CN104114692B - 形成物体的多层聚集体的方法 - Google Patents

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Abstract

一种在含有液体(L)的通道(2)中形成物体(O)的多层聚集体(120)的方法，所述方法包括：a)在所述通道(2)的第一叠加区域(50)和第二叠加区域(60)提供所述物体(O)，b)可选地通过在每个所述区域内向所述物体(O)施加横向声波、优选驻波，来获得所述物体(O)的第一聚集体(110)和第二聚集体(111)，和c)通过使所述第一聚集体(110)和所述第二聚集体(111)：‑在不存在声波时，受到重力作用，或者‑受到诱导所述第一聚集体(110)和所述第二聚集体(111)朝向彼此移动的声波、可选地驻波作用，使所述第一聚集体(110)和所述第二聚集体(111)接触，而形成所述物体(O)的多层聚集体(120)。

Description

形成物体的多层聚集体的方法
技术领域
本发明涉及在含有液体的通道中形成物体的多层聚集体的方法。
背景技术
组织工程学领域通过将生物材料与活细胞结合，为再生疗法提出令人兴奋的途径。新型生物材料(支架)与活细胞的结合在许多各种不同的功能组织(例如，骨骼、动脉和膀胱)的重建中已产生了一些临床的成功。然而，由于炎症反应和导致接下来的支架生物降解的病理学纤维化状态，已出现了被称为“细胞片层工程学”的新型组织工程方法学，该“细胞片层工程学”通过将二维细胞片层分层来构造3-D(三维)功能组织，而不使用任何可生物降解的细胞外基质替代物。
尽管如此，当涉及功能性应用时，细胞片层的主要缺点是它们的差的机械性能。当离开培养表面时，细胞片层普遍收缩，从而导致移植尺寸减小。在临床设置中，对于特定的应用，控制特定的移植尺寸和形状将是理想的。此外，细胞片层的脆性使得处理困难。即使当避免基于支架的技术时，解决这些问题的方法在机械上坚固和可操纵自如的3-D组织的有效重建中仍存在重大障碍。
由于再生医学疗法变得更加先进，故对于发展细胞和组织的扩大培养的策略以满足预计的需求存在不断增长的需求。作为回应，对于使用自动化细胞和组织培养系统产生了关注，该细胞和组织培养系统的成功依赖于监测和控制策略。存在各种在体外在悬浮液中形成2-D(二维)聚集体和3-D聚集体的培养技术，例如，在平的且刚性的塑料/玻璃表面上的2-D细胞接种，小球(pellet)培养、球形(spheroid)培养和悬滴培养、支架支撑、液体覆盖、旋转瓶和回转式旋转技术[4]。然而，这些方法会受限于培养时间长、大小不相等的聚集体的形成、或机械可达性难。因此，它们会不适合于高通量分析所需要的形式的标准化的、快速的且大规模的2-D聚集体/3-D聚集体的制造。
利用通过作用于薄室中的声学驻波场所产生的声力可实现操纵微米和亚微米尺寸的颗粒。V为颗粒的体积，<e>为平均声能，k＝2π/λ为波数，为依赖于颗粒和悬浮流体的声学性能的声学对比系数。
该室可被称为“声共振器”。该共振器可包括发射壁和反射壁。当室的厚度w和声波长λ的关系如下面的等式所示时：w＝nλ/2(其中，n为形成在室的厚度中的波节的数目)，可出现驻波。根据声学对比系数(该声学对比系数为被定义为乘积ρici的声阻抗的函数，其中，ρi和ci为流体或悬浮颗粒的密度和声速)，受到厚度可变的该声力场的颗粒，会被推向驻波的波节或波腹。
发展用于宇航员需要的组织工程学的技术，也将令人关注。在太空中的失重条件下，由于培养基中的细胞在反应器内游走且不被自然地导向支架或基质(聚集体和其他的组织必须在支架或基质处生长)，故细胞培养是一个挑战。在失重状态下形成聚集体会进一步花费几天的时间。
需要一种允许快速形成2-D细胞聚集体和3-D细胞聚集体的方法，该方法对于前述细胞培养的常规方法会是有利的。
需要获得一种允许形成包括生物体(例如，细胞)的多层结构的方法。
还需要获得一种形成组织模拟构造的方法。
还需要获得组织工程学的改进技术。
本发明目的在于满足上述需要中的一些或全部。
发明内容
根据第一方面，本发明提供一种在含有液体的通道中形成物体的多层聚集体的方法，所述方法包括：
a)在通道的第一叠加区域和第二叠加区域提供物体，
b)获得物体的第一聚集体和第二聚集体，和
c)通过使所述第一聚集体和所述第二聚集体：
○在不存在声波时，受到重力作用，或者
○受到诱导所述第一聚集体和所述第二聚集体朝向彼此移动的声波、可选地驻波作用，
使所述第一聚集体和所述第二聚集体接触，而形成所述物体的多层聚集体。
“物体的聚集体”的意思是满足所有下列特征的物体的层：
-包含在所述层中的至少两个物体接触，尤其包含在所述层中的至少10％、更好地25％、优选50％的物体接触，和
-当沿着其横向维度中的至少一个维度移动时，所述层在其长度的至少一部分上呈现一串物体。
所获得的聚集体可以是2D聚集体或3D聚集体。
所获得的聚集体可以在平面内延伸，且包括并排的物体、尤其由并排的物体构成。在这种情况下，聚集体被称为2D聚集体。
在另一个实施方式中，所获得的聚集体包括一叠2D聚集体。这种实施方式为3D聚集体的实例。
聚集体不同于仅沿着轴线延伸的一行物体。换句话说，一行物体在宽度上仅包括一个物体、在厚度上仅包括一个物体、以及沿着其长度包括一串物体。
本发明可有利地允许无损坏地连续收集聚集体。
本发明可有利地允许同一种类或不同种类的物体的多层聚集体的形成。
本发明可有利地能够控制且程序化地形成具有一致尺寸的细胞聚集体(2D和/或3D)。
本发明可有利地允许同时形成2-D细胞片层(同型的和/或异型的，即，相同的或不同的细胞类型)，所述2-D细胞片层将以分层的方式，以最低限度地侵入的方式进行定位，例如，以便形成组织模拟构造。
本发明可有利地允许操纵和控制聚集体，且避免物体和通道的壁之间的可改变它们的特性的接触。
本发明还有利地允许快速获得物体的聚集体，尤其是3-D细胞聚集体。
本发明有利地允许利用装置获得多层聚集体，该装置可被相对容易地制造，且可被用在无菌的条件下。用在根据本发明的方法中的装置可包括标准超声设备。
在步骤a)可提供在通道的第一叠加区域和第二叠加区域的物体的层，所述层可选地通过水动力聚焦而获得。
在步骤a)存在于第一区域中的物体可具有不同于在步骤a)存在于第二区域中的物体的尺寸和/或性质。
在步骤b)，通过在每个区域内施加横向声波，可选地驻波，获得物体的第一聚集体和第二聚集体。
在变型中，在步骤b)，通过水动力聚焦，可获得物体的第一聚集体和第二聚集体。在这种情况下，形成聚集体的物体可有利地呈现表面相互作用，例如，静电相互作用，使得物体移动更靠近彼此。
根据一个实施方式，在步骤c)中终止声场，物体的聚集体由于重力而接触，因此，使所述聚集体一个放置在另一个上面，例如，导致有组织的分层的组织模拟构造。
这种实施方式可有利地允许形成悬浮地布置成细胞片层的细胞，从而避免细胞片层的收缩。这种实施方式也是最低程度地侵入性的，且可便于处理。
根据一些实施方式，步骤c)包括使聚集体受到声波作用，该声波具有：
-与在步骤b)应用的声波的声波节的数目不同的、可选地比在步骤b)应用的声波的声波节少的声波节，和/或
-至少一个声波节、各自的声波腹，该至少一个声波节、各自的声波腹的横向位置不同于在步骤b)应用的声波的声波节、各自的声波腹的横向位置，和/或
-小于在步骤b)应用的声波的振幅的振幅。
根据一个特定的实施方式，沿着通道的长度存在至少第一声场发生器和第二声场发生器，并且：
-所述第一声场发生器和所述第二声场发生器在步骤b)和步骤c)发射声波，和
-所述通道具有分别位于在所述第一声场发生器和所述第二声场发生器对面的第一壁和第二壁，所述第一壁和所述第二壁具有不同的厚度，以此方式使得在步骤c)应用的声波具有位于所述第二壁上的波节和/或波腹。
该实施方式可有利地允许所形成的物体的多层聚集体位于通道的其中一个壁上，从而易于分离。
根据一个特定的实施方式，沿着通道的长度存在至少第一声场发生器和第二声场发生器，用于分别生成在步骤b)和步骤c)的声波，其中：
-所述第一声场发生器和所述第二声场发生器在步骤b)和步骤c)发射具有大体上相同的主频率的声波，和
-通道的宽度和/或厚度在其长度的至少一部分上变化、可选地减小，以此方式使得在步骤c)应用的声波具有与步骤b)应用的声波的声波节的数目不同的、可选地比在步骤b)应用的声波的声波节少的声波节。
根据一个特定的实施方式，在步骤c)应用的声波的主频率可不同于在步骤b)应用的声波的主频率，以此方式使得在步骤c)应用的声波具有与在步骤b)应用的声波的声波节的数目不同的、可选地比在步骤b)应用的声波的声波节少的声波节。
根据一个特定的实施方式，本发明涉及一种方法，该方法包括：
a)在通道的第一叠加区域、第二叠加区域和第三叠加区域提供物体，
b)可选地通过在每个区域内向物体施加横向声波、尤其是驻波，来获得物体的第一聚集体、第二聚集体和第三聚集体，和
c)通过使所述第一聚集体、所述第二聚集体和所述第三聚集体：
○在不存在声波时，受到重力作用，或者
○受到诱导所述第一聚集体、所述第二聚集体和所述第三聚集体朝向彼此移动的力的声波作用，
使所述第一聚集体、所述第二聚集体和所述第三聚集体接触，以便形成所述物体的多层聚集体。
在本发明的特定实施方式中，第一聚集体和第二聚集体、以及可选的第三聚集体中的至少一个包括至少100个物体，尤其至少250个物体，尤其至少500个物体，尤其至少750个物体，尤其至少1000个物体，尤其至少1500个物体。
在本发明的优选实施方式中，第一聚集体和第二聚集体、以及可选的第三聚集体中的至少一个包括至少100个细胞、尤其至少250个细胞，尤其至少500个细胞，尤其至少750个细胞，尤其至少1000个细胞，尤其至少1500个细胞。
在本发明的优选实施方式中，第一聚集体和第二聚集体、以及可选的第三聚集体中的每一个包括至少100个物体、尤其至少250个物体，尤其至少500个物体，尤其至少750个物体，尤其至少1000个物体，尤其至少1500个物体。
在本发明的优选实施方式中，第一聚集体和第二聚集体、以及可选的第三聚集体中的每一个包括至少100个细胞，尤其至少250个细胞，尤其至少500个细胞，尤其至少750个细胞，尤其至少1000个细胞，尤其至少1500个细胞。
如上所述，本发明有利地允许快速且容易地获得细胞聚集体，数以百计的细胞的3D构造优选在几秒钟内形成。
根据一个特定的实施方式，在强度小于或等于10m/s2，尤其小于或等于9.5m/s2，尤其小于或等于9m/s2，尤其小于或等于8.5m/s2，尤其小于或等于8m/s2，尤其小于或等于7.5m/s2，尤其小于或等于7m/s2，尤其小于或等于6.5m/s2，尤其小于或等于6m/s2，尤其小于或等于5.5m/s2，尤其小于或等于5m/s2，尤其小于或等于4.5m/s2，尤其小于或等于4m/s2，尤其小于或等于3.5m/s2，尤其小于或等于3m/s2，尤其小于或等于2.5m/s2，尤其小于或等于2m/s2，尤其小于或等于1.5m/s2，尤其小于或等于1m/s2，尤其小于或等于0.5m/s2的重力场中，全部或部分地执行该方法。
在特定的实施方式中，在强度明显不同于在地球表面的重力场的强度的重力场中，全部或部分地执行根据本发明的方法，该地球表面的重力场的强度等于9.81m/s2。
“强度明显不同于在地球表面的重力场的强度的重力场”的意思是强度与9.81m/s2相差至少5％的重力场。
特别有利的是在步骤b)利用声波，这是因为，在这种情况下，该方法不会受到重力条件，例如，受到在失重条件下或在地球重力条件下执行该方法的因素的显著影响。事实上，声辐射力由声场和物质之间的相互作用而产生，这点与重力场无关。因此，例如，在驻波场中，将物质引导至平衡位置(例如，朝向波节)是类似于具有人造重力。
当在步骤b)利用声波时，唯一的差别是，在1g下的聚集体的平衡位置稍微低于在0g下的聚集体的平衡位置。
例如，在0g下，细胞聚集体的平衡位置可设置在压力波节处，在1g下，细胞聚集体的平衡位置可设置在稍微低于远离通道的壁的波节。
当用在强度低于在地球表面的重力场的强度(g＝9.81m/s2)的重力场中时，根据本发明的方法是特别有利的。事实上，当利用声波(例如，超声驻波)时，所产生的声力可使物体(例如，游走细胞)聚集，而不需要任何其他外力。
因此，即使当在低强度(例如，在失重状态下)的重力场中执行根据本发明的方法时，该方法也有利地允许获得物体(例如，细胞)的紧凑的3D构造。
在特定的实施方式中，本发明涉及如上所限定的方法，其中：
-液体(L)为细胞培养基，和
-第一聚集体(110)和第二聚集体(111)、以及可选的第三聚集体中的至少一个包括细胞，和
-当所述细胞存在于所述第一聚集体(110)、所述第二聚集体(111)、以及可选的所述第三聚集体中的至少一个中时，培养所述细胞。
因此，当执行根据本发明的方法时，存在于第一聚集体和第二聚集体、以及可选的第三聚集体中的至少一个中的细胞会生长，在细胞培养期间，所述细胞的数目至少乘以2或甚至乘以5。
在优选的实施方式中，通过细胞培养，形成至少一个组织，特别地，通过细胞培养，形成骨骼组织。所形成的组织优选为3D组织。
优选地，在强度明显不同于、尤其是低于在地球表面的重力场的强度的重力场中，进行细胞培养。
在微重力下的细胞培养显示出双重好处。
首先，在为充分生长的组织提供理想环境的浮力中，如在正常的生理条件下一样，在微重力下可生长3D组织。
其次，如上所述，有利的是为宇航员的需要开发组织工程学的技术，即，骨骼重建和组织损伤替换。
本发明有利地允许在微重力下聚集游走细胞，而不需要任何其他外力，例如，以形成紧凑的3D构造。
在优选的实施方式中，第一聚集体和第二聚集体、以及可选的第三聚集体被保持在至少一小时，尤其至少一天，尤其至少一周的期间内。
特别优选的是，向这些第一聚集体和第二聚集体、以及可选的第三聚集体施加声波，以形成声阱，其中，稳定的聚集体在数小时、数天或数周期间内可被保持巩固。
在特定的实施方式中，在细胞培养期间，一些细胞培养基至少一次被引入在通道中。
在特定的实施方式中，在细胞培养期间，细胞培养基被更新至少一次。表述“细胞培养基被更新”的意思是，最初与聚集体接触的细胞培养基完全由另一个可具有相同或不同化学性质的重新被引入到通道中的细胞培养基替代。
由于这些聚集体是特别稳定的，故本发明有利地允许更新细胞培养基，而不干扰聚集体。该优势是令人关注的，这是因为，当不利用本发明时，培养基不可能轻易更换，事实上，在微重力条件下，流动会产生带出聚集体的扰动。
在微重力下，聚集体的用于提高组织生长的剪切刺激会是困难的，这是因为，任何扰动产生构造的不受控制的移动。然而在本发明中，可施加产生剪切应力的振动或振荡，同时保持构造在3D平衡位置周围。
在特定的实施方式中，第一聚集体和第二聚集体、以及可选的第三聚集体为3D聚集体。
在特定的实施方式中，多组第一聚集体和第二聚集体、以及可选的第三聚集体沿着通道的纵向轴线存在。
在优选的实施方式中，多组第一3D聚集体和第二3D聚集体沿着通道的纵向轴线存在，并且，所述多组聚集体通过在强度低于在地球表面的重力场的强度的重力场中执行步骤b)而获得。
声场发生器、声波和物体的悬浮
在步骤b)和/或步骤c)使用的声波可具有10MHz或更小的、优选被包括在0.5MHz和10MHz之间的主频率fmax。
在该频率范围内使用声场发生器可有利地促进维持活细胞或物体(例如，囊泡、脂质体、细菌或病毒)的完整性。
在步骤b)和/或步骤c)使用的声波可有利地沿着通道的厚度而生成。
声场发生器可以是压电体，例如，陶瓷。
例如，可以使用由丹麦的Kvistgard的Ferroperm Piezoceramics公司，以编号PZ26出售的声场发生器。
声场发生器的与通道的壁接触的部分可以是圆形的或矩形的。
该部分的面积可以大于或小于通道面积(即，长乘宽)。根据形成聚集体所需的配置，所述面积可以等于通道面积。
声场发生器可由正弦张力(tension)提供动力。在变型中，声场发生器可由三角波张力或方波张力提供动力。
声场发生器可被数字地或模拟地控制。
声场发生器可由波发生器(例如，由以色列的Tabor electronics公司出售的型号5062)提供动力。
通过波发生器发射的波可由放大器放大，该放大器例如为由以色列的Taborelectronics公司出售的型号9250。
在步骤b)和/或步骤c)期间，波发生器可以产生振幅在0Vp-p(伏特峰峰值)和40Vp-p之间的波。
在步骤b)和/或步骤c)期间产生的声能密度可在1J/m3(焦耳/m3)和1000J/m3之间，例如在1J/m3和300J/m3之间，例如在5J/m3和50J/m3之间，可以例如是10J/m3。
在步骤b)和/或步骤c)使用的声波可具有为通道沿着其横向维度中的一个维度的共振频率的主频率。
通道的横向维度为通道的厚度和宽度。
“为通道沿着其横向维度中的一个维度的共振频率的主频率”的意思是频率f0，使得在沿着通道的纵向轴线的给定位置所测量的通道的横向维度z满足式中n为整数，以及式中cf为在通道中存在的液体中、在所述液体的温度(例如，20℃)下的声速。
换句话说，频率f0对应于理论频率，在沿着通道的纵向轴线的给定位置处，该理论频率满足声波在通道中的共振条件和沿着所考虑的横向维度的驻波的形成。
在步骤b)和/或步骤c)使用的声波可具有在0.5f0和1.5f0之间，尤其在0.75f0和0.95f0之间、或者在1.05f0和1.25f0之间的主频率。
使用这种频率可有利地允许产生足够强以获得令人满意的物体的集中的声力。
声场发生器可被固定至通道的其中一个壁。适当地利用对于技工已知的任何手段，尤其是通过粘合，可进行该固定。
一层声学适配材料可存在于声场发生器和通道壁中的至少一个壁之间。
通过使用对于技工已知的任何适当的材料，可制成声学适配。
为了生成在步骤b)和/或步骤c)的所述声波，沿着通道的长度可存在多个声场发生器，声场发生器优选存在于通道的同一侧上。
通道
根据本发明，可以使用在US 2008/0067128中所描述的通道，US2008/0067128的内容以引用的方式并入本文中。
几何特征
通道的宽度和/或厚度在其长度的至少一部分上可变化，可选地减小。
因此，当沿着通道的纵向轴线移动时，所述通道的厚度可以是不变的或者可以变化。特别地，通道可包括至少两个轴向地跟随彼此、且呈现不同厚度的区域。
通道在其长度的至少一部分上，尤其在其整个长度上，可呈现小于或等于3cm的厚度，更好地，小于或等于1cm的厚度。例如，通道为微通道。
“微通道”的意思是在其整个长度上具有小于或等于1cm的厚度的通道。
通道在其长度的至少一部分上，尤其在其整个长度上，可呈现在50μm和3mm之间、优选在100μm和500μm之间的厚度。
当沿着所述通道的纵向轴线移动时，所述通道的宽度可以是不变的或者可以变化。例如，通道呈现两个轴向地跟随彼此、且呈现不同宽度的区域。
“通道的纵向轴线”意思是互相连接通道的横截面的重心的线。通道的纵向轴线可以是直的或曲线的，且可被包含在平面内，该平面可以是通道的横截面中的一些或甚至全部的对称平面。
在实施方式中，当从上方观测时，通道宽度可以变化，且通道可具有锥体形状。在该特定的情况下，声场发生器可以是矩形的或不是矩形的。
在变型中，当从上方观测时，通道可具有由子通道、尤其是直线形子通道连接的圆圈的形状。
在通道具有圆圈的形状的配置中，声场发生器可以是圆柱形的，特别地，所述配置能够生成马赛克式的聚集体。
通道在其长度的至少一部分上，尤其在其整个长度上，可具有在1mm和40mm之间、优选在5mm和20mm之间的宽度。
例如，沿着其纵向轴线所测量的通道的长度在3mm和1000mm之间，优选在10mm和500mm之间。
例如，通道具有100mm的长度、10mm的宽度和0.4mm的厚度。
根据另一个示例性实施方式，通道的长度可以在10mm和1000mm之间，通道的宽度可以在1mm和40mm之间，通道的厚度可以在0.5mm和3mm之间。
当沿着其纵向轴线移动时，通道可包括大体上不变的横断面。
通道在其长度的至少一部分上，尤其在其整个长度上，可具有矩形的横断面。
在变型中，通道在其长度的至少一部分上，尤其在其整个长度上，可具有正方形的或圆形的横断面。
通道可有利地具有大于或等于10的宽度/厚度比和/或长度/厚度比。
该比例可有利地防止流动轮廓(profile)中的三维效应。
在优选的实施方式中，通道在其长度的至少一部分上，尤其在其整个长度上，具有矩形的横断面和大于等于10的宽度/厚度比。
通道的壁可以是薄片形的。
通道的壁在它们的长度的至少一部分上，尤其在它们的整个长度上，可具有在0.5mm和5mm之间的厚度。
通道在其长度的至少一部分上，可包括厚度变化的壁。
这种配置可允许在具有不同厚度的壁的部分附近产生声波节或声波腹，从而使聚集体在该区域附近彼此接触。
当执行根据本发明的方法时，在产生声波的壁的对面的壁可自由振荡。
入口和出口
通道可与至少一个、尤其是至少两个入口流体连通。
通道可与至少一个、尤其是至少两个出口流体连通。
包括多个入口和/或多个出口，例如，两个入口和两个出口的通道，可被放置在稳定的框架中，或被放置在可以被倾斜的框架中，以便改变重力加速度。
通道入口和/或出口可被连接至注射泵和/或蠕动泵。当通道入口和/或出口被连接至蠕动泵时，水动力阻尼器可被添加在蠕动泵与通道入口和/或出口之间。
通道可与一个或多个出口流体连通，在该出口处，通过根据本发明的方法形成的多层聚集体可被排出。
因此，可以不必打开通道，以便收集所形成的多层聚集体。
优选地，至少一个入口呈现出不小于通道宽度的宽度，和/或呈现出大体上为矩形的截面。
在本发明的实施方式中，至少一个入口通向通道的底壁和顶壁中的一个壁中，另一个入口通向通道的底壁和顶壁中的另一个壁中。
例如，两个入口面向彼此布置。
在变型中，所有的入口通向通道的底壁或通向通道的顶壁。
在本发明的实施方式中，至少两个入口沿着通道的纵向轴线相对于彼此偏移。
至少一个入口可大体上平行于或垂直于通道的纵向轴线而通向通道。
在本发明的实施方式中，至少一个进料孔通过导管与至少一个入口流体连通，该导管尤其包括从导管的尖端分叉的分流部分，该进料孔邻近所述尖端、尤其垂直于导管而通向导管。
该导管的分流部分使其可以从进料点开始形成物质片。
在本发明的实施方式中，至少第一出口和第二出口与通道流体连通，且通过具有沿着通道的厚度所测量的非零高度的横向分隔壁而彼此分开。
出口可以允许回收通过根据本发明的方法形成的多层聚集体。
至少两个出口可沿着通道的纵向轴线相对于彼此偏移。在变型中，至少两个出口可面向彼此。
在本发明的实施方式中，通道与至少第一出口、第二出口和第三出口流体连通，第二出口沿着通道的厚度被布置在第一出口和第三出口之间。
在本发明的实施方式中，至少一个出口孔通过导管与通道的出口流体连通，该导管包括截面侧向变窄的部分，尤其是朝向尖端会聚的部分，当从上方观测时，所述部分为三角形，例如，该出口孔例如邻近尖端，尤其垂直于导管而通向导管。
该导管的会聚部分可起到避免在出口孔处形成滞点的作用。
构成通道的材料
通道的壁可包括选自下面的材料，尤其由选自下面的材料组成：有机玻璃或矿物玻璃、石英、热塑性材料(尤其是PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)或聚碳酸酯)、和金属。更一般地说，可以使用任何具有高声阻抗(即，比流体的声阻抗大至少10倍)的材料。
通道可利用用在微流体领域中的种类的常规制造方法来制造。
在适当情况下，微通道可设置有至少一个阀门，例如，电磁阀。
液体和物体
液体可以是生物液体，如血液。
在变型中，液体可以是水。
液体对于可见光可以是透明的。
在步骤b)期间，液体可以不流动。
根据实施方式，液体至少在步骤b)和/或步骤c)期间流动，液体的流的雷诺数可选地小于10。
物体可以为单分散生物细胞或多分散生物细胞，尤其是血细胞，例如，血球。
在特定的实施方式中，物体具有正的声学对比系数。
下面详细地定义“声学对比系数”。
声辐射力具有下面的表达式：
Fac＝<Eac>VpkA(ρ，β)Sin(2ky)，
其中，<Eac>为平均声能密度；Vp为颗粒物质的体积，k＝2π/λ，其中，λ为超声波的波长
声学对比系数具有下面的表达式：
A(ρ，β)＝[(5ρp-2ρf)/(2ρp+ρf)]-βp/βf
其中：
-ρp和ρf分别为颗粒p的密度和悬浮流体f的密度，
-βp和βf分别为颗粒p的压缩系数和悬浮流体f的压缩系数，和
-y为距驻波波节面的距离。
在特定的实施方式中，物体具有负的声学对比系数。
在特定的实施方式中，物体选自：气泡、微气泡、纳米气泡、液滴、脂肪细胞、血脂、磷脂囊泡、或它们的混合物。
具有负的声学对比系数的物体可在步骤b)之后被定位在不同的压力波腹处。在变型中，具有负的声学对比系数的物体可被定位在压力波节和压力波腹之间。
例如，第一物体在步骤b)之后被定位于第一压力波腹处，第二物体在步骤b)之后被定位于第二压力波腹处，所述第二压力波腹不同于第一压力波腹且与第一压力波腹叠加，所述第二物体不同于所述第一物体，例如，具有不同的密度或不同的弹性常数。所述第一物体和所述第二物体可具有相同的尺寸。
在特定的实施方式中，该方法包括在步骤b)后确定物体的至少一个特征，例如，至少一个声学特征，例如，所述物体的声阻抗。
在特定的实施方式中，该方法包括在步骤b)后物体的凝聚步骤，当所述物体存在于通道中时，特别地，全部或部分地执行所述凝聚。
在特定的实施方式中，在步骤c)后，物体被排出到通道外，例如，排出到容器中。
物体可以是刚性的或可变形的颗粒，例如，聚苯乙烯颗粒。
更一般地说，物体可以是刚性的或可变形的颗粒、多分散颗粒、生物细胞(尤其是血细胞，例如，血液样本或血球样本中的癌细胞)、细菌、胶状乳剂或非胶状乳剂、蛋白质或脂质体。
存在于通道中的物体的平均尺寸可以小于或等于100μm。
“平均尺寸”的意思是以总体的一半统计的粒度尺寸，被称为D50。
所采用的流速可取决于所处理的样本、通道的体积和所施加的声力。
例如，液体可以以在0.1ml/min至100ml/min之间的流速，在根据本发明的方法的全部或部分期间流动。
在特定的实施方式中，当最大主声力(acoustic primary force)与重力具有相同的量级(即，对于直径为10μm的乳胶颗粒或细胞，为1pN(皮牛顿＝10-9))时，对于体积为1ml的通道，液体可以以0.1ml/min的流速流动。
在所述物体被注入通道中时所测量的物体的体积分数可以是0.1％(v/v)或更大。物体的体积分数对应于[(物体的体积)/(含有所述物体的液体的体积)]x100％。
附图说明
根据查阅附图、以及根据阅读用于实施本发明的非限制性实例的下文详细描述，将更好地理解本发明，附图中：
图1示出用于执行根据本发明的方法的装置，
图2示出根据本发明的方法所获得的聚集体，
图3为根据在图1中使用的通道的III-III的视图，
图4为排出根据图1中所示的方法所形成的多层聚集体的实例，
图5至图8为用于执行根据本发明的方法的装置的变型，
图9为可被用在根据本发明的方法中的通道的实施方式，和
图10至图12B示出通过根据本发明的方法所获得的实验结果。
具体实施方式
图1示出可被用在根据本发明的方法中的装置1。装置1包括沿着纵向轴线X延伸的通道2。
如上所述，通道2可以是微通道。
通道2呈现出例如为矩形的横截面。在所描述的实例中，通道2的长度/厚度比大于10。
通道2具有底壁3和顶壁4。如图所示，通道2与入口7(例如，5个入口7)流体连通。
入口7在通道2的顶壁4和底壁3中打开，如图所示，4个入口7垂直于X轴线打开。另外，在通道2的顶壁4中打开的入口7平行于X轴线通向所述通道2。
在未示出的变型中，入口均通向通道的底壁。
入口7具有大体上矩形的截面，且具有等于通道2的宽度的宽度。
入口7被垂直于纵向轴线X的横向分隔壁10隔开。
如图所示，入口7呈现出小于通道2的厚度的厚度，例如，小于通道2的厚度的一半。
在图1所示的实施方式中，一些入口7可以沿着X轴线偏移例如分隔壁10。
如图所示，至少一个入口7通向连接到具有更大厚度的第二区域46的第一区域45，另一个入口7通向第二区域46，沿着通道2的厚度测量厚度。
第二区域46被连接至通道2的中心区域47。
区域45和区域46之间的厚度差以及区域46和区域47之间的厚度差对应于分隔壁10之间的高度差。
如下所述，装置1可被用在根据本发明的方法中。
例如，如图1所示，载液L和多个物体O被通过入口7引起流动。
物体O可以是单分散的或多分散的，所述物体O可以是生物细胞，液体L可以是生物液体，例如，血液。
在适当情况下，装置1可具有一个或多个用于控制物体O通过入口7注入的阀门，其中，这种阀门例如可以是呈现单个通道或多个通道的电磁阀。
为了加工大容量物体，可以控制物体O通过入口7的注入的频率和流速，以便使装置1能够连续运行。
这种装置1通过水动力聚焦技术，在通道2的第一叠加区域50和第二叠加区域60提供物体O(步骤a))。
物体O的第一层51和第二层61分别呈现在所述第一叠加区域50和第二叠加区域60中，所述第一层51的厚度和第二层61的厚度通过水动力聚焦来控制。
如图1所示，物体O的第一层51和第二层61被一层纯液体L隔开。呈现在第一层51中的物体O可以与呈现在第二层61中的物体O相同。在变型中，呈现在第一层51中的物体O和呈现在第二层61中的物体O属于不同的种类。在变型中，呈现在第一层51中的物体O的尺寸不同于呈现在第二层61中的物体O的尺寸。
这种物体的层可经受对于多悬浮潜流会是不利的水动力剪切诱导扩散[3]。
因此，装置1设置有如图所示固定至通道2的顶壁4的声场发生器100a和声场发生器100b。在图1中，声场发生器100a和声场发生器100b沿着通道2布置，且呈现在所述通道2的同一侧上。在未示出的变型中，声场发生器可沿着通道布置，且呈现在所述通道的相对侧上。
在步骤b)，声场发生器100a能够形成物体O的第一聚集体110和第二聚集体111。如图1所示，物体O以多悬浮被置于由声场发生器100a产生的波的压力波节周围。换句话说，在步骤b)结束时，第一聚集体110和第二聚集体111中的每一个被定位在不同的压力波节处。声场发生器100a可以以允许沿着通道2的厚度形成包括两个波节的驻波的频率而运行。在变型中，声场发生器100a沿着通道2的厚度不产生驻波，但能够产生能够形成聚集体的声力场。
当声学操纵试图将物体置于抵抗重力的平衡位置时，采用表述“声悬浮”。平衡位置取决于物体和悬浮液的声学性能、声功率和声波的波节的位置和数目。当同一种类或不同种类的颗粒或聚集体在通道中的不同平衡位置(悬浮)时，采用表述“声学多悬浮(acoustic multi-levitation)”。
液体L可以在根据本发明的方法期间流动，并且可以在步骤b)形成第一聚集体110和第二聚集体111，而没有停流时段。
声学聚焦对抗上述水动力剪切诱导扩散。
步骤b)可具有在0.1s至5分钟之间的持续时间。
在未示出的其他变型中，根据本发明的方法能够形成包括三层或更多层的多层聚集体。
如上所述，物体的聚集体可以比一层物体更加紧凑。图2示出根据本发明在步骤b)结束时所获得的第一聚集体110的上方视图。第一聚集体110包括一组彼此接触的物体O，例如，构成所述聚集体110的物体O的至少50％可以彼此接触。
例如，根据声场的强度和所用的水动力参数，本发明能够形成2D聚集体和/或3D聚集体。在下文中给出这种2D聚集体和3D聚集体的定义。
此外，当沿着Y轴线移动时，第一聚集体110包括一串物体O 1101，其对应于沿着通道2的宽度的位移。当沿着通道2的厚度移动时，第一聚集体110还包括一串物体O。因此，第一聚集体110为3D聚集体。
在一实施方式中，当沿着通道的宽度移动时，聚集体包括一串物体，但具有由至少一个物体形成的厚度。在这种情况下，聚集体为2D聚集体。
返回到图1，现将详细说明根据本发明的步骤c)的实例。在图1中，第一聚集体110和第二聚集体111接触，以形成物体O的多层聚集体120。通过使第一聚集体110和第二聚集体111受到诱导所述第一聚集体110和第二聚集体111朝向彼此移动的声波作用，而形成所述多层聚集体120。
这些声波由可以以允许沿着通道2的厚度形成包括一个波节的驻波的频率而运行的声场发生器100b而生成。在变型中，声场发生器100b不沿着通道2的厚度产生驻波，但能够产生能够形成多层聚集体的声力场。
在图1所示的实例中，步骤c)包括使聚集体110和聚集体111受到声波作用，该声波的声波节比在步骤b)应用的声波的声波节少。此外，在所示的实例中，在步骤c)所形成的声波节的横向位置不同于在步骤b)应用的声波的声波节的横向位置。
因此，聚集体110和聚集体111可通过波节的数目减少的区域，导致所形成的聚集体重新集中，从而产生多层聚集体120。
步骤c)可具有在10秒和60分钟之间的持续时间。
如图3所示，作为声阻抗适配器的一层凝胶101可存在于声场发生器100a和通道2的顶壁4之间。
图4示出在图1所阐明的方法中形成的多层聚集体120的排出。
在图4所示的实施方式中，通道2与多个出口8流体连通。如图所示，通道2可被连接至3个出口8，这些出口8中的两个可面向彼此而一个可打开，一个可通向通道2的底壁3，另一个可通向顶壁4，如图4所示。
所形成的多层聚集体120可通过中心出口而被排出，这点可扩展到具有3层或更多层的多层聚集体。
图5中示出了根据本发明的方法的另一个实施方式。在该附图中，例如以与图1中相同的方式在步骤b)结束时形成第一聚集体110和第二聚集体111。
然而，在这种情况下，在不存在声波时，通过使第一聚集体110和第二聚集体111受到重力作用，来使所述第一聚集体110和第二聚集体111接触而形成多层聚集体120。
在该实例中，第一聚集体110和第二聚集体111可进入区域48，在该区域48中，声场的强度降低，特别地，在该区域48中不存在声场。因此，所述聚集体110和聚集体111可被允许沉降，而形成多层聚集体120。
在变型中，在步骤b)，第一聚集体110和第二聚集体111可在停流时段之后而形成，然后，声波的频率和/或振幅可被调谐，以便使聚集体110和聚集体110沉降以形成厚度和组成可控的多层聚集体120。
在图6所示的实例中，按照在图1所示的实施方式中详细说明的，形成第一聚集体110和第二聚集体111。然而，通道2的底壁3具有变化的厚度。在该实例中，底壁3的厚度的变化可使由声场发生器100b产生的声波具有位于底壁3上的波节或波腹。在这种情况下，在步骤c)期间，第一聚集体110和第二聚集体111可被朝向通道2的底壁3移动，如图所示，第二聚集体111可与所述底壁3接触。
所形成的多层聚集体120可被定位在通道2的底壁3上。
图7示出另一个实施方式，其中，通道2的厚度t在其长度的至少一部分上减小，以此方式使得在步骤c)应用的声波的声波节比在步骤b)应用的声波的声波节少。在所示的实例中，第一声场发生器100a和第二声场发生器100b在步骤b)和步骤c)发出具有大体上相同的主频率的声波。
在未示出的变型中，第一声场发生器和第二声场发生器在步骤b)和步骤c)发出具有不同的主频率的声波。主频率之间的差异能够在步骤c)形成具有不同数目的、可选地比在步骤b)应用的声波少的声波节的声波。
在未示出的变型中，通道的厚度在其长度的至少一部分上增加，以此方式使得在步骤c)应用的声波与在步骤b)应用的声波相比具有不同数目的声波节。
在未示出的变型中，通过增加波节/波腹的数目，可使聚集体接触而形成所述物体的多层聚集体。
图8示出了移动沿着通道2所形成的多层聚集体120的可能的配置。
一系列多层聚集体120可沿着通道2形成，然后，流动可被停止。一系列被设置在与第一声场发生器100a和第二声场发生器100b相对的壁3上的井200可被用于容纳多层聚集体120。
然后，所形成的多层聚集体120利用慢的流动被运送至井200。该多层聚集体120的处置系统可按顺序进行制造。
图9示出从上方观测到的通道2的实施方式，如图9所示，该通道2具有圆圈210的形状，该圆圈210被通道220连接。在通道220的配置中，声场发生器可以是圆柱形的，且可形成马赛克式的聚集体。
实例
在下文中详细说明通过根据本发明的方法所获得的实验结果。
图10示出了在250μm厚度的通道中获得的悬浮的癌症细胞2D聚集体。
图11A和图11B示出了颗粒的多悬浮。直径均为10μm的两种种类的颗粒：乳胶颗粒和二氧化硅颗粒在通道的厚度(250μm)中的两个不同位置处于平衡状态。图11A示出根据本发明在步骤b)结束时的这些颗粒，图11B示出根据本发明在步骤c)结束时的这些颗粒。
图12A示出形成悬浮双层的10μm的乳胶颗粒(深色)和二氧化硅颗粒(亮色)的两个2D层。
图12B示出由3D乳胶颗粒聚集体和二氧化硅颗粒聚集体组成的双层。
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[3]Williams等，(2008)Analytical Chemistry 80,7105-7115,
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表述“包括一/一个”应被理解成“包括至少一个”。
表述“在…之间的”应被理解具有所包含的端点。

Claims (33)

1.一种在含有液体(L)的通道(2)中形成物体(O)的多层聚集体(120)的方法，所述方法包括：
a)在所述通道(2)的第一叠加区域(50)和第二叠加区域(60)提供所述物体(O)，
b)通过在每个区域内向所述物体(O)施加横向声波，获得所述物体(O)的第一聚集体(110)和第二聚集体(111)，和
c)通过使所述第一聚集体(110)和所述第二聚集体(111)
○在不存在声波时，受到重力作用，或者
○受到诱导所述第一聚集体(110)和所述第二聚集体(111)朝向彼此移动的声波作用，
使所述第一聚集体(110)和所述第二聚集体(111)接触，而形成所述物体(O)的多层聚集体(120)，
其中，在步骤b)和/或步骤c)使用的所述声波沿着所述通道(2)的厚度(t)生成。
2.根据权利要求1所述的方法，沿着所述通道(2)的厚度(t)生成在步骤c)使用的所述声波。
3.根据权利要求1所述的方法，步骤c)包括使所述聚集体(110；111)受到声波作用，所述声波具有：
-与在步骤b)应用的声波的声波节的数目不同的声波节，和/或
-至少一个声波节，所述至少一个声波节的横向位置不同于在步骤b)应用的声波的声波节的横向位置，和/或
-至少一个声波腹，所述至少一个声波腹的横向位置不同于在步骤b)应用的声波的声波腹的横向位置，和/或
-振幅，所述振幅小于在步骤b)应用的声波的振幅。
4.根据权利要求1所述的方法，所述通道(2)在其长度的至少一部分上包括厚度变化的壁。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，沿着所述通道(2)的长度存在至少第一声场发生器(100a)和第二声场发生器(100b)，并且所述第一声场发生器(100a)和所述第二声场发生器(100b)分别面向所述通道的具有不同厚度的壁部分。
6.根据权利要求4所述的方法，沿着所述通道(2)的长度存在至少第一声场发生器(100a)和第二声场发生器(100b)，并且：
-所述第一声场发生器(100a)和所述第二声场发生器(100b)在步骤b)和步骤c)发射声波，和
-所述通道(2)具有分别位于所述第一声场发生器(100a)和所述第二声场发生器(100b)对面的第一壁和第二壁，所述第一壁和所述第二壁具有不同的厚度，以此方式使得在步骤c)应用的声波具有位于所述第二壁上的波节和/或波腹。
7.根据权利要求1所述的方法，所述通道(2)的宽度(w)和/或厚度(t)在其长度的至少一部分上变化。
8.根据权利要求1所述的方法，沿着所述通道(2)的长度存在至少第一声场发生器(100a)和第二声场发生器(100b)，以分别生成在步骤b)和步骤c)的声波，其中：
-所述第一声场发生器(100a)和所述第二声场发生器(100b)在步骤b)和步骤c)发射具有相同的主频率的声波，和
-所述通道(2)的宽度(w)和/或厚度(t)在其长度的至少一部分上变化，以此方式使得在步骤c)应用的声波具有与步骤b)应用的声波的声波节的数目不同的声波节。
9.根据权利要求1所述的方法，在步骤c)应用的声波的主频率不同于在步骤b)应用的声波的主频率，以此方式使得在步骤c)应用的声波具有与步骤b)应用的声波的声波节的数目不同的声波节。
10.根据权利要求1所述的方法，包括：
a)在所述通道(2)的第一叠加区域、第二叠加区域和第三叠加区域提供所述物体(O)，
b)获得所述物体(O)的第一聚集体、第二聚集体和第三聚集体，和
c)通过使所述第一聚集体、所述第二聚集体和所述第三聚集体
○在不存在声波时，受到重力作用，或者
○受到诱导所述第一聚集体、所述第二聚集体和所述第三聚集体朝向彼此移动的力的声波作用，
使所述第一聚集体、所述第二聚集体和所述第三聚集体接触，以便形成所述物体(O)的多层聚集体。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤a)在所述通道(2)的第一叠加区域和第二叠加区域(50；60)提供所述物体(O)的层(51；61)。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述层(51；61)通过水动力聚焦而获得。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤a)存在于所述第一叠加区域中的所述物体(O)具有不同于在步骤a)存在于所述第二叠加区域中的所述物体(O)的尺寸和/或性质。
14.根据权利要求1所述的方法，所述物体(O)为单分散生物细胞或多分散生物细胞。
15.根据权利要求1所述的方法，所述物体(O)具有正的声学对比系数。
16.根据权利要求1所述的方法，所述物体(O)具有负的声学对比系数。
17.根据权利要求16所述的方法，所述物体(O)选自：气泡、液滴、脂肪细胞、血脂、磷脂囊泡、或它们的混合物。
18.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括在步骤b)后确定所述物体的至少一个特征。
19.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括在步骤b)后所述物体(O)的凝聚步骤。
20.根据权利要求19所述的方法，当所述物体(O)存在于所述通道(2)中时，全部或部分地执行所述凝聚。
21.根据权利要求1所述的方法，在步骤c)后，所述物体(O)的多层聚集体(120)被排出到所述通道外。
22.根据权利要求1所述的方法，所述第一聚集体(110)和所述第二聚集体(111)中的至少一个包括至少100个物体(O)。
23.根据权利要求1所述的方法，沿着所述通道(2)的长度存在多个声场发生器(100a；100b)以生成在步骤b)和/或步骤c)的所述声波。
24.根据权利要求1所述的方法，所述液体(L)至少在步骤b)和/或步骤c)期间流动。
25.根据权利要求1所述的方法，所述液体(L)在步骤b)期间不流动。
26.根据权利要求1所述的方法，其中：
-所述液体(L)为细胞培养基，和
-所述第一聚集体(110)和所述第二聚集体(111)中的至少一个包括细胞，和
-当所述细胞存在于所述第一聚集体(110)和所述第二聚集体(111)中的至少一个中时，培养所述细胞。
27.根据权利要求26所述的方法，通过细胞培养，形成至少一个组织。
28.根据权利要求27所述的方法，通过细胞培养，形成骨骼组织。
29.根据权利要求28所述的方法，在所述细胞培养期间，一些细胞培养基至少一次被引入在所述通道(2)中。
30.根据权利要求29所述的方法，在所述细胞培养期间，所述细胞培养基被更新至少一次。
31.根据权利要求1所述的方法，在至少一小时的期间内所述第一聚集体和所述第二聚集体被保持。
32.根据权利要求1所述的方法，所述第一聚集体(110)和所述第二聚集体(111)为三维3D聚集体。
33.根据权利要求1所述的方法，多组所述第一聚集体(110)和所述第二聚集体(111)沿着所述通道(2)的纵向轴线存在。
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