ES2683002T3 - Producción eficaz de parvovirus autónomos recombinantes utilizando un vector cooperador obtenido a partir de adenovirus - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de preparación de un parvovirus autónomo recombinante caracterizado porque (i) se transfectan células HEK 293T con (a) un vector de parvovirus recombinante obtenido a partir del parvovirus de rata H-1 (H-1) o del virus diminuto de ratón (MVM) que carece de los genes de las proteínas de la cápside VP1 y VP2 del virus pero que conserva las secuencias codificantes de la proteína no estructural NS1/2, b) un vector que contiene los genes que codifican las proteínas de la cápside VP1 y VP2 de parvovirus, y (c) un vector cooperador obtenido a partir de adenovirus que comprende las secuencias de ADN adenovíricas de Ad5 del gen E2a, el gen E4(orf6) y un gen ARN VAI; y (ii) el parvovirus recombinante que carece de los genes de VP1 y VP2 pero que conserva las secuencias codificantes de NS1/2 se aísla de las células HEK 293T o del medio después del cultivo de las células.

Description

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DESCRIPCION

Produccion eficaz de parvovirus autonomos recombinantes utilizando un vector cooperador obtenido a partir de adenovirus

La presente invencion se refiere a un procedimiento para preparar de manera eficaz un parvovirus recombinante (partmula) que se basa en el uso de diversos virus/vectores cooperadores obtenidos a partir de adenovirus.

Los parvovirus son virus icosaedricos de ADN monocatenario. Su genoma contiene aproximadamente 5,1 kilobases e incluye los promotores P4 y P38, que dirigen la expresion de protemas no estructurales (NS1 y NS2) y estructurales (VP1 y VP2), respectivamente. Los parvovirus pertenecen a la familia Parvovirinae, junto con los Dependovirus y los Eritrovirus. Los Dependovirus incluyen los virus adenoasociados (VAA). Estos virus, como su nombre indica, son dependientes de un virus cooperador, como el adenovirus, para un ciclo de infeccion productiva [1]. Por otro lado, los Eritrovirus y los Parvovirus son autonomos; son capaces de completar su ciclo productivo sin un virus cooperador. Los Eritrovirus incluyen B19, conocido por ser patogeno para los seres humanos.

Los parvovirus de roedores no son patogenos para los seres humanos y muestran propiedades oncotropicas y oncolfticas que los vuelven agentes muy atractivos para la terapia contra el cancer. Para mejorar aun mas su capacidad antineoplasica intrmseca, se han generado virus recombinantes para entregar transgenes antitumorales a celulas cancengenas. La estrategia consiste en sustituir los genes VP de la capside por un transgen particular [2]. Los vectores conservan la secuencia que codifica NS1/2 (bajo el control del promotor P4 parvovmco) y los telomeros del genoma de parvovirus que son necesarios para la amplificacion de ADN vmco y la encapsidacion. El transgen de interes generalmente se expresa bajo el control del promotor P38, el cual se transactiva fuertemente con la protema NS1. La produccion de los virus recombinantes solo se puede producir en celulas productoras, proporcionando las protemas VP en trans. La delecion de la region codificadora de la capside en el genoma vmco ofrece la oportunidad de insertar transgenes de hasta aproximadamente 2500 nt, aunque grandes deleciones de VP reducen significativamente los tftulos de produccion, probablemente debido a la inhibicion de elementos importantes de la encapsidacion de virus que actuan en cis [2]. Los vectores de parvovirus recombinantes generados de esta manera tienen una replicacion defectuosa, proporcionando una ventaja adicional para la seguridad terapeutica, en comparacion con sus homologos replicativos. Ejemplos de transgenes transducidos con exito mediante parvovirus recombinantes, incluyen genes toxicos, tales como la timidina cinasa del virus del herpes simple (por ejemplo, usada en combinacion con el profarmaco ganciclovir) [3] o apoptina [4]. Los viriones que expresan estos transgenes tienen actividades antineoplasicas mejoradas, en comparacion con los virus de tipo silvestre. Tambien se han generado parvovirus recombinantes que codifican genes inmunomoduladores tales como citocinas o quimiocinas, como interleucina-2 (IL-2) o protema quimiotactica de monocitos 1 o 3 (MCP-1) [5-8], protema inducible con interferon-y (IP-10) [9]. Estos viriones inducen un efecto espectador antitumoral potente en varios modelos de tumores in vitro e in vivo. Recientemente, se han observado efectos antitumorales sinergicos usando una combinacion de virus recombinantes que transducen el Factor de Necrosis Tumoral-a (TNF-a) e IP-10 [10].

Las actividades cooperadoras del adenovirus frente a la replicacion del VAA se han estudiado ampliamente [27, 28, 29, 30]. La protema E1A adenovmica es esencial para la activacion de la expresion genica de VAA mediante la union y la activacion del promotor P5 rep de VAA-2 [12]. Del mismo modo, E2A, otra protema adenovmica, activa la transcripcion del promotor P5 de VAA-2 [13]. E2A tambien parece que coopera con el ARN I asociado con virus (ARN VAI) para mejorar la traduccion de los ARN de VAA-2 [14]. E4 adenovmca (ORF6) mejora la conversion de los genomas de VAA-2 recombinantes de cadena sencilla, en genomas de doble cadena, una etapa limitante de la tasa de replicacion del ADN vmco, tanto in vitro como in vivo [15]. El ARN VAI tambien puede impulsar la replicacion de VAA-5. Se ha descrito que el ARN VAI interacciona ffsicamente con la protema cinasa activada con ARN de doble cadena (PKR), que de otro modo provocana una respuesta inmune antivmca que bloqueana la produccion de protema vmca [16].

Estudios con VAA-2 recombinante han confirmado que un pequeno subconjunto de genes adenovmcos es suficiente para el efecto cooperador. En celulas HEK 293, que proporcionan el gen E1 en trans, el conjunto mmimo de genes para la produccion eficaz de VAA-2 recombinante es E2a, E4(orf6) y el gen del ARN VAI [17, 18]. Un plasmido cooperador denominado pXX6, que contiene este conjunto de genes, se utiliza actualmente para la produccion de VAA-2 recombinante exento de adenovirus [18]. Este plasmido mantiene la produccion de VAA-2 de una manera similar a la del adenovirus infeccioso [18, 19]. Los genes de adenovirus (E2a, E4orf6 y los genes del ARN VAI) tambien permiten la replicacion del ADN del eritrovirus B19 humano y la produccion vmca en celulas HEK 293, que de otro modo no senan permisivas para B19 [20].

Sin embargo, la interaccion entre adenovirus y parvovirus autonomos se ha explorado menos. La replicacion de parvovirus H-1 en cultivos secundarios de celulas pulmonares embrionarias humanas normales no se inicia, a menos que se coinfecten con el adenovirus de serotipo 12 como virus cooperador [21]. Ademas, el adenovirus de serotipo 2 induce un aumento de la replicacion del ADN de parvovirus MVMp y traslada el ADN de MVMp desde los nucleolos del hospedador a las plantas de replicacion del adenovirus en celulas HeLa [22].

Un desafm principal en el desarrollo y la optimizacion de parvovirus recombinantes (rec.PVs) para aplicaciones clmicas, es incrementar la cantidad de virus que se produce. Debido a su naturaleza no proliferativa, su produccion

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depende unicamente de la eficacia de la transfeccion de los componentes genomicos del parvovirus en las lmeas celulares de encapsidacion (celulas embrionarias de rinon humano normales, HEK 293 o 293T). Tambien el uso de lmeas celulares de encapsidacion que expresan constitutivamente las protemas VP no mejoro significativamente la produccion de parvovirus recombinantes [11]. Sigue siendo muy importante desarrollar medios para incrementar la produccion de parvovirus recombinantes.

Recientemente se ha publicado un artmulo de revision sobre vectores basados en parvovirus autonomos y su posible uso para el tratamiento del cancer [31].

Por lo tanto, el problema en que se basa la presente invencion es proporcionar un medio para incrementar la eficacia de la produccion de parvovirus recombinantes.

Este problema tecnico se resuelve proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Se ha encontrado, sorprendentemente, que tambien la produccion de parvovirus recombinantes se puede beneficiar de la cooperacion de genes de adenovirus. La produccion de parvovirus recombinantes se realiza de forma clasica en celulas productoras HEK 293T, transfectandolas con el genoma de parvovirus recombinante y un plasmido que es portador de los genes VP de la capside. El protocolo en uso produce tftulos muy bajos de parvovirus recombinantes, en el intervalo de 0,1 a 0,5 unidades de transduccion (TU) por celula productora, en las mejores condiciones. Ademas, debido a diferencias en la eficacia de la transfeccion del plasmido, tambien hay una alta variabilidad de los tftulos obtenidos. Los virus generados de esta manera tienen una replicacion defectuosa, pero contienen una pequena fraccion de virus competentes para la replicacion (RCVs) reconstituidos a traves de recombinaciones homologas entre los genomas vfticos y los genes de la capside [11]. Estos RCVs son contaminantes no deseados de las reservas vfticas finales y por lo tanto es importante limitar su aparicion durante la produccion de parvovirus recombinantes.

En los experimentos resultantes en la presente invencion, la eficacia de la produccion de parvovirus recombinantes podna incrementarse significativamente empleando genes de adenovirus que se han introducido en las celulas, ya sea mediante transfeccion de las celulas productoras con un plasmido pXX6 obtenido a partir de adenovirus o a traves de la infeccion de las mismas con Adenovirus-5 recombinante (Ad-5). Empleando el nuevo protocolo, se alcanzaron tftulos mas de 10 veces superiores en un espacio de tiempo mas corto (2 dfas en lugar de 3). El porcentaje de RCVs generados es comparable al del protocolo exento de adenovirus. De cara a estos resultados, se genero un nuevo vector Ad-5 recombinante con replicacion defectuosa que albergaba la unidad genica de la capside de parvovirus (cooperador Ad-VP). Con este virus cooperador, se pudieron generar parvovirus recombinantes en otras celulas productoras tales como NB324K (NBK) y se produjeron tftulos vfticos mas elevados, sin afectar a la calidad del virus recombinante. Es importante destacar que el uso de un cooperador Ad-VP permite evitar la etapa de transfeccion. El procedimiento se puede normalizar, es reproducible y reduce tanto el tiempo de produccion como los costes.

Compendio:

El uso de vectores obtenidos a partir de adenovirus 5, por ejemplo, pXX6 (proporcionado mediante transfeccion) y el Ad5AE1AE3, (proporcionado mediante transfeccion y a traves de infeccion en forma de virus recombinante Ad5AE1AE3-CMV/GFP), mejora mas de 10 veces la produccion de parvovirus recombinantes en celulas HEK 293T.

El incremento de la produccion proporcionado por vectores obtenidos a partir de adenovirus, es independiente del modo de entrega de los parvovirus recombinantes, (transfeccion del plasmido o infeccion vftica), asf como del tamano y de la naturaleza del transgen parvovftico en celulas HEK 293T.

pXX6 acelera la produccion de parvovirus recombinante y acorta el tiempo de produccion de 3 a 2 dfas.

pXX6 aumenta significativamente y acelera la replicacion del ADN de parvovirus en celulas HEK 293T.

pXX6 no favorece la generacion no deseada de Virus Competentes para la Replicacion (RCV); los niveles de RCVs

obtenidos utilizando el protocolo basado en pXX6 son tan bajos como los obtenidos utilizando metodologfas

convencionales.

El virus cooperador Ad-VP que contiene los genes cooperadores de Ad, asf como la unidad genica de la capside de parvovirus permite la amplificacion de parvovirus recombinantes sin la necesidad de una etapa de transfeccion, a traves de la infeccion de un virus cooperador Ad-VP en combinacion con el parvovirus recombinante seleccionado. Esto reduce significativamente el tiempo y los costes de la produccion (en relacion, por ejemplo, con los reactivos de la transfeccion y el personal).

Por otra parte, supera las limitaciones anteriores en la eleccion de la lrnea celular de encapsidacion utilizada, ya que hace posible el uso de lmeas celulares que son diftciles de transfectar, pero que son buenas productoras de PVs, por ejemplo, las celulas NBK. Esto permite la produccion a gran escala de parvovirus recombinante, por ejemplo, en biorreactores.

Breve descripcion de las Figuras

Figura 1: Plasmidos basados en adenovirus mejoran la produccion de parvovirus recombinantes

Celulas HEK 293T, sembradas en placas de 6 cm, se transfectaron con prec.PV-GFP y pCMV/VP para producir

parvovirus recombinantes. Simultaneamente, se cotransfectaron o no con el plasmido pXX6 obtenido a partir de

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adenovirus. Tres d^as despues de la transfeccion, las celulas se recogieron junto con su medio y se lisaron mediante tres ciclos de congelacion y descongelacion. Volumenes iguales de extractos de virus crudo se aplicaron a celulas NBK de nuevo aporte en un ensayo de transduccion, tal y como se describe en la seccion de Materiales y Procedimientos.

A: Ejemplo representativo de micrograftas procedentes del ensayo de transduccion, que muestra celulas positivas para GFP procedentes de capas celulares confluentes. Las micrograftas fueron tomadas con los mismos ajustes de la camara, lo que sugiere que diferentes numeros valorados de celulas verdes se corresponden con un inoculo de virus diferente.

B: Analisis de transferencia Western. Muestras por triplicado procedentes del ensayo de transduccion se combinaron y se extrajeron las protemas. Se separaron 5 |jg de protemas mediante SDS-PAGE. Se realizaron inmunotransferencias utilizando anticuerpos anti-NS1, anti-GFP y anti-actina (utilizada como testigo de carga). neg., testigo negativo (celulas no transfectadas).

C: Cuantificacion de los ensayos de transduccion. Las celulas se transfectaron con prec.PV-GFP, pCMV/VP en combinacion con los plasmidos indicados, o sin ningun ADN adicional (-). pXX6 o pAd5AElAE3 se utilizaron como plasmidos cooperadores y pFRT/lacZeo se utilizo como un ADN de relleno testigo en las mismas cantidades, tal y como se indica en la figura. Las barras representan la media de tres replicados con desviaciones estandar relativas. Los valores encima de las barras de datos indican el numero de veces de cambios en la produccion de tftulos de virus, obtenidos en presencia de plasmidos cooperadores adenovfticos en comparacion con el testigo negativo. TU, unidad de transduccion.

Figura 2: La produccion de parvovirus recombinantes se incrementa con el plasmido pXX6 obtenido a partir de adenovirus

Celulas HEK 293T, sembradas en frascos de 175 cm2, se transfectaron con prec.PV-GFP, pCMV/VP con o sin pXX6. Tres dfas despues de la infeccion, se recogieron las celulas y se resuspendieron en 0,5 ml de tampon vTE (Tris-HCl 50 mM [pH 8,3], EDTA 0,5 mM) y se lisaron mediante tres ciclos de congelacion y descongelacion. Los extractos de virus crudo se utilizaron en diferentes ensayos para determinar los tftulos de virus. Las barras representan las medias de diferentes replicados, con desviaciones estandar relativas. Los valores encima de las barras de datos muestran el numero de veces de cambios en la produccion de virus en presencia o ausencia de pXX6. Los tftulos de virus se proporcionan en Vg/ml, tal como se midio a traves de PCR cuantitativa espedfica de parvovirus (Q-PCR), TU/ml como resultado de un ensayo de transduccion o RU/ml a traves de un ensayo de hibridacion espedfico de parvovirus. Los parvovirus competentes para la replicacion producidos se midieron mediante ensayo de placas y los resultados se expresaron como una proporcion de PFU producidas frente a TU producidas. Vg, genoma vftico, TU, unidad de transduccion, RU, unidad de replicacion; PFU, unidad formadora de placas.

Figura 3: Plasmidos cooperadores adenovfticos o virus Ad-GFP recombinantes mejoran la produccion de parvovirus recombinantes que albergan un transgen largo

Celulas HEK 293T, sembradas en placas de 6 cm, se transfectaron con una mezcla de prec.PV-luciferasa y pCMV/VP, con la adicion de pXX6 o pVAE2AE4-5 como plasmidos cooperadores, o sin ningun ADN adicional (-). Paralelamente, 1 h despues de la transfeccion de los plasmidos de parvovirus, un conjunto de placas se infecto con Ad5AE1AE3-CMV/GFP recombinante purificado (Ad-GFP) con la MOI indicada (GFU/celula). Tres dfas mas tarde, las celulas se trataron tal y como se indica en la leyenda de la Fig. 1. Extractos de virus crudo se utilizaron para infectar celulas NBK y, 48 h mas tarde, se usaron extractos totales de NBK para ensayos con luciferasa, tal y como se indica en la seccion de Materiales y Procedimientos. Las barras representan la media de tres replicados con sus desviaciones estandar relativas. Los valores encima de las barras de datos muestran el numero de veces de cambios en la produccion de luciferasa, en comparacion con el testigo negativo. GFU: unidad fluorescente verde. RLU, unidad de luciferasa relativa.

Figura 4: pXX6 acelera la produccion de parvovirus recombinantes

Celulas HEK 293T, sembradas en placas de 10 cm, se transfectaron con prec.PV-GFP, pCMV/VP con o sin plasmido pXX6. Despues de la transfeccion, las celulas se recogieron en su medio en los momentos indicados. La mitad de la cosecha fue sometida a lisis tal y como se ha descrito anteriormente y se utilizo para ensayos de transduccion, mientras que la otra mitad se uso para analisis de transferencia Southern.

A: Resultado del ensayo de transduccion. Las barras representan los valores medios de tres replicados con sus desviaciones estandar relativas. Los valores encima de las barras de datos muestran el numero de veces de cambios en la produccion de tftulos de virus en presencia de pXX6, en comparacion con su ausencia.

B: Analisis de transferencia Southern. El ADN vftico se extrajo a partir de lisados celulares de ADN crudo, se separo a traves de una electroforesis en gel de agarosa al 1 % y se transfirio a una membrana de nailon. La membrana se incubo con una sonda de ADN marcada con [32P] espedfica de parvovirus y se sometio a autorradiograffa. Neg. testigo negativo (celulas no transfectadas).

C: Celulas testigo transfectadas solo con prec.PV-GFP y recogidas despues de 72 h; TU, unidad de transduccion; mRF, forma replicativa monomera; dRF, forma replicativa dfmera.

Figura 5: pXX6 aumenta la produccion de parvovirus recombinantes en un protocolo basado en transfeccion/infeccion

Celulas HEK 293T, sembradas en placas de 6 cm, fueron transfectadas con pCMV/VP, +/- pXX6 y despues se infectaron con rec.PV-GFP. Tres dfas mas tarde, se recogieron las celulas en su medio y se lisaron mediante tres

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ciclos de congelacion y descongelacion. Extractos de virus crudo se utilizaron para determinar los tftulos de virus mediante un ensayo de transduccion, tal y como se ha descrito anteriormente. Se muestran las cantidades totales de entrada y salida de virus. Los valores encima de las barras de datos muestran las tasas de amplificacion del virus de entrada durante la produccion. TU, unidad de transduccion.

Figura 6: Produccion de diferentes parvovirus recombinantes utilizando virus cooperador Ad-VP recombinante

A: Celulas NBK, sembradas en placas de 6 pocillos, se infectaron con virus cooperador Ad-VP purificado con MOI 10 (unidad de Ad-X/celula), y luego se hiperinfectaron con el siguiente parvovirus recombinante: hH-1- GFP, H-1-GFP, MVM-GFP o Chi-hH-1-GFP [23] con una MOI de 0,1 GFU/celula o 0,5 para H-1-GFP. Un dfa despues de la infeccion, el medio se cambio y tres dfas mas tarde, las celulas se recogieron en su medio y se lisaron mediante tres ciclos de congelacion y descongelacion. Extractos de virus crudo se utilizaron para determinar los tftulos de virus mediante un ensayo de transduccion. Las barras representan los valores medios de tres replicados (duplicados para H-1-GFP) con sus desviaciones estandar relativas. Los valores encima de las barras de datos muestran el numero de veces de cambios de los tftulos de virus producidos con respecto al virus utilizado como entrada. Los tftulos de virus se proporcionan como GFU/ml.

B: Relacion entre los parvovirus competentes para la replicacion (RCV) producidos en presencia (+) o ausencia (-) de condiciones de cooperador Ad-VP. Los tftulos de RCV se midieron mediante ensayo de placas en celulas NBK y se expresaron en PFU/ml. GFU, unidad fluorescente verde; PFU, unidad formadora de placas.

Figura 7: Mapa esquematico del plasmido cooperador Ad-VP Descripcion detallada de la invencion

La invencion en su sentido mas amplio es como se define en las reivindicaciones independientes.

La presente invencion se refiere a un procedimiento de preparacion de un parvovirus autonomo recombinante caracterizado porque

(i) se transfectan celulas HEK 293T con

(a) un vector de parvovirus recombinante obtenido a partir del parvovirus de rata H-1 (H-1) o del virus diminuto de raton (MVM, sigla de minute virus of mice) que carece de los genes de las protemas de la capside del virus VP1 y VP2 pero que conserva las secuencias codificantes de la protema no estructural NS1/2,

b) un vector que contiene los genes que codifican las protemas de la capside VP1 y VP2 de parvovirus, y (c) un vector cooperador obtenido a partir de adenovirus que comprende las secuencias de ADN adenovftico de Ad5 procedentes del gen E2a, el gen E4 (orf6) y un gen de ARN VAI; y

(ii) el parvovirus recombinante que carece de los genes VP1 y VP2 pero que conserva las secuencias codificantes de NS1/2 se afsla de las celulas HEK 293T o del medio despues del cultivar las celulas.

El virus cooperador obtenido a partir de adenovirus contiene todas las secuencias de ADN de un virus cooperador que son necesarias para la formacion de parvovirus. De acuerdo con la presente invencion, tales secuencias de ADN se obtienen a partir de adenovirus 5. Secuencias de ADN del vector cooperador adecuado como material de partida para la preparacion de los parvovirus recombinantes, se describen en el documento de solicitud de patente alemana 196 44 500.0-41, es decir, los genes de Ad5, E2A, E4 y VA se pueden obtener a partir del plasmido pDG y los que estan controlados por el promotor original respectivo o por un promotor heterologo.

La expresion "virus cooperador obtenido a partir de adenovirus" utilizada en el presente documento, no solo se relaciona con aquellos virus que tienen los genes originales enumerados anteriormente en c), sino que tambien se relaciona con virus que tienen genes modificados, que incluyen deleciones o inserciones de nucleotidos, por ejemplo, pero que todavfa codifican protemas que tienen la funcion biologica deseada. Por medio de procedimientos comunes, una persona experta en la tecnica puede determinar si un gen modificado todavfa codifica un producto que tiene la funcion biologica deseada. La persona experta en la tecnica tambien conoce fuentes de los genes individuales que son caractensticos del virus de acuerdo con la invencion. Los procedimientos generales conocidos en este campo se pueden utilizar para la construccion de los virus que contienen las secuencias de ADN anteriores y, en su caso, otras secuencias. Estos procedimientos comprenden, por ejemplo, tecnicas de recombinacion in vitro, procedimientos sinteticos y procedimientos de recombinacion in vivo, tal y como se describen en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989), por ejemplo.

La expresion "unidad genica de la capside VP de parvovirus" utilizada en el presente documento, se refiere a los genes que codifican VP1, VP2 y VP3, siendo VP3 un producto de la escision de VP2.

Preferentemente, la unidad genica de la capside VP de parvovirus esta bajo el control de un promotor constitutivo o inducible, activo en mairftferos, y una senal de poliadenilacion. La expresion "un promotor constitutivo o inducible activo en mamferos" utilizada en el presente documento comprende todos los promotores que permiten en

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mai^eras la transcripcion de la secuencia de ADN deseada, sobre todo los que producen una expresion fuerte, preferentemente promotores heterologos. Los promotores adecuados son conocidos por la persona experta en la tecnica y comprenden, por ejemplo, los promotores constitutivos de CMV y los promotores de citoqueratina K14 o los promotores de MMTV inducibles (virus de tumor mamario de raton), metalotionema y sistemas de promotores controlables con tetraciclina (Tet-on/Tet-off).

Ademas, el virus cooperador obtenido a partir de adenovirus o el plasmido del vector de parvovirus recombinante pueden contener un gen que codifica un marcador fenotipico detectable, para demostrar la introduccion con exito en la celula diana. Preferentemente, la protema marcadora es una protema fluorescente. Esta confirma facilmente una transfeccion de la celula diana deseada. Ejemplos de genes adecuados que codifican protemas fluorescentes son los genes rfp-(rojo), gfp-(verde), cfp-(cian) e yfp-(amarillo), prefiriendose rfp-(rojo) (Dsred-cDNA; Clontech). Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la expresion de la protema marcadora son el promotor de RSV (virus del sarcoma de Rous), el promotor de CMV (citomegalovirus) y los promotores tk de HSV (virus del herpes simple), prefiriendose el promotor de RSV. El casete de expresion (promotor/gen marcador/sitio de poliadenilacion) se inserta en el(los) vector(es) en un sitio adecuado que una persona experta en la tecnica puede determinar facilmente.

Preferentemente, el "vector de parvovirus recombinante que carece de los genes VP1 y VP2" tiene la siguiente estructura: TR - rep (NS1/NS2) (opcional: transgen) - TR [TR; Repeticion Terminal].

De acuerdo con la presente invencion, el vector cooperador se obtiene a partir de adenovirus Ad5.

Las partmulas de parvovirus recombinantes se producen mediante la introduccion de los vectores anteriores en una celula permisiva, tal como se entiende este termino en la tecnica (por ejemplo, una celula "permisiva" se puede infectar o transducir con el virus). Se puede emplear cualquier procedimiento para introducir los vectores en la celula permisiva, incluyendo, pero no limitado a, electroporacion, transfeccion, precipitacion con fosfato de calcio, microinyeccion, liposomas cationicos o anionicos y liposomas en combinacion con una senal de localizacion nuclear.

De acuerdo con el procedimiento de la invencion, las celulas de mairnfero son celulas HEK 293T.

Con el nuevo virus cooperador obtenido a partir de adenovirus utilizado en el procedimiento de la presente invencion (virus cooperador Ad-VP), se puede utilizar un protocolo basado solo en la infeccion, evitando la necesidad de una transfeccion. Esto permitina llevar a cabo la produccion del parvovirus en lmeas celulares que son diffciles de transfectar, pero que son mas permisivas para la replicacion de parvovirus que HEK 293T, por ejemplo, celulas NBK. Por consiguiente, en este procedimiento la lmea celular de mamffero puede ser NBK. Otros ejemplos de lmeas celulares que se podnan utilizar en la presente solicitud, son NB-E, SiHa o A9.

De acuerdo con la presente invencion, el parvovirus recombinante se obtiene a partir de parvovirus H-1 o MVM.

En una realizacion preferida de los procedimientos de la invencion, en el vector de parvovirus recombinante los genes VP1 y VP2 se sustituyen por un transgen, es decir, un gen heterologo que esta flanqueado por al menos una TR.

Preferentemente, el transgen esta bajo el control del promotor P38 autologo del virus H-1PV o del virus diminuto de raton de parvovirus autonomo que esta fuertemente transactivado por la protema no estructural NS1, una protema que se une al ADN, espedfica de secuencia.

Preferentemente, el transgen es un gen que codifica

(a) una protema marcadora, por ejemplo, una protema descrita anteriormente; o

(b) un gen terapeutico, por ejemplo, un polipeptido citotoxico, una citocina o quimiocina o un polipeptido inmunogenico (para su uso como vacuna); supresores tumorales, o moleculas de ARN interferente y/o casetes que expresan ARNi (oligonucleotidos antisentido, siARNs, shARNs, miARNs, etc.).

La presente divulgacion tambien proporciona un parvovirus recombinante obtenible por un procedimiento de la invencion, asf como a una celula que contiene tal parvovirus recombinante.

Por ultimo, la presente divulgacion tambien se refiere a una composicion farmaceutica que contiene el parvovirus recombinante de la invencion y a un vehmulo farmaceuticamente aceptable, asf como al uso de un parvovirus recombinante de la invencion para su uso en terapia genica o a un procedimiento para tratar un tumor. Los vehmulos adecuados y la formulacion de tales medicamentos son conocidos por la persona experta en la tecnica. Los vehmulos adecuados comprenden, por ejemplo, soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, por ejemplo, emulsiones de aceite/agua, agentes humectantes, soluciones esteriles, etc. El tipo de vehmulo depende de la forma como se administra el vector cooperador y el parvovirus recombinante de acuerdo con la invencion. Una dosificacion adecuada es determinada por el medico responsable y depende de varios factores, por ejemplo, la edad del paciente, el sexo y el peso, la gravedad de la enfermedad, el tipo de administracion, etc.

Una terapia genica se puede llevar a cabo con partmulas de parvovirus recombinante, preparadas con un vector cooperador de acuerdo con la invencion, en donde las celulas se transducen/infectan mediante incubacion con las

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partfculas vmcas. Las celulas pueden estar presentes en un organismo, en donde las celulas que se van a infectar son accesibles mediante inyeccion con aguja, inyeccion a chorro o pistola de partfculas. Por otro lado, las celulas que se van a transducir tambien se pueden aislar a partir de un organismo, se infectan fuera del organismo, y a continuacion se devuelven de nuevo al organismo. Tales celulas se denominan celulas autologas. Por otra parte, con respecto al organismo tambien es posible usar celulas alogenicas para la transduccion. A este respecto, es favorable que estas celulas pertenezcan a un tipo de HLA correspondiente al organismo. La persona experta en la tecnica conoce procedimientos para proporcionar celulas con un cierto tipo de HLA. El parvovirus recombinante (partfculas) tambien es util para una aplicacion complementaria a la quimioterapia, es decir, a la terapia tumoral.

El uso de un cooperador Ad-VP no se limita a la produccion de parvovirus recombinantes. Tambien se puede utilizar en combinacion con recPV en la terapia contra el cancer. Esto permitina una segunda ronda de replicacion de recPV en el sitio del tumor, incrementando la eficacia terapeutica del parvovirus. Ademas, un segundo transgen contra el cancer se puede insertar en el cooperador Ad-VP aumentando aun mas el potencial terapeutico del cotratamiento.

Ejemplo 1

Materiales y procedimientos

(A) Celulas

Las celulas HEK 293T y NB324K (NBK) se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) o medio de Eagle modificado (MEM), respectivamente, suplementado con 10 % (DMEM) o 5 % de suero bovino fetal (MEM), L- glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina. Las celulas se mantuvieron a 37°C en 5 % de CO2 y 92 % de humedad.

(B) Plasmidos y virus

pH-1-EGFP se obtuvo subclonando el gen EGFP, procedente de pChi-hH-1-EGFP [23] en el psr19-H-1-A800 [2] empleando los sitios de restriccion SacI/Notl. phH-1-Luc es el phH1A1600luc descrito en [2].

El virus Ad-GFP purificado era un amable regalo del Dr. Laurent Mailly (Institut de Virologie, Inserm U748, Estrasburgo, Francia) y se valoro sobre celulas HEK 293T en unidad de fluorescencia verde por ml [GFU/ml] basandose en que una GFU es capaz de volver verde una celula 293T en 48 h.

El plasmido cooperador pAd-VP (un mapa esquematico de este vector se proporciona en la Figura 7) se genero utilizando el Sistema de vector adenovmco AdEasy® (Agilent technologies, Stratagene products, Waldbronn, Alemania) mediante recombinacion de pAd5AE1AE3 [24] y los vectores pShuttle-CMV/VP (H-1) en bacterias BJ5183, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. pShuttle-CMV/VP(H1) se genero subclonando la region VP procedente del pcDNA5-CMV/VP(H-1) empleando la digestion con Pmel y religandola en un vector pShuttle-CMV digerido con EcoRV (Agilent technologies, Stratagene products). pcDNA5-CMV/VP(H-1) se genero subclonando la region VP procedente de pVP-sub en pcDNA5/FRT/TO (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), utilizando los sitios de restriccion BamHI/XhoI. pVP-sub se construyo insertando primero un sitio de restriccion HpaI en el polienlazador del plasmido pBluescript SK (pBSK, Stratagene), y luego subclonandolo en el fragmento 2647-4680 nt del genoma de H- 1PV, que contiene la unidad genica VP, procedente del plasmido p(BK)CMV/VP(H-1) [2], utilizando los sitios de restriccion HindIII/HpaI.

El virus cooperador Ad-VP se produjo clasicamente con 3 rondas de produccion en HEK 293T, a continuacion se purifico a traves de un gradiente doble de CsCl y se valoro utilizando el kit Adeno-X® Rapid Titer (Clontech, Saint- Germain-en-Laye, Francia).

(C) Transfeccion

Para los experimentos mostrados en las Figs. 1, 3, 4 y 5, las transfecciones se llevaron a cabo utilizando Fugene HD (Roche Diagnostics & Applied Sciences, Mannheim, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con ligeras modificaciones. Los plasmidos se diluyeron en medio exento de suero con una concentracion final de 20 ng/pl. A continuacion, se anadio Fugene HD con una proporcion de 1:2,5 (pg de ADN:pl de Fugene) y la mezcla se incubo a TA durante 30 - 60 min. Posteriormente, la mezcla se anadio gota a gota a las celulas. En la Fig. 2, se llevo a cabo la transfeccion utilizando polietilenimina (PEI) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Munich, Alemania), tal y como se describe en [25].

Para el formato de placa de 6 cm, se sembraron 8 x 105 celulas 293T por placa. Un dfa despues, las celulas se transfectaron con las siguientes cantidades, solo cuando se mencionan: 1,2 pg de vector de parvovirus recombinante, 2,4 pg de pCMV/VP, 3 pg de pXX6, 5,2 pg de pAd5AE1AE3 y 3 o 5,2 pg de pFRT/lac-Zeo (Invitrogen), que se utilizaba como ADN de relleno testigo. En un formato de placas de 10 cm y un frasco de 175 cm2, el numero de celulas y las cantidades de plasmido se ajustaron proporcionalmente y se multiplicaron por factores de 2,5 y 6, respectivamente.

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(D) Anticuerpos

Los siguientes anticuerpos fueron utilizados para el analisis de transferencia Western: antisuero SP8 anti-NS1 policlonal (un amable regalo de la Dra. Nathalie Salome, DKFZ, Heidelberg, Alemania), anti-GFP policlonal de conejo (Santa Cruz, Heidelberg, Alemania) y anti-actina monoclonal de raton (clon C4, MP Biomedicals, Illkirch, Francia).

(E) Ensayo de luciferasa

Se utilizo el Sistema de Ensayo de Luciferasa (Promega, Mannheim, Alemania). Se sembraron 2,5 x 104 celulas NBK por pocillo en placas de 48 pocillos y se infectaron al dfa siguiente con 0,1 ml de diferentes diluciones de extractos de virus crudo. Dos dfas despues de la infeccion, las celulas se lavaron con PBS y se lisaron con 100 pl de 1x tampon de lisis pasivo. Se mezclaron 10 pl de los lisados celulares con 50 pl de sustrato de luciferasa y la luminiscencia resultante se midio durante 10 segundos, usando el luminometro Fluoroskan (Ascent FL, Thermo Labsystems, Dreieich, Alemania)

(F) Valoracion del virus Ensayo de transduccion

Se sembraron 2,5 x 104 celulas NBK por pocillo en placas de 48 pocillos y se infectaron al dfa siguiente con 0,1 ml de diferentes diluciones de extractos de virus crudo. Tres dfas despues de la infeccion, se hizo un recuento de las celulas positivas para GFP, usando un microscopio de fluorescencia. El tftulo de virus en unidad de transduccion por ml [TU/ml] se calculo de la siguiente manera: numero de celulas verdes x factor de dilucion x 10.

Reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR)

Extractos de virus crudo se digirieron con nucleasa Benzonasa® de grado ultrapuro (Sigma) (50 U/ml, 37 °C durante 30 min) para eliminar el ADN genomico y los plasmidos transfectados restantes. Para liberar el ADN vmco de los virus, se lisaron 10 pl de cada muestra, en un total de 40 pl de tampon de lisis alcalina (NaOH 1 M en tampon TE) a 56°C durante 30 min. La lisis se detuvo mediante la adicion de 960 pl de HCl 40 mM.

La cuantificacion del ADN vmco se llevo a cabo mediante qPCR en tiempo real con una sonda TaqMan® espedfica de NS1 (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania), utilizando un termociclador 7700 ABI Prism (Applied Biosystems) y se analizo por medio del programa informatico SDS 2.1 (Applied Biosystems). Brevemente, el aDn de parvovirus se amplifico y se detecto usando una sonda TaqMan® marcada con 5'FAM-MGB3' espedfica de NS1. Un plasmido que contema la secuencia de NS1 se diluyo en serie en el intervalo de 101-108 copias/reaccion y se utilizo para normalizar la qPCR. Mezclas individuales de la reaccion (20 pl) consistfan en 1 x TaqMan Universal PCR Master Mix® (Applied Biosystems), sonda NS1-TaqMan® marcada 0,3 pM, 0,3 pM de cada cebador y 3 pl de molde.

Ensayo de hibridacion de ADN virico

Las celulas NBK se sembraron en placas de 6 cm con una densidad de 5 x 105 celulas por placa. Al dfa siguiente, extractos de virus crudo se diluyeron en serie de 10-4 - 10-7 (en etapas de 1:10), a continuacion se utilizaron para infectar las celulas NBK en un volumen total de 400 pl. Despues de 1 h de incubacion a 37 °C y agitacion de las placas cada 10 min, se anadieron 5 ml de medio a cada placa. Tres dfas despues de la infeccion, las capas de celulas se lavaron con PBS y se aplicaron filtros de nitrocelulosa de 25 mm de diametro (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) a la parte superior de las celulas y se humedecieron con 100 pl de PBS. Los filtros se pusieron posteriormente boca abajo sobre papel Whatman saturado con tampon de desnaturalizacion (NaOH 0,5 M y NaCl 1,5 M). Despues de 5 min, los filtros se transfirieron a papel Whatman saturado con tampon neutralizante (Tris/HCl 0,5 M (pH 7,2), NaCl 1,5 M y EDTA 1 mM). Cinco minutos mas tarde, el ADN se fijo mediante secado de los filtros a 80 °C durante 2 h. La prehibridacion se realizo en 3 x SSC (1 x SSC es NaCl 0,15 M mas citrato de sodio 0,015 M), 1 % de SDS, EDTA 5 mM, 10x solucion de Denhardt y 100 pg/ml de ADN de esperma de salmon a 65 °C durante 1 h. La hibridacion se realizo mediante la adicion de la sonda radiactiva correspondiente al fragmento EcoRV (nt 385) - EcoRI (nt 1084) del plasmido pMVM, purificado por electroforesis en gel de agarosa, y se marco con [32P] dCTP utilizando el sistema de etiquetado de ADN Megaprime (GE Healthcare, Munich, Alemania). Despues de incubar a 65 °C durante la noche, los filtros se lavaron con tampon de lavado 1 (3 x SSC (pH 7), 1 % de SDS) a 65 °C durante 30 min y luego con tampon de lavado 2 (0,3 x SSC (pH 7)) a 65 °C durante 30 min. Posteriormente, los filtros se colocaron sobre papel Whatman, se envolvieron en una lamina de plastico y se expusieron a una pelfcula radiografica a -80 °C durante la noche. Las celulas infectadas representan puntos negros en la pelfcula debido al ADN vmco marcado radiactivamente. Los tftulos de virus en unidades de replicacion (RU) por ml [RU/ml] se calcularon de la siguiente manera: numero de puntos negros x factor de dilucion x 7,5.

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Ensayo de placas

Las celulas NBK cultivadas en monocapa se infectaron con diluciones seriadas de extractos de virus crudo durante 1 h, seguido por la sustitucion del inoculo por un recubrimiento con agar Bacto® (Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Alemania) (0,68 % en Medio Esencial Mmimo [+] L-glutamina) (Gibco, Invitrogen), 5 % de FBS, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina. Cinco dfas despues de la infeccion, las celulas vivas se tineron durante 18 h mediante la adicion de agar Bacto® (0,85 %) que contema rojo neutro (0,2 mg/ml) diluido en PBS. Se hizo un recuento de las placas y los tttulos se expresaron como unidades formadoras de placa (PFU) por ml.

(G) Extraccion de ADN y transferencia Southern

Para los analisis de los productos intermedios de ADN vmco producidos durante la produccion de virus recombinante, se prepararon extractos celulares en una mezcla (1:1) de tampon vTE (Tris-HCl 10 mM [pH 8,7], EDTA 1 mM) y 2x tampon Hirt (Tris 20 mM [pH 7,4], EDTA 20 mM, 1,2 % de SdS) y, a continuacion se digirieron con proteinasa K (400 pg/ml) durante 18 h a 46 °C bajo una rotacion de 60 vueltas por min. A continuacion, el ADN se rompio por cizallamiento mediante varios pases a traves de agujas de 0,5 pm y 0,4 pm, se sometio a extraccion con fenol-cloroformo y finalmente a digestion con Dpnl para eliminar plasmidos bacterianos que albergaban genomas vmcos.

Las muestras de ADN (2 pg) se fraccionaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1 %. Despues de la desnaturalizacion y la neutralizacion del ADN en el gel, el ADN se transfirio a una membrana Hybond-N de nailon (GE Healthcare) a traves de un procedimiento de transferencia Southern clasica, a continuacion, se reticulo con UV a la membrana. Los productos intermedios vmcos presentes en la membrana se mostraron a continuacion con el mismo procedimiento utilizado para los filtros del ensayo de hibridacion de ADN vmco.

Ejemplo 2

Genes de adenovirus aumentan la produccion de parvovirus recombinantes

En este estudio, se investigo si los genes adenovmcos son capaces de incrementar la produccion de parvovirus recombinantes. Para este fin, celulas HEK 293T se cotransfectaron de forma transitoria con un plasmido de parvovirus recombinante que era portador del transgen GFP (prec.PV-GFP), un plasmido que codifica las protemas de la capside de parvovirus H-1 (pCMV/VP) y el plasmido obtenido a partir de adenovirus 5, pXX6. pXX6 contiene E2a, E4(orf6) y los genes adenovmcos del ARN VAI y es suficiente para promover la produccion de vAa [17, 18].

Tres dfas despues de la transfeccion, las celulas se lisaron y se determino la produccion vmca de rec.PV-GFP mediante un ensayo de transduccion, tal y como se ha descrito en el Ejemplo 1. De este modo, se utilizaron extractos celulares procedentes de estas celulas productoras de virus para inocular celulas NBK de nuevo aporte. Despues de 48 horas, las celulas NBK positivas para GFP se controlaron mediante microscopfa de fluorescencia (Fig. 1A). Los extractos de celulas transfectadas con pXX6 y plasmidos de parvovirus produjeron un numero mucho mayor de celulas verdes positivas, que comparando con celulas transfectadas solo con plasmidos de parvovirus, lo que demuestra que los lisados procedentes de estas ultimas conteman menores cantidades de parvovirus recombinante. El analisis de transferencia Western confirmo niveles mas elevados de protema GFP, junto con niveles mas altos de NS1 de parvovirus, en celulas NBK infectadas con extractos obtenidos en la condicion de pXX6 (Fig. 1B).

Para investigar si la produccion de parvovirus recombinantes se puede mejorar aun mas con la presencia de elementos adenovmcos adicionales, se compararon los efectos de pXX6 y un vector pAd5AE1AE3 mas completo en el refuerzo de la produccion de parvovirus. Tres dfas despues de la transfeccion, se realizaron ensayos de transduccion vmca tal y como se han descrito anteriormente. Tal y como se muestra en la Fig. 1C, tanto pAd5AE1AE3 como pXX6 incrementan significativamente la produccion de virus en mas de 10 veces, en comparacion con el testigo negativo o las condiciones de relleno. Los cooperadores de adenovirus permitfan alcanzar 106 unidades de transduccion verdes (TU) por ml, que se correspondfa a un promedio de 5 TU por celula productora sembrada. Tanto pAd5AE1AE3 como pXX6 produjeron un incremento comparable en la produccion de parvovirus recombinante en estas condiciones experimentales, lo que indica que el material genetico contenido en pXX6 es suficiente para inducir este efecto.

Para cuantificar cuidadosamente las cantidades de parvovirus recombinante producidas con la ayuda de pXX6, las celulas HEK 293T se sembraron en frascos de 175 cm2, despues se cotransfectaron con prec.PV-GFP, pCMV/VP y con pXX6 o sin pXX6. Tres dfas despues de la transfeccion, las celulas se lisaron en tampon vTE (vease la leyenda de la Fig. 2). Los virus producidos, contenidos en los lisados celulares, se cuantificaron directamente empleando una PCR cuantitativa espedfica de parvovirus que mide la concentracion de genoma de parvovirus encapsidado, expresado como genoma vmco (Vg) por ml. Ademas, los lisados celulares se utilizaron para infectar celulas indicadoras NBK y los tttulos de virus se cuantificaron mediante i) un ensayo de transduccion, en el que se contaron las celulas positivas para GFP y la produccion de virus expresada como Unidad de Transduccion (TU) por ml, e ii) un ensayo de hibridacion espedfico de parvovirus en el que se detecto la cantidad de celulas que favoredan la replicacion del ADN vmco usando una sonda de NS radiomarcado. Las concentraciones de los virus producidos se expresaron entonces como Unidad de Replicacion (RU) por ml. La Fig. 2 muestra que todos los ensayos diferentes

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confirmaban el aumento significativo de la produccion vmca en presencia del plasmido pXX6.

A continuacion, se investigo si pXX6 podna dar lugar a una mayor produccion concomitante de parvovirus competentes para la replicacion (RCV), no deseados. Los RCVs se midieron usando un ensayo de placas clasico con parvovirus en celulas NBK; la relacion de PFU producidas por TU no se vio afectada por pXX6 (Fig. 2, panel derecho) mostrando que pXX6 no incrementa la productividad de RCV, por lo tanto, conserva la calidad de los virus recombinantes producidos.

Para confirmar los resultados que se muestran en la Fig. 1 y 2, se llevo a cabo un experimento similar utilizando otro parvovirus recombinante, que albergaba un transgen informador mas largo, prec.PV-luciferasa (prec.PV-Luc) (una insercion de 1656 nt en lugar de 731 nt en el caso del transgen de GFP usado previamente). La produccion de parvovirus que albergan transgenes grandes (mas de 800 nt) se sabe que es mucho menos eficaz que la produccion con los transgenes mas cortos (hasta 800 nt) [2]. La capacidad de un plasmido cooperador adenovmco diferente, pVAE2AE4-5, para incrementar la produccion de parvovirus tambien se sometio a ensayo. Este vector es portador de los mismos genes adenovmcos que pXX6 en una estructura principal de plasmido diferente [26]. Las celulas se cotransfectaron con prec.PV-Luc, pCMV/VP y con uno de los plasmidos cooperadores de adenovirus, pXX6 o pVAE2AE4-5, o se infectaron con virus Ad5AE1AE3-CMV/GFP (Ad-GFP) (con las MOI en el intervalo desde 0,1 a 5 GFU/celula (vease la Fig. 3)). Tres dfas despues de la transfeccion/infeccion, se estimo el rendimiento de la produccion de parvovirus recombinantes utilizando un ensayo de transduccion con luciferasa.

Los resultados obtenidos en la Fig. 3 confirman el efecto de refuerzo de pXX6 sobre la produccion de parvovirus recombinantes (aproximadamente 24 veces), generalizando los efectos positivos de este vector a otros parvovirus que son portadores de transgenes diferentes y mas largos. pVAE2AE4-5 aumentaba la produccion de parvovirus en un grado similar, confirmando que los elementos responsables del incremento observado se encuentran dentro de las secuencias adenovmcas comunes de pXX6 y pVAE2AE4-5 y no en la estructura principal del plasmido. Como la infeccion con adenovirus recombinante tambien incrementaba la produccion de parvovirus, los efectos cooperadores observados deben ser independientes del procedimiento elegido para la introduccion de elementos geneticos adenovmcos (mediante transfeccion o infeccion) dentro de las celulas productoras. El mayor incremento de la produccion de rec.PV-Luc, (aproximadamente 30 veces), se obtuvo utilizando Ad-GFP con MOI 1. En estas condiciones, se observo un 100 % de transduccion de GFP adenovmca en las celulas productoras, 2 dfas despues de la infeccion. Cuando se utilizo Ad-GFP con las MOI 2 y 5, se observo una toxicidad celular (datos no mostrados), que explica porque, en estas condiciones, se obtuvieron tftulos de parvovirus inferiores. El aumento de la produccion observada usando adenovirus fue ligeramente mas alto que con plasmidos cooperadores transfectados, debido probablemente a la mayor tasa de transduccion adenovmca. En conjunto, estos resultados muestran que la presencia de elementos genomicos adenovmcos incrementa la produccion de parvovirus recombinantes.

Ejemplo 3

pXX6 acelera la produccion de parvovirus recombinantes

En un experimento de evolucion temporal se investigo si pXX6 afecta a la cinetica de produccion de virus. Las celulas se cotransfectaron primero con prec.PV-GFP, pCMV/VP, con o sin pXX6, y la produccion vmca se evaluo a las 12, 24, 48 y 72 h despues de la transfeccion.

Al igual que antes, la presencia de pXX6 mejora en gran medida la produccion de parvovirus recombinantes (Fig. 4). Este efecto se puede observar despues de 24 h (9,2 veces), pero se hace mas evidente a las 48 h (30,4 veces), cuando el rendimiento de la produccion es maximo (1,5 x 106 Tu/ml). La produccion de virus en ausencia de pXX6 era mucho menos eficaz (tftulo maximo: 1,3 x 105GFU/ml). Vale la pena mencionar que los parvovirus recombinantes se cosechan generalmente despues de 72 h de produccion.

Por lo tanto, el uso de elementos adenovmcos en la produccion de parvovirus recombinantes incrementa los tftulos de virus y disminuye el tiempo de produccion en 24 h. Una transferencia Southern (Fig. 6B), confirmo un aumento en la cantidad de ADN vmco producido en presencia de pXX6, 48 y 72 h despues de la transfeccion. Formas replicativas monomeras de aDn de parvovirus (mRF) se enriquecieron en gran medida en condiciones de pXX6, que ya eran detectables a las 24 horas y mejoraron fuertemente a las 48 h y 72 h. Formas replicativas dfmeras de aDn (dRF) solo se detectaron claramente en presencia de pXX6 a las 48 y 72 h de tiempos de produccion. Por lo tanto, pXX6 no solo aumenta, sino que tambien acelera la replicacion del ADN vmco.

Ejemplo 4

pXX6 tambien incrementa la produccion de parvovirus recombinante en un protocolo basado en la transfeccion/infeccion

Los parvovirus recombinantes se producen de forma rutinaria cotransfectando las celulas productoras con dos plasmidos: uno que codifica las protemas VP de la capside y un segundo que contiene el genoma restante de parvovirus que alberga el transgen de interes. Como la infeccion vmca es un procedimiento de entrega de genes mejor que la transfeccion, intentamos reemplazar tanto como fuera posible en nuestro protocolo las etapas de transfeccion por infeccion. Una posibilidad sena amplificar los parvovirus recombinantes mediante la infeccion de

celulas permisivas que han sido transfectadas con el plasmido que contiene VP. En este caso, la transfeccion se limitana solo al plasmido VP, mientras que el genoma del parvovirus recombinante se entregana mediante infeccion vftica. Sin embargo, experimentos anteriores en el laboratorio no pudieron producir parvovirus recombinantes utilizando este procedimiento. De cara a las funciones cooperadoras de pXX6, se investigo si la introduccion de 5 pXX6 podna recuperar, en este caso, la produccion de parvovirus recombinantes. Las celulas se transfectaron con pCMV/VP junto con pXX6 o sin pXX6, y despues se infectaron con rec.PV-GFP. Los resultados mostraron una amplificacion significativa de la dosis vftica utilizada como inoculo (alrededor de 17 veces) solo en presencia del plasmido pXX6 (Fig. 5, y datos no presentados). Estos resultados muestran que pXX6 no solo refuerza la produccion de parvovirus recombinantes en un protocolo que se basa unicamente en la transfeccion, sino tambien cuando se 10 emplean partfculas infecciosas de parvovirus como fuente de ADN vftico recombinante. Esto apoya el posible uso de pXX6 en una segunda ronda de amplificacion de los parvovirus recombinantes.

Ejemplo 5

Produccion de parvovirus recombinantes utilizando un virus cooperador Ad-VP recombinante

Para evitar la transfeccion del plasmido VP y permitir la amplificacion de los virus unicamente a traves de la 15 coinfeccion con un virus cooperador, se sometio a ensayo si era posible producir parvovirus recombinantes utilizando un adenovirus que albergaba no solamente los genes de Ad necesarios para ayudar en la produccion de parvovirus, sino tambien la unidad genica de la capside VP. El gen de VP fue clonado en pAd5AE1AE3 [24], mediante recombinacion de pAd5AE1AE3 y pShuttle-CMV/VP, generando la estructura artificial cooperadora pAd- VP. Un virus cooperador Ad-VP se produda clasicamente en HEK 293T. La forma y tftulos del cooperador Ad-VP 20 eran similares a los del virus Ad5AE1AE3, utilizado como testigo (datos no mostrados).

Con el nuevo virus cooperador Ad-VP se puede utilizar un protocolo basado solo en la infeccion, evitando la necesidad de transfeccion. Esto permite la posibilidad de llevar a cabo la produccion en lmeas celulares que son diffciles de transfectar, pero que son mas permisivas para la replicacion de parvovirus que las celulas HEK 293T, por ejemplo, celulas NBK.

25 Las celulas NBK se sembraron en placas de 6 pocillos y se infectaron al dfa siguiente con el virus cooperador Ad-VP purificado y de forma concomitante con uno de los siguientes parvovirus recombinantes: hH-1-GFP, H-1-GFP, MVM- GFP o Chi-hH-1-GFP. Tres dfas despues de la infeccion, las celulas se lisaron y los virus recombinantes producidos se valoraron usando un ensayo de transduccion. Como antes, se realizaron ensayos de placas para controlar la produccion de virus competentes para la replicacion.

30 Utilizando este procedimiento, se obtuvieron tftulos 2 a 5 veces mas elevados que los que se alcanzaron con el uso de protocolos basados en la transfeccion, tal como se obtuvieron en la Fig. 1C (datos no mostrados). Es importante destacar que este procedimiento no aumento la tasa de contaminacion con RCV, en comparacion con la produccion llevada a cabo en ausencia de virus cooperador Ad-VP. Estos resultados ponen de manifiesto la eficacia de la utilizacion del cooperador Ad-VP para la produccion de parvovirus recombinantes.

35 En conclusion, el procedimiento con cooperador Ad-VP ofrece las siguientes ventajas: (i) permite la produccion de parvovirus recombinantes con tftulos elevados sin afectar a la calidad de las reservas vfticas, (ii) se reduce el tiempo de produccion en 1 dfa (datos no mostrados), (iii) solo se basa en la infeccion vftica, evitando la necesidad de una etapa de transfeccion, (iv) permite la produccion de parvovirus recombinantes en lmeas celulares (por ejemplo, NBK) que son mas permisivas que HEK 293T para la replicacion del parvovirus, pero que no se habfan podido utilizar 40 antes porque eran diffciles de transfectar y (v) es un procedimiento mas economico, ya que reduce los costes de los reactivos de transfeccion, el tiempo y el personal.

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18. Xiao, X., J. Li y R.J. Samulski, Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol, 1998. 72(3): pags. 2224-32.

19. Grimm, D., y col., Novel tools for production and purification of recombinant adenoassociated virus vectors. Hum Gene Ther, 1998. 9(18): pags. 2745-60.

20. Guan, W., y col., The genome of human parvovirus b19 can replicate in nonpermissive cells with the help of adenovirus genes and produces infectious virus. J Virol, 2009. 83(18): pags. 9541-53.

21. Ledinko, N. y H.W. Toolan, Human adenovirus type 12 as a "helper" for growth of H-1 virus. J Virol, 1968. 2(2): pags. 155-6.

22. Fox, E., P.T. Moen, Jr. y J.W. Bodnar, Replication of minute virus of mice DNA in adenovirus-infected or adenovirus-transformed cells. Virology, 1990. 176(2): pags. 403-12.

23. Wrzesinski, C., y col., Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells. J Virol, 2003. 77(6): pags. 3851-8.

24. He, T.C., y col., A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998. 95(5): pags. 2509-14.

25. Reed, S.E., y col., Transfection of mammalian cells using linear polyethylenimine is a simple and effective means of producing recombinant adeno-associated virus vectors. J Virol Methods, 2006. 138(1-2): pags. 85-98.

26. Matsushita, T., y col., Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Ther, 1998. 5(7): pags. 938-45.

27. Documento WO 01/25462 A1

28. Collaco y col., A helper-virus-free packaging system for recombinant adeno-associated viris vectors, GENE, Elesevier, Amsterdam, Vol. 238, N.° 2, 1999, pags. 397-405

29. Zhang y col., Recombinant adenovirus expressing adeno-associate virus cap and rep protein supports production of high-titer recombinant adeno-assaciated virus, GENE THERAPY, Vol. 8, 2001, pags. 704-712

30. Paterna y col., Influence of promoter and WHV post-transcriptional regulatory element on AAV-mediated transgene expression in rat brain, Gene Therapy, Vol. 7, 2000, pags. 1304-1311

31. Cornelis y col., Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer?, J. of Gene Medicine, Vol. 6, N.° S1,2004, pags. S193-202

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento de preparacion de un parvovirus autonomo recombinante caracterizado porque

   (i) se transfectan celulas HEK 293T con

   (a) un vector de parvovirus recombinante obtenido a partir del parvovirus de rata H-1 (H-1) o del virus 5 diminuto de raton (MVM) que carece de los genes de las protemas de la capside VP1 y VP2 del virus pero

   que conserva las secuencias codificantes de la protema no estructural NS1/2,

   b) un vector que contiene los genes que codifican las protemas de la capside VP1 y VP2 de parvovirus, y (c) un vector cooperador obtenido a partir de adenovirus que comprende las secuencias de ADN adenovmicas de Ad5 del gen E2a, el gen E4(orf6) y un gen ARN VAI; y

   10 (ii) el parvovirus recombinante que carece de los genes de VP1 y VP2 pero que conserva las secuencias

   codificantes de NS1/2 se afsla de las celulas HEK 293T o del medio despues del cultivo de las celulas.
2. 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que en el vector de parvovirus recombinante los genes de VP1 y VP2 estan sustituidos por un transgen.
3. 3. El procedimiento de la reivindicacion 2, en el que la expresion del transgen esta bajo el control del promotor P38.

   15 4. El procedimiento de la reivindicacion 2 o 3, en el que el transgen es un gen que codifica una protema marcadora.
4. 5. El procedimiento de la reivindicacion 2 o 3, en el que el transgen es un gen que codifica un polipeptido terapeutico o inmunogenico.
5. 6. El procedimiento de la reivindicacion 5, en el que la protema terapeutica es un polipeptido citotoxico, una citocina y/o una quimiocina.

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