ES2691392T3 - Procedimiento para formar un agregado multicapa de objetos - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para formar un agregado multicapa (120) de objetos (O) en un canal (2) que comprende un líquido (L), comprendiendo dicho procedimiento: a) proporcionar objetos (O) en una primera (50) y una segunda (60) zonas superpuestas del canal (2), b) obtener un primer (110) y un segundo (111) agregados de objetos (O) aplicando ondas acústicas transversales, preferiblemente ondas estacionarias, dentro de cada zona a los objetos (O), y c) poner dichos primer (110) y segundo (111) agregados en contacto para formar dicho agregado multicapa (120) de objetos (O) sometiendo dichos primer (110) y segundo (111) agregados a: - gravedad en ausencia de ondas acústicas, o a - ondas acústicas, opcionalmente ondas estacionarias, que hacen que dichos primer (110) y segundo (111) agregados se desplacen uno hacia otro.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento para formar un agregado multicapa de objetos

La presente invención se refiere a procedimientos para formar un agregado multicapa de objetos en un canal que comprende un líquido.

Antecedentes

El campo de la ingeniería de tejidos ofrece una emocionante vía para las terapias regenerativas mediante la combinación de biomateriales con células vivas. La combinación de nuevos biomateriales (armazones) con células vivas ha producido algunos éxitos clínicos en la reconstrucción de una amplia variedad de tejidos funcionales tales como, por ejemplo, hueso, arterias y vejigas. Sin embargo, debido a las respuestas inflamatorias y los estados fibróticos patológicos que se presentan después de la biodegradación de la armazón, ha emergido una nueva metodología de ingeniería de tejidos denominada “ingeniería de láminas celulares”, que construye tejidos funcionales 3D colocando en capas láminas celulares bidimensionales sin utilizar ninguna alternativa de matriz extracelular biodegradable.

Aun así, el principal defecto de las láminas celulares son sus malas propiedades mecánicas en relación con las aplicaciones funcionales. Las láminas celulares se contraen mucho cuando son retiradas de las superficies de cultivo, lo que tiene como resultado tamaños de injerto reducidos. En entornos clínicos, será ideal controlar el tamaño de injerto específico y la forma para aplicaciones específicas. Además, la fragilidad de las láminas celulares las hace difíciles de manejar. Los procedimientos para resolver estos problemas aún encuentran un obstáculo significativo en la reconstrucción eficaz de tejidos 3D mecánicamente robustos y manipulables, incluso cuando se evitan las tecnologías basadas en armazones.

Según las terapias de medicina regenerativa se hacen más avanzadas, existe una necesidad creciente de desarrollar estrategias para incrementar proporcionalmente el cultivo de células y tejidos con el fin de satisfacer las demandas previstas. En respuesta, existe interés en utilizar sistemas automatizados de cultivo de células y tejidos, cuyo éxito depende de estrategias de seguimiento y control. Existen diversas técnicas de cultivo para generar in vitro agregados 2D y 3D en suspensión, tales como siembra celular 2D sobre superficies de plástico/vidrio planas y rígidas, cultivo en aglomerados, en esferoides y en gota pendiente, armazones, superposición de líquidos, matraz spinner y la técnica de rotación giratoria [4]. Sin embargo, estos procedimientos pueden estar limitados por un largo tiempo de cultivo, la formación de agregados de tamaños desiguales o una accesibilidad mecánica difícil. Por consiguiente, pueden no ser adecuados para una producción normalizada, rápida y a gran escala de agregados 2D/3D en un formato necesario para ensayos de alto rendimiento.

La manipulación de partículas de tamaño micrométrico y submicrométrico puede realizarse utilizando una fuerza acústica, Fa = V <e> k Á sin (2ky) generada por un campo acústico estacionario que actúa en una cámara delgada. V es el volumen de la partícula, <e> es la energía acústica media, k = 2n/A es el número de ondas y Á es el factor de contraste acústico que depende de las propiedades acústicas de las partículas y el fluido de suspensión.

Esta cámara puede denominarse “resonador acústico”. Este resonador puede comprender una pared emisora y una pared reflectora. La onda estacionaria puede producirse cuando el espesor de la cámara w y la longitud de onda acústica A están relacionados como se muestra en la ecuación siguiente: w = n A/2, donde n es el número de nodos creados en el espesor de la cámara. Las partículas sometidas a este campo de fuerzas acústico variable en espesor pueden ser empujadas a los nodos o antinodos de las ondas estacionarias, dependiendo del factor de contraste acústico Á, que es una función de las impedancias acústicas definida como el producto pc, donde pi y Ci son las densidades y las velocidades del sonido del fluido o de las partículas suspendidas.

También sería interesante desarrollar técnicas de ingeniería de tejidos para necesidades de astronautas. En las condiciones de ingravidez del espacio, el cultivo celular es un reto, porque las células presentes en el medio de cultivo vagan dentro del reactor y no son dirigidas naturalmente hacia una armazón o una matriz en la que el agregado y el posterior tejido hayan de crecer. Formar un agregado en condiciones de ingravidez puede además llevar días.

Existe la necesidad de un procedimiento que permita una formación rápida de agregados celulares 2D y 3D que sea ventajoso en relación con los procedimientos convencionales de cultivo celular anteriormente mencionados.

Existe la necesidad de conseguir un procedimiento que permita la formación de estructuras multicapa consistentes en objetos biológicos tales como células.

Existe además la necesidad de conseguir un procedimiento para generar construcciones que imiten tejidos.

Existe además la necesidad de conseguir técnicas mejoradas de ingeniería de tejidos.

La presente invención tiene el objetivo de satisfacer algunas de las necesidades antes mencionadas o todas ellas.

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Compendio

Según un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para formar un agregado multicapa de objetos en un canal según la reivindicación 1.

Con “agregado de objetos” quiere decirse una capa de objetos que satisface todas las características siguientes:

- al menos dos objetos comprendidos en dicha capa, en particular al menos un 10%, mejor un 25%, preferiblemente un 50% de los objetos comprendidos en dicha capa, están en contacto, y

- dicha capa presenta, en al menos una parte de su longitud, una sucesión de objetos en un desplazamiento a lo largo de al menos una de sus dimensiones transversales.

Los agregados obtenidos pueden ser agregados 2D o 3D.

Los agregados obtenidos pueden extenderse en un plano y comprender, en particular consistir en, filas yuxtapuestas de objetos. En este caso, los agregados se denominan agregados 2D.

En otra realización, los agregados obtenidos comprenden un apilamiento de agregados 2D. Tal realización es un ejemplo de un agregado 3D.

Un agregado es diferente de una línea de objetos que sólo se extiende a lo largo de un eje. En otras palabras, una línea de objetos comprende sólo un objeto de anchura, sólo un objeto de espesor y una sucesión de objetos a lo largo de su longitud.

La presente invención puede permitir ventajosamente recoger agregados de manera continua sin daños.

La presente invención puede permitir ventajosamente la formación de agregados multicapa de objetos de la misma clase o de clases diferentes.

La presente invención puede posibilitar ventajosamente una generación controlada y programada de agregados celulares (2D y/o 3D) de idénticas dimensiones.

La presente invención puede permitir ventajosamente la formación simultánea de láminas celulares 2D (homotípicas y/o heterotípicas, es decir tipos de células iguales o diferentes) que se colocarán de manera estratificada en una forma mínimamente invasiva, por ejemplo para generar construcciones que imiten tejidos.

La presente invención puede permitir ventajosamente la manipulación y el control de los agregados y la evitación de un contacto entre los objetos y las paredes del canal que pueda modificar sus propiedades.

La presente invención permite además ventajosamente una obtención rápida de agregados de objetos, en particular agregados celulares 3D.

La presente invención permite ventajosamente obtener un agregado multicapa utilizando un dispositivo que puede fabricarse con relativa facilidad y que puede utilizarse en condiciones estériles. El dispositivo utilizado en el procedimiento según la invención puede comprender un equipo ultrasónico estándar.

En la etapa a) pueden proporcionarse capas de objetos en una primera y una segunda zonas superpuestas del canal, obteniéndose dichas capas opcionalmente mediante un enfoque hidrodinámico.

Los objetos presentes en la primera zona, en la etapa a), pueden tener un tamaño y/o una naturaleza diferentes de los objetos presentes, en la etapa a), en la segunda zona.

El primer y el segundo agregados de objetos pueden obtenerse en la etapa b) mediante aplicación de ondas estacionarias dentro de cada zona.

En una variante, el primer y el segundo agregados de objetos pueden obtenerse en la etapa b) mediante un enfoque hidrodinámico. En este caso, los objetos que forman un agregado pueden presentar ventajosamente interacciones de superficie, por ejemplo interacciones electrostáticas, que les permitan acercarse unos a otros.

Según una realización, en la etapa c) se pone fin al campo acústico, y los agregados de objetos se ponen en contacto debido a la gravedad, permitiendo así colocar dichos agregados unos encima de otros, lo que lleva por ejemplo a construcciones estratificadas organizadas que imitan tejidos.

Tal realización puede permitir ventajosamente la creación de células dispuestas como láminas celulares en suspensión y evitar así la contracción de las láminas celulares. Tal realización es también mínimamente invasiva y puede facilitar el manejo.

Según algunas realizaciones, la etapa c) comprende someter los agregados a ondas acústicas que tienen:

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- un número diferente de nodos acústicos, opcionalmente menos nodos acústicos, que las ondas acústicas aplicadas en la etapa b), y/o

- al menos un nodo acústico, respectivamente antinodo acústico, que tiene una posición transversal que es diferente de la o las posiciones transversales del o de los nodos acústicos, respectivamente del o de los antinodos acústicos, de las ondas acústicas aplicadas en la etapa b), y/o

- una amplitud menor que la amplitud de las ondas acústicas aplicadas en la etapa b).

Según una realización concreta, a lo largo de la longitud del canal están presentes al menos un primer y un segundo generadores de campo acústico y:

- dichos primer y segundo generadores de campo acústico emiten ondas acústicas en las etapas b) y c), y

- dicho canal tiene una primera y una segunda paredes situadas respectivamente enfrente de dichos primer y segundo generadores de campo acústico, que tienen espesores diferentes de tal manera que las ondas acústicas aplicadas en la etapa c) tienen un nodo y/o un antinodo que está situado en dicha segunda pared.

Esta realización puede permitir ventajosamente situar en una de las paredes del canal el agregado multicapa de objetos formado, que así puede aislarse fácilmente.

Según una realización concreta, a lo largo de la longitud del canal están presentes al menos un primer y un segundo generadores de campo acústico para generar respectivamente las ondas acústicas en las etapas b) y c),

- emitiendo dichos primer y segundo generadores de campo acústico ondas acústicas en las etapas b) y c) que tienen sustancialmente la misma frecuencia principal, y

- variando, opcionalmente disminuyendo, la anchura y/o el espesor del canal en al menos una parte de su longitud de tal manera que las ondas acústicas aplicadas en la etapa c) tienen un número diferente de nodos acústicos, opcionalmente menos nodos acústicos, que las ondas acústicas aplicadas en la etapa b).

Según una realización concreta, la frecuencia principal de las ondas acústicas aplicadas en la etapa c) puede ser diferente de la frecuencia principal de las ondas acústicas aplicadas en la etapa b), de tal manera que las ondas acústicas aplicadas en la etapa c) tengan un número diferente de nodos acústicos, opcionalmente menos nodos acústicos, que las ondas acústicas aplicadas en la etapa b).

Según una realización concreta, la invención se refiere a un procedimiento que comprende:

a) proporcionar objetos en una primera, una segunda y una tercera zonas superpuestas del canal,

b) obtener un primer, un segundo y un tercer agregados de objetos aplicando ondas acústicas transversales, en particular ondas estacionarias, dentro de cada zona a los objetos, y

c) poner dichos primer, segundo y tercer agregados en contacto con el fin de formar dicho agregado multicapa de objetos sometiendo dichos primer, segundo y tercer agregados a:

o gravedad en ausencia de ondas acústicas, o a

o ondas acústicas que inducen fuerzas que desplazan unos hacia otros dichos primer, segundo y tercer agregados.

En una realización concreta de la invención, al menos uno de los primer y segundo, y opcionalmente tercer, agregados comprende al menos 100, en particular al menos 250, en particular al menos 500, en particular al menos 750, en particular al menos 1.000, en particular al menos 1.500, objetos.

En una realización preferida de la invención, al menos uno de los primer y segundo, y opcionalmente tercer, agregados comprende al menos 100, en particular al menos 250, en particular al menos 500, en particular al menos 750, en particular al menos 1.000, en particular al menos 1.500, células.

En una realización preferida de la invención, cada uno de los primer y segundo, y opcionalmente tercer, agregados comprende al menos 100, en particular al menos 250, en particular al menos 500, en particular al menos 750, en particular al menos 1.000, en particular al menos 1.500, objetos.

En una realización preferida de la invención, cada uno de los primer y segundo, y opcionalmente tercer, agregados comprende al menos 100, en particular al menos 250, en particular al menos 500, en particular al menos 750, en particular al menos 1.000, en particular al menos 1.500, células.

Como se ha mencionado anteriormente, la presente invención permite ventajosamente la obtención rápida y fácil de agregados celulares, una construcción 3D de cientos de células formada preferiblemente en unos pocos segundos.

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Según una realización concreta, todo el procedimiento o parte del mismo se lleva a cabo en un campo gravitatorio con una fuerza inferior o igual a 10 m/s2, en particular 9,5 m/s2, en particular 9 m/s2, en particular 8,5 m/s2, en particular 8 m/s2, en particular 7,5 m/s2, en particular 7 m/s2, en particular 6,5 m/s2, en particular 6 m/s2, en particular 5,5 m/s2, en particular 5 m/s2, en particular 4,5 m/s2, en particular 4 m/s2, en particular 3,5 m/s2, en particular 3 m/s2, en particular 2,5 m/s2, en particular 2 m/s2, en particular 1,5 m/s2, en particular 1 m/s2, en particular 0,5 m/s2.

En una realización concreta, la totalidad o parte del procedimiento según la invención se lleva a cabo en un campo gravitatorio con una fuerza sustancialmente diferente de la fuerza del campo gravitatorio en la superficie de la Tierra, que es igual a 9,81 m/s2.

Por “un campo gravitatorio con una fuerza sustancialmente diferente de la fuerza del campo gravitatorio en la superficie de la Tierra” quiere decirse un campo gravitatorio con una fuerza que difiere en al menos un 5% de 9,81 m/s2.

Resulta particularmente ventajoso utilizar ondas acústicas en la etapa b), dado que en este caso el procedimiento puede no verse afectado de un modo significativo por las condiciones de gravedad, por ejemplo por el hecho de que el procedimiento se lleve a cabo en condiciones de ingravidez o en condiciones de gravedad de la Tierra. De hecho, la fuerza de radiación acústica se genera mediante la interacción entre un campo acústico y la materia, y esto independientemente del campo gravitatorio. Por lo tanto, dirigir clases a posiciones de equilibrio, por ejemplo hacia nodos, por ejemplo en un campo de onda estacionaria, es análogo a tener gravedad artificial.

Cuando se utilizan ondas acústicas en la etapa b), la única diferencia es que la posición de equilibrio de los

agregados a 1 g está situada ligeramente debajo de la posición de equilibrio a 0 g.

Por ejemplo, a 0 g la posición de equilibrio de un agregado celular puede estar situada en un nodo de presión y a 1 g

puede estar situada ligeramente debajo del nodo lejos de las paredes del canal.

El procedimiento según la invención es particularmente ventajoso cuando se utiliza en un campo gravitatorio con una fuerza menor que la fuerza del campo gravitatorio en la superficie de la Tierra (g = 9,81 m/s2). De hecho, cuando se utilizan ondas acústicas, por ejemplo ondas estacionarias ultrasónicas, la fuerza acústica generada puede reunir los objetos, por ejemplo células errantes, sin necesidad de ninguna otra fuerza externa.

Así pues, el procedimiento según la invención permite ventajosamente la obtención de construcciones 3D compactas de objetos, por ejemplo células, incluso cuando se lleva a cabo en un campo gravitatorio de poca fuerza, por ejemplo en condiciones de ingravidez.

En una realización concreta, la invención se refiere a un procedimiento como se ha definido anteriormente, en donde:

- el líquido (L) es un medio de cultivo celular, y

- al menos uno de los primer (110) y segundo (111), y opcionalmente tercer, agregados comprende células, y

- dichas células se cultivan mientras están presentes en el al menos uno de los primer (110), segundo (111) y opcionalmente tercer agregados.

Así pues, cuando se lleva a cabo el procedimiento según la invención, las células presentes en al menos uno de los primer y segundo, y opcionalmente tercer, agregados pueden cultivarse, multiplicándose el número de dichas células al menos por 2 o incluso por 5 durante el cultivo celular.

En una realización preferida, al menos un tejido está formado mediante el cultivo celular, estando en particular un tejido óseo formado mediante el cultivo celular. El tejido formado es preferiblemente un tejido 3D.

El cultivo celular se lleva a cabo preferiblemente en un campo gravitatorio con una fuerza sustancialmente diferente de la fuerza del campo gravitatorio en la superficie de la Tierra, en particular menor que la fuerza del campo gravitatorio en la superficie de la Tierra.

El cultivo celular en microgravedad tiene doble interés.

En primer lugar, en microgravedad los tejidos 3D pueden desarrollarse en flotación, lo que proporciona un entorno ideal para tejidos desarrollados adecuadamente, como en las condiciones fisiológicas normales.

En segundo lugar, es ventajoso, como se ha mencionado anteriormente, desarrollar técnicas de ingeniería de tejidos para necesidades de astronautas, concretamente la reconstrucción de huesos y la sustitución de tejidos dañados.

La presente invención permite ventajosamente reunir células errantes en microgravedad sin necesidad de ninguna otra fuerza externa, por ejemplo para realizar construcciones 3D compactas.

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En una realización preferida, el primer y el segundo, y opcionalmente el tercer, agregados se conservan durante al menos una hora, en particular al menos un día, en particular al menos una semana.

Se prefiere particularmente aplicar ondas acústicas a estos primer y segundo, y opcionalmente tercer, agregados para crear una trampa acústica en donde los agregados estables pueden mantenerse consolidados durante horas, días o semanas.

En una realización concreta se introduce al menos una vez algo de medio de cultivo celular en el canal durante el cultivo celular.

En una realización concreta se renueva el medio de cultivo celular al menos una vez durante el cultivo celular. La expresión “se renueva el medio de cultivo celular” significa que el medio de cultivo celular inicialmente en contacto con los agregados se sustituye completamente por otro medio de cultivo celular recién introducido en el canal, que puede ser de igual naturaleza química o de diferente naturaleza química.

La invención permite ventajosamente la renovación del medio de cultivo celular sin alterar los agregados, dado que estos agregados son particularmente estables. Tal ventaja es interesante, porque, cuando no se utiliza la invención, el medio de cultivo puede no ser fácil de cambiar y, de hecho, en condiciones de microgravedad el flujo puede generar perturbaciones que expulsen el agregado.

En microgravedad, la estimulación por cizallamiento de agregados para mejorar el crecimiento tisular puede resultar difícil, porque cualquier perturbación genera un desplazamiento descontrolado de la construcción. Utilizando la invención es posible aplicar vibraciones u oscilaciones que generen esfuerzos cortantes mientras se mantiene la construcción alrededor de una posición de equilibrio 3D.

En una realización concreta, el primer y el segundo, y opcionalmente el tercer, agregados son agregados 3D.

En una realización concreta, a lo largo de un eje longitudinal del canal están presentes una pluralidad de conjuntos de primer y segundo, y opcionalmente tercer, agregados.

En una realización preferida, a lo largo de un eje longitudinal del canal están presentes una pluralidad de conjuntos de primer y segundo agregados 3D y dichos conjuntos de agregados se han obtenido llevando a cabo la etapa b) en un campo gravitatorio con una fuerza menor que la fuerza del campo gravitatorio en la superficie de la Tierra.

Generador de campo acústico, ondas acústicas y levitación de objetos

Las ondas acústicas utilizadas en las etapas b) y/o c) pueden tener una frecuencia principal fmáx de 10 MHz o menos, preferiblemente comprendida entre 0,5 y 10 MHz.

El uso de un generador de campo acústico en tales intervalos de frecuencia puede facilitar ventajosamente el mantenimiento de la integridad de células vivas u objetos tales como vesículas, liposomas, bacterias o virus.

Las ondas acústicas utilizadas en las etapas b) y/o c) pueden generarse ventajosamente a lo largo de un espesor del canal.

El generador de campo acústico puede ser piezoeléctrico, por ejemplo cerámico.

Por ejemplo, es posible utilizar un generador de campo acústico vendido bajo la referencia PZ26 por la empresa Ferroperm Piezoceramics, Kvistgard, Dinamarca.

La parte del generador de campo acústico que está en contacto con una pared del canal puede ser circular o rectangular.

El área de esta parte puede ser mayor o menor que el área del canal, concretamente longitud por anchura. Dicha área puede ser igual al área del canal dependiendo de la configuración necesaria para generar los agregados.

El generador de campo acústico puede alimentarse con una tensión sinusoidal. En una variante, el generador de campo acústico puede alimentarse con una tensión triangular o de onda cuadrada.

El generador de campo acústico puede controlarse digitalmente o analógicamente.

El generador de campo acústico puede alimentarse con un generador de ondas, por ejemplo el modelo 5062 vendido por Tabor electronics, Israel.

La onda emitida por el generador de ondas puede amplificarse mediante un amplificador, siendo un amplificador de este tipo por ejemplo el modelo 9250 vendido por Tabor electronics, Israel.

El generador de ondas puede, durante las etapas b) y/o c), generar ondas que tengan una amplitud comprendida entre 0 y 40 Vp-p (voltios de pico a pico).

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La densidad de energía acústica generada durante las etapas b) y/o c) puede estar comprendida entre 1 y 1.000 J/m3 (julios/m3), por ejemplo entre 1 y 300 J/m3, por ejemplo entre 5 y 50 J/m3, y puede ser por ejemplo de 10 J/m3

Las ondas acústicas utilizadas en las etapas b) y/o c) pueden tener una frecuencia principal que sea una frecuencia resonante del canal a lo largo de una de sus dimensiones transversales.

Las dimensiones transversales del canal son el espesor y la anchura del canal.

Con “frecuencia principal que sea una frecuencia resonante del canal a lo largo de una de sus dimensiones transversales” quiere decirse una frecuencia fo tal que una dimensión transversal z del canal, medida en una

nX

z = -

determinada posición a lo largo del eje longitudinal del canal, satisface 2 , donde n es un número entero, y _ cf X s-L

■ ■■•*, donde Cf es la velocidad del sonido en el líquido presente en el canal a la temperatura de dicho líquido, por ejemplo 20°C.

En otras palabras, la frecuencia fü corresponde a la frecuencia teórica que satisface, en una determinada posición a lo largo del eje longitudinal del canal, la condición de resonancia de la onda acústica en el canal y la formación de una onda estacionaria a lo largo de la dimensión transversal considerada.

Las ondas acústicas utilizadas en las etapas b) y/o c) pueden tener una frecuencia principal que esté comprendida entre 0,5f0 y 1,5f0, en particular entre 0,75fo y 0,95f0 o entre 1,05fo y 1,25fo.

El uso de tales frecuencias puede permitir ventajosamente la creación de una fuerza acústica que sea suficientemente intensa para conseguir un enfoque deseable de los objetos.

El generador de campo acústico puede estar sujetado a una de las paredes del canal. Esta sujeción puede realizarse utilizando cualesquiera medios conocidos por el experto según sea apropiado, en particular mediante encolado.

Entre el generador de campo acústico y al menos una de las paredes del canal puede estar presente una capa de un material de adaptación acústica.

La adaptación acústica puede realizarse mediante el uso de cualquier material apropiado conocido por el experto.

A lo largo de la longitud del canal pueden estar presentes una pluralidad de generadores de campo acústico para generar dichas ondas acústicas en las etapas b) y/o c), estando los generadores de campo acústico presentes preferiblemente en el mismo lado del canal.

Canal

Según la presente invención, es posible utilizar canales descritos en el documento US 2008/0067128, cuyo contenido queda incorporado por referencia.

Características geométricas

La anchura y/o el espesor del canal pueden variar, opcionalmente disminuir, en al menos una parte de su longitud.

Así, en un movimiento a lo largo del eje longitudinal del canal, el espesor de dicho canal puede ser constante o puede variar. El canal puede comprender en particular al menos dos zonas que estén situadas axialmente una a continuación de la otra y que presenten espesores diferentes.

El canal puede presentar, al menos en una parte de su longitud, en particular en la totalidad de su longitud, un espesor que sea inferior o igual a 3 cm, mejor inferior o igual a 1 cm. El canal es, por ejemplo, un microcanal.

Con “microcanal” quiere decirse un canal que tiene, en la totalidad de su longitud, un espesor que es inferior o igual a 1 mm.

El canal puede presentar, en al menos una parte de su longitud, en particular en la totalidad de su longitud, un espesor comprendido entre 50 pm y 3 mm, preferiblemente entre 100 pm y 500 pm.

La anchura del canal puede, en un movimiento a lo largo del eje longitudinal de dicho canal, ser constante o variar. El canal presenta por ejemplo dos zonas que están situadas axialmente una a continuación de la otra y que presentan anchuras diferentes.

Con “eje longitudinal del canal” quiere decirse la línea que interconecta los centros de gravedad de las secciones transversales del canal. El eje longitudinal del canal puede ser recto o curvilíneo y puede estar contenido en un

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plano que puede ser un plano de simetría para algunas de las secciones transversales del canal o incluso para todas ellas.

En una realización, la anchura del canal puede variar y el canal puede tener una forma piramidal cuando se mira desde arriba. En este caso concreto, los generadores de campo acústico pueden ser rectangulares o no.

En una variante, el canal puede, cuando se mira desde arriba, tener la forma de círculos conectados por subcanales, en particular subcanales rectilíneos.

En esta última configuración, los generadores de campo acústico pueden ser cilíndricos, permitiendo dicha configuración en particular la generación de un mosaico de agregados.

El canal puede tener, en al menos una parte de su longitud, en particular en la totalidad de su longitud, una anchura comprendida entre 1 mm y 40 mm, preferiblemente entre 5 mm y 20 mm.

La longitud del canal, medida a lo largo de su eje longitudinal, está, por ejemplo, comprendida entre 3 mm y 1.000 mm, preferiblemente entre 10 mm y 500 mm.

El canal tiene por ejemplo una longitud de 100 mm, una anchura de 10 mm y un espesor de 0,4 mm.

Según otra realización ejemplar, la longitud del canal puede estar comprendida entre 10 mm y 1.000 mm, la anchura del canal puede estar comprendida entre 1 mm y 40 mm y el espesor del canal puede estar comprendido entre 0,5 mm y 3 mm.

El canal puede comprender una sección transversal que sea sustancialmente constante en un desplazamiento a lo largo de su eje longitudinal.

El canal puede tener en al menos una parte de su longitud, en particular en la totalidad de su longitud, una sección transversal rectangular.

En una variante, el canal puede tener en al menos una parte de su longitud, en particular en la totalidad de su longitud, una sección transversal cuadrada o circular.

El canal puede tener ventajosamente razones de anchura/espesor y/o longitud/espesor superiores o iguales a 10. Tales razones pueden prevenir ventajosamente efectos tridimensionales en el perfil de flujo.

En una realización preferida, el canal tiene, en al menos una parte de su longitud, en particular en la totalidad de su longitud, una sección transversal rectangular y una razón anchura/espesor > 10.

Las paredes del canal pueden tener forma de plaqueta.

Las paredes del canal pueden tener, al menos en parte de su longitud y en particular en la totalidad de la misma, un espesor comprendido entre 0,5 mm y 5 mm.

El canal puede comprender, al menos en una parte de su longitud, una pared cuyo espesor varíe.

Tal configuración puede permitir la creación de un nodo o antinodo acústico cerca de la parte de la pared de espesor diferente y hacer así que los agregados entren en contacto unos con otros cerca de esta zona.

La pared opuesta a la pared en la que se generan las ondas acústicas puede oscilar libremente cuando se lleva a cabo el procedimiento según la invención.

Entrada o entradas y salida o salidas

El canal puede estar en comunicación de fluidos con al menos una y en particular al menos dos entradas.

El canal puede estar en comunicación de fluidos con al menos una y en particular al menos dos salidas.

El canal que comprende una pluralidad de entradas y/o de salidas, por ejemplo dos entradas y dos salidas, puede estar colocado en un bastidor estable o en un bastidor que puede estar inclinado para modificar la aceleración gravitatoria.

La entrada o las entradas y/o la salida o las salidas del canal pueden estar conectadas a bombas de jeringa y/o bombas peristálticas. Cuando están conectadas a bombas peristálticas, puede añadirse un amortiguador hidrodinámico entre la bomba peristáltica y la entrada o las entradas y/o la salida o las salidas del canal.

El canal puede estar en comunicación de fluidos con una o más salidas por las que pueden evacuarse los agregados multicapa, formados mediante el procedimiento según la invención.

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Como tal, puede no ser necesario abrir el canal para recoger los agregados multicapa formados.

Preferiblemente, al menos una de las entradas presenta una anchura que no es menor que la anchura del canal y/o presenta una sección que es sustancialmente rectangular.

En una realización de la invención, al menos una entrada está abierta en una de las paredes inferior y superior del canal y otra entrada está abierta en la otra de las paredes inferior y superior del canal.

A modo de ejemplo, dos entradas están dispuestas una frente a otra.

En una variante, todas las entradas están abiertas bien en la pared inferior, bien en la pared superior del canal.

En una realización de la invención, al menos dos entradas están desplazadas una en relación con otra a lo largo del eje longitudinal del canal.

Al menos una entrada puede estar abierta en el canal de manera sustancialmente paralela o perpendicular al eje longitudinal del mismo.

En una realización de la invención, al menos un orificio de alimentación está en comunicación de fluidos con al menos una de las entradas a través de un conducto, incluyendo el conducto en particular una parte divergente que diverge de una punta del conducto, estando el orificio de alimentación abierto en el conducto de manera adyacente a dicha punta y en particular perpendicularmente al conducto.

Esta parte divergente del conducto hace posible formar una lámina de sustancia partiendo de un punto de alimentación.

En una realización de la invención, al menos una primera y una segunda salidas están en comunicación de fluidos con el canal y separadas una de otra por una pared de separación transversal de altura distinta de cero medida a lo largo del espesor del canal.

La o las salidas pueden permitir la recuperación del agregado multicapa formado mediante el procedimiento según la invención.

Al menos dos salidas pueden estar desplazadas una en relación con otra a lo largo del eje longitudinal del canal. En una variante, al menos dos salidas pueden estar situadas una frente a otra.

En una realización de la invención, el canal está en comunicación de fluidos con al menos una primera, una segunda y una tercera salidas, estando la segunda salida dispuesta entre la primera y la tercera salidas a lo largo del espesor del canal.

En una realización de la invención, al menos un orificio de salida está en comunicación de fluidos con la o las salidas del canal a través de un conducto, incluyendo el conducto una parte de sección que se estrecha lateralmente, en particular una parte que converge hacia una punta, teniendo dicha parte una forma triangular cuando se mira desde arriba, por ejemplo, estando el orificio de salida abierto en el conducto, por ejemplo de manera adyacente a la punta, y en particular perpendicularmente al conducto.

Esta parte convergente del conducto puede servir para evitar la formación de un punto de remanso en el orificio de salida.

Materiales que constituyen el canal

Las paredes del canal pueden comprender, en particular consistir en, un material elegido entre: vidrios orgánicos o minerales, cuarzo, materiales termoplásticos, en particular PMMA o policarbonato, y metales. Más en general, es posible utilizar cualquier material que tenga una alta impedancia acústica, es decir al menos diez veces mayor que la impedancia acústica del fluido.

El canal puede fabricarse utilizando procedimientos de fabricación convencionales del tipo utilizado en el campo de la microfluídica.

Cuando sea apropiado, el microcanal puede dotarse de al menos una válvula, por ejemplo una válvula solenoide. Líquido y objetos

El líquido puede ser un líquido biológico, tal como sangre.

En una variante, el líquido puede ser agua.

El líquido puede ser transparente a la luz visible.

El líquido puede no fluir durante la etapa b).

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Según una realización, el líquido fluye al menos durante las del líquido opcionalmente menor de 10.

Los objetos pueden ser células biológicas monodispersas ejemplo glóbulos.

En una realización concreta, los objetos tienen un factor de contraste acústico positivo.

El “factor de contraste acústico” se define como se detalla a continuación.

La fuerza de radiación acústica tiene la expresión:

Fac _ <Eac>Vp k A(p,p)Sin (2ky),

con <Eac> la densidad de energía acústica media; Vp el volumen de las clases de partícula, k = 2n/A con A la longitud de onda de la onda ultrasónica

y el factor de contraste acústico tiene la expresión:

A(p,P)=[(5 Pp - 2 pf)/(2 pp + pf)] - Pp/Pf

etapas b) y/o c), siendo el número de Reynolds del flujo o polidispersas, en particular células sanguíneas, por

en donde:

- Pp y pf son respectivamente densidades de partícula p y de fluido de suspensión f,

- Pp y pf son respectivamente compresibilidades de partícula p y de fluido de suspensión f,

- “y” es la distancia al plano nodal de la onda estacionaria.

En una realización concreta, los objetos tienen un factor de contraste acústico negativo.

En una realización concreta, los objetos están elegidos entre: burbujas, microburbujas, nanoburbujas, gotitas, células grasas, lípidos de la sangre, vesículas fosfolipídicas, o mezclas de los mismos.

Los objetos que tienen un factor de contraste acústico negativo pueden situarse después de la etapa b) en diferentes antinodos de presión. En una variante, los objetos que tienen un factor de contraste acústico negativo pueden estar situados entre nodos de presión y antinodos de presión.

Por ejemplo, unos primeros objetos están situados después de la etapa b) en un primer antinodo de presión y unos segundos objetos están situados después de la etapa b) en un segundo antinodo de presión, siendo dicho segundo antinodo de presión diferente del primer antinodo de presión y estando dicho segundo antinodo de presión superpuesto al primer antinodo de presión, siendo dichos segundos objetos diferentes de dichos primeros objetos, por ejemplo teniendo una densidad diferente o una constante de elasticidad diferente. Dichos primeros y segundos objetos pueden tener el mismo tamaño.

En una realización concreta, el procedimiento comprende después de la etapa b) una determinación de al menos una característica de los objetos, por ejemplo de al menos una característica acústica, por ejemplo de la o las impedancias acústicas de dichos objetos.

En una realización concreta, el procedimiento comprende después de la etapa b) una etapa de coalescencia de los objetos, realizándose dicha coalescencia en particular por completo o parcialmente cuando dichos objetos están presentes en el canal.

En una realización concreta, los objetos se evacúan fuera del canal, por ejemplo en un recipiente, después de la etapa c).

Los objetos pueden ser partículas rígidas o deformables, por ejemplo partículas de poliestireno.

Más en general, los objetos pueden ser partículas rígidas o deformables, partículas polidispersas, células biológicas, en particular células sanguíneas, por ejemplo células cancerosas en una muestra de sangre o de glóbulos, bacterias, emulsiones coloidales o no coloidales, proteínas o liposomas.

El tamaño medio de los objetos presentes en el canal puede ser inferior o igual a 100 pm.

Con “tamaño medio” quiere decirse la dimensión granulométrica estadística en la mitad de la población, conocida como D50.

Los caudales utilizados pueden depender de las muestras tratadas, el volumen del canal y las fuerzas acústicas aplicadas.

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Por ejemplo, el líquido puede fluir durante la totalidad o parte del procedimiento según la invención con un caudal comprendido entre 0,1 ml/min y 100 ml/min.

En una realización concreta, el líquido puede fluir con un caudal de 0,1 ml/min para un canal de 1 ml de volumen, cuando la fuerza acústica primaria máxima sea del mismo orden de magnitud que la fuerza de la gravedad, concretamente 1 pN (piconewton = 10-9) para partículas de látex o células de 10 pm de diámetro.

La fracción de volumen de objetos, medida cuando dichos objetos se inyectan en el canal, puede ser de un 0,1% (v/v) o más. La fracción de volumen de objetos corresponde al [(volumen de objetos)/(volumen de líquido que contiene dichos objetos)] x 100%.

Breve descripción de los dibujos

La invención se entenderá mejor leyendo la descripción detallada siguiente de ejemplos no limitativos para su implementación y examinando los dibujos adjuntos, en los que:

- la figura 1 muestra un dispositivo para llevar a cabo un procedimiento según la invención,

- la figura 2 muestra un agregado obtenido según un procedimiento de la invención,

- la figura 3 es una vista según MI-MI del canal utilizado en la figura 1,

- la figura 4 es un ejemplo de evacuación del agregado multicapa formado según el procedimiento mostrado en la figura 1,

- las figuras 5 a 8 son variantes de dispositivos para llevar a cabo procedimientos según la invención,

- la figura 9 es una realización de un canal que puede utilizarse en procedimientos según la invención, y

- las figuras 10 a 12B muestran resultados experimentales obtenidos mediante los procedimientos según la invención.

Descripción detallada

La figura 1 muestra un dispositivo 1 que puede utilizarse en los procedimientos según la invención. El dispositivo 1 comprende un canal 2 que se extiende a lo largo de un eje longitudinal X.

El canal 2 puede, como se ha mencionado anteriormente, ser un microcanal.

El canal 2 presenta una sección transversal que es por ejemplo rectangular. En el ejemplo descrito, la razón longitud/espesor del canal 2 es mayor de 10.

El canal 2 tiene unas paredes inferior y superior 3 y 4. El canal 2 está, como se muestra, en comunicación de fluidos con unas entradas 7, por ejemplo cinco entradas 7.

Las entradas 7 están abiertas en las paredes superior e inferior 4 y 3 del canal 2 y cuatro entradas 7 están abiertas perpendicularmente al eje X, como se muestra. Además, la entrada 7 que está abierta en la pared superior 4 del canal 2 está abierta en dicho canal 2 de manera paralela al eje X.

En una variante no mostrada, las entradas están todas abiertas en la pared inferior del canal.

Las entradas 7 tienen una sección sustancialmente rectangular y de una anchura igual a la anchura del canal 2.

Las entradas 7 están separadas por unas paredes transversales 10 de separación, que son perpendiculares al eje longitudinal X.

Las entradas 7 presentan, como se muestra, espesores menores que el del canal 2, por ejemplo de menos de la mitad de su espesor.

En la realización mostrada en la figura 1, algunas de las entradas 7 pueden estar desplazadas a lo largo del eje X, tal como las paredes 10 de separación.

Al menos una entrada 7 está abierta, como se muestra, en una primera zona 45 conectada a una segunda zona 46 de mayor espesor, en la que está abierta otra entrada 7, midiéndose los espesores a lo largo del espesor del canal 2.

La segunda zona 46 está conectada a una zona central 47 del canal 2.

Las diferencias de espesor entre las zonas 45 y 46 y entre las zonas 46 y 47 corresponden a la diferencia de altura entre las paredes 10 de separación.

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El dispositivo 1 puede utilizarse de la siguiente manera en los procedimientos según la invención.

Como se muestra en la figura 1 por ejemplo, se hace que un líquido portador L y una pluralidad de objetos O fluyan a través de las entradas 7.

Los objetos O pueden ser monodispersos o polidispersos, dichos objetos O pueden ser células biológicas y el líquido L puede ser un líquido biológico tal como, por ejemplo, sangre.

Cuando sea apropiado, el dispositivo 1 puede tener una o más válvulas para controlar la inyección de objetos O a través de las entradas 7, pudiendo una válvula de este tipo ser, por ejemplo, una válvula solenoide que presente un solo paso o múltiples pasos.

La inyección de objetos O a través de las entradas 7 puede controlarse en frecuencia y en caudal para permitir al dispositivo 1 funcionar de manera continua con el fin de procesar grandes volúmenes de objetos.

Tal dispositivo 1 proporciona objetos O en una primera 50 y una segunda 60 zonas superpuestas del canal 2 (etapa a)) mediante una técnica de enfoque hidrodinámico.

En dichas primera 50 y segunda 60 zonas superpuestas están presentes respectivamente una primera 51 y una segunda 61 capas de objetos O, controlándose el espesor de dichas primera 51 y segunda 61 capas mediante enfoque hidrodinámico.

La primera 51 y la segunda 61 capas de objetos O están, como se muestra en la figura 1, separadas por una capa de líquido L puro. Los objetos O presentes en la primera capa 51 pueden ser idénticos a los objetos O presentes en la segunda capa 61. En una variante, los objetos O presentes en la primera capa 51 y los objetos O presentes en la segunda capa 61 pertenecen a clases diferentes. En una variante, los objetos O presentes en la primera capa 51 tienen un tamaño diferente del de los objetos O presentes en la segunda capa 61.

Tales capas de objetos pueden experimentar una difusión inducida por cizallamiento hidrodinámico [3], que puede ser perjudicial para una corriente de fondo de multilevitación.

Así pues, el dispositivo 1 está provisto de unos generadores 100a y 100b de campo acústico que están, como se muestra, sujetados a la pared superior 4 del canal 2. En la figura 1, los generadores 100a y 100b de campo acústico están dispuestos a lo largo del canal 2 y presentes en el mismo lado de dicho canal 2. En una variante no mostrada, los generadores de campo acústico pueden estar dispuestos a lo largo del canal y presentes en lados opuestos de dicho canal.

El generador 100a de campo acústico permite la formación, en la etapa b), de un primer 110 y un segundo 111 agregados de objetos O. Como se muestra en la figura 1, los objetos O están situados en multilevitación alrededor de los nodos de presión de las ondas generadas por el generador 100a de campo acústico. En otras palabras, cada uno de los primer 110 y segundo 111 agregados está posicionado en un nodo de presión diferente al final de la etapa b). El generador 100a de campo acústico puede funcionar a una frecuencia que permita la formación de una onda estacionaria que comprenda dos nodos a lo largo del espesor del canal 2. En una variante, el generador 100a de campo acústico no produce una onda estacionaria a lo largo del espesor del canal 2, pero es capaz de crear un campo de fuerza acústica que posibilita la formación de agregados.

La expresión “levitación acústica” se emplea cuando una manipulación acústica busca situar objetos en una posición de equilibrio contra la gravedad. La posición de equilibrio depende de las propiedades acústicas de los objetos y el líquido de suspensión, la potencia acústica y la posición y el número de los nodos de las ondas acústicas. Cuando unas partículas o unos agregados de la misma clase o de clases diferentes están (levitando) en posiciones de equilibrio diferentes en el canal, se emplea la expresión “multilevitación acústica”.

El líquido L puede fluir durante el procedimiento según la invención, y la formación del primer 110 y el segundo 111 agregados en la etapa b) puede realizarse sin un periodo de detención de flujo.

El enfoque acústico se opone a la difusión inducida por cizallamiento hidrodinámico anteriormente mencionada.

La etapa b) puede tener una duración comprendida entre 0,1 s y 5 minutos.

En otras variantes no mostradas, los procedimientos según la invención permiten la formación de agregados multicapa que comprendan tres o más capas.

Como se ha explicado anteriormente, un agregado de objetos puede ser más compacto que una capa de objetos. La figura 2 muestra una vista desde arriba del primer agregado 110 obtenido al final de la etapa b) según la invención. El primer agregado 110 comprende un conjunto de objetos O que están en contacto mutuo, por ejemplo al menos un 50% de los objetos O que constituyen dicho agregado 110 pueden estar en contacto mutuo.

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La invención puede posibilitar la formación de agregados 2D y/o 3D, por ejemplo dependiendo de la fuerza del campo acústico y los parámetros hidrodinámicos utilizados. La definición de tales agregados 2D y 3D se ofrece posteriormente.

Además, el primer agregado 110 comprende una sucesión 1101 de objetos O en un movimiento a lo largo del eje Y, que corresponde a un desplazamiento a lo largo de la anchura del canal 2. El primer agregado 110 comprende también una sucesión de objetos O en un movimiento a lo largo del espesor del canal 2. Así pues, el primer agregado 110 es un agregado 3D.

En una realización, el agregado comprende una sucesión de objetos en un movimiento a lo largo de la anchura del canal, pero tiene un espesor formado por al menos un objeto. En este caso, el agregado es un agregado 2D.

Volviendo a la figura 1, a continuación se detalla un ejemplo de la etapa c) según la invención. En la figura 1, el primer 110 y el segundo 111 agregados se ponen en contacto para formar un agregado multicapa 120 de objetos O. Dicho agregado multicapa 120 se forma sometiendo el primer 110 y el segundo 111 agregados a ondas acústicas que hacen que dichos primer 110 y segundo 111 agregados se desplacen uno hacia otro.

Estas ondas acústicas son generadas por un generador 100b de campo acústico, que puede funcionar a una frecuencia que permita la formación de una onda estacionaria que comprenda un nodo a lo largo del espesor del canal 2. En un variante, el generador 100b de campo acústico no produce una onda estacionaria a lo largo del espesor del canal 2, pero es capaz de crear un campo de fuerza acústica que posibilita la formación del agregado multicapa.

En el ejemplo mostrado en la figura 1, la etapa c) comprende someter los agregados 110 y 111 a ondas acústicas que tienen menos nodos acústicos que las ondas acústicas aplicadas en la etapa b). Además, en el ejemplo mostrado, el nodo acústico formado en la etapa c) tiene una posición transversal que es diferente de las posiciones transversales de los nodos acústicos de las ondas acústicas aplicadas en la etapa b).

Así pues, los agregados 110 y 111 pueden atravesar un área en la que el número de nodos disminuye, lo que lleva a un nuevo enfoque de los agregados formados, generando así el agregado multicapa 120.

La etapa c) puede tener una duración comprendida entre 10 segundos y 60 minutos.

Como se muestra en la figura 3, entre el generador 100a de campo acústico y la pared superior 4 del canal 2 puede estar presente una capa de un gel 101 que sirva de adaptador de impedancia acústica.

La figura 4 muestra la evacuación del agregado multicapa 120 formado en el procedimiento ilustrado en la figura 1.

En la realización mostrada en la figura 4, el canal 2 está en comunicación de fluidos con una pluralidad de salidas 8. El canal 2 puede, como se muestra, estar conectado a tres salidas 8; dos de estas salidas 8 pueden estar situadas una frente a otra y estar una de ellas abierta en la pared inferior 3 del canal 2 y la otra en la pared superior 4, como se muestra en la figura 4.

El agregado multicapa 120 formado puede descargarse a través de la salida central, y esto puede extenderse a un agregado multicapa de 3 capas o más.

En la figura 5 está ilustrada otra realización de un procedimiento según la invención. En esta figura se forman al final de la etapa b) un primer 110 y un segundo 111 agregados, por ejemplo de la misma manera que en la figura 1.

Sin embargo, en este caso, el primer 110 y el segundo 111 agregados se ponen en contacto para formar el agregado multicapa 120 sometiendo dichos primer 110 y segundo 111 agregados a gravedad en ausencia de ondas acústicas.

En este ejemplo, el primer 110 y el segundo 111 agregados pueden entrar en una zona 48 en la que la intensidad del campo acústico esté reducida, en particular en la que no haya ningún campo acústico. Así, puede dejarse que dichos agregados 110 y 111 se posen para formar el agregado multicapa 120.

En una variante, el primer y el segundo 110 y 111 agregados en la etapa b) pueden formarse después de un periodo de detención de flujo y luego la frecuencia y/o la amplitud de las ondas acústicas pueden sintonizarse con el fin de dejar que los agregados 110 y 111 se posen para generar un agregado multicapa 120 de espesor y composición controlados.

En el ejemplo mostrado en la figura 6, el primer y el segundo 110 y 111 agregados se forman como se ha detallado en la realización mostrada en la figura 1. Sin embargo, la pared inferior 3 del canal 2 tiene un espesor que varía. En este ejemplo, la variación del espesor de la pared inferior 3 puede permitir que las ondas acústicas generadas por el generador 100b de campo acústico tengan un nodo o un antinodo situado en la pared inferior 3. En este caso, el primer 110 y el segundo 111 agregados pueden desplazarse, durante la etapa c), hacia la pared inferior 3 del canal 2 y, como se muestra, el segundo agregado 111 puede ponerse en contacto con dicha pared inferior 3.

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El agregado multicapa 120 formado se situará en la pared inferior 3 del canal 2.

La figura 7 muestra otra realización en la que el espesor t del canal 2 disminuye en al menos una parte de su longitud de tal manera que las ondas acústicas aplicadas en la etapa c) tienen menos nodos acústicos que las ondas acústicas aplicadas en la etapa b). En el ejemplo mostrado, el primer 100a y el segundo 100b generadores de campo acústico emiten ondas acústicas en las etapas b) y c) que tienen sustancialmente la misma frecuencia principal.

En una variante no mostrada, el primer y el segundo generadores de campo acústico emiten ondas acústicas en las etapas b) y c) que tienen una frecuencia principal que es diferente. La diferencia entre las frecuencias principales puede posibilitar la creación en la etapa c) de ondas acústicas que tengan un número diferente de nodos acústicos, opcionalmente menos nodos acústicos, que las ondas acústicas aplicadas en la etapa b).

En una variante no mostrada, el espesor del canal aumenta en al menos una parte de su longitud de tal manera que las ondas acústicas aplicadas en la etapa c) tienen un número de nodos acústicos diferente del de las ondas acústicas aplicadas en la etapa b).

En una variante no mostrada, los agregados pueden ponerse en contacto para formar dicho agregado multicapa de objetos aumentando el número de nodos/antinodos.

La figura 8 muestra una posible configuración para extraer los agregados multicapa 120 formados a lo largo del canal 2.

Puede formarse una serie de agregados multicapa 120 a lo largo del canal 2 y luego puede detenerse el flujo. Para recibir los agregados multicapa 120 puede utilizarse una serie de pozos 200 situados en la pared 3 opuesta al primer 100a y al segundo 100b generadores de campo acústico.

Entonces, los agregados multicapa 120 formados son transportados a los pozos 200 utilizando un flujo lento. Este sistema de disposición de agregados multicapa 120 puede producirse en serie.

La figura 9 muestra una realización del canal 2 observado desde arriba, que tiene la forma de círculos 210 conectados por canales 220 como se muestra en la figura 9. En esta última configuración, los generadores de campo acústico pueden ser cilíndricos y es posible generar un mosaico de agregados.

Ejemplos

A continuación se detallan los resultados experimentales obtenidos mediante los procedimientos según la invención.

La figura 10 muestra un agregado 2D de células cancerosas en levitación obtenido en un canal de 250 pm de espesor.

Las figuras 11A y 11B muestran la multilevitación de partículas. Partículas de dos clases: partículas de látex y sílice, en ambos casos con 10 pm de diámetro, están en equilibrio en dos posiciones diferentes en el espesor (250 pm) del canal. La figura 11A muestra estas partículas al final de la etapa b) según la invención y la figura 11B muestra estas partículas al final de la etapa c) según la invención.

La figura 12A muestra dos capas 2D de partículas de 10 pm de látex (oscuras) y de sílice (claras) que forman una bicapa en levitación.

La figura 12B muestra una bicapa compuesta de un agregado de partículas de látex 3D y un agregado de partículas de sílice.

Referencias

[1] Hoyos et al. Fluidic separation device: US2008/0067128 A1,

[2] Callens, et al. (2008) Analytical Chemistry 80, 4866-4875,

[3] Williams et al. (2008) Analytical Chemistry 80, 7105-7115,

[4] Kuznetsova et al. (2009) Biotechnology Progress 25(3), 834-841.

La expresión “que comprende un/una” debería entenderse como “que comprende al menos un/una”.

La expresión “entre” debería entenderse con los puntos finales incluidos.

Claims (15)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para formar un agregado multicapa (120) de objetos (O) en un canal (2) que comprende un líquido (L), comprendiendo dicho procedimiento:

   a) proporcionar objetos (O) en una primera (50) y una segunda (60) zonas superpuestas del canal (2),

   b) obtener un primer (110) y un segundo (111) agregados de objetos (O) aplicando ondas acústicas transversales, preferiblemente ondas estacionarias, dentro de cada zona a los objetos (O), y

   c) poner dichos primer (110) y segundo (111) agregados en contacto para formar dicho agregado multicapa (120) de objetos (O) sometiendo dichos primer (110) y segundo (111) agregados a:

   o gravedad en ausencia de ondas acústicas, o a

   o ondas acústicas, opcionalmente ondas estacionarias, que hacen que dichos primer (110) y segundo (111) agregados se desplacen uno hacia otro.
2. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, generándose a lo largo de un espesor (t) del canal (2) las ondas acústicas utilizadas en las etapas b) y/o c).
3. 3. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, comprendiendo la etapa c) someter los agregados (110; 111) a ondas acústicas que tienen:

   - un número diferente de nodos acústicos, opcionalmente menos nodos acústicos, que las ondas acústicas aplicadas en la etapa b), y/o

   - al menos un nodo acústico que tiene una posición transversal que es diferente de la o las posiciones transversales del o de los nodos acústicos de las ondas acústicas aplicadas en la etapa b), y/o

   - al menos un antinodo acústico que tiene una posición transversal que es diferente de la o las posiciones transversales del o de los antinodos acústicos de las ondas acústicas aplicadas en la etapa b), y/o

   - una amplitud menor que la amplitud de las ondas acústicas aplicadas en la etapa b).
4. 4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo el canal (2), en al menos una parte de su longitud, una pared cuyo espesor varía, y estando opcionalmente presentes a lo largo de la longitud del canal (2) al menos un primer (100a) y un segundo (100b) generadores de campo acústico y:

   - estando dichos primer (100a) y segundo (100b) generadores de campo acústico situados respectivamente enfrente de partes de pared del canal que tienen un espesor diferente,

   - emitiendo dichos primer (100a) y segundo (100b) generadores de campo acústico ondas acústicas en las etapas b) y c), y

   - teniendo dicho canal (2) una primera y una segunda paredes situadas respectivamente enfrente de dichos primer (100a) y segundo (100b) generadores de campo acústico, que tienen espesores diferentes de tal manera que las ondas acústicas aplicadas en la etapa c) tienen un nodo y/o un antinodo que está situado en dicha segunda pared.
5. 5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, variando, opcionalmente disminuyendo, la anchura (w) y/o el espesor (t) del canal (2) en al menos una parte de su longitud, estando presentes a lo largo de la longitud del canal (2) al menos un primer (100a) y un segundo (100b) generadores de campo acústico para generar respectivamente las ondas acústicas en las etapas b) y c), en donde:

   - dichos primer (100a) y segundo (100b) generadores de campo acústico emiten ondas acústicas en las etapas b) y c) que tienen sustancialmente la misma frecuencia principal, y

   - la anchura (w) y/o el espesor (t) del canal (2) varían, opcionalmente disminuyen, en al menos una parte de su longitud de tal manera que las ondas acústicas aplicadas en la etapa c) tienen un número diferente de nodos acústicos, opcionalmente menos nodos acústicos, que las ondas acústicas aplicadas en la etapa b).
6. 6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, siendo la frecuencia principal de las ondas acústicas aplicadas en la etapa c) diferente de la frecuencia principal de las ondas acústicas aplicadas en la etapa b), de tal manera que las ondas acústicas aplicadas en la etapa c) tienen un número diferente de nodos acústicos, opcionalmente menos nodos acústicos, que las ondas acústicas aplicadas en la etapa b).
7. 7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende:

   a) proporcionar objetos (O) en una primera, una segunda y una tercera zonas superpuestas del canal (2),

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   30

   b) obtener un primer, un segundo y un tercer agregados de objetos (O), opcionalmente aplicando ondas acústicas transversales, en particular ondas estacionarias, dentro de cada zona a los objetos (O), y

   c) poner dichos primer, segundo y tercer agregados en contacto para formar dicho agregado multicapa de objetos (O) sometiendo dichos primer, segundo y tercer agregados a:

   o gravedad en ausencia de ondas acústicas, o a

   o ondas acústicas que inducen fuerzas que desplazan dichos primer, segundo y tercer agregados unos hacia otros.
8. 8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde en la etapa a) se proporcionan capas (51; 61) de objetos (O) en una primera, una segunda y opcionalmente una tercera zonas superpuestas (50; 60) del canal (2), obteniéndose dichas capas (51; 61) opcionalmente mediante un enfoque hidrodinámico.
9. 9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los objetos (O) presentes en la primera zona, en la etapa a), tienen un tamaño y/o una naturaleza diferentes de los objetos (O) presentes, en la etapa a), en al menos una de las segunda y/o tercera zonas.
10. 10. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo el procedimiento después de la etapa b) una etapa de coalescencia de los objetos (O), realizándose dicha coalescencia en particular por completo o parcialmente cuando dichos objetos (O) están presentes en el canal (2).
11. 11. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, evacuándose dichos objetos (O) fuera del canal, por ejemplo en un recipiente, después de la etapa c).
12. 12. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, estando presentes a lo largo de la longitud del canal (2) una pluralidad de generadores (100a; 100b) de ondas acústicas para generar dichas ondas acústicas en las etapas b) y/o c), estando los generadores de ondas acústicas presentes preferiblemente en el mismo lado del canal (2).
13. 13. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, fluyendo el líquido (L) al menos durante las etapas b) y/o c), siendo el número de Reynolds del flujo del líquido (L) opcionalmente menor de 10, en particular no fluyendo el líquido (L) durante la etapa b).
14. 14. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, llevándose a cabo la totalidad o parte del procedimiento en un campo gravitatorio con una fuerza sustancialmente diferente de la fuerza del campo gravitatorio en la superficie de la Tierra.
15. 15. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, estando presentes a lo largo de un eje longitudinal del canal (2) una pluralidad de conjuntos de primer (110) y segundo (111) y opcionalmente tercer agregados.