptido citosolico glutation (GSH) forma un enlace disulfuro mixto con un residuo de cistefna reactiva en una protefna candidata. La glutationilacion confiere un aducto de 305 Da cargado negativamente a la protefna que recuerda a la fosforilacion y se visto implicada en la senalizacion oxidativa. La glutationilacion tambien se induce al exponer los ovocitos de Xenopus que sobreexpresan las subunidades a1/p1 de la bomba o los fragmentos de membrana de rinon de cerdo
enriquecidos con Na+-K+ ATPasa, a oxidantes. Los estudios mutacionales identificaron Cys46 en la subunidad p1 como el residuo reactivo, y demostraron que la glutationilacion estaba relacionada causalmente con la inhibicion de la bomba de Na+-K+ (Figtree et al., 2009).
5 La fosforilacion de las protefnas FXYD, con la posible excepcion de FXYD1, no puede justificar un papel en la regulacion de la bomba de Na+-K+ dependiente de cinasa. Sin embargo, como se describe en el presente documento, el presente inventor examino si alguno de sus residuos de cistefna es "reactivo", es decir, puede experimentar glutationilacion, y si tales cistefnas reactivas interaction con la glutationilacion de las subunidades pi de la bomba y su equivalente funcional, la inhibicion de la bomba.
10
En el presente documento se describe una funcion de las protefnas FXYD nunca sospechada previamente que es que las protefnas FXYD modulan la inhibicion oxidativa de la bomba de Na+/K+ mediante la alteracion de la glutationilacion de la bomba de Na+/K+. Este descubrimiento, a diferencia del pensamiento existente, proporciona un papel modulador a los miembros de la familia de protefnas FXYD que no tienen sitios de fosforilacion funcionales. 15 Ese papel es la reversion de la inhibicion de la bomba de Na+/K+ inducida por una senal de oxidante. En circunstancias fisiologicas, esta senal puede ser dependiente de receptores de hormonas y dependiente de NADPH oxidasa. En condiciones fisiopatologicas, la senal puede surgir de la isquemia tisular con o sin reperfusion, por ejemplo, en el infarto de miocardio. Las protefnas FXYD tambien pueden desempenar un papel en la proteccion de las celulas cancerosas ante los altos niveles de estres oxidante.
20
Implicaciones del nuevo papel de las protefnas FXYD para la enfermedad
El papel de las protefnas FXYD en la reduccion de la modificacion oxidativa de la subunidad pi de la bomba de Na-K como se describe en el presente documento tiene implicaciones importantes para los procesos de enfermedad 25 asociados con el aumento del estres oxidativo. Se pueden desarrollar tratamientos para mejorar la funcion reductora de las protefnas FXYD o suprimirla.
Infarto de miocardio
30 El aumento del estres oxidativo y los altos niveles de miocitos Na+ y Ca+ contribuyen al dano miocardico y las anomalfas contractiles en la isquemia y la reperfusion. De acuerdo con el aumento del estres oxidativo, la subunidad pi de la bomba de Na+-K+ se glutationila en el infarto (Figtree, 2009), y la inhibicion de la bomba causada por esto puede contribuir a los niveles elevados de Na+ y Ca2+. Cabe destacar que, el infarto de miocardio tambien esta asociado con un aumento marcado en la glutationilacion de FXYD1 (Figura 1), una disminucion de su asociacion 35 "normal" con la subunidad a de la bomba de Na-K y un aumento en la asociacion de la subunidad p1 (Figura 6), consistente con un papel de FXYD1 en la desglutationilacion de la subunidad p1.
El tratamiento con antioxidantes, por ejemplo, las vitaminas A y E, tienen un potencial limitado de eficacia porque el citosol contiene un reductor abundante de todos modos. Las protefnas FXYD pueden ser el factor crftico que permite 40 la reduccion de las protefnas de membrana, incluida la bomba de Na-K, y por lo tanto, la restauracion de la funcion. En la interfaz entre la membrana y el citosol, la cistefna reactiva en las protefnas FXYD puede proporcionar un enlace a la cascada de oxidorreductasas que, en ultima instancia, obtienen su poder reductor del abundante GSH citosolico.
45 Ictus
El estres oxidativo se ha visto implicado en el dano isquemico cerebral con el ictus, y se han examinado estrategias antioxidantes. Podrfa ser factible un enfoque similar al propuesto para el infarto, usando protefnas FXYD exogenas.
50 Cancer
Se sabe que muchos tejidos cancerosos tienen altos niveles de estres oxidativo y han desarrollado defensas antioxidantes aumentadas, especfficamente del sistema de oxidorreductasa citosolica.
55 FXYD3 es particularmente bien conocido por su posible papel en la biologfa del cancer. FXYD3 (tambien conocida como protefna tumoral mamaria 8) se sobreexpresa en canceres importantes, incluidos los canceres de prostata, mama y pancreas. El nuevo papel de la "membrana oxidorreductasa" que se ha identificado sugiere que la sobreexpresion puede servir para proteger protefnas de membrana crfticas, incluida la bomba de Na-K, ante el estres oxidativo. En apoyo de esto, la regulacion negativa de FXYD3 mediante el silenciamiento genico con tecnicas
de ARNsi o la inhibicion de la bomba de Na+-K+ con glucosidos cardfacos altera el crecimiento de celulas de cancer de prostata in vitro. Tambien es notable que los datos clfnicos de observacion sugieren que los glucosidos cardfacos tienen un efecto beneficioso sustancial en la supervivencia del cancer de mama. La funcion del transporte de iones, asf como el papel de la bomba de Na+-K+ en la senalizacion se han relacionado con la posible eficacia de los 5 glucosidos cardfacos en el tratamiento del cancer.
Reactividad de las cistefnas a la protelna FXYD
Una, pero no la otra de las dos protefnas FXYD mejor conocidas y mas estudiadas fue susceptible a la 10 glutationilacion. La protefna susceptible, FXYD1 tiene dos residuos de cistefna en su terminal citoplasmico en un motivo C1XC2, mientras que FXYD2 tiene un solo residuo candidato de cistefna. La mutacion de C2, pero no C1, suprimio la susceptibilidad a la glutationilacion de FXYD1 identificando a C2 como el residuo reactivo y tambien indicando que el motivo C1XC2 no era crftico para la reactividad. La proximidad de las cargas positivas de los aminoacidos basicos es importante para que las cistefnas, en un sistema de modelo de protefna purificada, 15 reaccionen con el GSH cargado negativamente, y en el presente documento, se describe que los aminoacidos basicos adyacentes tambien son importantes para la glutationilacion de protefnas FXYD en el modelo celular descrito. Una mutacion Gly ^ Lys de FXYD2 para flanquear la cistefna candidata con aminoacidos basicos hizo que la protefna FXYD se volviera reactiva y, a la inversa, una mutacion Lys ^ Gly que elimino uno de los aminoacidos basicos que flanqueaban la cistefna reactiva en FXYD1 elimino su susceptibilidad a la glutationilacion. Sin embargo, 20 debe tenerse en cuenta que C1 en FXYD1 no era reactivo, a pesar de su motivo RC1R, lo que indica que los aminoacidos basicos adyacentes promueven, pero no necesariamente predicen, la reactividad como se ha reconocido previamente. Los efectos estericos en la estructura tridimensional de FXYD1 y las protefnas adyacentes o su proximidad a la membrana tambien pueden ser importantes.
25 Glutationilacion e interaccion de proteinas FXYD con subunidades de la bomba de Na+-K+
Las protefnas FXYD tienen enlaces multiples con las subunidades a y p del heterodfmero de la bomba de Na+-K+ en el dominio transmembrana y extracelular respectivamente (Shinoda et al., 2009). Estas parecen haber sido afectadas por estfmulos oxidativos y glutationilacion como se indica por una disminucion en la coinmunoprecipitacion 30 de FXYD1 con la subunidad a1 y un aumento en su coinmunoprecipitacion con la subunidad p1 en los miocitos cardfacos. Esto no necesariamente refleja una interrupcion in situ de todos los enlaces a alguna subunidad a1 o la formacion de nuevos enlaces a la subunidad p1. Es posible que se hayan producido alteraciones durante el procedimiento experimental de coinmunoprecipitacion segun lo analizado anteriormente para las subunidades a y p (Figtree 2009). Sin embargo, los cambios en la coinmunoprecipitacion, no obstante, sugieren un cambio en la fuerza 35 relativa in situ de las asociaciones, quizas mediada por un efecto esterico del aducto de GSH de 305 Da.
La asociacion de las protefnas FXYD con la subunidad a catalftica puede modificar las propiedades funcionales de la bomba de Na+-K+ y, en principio, un cambio en la asociacion inducida por la glutationilacion puede cambiar la funcion. Sin embargo, un papel funcional crftico de cualquier cambio en la interaccion FXYD1/a1 no se admite en 40 este estudio por los numeros de recambios identicos que se muestran en la Figura 8 cuando las subunidades a1/p1 se expresaron con o sin FXYD1. Como se ha mostrado previamente (Figtree, 2009), la disminucion en la funcion de la bomba inducida con estfmulos oxidativos, se asocia con la glutationilacion de la subunidad p1 y se evita mediante la mutacion de su unica cistefna libre, Cys46, que indica una relacion causal entre la glutationilacion y la inhibicion de la bomba. Los estfmulos oxidativos en este estudio no se asociaron con la glutationilacion de la subunidad p1 o la 45 inhibicion de la bomba de Na+-K+ cuando las protefnas FXYD con cistefnas reactivas se expresaron en ovocitos de Xenopus o se administraron exogenamente a los miocitos cardfacos. La mutacion de la cistefna reactiva en las protefnas FXYD elimino estos efectos. Estos hallazgos sugieren que una interaccion entre cistefnas reactivas en protefnas FXYD y la subunidad p1 es importante para la funcion.
50 Las protefnas FXYD podrfan prevenir la glutationilacion de la subunidad p1 y, por lo tanto, la inhibicion de la bomba. Como alternativa, podrfan facilitar la desglutationilacion despues de la glutationilacion inicial de la subunidad p1. La velocidad espontanea de desglutationilacion es muy lenta, pero puede acelerarse en muchos ordenes de magnitud mediante oxidorreductasas. De estos, la glutaredoxina 1 (GRx1) media la desglutationilacion del disulfuro de protefna de GSS mixto con selectividad exclusiva contra otros disulfuros mixtos de protefna. Se ha encontrado que 55 coinmunoprecipita con la subunidad p1 de la bomba de Na+-K+ en el lisado de miocitos cardiacos y que la administracion intracelular de GRx1 recombinante elimina la inhibicion de la bomba inducida por una senal de oxidante en los miocitos con pinzamiento de tension (Figtree, 2009). Las protefnas FXYD pueden facilitar la desglutationilacion de la subunidad p1 de la bomba de Na+-K+ y quizas otras protefnas de membrana al proporcionar un enlace a las oxidorreductasas, incluyendo GRx1, que son citosolicas, y por lo tanto no se espera que tengan
acceso directo al medio de membrana. En ausencia de cualquier estfmulo oxidante anterior, la desglutationilacion de la subunidad pi de la bomba de Na+-K+ desde el inicio, inducida por el agonista del receptor p3 adrenergico de activacion de la bomba CL316.243, se bloqueo por FXYD3 Cysless y se facilito por FXYD3 de tipo salvaje en este estudio, lo que sostiene un papel de las protefnas FXYD en la mediacion de la desglutationilacion.
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Aunque es plausible, la cistefna reactiva en el dominio citoplasmico, cerca del segmento transmembrana de las protefnas FXYD, puede interactuar con la cascada estrictamente citosolica de las oxidorreductasas, la estructura tridimensional determinada para el complejo a/p/FXYD indica que no esta en la distancia de interaccion con la Cys46 reactiva en la subunidad pi en el dominio transmembrana. Sin embargo, la Na+-K+ ATPasa en los cristales utilizados 10 para determinar la estructura se limito estrictamente al estado conformacional E2. La subunidad p se mueve sustancialmente en relacion con la subunidad a durante el cambio conformacional E2 ^ Ei del ciclo de la bomba de Na+-K+ (Shinoda et al., 2009), y como se ha analizado previamente, existe evidencia de que los compartimentos llenos de agua pueden tener acceso a la cistefna transmembrana en la subunidad pi (Figtree et al. 2009). Ademas, dado que GSH es estrictamente citosolico, la susceptibilidad de la subunidad pi a la glutationilacion indica que se 15 puede acceder a Cys46 desde el compartimento citosolico en alguna fase del ciclo de la bomba y, por lo tanto, tal vez en la distancia de interaccion con las cistefnas reactivas de las protefnas FXYD.
Implicaciones fisiologicas
20 Una gran cantidad de evidencia indica que la presencia o ausencia de protefnas FXYD modifica las propiedades funcionales y puede ser importante para ajustar las propiedades de la bomba funcional estatica de acuerdo con las necesidades de tejidos o celulas especfficas que las expresan. El presente estudio indica que tambien tienen un papel mas amplio, integrado en un esquema de regulacion oxidativa que conserva los roles firmemente establecidos de las protefnas cinasas en la regulacion de la bomba de Na+-K+ (White et al 2009; Figtree et al 2009) pero que 25 invoca la glutationilacion en lugar de la fosforilacion como la modificacion molecular aguas abajo que causa un cambio en la funcion. Si bien el esquema de modulacion de la bomba divulgado en el presente documento se extiende a una funcion reguladora para la mayorfa de las protefnas FXYD, no incluye FXYD2, expresada en el rinon que no es susceptible a la glutationilacion, ni incluye heterodfmeros de bomba con subunidades p2 o p3, ya que estas subunidades relativamente poco expresadas no tienen una cistefna reactiva libre (Figtree et al 2009). 30 Mecanismos alternativos pueden regular la funcion de la bomba cuando se expresan las subunidades p2 o p3 de FXYD2 o puede que no se requiera una respuesta rapida a una senal oxidativa.
Implicaciones terapeuticas
35 Una gran cantidad de afecciones patologicas estan asociadas con un aumento en el estres oxidativo y la reactividad de las protefnas cistefnas de FXYD puede ser importante para su fisiopatologfa y tratamiento. De particular relevancia para este estudio, el aumento del estres oxidativo y los altos niveles de Na+ y Ca+ de los miocitos contribuyen al dano miocardico y las anomalfas contractiles en la isquemia y la reperfusion. De acuerdo con el aumento del estres oxidativo, la subunidad pi de la bomba de Na+-K+ se glutationila en el infarto (Figtree et al., 40 2009), y la inhibicion de la bomba causada por esto puede contribuir a los elevados niveles de Na+ y los niveles de Ca2+ dependientes del intercambio de Na+-Ca2+. Una abundante capacidad de tampon redox celular hace que sea improbable que un cambio global en el estado redox sea crftico en el estres oxidante y el tratamiento con antioxidantes, tales como vitaminas A y E, por lo tanto, tienen un potencial de eficacia limitado. La presente invencion muestra que los estfmulos oxidativos, incluido el infarto de miocardio, estan asociados con la 45 glutationilacion de FXYDi. Tambien demuestra la capacidad de las protefnas FXYD exogenas recombinantes para reemplazar FXYDi nativa y disminuyen la glutationilacion de la subunidad pi de la bomba de Na+-K+. La administracion in vivo de una protefna FXYD exogena, o un derivado mas pequeno con una caracterfstica clave conservada, podrfa facilitar en gran medida la desglutationilacion de la subunidad pi de la bomba de Na+-K+, la activacion de la funcion y la reversion de los efectos adversos de la sobrecarga celular de Na+ y Ca2+ en la fase 50 aguda del infarto de miocardio.
Una perdida de funcion que depende de la cistefna reactiva en las protefnas FXYD puede tener aplicacion en el tratamiento del cancer. El papel de FXYD3 para facilitar la desglutationilacion de la subunidad pi puede ser crftico para tal aplicacion. Los Ejemplos proporcionados en el presente documento ilustran que la protefna FXYD nativa 55 puede ser desplazada por Cysless FXYD3 in vitro, al menos en miocitos cardfacos. Un derivado de la protefna FXYD administrado por via intravenosa sin cistefna reactiva o residuos de aminoacidos basicos adyacentes crfticos podrfa desplazar la FXYD3 de tipo salvaje y eliminar su proteccion de la funcion de la bomba de Na+-K+ ante un aumento de la carga oxidativa en las celulas cancerosas. El acoplamiento de la protefna a un peptido que permite el direccionamiento selectivo de compuestos solubles en la membrana a las celulas cancerosas podrfa mejorar la
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eficacia y reducir los efectos no deseados en los tejidos no diana. Dado que la inhibicion de la bomba de Na+-K+ aumenta el dano por irradiacion a lfneas celulares de tumores humanos, pero no a lfneas celulares normales (Mijatovic T, Kiss R, 2007), la eficacia de un compuesto terapeutico tambien puede mejorar cuando se usa en combinacion con radioterapia o con enfoques quimioterapeuticos que tambien aumentan las cargas oxidativas en las celulas.
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Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una protefna FXYD seleccionada del grupo que consiste en FXYD1 (SEQ ID NO: 1), FXYD3 (SEQ ID NO: 3), FXYD4 (sEq ID NO: 4) y FXYD7 (SEQ ID NO: 7) o un fragmento o variante de la misma para su uso en el
    5 tratamiento del infarto de miocardio,
    en la que el fragmento o variante tiene la capacidad de promover la desglutationilacion de la bomba de Na/K, en la que el fragmento o variante comprende una cistefna reactiva correspondiente a Cys62 de FXYD1, y en la que la variante presenta al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 7, respectivamente, a lo largo de la longitud de la variante.
    10
  2. 2. Una protefna FXYD de perdida de funcion para su uso en el tratamiento del cancer que esta caracterizada por la sobreexpresion de FXYD3,
    en la que la protefna FXYD de perdida de funcion es un fragmento o variante de FXYD3 (SEQ ID NO: 3) que conserva la capacidad de asociarse con la bomba de Na/K pero no tiene la capacidad de promover la 15 desglutationilacion de la bomba de Na/K o tiene una capacidad que se reduce en comparacion con la protefna FXYD3 de tipo salvaje,
    en la que dicho fragmento o variante de FXYD3 no comprende una cistefna reactiva correspondiente a Cys62 de FXYD1, y
    en la que la variante presenta al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 a lo largo de la 20 longitud de la variante.
  3. 3. La protefna FXYD de perdida de funcion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en la que dicha protefna FXYD de perdida de funcion se administra en un tratamiento combinado con una o ambas de radioterapia o quimioterapia.
    25
  4. 4. La protefna FXYD de perdida de funcion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en la que el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama, cancer de prostata, cancer de pancreas y cancer de intestino.
    30 5. Una composicion farmaceutica que comprende una protefna FXYD de perdida de funcion junto con al
    menos un adyuvante, excipiente o tampon farmaceuticamente aceptable,
    en la que la protefna FXYD de perdida de funcion es una variante de FXYD3 (SEQ ID NO: 3) que conserva la capacidad de asociarse con la bomba de Na/K pero no tiene la capacidad de promover la desglutationilacion de la bomba de Na/K o tiene una capacidad que se reduce en comparacion con la protefna FXYD3 de tipo salvaje,
    35 en la que dicha variante de FXYD3 no comprende una cistefna reactiva correspondiente a Cys62 de FXYD1, y
    en la que la variante presenta al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 a lo largo de la longitud de la variante.
  5. 6. Una protefna FXYD de perdida de funcion aislada que es una variante de FXYD3 (SEQ ID NO: 3) y
    40 conserva la capacidad de asociarse con la bomba de Na/K pero no tiene la capacidad de promover la desglutationilacion de la bomba de Na/K o tiene una capacidad que se reduce en comparacion con la protefna FXYD3 de tipo salvaje y que no comprende una cistefna reactiva correspondiente a Cys62 de FXYD1, en la que la variante presenta al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 a lo largo de la longitud de la variante.
    45
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