CN114134224B - 运动肌肉损伤相关线粒体检测位点、检测方法及应用 - Google Patents

运动肌肉损伤相关线粒体检测位点、检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于运动肌肉损伤相关的线粒体致病位点检测技术领域，公开了运动肌肉损伤相关线粒体检测的12个位点组合，并采用对线粒体高度保守区域从两个方向分别扩增线粒体基因组，避免对核基因组携带的线粒体DNA相似序列的非特异扩增，获得能够覆盖线粒体全基因组的两个长片段。采用本发明提供的运动肌肉损伤相关线粒体检测位点为检测对象，并采用本发明提供的试剂盒，可判断对应的位点是否出现突变，如果携带线粒体致病性碱基突变，则提示在运动训练时存在肌肉损伤的易感倾向并提示预警。

Description

运动肌肉损伤相关线粒体检测位点、检测方法及应用
技术领域
本发明属于运动肌肉损伤检测技术领域，涉及一种运动肌肉损伤相关线粒体检测位点、检测方法及应用。
背景技术
在大强度、高负荷的运动训练中可能导致肌纤维过度收缩或拉伸，产生损伤诱发肌肉细胞坏死、炎症细胞浸润，局部可发生炎症反应，机体产生乏力感、肌肉肿胀感、酸痛感，且较正常运动疲劳更难恢复。当肌肉损伤持续超出身体可恢复的范围时，可发生横纹肌溶解，并在外周循环中呈现出由损伤肌肉释放出来的物质，引起茶色尿甚至深色尿。肌肉成分释放到血液中后，可表现为肌酸激酶(creatine kinase,CK)、肌红蛋白(myoglobin)、α-肌动蛋白(α-actin)水平升高，在尿液中也可以检测到肌红蛋白。血清或血浆中肌酸激酶的水平是最常见的判定和诊断肌肉损伤程度的指标，CK数值超过1000U/L可确诊，或者通过血或尿中检测到肌红蛋白可确定，需要注意的是血清肌红蛋白升高也可能由急性心梗引起。因为肌酸激酶对肌肉损伤的指示作用，在运动训练和运动员状态监测中，常用来判断运动负荷和可能的运动损伤，在动物模型中也得到验证。不过这些都依赖于运动后发生了损伤现象才可以实施监测，并不能提前预警潜在的运动损伤风险。
发生横纹肌溶解时，由于循环中肌肉释放的蛋白大分子成分含量上升，造成肾脏负担加重，甚至引发肾衰以及威胁生命。因此，如果能通过已知可能引发横纹肌溶解这类肌肉损伤的风险进行预判，可以更早地对训练策略和训练相关的生化监测进行提示，避免出现严重的肌肉损伤甚至危及生命的不良结局。
造成运动肌肉损伤甚至横纹肌溶解的遗传因素包括线粒体的致病突变。线粒体中三羧酸循环为机体最重要的能量代谢途径，线粒体的致病突变可导致线粒体能量代谢和电子传递链功能异常。例如有文献报道人的线粒体基因组长约16.6kb，编码了37个基因都参与线粒体氧化呼吸链上蛋白的组装，其中13个基因编码呼吸酶复合物蛋白，22个基因编码不同的tRNA，2个编码rRNA。编码了细胞色素C氧化酶(cytochrome c oxidase)复合物组分的COX I/II/III发生致病突变时，可导致运动或长时间运动诱导的横纹肌溶解。还有文献报道一名45岁男性带有ND1基因突变(m.3394T>C)表现出高肌红蛋白尿、乏力、血清CK水平升高并且出现肾衰，肌肉组织病理显示异常肌纤维表现，并且既往在竞技运动项目后出现过两次类似症状。这些都提示我们线粒体突变和横纹肌溶解相关，并进一步可以作为判断运动员横纹肌溶解及运动肌肉损伤的标准。
对于线粒体的致病突变位点，常见的检测方法有经典的Southern杂交、一代测序(单个检测序列覆盖800bp左右)、二代测序，也可以使用通用的SNP检测方法。在各类方法中，对线粒体扩增可选择常规PCR、定量PCR或者是长片段PCR。常规PCR一般扩增2kb以内的片段，定量PCR的目标片段更短，通常不超过300bp。长片段扩增甚至可以直接扩增整个线粒体序列，都可用于缺失序列检测。PCR扩增结合RFLP(限制性内切酶片段长度多态性)也是研究中常用的突变检测方式。但是常规短片段扩增可能因为核基因组上和线粒体同源的序列，造成检测的错误。核内的线粒体类似序列(NUMTs)广泛分布于各个染色体，部分和线粒体同源性可达94％以上，多数的相似度在68％至100％之间。而且大部分NUMTs的片段长度较短，为几十至200bp。因此短片段扩增或者扩增位置序列与NUMTs重合时，容易造成PCR扩增的偏倚和NUMT序列对线粒体序列的污染。
因此，目前在运动员肌肉损伤风险的判断尤其是在运动前就能实现运动肌肉损伤风险的判断是存在困难，急需一种能够精准有效判断运动员在训练前出现肌肉损伤风险的方法。
发明内容
为了克服上述技术问题，本发明提供了一种运动肌肉损伤相关线粒体检测位点的集合，以及该检测位点集合的检测方法。本发明对一组训练后出现横纹肌溶解的新学员进行线粒体测序发现，在这组样本中携带有12个线粒体致病突变，并通过本发明的检测方法，快速准确地实现了运动员在运动前肌肉损伤风险的预判。
第一方面，本发明提供了一种运动肌肉损伤相关线粒体检测位点，所述检测位点由线粒体DNA中3394T>C、3421A>G、4833A>G、5814T>C、8108A>G、8363G>A、9957T>C、12338T>C、14484A>G、14502T>C、14693A>G、15927G>A组成。其中，所述线粒体序列为已知人线粒体基因组序列(NC_012920.1)。
第二方面，本发明还提供了一种检测本发明第一方面所述线粒体检测位点的引物组，所述引物组包括线粒体长片段扩增引物及一步延伸引物。
更进一步地，所述线粒体长片段扩增引物包括扩增引物组合1及扩增引物组合2，所述扩增引物组合1包括扩增上游引物SEQ ID NO.1及扩增下游引物SEQ ID NO.2，所述扩增引物组合2包括扩增上游引物SEQ ID NO.3及扩增下游引物SEQ ID NO.4。
更进一步地，所述一步延伸引物的序列如SEQ ID NO.5-16所示。
第三方面，本发明还提供了一种检测运动肌肉损伤相关线粒体位点的试剂盒，其包括至少一次用量的权利要求2-4任一所述的引物组。
第四方面，本发明还提供了一种筛查样本出现运动肌肉损伤的方法，所述方法用于非疾病的诊断和治疗目的，其特征在于，所述方法包括，采用本发明第一方面所述的引物组或者本发明第二方面所述的试剂盒对样本进行检测，并与对照样本比较，以筛查出现运动肌肉损伤的样本。
更进一步地，所述比较是指与对照样本相比是否出现线粒体DNA突变位点，如果出现所述线粒体DNA突变位点，则样本出现运动肌肉损伤的风险相对较大。
更进一步地，所述线粒体DNA突变位点为3394T>C、3421A>G、4833A>G、5814T>C、8108A>G、8363G>A、9957T>C、12338T>C、14484A>G、14502T>C、14693A>G、15927G>A。
本发明相对于现有技术具有的技术效果：
1)本发明发现的线粒体致病位点组合，在运动训练之前进行检测，可以有效预判其出现运动肌肉损伤的风险，为线粒体致病突变相关的肌病表现给予预警提示。
2)本发明选择了和NUMT报道重叠概率小的3200-3400bp和12200-12900bp(参考序列NC_012920.1)位置，设计线粒体的长片段扩增引物，分别从两个方向扩增得到两个长片段，从而覆盖线粒体的全长序列，并对此扩增产物采用SnapShot的方法同时检测12个致病位点的突变情况，可以有效避免检测过程中出现的PCR扩增偏倚和NUMT序列对线粒体序列的污染。
3)采用本发明提供的试剂盒，在临床中可以准确快速检测出样本中突变位点的位置，使用简单方便。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例4单个样本对线粒体扩增得到的两个长片段。M，1kb ladder Marker。1-1，样本1用扩增引物组合1得到的长片段，长度约9641bp；1-2，样本1用用扩增引物组合2得到的长片段，长度约7678bp。2-1和2-2，3-1和3-3，13-1和13-2分别是样本2、3、13的两个扩增片段。
图2为参考序列无突变的参考对比峰图。
图3为实施例5中8个无突变的对照样本位点的检测峰图。
图4为实施例6中13个临床的检测峰图。
具体实施方式
下面将对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
实施例1
在前期大量突变位点的检测及筛查的基础上，根据在运动后出现横纹肌溶解的30多人中和运动耐受组对比发现，在已经报道的和体能相关的变异中，多个基因位点的基因分型具有显著性差异，因此针对多个位点进行Snapshot方法的检测，同时检测这些位点，进行基因分型，最终筛选出上述12个具有特异性差异的突变位点，因此将其组合成针对运动肌肉损伤的检测位点应用于临床，具体突变位点见表1中所示。
表1 12个线粒体致病突变位点
序号 突变位置 突变情况
1 3394 T>C
2 3421 G>A
3 4833 A>G
4 5814 T>C
5 8108 A>G
6 8363 G>A
7 9957 T>C
8 12338 T>C
9 14484 T>C
10 14502 T>C
11 14693 A>G
12 15927 G>A
实施例2
根据实施例1提供的突变位点检测panel设计检测2组长片段PCR引物和单位点一步延伸引物序列，其具体序列如表2及表3所示。
表2线粒体长片段扩增引物序列
Figure BDA0003395647120000061
表3单基因延伸引物序列
Figure BDA0003395647120000062
Figure BDA0003395647120000071
实施例3
将实施例2中的长片段引物和单位点一步延伸引物制备为试剂盒。所述试剂盒中，包括长片段PCR引物组合以及单位点一步延伸引物混合物，还包括：PrimeSTAR GXL DNA聚合酶反应混合液，去离子水，ExoSAP反应酶，分别带四种荧光标记的ddNTP和延伸所需合成酶及缓冲体系的混合液SNaPshot Multiplex，FastAP磷酸消化酶和10×FastAP Buffer。
实施例4
采用实施例3中的试剂盒对样本进行检测，具体步骤如下：
1.取待检测人的血液，唾液，口腔拭子等可提取出人基因组DNA的生物样本，进行核酸提取；
2.对核酸提取液进行核酸浓度确定，核酸浓度不低于1ng/μl，OD260/280比值为1.7-2.0表示纯度符合要求；
3.对于浓度在1-50ng/ul的样品可直接进行PCR，样本浓度过高时将核酸浓度调整到合适范围内；
4.采用本发明提供的试剂盒进行突变位点检测panel的检测：
4.1配制2个长片段引物组合针对线粒体全序列的第一轮反应混合液，在2个反应管中完成，第一轮反应程序为：98℃变性10秒,66℃退火15秒并设置从第二轮开始每轮退火温度降低0.8℃，再68℃延伸10分钟；再进行35轮固定温度循环反应：98℃变性10秒，58℃退火15秒,68℃延伸10分钟；循环结束后68℃延伸10分钟，共计45循环结束反应。反应产物进行电泳，结果如图1所示。
4.2将PCR产物按产物浓度比例配置成混合样品，使用ExoSAP-ITTM(Thermofisher)水解过量的引物和核苷酸，防止干扰后续的单碱基延伸；
4.3加入含有四种荧光标记的ddNTP混合液SNaPshotTM Multiplex ReadyReactionMix，单碱基延伸引物和前一步骤中经过ExoSAP酶处理的PCR混合产物，进行单碱基延伸步骤。单碱基延伸反应为：95℃变性1分钟，设置循环30轮，循环内95℃变性10秒，60℃退火并延伸30秒，循环结束后结束反应。
4.4按照ThermoFisher相应的试剂盒操作，对反应产物加入FastAP 1U和10×FastAP Buffer，将未反应的核苷酸的5’和3’磷酸集团去除实现产物纯化，降低检测背景。
5.将延伸产物取2-3μl和混合有0.2μl片段长度标志物GeneScanTM -120 LIZ的Hi-DiTM Formamide转移至96孔板，在95℃变性5分钟后立刻转移至冰上，然后在3500系列基因分析仪上使用片段化检测模式进行上机检测；
6.完成检测后使用预设的Panel分析完成多位点基因型的分析和报告。
对于同一个位点上可能出现的不同碱基，片段化分析后在参考识别的长度范围左右通常会以G、C、A、T的顺序从小到大排列，即当该位点携带G碱基时，片段化分析展示的位置会略小于该位点携带A碱基的片段。个别引物因碱基序列的差异，可能出现排列GCAT排列顺序的变化，通常表现为不同碱基展示在相近/相同的位置上。如图2所示为参考序列无突变位点检测峰图。
表4 12个位点一步延伸引物配对信息、位点突变信息和峰图参考识别范围
Figure BDA0003395647120000091
实施例5
采用实施例4的检测方法，针对8个对照组(C1-C8)临床样品进行检测，所有样本均来源于在训练中表现正常的训练人员，未见有CK升高、尿色加深的现象。对样本进行12个线粒体致病位点的序列检测，结果如图3显示。检测结果显示所有8个样本均显示了一致的检测结果。对应序列显示与参考基因组序列一致，表明无上述12种线粒体致病位点突变。
实施例6
采用实施例4的检测方法，对13例(P1-P13)训练后出现严重乏力、肌肉肿胀、尿色加深/茶色尿、生化检测CK值大于1000U/L的训练人员的样品进行12个线粒体致病位点的序列检测，结果显示如图4所示。
位点发生突变时，以5814为例，如果位点突变为C，显示的是互补碱基G，在图2中5814指示的A峰消失，在A峰前面位置出现一个G峰(蓝色峰，显示的碱基数小于A峰对应的碱基数，见图4所示P4)。对于配对方向为“正”的片段，位点对应的碱基和检测峰识别的碱基一致；对于配对方向为“反”的片段，位点对应的碱基为检测峰识别的碱基的配对碱基。
基于以上判断原则，根据图4中每个案例峰图上所示的碱基序列和对应分析得到的序列，可以得检测到以下突变(仅显示发生突变的位点，未突变位点不显示)，如下表所示。
表5 13例患者线粒体突变结果报告信息
Figure BDA0003395647120000101
Figure BDA0003395647120000111
综上，采用本发明提供的运动肌肉损伤相关线粒体检测位点为检测对象，并采用本发明提供的试剂盒，可判断对应的位点是否出现突变，如果携带线粒体致病性碱基突变，则提示在运动训练时存在肌肉损伤的易感倾向并提示预警。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。
序列表
<110> 中国人民解放军总医院
<120> 运动肌肉损伤相关线粒体检测位点、检测方法及应用
<130> 2021
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
aacagggttt gttaagatgg cagag 25
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
gttgtatagg attgcttgaa tggctgct 28
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
cttttaaagg ataacagcta tccattgg 28
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
ggtaagcatt aggaatgcca ttgc 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
tagcccgtag gggcctacaa 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
ccagaggtta cccaaggc 18
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
ctttttacca gctccgaggt g 21
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
ggtggttata gtagtgtgca tggtt 25
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
tttcttatcg ctgtagtata tccaaagaca acca 34
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
attttggggg aggttatatg ggtttaatag ttttttta 38
<210> 11
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
tcttatctta tcttatcctc atcaatagat ggagacatac agaa 44
<210> 12
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
tcttatctta tcttatctta tattaagaga accaacacct ctttacagt 49
<210> 13
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
tcttatctta tcttatctta tcttatttcc acattaggct taaaaacaga tgca 54
<210> 14
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
tcttatctta tcttatctta tcttatctta tttggggcct ttgcgtagtt gtatat 56
<210> 15
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
tcttcttatc ttatcttatc ttatcttatt tgtagtataa actaatacac cagtcttgta 60
aacc 64
<210> 16
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
tcttatctta tcttatctta tcttatctta tcttatctta tcttaatcat tattctcgca 60
cggactaca 69

Claims (2)

1.一种检测运动肌肉损伤相关线粒体DNA突变位点的引物组，其特征在于，所述运动肌肉损伤相关线粒体DNA突变位点为3394T>C、3421A>G、4833A>G、5814T>C、8108A>G、8363G>A、9957T>C、12338T>C、14484A>G、14502T>C、14693A>G、15927G>A，
所述引物组包括线粒体长片段扩增引物及一步延伸引物，所述线粒体长片段扩增引物包括扩增引物组合1及扩增引物组合2，所述扩增引物组合1包括扩增上游引物SEQ ID NO.1及扩增下游引物SEQ ID NO.2，所述扩增引物组合2包括扩增上游引物SEQ ID NO.3及扩增下游引物SEQ ID NO.4，所述一步延伸引物的序列如SEQ ID NO.5-16所示。
2.一种检测运动肌肉损伤相关线粒体DNA突变位点的试剂盒，其特征在于，其包括至少一次用量的权利要求1所述的引物组。
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