ES2689765T3 - Variantes del gen NDI1 de levadura y sus usos en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la disfunción mitocondrial - Google Patents

Abstract

Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una variante funcional optimizada inmunitaria de la proteína NDI1 de levadura de SEQ ID nº 542 que comprende al menos un cambio de aminoácido conservador en un resto seleccionado del grupo que consiste en: L195, F90, I82, L89, V266, L481, L202, L259, L150, R85, Y151, Y482, S488, V45 y S80, en donde el ácido nucleico comprende al menos 50 codones que, en comparación con la secuencia del gen NDI1 de levadura natural de SEQ ID nº 1, están codones optimizados para la expresión en células de mamíferos.

Description

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DESCRIPCION

Variantes del gen NDI1 de levadura y sus usos en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la disfunción mitocondrial

Campo técnico

La invención se refiere a variantes del gen NDI1 de levadura y a los usos de los genes variantes en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.

Introducción

La neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON) es un trastorno heredado de la madre que afecta a 1/25.000 personas, principalmente varones1. La pérdida de la visión central resulta de la degeneración de la capa de células ganglionares de la retina (CGR) y del nervio óptico2. En más del 95% de los pacientes, la patogenia genética de la LHON implica mutaciones en genes que codifican componentes del complejo mitocondrial respiratorio NADH- ubiquinona oxidorreductasa3 (complejo I), que está involucrado en la transferencia de electrones desde NADH a ubiquinona (coenzima Q). El complejo I está compuesto por cuarenta y seis subunidades, siete de las cuales están codificadas por el genoma mitocondrial, ND1-6 y ND4L. Las mutaciones en cinco de las subunidades codificadas por mitocondrias del complejo I, ND1, ND4, ND4L, ND5 y ND6, están relacionadas con la LHON (
http://www.mitomap.org/MITOMAP). Existen pruebas crecientes de que la disfunción mitocondrial puede estar involucrada en una amplia gama de trastornos neurodegenerativos tales como la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Huntington y la atrofia óptica dominante, así como enfermedades multifactoriales incluidas la degeneración macular por la edad seca y húmeda (AMD), retinopatías diabéticas y glaucoma4 Quizás no sea sorprendente que un tejido como la retina, con los requisitos de energía más significativos de cualquier tejido de mamífero5, pueda ser particularmente vulnerable a la disfunción mitocondrial. Sin embargo, es notable que tal dependencia del metabolismo energético en principio puede proporcionar una oportunidad para el desarrollo de intervenciones terapéuticas para dichos tejidos tan dependientes de la energía en los que un cambio en el metabolismo energético puede proporcionar sustanciales efectos beneficiosos. La disfunción del complejo I produce un aumento de las especies de oxígeno reactivo (ROS) y una disminución del suministro de energía6. En las mitocondrias, la síntesis de ATP está acoplada con el consumo de oxígeno mediante el gradiente electroquímico de protones constituido a través de la membrana interna mitocondrial en el proceso denominado fosforilación oxidativa7(OXPHOS). Las mutaciones del complejo mitocondrial I que conducen a la disfunción de la cadena respiratoria están, por lo tanto, relacionadas con un consumo reducido de oxígeno; una medida confiable de la actividad mitocondrial general.

Curiosamente, muchas mutaciones de LHON no son totalmente penetrantes, parece que la aparición de las características patológicas del trastorno puede verse influida por modificadores genéticos y ambientales. Por ejemplo, se ha observado que la mutación T14484C en la subunidad ND6 tiende a asociarse con un mejor resultado clínico y, a veces, la recuperación en la función visual8. Además, se ha sugerido que ciertos antecedentes genéticos mitocondriales pueden hacer que los pacientes sean más o menos sensibles a una variedad de trastornos, incluido la LHON, y que esto puede estar relacionado con variaciones en el consumo de oxígeno, la eficiencia del transporte de electrones y la producción de ATP9. Por ejemplo, las mutaciones G11778A y T14484C de LHON en unos antecedentes del haplogrupo J o K mitocondrial se han asociado con un mayor riesgo de pérdida visual10. Los genes modificadores nucleares pueden influir en la evolución y gravedad de la LHON, por ejemplo, se ha descrito11 un locus modificador ligado a x. Además, se ha sugerido que fumar es uno de los factores ambientales que pueden influir en la penetración de la enfermedad12. Además, la prevalencia masculina (5:1) de LHON puede estar influenciada al menos en parte por estrógenos13. Una interacción entre la mutación primaria, los genes nucleares modificadores, antecedentes genéticos del ADN mitocondrial y los factores ambientales pueden colaborar para determinar el riesgo global de pérdida visual para un paciente con LHON dado.

Si bien se ha logrado un progreso significativo con respecto a la comprensión de la patogenia genética de la LHON, el desarrollo de terapias génicas para la LHON se ha visto obstaculizado por la necesidad de administrar terapias a las mitocondrias de las CGR. Además, la heterogeneidad intragénica ha hecho que el desarrollo de terapias sea complejo. La expresión alotópica o nuclear de los genes mitocondriales se está explorando como una posible vía terapéutica para algunos trastornos mitocondriales, incluido la LHON ligada a ND4, aunque pueden requerirse modificaciones para facilitar la importación de proteínas expresadas en las mitocondrias141516. Se ha considerado que un método de complementación nuclear con NDI1 es un posible tratamiento para la enfermedad de Parkinson (EP)17. Además, la administración del serotipo 5 del virus recombinado adenoasociado (AAV) de NDI1 en la capa óptica del tubérculo cuadrigémino superior del cerebro, recientemente se ha demostrado que proporciona un beneficio significativo en un modelo de LHON de rata químicamente inducido utilizando lecturas funcionales e histológicas18. Mientras que esto representa una estrategia emocionante e innovadora que hace uso de la genoterapia transkingdom, el modo de administración puede no ser fácilmente traducible a pacientes humanos con LHON.

Es un objeto de la invención superar al menos uno de los problemas mencionados anteriormente.

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Declaraciones de la invención

La invención se refiere a variantes del gen NDI1 de levadura de SEQ ID n°: 1 que están optimizados en los codones para proporcionar una expresión mejorada en células de mamífero, y/o modificados para codificar una inmunovariante funcional optimizada de proteína NDI1. La optimización de codones implica reemplazar codones que son frecuentes en células de levadura y poco frecuentes en células de mamífero con codones sinónomos que son frecuentes en células de mamífero. Estos se conocen como "cambios imperceptibles" ya que no dan lugar a un cambio de aminoácido en la proteína codificada. La optomización del codón proporciona una expresión mejorada del ácido nucleico en células de mamífero y/o transmite menos inmunogenicidad. La optimización inmunitaria implica la sustitución de uno o más aminoácidos (es decir, véase la tabla 1b), por ejemplo, de uno a diez aminoácidos, en la proteína para proporcionar una proteína variante que presenta una inmunogenicidad reducida in vivo en el hombre en comparación con la proteína NDI1 de levadura. Los ejemplos de posibles cambios de aminoácidos incluyen cambios conservadores de aminoácidos en una o más de las siguientes posiciones:

L195, F90, I82, L89, V266, L481, L202, L259, L150, R85, Y151, Y482, S488, V45, S80, por ejemplo, uno o más de los siguientes cambios de aminoácidos:

L195F, F90H, L259F, I82V, F90Y, L89I, V266I, L481I, L202M, L259V, L150M, R85K, Y151F, Y482F, S488T, V45I, S80T.

En un primer aspecto, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico optimizada con codón aislado que codifica una variante funcional optimizada inmunitaria de la proteína NDI1 de levadura de SEC ID n°: 542 que comprende al menos un cambio de aminoácido conservador en un resto seleccionado del grupo que consiste en:

L195, F90, I82, L89, V266, L481, L202, L259, L150, R85, Y151, Y482, S488, V45 y S80, por ejemplo, uno o más de los siguientes cambios de aminoácidos:

L195F, F90H, L259F, I82V , F90Y, L89I, V266I, L481I, L202M, L259V, L150M, R85K, Y151F, Y482F, S488T, V45I y S80T, en donde el ácido nucleico comprende al menos 50 codones que son codones optimizados en comparación con la secuencia del gen NDI1 de levadura natural de SEQ ID n°: 1.

Los ejemplos de variantes con codones optimizados del gen NDI1 de levadura se enumeran en las SEQ ID n°: 2-62, n°: 75-145, n°: 165-243, n°: 264-341, n°: 362-441, n°: 462-541 y n°: 705-1004.

Los ejemplos de variantes inmunitarias y con codones optimizados del gen NDI1 de levadura se enumeran en SEQ ID n°: 75-145, n°: 165-243, n°: 264-341, n°: 362-441, n°: 462-541, n°: 566-584, n°: 705-824, n°: 835-884, n°: 895-944 y n°: 955-1004.

Los ejemplos de variantes optimizadas inmunitarias del gen NDI1 de levadura (sin optimización de codones) se muestran en SEQ ID n°: 63-74 y n°: 547-565 (un cambio de aminoácido), n°: 146-164 y n°: 585-605 (dos cambios de aminoácidos), n°: 244 -263 y n°: 606-640 (tres cambios de aminoácidos), n°: 641-675 (cuatro cambios de aminoácidos), n°: 342-361 y n°: 676-696 (cinco cambios de aminoácidos), n°: 697-703 (seis cambios de aminoácidos), n°: 704 (siete cambios de aminoácidos) y n°: 442-461 (diez cambios de aminoácidos).

Generalmente, la secuencia de ácido nucleico de la invención codifica una variante funcional de la proteína NDI1 de levadura de SEQ ID n°: 542 que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID n°: 542. Preferiblemente, la variante funcional comprende al menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID n°: 542.

Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico de la invención codifica una proteína NDI1 de levadura incluidos al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 cambios de aminoácidos. Generalmente, de 1-15, o idealmente de 1-10, aminoácidos se cambian, y los cambios se seleccionan adecuadamente en las posiciones NDI1 del grupo: V45, S80, I82, R85, L89, F90, L150, Y151, L195, L202, L259, V266, L481, Y482, S488.

Debidamente, la proteína variante incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 cambios de aminoácidos seleccionados de: L195F, F90H, L259F, I82V, F90Y, L89I, V266I, L481I, L202M, L259V, L195I, L150M, R85K, Y151F, Y482F, S488T, V45I, S80T.

Preferiblemente, al menos 90, 100, 150, 200, 250, 300, 320 o 329 codones son codones optimizados para uso en un mamífero. En una realización, se optimizan 100-200, 200-300 o 300-329 codones están optimizados. Idealmente, 329 codones están optimizados.

Preferiblemente, el ácido nucleico de la invención codifica una proteína variante que tiene al menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID n°: 542.

La invención también se refiere a un montaje de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención y una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de localización mitocondrial. Esto puede ser, pero no se limita a, secuencias tales como MLSKNLYSNKRLLTSTNTLVRFASTRS (SEQ ID n°: 1006) o MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSL (SEQ ID n°: 1007).

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El ácido nucleico puede ser un ácido nucleico ADN o ARN. El ácido nucleico de la invención puede usar ácidos nucleicos modificados para optimizar la administración y/o aumentar la estabilidad y/o aumentar la longevidad y/o reducir la inmunogenicidad2223.

La expresión "secuencia de ácido nucleico de la invención" como se emplea a continuación debe entenderse como una o ambas de las secuencias de ácido nucleico de la invención y los montajes de ácido nucleico de la invención.

También se describe una proteína codificada por una secuencia de ácido nucleico de la invención. La proteína también puede incluir una o más señales de localización mitocondrial. Esto puede ser, pero no se limita a, secuencias tales como MLSKNLYSNKRLLTSTNTLVRFASTRS (SEQ ID n°: 1006) o

MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSL (SEQ ID n°: 1007).

La invención también se refiere a un vector adecuado para uso en genoterapia y que comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención. Propiamente, el vector es un vector vírico, por lo general un virus adenoasociado (AAV), preferiblemente el serotipo 2 del virus AAV, aunque pueden emplearse otros serotipos de AAV y otros tipos de vectores, como por ejemplo otros vectores víricos, vectores no víricos, ADN desnudo y otros vectores, cuyos ejemplos se enumeran en la tabla 5. Por lo general, el ácido nucleico de la invención se expresa individualmente a partir del vector (portador de administración único). En otra realización, el ácido nucleico de la invención se expresa junto con otro gen del portador de administración individual o usando dos portadores de administración, por ejemplo, un gen que mejora la supervivencia celular o la función celular tal como un factor neurótrofo, un factor de crecimiento, un agente antiapoptótico, un antioxidante, una citocina, una hormona u otros, cuyos ejemplos se describen en la tabla 6. Los genes pueden administrarse al mismo tiempo y/o antes y/o después de cada uno. Idealmente, el segundo gen es un factor neurótrofo, cuyos ejemplos se describen en la tabla 6.

También se describe en la presente memoria un equipo que comprende un vector de la invención en combinación con un segundo vector que comprende un gen que potencia la supervivencia celular y/o la función celular tal como un factor neurótrofo, un factor de crecimiento, un agente antiapoptótico, un antioxidante, una citocina, una hormona u otros, cuyos ejemplos se describen en la tabla 6. Idealmente, el segundo vector comprende un gen que codifica un factor neurótrofo.

En una realización adicional, se pueden expresar secuencias génicas adicionales en el mismo vector que el ácido nucleico de la invención a partir de un componente tal como un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) y/o se pueden expresar usando dos o múltiples secuencias activadoras.

Por lo general, el vector de la invención comprende un activador en donde el ácido nucleico de la invención se expresa a partir del activador. Preferiblemente, el activador es el que se expresa preferente o específicamente en células ganglionares de la retina (CGR) en las que la expresión del ácido nucleico de la invención está bajo el control del activador. Ejemplos de dichos activadores se describen en la tabla 4. En una realización alternativa, el vector de la invención comprende un activador que se sabe que se expresa a bajos niveles en las CGR.

En una realización más, el activador es el que se sabe que se expresa en múltiples tipos de células, cuyos ejemplos se describen en la tabla 4.

En una realización más, el ácido nucleico de la invención se puede expresar a partir de un activador inducible y/o condicional.

En una realización, el activador es un activador específico de tejidos y/o específico de células dirigido a células de mamífero distintas de CGR tales como el activador de rodopsina que se expresa en células fotorreceptoras de bastones. Propiamente, el vector comprende activadores específicos de tejidos y/o activadores específicos de células combinados con un sistema activador inducible para controlar la expresión del ácido nucleico.

Los activadores pueden controlar la expresión del ácido nucleico de la invención en combinación con genes adicionales, como se describió anteriormente. Alternativamente, el vector puede comprender diferentes activadores para expresar el ácido nucleico de la invención y los demás genes, por ejemplo, un gen que codifica un agente neurótrofo.

La invención también se refiere a un método para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad neurodegenerativa, especialmente LHON, cuyo método comprende una etapa de suministrar un ácido nucleico de la invención a un individuo mediante administración intraocular, idealmente intravítrea. En un aspecto, un ácido nucleico de la invención se administra a un individuo mediante administración general.

Preferiblemente, la etapa de administrar el ácido nucleico de la invención implica administrar un vector de la invención al individuo.

La invención también se refiere al uso de un ácido nucleico de la invención, o una proteína codificada por un ácido nucleico de la invención, o un vector de la invención, como medicamento.

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La invención también se refiere a una secuencia de ácido nucleico de la invención, o un vector de la invención, para su uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, especialmente la neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON). Por lo general, el tratamiento es sintomático o tratamiento profiláctico.

También se describe en la presente memoria un método para tratar una enfermedad, por ejemplo, una enfermedad asociada a la disfunción mitocondrial, por ejemplo una enfermedad neurodegenerativa, en un individuo que comprende una etapa de administración de un agente activo al individuo, administrando generalmente el agente activo al ojo, idealmente para las células ganglionares de la retina, las células fotorreceptoras u otras células oculares, en las que el agente activo incluye una secuencia de ácido nucleico de la invención, una proteína codificada por la secuencia de ácido nucleico o un vector de la invención. El tratamiento puede ser sintomático o profiláctico.

Por lo general, el agente activo se administra por administración intraocular, idealmente intravítrea y/o subretiniana. El agente activo puede incluir un agente adicional, por ejemplo, un gen o proteína o compuestos que mejoran la supervivencia celular y/o la función celular tal como un factor neurótrofo, un factor de crecimiento, un agente antiapoptótico, un antioxidante, una citocina, una hormona u otros, cuyos ejemplos se describen en la tabla 6. El agente activo y el agente adicional, por ejemplo, un gen adicional, pueden administrarse al mismo tiempo o antes o después uno del otro.

Idealmente, el agente adicional es un gen que codifica un factor neurótrofo, cuyos ejemplos se describen en la tabla 6. El agente activo puede administrarse mediante un vector, o mediante vectores separados, o mediante la administración directa del agente adicional. El agente activo puede administrarse a otras partes del cuerpo que involucran una disfunción mitocondrial, por ejemplo, al cerebro para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson o la demencia, o células fotorreceptoras para el tratamiento de la retinosis pigmentaria o degeneración macular relacionada con la edad o a las células musculares para tratar debilidad y/o degeneración muscular.

Además, la secuencia de ácido nucleico de la invención, su producto proteico, o un vector de la invención, puede administrarse a la célula o tejido diana al mismo tiempo o en momentos diferentes del agente adicional.

La invención también se refiere a una célula in vitro, por ejemplo, una célula madre o célula progenitora, una célula CGR o precursora de CGR que se transforma con un ácido nucleico de la invención. Las células de la invención pueden administrarse al ojo mediante inyección subretiniana y/o intravítrea para tratar las células del ojo afectadas por la disfunción mitocondrial tal como la disfunción de CGR. Alternativamente, las células de la invención pueden administrarse a otras partes del cuerpo que implican disfunción mitocondrial, por ejemplo, al cerebro para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson o la demencia, o a células fotorreceptoras para el tratamiento de la retinosis pigmentaria o la degeneración macular relacionada con la edad, o a las células musculares para tratar la debilidad y/o la degeneración muscular.

Por lo tanto, la célula transformada de la invención se puede usar como medicamento. Se describe un método para tratar una enfermedad o afección que implica una disfunción mitocondrial, por lo general una enfermedad neurodegenerativa, propiamente LHON, que comprende una etapa de administración de las células de la invención al individuo.

También se describe una formulación farmacéutica que comprende un agente activo seleccionado de entre un ácido nucleico de la invención, una proteína codificada por el ácido nucleico de la invención, un vector de la invención, o una célula de la invención, en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Propiamente, la formulación se proporciona en forma de cápsula de liberación lenta adaptada para liberar el agente activo después de una inyección subretiniana y/o intravítrea, o después de la administración a o cerca de un tipo de tejido/tipo de célula diana (véanse ejemplos en la tabla 7).

La tecnología de células encapsuladas se puede emplear para la administración del tratamiento.

También se describe un órgano transgénico, o un animal transgénico no humano, que comprende los ácidos nucleicos y vectores de la invención.

La invención puede administrarse a células con mutaciones en el genoma nuclear que conducen a fenotipos de enfermedades que son similares a fenotipos de enfermedades relacionados con mutaciones mitocondriales. Por ejemplo, los fenotipos de enfermedades descritos en la tabla 8 pueden todos proceder de mutaciones nucleares o mutaciones mitocondriales y, por lo tanto, pueden beneficiarse de la invención. La invención necesitaría administrarse al tipo de célula o tejido afectado apropiado. Normalmente, estas mutaciones nucleares afectan a tipos de células que requieren altos niveles de energía, como las neuronas y las células musculares. Por lo tanto, estos trastornos, que proceden de mutaciones en el genoma nuclear y que afectan a estos tipos de células que requieren alta energía, también pueden beneficiarse de la energía adicional proporcionada por la invención.

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También se describe un método para el tratamiento o prevención de una enfermedad neurodegenerativa,

especialmente LHON, cuyo método comprende una etapa de administrar un gen NDI1 de levadura, o una variante

del mismo, tal como un ácido nucleico de la invención, a un individuo mediante administración intraocular, idealmente administración intravítrea y/o subretiniana.

También se describe un método para el tratamiento o prevención de una enfermedad neurodegenerativa,

especialmente LHON, cuyo método comprende una etapa de administrar a un individuo un gen NDI1 de levadura, o

una variante del mismo tal como un ácido nucleico de la invención, y un agente que mejora la supervivencia celular y/o la función celular tal como un factor neurótrofo, un factor de crecimiento, un agente antiapoptótico, un antioxidante, una citocina, una hormona u otros (cuyos ejemplos se describen en la tabla 6). El tratamiento puede ser sintomático o profiláctico.

También se describe un método para el tratamiento o la prevención de una enfermedad neurodegenerativa, especialmente LHON, cuyo método comprende una etapa de administración de un gen NDI1 de levadura, o una de sus variantes tal como un ácido nucleico de la invención usando un vector AAV, y la administración de un agente que usa el mismo o un vector AAV diferente, que mejora la supervivencia celular o la función celular, tal como un factor neurótrofo, un factor de crecimiento, un agente antiapoptótico, un antioxidante, una citocina, una hormona u otros (cuyos ejemplos se describen en la tabla 6) a un individuo. El tratamiento puede ser sintomático o profiláctico.

La expresión "gen NDI1 de levadura" se refiere al gen NDI1 de Saccharomyces cerviscae natural que se muestra en la SEQ ID n°: 1.

La expresión "variante de gen NDI1 de levadura" significa una variante del gen NDI1 de levadura que difiere del gen natural debido al menos a la optimización del codón, la optimización inmunitaria o ambas.

Por la expresión "cambio conservador de aminoácidos" debe entenderse que el aminoácido que se está introduciendo es similar estructural, química o funcionalmente al que se está sustituyendo. En particular, se refiere a la sustitución de un aminoácido de un grupo concreto definido por su cadena lateral por un aminoácido diferente del mismo grupo.

La expresión ácido nucleico significa ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN) y análogos de ácidos nucleicos artificiales tales como ácido peptidonucleico (APN), ácido morfolino-nucleico y bloqueado, ácido glicolnucleico y ácido treosanucleico. Los análogos de ácidos nucleicos artificiales difieren del ADN y ARN ya que generalmente contienen cambios en la estructura de la molécula. Los ácidos nucleicos que incorporan modificación o modificaciones químicas a ADN y ARN para optimizar la administración y/o aumentar la estabilidad y/o aumentar la longevidad y/o reducir la inmunogenicidad también son contemplados por la expresión ácido nucleico. Se han realizado modificaciones, tales como fosforotioatos, boranofosfato, 2'-amino, 2'-fluoro, 2'-metoxi en los ácidos nucleicos para modular parámetros tales como la resistencia a la degradación por nucleasas, la afinidad de unión y/o la absorción. Ejemplos de moléculas de ácido nucleico para su uso son fosforamidato, fosfotioato y análogos de metilfosfonato de ADN y/o ARN. Las modificaciones incluyen, pero no están limitadas a, la inclusión de 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina , seudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 2'-O-metilo, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w and 2,6-diaminopurina, 2-tiouridina, 5-metil-citidina entre otros.

La expresión "codón optimizado" significa que un codón que expresa un sesgo para levaduras (es decir, es frecuente en genes de levaduras, pero poco frecuente en genes de mamíferos) se cambia por un codón sinónimo (un codón que codifica el mismo aminoácido) que expresa un sesgo para mamíferos. Por lo tanto, el cambio en el codón no produce ningún cambio de aminoácido en la proteína codificada.

La expresión "optimizada inmunológicamente" aplicado a una variante del gen NDI1 de levadura significa que la variante genética codifica una proteína NDI1 variante que provoca una respuesta inmunitaria reducida cuando se expresa en un mamífero en comparación con el gen NDI1 de levadura natural.

Por la expresión "proteína NDI1 de levadura" debe entenderse la proteína NDI1 natural de Saccharomyces cerviscae que se muestra en la SEQ ID n° 542. La "variante funcional" debe entenderse que significa una variante de la SEQ ID n° 542 que conserva la funcionalidad de la proteína NDI1 de levadura, por ejemplo, mediciones comparables del consumo de oxígeno en presencia de rotenona (véanse los métodos a continuación/figura 2) Por lo general, las variantes funcionales de la proteína NDI1 de levadura tendrán al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID n° 542 En este contexto, una secuencia polipeptídica que comparte una identidad de aminoácidos del 90% con la SEQ ID n° 542 es aquella en la que cualquier 90% de restos alineados son idénticos a, o sustituciones conservadoras de, los restos correspondientes en la SEQ ID n° 542. El

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"porcentaje de identidad de secuencia" de dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Karlin y Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264 - 68, 1990, modificado como en Karlin y Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 - 77, 1993. Dicho algoritmo está incorporado a los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990. Las búsquedas de proteína BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener homólogos de secuencias de aminoácidos a las moléculas de proteína de la invención. Cuando existen espacios entre dos secuencias, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402, 1997. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden utilizarse parámetros predeterminados de los programas respectivos (p. ej., XBLAST y nBlAST).

Por la expresión "enfermedad neurodegenerativa" debe entenderse una enfermedad caracterizada por lesión neuronal o muerte, o degeneración axonal, e incluye enfermedades tales como las enfermedades de las neuronas motoras; enfermedades priónicas; enfermedad de Huntington; enfermedad de Parkinson; Parkinson plus; tauopatías; demencias del cromosoma 17; enfermedad de Alzheimer; esclerosis múltiple (MS); neuropatías hereditarias y adquiridas; retinopatías y enfermedades que conllevan degeneración cerebelosa.

En el contexto de la presente invención, el término "genoterapia" se refiere al tratamiento de un individuo que implica la inserción de un gen en las células de un individuo con el fin de prevenir o tratar la enfermedad. La inserción del gen generalmente se consigue usando un portador para administración, también conocido como vector. Se pueden emplear vectores víricos y no víricos para administrar un gen a las células de un paciente. Se describen a continuación otros tipos de vectores adecuados para uso en genoterapia.

Por la expresión "agente neurótrofo" debe entenderse una proteína que induce la supervivencia, el desarrollo y la función de las neuronas. Los ejemplos incluyen el factor de crecimiento nervioso (NGF) y el factor neurótrofo derivado del cerebro (BDNF). Se proporcionan a continuación otros ejemplos.

Las células ganglionares de la retina (CGR) son tipos de neuronas situadas cerca de la superficie interna (la capa ganglionar retiniana) de la retina del ojo. Visualizan información formando imágenes y sin formar imágenes colectivamente desde la retina en varias regiones en el tálamo, el hipotálamo y el mesencéfalo.

Se apreciará que los ácidos nucleicos de la invención puedan incluir una o más señales de poliadenilación, por lo general situadas en el extremo 3' de la molécula. Además, el ácido nucleico puede incluir una secuencia principal y/o un codón de terminación. También se apreciará que los ácidos nucleicos de la invención pueden incluir una o más señales para facilitar la importación de proteínas a las mitocondrias.

Las proteínas y polipéptidos (incluidos variantes y fragmentos de los mismos) y para su uso en la invención pueden generarse total o parcialmente mediante síntesis química o mediante expresión a partir de ácido nucleico. Las proteínas y péptidos de la presente invención y para su uso en la misma pueden prepararse fácilmente según los métodos de síntesis de péptidos bien probados, en fase líquida normal o, preferiblemente, en fase sólida conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, J. M. Stewart y J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2a edición, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984), en M. Bodanzsky y A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Nueva York (1984)).

Además de los sistemas de administración específicos expresados a continuación, se conocen diversos sistemas de administración y se pueden usar para administrar el agente terapéutico de la invención, p. ej., encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células biotecnológicas capaces de expresar la endocitosis terapéutica mediada por receptor (véase, p. ej., Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), montaje de un ácido nucleico terapéutico como parte de un vector retrovírico u otro, etc. Los métodos de introducción incluyen, pero no se limitan a, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intraocular, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. Los compuestos pueden administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, mediante infusión o inyección intravenosa rápida, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (p. ej., mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser general o local. Además, puede ser deseable introducir las composiciones farmacéuticas en el sistema nervioso central por cualquier vía adecuada, incluida la inyección intraventricular e intratecal; la inyección intraventricular puede ser facilitada por un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un depósito, tal como un depósito Ommaya. La administración pulmonar también puede emplearse, p. ej., mediante un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente aerosolizante. Además, el ADN desnudo puede usarse para partos.

Se pueden incluir agentes tales como tensioactivos en formulaciones para minimizar la agregación del agente terapéutico de la invención, ya sean vectores víricos y/o no víricos, proteínas o polipéptidos y/o células.

En un ejemplo específico, puede ser deseable administrar composiciones farmacéuticas localmente en el área que necesita tratamiento; esto puede conseguirse, por ejemplo, mediante un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluidas membranas, tales como membranas sialásticas o fibras.

En otro ejemplo, el agente terapéutico puede administrarse en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer, Science 249: 1527-1533 (1990); Treat et al., en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,

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López-Berestein y Fidler (eds.), Liss, Nueva York, págs. 353-365 (1989); López-Berestein, ibid., págs. 317-327; véase en general ibid.)

En otro ejemplo más, el agente terapéutico puede administrarse en un sistema de liberación controlada. En un ejemplo, se puede usar una bomba (véase Langer, más arriba; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed., Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:75 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). En otro ejemplo, se pueden usar materiales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controled Drugs Biodisponibility, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); véase también Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989)). En otro ejemplo más, se puede colocar un sistema de liberación controlada cerca de la diana terapéutica, requiriendo así solo una fracción de la dosis general (véase, p. ej., Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, más arriba, volumen 2, págs. 115-138 (1984)). Otros sistemas de liberación controlada se exponen en la reseña de Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).

También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden un ácido nucleico de la invención y/o una proteína codificada por el ácido nucleico. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del agente terapéutico y un portador farmacéuticamente aceptable. En una opción específica, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales y el hombre. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el agente terapéutico. Dichos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también se pueden emplear como portadores líquidos, especialmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares.

La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes amortiguadores del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación prolongada y similares. La composición puede formularse como un supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir portadores habituales tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados están descritos en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del agente terapéutico, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portador a fin de proporcionar la forma de administración apropiada para el paciente.

La composición puede formularse según procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a seres humanos. Por lo general, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en amortiguador acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente disolvente y un anestésico local tal como lidocaína para aliviar el dolor en la zona de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran por separado o se mezclan juntos en una forma galénica unitaria, por ejemplo, como un polvo seco liofilizado o concentrado exento de agua en un recipiente herméticamente sellado tal como una ampolla o bolsita indicando la cantidad de agente activo. Cuando la composición se va a administrar por infusión, se puede administrar con una botella de infusión que contiene agua estéril de calidad farmacéutica o solución salina. Cuando la composición se administra por inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua esterilizada para inyectables o solución salina de modo que los ingredientes puedan mezclarse antes de su administración.

La cantidad del agente terapéutico de la invención que será eficaz en el tratamiento de un trastorno o afección concreto dependerá de la naturaleza del trastorno o afección, y puede determinarse por técnicas clínicas convencionales. Además, los ensayos in vivo y/o in vitro se pueden emplear opcionalmente para ayudar a predecir los intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa que se empleará en la formulación también dependerá de la vía de administración y de la gravedad de la enfermedad o trastorno, y debe decidirse de acuerdo con el criterio del médico y las circunstancias de cada paciente.

Secuencias de ácidos nucleicos

El listado de secuencias a continuación resume varias secuencias de ácidos nucleicos, específicamente:

SEQ ID n° 1 - Gen NDI1 de levadura - 0 cambios de aminoácidos - 0 cambios de codones

SEQ ID n° 2-21 y n° 825-834 - Gen NDI1 de levadura - 0 cambios de aminoácidos -100 cambios de codones

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SEQ ID n° 22-41 y n° 885-894 - Gen NDI1 de levadura - 0 cambios de aminoácidos - 200 cambios de codones

SEQ ID n° 42-61 y n° 945-954- Gen NDI1 de levadura - 0 cambios de aminoácidos - 300 cambios de codones

SEQ ID n° 62 - Gen NDI1 de levadura - 0 cambios de aminoácidos - 329 cambios de codones

SEQ ID n° 63-74 y n° 547-565- Gen NDI1 de levadura -1 cambio de aminoácido - 0 cambios de codones

SEQ ID n° 75-94 y n° 835-844 - Gen NDI1 de levadura -1 cambio de aminoácido -100 cambios de codones

SEQ ID n° 95-114 y n° 895-904 - Gen NDI1 de levadura -1 cambio de aminoácidos - 200 cambios de codones

SEQ ID n° 115-134 y n° 955-964 - Gen NDI1 de levadura -1 cambio de aminoácidos - 300 cambios de codones

SEQ ID n° 134-145 y n° 566-584 - Gen NDI1 de levadura -1 cambio de aminoácido - 329 cambios de codones

SEQ ID n° 146-164 y n° 585-605 - Gen NDI1 de levadura - 2 cambios de aminoácidos - 0 cambios de codones

SEQ ID n° 165-184 y n° 845-854 - Gen NDI1 de levadura - 2 cambios de aminoácidos -100 cambios de codones

SEQ ID n° 185-204 y n° 905-914 - Gen NDI1 de levadura - 2 cambios de aminoácidos - 200 cambios de codones

SEQ ID n° 205-224 y n° 965-974 - Gen NDI1 de levadura - 2 cambios de aminoácidos - 300 cambios de codones

SEQ ID n° 225-243 y n° 705-725 - Gen NDI1 de levadura - 2 cambios de aminoácidos - 329 cambios de codones

SEQ ID n° 244-263 y no 606-640 - Gen NDI1 de levadura - 3 cambios de aminoácidos - Cambios de 0 codones

SEQ ID n° 264-283 y n° 855-864 - Gen NDI1 de levadura - 3 cambios de aminoácidos -100 cambios de codones

SEQ ID n° 284-303 y 915-924 - Gen NDI1 de levadura - 3 cambios de aminoácidos - 200 cambios de codones

SEQ ID n° 304-323 y n° 975-984 - Gen NDI1 de levadura - 3 cambios de aminoácidos - 300 cambios de codones

SEQ ID n° 324-341 y n° 726-760 - Gen NDI1 de levadura - 3 cambios de aminoácidos - 329 cambios de codones

SEQ ID n° 641-675 - Gen NDI1 de levadura - 4 cambios de aminoácidos - 0 cambios de codones

SEQ ID n° 865-874 - Gen NDI1 de levadura - 4 cambios de aminoácidos -100 cambios de codones

SEQ ID n° 925-934 - Gen NDI1 de levadura - 4 cambios de aminoácidos - 200 cambios de codones

SEQ ID n° 985-994 - Gen NDI1 de levadura - 4 cambios de aminoácidos - Cambios de 300 codones

SEQ ID n° 761-795 - Gen NDI1 de levadura - 4 cambios de aminoácidos - 329 cambios de codones

SEQ ID n° 342-361 y n° 676-696 - Gen NDI1 de levadura - 5 cambios de aminoácidos - 0 cambios de codones

SEQ ID n° 362-381 y n° 875-884 - Gen NDI1 de levadura - 5 cambios de aminoácidos -100 cambios de codones

SEQ ID n° 382-401 y n° 935-944 - Gen NDI1 de levadura - 5 cambios de aminoácidos - 200 cambios de codones

SEQ ID n° 402-421 y n° 995-1004 - Gen NDI1 de levadura - 5 cambios de aminoácidos - 300 cambios de codones

SEQ ID n° 422-441 y n° 796-816 - Gen NDI1 de levadura - 5 cambios de aminoácidos - 329 cambios de codones

SEQ ID n° 697-703 - Gen NDI1 de levadura - 6 cambios de aminoácidos - 0 cambios de codones

SEQ ID n° 817-823 - Gen NDI1 de levadura - 6 cambios de aminoácidos - 329 cambios de codones

SEQ ID n° 704 - Gen NDI1 de levadura - 7 cambios de aminoácidos - 0 cambios de codones

SEC ID n° 824 - Gen NDI1 de levadura - 7 cambios de aminoácidos - 329 cambios de codones

SEQ ID n° 442-461 - Gen NDI1 de levadura -10 cambios de aminoácidos - 0 cambios de codones

SEQ ID n° 462-481 - Gen NDI1 de levadura -10 cambios de aminoácidos -100 cambios de codones

SEQ ID n° 482-501 - Gen NDI1 de levadura -10 cambios de aminoácidos - 200 cambios de codones

SEQ ID n° 502-521 - Gen NDI1 de levadura -10 cambios de aminoácidos - 300 cambios de codones

SEQ ID n° 522-541 - Gen NDI1 de levadura -10 cambios de aminoácidos - 329 cambios de codones

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SEQ ID n° 542 - Proteína NDI1 de levadura - 0 cambios de aminoácidos Breve descripción de las figuras

Figura 1. Representación diagramática de los diseños de montajes centrales. A: OphNDI1; OphNDI1 (gen NDI1 de levadura que ha sido optimizado para codones y/o optimizado inmunológicamente) se expresó a partir del activador precoz inmediato de CMV (citomegalovirus). Una señal de poliadenilación mínima se localizó en el extremo 3' del gen NDI1. B: AAV-GDNF; GDNF (factor neurótrofo derivado de la estirpe celular glial) se expresó en el activador precoz de ubiquitina. La señal de poliadenilación de neurturina se localizó en el extremo 3' del gen GDNF. C: AAV- OphNDI1_GDNF; OphNDI1 se expresó en el activador temprano inmediato de CMV. Se localizó una señal de poliadenilación mínima en el extremo 3' del gen NDI1. 3' a este GDNF se expresó en el activador de ubiquitina corto. La señal de poliadenilación de neurturina se localizó en el extremo 3' del gen GDNF. D: OphNdiI expresado en un activador de CMV con una señal de poliadenilación mínima 3'. En este montaje, GDNF se expresa en un IRES y también contiene la señal de poliadenilación de neurturina.

Especialmente, OphNDI1 puede contener 0-10 sustituciones de aminoácidos para modular y respuesta inmunitaria o 1-329 codones alterados, que se expresan con mayor frecuencia en células de mamífero que los codones naturales en NDI1 (Tabla 1a y 1b y Listado de secuencias). Además, los activadores de CMV y ubiquitina pueden sustituirse por cualquiera de los activadores indicados en las tablas 2-4 y el gen GDNF puede sustituirse por cualquier gen indicado en la tabla 6. Las secuencias para estos diseños de montajes centrales se presentan en las tablas 1a y 1b y el Listado de secuencias adjunto. Especialmente, pueden utilizarse también diferentes señales de poliadenación en los montajes descritos.

Figura 2. Localización, función y expresión de ARNm de NDI1. Análisis de transferencia Western de proteína mitocondrial aislada de células HeLa transfectadas y no transfectadas con pAAV-NDI1 (Ref.) (A). El recuadro superior muestra la expresión de la proteína NDI1 (56 KDa) y el panel inferior muestra la expresión de la proteína VDAC1 (31 KDa, control de carga mitocondrial; n = 3). B. El diagrama de barras representa mediciones de consumo de oxígeno de las células HeLa transfectadas con pAAV-NDI1 (columnas negras) y transfectadas con pAAV- EGFP (Ref., columnas blancas) con (+) y sin 5 pmol de rotenona (n = 6). C. El diagrama de barras representa el porcentaje de respiración insensible a rotenona en células HeLa transfectadas con pAAV-NDI1 (columnas negras) y transfectadas con pAAV-EGFP (referencia, columnas blancas) (n = 6). D. Expresión de ARNm de NDI1 de la retina de ratones adultos naturales inyectados por vía intravítrea con 3 x 109 vp AAV-NDI1 o 3 x 109 vp AAV-EGFP (Ref.) y analizados por RT-PCR dos semanas después de la inyección (n = 6) . Resp insensible a rot. (%): Respiración insensible a rotenona en porcentaje, w: blanco de agua, M: marcador de tamaño; KDa (A), pb (D). Las barras de error representan valores de D.T. y *: p <0,001.

Figura 3. Mediciones de consumo de oxígeno de células HeLa transfectadas con NDI1. Mediciones del consumo de oxígeno de células HeLa transfectadas con pAAV-NDI1 (A) y pAAV-EGFP (B) en presencia de 5 pmol de rotenona. Mediciones de consumo de oxígeno de células HeLa transfectadas con pAAV-NDI1 (C) y pAAV-EGFP (D) en ausencia de rotenona (referencia).

Figura 4a. Oxygráficos para montajes de NDI1. Rastros que muestran la concentración de oxígeno (línea azul) y el consumo de oxígeno (línea roja) en medios tratados con 5 pmol de rotenona y células HeLa no transfectadas (referencia negativa, A), células transfectadas con ophNDI1-I82V (B), que contienen optimización de codones en 329 codones y la sustitución de I82V y células transfectadas con NDI1-I82V (C). Se presentan gráficos representativos para cada uno. De forma similar, las células HeLa se transfectaron con montajes V45I bien el montaje hNDI1-V45I optimizado por el codón (D) o el montaje de NDI1 natural que contiene la sustitución V45I (NDI1-V45I; E). Además, se evaluaron los montajes V266I, tanto NDI1-V266I (F) como hNDI1-V266I (G). Los montajes NDI1-F90Y (H) y hNDI1-F90Y (I) también se probaron en células HeLa tratadas con rotenona.

Figura 4b. Se presentan diagramas de barras de los conjuntos de datos que miden el cambio en el consumo de oxígeno de los experimentos en la figura 4a. Se observó una retención estadísticamente significativa en el consumo de oxígeno entre las células transfectadas ya sea con los montajes de la variante NDI1 o de la variante de hNDI1 con valores p que varían desde p <0,05 (*) a <0,01 (**). Se observó una diferencia significativa entre la respiración insensible a rotenona lograda con montajes I82V y V45I frente a la conseguida con el montaje F90Y (I82V frente a F90Y p <0,02 y V45I frente a Y90Y p <0,002). No se observaron diferencias significativas entre las células tratadas con NDI1 y las células tratadas con montajes NDI1-I82V, hNDI1-I82V o V45I. Sin embargo, las células transfectadas con F90Y diferían significativamente en comparación con las células transfectadas con NDI1, mostrando esta última una mejor retención del consumo de oxígeno.

Figura 5. Histología de retinas tratadas con NDI1 después del ataque con rotenona. Se inyectó a ratones adultos naturales por vía intravítrea en ojos contralaterales con 3 x 109 vp de AAV-NDI1 (A) y 1 x 108 vp de AAV-EGFP, para facilitar la localización de regiones transducidas de las retinas, o 3 x 109 vp de AAV-EGFP (B) solo (n = 4). Tres semanas después de la inyección, se administraron 1,5 nmol de rotenona por vía intravítrea a ambos ojos. Tres semanas después del tratamiento con rotenona, los ojos se enuclearon, se fijaron, se sometieron a criosección (12 pm) y se trataron por inmunocitoquímica usando anticuerpos primarios NeuN y anticuerpos secundarios conjugados con Cy3. Los núcleos se tiñeron por contraste con DAPI. A y B: las secciones representativas muestran señales de

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marcado con NeuN (rojo) y DAPI nuclear (azul) superpuestas. OS: segmentos externos fotorreceptores; ONL: capa nuclear externa; INL: capa nuclear interna; GCL: capa de células ganglionares. Barra de escala: 20 |jm. C: Gráfico de barras que representa recuentos medios de células ganglionares por 100 jm. Las columnas azules y blancas representan los valores correspondientes a AAV-NDI1 + rotenona (NDI1) y AAV-EGFP + rotenona (EGFP)), respectivamente. Las barras de error representan valores D.T. y ***: p <0,001.

Figura 6. Análisis ultraestructural de los nervios ópticos tratados con NDI1 después del ataque con rotenona. Se inyectó a ratones adultos naturales por vía intravítrea en ojos contralaterales con AAV-NDI1 (B) o AAV-EGFP (C y D) (n = 3). Tres semanas después de la inyección, se administraron a ambos ojos 1,5 nmol de rotenona por vía intravítrea. Tres semanas después se enuclearon los ojos y se recogieron los nervios ópticos, se fijaron posteriormente, se procesaron y se analizaron por microscopia electrónica de transmisión. A bajo aumento, las estructuras electrónicas densas (cabezas de flecha, B y C) eran menos frecuentes en las muestras tratadas con AAV-NDI1 + rotenona (B) en comparación con las muestras tratadas con AAV-EGFP + rotenona (C). Muestras tratadas con AAV -EGFP + rotenona a mayor aumento (D). Estas no fueron visibles en las muestras no tratadas (A). E: Gráfico de barras que representa el número medio de restos de membranas. Las columnas blancas y negras representan AAV-NDI1 + rotenona (NDI1) y AAV-EGFP + rotenona (EGFP), respectivamente. F: Gráfico de barras que representa las medidas medias del diámetro del nervio óptico. Los nervios ópticos de ratones idénticamente inyectados se tomaron nueve meses después del tratamiento con rotenona, se fijaron, se sometieron a criosección (12 jm) y se midió el grosor del nervio óptico usando microscopia óptica. Las columnas blancas y negras representan AAV-NDI1 + rotenona (NDI1) y AAV-EGFP + rotenona (EGFP)), respectivamente. Las barras de error representan los valores de D.T. y **: p <0,01. Barras de escala: 10 jm (A, B y C) y 2 jm (D).

Figura 7. Análisis funcional de los nervios ópticos tratados con AAV-NDI1 y AAV-NSG después del ataque con rotenona. Se inyectó por vía intravítrea ratones adultos naturales en el ojo derecho con AAV-NDI1 (n = 10) o AAV- NSG (n = 6). Tres semanas después, los ratones inyectados con AAV-NDI1 (n = 10) o AAV-NSG (n = 6) recibieron 1,5 nmol de rotenona en el ojo derecho. Otro grupo de ratones adultos naturales recibió DMSO (vehículo de referencia, n = 16) o 1,5 nmol de rotenona inyectada por vía intravítrea en el ojo derecho (n = 16). Dos semanas después del tratamiento con rotenona, o DMSO, cada ratón se inyectó por vía intravítrea con 40 jg de cloruro de manganeso y el manganeso mejoró las imágenes de resonancia magnética (MEMRI) realizadas 2 horas después. Imágenes ponderadas en T1 seudocoloreadas: Mejora de la señal de la vía visual del ratón en secciones oblicuas (36°) de DMSO (A), rotenona sola (B), se presentan AAV-NDI1 + rotenona (C) y AAV-NSG + rotenona (D). E: Diagrama de barras que representa las intensidades de señal media de lg en la región del quiasma óptico calculadas con el programa informático Image J®, u.a.: unidad arbitraria. Las barras de error representan valores de D.T. y ** representan p <0,01.

Figura 8. Análisis de la visión espacial en ratones tratados con NDI después del ataque con rotenona. Se inyectaron ratones adultos naturales por vía intravítrea en ojos contralaterales con 3 x 109 vp de AAV-NDI1 o 3 x 109 vp de AAV-EGFP. Tres semanas después de la inyección, se administraron 1,5 nmol de rotenona por vía intravítrea a ambos ojos; a los ratones de referencia no se les administró rotenona. Tres meses después del tratamiento con rotenona se midieron las respuestas optocinéticas usando un sistema optocinético virtual. El diagrama de barras representa el umbral de frecuencia espacial promedio fijado para cada ojo. Las columnas en blanco y negro representan los valores correspondientes a AAV-NDI1 + rotenona (NDI1) y AAV-EGFP + rotenona (EGFP), respectivamente, en ratones tratados con rotenona (+ Rotenona) y referencia (sin Rotenona). Las barras de error representan valores de D.T. y ***: p <0,001.

Figura 9a. Una transferencia Western representativa de proteínas extraídas de células HeLa transfectadas temporalmente con plásmidos que expresan OphNDI1 y NDI1. Se usó un anticuerpo policlonal para Ndi1 a fin de detectar la proteína OphNDI1 y Ndi1 expresada en células transfectadas. Carril 1; proteína Ndi1 expresada en el montaje original de NDI1 natural, carril 2; Ndi1 con una etiqueta HA en el terminal C, carril 3; proteína Ndi1 expresada en OphNDI1, un montaje de NDI1 humanizada con 329 codones optimizados, carril 4; proteína Ndi1 expresada en OphNDI1-HA, una Ndi1 humanizada con una etiqueta HA. Carril 5; células HeLa no transfectadas.

Figura 9b: Gráfico de barras que muestra la expresión normalizada de la proteína Ndi1 humanizada y natural, medida por transferencia Western. Se transfectaron células HeLa con Ndi1 humanizada y natural. Se recogieron las células 48 horas después de la transfección y la proteína se extrajo y se sometió a transferencia Western usando un anticuerpo primario policlonal anti-Ndil. Se realizaron cuatro transferencias independientes y las imágenes se capturaron y analizaron con el programa informático ImageJ® para medir la expresión relativa. Para cada transferencia, se tomó como referencia el nivel de expresión relativa de Ndi1 natural y se comparó directamente con el nivel de expresión de Ndi1 humanizada. La prueba de la t para datos emparejados realizada en los valores no normalizados indica que Ndi1 humanizada se expresa significativamente más que Ndll natural (P <0,005). u.a.: unidades arbitrarias

Figura 10. Expresión de vectores AAV que expresan variantes de vectores AAV de NDI1se inyectaron por vía intravítrea en ratones naturales. Los vectores AAV contenían NDI1 no modificado, NSG (que expresan tanto NDI1 no modificado como un gen GDNF), NDI1 modificado con una modificación V266I, NDI1 humanizado (hNDI1) o hNDI1 con una modificación I82V. Dos semanas después de la inyección se recogieron las retinas y se extrajo el todo el

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ARN. Las RT-PCR en tiempo real se realizaron en muestras de ARN usando los cebadores NDI1F y NDI1R y hNDIlFy hNDII R.

A, Niveles de NDI1 expresados en el vector no modificado (NDI1) y en NSG, que expresa tanto un gen NDI1 no modificado como un gen GDNF, se compararon por RT-PCR en tiempo real. Los niveles de expresión (eje y) se expresan en número de copias por unidad del gen constitutivo, p-actina.

B, Los niveles de NDI1 humanizado (hNDII) expresados en retinas de ratón administrados por vía intravítrea usando vectores AAV2/2 se compararon con niveles de NDI1 no modificados administrado también usando AAV2/2. Los niveles de expresión se expresan en número de copias por unidad del gen constitutivo p-actina. En cuanto a los niveles de expresión en las figuras 5A y 5B se expresan en número de copias por unidad del gen constitutivo p- actina, los niveles de expresión pueden compararse directamente.

C, muestras de RT-PCR realizadas en muestras de ARN extraídas de ratones naturales a los que se inyectó por vía intravítrea con vectores AAV2/2 que expresan variantes del gen NDI1 y se ejecutan en geles de agarosa al 3%. Carriles 1 y 8, escala de tamaño de ADN de 100 pb GeneRuler (Fermentas). Los dos carriles inferiores de la escala representan 100 y 200 pb. Carril 2, NDI1; carril 3, NSG; carril 4, NDI1 con modificación V266I; carril 5, NSG; carril 6, NDI1 humanizado; carril 7 NDI1 humanizado con modificación I82V. El producto de amplificación de NDI1 tiene 87 pb y el producto de amplificación de NDI1 humanizado tiene 115 pb. Se cargaron cantidades iguales de productos de PCR en cada pocillo. Los vectores hNDI1 y NSG dieron como resultado niveles de expresión visiblemente mayores que el vector NDI1 no modificado que refleja los resultados en las figuras 10a y 10b.

Figura 11. Predicciones de inmunogenicidad de cada fragmento peptídico de 9 eslabones en NDI1, mediante simulación por ordenador de la presentación del antígeno utilizando el indicador MHC de clase I solo (figura 11a) o empleando la vía del MHC-I utilizando el indicador combinado IEDB escisión proteasómica/TAP transporte/MHC clase I (figura 11b). Se presentan puntuaciones de inmunogenicidad y posiciones de aminoácidos.

Figura 12A. Oxigráficos para montajes con NSG

Concentración de oxígeno en pequeñas cantidades (línea azul) y consumo de oxígeno (línea roja) en medios que contienen células no transfectadas (referencia negativa A), células transfectadas con Ndi1 (B) natural y células transfectadas con NSG, un montaje que expresa tanto NDI1 como GDNF naturales (C). En cada caso, las células se analizaron sin rotenona y se midió un nivel de respiración estable. Una vez estabilizada la respiración y tomadas las mediciones, se agregaron 5 pmol de rotenona y se tomó una medición de la respiración insensible a la rotenona una vez estabilizado el consumo de oxígeno.

Figura 12B: Se presenta un diagrama de barras de los datos de las células HeLa transfectadas con NSG y NDI1. Las células HeLa transfectadas con NSG y NDI1 no difirieron significativamente unas de otras p = 0,6, sin embargo, ambas conservaron significativamente el consumo de oxígeno en comparación con las referencias no transfectadas (NSG p <0,05 y NDI1 p<0,01).

Descripción detallada de la invención

En la presente solicitud, se ha utilizado la administración de montajes con NDI1 (figura 1) para proteger las células en presencia de un inhibidor del complejo I, rotenona, (figuras 2-8 y 12), las células HeLa y las células ganglionares de la retina (CGR) se protegieron en presencia de NDI1 administrado como un montaje natural o como montajes con codones optimizados e inmuno-optimizados (figuras 2-4). Por ejemplo, las CGR, las células afectadas principalmente en LHON, se protegieron en un modelo murino de LHON inducido por rotenona. El serotipo 2 del AAV biotecnológico (AAV2/2) que expresa NDI1 natural de un activador de CMV (AAV-NDI1, figura 1A) se administró a ratones usando una única inyección intravítrea. Se ha demostrado que AAV2/2 administrado por esta vía infecta las CGR de manera eficiente. Además, la inyección intravítrea generalmente da como resultado una amplia área de transducción retiniana a medida que el vítreo se pone en contacto con toda la superficie retiniana subyacente32. La inyección intravítrea de AAV proporciona una vía de administración para la genoterapia que es directamente aplicable a pacientes humanos y se usa de forma rutinaria para administrar fármacos como Avastín y Lucentis para el tratamiento de la DMAE húmeda. En este estudio, se utilizó por primera vez la inyección intravítrea de AAV- NDI1 y se demostró que reduce significativamente la muerte de CGR y la atrofia del nervio óptico observada en ojos no tratados en respuesta a la administración de rotenona y además, condujo a la conservación de la función retiniana evaluada mediante resonancia magnética mejorada con manganeso (MEMRI) y respuestas optocinéticas (OKR; figuras 5-8).

En la presente solicitud, la inyección intravítrea de AAV-NDI1 proporcionó una protección sustancial contra la agresión inducida por rotenona, evaluada mediante una variedad de ensayos (figuras 5-8). Especialmente, los análisis histológicos demostraron una protección significativa tanto de las CGR como del nervio óptico (figuras 5 y 6). Además, MEMRI indicó que el tratamiento con AAV-NDI1 conservaba la función del nervio óptico al permitir el transporte activo de iones de manganeso a través del nervio óptico utilizando canales de calcio dependientes de voltaje y por lo tanto proporcionó pruebas de la integridad funcional mejorada del tejido del nervio óptico en ojos tratados con AAV-NDI1 en comparación con los ojos de referencia (figura 7). La evaluación de la función visual por optocinética demostró que la protección de CGR y la integridad del nervio óptico proporcionada por AAV-NDI1

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condujo a la conservación de la visión del ratón en presencia del inhibidor del complejo I rotenona (figura 8). Los resultados ponen de manifiesto el valor terapéutico potencial de tratamientos a base de NDI1 para LHON cuando se administra por vía intravítrea usando AAV2/2.

Tras la administración con éxito de AAV-NDI1 a las CGR mediante inyección intravítrea, se optimizó el codón de NDI1 de modo que los codones que se usan con más frecuencia en células de mamífero se introdujeron en el gen NDI1 de levadura. Pueden realizarse modificaciones de codones de 1-329 codones para optimizar la expresión de NDI1 en mamíferos mientras se mantienen aminoácidos naturales. El número máximo de codones que se pueden alterar en NDI1 para alinear codones con los más frecuentemente usados en mamíferos es 329 codones y estas alteraciones se emplearon para generar un montaje denominado OphNDI1 y también conocido como NDI1 humanizado (hNDI1). Los plásmidos que contienen OphNDI1 (hNDI1) o NDI1 natural, ambos expresados a partir de un activador de citomegalovirus (CMV) y que contienen una señal de poliadenilación mínima (PolyA), una señal de poliadenilación de beta-globina de conejo modificada, se transfectaron temporalmente en células HeLa usando lipofectamina. Los niveles de expresión de la proteína NDI1 de montajes de NDI1 y hNDI1 se compararon usando análisis de transferencia Western. Se determinó que hNDI1 (OphNDI1) expresaba mucho más que NDI1 natural, lo que indica que el codón que optimiza el gen NDI1 de hecho ha potenciado la expresión en células de mamíferos (figuras 9a, 9b y 10) Se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa en los niveles de expresión entre montajes de NDI1 natural y optimizado (figuras 9a y 9b). Los resultados obtenidos para la proteína NDI1 (figuras 9a y 9b) se reflejan por los obtenidos en el nivel de ARN en ratones inyectados por vía intravítrea con AAV natural y montajes optimizados de NDI1 usando RT PCR en tiempo real como ensayo (figura 10).

Además, tanto los montajes de NDI1 natural como los de codones optimizados se han optimizado inmunológicamente introduciendo uno o más cambios de aminoácidos para modular la(s) respuesta(s) inmunitaria(s) (tabla 1a y 1b y Listado de secuencias). Se emprendieron modificaciones de aminoácidos posteriores a los análisis realizados en ordenador para posibles sitios inmunógenos dentro de NDI1 (véanse las figuras 11a y 11b, material y métodos). Se generaron montajes inmunológicamente optimizados tanto para el montaje de NDI1 natural como para el montaje de hNDI1 de codones optimizados. Se generaron montajes de NDI1 modificados con codones optimizados y inmunológicamente optimizados como vectores de alto valor AAV2/2 (1-5 x 1011 vg/ml) usando métodos de transfección de plásmido triples en células 293 seguido de purificación del virus en gradiente de cloruro de cesio. Se generaron montajes de NDI1 inmunológicamente optimizados representativos y de hNDI1 inmunológicamente optimizados, entre otros V45I, I82V, L89I, I90Y, V266I, L481I, L483M como plásmidos y/o vectores de AAV. Todas las células de mamífero nucleadas presentan fragmentos peptídicos unidos a moléculas de MHC-I en su superficie celular. Estos fragmentos proceden de la degradación de proteínas en el citoplasma. Como tal, la presentación de MHC-I ofrece una instantánea del conjunto de proteínas que se producen dentro de cada célula. Los linfocitos T citotóxicos inspeccionan los fragmentos peptídicos presentados por las células y pueden inducir la apoptosis en células que no presentan proteínas que no son propias, lo que generalmente es un indicador de infección vírica. Se transfectaron células HeLa con montajes con NDI1,hNDI1 y inmunológicamente optimizados y se evaluaron niveles de respiración insensibles a rotenona (figuras 2-4, 12) Se observó una retención significativa del consumo de oxígeno en células transfectadas con NDI1, montajes con codones optimizados e inmunológicamente optimizados (figuras 2-4, 12), cuando se compara con células de referencia no transfectadas.

Además, para montajes de NDI1 con codones optimizados e inmunológicamente optimizados, se generó un montaje de doble componente que contenía el gen NDI1 dirigido por el activador CMV junto con un gen (NSG) del factor neurótrofo derivado gliálico (GDNF) dirigido por un activador de ubiquitina, empleando este último una señal poliA de neurturina (figura 1) y generado como un vector AAV2/2 (AAV-NSG). Se consiguieron niveles de expresión de NDI1 significativamente mayores a partir de este vector in vivo en ratones después de la inyección intravítrea en comparación con AAV-NDI1 según lo evaluado mediante ensayos de RT-PCR en tiempo real (figura 10a y 10c) La expresión de GDNF de AAV-NSG se confirmó en retinas de ratón mediante RT-PCR en tiempo real. Además, la administración intravítrea de AAV-NSG dio como resultado la conservación de la función celular evaluada por mediciones de consumo de oxígeno en células HeLa tratadas con rotenona (figura 12) y la conservación funcional in vivo utilizando análisis de MRI de ratones naturales inyectados por vía intravítrea con vector AAV-NSG (figura 7) La intensidad media de la señal MRI para DMSO fue de 2,38 ± 0,04, para rotenona sola, fue de 2,30 ± 0,06 para aAv- NDI1 más rotenona, fue de 2,35 ± 0,07 y para AAV-NSG más rotenona fue de 2,37 ± 0,07, se encontraron diferencias significativas entre ratones tratados con rotenona sola y los tratados con rotenona y AAV-NDI1 o AAV- NSG; para comparaciones tanto rotenona frente a AAV-NDI1 como rotenona frente a AAV-NSg, p <0,01 (**). De hecho, los ratones tratados con AAV-NDI1 (más rotenona) o AAV-NSG (más rotenona) no diferían significativamente de los ratones de referencia naturales tratados con DMSO solo. Especialmente, estos resultados de MRI se probaron usando un valor 4 veces menor de AAV-NSG que AAV-NDI1 (5,99x1010 vp/ml frente a 2,5 x1011 vp/ml). Lo que sugiere que se necesita menos AAV-NSG para mediar un efecto beneficioso equivalente.

Se inyectó a cohortes de ratones naturales adultos por vía intravítrea con 3 |jl de vectores AAV2/2 que expresan NDI1, hNDI1, hNDI1 I82V inmunológicamente optimizado, NDI1 V266I inmuno-optimizado o AAV-NsG. Dos semanas después de la inyección se recogieron retinas de ojos de ratón tratados y se extrajo todo el ARN. Los niveles de expresión de vectores AAV en retinas de ratón se evaluaron por RT-PCR en tiempo real (figura 10) Los niveles de expresión de diferentes vectores podrían compararse directamente ya que la expresión se evaluó por el número de copias absoluto por unidad de p-actina (la referencia constitutiva) para cada vector. Se generaron curvas patrón usando patrones de ADN plasmídico con número de copias conocido. Los niveles de expresión alcanzados

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después de la inyección intravítrea de AAV de vectores fueron mayores en ojos de ratón tratados con ojos tratados con AAV-hNDI1 o AAV-NSG en comparación con los ojos inyectados con AAV-NDI1 (figura 10).

Todas las genoterapias que administran proteínas no humanas arriesgan la activación de respuestas de linfocitos T citotóxicos después de la presentación de fragmentos de péptidos procedentes de la proteína transgénica. Por lo tanto, es importante para el éxito del tratamiento que la inmunogenicidad de la proteína transgénica esté modulada. Una de las formas más eficaces para hacer esto es buscar en la secuencia de la proteína fragmentos que probablemente se unen fuertemente a MHC-I, aumentando la probabilidad de que se presenten en la superficie celular y así induzcan una reacción inmunitaria.

Este enfoque es algo complicado por la presencia de muchos alelos de MHC-I diferentes en la población humana, cada uno de los cuales puede tener afinidades de unión ligeramente diferentes para diferentes péptidos.

Existen métodos bioinformáticos probados para predecir la afinidad de unión a MHC-I de un péptido determinado, de los cuales varios están disponibles como herramientas descargables. Para nuestros propósitos, el método de predicción de consenso de Nielsen et al. (Protein Sci. Mayo2003; 12(5):1007-17) fue el más adecuado, además de tener una excelente precisión validada experimentalmente. Estas herramientas fueron adaptadas y se generó un programa informático de soporte para permitir la predicción de afinidad para una amplia variedad de alelos de MHC-

I. La herramienta informática así generada se puede aplicar y modificar para predecir otros tipos de respuestas inmunitarias.

Todos los fragmentos peptídicos posibles que podrían derivarse de la proteína Ndi1 se analizaron mediante el método de predicción de consenso para la afinidad de unión a todas las proteínas MHC-I humanas bien caracterizadas.

Métodos

Construcción de vectores y producción de AAV

La levadura NDI1 (número de acceso: NM_ 001182483.1) se clonó como se describe53. En resumen, NDI1 se amplificó por PCR a partir de todo el ADN de levadura extraído de S288c usando los siguientes cebadores F: TTCTCGAGGTAGGGTGTCAGTTTC (SEQ ID n° 543) y R: AAAGCGGCCGCAGTGATCAACCAATCTTG (SEQ ID n° 544) y se clonó en sitios Xho I y Not I de pcDNA3.1- (Invitrogen, Paisley, Reino Unido). Se clonó una señal de poliadenilación mínima54 aguas abajo de NDI1 usando NotI y EcoRV. El activador temprano inmediato de CMV (presente en pcDNA3.1-), el gen NDI1 y la señal de poliadenilación se aislaron en un fragmento MluI y EcoRV, se terminaron y clonaron en los sitios NotI de pAAV-MCS (Agilent Technologies, La Jolla, CA, EE. UU.) para crear pAAV- NDI; figura 1. pAAV-EGFP se clonó como se describió anteriormente19.

La secuencia de codificación de GDNF humana completa del codón de inicio atg (nucleótidos 201-836 de número de acceso NM_000514) se clonó 3-prima de un activador de ubiquitina humana de 347 pb (nucleótidos 3557-3904 de número de acceso D63791) y una poliA de Neurturina humana constituida por nucleótidos 1057-1160 de número de acceso AL161995 se clonó aguas abajo del gen GDNF. Todo este casete de GDNF dirigido por ubiquitina, incluida Neurturin poliA se clonó aguas abajo del NDI1 dirigido por CMV (incluida la poliA de p-globulina de conejo).

Las secuencias de NDI1 con codones optimizados y/o con cambios de aminoácidos para reducir las características de inmunogenicidad fueron sintetizadas por Geneart Inc. Estas se aislaron en un fragmento XbaI y XhoI y se clonaron en plásmidos pAAV-MCS (Agilent Technologies, La Jolla, CA, EE. UU.) y pcDNA3.1- (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) con un activador precoz inmediato de CMV y poliA mínimo y se verificó mediante secuenciación de ADN.

Se prepararon virus AAV2/2 biotecnológicos, AAV-ND1, AAV-NGS, pAAV-NDI1 V266I, AAV-huNDI1, pAAV-huND/1 182V y AAV-EGFP como se ha descrito20, con un gradiente de cloruro de cesio modificado como se ha descrito19. El Centro de producción Gene Vector de Nantes generó más virus biotecnológicos AAV-ND1, AAV-NSG. Se determinaron valores genómicos (partículas víricas resistentes a ADNasa por mililitro; vp/ml) por reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) según el método de Rohr et al.21

Cultivo celular

Se transfectaron células de carcinoma de cuello uterino humano (HeLa, número de acceso ATCC CCL-2) con pAAV- ND/1 o pAAV-EGFP usando reactivo Lipofectamina 2000, según las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Se sembraron 5 x 105 células por pocillo en placas de 6 pocillos que contenían 1 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco enriquecido con suero de ternera al 10%, glutamina 2 mM y piruvato de sodio 1 mM y se incubó durante la noche a 37°C. A continuación, se aspiró el medio y las células se lavaron dos veces con solución salina amortiguada con fosfatos (PBS). Cada pocillo setransfectó con 1 |jg de pAAV-ND/1 o 1 |jg de pAAV-EGFP por triplicado. Las células se recogieron 48 horas más tarde y las células de cada triplicado se agruparon para un experimento individual, cada experimento se repitió por triplicado.

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Aislamiento mitocondrial y análisis de transferencia Western

Se aislaron mitocondrias de células HeLa usando microperlas Anti-TOM22 (Mitochondria isolation kit, Miltenyi Biotec GmbH, Alemania). Las mitocondrias aisladas se lavaron dos veces en PBS y se homogeneizaron en 100 |jl de amortiguador de análisis de radioinmunoprecipitación (RIPA) (NaCl150 mM, Triton X-100 al 1%, desoxicolato de sodio al 0,5%, SDS al 0,1%, TrisCl 50 mM pH 8,0 y comprimido de mezcla de inhibidor de proteasa 1/10 ml (Roche, Mannheim, Alemania)). El homogeneizado se centrifugó a 10.000 g durante 20 min a 4°C y el sobrenadante se eliminó para su análisis. Las muestras de proteínas normalizadas se separaron en geles de poliacrilamida al 12% y se transfirieron mediante electroforesis a membranas de PVDF (Bio-Rad, Berkley, CA, EE. UU.). La membrana de PVDF se bloqueó con leche desnatada al 5% en solución salina amortiguada con tris (TBS, Tris 0,05 M, NaCl 150 mM, pH 7,5) y Tween 20 al 0,05% (vol/vol) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos policlonales de conejo contra NDI1 (1:500, Cambridge Research Biochemicals, Cleveland, Reino Unido) y VDAC1 (1: 1000, Abcam, Cambridge, Reino Unido) se diluyeron en leche al 5% y se incubaron durante la noche a 4°C. Las membranas se lavaron dos veces con TBS y se incubaron con un anticuerpo anti-conejo (IgG) conjugado con peroxidasa de rábano picante secundario (1: 2500, Sigma-Aldrich, St. Louis Missouri, EE. UU.) durante 2 horas a temperatura ambiente, expuesto a sustrato quimioluminiscente Super-Signal y mejorador (Pierce Biotechnology, Rochford, IL, EE. UU.) y se detectó la señal usando película de rayos X (Kodak, Rochester, NY, EE. UU.). Todas las transferencias Western se repitieron tres veces.

Análisis respiratorio

Se realizaron mediciones respiratorias en DMEM a 37°C en un Oxygraph-2k (OROBOROS® INSTRUMENTS GmbH, Innsbruck, Austria) según las instrucciones del fabricante. En resumen, cada cámara se calibró con 2 ml de DMEM y se agitó (200 rpm) durante 1 hora para saturar el medio con oxígeno. Se llevaron a cabo experimentos en paralelo en las dos cámaras del Oxygraph-2k usando 1 x 106 de pAAV-NDI1 o 1 x 106 células HeLa transfectadas con pAAV-EGFP. Después de agregar las células a los medios saturados de oxígeno, el tamaño de la cámara se redujo a 2 ml para eliminar el aire. Se tomaron lecturas continuas fijar los valores de referencia completamente oxigenados. Se añadieron 2 jl de rotenona 5 mM (5 jM en etanol al 100%) a 1 x 106 de pAAV-NDI1 o 1 x 106 células HeLa transfectadas con pAAV-EGFP antes de la transferencia a las cámaras necesarias y se tomaron lecturas continuas después de rotenona. Se tomaron lecturas continuas con y sin rotenona hasta que el consumo de oxígeno se estabilizó. Se tomaron lecturas de tres transfecciones independientes para cada montaje.

Animales e inyecciones intravítreas

Ratones naturales 129 S2/SvHsd (Harlan UK Ltd, Oxfordshire, Reino Unido) se mantuvieron en condiciones de alojamiento exentos de patógenos específicos (spf). Se llevaron a cabo inyecciones intravítreas en estricto cumplimiento de las Normass de las Comunidades Europeas de 2002 y 2005 (Ley sobre crueldad hacia los animales) y de la declaración para el empleo de animales de la Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO). En resumen, se anestesiaron ratones adultos y se dilataron sus pupilas como se describe57. Usando anestesia tópica (ametocaína), se realizó una pequeña punción en la esclerótica. Se insertó una microaguja de punta roma calibre 34 acoplada a una jeringuilla Hamilton de 10 jl a través de la punción, y 0,6 jl de rotenona 2,5 mM (1,5 nmol) en sulfóxido de dimetilo (DmSO, vehículo), 0,6 jl de DMSO solo o 3 jl de 1 x 1012 vp/ml de AAV2/2 se administraron lentamente durante un período de dos minutos en el vítreo. Después de la inyección intravítrea, se administró un agente anestésico reversible (100 mg/10 g de peso corporal, clorhidrato de atipamezol) por inyección intraperitoneal. La temperatura corporal se mantuvo usando un dispositivo de calentamiento homeotérmico. Todos los estudios en animales han sido aprobados por la Institutional Review Board de los autores.

Extracción de ARN y análisis de PCR

Se inyectó 3x109 vp de AAV-NDI1 por vía intravítrea a ratones naturales adultos (n = 6) mientras que los ojos contralaterales recibieron 3x109 vp de AAV- EGFP. Se recogieron las retinas dos semanas después de la inyección y el se extrajo todo el ARN utilizando el equipo Qiagen RNeasy según la especificación del fabricante. Se confirmó la expresión in vivo de NDI1 de AAV-NDI1 por PCR de transcripción inversa (RT-PCR) en un sistema de PCR 7300 en tiempo real (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) utilizando un equipo de RT-PCR QuantiTect SYBR Green (Qiagen Ltd ., Crawley, Reino Unido) y productos de amplificación resultantes separados y dimensionados en geles de agarosa al 2,5%. Se usaron los siguientes cebadores: cebador directo NDI1 5 'CACCAGTTGGGACAGTAGAC 3' (SEC ID n°: 545) y cebador inverso NDI1: 5 'CCTCATAGTAGGTAACGTTC 3' (SEQ ID n°: 546). Las formas humanizadas del transcrito de NDI1 se amplificaron por RT-PCR con el cebador directo de hNDI1 5 'GAACACCGTGACCATCAAGA 3' y se utilizó el cebador inverso de hNDI1 5 'GCTGATCAGGTAGTCGTACT 3' p-actina como patrón interno como se describe (ref). Las RT-PCR se realizaron dos veces por triplicado o por cuadruplicado. Los niveles de expresión de NDI1 o de NDI1 humanizada se determinaron por RT PCR en tiempo real usando el kit Quantitect SYBR green RT PCR (Qiagen). En resumen, el número de copias de dos preparados de ADN plasmídico que contienen NDI1 o NDI1 humanizada se determinó por espectrofotometría en un NanoDrop y se prepararon diluciones en serie de estos preparados de ADN plasmídico que contenían entre 10e2-10e7 copias/jl. Estas curvas patrón se incluyeron en placas de 96 pocillos que también incluían muestras de ARN para su análisis. Por lo tanto, los niveles de expresión de todos los montajes, humanizados o no, podrían compararse usando un número de copias absoluto, aun cuando los pares de cebadores

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utilizados para la amplificación por PCR no humanizada y humanizada no eran los mismos. Los niveles de expresión se normalizaron usando el gen constitutivo interno p-actina.

Histología

Los ojos y los nervios ópticos se fijaron en paraformaldehído al 4% en PBS (pH 7,4) durante la noche a temperatura ambiente 4°C se lavaron tres veces con PBS y se crioprotegieron usando un gradiente de sacarosa (10%, 20%, 30%). Se cortaron secciones de 10 |jm en un criostato (HM 500 Microm, Leica, Solms, Alemania) a -20°C. Los núcleos se tiñeron por contraste con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Las muestras se analizaron con un microscopio de fluorescencia Zeiss Axiophot (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania). Las imágenes correspondientes del microscopio tomadas con diferentes filtros se superpusieron utilizando Photoshop v. 10 (Adobe Systems Europe, Glasgow, Reino Unido). Para los recuentos de células ganglionares (GCL), las células ganglionares se marcaron usando inmunohistoquímica NeuN (Abcam, Cambridge, Reino Unido) como se describió previamente. El anticuerpo primario se diluyó 1:100 y se visualizó usando anticuerpo secundario anti-ratón-IgG conjugado con cy3 (Jackson ImmunoResearch Europe, Suffolk, Reino Unido). Se analizaron cuatro secciones retinianas por ojo de cuatro ratones por grupo (n = 4). Las secciones se tomaron aproximadamente 150 jm de separación en la retina central (600 jm de amplitud en total); 2 recuentos por sección, es decir 8 recuentos por ojo en total, se hicieron usando la herramienta de recuento en Photoshop (Adobe Systems). El diámetro de los nervios ópticos se determinó a aproximadamente 5 mm de la cabeza del nervio óptico de 3 animales por grupo (n = 3). Se realizaron tres mediciones por nervio a aproximadamente 150 jm de separación utilizando la herramienta de regla en Photoshop (Adobe Systems). Los procedimientos para TEM fueron como se describió previamente. En resumen, tres semanas después de la inyección de rotenona, los nervios ópticos se fijaron en paraformaldehído al 4% en solución amortiguada con fosfato y se fijaron en glutaraldehído al 2,5% en amortiguador de cacodilato 0,1 M (pH 7,3) durante 2 horas a temperatura ambiente. Las muestras lavadas se fijaron posteriormente en tetróxido de osmio al 2% amortiguado, se deshidrataron y se incorporaron en araldite. Se cortaron secciones transversales ultrafinas en un vibratomo (Leica VT 1000 S), se analizaron usando un microscopio electrónico de transmisión Tecnai 12 BioTwin (FEI, Eindhoven, Holanda) y se tomaron imágenes con una cámara con dispositivo acoplado para carga de canal de superficie (SCCD) SIS MegaView III (Olympus Soft Imaging Solutions, Münster, Alemania). Se hizo recuento del número total de partículas de restos de membrana en las imágenes en 5 secciones transversales por nervio óptico de 3 animales por grupo (n = 3).

Resonancia magnética nuclear

La integridad del nervio óptico en ratones experimentales y de referencia se evaluó por la técnica de resonancia magnética nuclear mejorada con manganeso (Mn2+) (MEMRI) usando un imán 7 T Bruker Biospec 70/30 (Bruker Biospin, Etlingen, Alemania). MEMRI delimita las regiones activas del cerebro debido a la capacidad de los iones Mn2+ para entrar en las células excitables a través de canales de calcio dependientes de voltaje, por lo tanto, el análisis del transporte de Mn2+ a través del nervio óptico proporciona una buena medida de su integridad. Dos horas antes de la exploración, los ratones se anestesiaron y se les inyectó por vía intravítrea, como se describió anteriormente, con 2 |jl de solución 20 mg/ml de cloruro de manganeso. Para la adquisición de imágenes, los ratones se mantuvieron bajo sedación con ketamina (375 jg/10 g de peso corporal) y se colocaron en un receptáculo compatible con MRI que mantiene la temperatura corporal del animal a 37°C (se controlaron la respiración y la temperatura durante el experimento). El receptáculo se colocó dentro del escáner MRI y se obtuvo una imagen piloto rápida inicial para asegurar la posición exacta del ratón. Se obtuvieron imágenes 2D coronales oblicuas ponderadas en T1 usando secuencia FLASH (TR/TE: 150/2,5 ms; Matriz: 128x128; Campo de visión: 20x20mm2; ángulo opuesto 50°; número de promedios: 40, la resolución del píxel fue 0,156 mm/píxel). En la orientación coronal oblicua (36°), se registraron 20 cortes, cada una de los cuales medía 0,35 mm de espesor con 0,45 mm de espacio entre cortes, durante un tiempo de obtención de 9 min 36 s. Las exploraciones por MRI correspondientes al área inmediatamente superior al quiasma óptico proporcionaron imágenes más consistentes en comparación con el nervio óptico en sí debido a las variaciones en el posicionamiento físico de cada animal. Las intensidades de la señal log en esta región se cuantificaron utilizando el programa informático Image J© (
http://imagej.nih.gov/ij/).

Optocinética

Los umbrales de frecuencia espacial de la respuesta optocinética (OKR) fueron medidos a ciegas por dos investigadores independientes que usaban un sistema optocinético virtual (VOS, OptoMotry, CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canadá). OptoMotry36 mide el umbral de la respuesta de seguimiento optocinético del ratón a las rejillas móviles. En pocas palabras, se crea una cámara de realidad virtual con cuatro monitores de ordenador de 17 pulgadas orientados hacia un cuadrado y el ratón desenfrenado se colocó en una plataforma en el centro. Una cámara de video, situada sobre el animal, proporcionó retroalimentación de video en tiempo real. El experimentador centró el tambor virtual en la cabeza del ratón y juzgó si el mouse realizaba movimientos lentos de rastreo con la cabeza y el cuello. El umbral de frecuencia espacial, el punto en el que el ratón ya no rastreó, se obtuvo aumentando en incrementos la frecuencia espacial de la rejilla al 100% de contraste. Se utilizó un procedimiento en escalera en el que el tamaño del paso se reducía a la mitad después de cada inversión, y finalizó cuando el tamaño del paso se hizo más pequeño que la resolución del equipo informático (~0,003c/d, 0,2% de contraste). Se presentó una

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45

50

escalera para cada dirección de rotación para medir cada ojo independientemente, estando las dos escaleras intercaladas.

Análisis estadístico

Los conjuntos de datos de las muestras tratadas y no tratadas se combinaron, se calculó el promedio y los valores de la desviación típica (D.T.). La significación estadística de las diferencias entre los conjuntos de datos se determinó mediante la prueba t bilateral de Student o el ANOVA utilizado con la prueba posterior de comparación múltiple de Tukey. Además, el análisis de variancia de una vía de Kruskall-Wallis se aplicó al conjunto de datos de MRI y se realizaron pruebas U de Mann Whitney en todos los demás conjuntos de datos para demostrar que la significación estadística se mantenía utilizando modelos estadísticos no paramétricos. El análisis se realizó usando Prism v. 5.0c (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE. UU.); las diferencias con p <0,05 se consideraron estadísticamente significativas.

Predicciones de codones inmunógenos

Todos los fragmentos peptídicos posibles que podrían proceder de la proteína Ndi1 se analizaron por el método de predicción del consenso para la afinidad de unión a todas las proteínas MHC-I humanas bien caracterizadas. Se observaron todos los epítopos que presentan una alta afinidad por MHC-I (definida como una CI50 prevista <500 nM), junto con el alelo MHC-I correspondiente al que habían presentado una alta afinidad de unión. A cada fragmento de péptido posible se le asignó entonces una "puntuación de inmunogenicidad", definida como la suma de las frecuencias de todos los alelos de MHC-I en la población humana global para la que tenía una alta afinidad de unión. A continuación, se seleccionaron los fragmentos de mayor puntuación para una posible modificación para reducir la inmunogenicidad. Se generaron todas las posibles mutaciones de aminoácidos individuales para cada una de estas secuencias de fragmentos inmunógenos, y cada una se ensayó la inmunogenicidad por los métodos anteriores. Además, se usó la matriz BLOSUM62 para calcular la similitud de secuencia entre las secuencias original y mutada. Para cada fragmento, se eligió una mutación óptima que reduce la inmunogenicidad. Esto se hizo tomando el conjunto de todas las mutaciones posibles para ese fragmento y eliminando todos los fragmentos que tenían una puntuación de inmunogenicidad mayor que la mitad de la puntuación de inmunogenicidad del fragmento original. La secuencia con la mayor similitud de secuencia con el fragmento original (definida por la matriz BLOSUM62) se seleccionó como la sustitución óptima para esa posición.

Además de los análisis descritos anteriormente utilizando información con respecto al MHC-1 solo, la estimación de la inmunogenicidad y la reducción en Ndi1 se consiguieron mediante modelado informático de la presentación del antígeno por la vía MHC-I utilizando la escisión proteasómica IEDB/transporte TAP/ de combinado MHC clase I.

Como fragmentos de 9 aminoácidos de longitud están los fragmentos más comúnmente presentados por MHC-I, todas las secuencias posibles de 9 aminoácidos consecutivos que podrían proceder de Ndi1 se enumeraron y pasaron al indicador IEDB para su análisis. Por cada péptido de 9 eslabones P y alelo i de MHC-I, se generó un valor inmunogenicidad Gp,i que es proporcional a la cantidad de ese fragmento que se desplegaría en la superficie celular por un de alelo MHC-I dado, teniendo en cuenta degradación proteasómica, transporte y unión por MHC-I.

Un factor de inmunogenicidad global

para el péptido de 9 eslabones se calculó a continuación como

I'' = Y G, :N: M

donde 1 f es la prevalencia estimada de cada alelo en la población humana global como una fracción del conjunto total de alelos, calculada utilizando datos de frecuencia poblacional de The Alíele Frequency

Net Database (González-Galarza et al., 2011). En otras palabras, p representa la cantidad media de ese fragmento que se presentaría en la superficie de una célula para todos los alelos del MHC-I, ponderada por la frecuencia con que aparece cada alelo en la población humana.

imagen1

A cada posición de aminoácido A en el péptido Ndi1 se le asignó entonces una puntuación de inmunogenicidad Sa definida como la suma de los factores de inmunogenicidad para todos los péptidos de 9 eslabones que contienen ese aminoácido. No se consideraron además todas las posiciones cuya puntuación de inmunogenicidad fue menor que un quinto de la puntuación más alta, ya que las mutaciones en estas posiciones no podrían afectar significativamente la inmunogenicidad global de la proteína.

Para cada una de las posiciones restantes, se usó una matriz BLOSUM (Henikoff y Henikoff, 1992) para identificar posibles mutaciones que no serían demasiado perturbadoras para la estructura o función de Ndi1. Se calcula una matriz BLOSUM alineando secuencias de proteínas homólogas de muchas especies unas contra otras, y comparando la frecuencia con la que cada aminoácido es reemplazado por cualquier otro aminoácido.

Para dos aminoácidos x e y, la puntuación B x,y de BLOSUM se define como la probabilidad logarítmica de que el aminoácido x reemplace ayo viceversa en una posición dada en péptidos homólogos. Como consecuencia directa de esta definición, Bx,y = By,x para todo x e y (en otras palabras, todas las matrices BLOSUM son simétricas).

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10

15

20

25

30

35

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45

50

Una puntuación alta de BLOSUM para un par de aminoácidos indica que las mutaciones que cambian uno de esos aminoácidos por el otro tienen más probabilidades de observarse en proteínas homólogas, lo que indica que dichos cambios tienen menos probabilidades de alterar gravemente la estructura de la proteína. También se puede calcular una puntuación de BLOSUM entre cada aminoácido y él mismo (Bx,x), lo que indica la probabilidad de que ese aminoácido permanezca constante entre las proteínas homólogas.

Para todas las mutaciones posibles en una posición determinada, AB se definió como el cambio en la puntuación BLOSUM para esa mutación. Más formalmente, dado un aminoácido inicial x y un aminoácido de reemplazo experimental y, AB = Bx,x- Bx,y. Todas las mutaciones para las que AB era mayor que 4 se consideraron demasiado perjudiciales para la función de la proteína y no se analizaron más.

Para todas las mutaciones experimentales restantes, se volvieron a calcular los factores de inmunogenicidad F y las puntuaciones S para el péptido después de la mutación utilizando el indicador IEDB. La reducción en la inmunogenicidad AS se determinó a continuación, definida como la diferencia entre la puntuación S para esa posición en el péptido original frente a la nueva puntuación S después de la mutación.

Todas las mutaciones posibles fueron clasificadas por la métrica AS/AB. Valores altos de AS/AB representan mutaciones que probablemente causen una gran reducción en la inmunogenicidad con un impacto previsto relativamente pequeño en la función de la proteína. Los resultados con aminoácidos predichos y puntuaciones previstos se proporcionan en la tabla X.

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5

10

15

20

25

30

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Apéndice

Tabla 1a: Secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de la invención.

Gen

Sustitución de aminoácidos Secuencia de ácidos nucleicos

NDI1 de levadura

FYLWRILYL SEQ ID n°: 1

Codón optimizado de NDI1 de levadura

FYLWRILYL SEQ ID n°: 62

NDI1 de levadura + 1 cambio de aminoácidos

FYLWRILYL ^ FYLWRILYM SEQ ID n°: 63

Codón optimizado de NDI1 de levadura + 1 cambio de aminoácidos

FYLWRILYL ^ FYLWRILYM SEQ ID n°: 134

NDI1 de levadura + 2 cambios de aminoácidos

FYLWRILYL ^ FYLWRILYM FLKEIPNSL ^ FFKEIPNSL SEQ ID n°: 146

Codón optimizado de NDI1 de levadura + 2 cambios de aminoácidos

FYLWRILYL ^ FYLWRILYM FLKEIPNSL ^ FFKEIPNSL SEQ ID n°: 225

Tabla 1b

Inmunocambio/

Inicial

Posición Nuevo Inmunopunt. Inmunocambio CambioBlosum CambioBlosum

1

62 V 2.569262962 1 002693604 2 0 501346042

F

90 Y 1.926170105 1.497108603 3 0.499036228

L

69 I £.104411358 1 .£53907982 3 0.417969327

V

266 I 0,667339713 0 362559877 1 0,362552077

K

£14 E 0.7'£950213 0.70677809 4 0.176694523

L

461 I 0.685723713 0.498012741 3 0.1660W-247

L

£02 M 0.608955047 0 51549471 7 2 0.1 57747359

L

259 V 0.594169679 0.469145841 3 0.1563&’ 947

L

195 I 0.565666654 0.465061672 3 0.155020558

1

61 V Ü.85S520887 0.266903644 2 0.13345' 822

L

150 M 0.656551633 0.259100709 3 0129550309

F.

65 < 2.7'4843954 0.43039463 4 0.107590557

Y

151 r 0.686249712 0.397772899 4 0.099443225

Y

482 F 0.891857027 0.37332640 4 0 0933316P

S

46 S T 0.562053138 0.361418691 4 0.090354673

s

60 T 0.674070848 0.301172594 4 0.075293149

K

196 E 0.6J 8739275 0.284207587 4 0.071051&97

R

206 K 0.7B0227471 0.247789757 4 0.061947439

R

490 4 0.59090641 1 0.2377696 9 ¿ 4 0.059442424

S

145 0.67224222 0.225480189 4 0.056370042

V

147 T 0.671708207 0 210263616 4 0 052565904

F.

479 < 1.226655337 0.210156807 4 0.052539222

A

469 S 0.587738343 0.201645996 4 0.050411499

L

212 V 0.7'7379457 0 144498379 3 0.0431661P6

R

492 4 0.564269712 0 1912597G6 4 0 047014941

L

262 M 0.596470347 0.084255646 2 0.042'27B23

Q

149 E 0.656724126 0.167775872 4 0.041943968

T

207 S 0,779275641 0,162365948 4 0 040591487

Y

476 F 1.203763001 0.154940174 4 0.038735043

S

201 0.598628015 0.145693616 4 0.036423404

S

86 A 2.75P0111P5 0 111576956 4 0 027894239

M

473 L 0.621739886 0.108503212 4 0.027125B03

E

265 Q 0.583898093 0.099401686 4 Q-Ü24B50422

E

264 Q 0.5B3540076 0.086415603 4 0.021603901

S

148 A 0.642943664 0 0695041 99 4 0.01737605

A

261 s 0.592734437 0.053926096 4 0.013401524

A

209 S 0.725497927 0.039698254 4 0.009924564

E

213 Q 0.71301777 0 004330404 4 0.001082601

Inicial: El aminoácido en esta posición en la proteína natural 5 Posición: Posición en la proteína

Nuevo: Aminoácido de reemplazo sugerido por el programa

Immunopuntuación: Puntuación inmunológica para este locus en la proteína natural.

Inmunocambio: Cambio en la puntuación inmunológica entre el locus natural y el modificado. CambioBlosum: Cambio en la puntuación BLOSUM entre la posición nativa y la modificada 10 (una medida de cuán conservador es el cambio, siendo los números menores más conservadores) Inmunocambio/ CambioBlosum : El cambio en la inmunogenicidad dividido por el cambio en Blosum.

Tabla 1c

Resultados de los análisis de inmunogenicidad

posición

puntuación total puntuación MHC puntuación TAP puntuación prateasoma

0

0.000165143 1 17 4069809 0.4435191S 9.06162 L-05

i

0.041457346 11.¿0019829 2.86360034 0.003448543

2

0-002426595 1573665433 7.707479979 5.40497 E-05

3

6.002526301 24.94091632 4.435191796 6.27721 E-05

4

0.005 B9 7232 16.1032061 6.122263966 0.0 COI 62311

5

000032745 12.79123206 1.221553255 5.69915 E-05

6

7.91604E 35 15.37844434 0.168621289 3.22938E 05

7

0.000166722 13.39406509 0 702930520 4.84144E-05

8

00001 69826 14.68630033 0.533227336 3.79468E-05

9

0.000316701 117 4069809 1.3039J7895 5 63262E C5

*0

C 123430476 2274636603 6.264874929 0.002349837

11

0.097134418 17.65661657 2.5E21B6489 0.005899326

12

0.040626469 20.27273709 7.532036315 0.000303130

'3

0.046499396 20.74495061 £1.22816259 0,000286364

14

0.001693195 20.74495061 0.926642906 0.000243003

15

2.94196 E-05 11.¿0019029 0.150283880 ¿.36216 E-05

16

6 000555893 11.14069009 0.845108374 0 90O157342

17

C 062993666 16.4783 9.055499382 0,001 146233

18

0.000129314 12.79123206 0.2'2281626 0.0001 29245

19

0-000372025 11.93747303 1.250006885 6.79306E-05

26

0.0001 70764 11,40010829 0.656012939 6.24617 E-05

£1

0.0171 2E463 13.39406509 2.4373'9175 0.00142792

22

3.299 04 E-05 14.68630033 0.360505924 4.22373E-05

23

0 030159095 14.02530793 0.558357566 5.49707E 05

24

3.85269 L- 35 12.50006885 0.2222B6151 3 77629E-0E

25

00001 26872 14.68630033 0.533227336 4.4S 928 E-05

26

0.000210364 1174069009 0.970314241 5.24778 E-05

27

5.09001 E-05 9.929157627 0.352299807 4.009E-05

28

0.000168829 8.070722319 1.537844434 3.71193E-05

29

0.000363844 107 6043742 0.571293443 0.300146293

30

2.00189 F-05 11,66574302 0.12791 ?3Pd 3,82109E-05

3’

0.002132696 17.65661657 16.’032081 0.000209655

32

0-027079223 0.84937105 2.494091632 0.003429894

33

0.0001 23359 11.14069809 0.641030261 4.68999E-05

34

0.000806311 20.74495061 1.891961982 5.6O86E-05

35

0.000356829 1 1.14069009 1.806809666 4.02O49E-05

Claims (20)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   REIVINDICACIONES

   1. Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una variante funcional optimizada inmunitaria de la proteína NDI1 de levadura de SEQ ID n° 542 que comprende al menos un cambio de aminoácido conservador en un resto seleccionado del grupo que consiste en: L195, F90, I82, L89, V266, L481, L202, L259, L150, R85, Y151, Y482, S488, V45 y S80, en donde el ácido nucleico comprende al menos 50 codones que, en comparación con la secuencia del gen NDI1 de levadura natural de SEQ ID n° 1, están codones optimizados para la expresión en células de mamíferos.
2. 2. La secuencia de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en la que al menos 100 codones están optimizados, en comparación con la secuencia del gen NDI1 de levadura natural de la SEC ID n°: 1, para expresión en células de mamífero.
3. 3. La secuencia de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en la que 329 codones son codones optimizados, en comparación con la secuencia del gen NDI1 de levadura natural de la SEC ID n°: 1, para la expresión en células de mamífero.
4. 4. Una secuencia de ácido nucleico aislada de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que el al menos un cambio de aminoácido conservador se realiza en un resto seleccionado del grupo que consiste en V45, I82, V266 y F90.
5. 5. Una secuencia de ácido nucleico aislada de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el al menos un cambio de aminoácido conservador se selecciona del grupo que consiste en V45I, I82V, V266I y F90Y.
6. 6. Una secuencia de ácido nucleico aislada de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la variante funcional optimizada inmunitaria de la proteína NDI1 de levadura de la SEC ID n°: 542 comprende al menos dos de los cambios conservadores de aminoácidos.
7. 7. Una secuencia de ácido nucleico aislada de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que codifica una variante funcional optimizada inmunitaria de la proteína NDI1 de levadura que tiene al menos un 90% o un 95% de identidad de secuencia con la SEC ID n°: 542.
8. 8. Un montaje de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes y una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de localización mitocondrial.
9. 9. Un vector adecuado para su uso en genoterapia y que comprende una secuencia de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o un montaje de ácido nucleico de la reivindicación 8,
10. 10. Vector según la reivindicación 9, en el que el vector es un virus adenoasociado (AAV).
11. 11. Un vector según la reivindicación 9 o la reivindicación 10, que comprende adicionalmente un gen seleccionado de un gen que codifica un factor neurótrofo, un factor de crecimiento, un agente antiapoptótico, un antioxidante, una citocina o una hormona.
12. 12. Vector según la reivindicación 11, en el que el gen codifica el factor neurótrofo derivado de glial (GDNF).
13. 13. Una célula in vitro transformada con una secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, el montaje de ácido nucleico de la reivindicación 8, o el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.
14. 14. La célula in vitro según la reivindicación 13, en la que la célula es una célula madre, una célula progenitora, una célula ganglionar de la retina (CGR) o una célula precursora de CGR.
15. 15. Una secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, el montaje de ácido nucleico de la reivindicación 8, o el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 para uso en un método para tratar o prevenir una enfermedad neurodegenerativa.
16. 16. Una secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, el montaje de ácido nucleico de la reivindicación 8, o el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, y un factor neurótrofo, para usar en un método de tratamiento o prevención de una enfermedad neurodegenerativa.
17. 17. La secuencia de ácido nucleico, montaje de ácido nucleico o vector para uso de la reivindicación 16, en la que el factor neurótrofo es GDNF.
18. 18. Un vector adenoasociado (AAV) que comprende una secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en un método para tratar o prevenir una enfermedad neurodegenerativa.
19. 19. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el vector es un vector adenoasociado (AAV) y comprende un activador en el que la secuencia de ácido nucleico

    está bajo el control del activador, y en el que el activador se selecciona de (a) un activador que se expresa preferencial o específicamente en las células ganglionares de la retina y (b) un activador que es específico de las células fotorreceptoras de la varilla.
20. 20. Un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende una secuencia de ácido nucleico de cualquiera de las 5 reivindicaciones 1 a 7 y una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de localización mitocondrial.

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    Ubigoitina corta

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    Concentración 02 (nmol/ml)

    Figura 3

    Osygraphs para montaj e de NDI1

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    Pendiente 02 [pmol/(s*ml]j

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    Figura 4a

    Oxygraphs para montajes de NDI1 y hXDIlcon sustituciones de aminoácidos

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    Porcentaje de respiración insensible a Rotenona

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    ND/7-f-Rotenona

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    FGFP+Rotenona

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    Restos

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    Figura 3

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    Fisura 10A

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    Numero de copias

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    Posiciones de aminoácidos

    Innnunogenicidad prevista (unidades arbitrarias)

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    Oxygraphs para montajes de NDI1 v NSG

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