ES2679370T3 - Polimorfismos de clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fhenil)-etil]-benzamida - Google Patents

Abstract

Una forma sólida de clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxifenil)- etil]-benzamida , que presenta por lo menos los siguientes picos de difracción en polvo de rayos X característicos (radiación Cu Kα, expresada en grados 2θ) a 5.1 ± 0.2, 10.3 ± 0.2, 10.7 ± 0.2, 18.1 ± 0.2 y 18.6 ± 0.2.

Description

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DESCRIPCION

Polimorfismos de clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fhenil)- etil]-benzamida

La presente invención se refiere a nuevos polimorfos de un inhibidor de calicreína plasmática, una composición farmacéutica que los contiene y su uso en terapia.

Antecedentes de la invención

Los inhibidores de la calicreína plasmática tienen una serie de aplicaciones terapéuticas, particularmente en el tratamiento de la permeabilidad vascular retiniana asociada con la retinopatía diabética y el edema macular diabético. Otras complicaciones de la diabetes, como la hemorragia cerebral, la nepropatía, la cardiomiopatía y la neuropatía, todas las cuales tienen asociaciones con la calicreína plasmática también pueden considerarse como objetivos de un inhibidor de la calicreína plasmática.

La calicreína plasmática es una serina proteasa de tipo tripsina que puede liberar cininas de cininógenos (ver K. D. Bhoola et al., "Kallikrein-Kinin Cascade", Encyclopedia of Respiratory Medicine, p483-493; J. W. Bryant et al., "Human plasma kallikrein-kinin system: physiological and biochemical parameters" Cardiovascular and haematological agents in medicinal chemistry, 7, p234-250, 2009; K. D. Bhoola et al., Pharmacological Rev., 1992, 44, 1; y D. J. Campbell, "Towards understanding the kallikrein-kinin system: insights from the measurement of kinin peptides", Brazilian Journal of Medical and Biological Research 2000, 33, 665-677). Es un miembro esencial de la cascada de la coagulación sanguínea intrínseca, aunque su papel en esta cascada no implica la liberación de bradicinina o la escisión enzimática. La precalicreína plasmática está codificada por un único gen y se sintetiza en el hígado. Es secretada por hepatocitos como una precalicreína plasmática inactiva que circula en el plasma como un complejo heterodímero unido a un cininógeno de alto peso molecular que se activa para dar la calicreína plasmática activa. Las cininas son mediadores potentes de la inflamación que actúan a través de los receptores acoplados a proteína G y los antagonistas de las cininas (como los antagonistas de la bradicinina) se han investigado anteriormente como potenciales agentes terapéuticos para el tratamiento de una serie de trastornos (F. Marceau and D. Regoli, Nature Rev., Drug Discovery, 2004, 3, 845-852).

Las cininas desempeñan un papel fundamental en la patogénesis de la pancreatitis y también pueden ser importantes en la progresión de formas edematosas a necrosantes de la enfermedad. En modelos animales de pretratamiento de pancreatitis con antagonistas de bradicinina se ha demostrado que previene la formación de edema y secuelas como hipotensión, hipovalemia, hemoconcentración y acumulación de enzimas digestivas activadas dentro del tejido pancreático (T. Griesbacher and F. Lembeck F. Br. J. Pharmacol., 1992 107, 356-360; T. Griesbacher et al., Br. J. Pharmacol., 1993, 108, 405-411). Sin embargo, el desarrollo adicional de antagonistas de bradicinina está limitado por su falta de especificidad y eficacia. Además, (T T. Griesbacher et al., Br. J. Pharmacol., 2003, 139, 299308) se ha demostrado que los antagonistas de bradicinina aumentan los niveles de hK1 en el páncreas, lo que indica que el tratamiento con inhibidores de hK1 podría ser significativamente más eficaz que los antagonistas de bradicinina. La prevención de la formación de cinina a través de la inhibición de hK1 representa por tanto una alternativa viable a los antagonistas de cinina para el tratamiento de estos trastornos.

Se cree que la calicreína plasmática desempeña un papel en una serie de trastornos inflamatorios. El inhibidor principal de la calicreína plasmática es el inhibidor de la esterasa serpina C1. Los pacientes que presentan una deficiencia genética en el inhibidor de la esterasa C1 padecen de angioedema hereditario (HAE) que da como resultado una hinchazón intermitente de la cara, las manos, la garganta, el tracto gastrointestinal y los genitales. Las ampollas formadas durante los episodios agudos contienen altos niveles de calicreína plasmática que escinde el cininógeno de alto peso molecular liberando bradicinina lo que lleva a una permeabilidad vascular aumentada. Se ha demostrado que el tratamiento con un inhibidor de calicreína plasmática de proteína grande trata eficazmente el HAE evitando la liberación de bradicinina que provoca una mayor permeabilidad vascular (A. Lehmann "Ecallantide (DX- 88), a plasma kallikrein inhibitor for the treatment of hereditary angioedema and the prevention of blood loss in on- pump cardiothoracic surgery" Expert Opin. Biol. Ther. 8, p1187-99).

El sistema de calicreína-cinina plasmático es anormalmente abundante en pacientes con edema macular diabético avanzado. Se ha publicado recientemente que la calicreína plasmática contribuye a disfunciones vasculares retinianas en ratas diabéticas (A. Clermont et al. "Plasma kallikrein mediates retinal vascular dysfunction and induces retinal thickening in diabetic rats" Diabetes, 2011, 60, p1590-98). Además, la administración del inhibidor de calicreína plasmática ASP-440 mejoró tanto la permeabilidad vascular retiniana como las anomalías del flujo sanguíneo retiniano en ratas diabéticas. Por lo tanto, un inhibidor de la calicreína plasmática debería ser útil como un tratamiento para reducir la permeabilidad vascular retiniana asociada con la retinopatía diabética y el edema macular diabético.

Se han descrito anteriormente inhibidores de calicreína plasmática sintéticos y de molécula pequeña por ejemplo, porGarrett et al. ("Peptide aldehyde...." J. Peptide Res. 52, p62-71 (1998)), T. Griesbacher et al.

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("Involvement of tissue kallikrein but not plasma kallikrein in the development of symptoms mediated by endogenous kinins in acute pancreatitus in rats" British Journal of Pharmacology 137, p692-700 (2002)), Evans ("Selective dipeptide inhibitors of kallikrein" WO03/076458), Szelke et al. ("Kininogenase inhibitors" WO92/04371), D. M. Evans et al. (Immunolpharmacology, 32, p1 15-116 (1996)), Szelke et al. ("Kininogen inhibitors" WO95/07921), Antonsson et al. ("New peptides derivatives" WO94/29335), J. Sturzbecher et al. (Brazilian J. Med. Biol. Res 27, p1929-34 (1994)), Kettner et al. (US 5,187,157), N. Teno et al. (Chem. Pharm. Bull. 41, p1079-1090 (1993)), W. B. Young et al. ("Small molecule inhibitors of plasma kallikrein" Bioorg. Med. Chem. Letts. 16, p2034-2036 (2006)), Okada et al. ("Development of potent and selective plasmin and plasma kallikrein inhibitors and studies on the structure-activity relationship" Chem. Pharm. Bull. 48, p1964-72 (2000)), Steinmetzer et al. ("Trypsin-like serine protease inhibitors and their preparation and use" WO08/049595), Zhang et al. ("Discovery of highly potent small molecule kallikrein inhibitors" Medicinal Chemistry 2, p545-553 (2006)), Sinha et al. ("Inhibitors of plasma kallikrein" WO08/016883), Brandl et al. ("N-((6-amino-pyridin-3-yl)methyl)-heteroaryl-carboxamides as inhibitors of plasma kallikrein" WO2012/017020), y Okada et al. ("Development of plasmin and plasma kallikrein selective inhibitors and their effect on M1 (melanoma) and ht29 cell lines" Bioorg. Med. Chem. Lett. 10, p2217-2221 (2000)).

Hasta la fecha, no se ha aprobado para uso médico ningún inhibidor de la calicreína plasmática sintético de molécula pequeña. Las moléculas descritas en la técnica conocida adolecen de limitaciones como una selectividad pobre sobre enzimas relacionadas como KLK1, trombina y otras serina proteasas, y una disponibilidad oral pobre. Los inhibidores de calicreína plasmática de proteína grande presentan riesgos de reacciones anafilácticas, como se ha informado por Ecallantide. Por tanto, sigue habiendo una necesidad de compuestos que inhiban selectivamente la calicreína plasmática, que no induzcan la anafilaxia y que estén disponibles oralmente. Además, la mayoría de las moléculas en la técnica conocida presentan una funcionalidad de guanidina o amidina altamente polar e ionizable. Es bien sabido que tales funcionalidades pueden ser limitativas de la permeabilidad del intestino y por lo tanto de la disponibilidad oral.

En la fabricación de formulaciones farmacéuticas, es importante que el compuesto activo esté en una forma en la que pueda manipularse y procesarse convenientemente para obtener un proceso de fabricación comercialmente viable. Por consiguiente, la estabilidad química y la estabilidad física del compuesto activo son factores importantes. El compuesto activo, y las formulaciones que lo contienen, deben poder almacenarse eficazmente durante períodos de tiempo apreciables sin mostrar ningún cambio significativo en las características físico-químicas (por ejemplo, composición química, densidad, higroscopicidad y solubilidad) del compuesto activo.

Se sabe que la fabricación de una forma en estado sólido particular de un ingrediente farmacéutico puede afectar a muchos aspectos de sus propiedades en estado sólido y ofrecer ventajas en aspectos de solubilidad, velocidad de disolución, estabilidad química, propiedades mecánicas, viabilidad técnica, procesabilidad, farmacocinéticas y biodisponibilidad. Algunos de estos se describen en "Handbook of Pharmaceutical Salts; Properties, Selection and Use", P. Heinrich Stahl, Camille G. Wermuth (Eds.) (Verlag Helvetica Chimica Acta, Zurich). Los métodos para la fabricación de formas en estado sólido también se describen en "Practical Process Research and Development", Neal G. Anderson (Academic Press, San Diego) y "Polymorphism: In the Pharmaceutical Industry", Rolf Hilfiker (Ed) (Wiley VCH). Los polimorfismos en cristales farmacéuticos se describen en Byrn (Byrn, S.R., Pfeiffer, R.R., Stowell, J.G., "Solid-State Chemistry of Drugs", SSCI Inc., West Lafayette, Indiana, 1999), Brittain,H.G., "Polymorphism in Pharmaceutical Solids", Marcel Dekker, Inc., New York, Basel, 1999) or Bernstein (Bernstein, J., "Polymorphism in Molecular Crystals", Oxford University Press, 2002).

El solicitante ha desarrollado una nueva serie de derivados de bencilamina que son inhibidores de la calicreína plasmática, que se divulgan en la WO2013/005045 (PCT/GB2012/051588). Estos compuestos demuestran buena selectividad para la calicreína plasmática y son potencialmente útiles en el tratamiento de agudeza visual deteriorada, retinopatía diabética, edema macular, angioedema hereditario, diabetes, pancreatitis, hemorragia cerebral, nepropatía, cardiomiopatía, neuropatía, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis, inflamación, choque séptico, hipotensión, cáncer, síndrome de dificultad respiratoria de adultos, coagulación intravascular diseminada, cirugía de bypass cardiopulmonar y hemorragia de cirugía postoperatoria. Uno de tales derivados de bencilamina es N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]- benzamida. Los intentos iniciales de preparar N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2- (4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida produjeron un sólido amorfo. Sin embargo, el solicitante ha desarrollado ahora nuevas formas cristalinas estables de la sal de ácido clorhídrico de este compuesto, que en este documento son referidas como 'Forma 1' y 'Forma 2'. Las nuevas formas sólidas tienen propiedades físico-químicas ventajosas que las hacen adecuadas para el desarrollo.

Por ejemplo, los datos de Sorción de Vapor Gravimétrico (GVS) de la "Forma 1" de clorhidrato de N-[(R)-1- [(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida, Figura 4, muestran que la hidratación es reversible (es decir, sin histéresis significativa). Además, estos datos muestran que bajo condiciones normales (20% a 80% de humedad relativa) solo hay un aumento relativamente gradual en el contenido de agua. Esto puede deberse a la humectación de la muestra y es consistente con la ausencia de higroscopicidad significativa.

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Se proporcionan más evidencias de la idoneidad de las formas cristalinas para el desarrollo farmacéutico mediante los siguientes datos de estabilidad. La Forma 1 de clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil- bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida se envasó en bolsas dobles de polietileno dentro de un recipiente de polipropileno y se almacenó a 40° C y 75% de humedad relativa durante 6 meses:

• No hubo cambios en el difractograma de XRPD

• El contenido de agua (usando el método de prueba de Karl Fischer) aumentó inicialmente inmediatamente después de la preparación, que incluyó una operación de secado, pero se estabilizó a un intervalo de aproximadamente 2,5%-2,8% p/p después de un mes y permaneció dentro de este intervalo a partir de ahí. Estos datos son consistentes con los datos de GVS y además demuestran la ausencia de higroscopicidad significativa

• No hubo una degradación química significativa. La pureza (HPLC) se mantuvo en el área del 99,8% Descripción de la invención

La presente invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Por tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un polimorfo cristalino de clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-

benzamida. En la presente solicitud, este polimorfo puede ser referido 'Forma 1'.

El nombre N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-

benzamida denota la estructura representada en la Figura A.

imagen1

La presente invención abarca hidratos de la forma cristalina del clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil- bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida.

Hasta la fecha se han aislado y caracterizado dos polimorfos cristalinos de clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4- aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida, que son referidos en la presente como 'Forma 1' y 'Forma 2'.

La forma cristalina de la presente invención es la Forma 1. En un aspecto de la invención, la forma cristalina del clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]- benzamida es un hidrato, particularmente un monohidrato o hemi-hidrato.

En la presente especificación, los picos de difracción en polvo de rayos X (expresados en grados 20) se miden usando radiación Cu Ka.

La presente invención proporciona una forma cristalina (Forma 1) de clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4- aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida, que muestra por lo menos los siguientes picos de difracción en polvo de rayos X característicos (radiación de Cu Ka, expresada en grados 20) a aproximadamente:

(1) 5.1, 10.3, 10.7, 18.1 y 18.6; o

(2) 5.1, 10.3, 10.7, 14.9, 17.9, 18.1 y 18.6; o

(3) 5.1, 7.8, 10.3, 10.7, 14.9, 16.6, 17.9, 18.1 y 18.6.

El término "aproximadamente" significa en este contexto que hay una incertidumbre en las mediciones de los grados 20 de ± 0.2 (expresado en grados 20).

La presente invención también proporciona una forma cristalina (Forma 1) del clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)- 1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi)-fenil)-etil]-benzamida, que tiene un patrón de

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difracción en polvo de rayos X que comprende los picos característicos (expresados en grados 20) a aproximadamente 5.1, 7.8, 10.3, 10.7, 13.0, 14.9, 16.6, 17.9, 18.1 y 18.6.

La presente invención también proporciona una forma cristalina (Forma 1) del clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-

1- (4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi)-fenil)-etil]-benzamida, que tiene un patrón de difracción en polvo de rayos X que muestra por lo menos los siguientes valores de espacio d (A) característicos de aproximadamente:

(1) 17.32, 8.61, 8.23, 4.89 y 4.76; o

(2) 17.32, 8.61, 8.23, 5.96, 4.97, 4.89 y 4.76; o

(3) 17.32, 11.28, 8.61, 8.23, 5.96, 5.34, 4.97, 4.89 y 4.76.

El término "aproximadamente" significa en este contexto que hay una incertidumbre en las mediciones de los valores del espacio d (A) de ± 0.2 (expresado en A).

La Figura 1 muestra un patrón de difracción en polvo de rayos X de la Forma 1 del clorhidrato de N-[(R)-1- [(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida. La presente invención también proporciona una forma cristalina (Forma 1) de clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-

2- fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida que tiene un patrón de difracción en polvo de rayos X sustancialmente igual al mostrado en la Figura 1.

La Figura 2muestra un espectro IR de la Forma 1 del clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil- bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida. La presente invención también proporciona una forma cristalina (Forma 1) del clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]- 2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida que se caracteriza por un espectro IR que tiene picos característicos expresados en cm-1 en aproximadamente 3274, 3027, 2976, 2928, 1651, 1636, 1536, 1512, 1243 y 703.

El término "aproximadamente" significa en este contexto que los valores de cm-1 pueden variar, por ejemplo, hasta ± 1 cm-1. Adicionalmente, la presente invención proporciona una forma cristalina (Forma 1) del clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida que tiene un espectro de IR sustancialmente igual al que se muestra en la Figura 2.

La Figura 5 muestra un patrón de difracción en polvo de rayos X de la Forma 2 del clorhidrato de N-[(R)-1- [(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida.

La forma cristalina de la presente invención puede existir tanto en formas solvatadas como no solvatadas. El término "solvato" se usa en la presente para describir un complejo molecular que comprende el compuesto de la invención y una cantidad de uno o más solventes farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, etanol. El término "hidrato" se emplea cuando el solvente es agua.

La presente invención también abarca un proceso para la preparación de la Forma 1 de la presente invención, dicho proceso comprendiendo la cristalización de dicha forma cristalina a partir de una solución de clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida en un solvente o una mezcla de solventes. En un aspecto de la invención, la mezcla de solventes es acetonitrilo y agua. En otro aspecto, la mezcla de solventes es acetonitrilo y dimetilsulfóxido. En otro aspecto, se añade clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida a un solvente o una mezcla de solventes (por ejemplo, acetonitrilo y agua o acetonitrilo y dimetilsulfóxido) y la mezcla combinada (compuesto más solvente(s)) se calienta a una temperatura de aproximadamente 70-85° C antes de dejarla enfriar a temperatura ambiente. Alternativamente, en este aspecto, la mezcla combinada se calienta a una temperatura de aproximadamente 75-80° C antes de dejarla enfriar a temperatura ambiente. Alternativamente, en este aspecto, la mezcla combinada se calienta a una temperatura de aproximadamente 75, 76, 77, 78, 79 u 80° C antes de dejarla enfriar a temperatura ambiente. Alternativamente, en este aspecto, la mezcla combinada se calienta a una temperatura de aproximadamente 77° C antes de dejarla enfriar a temperatura ambiente.

Alternativamente, la forma cristalina mencionada puede obtenerse mediante ciclado térmico de la forma amorfa sólida (por ejemplo, ciclando calor/frío la muestra mediante calorimetría de barrido diferencial hasta 245°).

Los procesos de la presente invención también pueden comprender la adición de semillas cristalinas de la forma cristalina de la invención.

En un aspecto, la presente invención proporciona la forma cristalina de la invención cuando se fabrica por un proceso de acuerdo con la invención.

Como se ha mencionado anteriormente, la forma cristalina de la presente invención tiene una serie de aplicaciones terapéuticas, particularmente en el tratamiento de enfermedades o afecciones mediadas por la

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calicreína plasmática.

Por consiguiente, la presente invención proporciona la Forma 1 del clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4- aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida, como se ha definido anteriormente, para su uso en terapia. También se divulga el uso de una forma cristalina de clorhidrato de N-[(R)-1- [(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida, como se ha definido anteriormente en la presente, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o afección mediada por calicreína plasmática. En un aspecto preferido de la divulgación, la forma cristalina es la Forma 1.

La presente invención también proporciona la Forma 1 del clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil- bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida, como se ha definido anteriormente en la presente, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o afección mediada por calicreína plasmática.

También se divulga un método de tratamiento de una enfermedad o afección mediada por calicreína plasmática, dicho método comprendiendo administrar a un mamífero con necesidad de dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de una forma cristalina de clorhidrato N-[(R)-1-[(S))-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil- etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida, como se ha definido anteriormente en la presente. En un aspecto preferido de la divulgación, la forma cristalina es la Forma 1.

En un aspecto, la enfermedad o afección mediada por calicreína plasmática se selecciona entre agudeza visual deteriorada, retinopatía diabética, edema macular diabético, angioedema hereditario, diabetes, pancreatitis, hemorragia cerebral, nepropatía, cardiomiopatía, neuropatía, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis, inflamación, choque séptico, hipotensión, cáncer, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, coagulación intravascular diseminada, cirugía de bypass cardiopulmonar y hemorragia de cirugía postoperatoria.

En un aspecto, la enfermedad o afección mediada por la calicreína plasmática es la permeabilidad vascular retiniana asociada con la retinopatía diabética o el edema macular diabético.

En el contexto de la presente invención, las referencias en la presente a "tratamiento" incluyen referencias a tratamiento curativo, paliativo y profiláctico, a menos que haya indicaciones específicas de lo contrario. Los términos "terapia", "terapéutico" y "terapéuticamente" deben interpretarse de la misma manera.

La forma cristalina de la presente invención puede administrarse sola o en combinación con uno o más de otros fármacos. Generalmente, se administrará como una formulación en asociación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. El término "excipiente" se usa en la presente para describir cualquier ingrediente distinto del compuesto(s) de la invención que puede impartir una característica o funcional (es decir, control de la velocidad de liberación del fármaco) y/o una no funcional (es decir, auxiliar de procesamiento o diluyente) característico para las formulaciones. La elección del excipiente dependerá en gran medida de factores como el modo particular de administración, el efecto del excipiente sobre la solubilidad y estabilidad, y la naturaleza de la forma de dosificación.

En otro aspecto, los compuestos de la presente invención pueden administrarse en combinación con tratamiento láser de la retina. La combinación de la terapia láser con inyección intravítrea de un inhibidor de VEGF para el tratamiento del edema macular diabético es conocida (Elman M, Aiello L, Beck R, et al. " Elman M, Aiello L, Beck R, et al. "Randomized trial evaluating ranibizumab plus prompt or deferred laser or triamcinolone plus prompt laser for diabetic macular edema" .Ophthalmology. 27 de abril de 2010).

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración de la forma cristalina de la presente invención y los métodos para su preparación serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. Tales composiciones y métodos para su preparación pueden encontrarse, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a Edición (Mack Publishing Company, 1995).

Para la administración a pacientes humanos, la dosis diaria total de la forma cristalina de la invención está típicamente en el intervalo de 0,01 mg y 1000 mg, o entre 0,1 mg y 250 mg, o entre 1 mg y 50 mg, dependiendo, por supuesto, del modo de administración. Si se administra mediante inyección intravítrea, se prevé una dosis inferior de entre 0,0001 mg (0,1 |jg) y 0,2 mg (200 |jg) por ojo, o entre 0,0005 mg (0,5 |jg) y 0,05 mg (50 |jg) por ojo.

La dosis diaria total puede administrarse en dosis individuales o divididas y, a discreción del médico, puede quedar fuera del intervalo típico proporcionado en la presente. Estas dosificaciones se basan en un sujeto humano promedio que tiene un peso de aproximadamente 60 kg a 70 kg. El médico será capaz de determinar fácilmente las dosis para los sujetos cuyo peso está fuera de este intervalo, como los bebés y los ancianos.

Por consiguiente, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la Forma 1 del clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi)-fenil)-etil]- benzamida, como se ha definido anteriormente en la presente, y un portador, diluyente o excipiente

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farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse tópicamente (por ejemplo, al ojo, la piel o el pulmón y/o a las vías respiratorias) en forma de, por ejemplo, cremas, suspensiones, aerosoles de heptafluoroalcano (HFA) y formulaciones de polvo seco; o sistémicamente, por ejemplo, mediante administración oral en forma de comprimidos, cápsulas, polvos o gránulos; o mediante administración parenteral en forma de suspensiones; o mediante administración subcutánea; o mediante administración rectal en forma de supositorios; o transdérmicamente

En una realización de la invención, el ingrediente activo se administra oralmente. La administración oral puede implicar la deglución, de tal manera que el compuesto se introduzca en al tracto gastrointestinal, y/o la administración bucal, lingual o sublingual por la cual el compuesto se introduce en el torrente sanguíneo directamente desde la boca.

Las formulaciones adecuadas para administración oral incluyen tapones sólidos, micropartículas sólidas, semisólidos y líquidos (que incluyen fases múltiples o sistemas dispersos) como comprimidos; cápsulas blandas o duras que contienen multi-o nanopartículdos, líquidos, emulsiones o polvos; grajeas (incluyendo las rellenas de líquido); gomas; geles; formas de dosificación de dispersión rápida; películas; óvulos; espráis; y parches bucales/mucoadhesivos.

Las formulaciones adecuadas para administración oral también pueden diseñarse para administrar la forma cristalina de una manera de liberación inmediata o de una manera de velocidad sostenida, en donde el perfil de liberación puede retrasarse, pulsarse, controlarse, mantenerse o retrasarse y mantenerse o modificarse de tal manera que optimice la eficacia terapéutica de la forma cristalina mencionada. Los medios para administrar compuestos de una manera de velocidad sostenido son conocidos en la técnica e incluyen polímeros de liberación lenta que pueden formularse con los compuestos mencionados para controlar su liberación.

Los ejemplos de polímeros que mantienen la velocidad incluyen polímeros degradables y no degradables que pueden usarse para liberar los compuestos mencionados por difusión o una combinación de difusión y erosión del polímero. Ejemplos de polímeros de velocidad sostenida incluyen hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, alcohol polivinílico, polivinil pirrolidona, goma xantana, polimetacrilatos, óxido de polietileno y polietilenglicol.

Las formulaciones líquidas (incluyendo fases múltiples y sistemas dispersos) incluyen suspensiones. Tales formulaciones pueden presentarse como rellenos en cápsulas blandas o duras (hechas, por ejemplo, de gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa) y comprenden típicamente un portador, por ejemplo, agua, etanol, polietilenglicol, propilenglicol, metilcelulosa o un aceite adecuado, y uno o más agentes emulsionantes y/o agentes de suspensión. Las formulaciones líquidas también pueden prepararse mediante la reconstitución de un sólido, por ejemplo, de una bolsita.

La forma cristalina de la invención también puede usarse en formas de dosificación de disolución rápida y disgregación rápida como las descritas en Liang and Chen, Expert Opinion in Therapeutic Patents, 2001, 11 (6), 981986.

La formulación de comprimidos se trata en Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Vol. 1, por H. Lieberman y L. Lachman (Marcel Dekker, Nueva York, 1980).

La invención se ilustrará ahora a través de los siguientes ejemplos no limitativos. Cualquier ejemplo que caiga fuera del alcance de las reivindicaciones adjuntas se proporciona solo con propósitos de referencia. En los ejemplos se presentan las siguientes figuras:

Figura 1: Patrón de difracción en polvo de rayos X de la Forma 1 de clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4- aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida.

Figura 2: Espectro IR de la Forma 1 de clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil- etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida.

Figura 3: Termógrafo DSC de la Forma 1 clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2- fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida.

Figura 4: Isotermas de sorción de vapor gavimétrico (sorción, desorción y sorción) de la Forma 1 de clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)- etil]-benzamida.

Figura 5: Patrón de difracción en polvo de rayos X de la Forma 2 de clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4- aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida.

Figura 6: Termógrafo DSC de la Forma 2 de clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2- fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida.

Figura 7: Muestra el efecto inhibidor del clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil- etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida (etiquetado como "Compuesto de Prueba") y CH- 3457 (control positivo, inhibidor de calicreína plasmática) sobre RVP estimulado por CA-I en ratas

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Sprague Dawley.

Figura 8: Muestra las concentraciones de tejido ocular de clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil- bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida (etiquetado como "Compuesto de Prueba") después de la administración IVT de 4,2 |jg/ml (210 ng/ojo).

Detalles Experimentales Generales

Se registraron los espectros de 1H NMR en un espectrómetro Brucker Avance III (400 MHz) con referencia al solvente deuterio y a temperatura ambiente.

Los iones moleculares se obtuvieron usando LCMS que se llevó a cabo usando una columna Chromolith Speedrod RP-18e, 50 x 4,6 mm, con un gradiente lineal del 10% al 90% de HCO2H/MeCN al 0,1% en HCO2H/H2O al 0,1% durante 11 minutos, caudal de 1,5 ml/min. Los datos se recogieron usando un espectrómetro de masas Thermofinnigan Surveyor MSQ con ionización por electropulverización junto con un sistema Thermofinnigan Surveyor LC.

Los nombres químicos se generaron usando el software Autonom proporcionado como parte del paquete de dibujo ISIS de MDL Information Systems.

Todos los solventes y reactivos comerciales se usaron tal como se recibieron.

Los espectros de infrarrojos se midieron usando un sistema ajustado a una configuración de absorbancia estándar, con muestras preparadas con bromuro de potasio, y escaneadas de 4000 cm-1 a 400 cm-1.

Los patrones de difracción de polvo de rayos X se recogieron en un difractómetro PANalytical usando radiación Cu Ka (45 kV, 40 mA), goniómetro, 0-0, espejo de enfoque, rendija de divergencia (1/2''), rendijas soller tanto en el haz incidente como en el divergente (4 mm) y un detector PIXcel. El software usado para la recogida de datos fue X'Pert Data Collector, versión 2.2f y los datos se presentaron usando X'Pert Data Viewer, versión 1.2d.

Los patrones de XRPD se adquirieron bajo condiciones ambientales a través de una etapa de muestra de lámina de transmisión (poliimida - Kapton, película de 12,7 jm de grosor) bajo condiciones ambientales usando un PANalytical X'Pert PRO. El intervalo de recogida de datos fue 2.994 - 35° 0 con una velocidad de escaneo continuo de 0.202004°s-1.

Los datos de DSC se recogieron en un PerkinElmer Pyris 4000 DSC equipado con un soporte de muestras de 45 posiciones. El instrumento fue verificado para calibración de energía y temperatura usando indio certificado. Se colocó una cantidad predefinida de la muestra, 0,5-3,0 mg, en una bandeja de aluminio perforado con alfileres y se calentó a 20° C.min-1 de 30 a 350° C, o se varió según lo dictara la experimentación. Se mantuvo una purga de nitrógeno seco a 60 ml.min-1 sobre la muestra. El control del instrumento, adquisición de datos y análisis se realizaron con Pyris Software v9.0.1.0203.

Clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-am¡nomet¡l-benc¡lcarbamoM)-2-ohen¡l-etMcarbamoM1-2-(4-etox¡-oen¡l)-etM1- benzamida (Forma 1)

Método

A. Éster bencíl¡co de ác¡do {(S)-1-[4-(terc-butox¡carbon¡lam¡no-met¡l)-benc¡lcarbamo¡l]-2-fen¡let¡l}-carbám¡co

Se disolvió éster 2,5-dioxo-pirrolidin-1-ilo de ácido (S)-2-benciloxicarbonilamino-3-fenil-propiónico (4,25 g, 10.72mmol) en CH2Ch(100 ml). Esta solución se enfrió a 0° C. Se añadió 1-(N-Boc-Aminometil)-4-(aminometil) benceno (2,79 g, 11,79 mmol) seguido por trietilamina (3,25 g, 32,16 mmoles). Después de 18 horas a 0° C a temperatura ambiente la mezcla de la reacción se diluyó con cloroformo (100 ml) y se lavó con NaHCO3 (1x30 ml), agua (1x30 ml), salmuera (1x30 ml), se secó (Na2SO4) se evaporó al vacío dando un aceite amarillo. El residuo se trituró con éter de petróleo (60-80° C) y EtOAc para dar un sólido blanco identificado como éster bencílico del ácido {(S)-1-[4-(terc-butoxicarbonilamino-metil)-bencilcarbamoil]-2-fenil-etil}-carbámico (3,88 g, 7,49 mmol, 70%). [M+H]+ = 518.28, 540.32 (M+Na).

B. Éster terc-butíNco de ác¡do {4-[((S)-2-am¡no-3-fen¡l-prop¡on¡lam¡no)-met¡l]-benc¡l-carbám¡co

Se disolvió éster bencílico de ácido {(S)-1-[4-(terc-butoxicarbonilamino-metil)-bencilcarbamoil]-2-fenil-etil}- carbámico (3,66 g, 7,08 mmol) en metanol (200 ml). Esta solución se hidrogenó sobre Pd/C al 10% (500 mg) a presión atmosférica y temperatura ambiente durante una hora, después de lo cual se filtró el catalizador a través de celite y se lavó el residuo con metanol (30 ml), los filtrados combinados se evaporaron al vacío para dar un sólido blanco identificado como terc-butil éster de ácido {4-[((S)-2-amino-3-fenil-propionilamino)-metil]-bencil}-carbámico (2,627 g, 6,85 mmol, 97%).

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[M+H]+ = 384.37

C. Ácido (R)-2-amino-3-(4-etoxi-fenil)-propiónico

Se disolvió ácido (R)-2-butoxicarbonilamino-3-(4-etoxi-fenil)-propiónico (4,0 g, 12,93 mmol) en HCl 4 M en dioxano (150 ml). Después de una hora a temperatura ambiente, el solvente se eliminó al vacío para dar un sólido blanco identificado como clorhidrato de ácido (R)-2-amino-3-(4-etoxi-fenil)-propiónico (3,18 g, 12,9 mmol, 100%) . [M+H]+ = 210.18

D. Ácido (R)-2-benciloxicarbonilamino-3-(4-etoxi-fenil)-propiónico

Se disolvió clorhidrato de ácido (R)-2-amino-3-(4-etoxi-fenil)-propiónico (3,17 g, 12,9 mmol) en una solución de hidróxido de sodio (1,14 g, 28,38 mmol) en agua (100 ml). Se añadió cloroformiato de bencilo (2,64 g, 15,48 mmol) en dioxano (100 ml). La mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas, después de lo cual el dioxano se eliminó al vacío. El residuo acuoso se lavó con éter dietílico (1x 100 ml), se acidificó a pH 2 con HCl 1M y se extrajo con cloroformo (2x200 ml). Los extractos combinados se lavaron con agua (1x50 ml), salmuera (1x50 ml), se secaron (Na2SO4) y se evaporaron al vacío para dar un sólido blanco identificado como ácido (R)-2- benciloxicarbonilamino-3-(4-etoxi-fenil)-propiónico (4,0 g, 11,65 mmol, 90%).

[M+H]+ = 344.20.

E. Éster bencílico de ácido [(R)-1-{(S)-1-[4-(terc-butoxicarbonilamino-metil)-bencilcarbamoil]-2-fenil- etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-carbámico

Se disolvió éster terc-butílico de ácido {4-[((S)-2-amino-3-fenil-propionilamino)-metil]-bencil}-carbámico (2,63 g, 6.86mmol) en CH2Ch(100 ml) y DMF (5 ml). Esta solución se enfrió a 0° C. Se añadió ácido (R)-2- benciloxicarbonilamino-3-(4-etoxi-fenil)-propiónico (2,59 g, 7,54 mmol) seguido por HOBt (1,11 g, 8,23 mmol) y trietilamina (2,08 g, 20,57 mmol). Luego se añadió carbodiimida soluble en agua (1,45 g, 7,54 mmol). Después de 18 horas a 0° C a temperatura ambiente la mezcla de la reacción se diluyó con cloroformo (200 ml) y se lavó con NaHCO3(1x50 ml), agua (1x50 ml), salmuera (1x50 ml), se secó (Na2SO4) y se evaporó al vacío dando un aceite amarillo. El residuo se trituró con acetato de etilo y éter de petróleo (60-80° C) para dar un sólido blanco identificado como éster bencílico de ácido [(R)-1-{(S)-1-[4-(terc-butoxicarbonilamino-metil)-bencilcarbamoil]-2-fenil-etilcarbamoil}- 2-(4-etoxi-fenil)-etil]-carbámico (3,55 g, 5,01 mmol, 73%).

[M+H]+ = 70934.

F. Éster terc-butílico de ácido [4-({(S)-2-[(R)-2-amino-3-(4-etoxi-fenil)-propionilamino]-3-fenil-propionilamino}- metil)-bencil]-carbámico

Se disolvió éster bencílico de ácido [(R)-1-{(S)-1-[4-(terc-butoxicarbonilamino-metil)-bencilcarbamoil]-2-fenil- etilcarbamoil}-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-carbámico (3,55 g, 5,00 mmol) en metanol (200 ml). Esta solución se hidrogenó sobre Pd al 10%/C (500 mg) a presión atmosférica y temperatura ambiente durante una hora, después de lo cual se filtró el catalizador a través de Celite y se lavó el residuo con metanol (30 ml), los filtrados combinados se evaporaron a vacío para dar un sólido blanco identificado como éster terc-butílico de ácido [4-({(S)-2-[(R)-2-amino-3- (4-etoxi-fenil)-propionilamino]-3-fenil-propionilamino}-metil)-bencil]-carbámico (2,8 g, 4,87 mmol, 97%).

[M+H]+ = 575.37.

G. Éster terc-butílico de ácido [4-({(S)-2-[(R)-2-benzoilamino-3-(4-etoxi-fenil)-propionilamino]-3-fenil- propionilamino}-metil)-bencil]-carbámico

Se disolvió éster terc-butílico de ácidos [4-({(S)-2-[(R)-2-amino-3-(4-etoxi-fenil)-propionilamino]-3-fenil- propionilamino}-metil)-bencil]-carbámico (3,45 g, 5,99 mmol) en diclorometano (150 ml). Se añadió cloruro de benzoilo (1,01 g, 7,19 mmol) seguido de trietilamina (1,82 g, 17,98 mmol). La mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas y se diluyó con CHCh (150 ml), esta solución se lavó con KHSO4 0,3M (1x50 ml), NaHCO3 saturado (1x50 ml), agua (1x50 ml), salmuera (1x50 ml), se secó (Na2SO4) y se evaporó al vacío. El residuo se trituró con éter de petróleo (60-80° C) y EtOAc para dar un sólido blanco identificado como éster terc- butílico de ácido [4-({(S)-2-[(R)-2-benzoilamino-3-(4-etoxi-fenil)-propionilamino]-3-fenil-propionilamino}-metil)-bencil]- carbámico (3,06 g, 4,51 mmol, 75%).

[M+H] + = 679.34.

H. Clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-am¡nomet¡l-benc¡lcarbamo¡l)-2-fen¡l-et¡lcarbamo¡l]-2-(4-etox¡-fen¡l)-et¡l)- benzamida (Forma 1)

Se agitó éster terc-butílico de ácido [4-({(S)-2-[(R)-2-benzoilamino-3-(4-etoxi-fenil)-propionilamino]-3-fenil- propionilamino}-metil)-bencil]-carbámico (10,0 g, 14,7 mmol) en cloruro de hidrógeno/acetato de etilo (3,7 M, 250 ml) a temperatura ambiente. Después de dos horas, la mezcla se filtró, se lavó con acetato de etilo (2 x 50 ml) y se secó para proporcionar un sólido (7,9 g). Una porción del sólido (0,106 g) se suspendió en una mezcla de acetonitrilo (2,1 ml) y agua (0,32 ml), se agitó y se calentó a 77° C. Se añadieron alícuotas adicionales de agua (0,05 ml)

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sucesivamente a la mezcla hasta que se observó la disolución. La mezcla agitada se enfrió luego a temperatura ambiente durante la noche. El sólido resultante se aisló por filtración y se secó al vacío a 40° C para proporcionar clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxifenil)-etil)-benzamida (Forma 1) (0,067 g, 3,41 mmol, 81%).

[M+H]+ = 579.34

1H NMR: (CD3OD), 1.40 (3H, t, J= 6.9 Hz), 2.91-2.99 (3H, m), 3.14-3.19 (1H, m), 4.02 (2H, q, J= 6.9 Hz), 4.08 (2H, s), 4.41 (1H, d, J= 15.5 Hz), 4.51 (1H, d, J= 15.5 Hz), 4.66-4.69 (2H, m), 6.82 (2H, d, J= 8.4 Hz), 7.10 (2H, d, J= 8.2 Hz), 7.18-7.20 (2H, m), 7.25-7.38 (7H, m), 7.44-7.59 (3H, m), 7.72 (2H, d, J= 7.8 Hz).

En la Figura 1 se muestra un difractograma XRPD de clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil- bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida (Forma 1).

Tabla de posición de picos:

Pos. [°2Th.]

Altura [cts] FWHM [°2Th.] espaciado d [A] Rel. Int. [%]

5.1017

1329.67 0.1023 17.32212 100.00

5.9073

268.87 0.1023 14.96140 20.22

7.8360

212.97 0.1279 11.28276 16.02

10.2760

325.77 0.1279 8.60856 24.50

10.6870

227.90 0.1023 8.27835 17.14

11.8572

67.00 0.1535 7.46389 5.04

12.9566

230.78 0.1535 6.83291 17.36

14.8739

293.35 0.1279 5.95615 22.06

15.4578

148.51 0.1023 5.73245 11.17

15.7597

243.28 0.1535 5.62332 18.30

16.5908

488.41 0.1535 5.34347 36.73

17.8537

439.46 0.1279 4.96822 33.05

18.1443

1305.68 0.1535 4.88931 98.20

18.6294

1316.97 0.1535 4.76308 99.05

19.5704

643.93 0.1279 4.53612 48.43

20.0346

491.15 0.1791 4.43206 36.94

20.6761

789.56 0.1535 4.29598 59.38

20.9345

644.58 0.1279 4.24353 48.48

21.5959

208.07 0.2047 4.11503 15.65

22.1545

308.04 0.1791 4.01253 23.17

22.5745

392.23 0.1791 3.93883 29.50

23.3449

238.25 0.1279 3.81055 17.92

23.7157

786.12 0.1791 3.75181 59.12

23.9647

892.17 0.1535 3.71338 67.10

24.5150

156.93 0.2047 3.63125 11.80

25.5989

359.73 0.1791 3.47991 27.05

26.6668

341.96 0.2303 3.34294 25.72

27.6988

394.43 0.2047 3.22068 29.66

28.1867

71.81 0.1535 3.16604 5.40

28.9888

296.12 0.1279 3.08023 22.27

29.5799

56.04 0.2047 3.02001 4.21

30.5389

38.86 0.1535 2.92733 2.92

31.4200

71.21 0.1535 2.84722 5.36

31.8195

63.64 0.1535 2.81237 4.79

33.0388

37.25 0.1535 2.71132 2.80

34.1843

48.19 0.3070 2.62305 3.62

34.8271

94.43 0.2047 2.57609 7.10

Espectroscopia infrarroja

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El espectro IR de la Forma 1 comprende picos en longitudes de onda de aproximadamente 3274, 3027, 2976, 2928, 1651, 1636, 1536, 1512, 1243 y 703 cm-1 . El espectro se presenta en la Figura 2.

Calorimetría diferencial de barrido (DSC)

Los datos de DSC para la Forma 1 se muestran en la Figura 3.

Sorción Gravimétrica de Vapor

Las isotermas de sorción se obtuvieron usando un analizador de sorción de humedad Hiden Isochema (modelo IGAsorp), controlado por IGAsorp Systems Software V6.50.48. La muestra se mantuvo a una temperatura constante (25° C) por los controles del instrumento. La humedad se controló mezclando corrientes de nitrógeno seco y húmedo, con un flujo total de 250 ml.min-1. Se verificó el instrumento para determinar el contenido de humedad relativa midiendo tres soluciones de sal de Rotronic calibradas (10-50-88%). Se monitorizó el cambio de peso de la muestra como una función de la humedad mediante una microbalanza (precisión +/- 0,005 mg). Se colocó una cantidad definida de muestra en una cesta de acero inoxidable con malla tarada en condiciones ambientales. Un ciclo experimental completo consistió en tres escaneos (sorción, desorción y sorción) a una temperatura constante (25° C) y 10% de intervalos de RH durante un intervalo del 0-90% (60 minutos para cada nivel de humedad.

Los datos de GVS para la Forma 1 se muestran en Figura 4.

Clorhidrato de N-r(R)-1-r(S)-1-(4-am¡nomet¡l-benc¡lcarbamoM)-2-fen¡l-etMcarbamoM1-2-(4-etox¡-fen¡l)-etM1-

benzamida (Forma 2)

Método

Se suspendió éster terc-butílico de ácido [4-({(S)-2-[(R)-2-benzoilamino-3-(4-etoxi-fenil)-propionilamino]-3- fenil-propionilamino}-metil)-bencil]-carbámico (5,0 g) en acetato de etilo (15 ml) bajo una atmósfera de nitrógeno. Se cargó una solución de cloruro de hidrógeno seco en acetato de etilo (3,7 M, 60 ml) a la suspensión y la mezcla se agitó a temperatura ambiente. Después de agitar durante un total de 2 horas, la suspensión resultante se filtró y se lavó con acetato de etilo (2 x 25 ml). El sólido se secó al vacío durante 60 horas a 40° C para dar clorhidrato de N- [(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida como un sólido blanquecino (4,14 g, 91% de rendimiento). Se selló una alícuota (6 mg) en una bandeja de aluminio perforada con alfileres. La bandeja se calentó usando un ciclo térmico de 30° C a 256° C a 20° C por minuto y luego se enfrió de nuevo a 30° C (50° C por minuto). Se mantuvo un caudal de nitrógeno de 60 ml/min sobre la muestra durante el ciclo. El aislamiento del sólido blanco (6 mg) de la bandeja de DSC produjo clorhidrato de [(R)-1-[(S)-1-(4- aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida (Forma 2).

En la Figura 5 se muestra un difractograma XRPD de clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil- bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida (Forma 2).

Tabla de posición de picos:

Pos. [° 2Th.]

Altura [cts] FWHM [° 2Th.] espaciado d [A] Rel. Int. [%]

3.3070

1075.86 0.0768 26.71753 39.80

4.6799

950.11 0.1023 18.88250 35.15

5.6951

1856.24 0.0768 15.51845 68.67

5.9805

1039.95 0.1023 14.77853 38.47

6.6686

1014.97 0.0768 13.25511 37.55

7.3582

369.02 0.1279 12.01428 13.65

7.8208

487.46 0.1023 11.30472 18.03

8.2936

899.00 0.1791 10.66123 33.26

8.4475

806.49 0.0768 10.46733 29.83

8.9889

330.16 0.1023 9.83805 12.21

9.4038

486.45 0.1023 9.40489 18.00

10.0299

729.01 0.1023 8.81923 26.97

10.4931

624.51 0.1791 8.43091 23.10

10.9988

975.24 0.1023 8.04442 36.08

11.7536

245.09 0.1023 7.52941 9.07

13.1421

877.95 0.1279 6.73688 32.48

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

(continuación)

Pos. [° 2Th.]

Altura [cts] FWHM [° 2Th.] espaciado d [A] Rel. Int. [%]

14.1298

189.58 0.2047 6.26812 7.01

15.3505

210.21 0.1535 5.77229 7.78

15.7802

310.59 0.2047 5.61607 11.49

16.7562

812.56 0.1023 5.29108 30.06

16.9866

1130.90 0.1279 5.21984 41.83

17.3077

810.26 0.1279 5.12370 29.97

18.0388

1199.00 0.3070 4.91767 44.35

18.3860

1333.07 0.0768 4.82559 49.31

18.5848

1711.69 0.1279 4.77440 63.32

18.9114

1053.68 0.1023 4.69267 38.98

19.7135

945.69 0.1791 4.50353 34.98

20.2996

767.87 0.2558 4.37480 28.41

21.1161

602.32 0.1535 4.20744 22.28

21.4678

764.85 0.1279 4.13931 28.29

22.1871

1028.96 0.1279 4.00671 38.06

22.7211

815.23 0.2558 3.91373 30.16

23.4683

678.22 0.2047 3.79080 25.09

24.3820

1401.49 0.1279 3.65077 51.84

25.5221

2703.25 0.2047 3.49021 100.00

26.4725

476.72 0.2047 3.36702 17.63

27.4387

294.02 0.4093 3.25062 10.88

28.1127

1047.80 0.1791 3.17420 38.76

28.9034

464.66 0.1279 3.08914 17.19

29.3333

255.04 0.1535 3.04484 9.43

30.4339

165.30 0.1535 2.93719 6.12

31.0871

342.59 0.1248 2.87456 12.67

31.8915

61.28 0.4992 2.81084 2.27

Los datos de DSC para la Forma 2 se muestran en la Figura 6. Actividad Biológica

La capacidad de las formas cristalinas de la invención para inhibir la calicreína plasmática puede determinarse usando el siguiente ensayo biológico:

Determinación del Ki para la calicreína plasmática

La actividad inhibidora de la calicreína plasmática in vitro se determinó usando métodos publicados estándar (ver, por ejemplo, Johansen et al., Int. J. Tiss. Reac. 1986, 8, 185; Shori et al., Biochem. Pharmacol., 1992, 43, 1209; Stürzebecher et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1992, 373, 1025). Se incubó calicreína plasmática humana (Protogen) a 37° C con el sustrato fluorogénico H-DPro-Phe-Arg-AFC y varias concentraciones del compuesto de prueba. La actividad enzimática residual (velocidad de reacción inicial) se determinó midiendo el cambio en la absorbancia óptica a 410 nm y se determinó el valor Ki para el compuesto de ensayo.

Cuando se probó en este ensayo, la Forma 1 mostró una Ki (Pkal humana) de 0,010 pM.

Las formas cristalinas también pueden examinarse para detectar actividad inhibidora contra el enzima relacionado KLK1 usando el siguiente ensayo biológico:

Determinación del IC50 para KLK1

Se determinó la actividad inhibidora de KLK1 in vitro usando métodos publicados estándar (ver, por ejemplo, Johansen et al., Int. J. Tiss. Reac. 1986, 8, 185; Shori et al., Biochem. Pharmacol., 1992, 43, 1209; Stürzebecher et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1992, 373, 1025). Se incubó KLK1 humano (Callbiochem) a 37° C

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

con el sustrato fluorogénico H-DVal-Leu-Arg-AFC y varias concentraciones del compuesto de prueba. La actividad enzimática residual (velocidad de reacción inicial) se determinó midiendo el cambio en la absorbancia óptica a 410 nm y el se determinó el valor de IC50 para el compuesto del ensayo.

Cuando se probó en este ensayo, la Forma 1 mostró un IC50 (KLK1 humano) de> 10 pM.

Las formas cristalinas también pueden examinarse para determinar su actividad inhibidora frente a los enzimas relacionados plasmina, trombina, tripsina, Factor Xa y Factor XIIa usando los siguientes ensayos biológicos:

Determinación de la selectividad de la enzima

Las enzimas serina proteasas humanas plasmina, trombina, tripsina, Factor Xa y Factor XIIa se ensayaron para actividad enzimática usando un sustrato fluorogénico apropiado. La actividad de proteasa se midió monitorizando la acumulación de fluorescencia liberada del sustrato durante 5 minutos. La velocidad lineal del aumento de fluorescencia por minuto se expresó como porcentaje (%) de actividad. El Km para la escisión de cada sustrato se determinó mediante transformación estándar de la ecuación de Michaelis-Menten. Los ensayos de compuestos inhibidores se realizaron a concentración de sustrato Km y las actividades se calcularon como la concentración de inhibidor dando un 50% de inhibición (IC50) de la actividad enzimática no inhibida (100%).

Cuando se analizó el clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2- (4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida en estos ensayos, se obtuvieron los siguientes datos:

IC50 (nM)

Trombina

Tripsina Plasmina Factor Xa Factor XIIa

> 40000

10800 3500 >10000 >10000

Modelo de Permeabilidad Vascular Retiniana Inducido por Anhidrasa Carbónica I

La actividad del clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4- etoxi-fenil)-etil]-benzamida se ha establecido usando este modelo in vivo en rata. Las ratas recibieron una inyección intravítrea (5 pl) de solución salina tamponada con fosfato (PBS), CH-3457 (un control positivo del inhibidor de calicreína plasmática) (10 pM) o clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2- (4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida ("Compuesto de prueba") (1 pM) en el momento 0. Después de 30 minutos, se dio una segunda inyección intravítrea (5pE) de PBS o CA-I (200 ng/ojo). Después de 15 minutos, se infundió fluoresceína sódica al 10% y se midió la permeabilidad vascular retiniana (RVP) mediante fluorofotometría vítrea 75 minutos después de las inyecciones IVT iniciales. Los datos para el clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil- bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxifenil)-etil]-benzamida ("Compuesto de prueba") se presentan en la Figura 7, en la que la línea discontinua inferior indica rVp de referencia después de pBs/PBS y la línea discontinua superior indica la estimulación máxima. La inyección intravítrea de 1 pM de clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4- aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida sola no tuvo efecto sobre la RVP de referencia en comparación con PBS solo (3,29±0,21 frente a 3,64±0,48). La inyección intravítrea de clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida redujo la RVP (estimulado por inyección de CA-I) en un 53±21%.

Farmacocinética

Se realizó un estudio farmacocinético del clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2- fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida para evaluar la farmacocinética ocular y sistémica después de una dosis de IVT individual en conejos pigmentados (cinturón Holandés). Seis conejos por nivel de dosis recibieron una inyección IVT individual bilateral de 50 pl de un clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2- fenil-etil-carbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida de 4,2 pg/ml (210 ng por ojo) formulado en solución salina tamponada con fosfato. Se sacrificó un conejo en cada punto temporal (4, 8, 24, 48, 96 y 168 horas después de la administración IVT) y se midieron las concentraciones en el tejido ocular de clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4- aminometil)-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida en el vítreo, retina/coroides y humor acuoso. Se recogieron muestras de sangre en serie en los conejos supervivientes.

Los datos de concentración en tejido ocular se presentan en la Figura 8, en el que la línea continua para cada concentración de tejido ocular es la media del ojo izquierdo y el derecho de cada conejo. La disminución en las concentraciones en el tejido ocular de clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil- etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida ("Compuesto de prueba") fue mínimo durante 7 días. Las concentraciones en plasma del clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2- (4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida tras la administración de IVT fueron inferiores a 1 ng/ml en todos los puntos temporales.

Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Una forma sólida de clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4-aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi- fenil)-etil]-benzamida , que presenta por lo menos los siguientes picos de difracción en polvo de rayos X característicos (radiación Cu Ka, expresada en grados 20) a 5.1 ± 0.2, 10.3 ± 0.2, 10.7 ± 0.2, 18.1 ± 0.2 y 18.6 ± 0.2.
2. 2. La forma sólida de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene un patrón de difracción en polvo de rayos X sustancialmente igual al mostrado en la Figura 1.
3. 3. La forma sólida de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 caracterizada por un espectro IR que tiene picos expresados en cm-1 a 3274 ± 1, 3027 ± 1, 2976 ± 1, 2928 ± 1, 1651 ± 1, 1636 ± 1, 1536 ± 1, 1512 ± 1, 1243 ± 1 y 703 ± 1.
4. 4. La forma sólida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que tiene un espectro IR sustancialmente igual al mostrado en la Figura 2.
5. 5. La forma sólida de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que es un hidrato.
6. 6. La forma sólida de acuerdo con la reivindicación 5, en la que el hidrato es un monohidrato.
7. 7. Una composición farmacéutica que comprende una forma sólida como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en asociación con un adyuvante, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable; en el que dicha composición farmacéutica está en forma de suspensión, comprimido, cápsula, polvo, gránulo o supositorio.
8. 8. Una forma sólida como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en terapia.
9. 9. Una forma sólida como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección mediada por la calicreína plasmática; en donde la enfermedad o afección mediada por la calicreína plasmática se selecciona de agudeza visual deteriorada, retinopatía diabética, edema macular diabético, angioedema hereditario, diabetes, pancreatitis, hemorragia cerebral, nepropatía, cardiomiopatía, neuropatía, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis, inflamación, choque séptico, hipotensión, cáncer, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, coagulación intravascular diseminada, y hemorragia de cirugía postoperatoria.
10. 10. La forma sólida de acuerdo con la reivindicación 9 en la que la enfermedad o afección mediada por la calicreína plasmática es retinopatía diabética o edema macular diabético.
11. 11. Una forma sólida como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección mediada por la calicreína plasmática; en donde la enfermedad o afección mediada por calicreína plasmática es permeabilidad vascular retiniana asociada con retinopatía diabética y edema macular diabético y en donde dicha forma sólida se administra en una forma adecuada para inyección en la región ocular de un paciente, en particular, en una forma adecuada para inyección intravítrea.
12. 12. Un proceso para la preparación de una forma sólida como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende cristalizar dicha forma sólida a partir de una mezcla de clorhidrato de N-[(R)-1-[(S)-1-(4- aminometil-bencilcarbamoil)-2-fenil-etilcarbamoil]-2-(4-etoxi-fenil)-etil]-benzamida y un solvente o una mezcla de solventes, en donde la mezcla de solventes es acetonitrilo y agua o acetonitrilo y dimetilsulfóxido, y dicha mezcla se calienta a una temperatura de aproximadamente 75-80° C antes de que se permita que enfríe a temperatura ambiente.