ES2677219T3 - Derivados multivalentes de ácido siálico - Google Patents

Abstract

Un derivado tri- o tetravalentes de ácido siálico, comprendiendo dicho derivado un resto central al que se unen 3 o 4 grupos de acuerdo con la fórmula A o B **Fórmula** en el que "X" es O (oxígeno) o S (azufre); R1 es alquilo C1-3; el número entero "n1" es de 2 a 8; el número entero "n2" es de 1 a 8; y la línea ondulada indica el punto de unión al resto central; en el que dicho resto central es un resto de acuerdo con una cualquiera de las fórmulas II a V **Fórmula** en la que el número entero "m1" de la fórmula II es de 1 a 8 si los grupos unidos al resto II son grupos de acuerdo con la fórmula A; el número entero "m1" de la fórmula II es de 2 a 8 si los grupos unidos al resto II son grupos de acuerdo con la fórmula B; el entero "m2" es de 1 a 8; y las líneas onduladas indican el punto de unión a los grupos de acuerdo con la fórmula A o B; como una base libre, un ácido en su forma protonada no cargada, un zwitterión, una sal de adición farmacéuticamente aceptable, un solvato o un solvato de una sal del mismo.

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Derivados multivalentes de acido sialico Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a nuevos derivados multivalentes de acido sialico, composiciones farmaceuticas que comprenden dichos derivados, y dichos compuestos para uso en un procedimiento para tratar o prevenir la queratoconjuntivitis epidemica (QCE) y otras enfermedades oculares causadas por virus, en las que el virus se une a los residuos sialicos terminales presentes en la superficie celular, mediante el uso de dichos compuestos.

Antecedentes

Los adenovirus humanos (AdVH), que pertenecen al genero de adenovirus de los mamiferos (Mastadenovirus), son agentes infecciosos comunmente encontrados. En humanos, los adenovirus se asocian a diversos sintomas clinicos, incluidas enfermedades oculares tales como conjuntivitis y queratoconjuntivitis epidemica (QCE).

Hasta la fecha, desafortunadamente no hay farmacos antiviricos especificos disponibles para el tratamiento de las infecciones por adenovirus. Los adenovirus son parasitos intracelulares estrictos, lo que indica que dependen por completo de la maquinaria de replicacion de la celula. La inhibicion selectiva de la replicacion de adenovirus por compuestos antiviricos es, por lo tanto, muy dificil de conseguir, ya que algunas de las funciones esenciales de las celulas hospedadoras tambien se pueden ver alteradas. Sin embargo, un enfoque en la investigacion de farmacos antiviricos actual consiste en bloquear los receptores celulares de los virus de modo que se impida su union a y penetracion en las celulas. No se ha registrado ningun farmaco basado en dicho bloqueo para su uso en el tratamiento de la queratoconjuntivitis epidemica (QCE).

Los adenovirus son de naturaleza ubicua y, por lo tanto, aun se estan descubriendo nuevos serotipos. Asi, aproximadamente 60 anos despues del aislamiento de los primeros AdVH, se han identificado mas de 50 nuevos serotipos agrupados en siete especies (A-G).

La QCE es una infeccion ocular grave y altamente contagiosa que contraen millones de personas cada ano. Entre los serotipos de adenovirus responsables de la QCE, el AdVH-8, el AdVH-19 y el AdVH-37 siguen siendo los principales agentes causantes de la infeccion, aunque recientemente tambien han surgido AdVH-53, AdVH- 54 y AdVH-56 como tipos nuevos que causan QCE. Los sintomas asociados son queratitis, conjuntivitis, edema, dolor, lagrimeo, formacion de pseudomembranas y perdida de vision. Debido a que estos virus se transmiten por contacto (por ejemplo, por contacto de la mano con los ojos), la QCE es frecuente en areas densamente pobladas y en salas medicas con medidas de higiene insuficientes. La infeccion suele durar hasta dos semanas; sin embargo, algunos pacientes continuan padeciendo discapacidad visual durante varios meses, anos o incluso de forma permanente.

El ciclo de vida del virus se inicia mediante la union de los adenovirus, a traves de las cabezas de fibras homotrimericas, a glicanos que contienen acido sialico que estan situados en las celulas epiteliales de la cornea y/o la conjuntiva. Las cabezas de fibras, ubicadas en la parte mas distal de cada una de las 12 fibras que sobresalen del virion de adenovirus, mantienen los dominios de reconocimiento de carbohidratos. Recientemente, las glicoproteinas con glicanos correspondientes a los glicanos de los gangliosidos GD1a se evidenciaron como receptores funcionales para la infeccion de celulas oculares por adenovirus causantes de QCE. La estructura cristalina del complejo AdVH-37-GD1a mostro que los residuos terminales de acido sialico localizados en cada una de las dos ramificaciones del glicano de GD1a se acomodaron en dos de los tres sitios de reconocimiento de carbohidratos en la parte superior de la cabeza de fibra de AdVH-37.

Por lo tanto, la inhibicion de los adenovirus con derivados de acido sialico naturales o sinteticos puede evitar que el virion se una a, penetre en e infecte nuevas celulas (vease el documento WO 01/037846, entre otros). Como resultado, la infeccion se limitaria. Es importante destacar, y especialmente en el caso de la QCE, que las deficientes propiedades farmacologicas de los farmacos basados en carbohidratos, que incluyen el rapido aclaramiento del suero y la deficiente captacion celular, se pueden evitar mediante el uso de un modo topico de administracion (por ejemplo, crema, unguento, gotas para los ojos).

El documento WO 01/037846 divulga que las infecciones adenoviricas y, en particular, las infecciones adenoviricas oculares, por ejemplo la queratoconjuntivitis, se pueden tratar o aliviar mediante la administracion de una sustancia, interfiriendo en la interaccion entre el virus y el receptor de acido sialico, tal como el acido sialico, en una cantidad terapeuticamente eficaz. Desafortunadamente, las interacciones debiles entre carbohidratos y proteinas limitan el uso de carbohidratos como farmacos.

En la tecnica se han divulgado diversas formas de sintetizar compuestos multivalentes para mejorar las interacciones entre carbohidratos y proteinas (vease, por ejemplo, Organic and Biomolecular Chemistry vol. 6(8), 2008, 1396-1409, Chembiochem 12(6), 2011,887-895 y el documento WO 2007/011696).

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Se han realizado intentos para superar dichas limitaciones usando un glicoconjugado con varios derivados de acido sialico unidos a seroalbumina humana (AS-SAH). Sin embargo, dichos glicoconjugados polivalentes no son adecuados como productos farmaceuticos por diversas razones. La estructura y composicion exactas del AS- SAH variaran entre las diferentes moleculas. En consecuencia, el derivado AS-SAH representa un tipo de estructura que es dificil de definir estructuralmente. Ademas, la composicion de los derivados AS-SAH variara entre diferentes lotes incluso si se producen de la misma manera. Desde una perspectiva de seguridad y regulacion, esto es un inconveniente significativo. Ademas, el uso de una proteina, esto es, SAH, que se deriva del plasma humano, es una gran desventaja. El origen de SAH hace que sea dificil producir cantidades mas grandes de un producto farmaceutico basado en SAH. Ademas, la contaminacion por agentes infecciosos, tales como virus o priones, no se puede excluir en la SAH derivada de plasma humano. Por consiguiente, un producto basado en SAH no es adecuado como producto farmaceutico, y seria altamente deseable una alternativa polivalente.

En el documento WO 2011/003876 se divulgan nuevos derivados anfifilicos de acido sialico que forman agregados multivalentes en soluciones acuosas. Los agregados se divulgan para superar los inconvenientes asociados con el AS-SAH, siendo de ese modo utiles en el tratamiento de la QCE. Otros aspectos de dichos derivados han sido divulgados por Aplander et al. en J. Med. Chem. 2011,54, 6670.

Ademas, en la tecnica se han descrito inhibidores multivalentes eficaces basados en acido sialico unidos covalentemente de la infeccion por AdVH-37 de celulas epiteliales corneales humanas (ECH) (vease Spjut et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 6519; Johansson et al. Chembiochem 2005, 6, 358; y Johansson et al. Antivir. Res. 2007, 73, 92). Con el fin de eludir la eficacia relativamente baja de los derivados monovalentes de acido sialico, los autores aprovecharon el sitio de union trimerica en la cabeza de fibra de AdVH-37. El uso de derivados tri- y tetravalentes de acido sialico que se pueden unir simultaneamente a mas de un dominio de reconocimiento de carbohidratos por cada cabeza, como se divulga en Spjut et al., mejoro considerablemente la potencia inhibidora en comparacion con compuestos monovalentes de acido sialico.

Por ejemplo, se informo de un compuesto denominado ME0322, que es un derivado trivalente sintetico de acido sialico en el que se usa acido escuarico para unir el acido sialico a una unidad central, con una potencia cuatro ordenes de magnitud mayor que el monosacarido natural de acido sialico. Ademas, ME0322 fue tan eficaz como el conjugado acido sialico-SAH heptadecavalente en la prevencion de la union del virus por la cabeza de fibra. Curiosamente, se encontro que ME0322 era mucho mas potente que el conjugado con SAH en la inhibicion de la infeccion de celulas epiteliales corneales humanas (ECH) por AdVH-37.

Si bien dicho compuesto, en efecto, muestra propiedades interesantes, aun resultaria util proporcionar un derivado multivalente de acido sialico que tenga incluso una potencia aun mas mejorada en terminos de evitar la union de viriones de AdVH-37 a celulas epiteliales corneales humanas (ECH).

Por lo tanto, todavia existe una necesidad en la tecnica de un derivado multivalente de acido sialico de bajo peso molecular que presente una alta eficacia para evitar la union de viriones de AdVH-37 a celulas epiteliales corneales humanas (ECH). Dicho derivado seria util para tratar y prevenir la QCE.

Sumario

En consecuencia, la presente invencion busca mitigar, aliviar, eliminar o eludir una o mas de las deficiencias identificadas anteriormente en la tecnica y desventajas, individualmente o en cualquier combinacion, proporcionando un derivado trivalente o tetravalente de acido sialico, en el que dicho derivado comprende un resto central al que se unen 3 o 4 grupos de acuerdo con la formula A o B

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en la que

"X" es O (oxigeno) o S (azufre);

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R1 es alquilo C1-3;

el numero entero "n1" es de 2 a 8;

el numero entero "n2" es de 1 a 8; y

la linea ondulada indica el punto de union al resto central; en el que dicho resto central es un resto de acuerdo con una cualquiera de las formulas II a V

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en las que

el numero entero "m1" de la formula II es de 1 a 8 si los grupos unidos al formula A;

el numero entero "m1" de la formula II es de 2 a 8 si los grupos unidos al formula B;

el entero "m2" es de 1 a 8; y las lineas onduladas indican el punto de union a los grupos de acuerdo con la formula A o B; como una base libre, un acido en su forma protonada no cargada, un zwitterion, una sal de adicion farmaceuticamente aceptable, un solvato o un solvato de una sal del mismo.

resto II son grupos de acuerdo con la resto II son grupos de acuerdo con la

De acuerdo con aspectos de la invencion:

"X" puede ser O (oxigeno); R1 puede ser metilo, el numero entero "n1" puede ser de 2 a 3; dichos grupos pueden ser grupos de acuerdo con la formula A; y/o el peso molecular de dicho derivado en su forma libre es de 1500 Da o menos; o

"X" puede ser O (oxigeno); R1 puede ser metilo, el numero entero "n2" puede ser 1, 2 o 3; dichos grupos pueden ser grupos de acuerdo con la formula B; y/o el peso molecular de dicho derivado en su forma libre es de 1500 Da o menos.

De acuerdo con otro aspecto, se proporciona una composicion farmaceutica para su administracion en el ojo que comprende un derivado de acido sialico del tipo descrito anteriormente en el presente documento y al menos un excipiente farmaceuticamente aceptable. La composicion farmaceutica puede ser una composicion acuosa que comprende de 0,001 a 10 mM, tal como de 0,01 a 1 mM, de un derivado de acido sialico. El contenido en agua de dicha composicion acuosa puede ser de al menos un 90 % en peso. Ademas, dicha composicion acuosa puede comprender un agente, tal como glicerol, para proporcionar una solucion isotonica.

De acuerdo con otro aspecto, el derivado de acido sialico o la composicion farmaceutica que comprende dicho derivado descritos anteriormente en el presente documento son para uso en terapia.

De acuerdo con otro aspecto, el derivado de acido sialico o la composicion farmaceutica que comprende dicho derivado descritos anteriormente en el presente documento son para uso en el tratamiento y/o prevencion de una infeccion ocular causada por un virus, que se une a residuos sialicos terminales presentes en la superficie celular de la celula que va a resultar infectada por dicho virus. La infeccion puede ser una infeccion causada por un virus seleccionado del grupo que consiste en AdVH-8, AdVH-19, AdVH-37, AdVH-53, AdVH-54 y AdVH-56. Ademas, la infeccion puede ser una queratoconjuntivitis epidemica.

Ademas, las caracteristicas ventajosas de diversos modos de realizacion de la invencion se definen en las reivindicaciones dependientes y en la descripcion detallada a continuacion.

Desoripoion detallada de modos de realizacion preferentes

Como se usa en este documento, el termino "sal de adicion" pretende significar sales formadas por la adicion de un acido farmaceuticamente aceptable, tal como acidos organicos o inorganicos, o una base farmaceuticamente aceptable. El acido organico puede ser, pero no se limita a, acido acetico, propanoico, metanosulfonico, bencenosulfonico, lactico, malico, citrico, tartarico, succinico o maleico. El acido inorganico puede ser, pero no se limita a, acido clorhidrico, bromhidrico, sulfurico, nitrico o fosforico. La base puede ser, pero no se limita a,

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amoniaco e hidroxidos de metales alcalinos o alcalinoterreos. El termino "sal de adicion" tambien comprende los hidratos y las formas de adicion de disolvente, tales como hidratos y alcoholatos.

Como se usa en el presente documento, "alquilo" usado solo o como un sufijo o prefijo, pretende incluir tanto grupos hidrocarburo alifaticos saturados de cadena lineal como ramificados que tienen un numero especifico de atomos de carbono. Por ejemplo, "alquilo C1 -6" significa alquilo que tiene 1,2, 3, 4, 5 o 6 atomos de carbono.

Compuestos

El derivado trivalente de acido sialico denominado ME0322 (vease a continuacion), conocido en la tecnica por inhibir la union de AdVH-37 a celulas epiteliales corneales humanas, tiene tres elementos principales, un resto central, residuos de acido sialico y conectores, que conectan el resto central y los residuos de acido sialico. En el conector esta presente un residuo de acoplamiento basado en acido escuarico. El derivado trivalente de acido sialico ME0322 se diseno de manera que proporcionara suficiente flexibilidad como para permitir la interaccion con los tres sitios de union a acido sialico de la cabeza de fibra de forma simultanea. Aparentemente, una estructura cristalina resuelta de un complejo de cabeza de fibra de AdVH-37 y ME0322 confirma que el compuesto es capaz de unirse a los tres sitios de union a acido sialico de forma simultanea, confirmando asi que la flexibilidad proporcionada por los conectores es suficiente.

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Se especulo que reemplazar el residuo de acido escuarico por otro residuo de acoplamiento, proporcionando medios para establecer contactos adicionales con los sitios de reconocimiento de carbohidratos en la cabeza de fibra de AdVH-37, podria aumentar potencialmente la afinidad de union aun mas. Sorprendentemente, los presentes inventores tambien han confirmado que reemplazar el residuo de acoplamiento de acido escuarico presente en ME0322 por un residuo de acoplamiento acido de triazol da como resultado derivados de multivalentes de acido sialico con potencia incrementada para prevenir la union de AdVH-37 a celulas epiteliales corneales humanas.

Por lo tanto, un modo de realizacion se refiere a un derivado tri o tetravalente de acido sialico, comprendiendo dicho derivado un resto central al que se unen 3 o 4 grupos de acuerdo con la formula A o B

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en la que

"X" es O (oxigeno) o S (azufre);

R1 es alquilo C1-3;

el numero entero "n1" es de 2 a 8;

el numero entero "n2" es de 1 a 8; y

la linea ondulada indicaba el punto de union al resto central.

Dichos compuestos pueden estar presentes como bases libres, como acidos en su forma protonada no cargada, como sales de adicion farmaceuticamente aceptables, como solvatos, o como solvatos de una sal de adicion farmaceuticamente aceptable. Dado que los compuestos comprenden un residuo de triazol alcalino, asi como un resto carboxilico acido, tambien pueden estar presentes como zwitteriones. Ademas, dicho compuesto puede estar presente como un estereoisomero puro, o en una mezcla racemica, diastereomerica, escalemica o anomerica que comprende dicho compuesto. Preferentemente, dicho compuesto esta presente como un estereoisomero puro, o como una mezcla anomerica.

Si esta presente en una mezcla anomerica, es preferente que prevalezca el anomero a. En consecuencia, es preferente un 75 % o mas, tal como mas de un 90 %, un 95 %, un 99 % o incluso mas de un 99,9 % de un compuesto esta presente como anomero a. Los anomeros (3 correspondientes se representan a continuacion.

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Tambien son de interes los N- y S-glicosidos, aunque son preferentes los O-glicosidos. Por lo tanto, "X" en la formula A y B son "O" (oxigeno) de acuerdo con un modo de realizacion.

Para los derivados de SAH anteriores que se relacionan de alguna manera con el presente, se ha mostrado previamente (Johansson et al. J. Med. Chem. 2009, 52, 366) que R1 no esta restringido a metilo en compuestos que tienen afinidad por los sitios de reconocimiento de carbohidratos de la cabeza de fibra de AdVH-37. Sin embargo, aunque R1 en derivados tri- o tetravalentes de acido sialico divulgados en el presente documento no esta restringido a metilo, es preferente que R1 sea metilo.

En el derivado tri- o tetravalente de acido sialico divulgado en el presente documento, el residuo de acido sialico se une al residuo de triazol mediante un alquileno. Aunque es preferente un alquileno, tambien se podria considerar la sustitucion del alquileno por, por ejemplo, un conector de PEG corto o un conector que comprende un resto cicloalquilo, tal como ciclopropilo (que no es parte de la invencion). El alquileno puede ser de varias longitudes, es decir, de etileno a octileno para un derivado tri- o tetravalente de acido sialico que comprende grupos de acuerdo con la formula A y de metileno a octileno un derivado tri- o tetravalente de acido sialico que comprende grupos de acuerdo con la formula B. Sin embargo, es preferente que el alquileno sea etileno o propileno Por lo tanto, es preferente que el numero entero "n1" sea 2 o 3 en un derivado tri- o tetravalente de acido sialico que comprende grupos de acuerdo con la formula A. De manera similar, es preferente que el numero entero "n2" sea 1, 2 o 3 en un derivado tri- o tetravalente de acido sialico que comprende grupos de acuerdo con la formula B.

El derivado tri- o tetravalente de acido sialico como se divulga en el presente documento se puede obtener por acoplamiento de un residuo de acido sialico que comprende un grupo azida con un resto central que comprende grupos etino en una cicloadicion de Huisgen de azida-alquino catalizada por cobre (I) (veanse los detalles experimentales mas adelante). De forma similar, un residuo de acido sialico que comprende un grupo etino se puede acoplar a un resto central que comprende grupos azida en presencia de cobre (I). De acuerdo con un modo de realizacion, los derivados tri- o tetravalentes de acido sialico como se divulgan en el presente documento comprenden grupos de acuerdo con la formula A. De acuerdo con otro modo de realizacion, los derivados tri- o tetravalentes de acido sialico como se divulgan en el presente documento comprenden grupos de

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acuerdo con la formula B. Aparentemente, los compuestos que comprenden grupos de acuerdo con la formula B puede ser algo mas potente que los compuestos que comprenden grupos de acuerdo con la formula A, al menos con ciertas longitudes del conector.

Aunque la tripropargilamina y la tris(2-azidoetil)amina, respectivamente, se resultaron ser utiles como restos centrales en la obtencion de un derivado tri- o tetravalente de acido sialico con afinidad aumentada por los sitios de reconocimiento de carbohidratos en la cabeza de fibra de AdVH-37, la presente invencion no esta limitada en forma alguna unicamente a este tipo de resto central trivalente. Otros compuestos de moleculas pequenas, estructuralmente bien definidos que comprenden tres o cuatro grupos etino, o azida, tambien se pueden acoplar a residuos de acido sialico en presencia de cobre (I) para obtener derivados tri- o tetravalentes de acido sialico.

De acuerdo con un modo de realizacion, el peso molecular del derivado tri- o tetravalente de acido sialico en su forma libre es de 2500 Da o menos, tal como 2000 Da o menos o 1500 Da o menos. Dado que los tres sitios de union al acido sialico de la cabeza de fibra estan situados bastante cerca (es decir, a aproximadamente 10 A) unos de otros, es preferente que los restos de acido sialico del derivado tri- o tetravalente de acido sialico no esten demasiado separados. Ademas, un resto central demasiado flexible o una distancia demasiado grande entre los residuos de acido sialico pueden afectar negativamente la union del derivado a la cabeza de fibra. Un derivado pequeno y mas rigido tambien dara como resultado menos perdidas de entropia cuando se une a la proteina de la cabeza de fibra y contribuira asi a una potencia mejorada.

Como ya se explico, el resto central puede ser de varios tipos. De acuerdo con un modo de realizacion, el resto central es un resto de acuerdo con cualquiera de las formulas II a V

en la que

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los grupos de acuerdo con la formula A o B unidos al resto I son grupos de acuerdo con la formula A;

el numero entero "m1" en la formula II es de 1 a 8 si los grupos de acuerdo con la formula A o B unidos al resto II

son grupos de acuerdo con la formula A;

el numero entero "m1" en la formula II es de 2 a 8 si los grupos de acuerdo con la formula A o B unidos al resto II son grupos de acuerdo con la formula B; el entero "m2" es de 1 a 8; y

las lineas onduladas indican el punto de union a los grupos de acuerdo con la formula A o B.

Aunque la naturaleza exacta del resto central es de menor importancia para la afinidad de union, de todos modos se ha encontrado que es preferente que el resto central sea un resto de acuerdo con la formula II. Ademas, preferentemente el numero entero "m1" es de 1 a 3 y el numero entero "m2" es de 1 a 3. Ademas, los grupos de acuerdo con la formula A o B unidos al resto II son de acuerdo con un modo de realizacion grupos de acuerdo con la formula A. De acuerdo con otro modo de realizacion, son grupos de acuerdo con la formula B.

De acuerdo con un modo de realizacion, un derivado tri- o tetravalente de acido sialico como se divulga en el presente documento comprende grupos de acuerdo con la formula A y se selecciona del grupo que consiste en:

Tris((acido 1-(2-O-(5-N-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosilonico))-2-oxoetil-1 H-1,2,3- triazol-4-il)methil)amina;

Tris((acido 1-(2-O-(5-N-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosilonico))-3-oxopropil-1 H-

1.2.3- triazol-4-il)metil)amina;

Tris((acido 1-(2-O-(5-N-propanoilamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosilonico))-2-oxoetil-1 H-

1.2.3- triazol-4-il)metil)amina; y

Tris((acido 1-(2-O-(5-N-propanoilamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosilonico))-3-oxopropil- 1 H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amina

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De acuerdo con dicho modo de realizacion, es preferente que el derivado tri- o tetravalente de acido sialico sea

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De acuerdo con otro modo de realizacion, el derivado tri- o tetravalente de acido sialico como se divulga en el presente documento comprende grupos de acuerdo con la formula B y se selecciona del grupo que consiste en:

Tris((acido 4-(2-0-(5-W-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosilonico))-2-oxometil-1 H-

1.2.3- triazol-1 -il)etil)amina;

Tris((acido 4-(2-0-(5-W-propanoilamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosilonico))-2-oxometil-

1H-1,2,3-triazol-1 -il)etil)amina;

Tris((acido 4-(2-0-(5-W-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosilonico))-2-oxoetil-1 H-1,2,3- triazol-1 -il)etil)amina; y

Tris((acido 4-(2-0-(5-W-propanoilamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosilonico))-2-oxoetil-1 H-

1.2.3- triazol-1 -il)etil)amina.

De acuerdo con dicho modo de realizacion, es preferente que el derivado tri- o tetravalente de acido sialico sea Tris((acido 4-(2-0-(5-W-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosilonico))-2-oxometil-1 H-

1.2.3- triazol-1 -il)etil)amina, es decir,

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Composition farmaceutica

Otro modo de realizacion de la invencion se refiere a una composicion farmaceutica, por ejemplo, un medicamento para el tratamiento y/o la prevencion de la QCE, que comprende un derivado tri- o tetravalente de acido sialico como se divulga en el presente documento. Dicha composicion farmaceutica puede comprender ademas excipientes farmaceuticamente aceptables, tales como vehiculos, diluyentes y/o estabilizantes. Dependiendo de la regulacion aplicable, la composicion farmaceutica se puede clasificar como un producto farmaceutico, o como un dispositivo medico, para el tratamiento o la prevencion de una infeccion en los ojos. El mero hecho de que en el presente documento se haga referencia a la composicion como una composicion farmaceutica no se debe interpretar como que excluye el registro de la composicion como un dispositivo medico. Las propiedades de union al virus del derivado tri- o tetravalente de acido sialico implican que tambien se puede usar, por ejemplo, para evitar la contaminacion de lentes de contacto, tal como en forma de una solucion para lentes.

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En este contexto, "farmaceuticamente aceptable" significa un excipiente que, a la dosificacion y concentracion empleadas, no causa ningun efecto no deseado en los sujetos a los que se administra. Dichos excipientes farmaceuticamente aceptables son bien conocidos en la tecnica.

De acuerdo con un modo de realizacion, dicha composicion farmaceutica como se divulga en el presente documento es una composicion farmaceutica adecuada para administrarse en el ojo. Sin limitacion, los ejemplos tipicos de composiciones farmaceuticas adecuadas para la administracion en los ojos comprenden gotas para los ojos, unguentos, aerosoles, apositos y geles.

Una composicion farmaceutica adecuada para la administracion en el ojo puede ser una composicion acuosa. Dicha composicion acuosa puede tener un contenido en agua de un 90 % en peso de agua o mas, tal como de un 90 a un 99,9, de un 95 a un 99 o de un 95 a un 98 % en peso de agua. Ademas, una composicion acuosa que comprende un derivado tri- o tetravalente de acido sialico como se divulga en el presente documento puede comprender de 0,001 a 10 mM, tal como de 0,01 a 1 mM, del derivado tri- o tetravalente de acido sialico.

Ademas, una composicion acuosa puede comprender un agente para proporcionar una solucion isotonica. Por consiguiente, una composicion acuosa puede comprender un agente seleccionado del grupo que consiste en cloruro de sodio, glicerol, polietilenglicol, sacaridos, tales como monosacaridos, por ejemplo, glucosa y manitol, y disacaridos, por ejemplo, sacarosa.

De acuerdo con un modo de realizacion, una composicion farmaceutica como se divulga en el presente documento es una composicion acuosa que comprende un electrolito, tal como cloruro de sodio. Preferentemente, el contenido del electrolito debe estar cerca de la concentracion isoosmotica, tal como aproximadamente un 0,9 % en peso para cloruro de sodio.

De acuerdo con otro modo de realizacion, una composicion farmaceutica como se divulga en el presente documento es una composicion acuosa que comprende glicerol. El contenido en glicerol puede ser de un 2 a un 3 % en peso, tal como de un 2,3 a un 2,3 o de un 2,5 a un 2,7 % en peso. Preferentemente, dicho contenido deberia estar cerca de la concentracion isoosmotica, tal como aproximadamente un 2,6 % en peso.

Ademas, puede ser interesante ajustar el pH de la composicion farmaceutica para proporcionar una composicion que tenga un pH proximo al fisiologico. Por lo tanto, la composicion farmaceutica de acuerdo con un modo de realizacion es una composicion farmaceutica acuosa que tiene un pH de aproximadamente 6,5 a 8. Preferentemente, dicho pH esta mas cerca del pH fisiologico, tal como de aproximadamente 7,2 a 7,8.

Dado que los derivados tri- o tetravalentes de acido sialico divulgados en el presente documento comprenden restos de acido carboxilico acidos, asi como restos alcalinos, que incluyen restos de triazol, la composicion farmaceutica puede comprender un acido y/o base farmaceuticamente aceptable para ajustar el pH al nivel deseado. Ademas, la composicion farmaceutica puede estar tamponada. Una composicion farmaceutica tamponada tipicamente comprende especies tampon, tales como HCO37CO32- o H2PO4-/ HPO42-. Ademas, la composicion farmaceutica tamponada puede estar tamponada con borato.

De acuerdo con otro modo de realizacion, el pH de la composicion farmaceutica es ligeramente menor que el fisiologico, tal como de aproximadamente 5 a 7. Una composicion con un pH acido, es decir, por debajo de 7, tiene la ventaja de ser menos susceptible al crecimiento de microorganismos. Ademas, el crecimiento de microorganismos se puede prevenir anadiendo un conservante a la composicion farmaceutica. De acuerdo con un modo de realizacion, una composicion farmaceutica como se divulga en el presente documento comprende asi un conservante. Ejemplos de dichos conservantes incluyen cloruro de benzalconio, acido benzoico, hidroxianisol butilado, parabenos, tales como butilparabeno, propilparabeno, etilparabeno, metilparabeno y mezclas de los mismos, fenoxietanol, alcohol feniletilico o acido sorbico. Una composicion farmaceutica que comprende un conservante puede ser mas adecuada para el almacenamiento. Ademas, una composicion farmaceutica como se divulga en el presente documento se puede esterilizar, tal como mediante esterilizacion por calor o mediante filtracion esteril.

La composicion farmaceutica como se divulga en el presente documento tambien puede comprender ademas otros excipientes farmaceuticamente aceptables, tales como antioxidantes, agentes de isotonicidad adicionales, agentes colorantes y similares.

En modos de realizacion relacionados con composiciones farmaceuticas acuosas, la composicion puede comprender agentes de suspension y estabilizantes, tales como tensioactivos no ionicos, polimeros hidrofilos y similares.

De acuerdo con un modo de realizacion, una composicion farmaceutica como se divulga en el presente documento puede comprender un agente espesante. Tipicamente, una composicion farmaceutica que se ha de espesar es acuosa. Se pueden emplear agentes espesantes para crear una solucion espesa, gel, jarabe, crema o unguento. Para formar una solucion espesa o gel se puede emplear un material formador de hidrogel. Dicho

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material formador de hidrogel se puede seleccionar del grupo que consiste en polimeros sinteticos, polimeros semisinteticos y gomas naturales.

Los ejemplos de polimeros sinteticos incluyen alcohol polivinilico, polivinilpirrolidona, acido poliacrilico, polietilenglicol, copolimeros de bloques de poloxamero. Los ejemplos de polimeros semisinteticos incluyen eteres de celulosa, tales como carboximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y etilhidroxietilcelulosa. Los ejemplos de gomas naturales incluyen goma arabiga, alginato, carragenano, quitosano, pectina, almidon, goma de xantano.

Una solucion espesa o gel se puede hacer mucoadhesiva empleando materiales tales como acido hialuronico y sus derivados, acidos poliacrilicos reticulados del tipo carbomero y policarbofilo, y polimeros que forman facilmente geles, que se sabe que se adhieren fuertemente a las membranas mucosas.

De acuerdo con un modo de realizacion, una composicion farmaceutica como se divulga en el presente documento puede comprender un copolimero de bloques del tipo poloxamero. Es ventajoso usar el copolimero de bloques del tipo poloxamero, tal como polimeros que comprenden bloques de polietilenglicol y polipropilenglicol, ya que ciertos poloxameros dispersados en agua son termorreversibles. Ejemplos de poloxameros termorreversibles son el poloxamero 188 y el poloxamero 407.

Los poloxameros termorreversibles dispersados en agua tienen una baja viscosidad, pero exhiben un marcado aumento de la viscosidad a temperaturas elevadas, dando como resultado la formacion de un gel a temperatura corporal. De ese modo, el tiempo de contacto de una formulacion farmaceutica administrada en la cornea relativamente caliente se puede prolongar. Por consiguiente, un modo de realizacion de la invencion se refiere a una composicion farmaceutica como se divulga en el presente documento que es termorreversible.

De acuerdo con un modo de realizacion, una composicion farmaceutica como se divulga en el presente documento puede comprender un compuesto antivirico adicional. Los ejemplos de tales compuestos incluyen N- clorotaurina y povidona yodada (PVP-I).

La N-clorotaurina (C1-HN-CH2-CH2-SO3H) es un agente antimicrobiano endogeno. Es un compuesto de cloro activo suave producido por granulocitos y monocitos durante la explosion oxidativa. Debido a su mecanismo de reaccion inespecifico, esto es, la oxidacion de grupos amino, compuestos tio y aromaticos, tiene una actividad microbicida de amplio espectro similar a los antisepticos. Se ha demostrado que la solucion de sal de sodio de N- clorotaurina (C1-HN-CH2-CH2-SO3Na) mata bacterias y hongos in vitro. Ademas, se ha demostrado un efecto viricida. La povidona yodada es un complejo quimico estable de polivinilpirrolidona (povidona, PVP) y yodo elemental.

De acuerdo con un modo de realizacion, una composicion farmaceutica como se divulga en el presente documento puede comprender un compuesto antivirico adicional, en el que dicho compuesto antivirico es un compuesto util para tratar topicamente infecciones causadas por herpes. Los ejemplos de dichos compuestos incluyen los analogos de guanosina aciclovir, valaciclovir, penciclovir y famciclovir, y foscarnet (fosfonoformiato de sodio hexahidratado).

De acuerdo con un modo de realizacion, una composicion farmaceutica como se divulga en el presente documento puede comprender un anestesico local. Dado que la QCE puede ser una enfermedad muy dolorosa, puede ser ventajoso incluir un anestesico local para aliviar el dolor. Ademas, dicho alivio del dolor puede tener la ventaja de alentar al paciente a continuar el tratamiento, aunque la administracion en si misma pueda ser dolorosa. Ademas, el uso de un anestesico local con un inicio rapido puede permitir que el paciente abra realmente el ojo para permitir una administracion adicional de la composicion directamente en la cornea. Los ejemplos de anestesicos locales utiles incluyen lidocaina, prilocaina y ropivacaina.

Terapia

De acuerdo con otro modo de realizacion, un derivado tri- o tetravalente de acido sialico, o una composicion farmaceutica, como se divulga en el presente documento se puede usar en terapia

Tratamiento de infecciones oculares

Como ya se ha divulgado anteriormente, se descubrio que los derivados tri- o tetravalentes de acido sialico como se divulgan en el presente documento inhiben la union de AdVH-37 a celulas corneales humanas.

Por consiguiente, un modo de realizacion de la invencion se refiere a un derivado tri- o tetravalente de acido sialico o una composicion farmaceutica, como se divulga en el presente documento, para uso en el tratamiento y/o la prevencion de una infeccion ocular causada por un virus, en la que virus que se une a residuos sialicos terminales. presente en la superficie celular de la celula que va a resultar infectada por dicho virus.

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De forma similar, un modo de realizacion de la invencion se refiere al uso de un derivado tri- o tetravalente de acido sialico o una composicion farmaceutica, como se divulga en el presente documento, para la fabricacion de un medicamento para uso en el tratamiento y/o la prevencion de una infeccion ocular causada por virus, en la que el virus se une a residuos terminales de acido sialico presentes en la superficie celular de la celula que va a resultar infectada por dicho virus. Tambien se divulga un procedimiento de prevencion y/o tratamiento de una infeccion ocular causada por un virus, en la que el virus se une a residuos terminales de acido sialico presentes en la superficie celular de la celula que va a resultar infectada por dicho virus, tal como QCE, que comprende administrar a un mamifero, incluido el hombre, que necesita dicha prevencion y/o tratamiento una cantidad terapeuticamente eficaz de un derivado tri- o tetravalente de acido sialico como se divulga en el presente documento o una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de un derivado tri- o tetravalente de acido sialico como se divulga en el presente documento . Preferentemente, dicho derivado tri- o tetravalente de acido sialico o composicion farmaceutica se administra en el ojo en dicho procedimiento.

Los ejemplos de virus que se unen a residuos terminales de acido sialico presentes en la superficie de la celula y que permiten la infeccion de dichas celulas para causar infecciones, tales como infecciones oculares, incluyen AdVH-8, AdVH-19, AdVH-37, AdVH-53, AdVH-54 y AdVH-56. Los ejemplos de adenovirus que causan infecciones oculares al unirse a residuos terminales de acido sialico presentes en la superficie celular incluyen AdVH-8, AdVH-19 y AdVH-37, siendo AdVH-37 un ejemplo tipico.

De acuerdo con un modo de realizacion, la infeccion ocular que se debe tratar y/o prevenir mediante el uso del presente derivado tri- o tetravalente de acido sialico o composicion es la queratoconjuntivitis epidemica (QCE).

Una composicion farmaceutica de acuerdo con los modos de realizacion de la presente invencion se puede administrar a un paciente en una dosis farmaceuticamente eficaz. Por "dosis farmaceuticamente eficaz" se quiere decir una dosis que sea suficiente para producir los efectos deseados en relacion con la afeccion para la que se administra. La dosis exacta puede depender de la actividad del derivado tri- o tetravalente de acido sialico, de la forma de administracion, la naturaleza y la gravedad del trastorno y/o enfermedad y de las afecciones generales, tales como la edad y el peso corporal del paciente.

De acuerdo con un modo de realizacion, una composicion farmaceutica como se divulga en el presente documento se debe administrar una o varias veces al dia. Tipicamente, dicha composicion farmaceutica se administrara tres veces al dia, aunque tambien se puede usar otro regimen de dosificacion.

Cuando se usa en el presente documento, "prevenir/prevencion" no se deben interpretar en el sentido de que una afeccion y/o una enfermedad nunca pueda volver a ocurrir despues del uso de un compuesto o composicion farmaceutica de acuerdo con las modos de realizacion divulgados en este documento para lograr la prevencion. Ademas, el termino tampoco se debe interpretar en el sentido de que una condicion no pueda ocurrir, al menos en cierta medida, despues de dicho uso para evitar dicha condicion. Por el contrario, "prevenir/prevencion" significan que la condicion que se debe prevenir, si se produce a pesar de dicho uso, sera menos grave que sin dicho uso.

De acuerdo con un modo de realizacion, el tratamiento tambien abarca el tratamiento previo, es decir, el tratamiento profilactico.

Observaciones generales

Aunque la presente invencion se ha descrito anteriormente con referencia a modos de realizacion ilustrativos especificos, no se pretende que este limitada a la forma especifica expuesta en el presente documento. Se debe apreciar que cualquier combinacion de los modos de realizacion mencionados anteriormente esta dentro del alcance de la invencion. Por el contrario, la invencion esta limitada unicamente por las reivindicaciones adjuntas, y otros modos de realizacion ademas de los especificos anteriores son igualmente posibles dentro del alcance de estas reivindicaciones adjuntas.

En las reivindicaciones, el termino "comprende/comprendiendo" no excluye la presencia de otros elementos o etapas. Adicionalmente, aunque se pueden incluir caracteristicas individuales en diferentes reivindicaciones, estas posiblemente se pueden combinar de forma ventajosa, y la inclusion en diferentes reivindicaciones no implica que una combinacion de caracteristicas no sea viable y/o ventajosa. Ademas, las referencias singulares no excluyen una pluralidad. Los terminos "uno", "una", "primero", "segundo", etc. no excluyen una pluralidad. Las frases "al menos uno" o "uno o mas" se refieren a 1 o a un numero mayor que 1, como a 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.

Parte experimental

Los siguientes ejemplos son meros ejemplos y de ninguna manera se deben interpretar como limitantes del alcance de la invencion. Mas bien, la invencion esta limitada solo por las reivindicaciones adjuntas.

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Breve descripcion de Ios dibuios

Figuras 1a, 2a y 2b: Efecto del conjunto de derivados trivalentes de acido sialico sobre la union de AdVH-37 y la infeccion de celulas ECH - Union de virion en presencia de inhibidores a diferentes concentraciones (los datos se presentan como % de control que es el valor obtenido en ausencia de inhibidor) .

Figuras 1b, 3a y 3b: Efecto del conjunto de derivados trivalentes de acido sialico sobre la union de AdVH-37 y la infeccion de celulas ECH - Infeccion a diferentes concentraciones de los inhibidores (los datos se presentan como % de control que es el valor obtenido en ausencia de inhibidor).

Procedimientos quimicos generales

Los espectros de 1H-RMN y 13C-RMN se registraron con un espectrometro Bruker DRX-400 a 400 MHz y 100 MHz, respectivamente. Los experimentos de RMN se realizaron a 298 K en CDCh (pico del disolvente residual = 7,26 ppm (SH)), CD3OD (pico del disolvente residual = 3,31 ppm (SH) y 49,00 ppm (SC)) y D2O (pico del disolvente residual = 4,79 ppm (SH)).

LC-MS se llevo a cabo con un sistema Waters LC equipado con una columna Xterra C18 (50 x 19 mm, 5 pm, 125 A), eluida con un gradiente lineal de CH3CN en agua, ambos conteniendo acido formico (0,2 %). Se utilizo un caudal de 1,5 ml/min y la deteccion se realizo a 214 nm. Los espectros de masas se obtuvieron en un Waters Micromass ZQ 2000 usando ionizacion por electronebulizacion positiva y negativa.

Se realizaron separaciones de HPLC semipreparativa en un sistema de HPLC Gilson, usando una columna Nucleodur C-18 HTEC de 5 pm (VP 250/21) con un caudal de 20 ml/min, deteccion a 214 nm y sistema de eluyente: A. CF3COOH ac. al 0,005 % en agua, y B. CF3COOH al 0,005 % en CH3CN.

La cromatografia en columna se realizo sobre gel de silice (Merck, 60 A, ASTM 70-230 mesh). La cromatografia en capa fina (TLC) se realizo sobre gel de silice 60 F254 (Merck) con deteccion bajo luz UV y/o desarrollo con H2SO4 al 5 % en EtOH y calor.

Las rotaciones opticas se midieron con un polarimetro Perkin-Elmer 343 a 20 0C. Los disolventes organicos se secaron usando un sistema Glass Contour Solvent Systems (SG Waters USA), excepto el CH3CN y el MeOH que se secaron sobre tamices moleculares 3 A.

Todos los reactivos comerciales se usaron tal como se recibieron.

El compuesto denominado ME0322 se sintetizo de acuerdo con el procedimiento publicado (vease Spjut et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 6519). Todos los compuestos diana eran > 95 % puros de acuerdo con la presencia de trazas en HPLC y UV. Las estadisticas se calcularon utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc, La Jolla, CA).

Procedimientos sinteticos

General

Los compuestos de la presente invencion se pueden obtener proporcionando acido sialico con un conector, tipicamente un conector alquileno, que tiene un grupo terminal reactivo, esto es, un grupo azida (vease el compuesto representado a la izquierda a continuacion) o grupo etino (vease el compuesto representado a la derecha a continuacion).

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Al permitir que el acido sialico proporcionado con un grupo terminal reactivo reaccione con un resto central que tiene 3 o 4 grupos reactivos, es decir, restos de azida o etino, en una cicloadicion de Huisgen de azida-alquino, tipicamente en presencia de cobre (I) que actua como catalizador, se pueden obtener los compuestos de la presente invencion. Como reconocera facilmente el experto, puede ser ventajoso, o incluso necesario, proteger diversos grupos en diversas etapas de la sintesis. El experto esta familiarizado con los grupos que se utilizaran.

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Uso de tripropargilamina como resto central

La ruta para obtener acidos sialicos trivalentes W-acilo no modificados, tal como Tris((acido (1-(2-O-(5-N- acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil6nico))-2-oxoetil-1 H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amina (ME0385) y Tris((acido 1 -(2-O-(5-N-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil6nico))-3- oxopropil-1 H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amina (ME0386), result6 sencilla y se podria lograr en ocho etapas a partir de productos quimicos comercialmente disponibles o en cinco etapas a partir del intermedio clave 1 (esquema 1). La sintesis del derivado de tiofenilo del acido sialico 1, preparado facilmente a partir de acido sialico comercial, se realiz6 conforme a los procedimientos publicados (Marra et al., Carbohydr. Res. 1989, 187, 35). A continuaci6n, se accedi6 a los sial6sidos 3a y 3b mediante una buena conversi6n por glicosilaci6n del alcohol correspondiente (2-bromoetanol y 3-bromopropan-1-ol, respectivamente) con el compuesto 1. El uso de otros bromoalcoholes proporcionaria componentes basicos con conectores de otras longitudes. La reacci6n produjo una mezcla inseparable de an6meros, junto con el producto de eliminaci6n resultante, que no se purifico adicionalmente en esta etapa. Los derivados de bromo 3a y 3b se convirtieron facilmente en sus analogos azido 5a y 5b. La posterior 0-desacilaci6n usando condiciones de Zemplen estandar proporcion6 7a y 7b anomericamente puros con un rendimiento de un 40 % y 58 %, respectivamente, en tres etapas. A continuaci6n, los compuestos 7a y 7b se hicieron reaccionar con tripropargilamina en una reacci6n de cicloadici6n de azida-alquino catalizada por cobre (reacci6n de "clic"). Asi, los esteres metilicos 9a y 9b se obtuvieron con un rendimiento de un 51 % y 45 %, respectivamente. La posterior saponificaci6n proporcion6 los compuestos diana finales ME0385 y ME0386 con un rendimiento de un 76 % y 41 %, respectivamente.

El uso de otros derivados de etino distintos de la tripropargilamina en la cicloadici6n de azida-alquino catalizada por cobre permitiria acceder a otros tipos de derivados tri- o tetravalentes de acido sialico.

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Esquema l.a Sintesis de ME0385 y ME0386

“Reactivos y condiciones: (a) i: tamiz molecular 3A, 2-bromoetanol o 3-bromopropan-l-ol, CH3CN/CH2C12 (3:2), t.a., 2 h; ii: AgOTf IBr, -73 °C, 4,5 h; Hi: DIPEA, -73 °C, 30 min. (b) NaN3, TBAI, DMSO, t.a. (c) i: NaOMe, MeOH, t.a., 3 h; ii: resina de intercambio de iones H+. (d) Tripropargilamina, CuS04, ascorbato de sodio, THF/H20 (1:1), 50 °C, 3 h seguido de t.a., 18 h. (e) i: LiOH, MeOH, t.a., 9 h; ii: resina de intercambio de iones H+.

Los acidos sialicos trivalentes W-modificados Tris((acido 1-(2-O-(5-N-propanoilamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D- galacto-2-nonulopiranosil6nico))-2-oxoetil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amina ME0408 y Tris((acido 1-(2-O-(5-N- propanoilamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil6nico))-3-oxopropil-1 H-1,2,3-triazol-4- il)metil)amina ME0407 se podrian producir en 13 etapas a partir de acido sialico disponible comercialmente o 5 etapas a partir del intermedio clave 2 (esquema 1). La sintesis del compuesto 2 se realiz6 de acuerdo con los procedimientos publicados (Johansson et al., J. Med. Chem. 2009, 52, 3666). Las siguientes etapas fueron analogas a la ruta sintetica descrita anteriormente para los compuestos ME0385 y ME0386. Por lo tanto, las sucesivas reacciones de glicosilaci6n, formaci6n de azida y O-desacilaci6n proporcionaron los productos anomericamente puros 8a y 8b con un rendimiento de un 46 % y 55 % en tres etapas, respectivamente. La

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reaccion de "olio" posterior proporciono los compuestos trivalentes 10a y 10b con un rendimiento de un 50 % y 34 %, respectivamente. Finalmente, la saponificacion de los esteres metilicos 10a y 10b dio los productos diana ME0408 y ME0407 con buenos rendimientos.

Procedimiento general para la reaccion de glicosilacion.

El donador de glicosilo 1 o 2 (1,0 equiv.) y tamices moleculares de 3 A recien triturados (1,5 g/mmol) se disolvieron/suspendieron en una mezcla de CH3CN/CH2Cl2 (3:2; 35 ml/mmol) a temperatura ambiente y bajo atmosfera de nitrogeno Se anadio 2-bromoetanol o 3-bromopropan-1-ol (4,5 equiv.) y la mezcla se agito durante 2 h. La reaccion se protegio de la luz y se anadio una solucion de triflato de plata (2,0 equiv.) en CH3CN. La mezcla se enfrio a -73 0C (-70 0C < t < -75 0C) y se anadio IBr (1,4 equiv., 1 M en CH2Cb). La reaccion se dejo avanzar durante 4,5 h a -73 °C. Una vez completada la reaccion, se agrego DIPEA (6,0 equiv.). La mezcla de reaccion se agito durante 30 min adicionales a -73 °C y luego se dejo atemperar hasta temperatura ambiente. La mezcla se filtro a traves de una almohadilla de Celite®, se lavo con CH2Cl2 o CH3CN y los disolventes se concentraron a sequedad.

(2-Bromoetoxi-(5-N-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetil-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil))onato de metilo (3a). El compuesto 3a se sintetizo siguiendo el procedimiento general para la reaccion de glicosilacion. La purificacion por cromatografia en columna (gradiente n-heptano/EtOAc) proporciono el compuesto 3a y el correspondiente anomero inverso. El compuesto 3a se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional.

(3-Bromo-propiloxi-(5-N-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetil-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2- nonulopiranosil))onato de metilo (3b). El Compuesto 3b se sintetizo siguiendo el procedimiento general para la reaccion de glicosilacion. La purificacion por cromatografia en columna (gradiente n-heptano/EtOAc) proporciono el compuesto 3b y el correspondiente anomero inverso. El compuesto 3b se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional.

(2-Bromoetoxi-(5-N-propanoilamido-4,7,8,9-tetra-O-acetil-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2- nonulopiranosil))onato de metilo (4a). El compuesto 4a se sintetizo siguiendo el procedimiento general para la reaccion de glicosilacion. La purificacion por cromatografia en columna (Tolueno/EtOH, 10:1) proporciono el compuesto 4a y el correspondiente anomero inverso (390 mg, 95 %: a/p (6:1)). El compuesto 4a se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional.

(3-Bromo-propiloxi-(5-N-propanoilamido-4,7,8,9-tetra-O-acetil-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2- nonulopiranosil))onato de metilo (4b). El compuesto 4b se sintetizo siguiendo el procedimiento general para la reaccion de glicosilacion. La purificacion por cromatografia en columna (Tolueno/EtOH, 8:1) proporciono el compuesto 4b y el correspondiente anomero inverso (400 mg, 98%: a/p (22:3)). El compuesto 4b se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional.

Procedimiento general para la sintesis de derivados de azido.

A los derivados de bromo (1,0 equiv.) disueltos en DMSO (40 ml/mmol) se anadio sucesivamente azida sodica en porciones (6,0 equiv.) y TBAI (2,0 equiv.). La reaccion se dejo avanzar durante 6 h a temperatura ambiente y bajo atmosfera de nitrogeno. Una vez completada la reaccion, la mezcla se diluyo con CH2Cl2, se lavo con agua y salmuera, se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro a sequedad.

(2-Azidoetoxi-(5-N-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetil-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil))onato de metilo (5a). El compuesto 5a se sintetizo siguiendo el procedimiento general para la sintesis de derivados de azido. La purificacion por cromatografia en columna (CH2Cl2/MeOH, 95:5) proporciono el compuesto 5a y el correspondiente anomero inverso (a/p (5:1)). El compuesto 5a se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional.

(3-Azido-propiloxi-(5-N-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetil-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2- nonulopiranosil))onato de metilo (5b). El compuesto 5b se sintetizo siguiendo el procedimiento general para la sintesis de derivados de azido. La purificacion por cromatografia en columna (CH2Cl2/MeOH, 95:5) proporciono el compuesto 5b y el correspondiente anomero inverso (a/p (n.d.)). El compuesto 5b se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional.

(2-Azidoetoxi-(5-N-propanoilamido-4,7,8,9-tetra-O-acetil-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2- nonulopiranosil))onato de metilo (6a). El compuesto 6a se sintetizo siguiendo el procedimiento general para la sintesis de derivados de azido. La purificacion por cromatografia en columna (tolueno/CH2Cl2/MeOH, 10:2:0,5) proporciono el compuesto 6a y el correspondiente anomero inverso (366 mg, cuantitativo; a/p (6:1)). El compuesto 6a se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional.

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Procedimiento general para la O-desacilacion de sialosidos.

A sialosido peracilado (1,0 equiv.) disuelto en MeOH (70 ml) se le anadio metoxido de sodio (3,9 equiv.). La reaccion se dejo avanzar durante 3 ha temperatura ambiente y bajo atmosfera de nitrogeno. Una vez completada la reaccion, la solucion se neutralizo por adicion gota a gota de AcOH glacial o por Amberlyst® 15. El disolvente se concentro entonces a sequedad.

(2-Azidoetoxi-(5-N-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil))onato de metilo (7a). El compuesto 7a se sintetizo siguiendo el procedimiento general para la O-desacilacion de sialosidos. La purificacion por cromatografia en columna (EtOAc/EtOH/H2O, 4:1:0,1) proporciono el compuesto 7a (256 mg, rendimiento de un 46 % en tres etapas).

1H-RMN (400 MHz, CD3OD): 8 3,93-4,02 (m, 1H, -OCH2b-), 3,85 (s, 3H, OCH3), 3,80-3,84 (m, 2H, H-8, H-9b),

3.77 (t, J54 « J56 = 10,2 Hz, 1H, H-5), 3,60-3,73 (m, 3H, H-4, H-9a, -OCH2a-) , 3,58 (dd, J65 = 10,7 y J^ = 1,8 Hz, 1H, H-6), 3,51 (dd, J/.e = 8,7 y J6J = 1,8 Hz, 1H, H-7), 3,27-3,43 (m, 2H, -CH2N3), 2,72 (dd, J3eq,3ax = 12,8 y J3eq,4 = 4,6 Hz, 1H, H-3eq), 2,00 (s, 3h , COCH3), 1,77 (dd, J3eq,3ax = 1 2,8 y J3ax,4 = 11,8 Hz, 1 H, H-3ax).

13C-RMN (100 MHz, CD3OD): 8 175,22, 170,71, 100,20, 75,05, 72,37, 70,18, 68,49, 64,74, 64,47, 53,79, 53,42, 51,74, 41,57, 22,66.

ESI-MS m/z calculado para C14H26N4O9 (M+H)+ 392,15 y CuH25N4NaOg (M+Na)+ 415,14; encontrados 392,56 y 415,31, respectivamente.

(3-Azido-propiloxi-(5-N-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil))onato de metilo (7b). El compuesto 7b se sintetizo siguiendo el procedimiento general para la O-desacilacion de sialosidos. La purificacion por cromatografia en columna (EtOAc/EtOH/H2O, 4:1:0,1) proporciono el compuesto 7b (289 mg, rendimiento de un 55 % en tres etapas).

1H-RMN (400 MHz, CD3OD): 8 3,80-3,92 (m, 6H, -OCH2b-, H-9b, H-8, OCH3), 3,77 (t, Jb,4 « J5.6 = 10,2 Hz, 1H, H- 5), 3,61-3,69 (m, 2H, H-9a, H-4), 3,59 (dd, JS5 = 10,3 y Jay = 2,0 Hz, 1H, H-6), 3,51 (dd, J78 = 9,2 y Jay = 1,9 Hz, 1H, H-7), 3,43-3,50 (m, 1H, OCH2a-), 3,38 (t, J = 6,6 Hz, 2H, -CH2N3), 2,68 (dd, J3eq,3ax = 12,8 y J3eq,4 = 4,7 Hz, 1H, H-3eq), 2,00 (s, 3H, COCH3), 1,75-1,85 (m, 2H, -CH2-), 1,74 (dd, Jaeq,3ax = 12,8 y J5ax,4 = 11,8 Hz, 1H, H-3ax).

13C-RMN (100 MHz, CD3OD): 8 175,22, 171,06, 100,21, 74,97, 72,45, 70,20, 68,52, 64,71, 62,09, 53,83, 53,38, 48,98, 41,69, 30,14, 22,65.

ESI-MS m/z calculado para C15H26N4O9 (M+H)+ 407,17 y C15H25N4NaO9 (M+Na)+ 429,16; encontrados 406,87 y 428,56, respectivamente.

(2-Azidoetoxi-(5-N-propanoilamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil))onato de metilo (8a). El compuesto 8a se sintetizo siguiendo el procedimiento general para la O-desacilacion de sialosidos. La purificacion por cromatografia en columna (tolueno/CH2Cl2/MeOH, 3,5:6:0,5 a 3:6:1) proporciono el compuesto 8a (120 mg, 46 % de rendimiento en tres etapas).

1H-RMN (400 MHz, CD3OD): 8 3,94-4,00 (m, 1H, -OCH2b-), 3,85 (s, 3H, OCH3), 3,80-3,84 (m, 2H, H-8, H-9b),

3.77 (t, J5,4 « J5,6 = 10,4 Hz, 1H, H-5), 3,67-3,72 (ddd, J4,3ax = 11,6, J5,4 = 10,4, J4,3eq = 4,6 Hz, 1H, H-4), 3,60-3,66 (m, 2H, H-9a, -OCH2a-), 3,57 (dd, JS5 = 10,2 y Je7 = 1,6 Hz, 1H, H-6), 3,49 (dd, J78 = 8,9 y Je7 = 1,6 Hz, 1H, H-7), 3,32-3,35 (m, 1H, -CH2bNa), 2,72 ( dd, J3eq,3ax = 1 2,8 y J3eq,4 = 4,6 Hz, 1H, H-3eq), 2,27 (q, J = 7,6 Hz, 2H, - COCH2-), 1,76 (dd, J3eq,3ax = 12,8 y J3ax,4 = 11,6 Hz, 1H, H-3ax), 1,14 (t, J = 7,6 Hz, 3H, -COCH2).

13C-RMN (100 MHz, CD3OD): 8 179,01, 170,73, 100,19, 75,09, 72,36, 70,17, 68,40, 64,72, 64,47, 53,64, 53,43, 51,73, 41,64, 30,16, 10,28.

ESI-MS m/z calculado para C15H27N4O9 (M+H)+ 407,18 y C15H26N4NaO9 (M+Na)+ 429,16; encontrados 407,09 y 429,02, respectivamente.

(3-Azido-propiloxi-(5-N-propanoilamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil))onato de metilo (8b). El compuesto 8b se sintetizo siguiendo el procedimiento general para la O-desacilacion de sialosidos. La

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purificacion por cromatografia en columna (tolueno/CI-bCb/MeOH, 3,5:6:0,5 a 3:6:1) proporciono el compuesto 8b (157 mg, 55 % de rendimiento en tres etapas).

1H-RMN (400 MHz, CD3OD): 8 3,80-3,89 (m, 3H, -OCH2b-, H-9b, H-8), 3,84 (s, 3H, OCH3), 3,76 (t, J54 « J56 = 10,2 Hz, 1H, H-5), 3,60-3,69 (m, 2H, H-9a, H-4), 3,58 (dd, J65 — 10,2 y J;7 = 1,6 Hz, 1H, H-6), 3,49 (dd, J7,8 = 8,9 y J6J — 1,6 Hz, 1H, H-7), 3,43-3,50 (m, 1H, OCH2a-), 3,38 (t, J = 6,6 Hz, 2H, -CH2N3), 2,68 (dd, J3eq,3ax — 1 2,8 y J3eq,4 = 4,6 Hz, 1H, H-3eq), 2,27 (q , J — 7,6 Hz, 2H, -COCH2-), 1,75-1,83 (m, 2H, -CH2-), 1,74 (dd, J3eq,3ax — 12,8 y J3ax,4 = 11,8 Hz, 1H, H-3ax), 1,13 (t, J = 7,6 Hz, 3H, COCH2CH3).

13C-RMN (100 MHz, CD3OD): 8 178,99, 171,08, 100,20, 75,01, 72,43, 70,18, 68,42, 64,69, 62,07, 53,68, 53,39, 48,78, 41,76, 30,16, 30,13, 10,28.

ESI-MS m/z calculado para C16H29N4O9 (M+H)+ 421,19 y C16H2sN4NaO9 (M+Na)+ 443,18; encontrados 420,99 y 442,93, respectivamente.

Procedimiento general para la sintesis de acido sialico trivalente.

Al derivado de azido (3,7 equiv.) disuelto en THF/H2O (1:1, 81 ml/mmol) se anadio sucesivamente tripropargilamina (1,0 equiv.), CuSO4 (0,9 equiv.) y ascorbato de sodio (0,9 equiv.). La reaccion se dejo avanzar a 50 0C durante 3 h y a temperatura ambiente durante 18 h adicionales. Despues del consumo completo de la azida de partida, el THF se evaporo a vacio y el bruto se liofilizo. El solido bruto se disolvio en DMSO y se purifico por HPLC (A: CF3COOH ac. al 0,005 % en H2O, B: CF3COOH ac. al 0,005 % en CH3CN, gradiente de fase organica de un 7 % a un 25 %). Las fracciones recogidas que contenian el compuesto se liofilizaron para proporcionar el producto puro.

Tris((1-(2-O-((metil-(5-N-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil)onato))-2-oxoetil-1 H-

1.2.3- triazol-4-il)metil)amina (9a). El compuesto 9a se sintetizo siguiendo el procedimiento general para la sintesis de acido sialico trivalente (40 mg, 51 % de rendimiento).

1H-RMN (400 MHz, CD3OD): 8 8,08 (s, 3H, 3ArCH), 8,01 (d, Js.nh = 8,4 Hz, 3H, 3NH), 4,60 (t, J — 5,0 Hz, 6H, 3- CH2-ArN), 4,15-4,27 (m, 3H, 3-OCH2b), 3,70-3,97 (m, 27H, 3-OCH2a, 3H-9b, -N(CH2)3, 3H-8, 3H-5, 3-OCH3), 3,553,67 (m, 9H, 3H-4, 3H-9b, 3H-6), 3,48 (dd, J/e = 8,8 y Jay = 1,4 Hz, 3H, H-7), 2,58 (dd, J3eq3ax = 12,8 y J3eq,4 = 4,7 Hz, 3H, 3H-3eq), 1,99 (s, 9H, 3-COCH3), 1,71 (dd, J3eq,3ax = 12,8 y J3ax,4 = 11,7 Hz, 3H, 3H-3ax).

13C-RMN (100 MHz, CD3OD): 8 175,12, 170,47, 144,25, 126,94, 100,28, 75,07, 72,25, 70,16, 68,40, 64,84, 63,91, 53,68, 53,55, 51,47, 48,73, 41,44, 22,70.

ESI-MS m/z calculado para C51H82N13O27 (M+H)+ 1308,54; encontrado 1309,47.

Tris((1-(2-O-(metil-(5-N-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil)onato))-3-oxopropil-1 H-

1.2.3- triazol-4,1-il)metil)amina (9b). El compuesto 9b se sintetizo siguiendo el procedimiento general para la sintesis de acido sialico trivalente (60 mg, 45 % de rendimiento).

1H-RMN (400 MHz, CD3OD): 8 8,01 (s, 3H, 3ArCH), 4,50 (t, J — 6,6 Hz, 6H, 3-CH2-ArN), 3,70-3,88 (m, 27H, 3- OCH2b-, 3H-9b, 3-OCH3, -N(CH2)3, 3H-8, 3H-5), 3,54-3,69 (m, 9H, 3H-4, 3H-9b, 3H-6), 3,49 (dd, J78 — 9,0 y Jei — 1,3 Hz, 3H, 3H-7), 3,35-3,43 (m, 3H, 3-OCH2a), 2,68 (dd, J5eq 3ax = 12,8 y J5eq 4 = 4,7 Hz, 3H, 3H-3eq), 2,092,20 (m, 6H, 3-CH2-), 2,00 (s, 9H, 3-COCH3), 1,74 (dd , J3eq,3ax = 12,7 y J3ax,4 = 11,8 Hz, 3H, 3H-3ax).

13C-RMN (100 MHz, CD3OD): 8 175,20, 170,86, 145,26, 125,97, 100,12, 74,92, 72,43, 70,19, 68,50, 64,77, 61,77, 53,80, 53,54, 48,48, 48,10, 41,65, 31,29, 22,72.

ESI-MS m/z calculado para C54H88N13O27 (M+H)+ 1350,58; encontrado 1350,21.

Tris((1-(2-O-(metil-(5-N-propanoilamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil)onato))-2-oxoetil- 1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amina (10a). El compuesto 10a se sintetizo siguiendo el procedimiento general para la sintesis de acido sialico trivalente (60 mg, 50% de rendimiento).

1H-RMN (400 MHz, CD3OD): 8 8,04 (s, 3H, 3ArCH), 4,50 (t, J — 5,1 Hz, 6H, 3-CH2-ArN), 4,16-4,23 (m, 3H, 3- OCH2b), 3,86-3,92 (m, 3H, 3-OCH2a), 3,74-3,84 (m, 15H, 3H-9b, -N(CH2)3, 3H-8, 3H-5), 3,72 ( s, 9H, 3-OCH3), 3,59-3,67 (m, 6H, 3H-4, 3H-9b), 3,57 (dd, J65 — 10,4 y J6j — 1,3 Hz, 3H, 3H-6), 3,47 (dd, Jv8 — 8,9 y J6j — 1,3 Hz, 3H, H-7), 2,58 (dd, J3eq,3ax — 1 2,4 y J3eq,4 — 4,6 Hz, 3-, 3H-3eq), 2,25 (q, J — 7,6 Hz, 6H, 3-COCH2-), 1,74 (aparecen como t, J3eq,3ax “ J3ax,4 — 12.4 Hz, 3H, 3H-3ax), 1,12 (t, J — 7,6 Hz, 9H, 3-COCH2CH3).

13C-RMN (100 MHz, CD3OD): 8 178,88, 170,43, 145,08, 126,66, 100,23, 75,04, 72,15, 69,97, 68,29, 64,73, 63,95, 53,60, 53,45, 51,43, 49,07, 41,52, 31,15, 10,36.

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ESI-MS m/z calculado para C54H88N13O27 (M+H)+ 1350,59; encontrado 1351,56.

Tris((1-(2-O-(metil-(5-N-propanoilamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil)onato))-3-oxopropil- 1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amina (10b). El compuesto 10b se sintetizo siguiendo el procedimiento general para la sintesis de acido sialico trivalente (45 mg, 34 % de rendimiento).

1H-RMN (400 MHz, CD3OD): 8 8,03 (s, 3H, 3ArCH), 7,89 (d, Js.nh = 8,5 Hz, 3H, 3NH), 4,50 (t, J = 6,5 Hz, 6H, 3- CH2-ArN), 3,73-3,86 (m, 18H, 3-OCH2b-, 3H-9b, -N(CH2)s, 3H-8, 3H-5), 3,81 (s, 9H, 3-OCH3), 3,58-3,70 (m, 6H, 3H-4, 3H-9b), 3,56 (dd, J65 = 10,4 y Ja 7 = 1,3 Hz, 3H, 3H-6), 3,47 (dd, J7 8 = 8,9 y Ja 7 = 1,3 Hz, 3H, 3H-7), 3,353,43 (m, 3H, 3-OCH2a), 2,68 (dd, Jaeq.sax = 12,4 y Jaeq.4 = 4,6 Hz, 3H, 3H-3eq), 2,27 (q, J = 7,6 Hz, 6H, 3-COCH2-), 2,10-2,20 (m, 6H, 3-CH2-), 1,74 (aparece como t, Jaeq 3ax = J3ax 4 = 12,4 Hz, 3H, 3H-3ax), 1,13 (t, J = 7,6 Hz, 9H, 3- COCH2CH3).

13C-RMN (100 MHz, CD3OD): 8 178,92, 170,88, 143,82, 126,16, 100,12, 75,01,72,44, 70,22, 68,44, 64,72, 61,73, 53,67, 53,52, 49,28, 49,07, 41,75, 31,28, 30,17, 10,32.

ESI-MS m/z calculado para C57H94N13O27 (M+H)+ 1392,64 y C57Hg3N13NaO27 (M+Na)+ 1414,62; encontrados 1392,50 y 1414,47, respectivamente.

Procedimiento general para la saponificacion de ester metilico.

A los derivados trivalentes de ester metilico (1,0 equiv.) disueltos en MeOH (135 ml/mmol) se anadio una solucion acuosa de LiOH (1 M, 9,0 equiv.). La mezcla se dejo avanzar durante 9 h a temperatura ambiente. Una vez completada la reaccion, la mezcla de reaccion se neutralizo con Dowex 50W8 (H+). Despues de retirar la resina Dowex, el disolvente se evaporo a vacio y el producto en bruto, disuelto en agua, se eluyo en un tapon C- 18 con H2O. Las fracciones que contenian el compuesto se liofilizaron para dar un derivado de acido sialico trivalente puro.

Tris(((acido 1-(2-O-(5-N-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosilonico))-2-oxoetil-1 H-

1,2,3-triazol-4-il)metil)amina (ME0385). ME0385 se sintetizo siguiendo el procedimiento general para la

r 17120

saponificacion de ester metilico (22 mg, 76 % de rendimiento). -15,77 (c 4,8 mg/ml, H2O).

1H-RMN (400 MHz, D2O): 8 8,40 (s, 3H, 3ArCH), 4,72 (t, J = 5,2 Hz, 6H, 3-CH2-ArN), 4,60 (s.an., 6H, -N(CH2)s), 4,14-4,27 (m, 3H, 3-OCH2b), 3,93-4,02 (m, 3H, 3-OCH2a), 3,85 (dd, J9a9b = 11,7 y J9b8 = 2,3 Hz 3H, 3H-9b), 3,733,82 (m, 6H, 3H-8, 3H-5), 3,59-3,72 (m, 9H, 3H-4, 3H-6, 3H-9a), 3,56 (dd, J78 = 9,3 y Jei = 1,7 Hz, 3H, H-7), 2,66 (dd, J3eq,3ax = 12,5 y J3eq,4 = 4,6 Hz, 3H, 3H-3eq), 2,04 (s, 9H, 3-COCH3), 1,67 (aparece como t,

J3eq,3ax ~ J3ax,4 = 1 2,0 Hz, 3H, 3H-3ax).

13C-RMN (100 MHz, D2O): 8 175,05, 172,55, 135,87, 128,64, 100,05, 72,72, 71,42, 68,10, 67,88, 62,68, 62,58, 51,73, 50,57, 46,49, 39,64, 22,0. EsI-MS m/z calculado para C48H76N^O27 (M+H)+ 1266,49; encontrado 1266,29.

Tris((acido (1-(2-O-(5-N-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosilonico))-3-oxopropil-1 H-

1,2,3-triazol-4-il)metil)amina (ME0386). ME0386 se sintetizo siguiendo el procedimiento general para la

izo

saponificacion de ester metilico (27 mg, 75 % de rendimiento). L Jn -3,83 (c 3,9 mg/ml, H2O).

1H-RMN (400 MHz, D2=): 8 8,02 (s, 3H, 3ArCH), 4,45-4,64 (m, 6H, 3-CH2-ArN), 3,92 (s.an., 6H, N(CH2)s), 3,563,87 (m, 24H, 3H-9b, 3-OCH2-, 3H-8, 3H-5, 3H-4, 3H-6, 3H-9a), 3,46-3,54 (m, 3H, 3H-7), 2,73 (dd, J3eq,3ax = 12,5 y J3eq,4 = 4,7 Hz, 3H, 3H-3eq), 2,15-2,25 (m, 6H, 3-CH2-), 2,05 (s, 9H, COCH3,), 1,63 (aparece como t,

J3eq,3ax ~ J3ax,4 = 12,1 Hz, 3H, 3H-3ax).

13C-RMN (100 MHz, D2O): 8 175,05, 173,52, 142,34, 125,79, 100,48, 72,56, 71,71, 68,28, 68,16, 62,51, 61,22, 51,89, 47,54, 47,30, 40,29, 29,64, 22,02.

ESI-MS m/z calculado para C51H82N13O27 (M+H)+ 1308,54; encontrado 1308,51.

T ris((acido 1 -(2-O-(5-N-propanoilamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosilonico))-2-oxoetil-1 H-

1,2,3-triazol-4-il)metil)amina (ME0408). ME0408 se sintetizo siguiendo el procedimiento general para la

f/yl20

saponificacion de ester metilico (19 mg, 72 % de rendimiento). 1 iD -14,34 (c 4,6 mg/ml, H2O).

1H-RMN (400 MHz, D2O): 8 8,17 (s, 3H, 3ArCH), 4,64 (s.an., 6H, 3-CH2-ArN), 4,07-4,20 (m, 9H, 3-OCH2b, - N(CH2)s), 3,87-3,93 (m, 3H, 3-OCH2a), 3,82 (dd, Jga,gb = 11,7 y Jgb,8 = 2,4 Hz,, 3H, 3H-9b), 3,75 (ddd, J8J = 8,9, J8,ga = 5,6 Hz, J9b,8 = 2,4 Hz, 3H, 3H-8), 3,72 (t, Ja^ « Jsa = 10,1 Hz, 3H, 3H-5), 3,63-3,69 (m, 3H, 3H-4), 3,56-3,63

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(m, 6H, 3H-6, 3H-9a), 3,51 (dd, J/.e = 8,9 y J6J — 1,6 Hz, 3H, H-7), 2,66 (dd, J3eq,3ax — 12,3 y J3eq,4 — 4,6 Hz, 3H, 3H-3eq), 2,28 (q, J — 7,6 Hz, 6H, 3-COCH2-), 1,74 (aparece como t, J3eq 3ax “ J3ax4 — 12,3 Hz, 3H, 3H-3ax), 1,10 (t, J — 7,6 Hz, 9H, 3-COCH2CH3).

13C-RMN (100 MHz, D2O): 8 179,90, 174,12, 127,82, 101,35, 73,50, 72,50, 69,00, 68,91, 63,74, 63,40, 52,51, 51,39, 49,84, 40,87, 30,05, 10,36.

ESI-MS m/z calculado para C51H82N13O27 (M+H)+ 1308,54; encontrado 1308,44.

Tris((acido 1-(2-O-(5-N-propanoilamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil6nico) -3-oxopropil- 1H-1,2,3 -triazol-4-il)metil)amina (ME0407). ME0407 se sintetizo siguiendo el procedimiento general para la

\rrXi0

saponificacion de ester metilico (27 mg, 75 % de rendimiento). L“JD -0,76 (c 4,8 mg/ml, H2O).

1H-RMN (400 MHz, D2O): 8 8,31 (s, 3H, 3ArCH), 4,53-4,63 (m, 12H, 3-CH2-ArN, N(CHg)3), 3,82 (dd, Jgbga — 11,8 y Jgb8 — 2,4 Hz, 3H, H-9b), 3,74-3,83 (m, 12H, 3-OCHgb-, 3H-8, 3H-5), 3,67-3,73 (m, 3H, 3H-4), 3,67 (dd, J65 — 10,4 y Jay — 1,5 Hz, 3H, 3H-6), 3,60 (dd, J9a9b — 11,8 y J9a8 — 5,9 Hz, 3H, 3H-9a), 3,53 (dd, Jj8 — 8,9 y J6j — 1,5 Hz, 3H, 3H-7), 3,42-3,50 (m, 3H, 3-OCH2a), 2,69 (dd, J3eq,3ax — 1 2,4 y J3eq,4 — 4,5 Hz, 3H, 3H-3eq), 2,29 (q, J — 7,6 Hz, 6H, 3-COCH2-), 2,15-2,25 (m , 6H, 3-CH2-), 1,65 (aparece como t, Jgeq3ax » J3ax4 — 12,4 Hz, 3H, 3H-3ax), 1,11 (t, J — 7,6 Hz, 9H, 3-COCH2CH3).

13C-RMN (100 MHz, D2O): 8 178,87, 173,77, 136,66, 128,98, 100,86, 73,47, 72,34, 69,04, 68,66, 63,47, 61,82, 52,52, 48,52, 47,57, 40,83, 30,17, 30,01, 10,30.

ESI-MS m/z calculado para C54H88N13O27 (M+H)+ 1350,59; encontrado 1350,28.

Ejemplo 2

Uso de Tris(2-azidoetil)amina como resto central

La ruta para obtener acidos sialicos trivalentes N-acilo, tal como Tris((acido 4-(2-O-(5-N-acetamido-3,5-didesoxi- D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil6nico))-2-oxoetil-1H-1,2,3-triazol-1-il)etil)amina (ME0461) y Tris ((acido 4- (2-O-(5-N-acetamido-3,5-didesoxi)-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil6nico))-2-oxometil-1 H-1,2,3-triazol-1- il)etil)amina (ME0462), result6 sencilla y se podria lograr en siete etapas a partir de productos quimicas comercialmente disponibles o en cuatro etapas a partir del intermedio clave 1 (esquema 2). La sintesis del derivado de tiofenilo del acido sialico 1, preparado facilmente a partir de acido sialico comercial, se realiz6 conforme a los procedimientos publicados (Marra et al., Carbohydr. Res. 1989, 187, 35). Se accedi6 a los sial6sidos 11a y 11b en una conversi6n moderada mediante glicosilaci6n del alcohol correspondiente (alcohol propargilico y 3-butin-1-ol, respectivamente) con el compuesto 1. El uso de otros alcoholes de alquino proporcionaria componentes basicos con conectores de otras longitudes. La reacci6n produjo una mezcla inseparable de an6meros, junto con el producto de eliminaci6n resultante, que no se purific6 adicionalmente en esta etapa.

La posterior O-desacilaci6n usando condiciones de Zemplen estandar proporcion6 12a y 12b anomericamente puros con un rendimiento de un 48 % y 31 %, respectivamente, en dos etapas.

A continuaci6n, los compuestos 12a y 12b se hicieron reaccionar con Tris(2-azidoetil)amina (13) en una reacci6n de cicloadici6n de azida-alquino catalizada por cobre (reacci6n de "clic").

El derivado de Tris-azido 13 se sintetiz6 en dos etapas a partir de trietanolamina comercialmente disponible. En primer lugar, la trietanolamina se convirti6 en tris(2-cloroetil)amina conforme al procedimiento publicado (M. Sun et al., J. Am. Chem. Soc. 2012, 134(51), 20581). A continuaci6n, el derivado de cloro se convirti6 facilmente en su analogo azido 13. (Nota: 13 es altamente explosivo, por lo tanto, es fundamental almacenarlo siempre en soluci6n y en la oscuridad). Los esteres metilicos 14a y 14b se obtuvieron en un 76 % y 53 % de rendimiento, respectivamente.

La posterior saponificaci6n proporcion6 los compuestos diana finales ME0462 y ME0461 con un rendimiento cuantitativo y de un 88 %, respectivamente.

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imagen13

Esquema 2.a Smtesis de ME0462 y ME0461

“Reactivosy condiciones: (a) i: tamiz molecular 3A, 3-butin-l-ol o alcohol propargilico, CH3CN/CH2C12 (3:2), t.a., 2 h; ii: AgOTf, IBr, -73 °C, 4,5 h; iii: DIPEA, -73 °C, 30 min. (b) i: NaOMe, MeOH, t.a., 3 h; ii: resina de intercambio de iones H+. (c) CuS04, ascorbato de sodio, THF/H20 (1:1), 50 °C, 3 h seguido de t.a., 18 h. Id) i: LiOH, MeOH, t.a., 9 h; ii: resina de intercambio de iones H+.

Procedimiento general para la reaccion de glicosilacion.

El donador de glicosilo 1 (1,0 equiv.) y tamices moleculares de 3 A recien triturados (1,5 g/mmol) se disolvieron/suspendieron en una mezcla de CH3CN/CH2Cl2 (3:2; 35 ml/mmol) a temperatura ambiente y bajo atmosfera de nitrogeno Se anadio 3-butin-1-ol o alcohol propargilico (4,5 equiv.) y la mezcla se agito durante 2 h. La reaccion se protegio de la luz y se anadio una solucion de triflato de plata (2,0 equiv.) en CH3CN. La mezcla se enfrio a -73 0C (-70 0C < t < -75 0C) y se anadio IBr (1,4 equiv., 1 M en CH2Cb). La reaccion se dejo avanzar durante 4,5 h a -73 °C. Una vez completada la reaccion, se agrego DIPEA (6,0 equiv.). La mezcla de reaccion se agito durante 30 min adicionales a -73 °C y luego se dejo atemperar hasta temperatura ambiente. La mezcla se filtro a traves de una almohadilla de Celite®, se lavo con CH2Cl2 o CH3CN y los disolventes se concentraron a sequedad.

2-(Prop-2-iniloxi-(5-N-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetil-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2- nonulopiranosil))onato de metilo (11a). El compuesto 11a se sintetizo siguiendo el procedimiento general para la reaccion de glicosilacion. La purificacion por cromatografia en columna (gradiente n-heptano/EtOAc) proporciono el compuesto 11a y el correspondiente anomero inverso. El compuesto 11a se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional.

2-(But-3-iniloxi-(5-N-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetil-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil))onato de metilo (11b). El compuesto 11b se sintetizo siguiendo el procedimiento general para la reaccion de glicosilacion. La purificacion por cromatografia en columna (gradiente n-heptano/EtOAc) proporciono el compuesto 11b y el correspondiente anomero inverso. El compuesto 11b se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional.

Procedimiento general para la O-desacilacion de sialosidos.

A sialosido peracilado (1,0 equiv.) disuelto en MeOH (70 ml) se le anadio metoxido de sodio (3,9 equiv.). La reaccion se dejo avanzar durante 3 ha temperatura ambiente y bajo atmosfera de nitrogeno. Una vez completada la reaccion, la solucion se neutralizo por adicion gota a gota de AcOH glacial o por Amberlyst® 15. El disolvente se concentro entonces a sequedad.

2-(Prop-2-iniloxi-(5-N-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil))onato de metilo (12a). El compuesto 12a se sintetizo siguiendo el procedimiento general para la O-desacilacion de sialosidos. La purificacion por HPLC (A: HCOOH ac. al 0,005 % en H2O, B: HCoOh ac. al 0,005 % en CH3CN, gradiente de fase organica de un 5 % a un 20 %) proporciono el compuesto 12a (178 mg, rendimiento de un 48 % en dos etapas).

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1H-RMN (400 MHz, CD3OD): 8 4,40 (dd, J — 4,3 Hz, J — 15,9 Hz, 1H), 4,33 (dd, J — 4,3 Hz, J — 15,9 Hz, 1H), 3,813,91 (m, 5H), 3,78 (d, J — 10,3 Hz, 1H), 3,63-3,72 (m, 2H), 3,60 (dd, J — 1,5 Hz, J — 10,4 Hz, 1H), 3,52 (dd, J — 1,4 Hz, J — 9,0 Hz, 1H), 2,86 (t, J — 2,4 Hz, 1H), 2,72 (dd, J3eq4 = 4,6 Hz, Jseqsax — 12,7 Hz, 1H), 2,01 (s, 3H), 1,75 (dd, J3eq,3ax — 12,7 Hz, J3ax,4 — 11,8 Hz, 1H).

2-(But-3-iniloxi-(5-N-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil))onato de metilo (12b). El compuesto 12b se sintetizo siguiendo el procedimiento general para la O-desacilacion de sialosidos. La purificacion por cromatografia en columna(EtOAc/EtOH/H2O, 4:1:0,1) proporciono el compuesto 12b (218 mg, 31 % de rendimiento en dos etapas).

1H-RMN (360 MHz, CD3OD): 8 3,72-3,95 (m, 7H), 3,45-3,71 (m, 6H), 2,69 (dd, J3eq,4 — 4,6 Hz, J3eq,3ax — 12,8 Hz , 1H), 2,35-2,45 (m, 2H), 2,26 (t, J — 2,7 Hz, 1H) 2,00 (s, 3H), 1,73 (dd, J3eq,3ax — 12,3 Hz, J5sx,4 — 12,0 Hz, 1H).

Tris(2-azidoetil)amina (13)

Se anadio lentamente una solucion de trietanolamina (0,298 g, 2,0 mmol) en 0,5 ml de CHCl3 a una solucion de cloruro de tionilo (0,52 ml, 7,0 mmol) en 0,8 ml de CHCl3 con agitacion. Despues de la adicion, la mezcla de reaccion se calento a temperatura de reflujo durante 4 horas. Despues de enfriar a temperatura ambiente, el producto solido blanco se filtro y se lavo con diclorometano (1,0 ml x 2) para dar clorhidrato de tris(2- cloroetil)amina con un rendimiento de un 82 % (0,395 g) despues de secar a vacio durante la noche. A continuacion, se anadio clorhidrato de tris(2-cloroetil)amina (0,198 g, 0,82 mmol) y azida sodica (0,320 g, 4,92 mmol) a DMSO (7,0 ml) y la mezcla resultante se agito a 92 0C durante 22 horas. Despues de enfriar la mezcla, se vertio en agua destilada (40,0 ml) y la solucion se alcalinizo con Na2CO3 (10 % ac.) hasta pH — 10 y se extrajo con diclorometano (15,0 ml x 3). La fase organica se lavo con agua (20,0 ml) y despues se seco sobre Na2SO4. El diclorometano se concentro hasta 1 ml y luego se agregaron 15,0 ml de THF, se concentro nuevamente hasta 1,0 ml, se anadieron 15,0 ml de THF y se concentraron hasta 1,8 ml. Esta solucion de THF que contiene 0,8 mmol de tris(2-azidoetil)amina se podria usar en la siguiente etapa. (Nota: 13 es altamente explosivo, por lo tanto, es fundamental almacenarlo siempre en solucion y en la oscuridad).

1H-RMN (400 MHz, CDCh): 8 3,33 (t, J — 6,2 Hz, 6H), 2,76 (t, J — 6,2 Hz, 6H).

ESI-MS m/z calculado para C6H13N10 (M+H)+ 225,13; encontrado 225,33.

Ref.: M. Sun, C-Y. Hong, C-Y. Pan, Journal of the American Chemical Society 2012, 134(51), 20581-20584.

Tris((4-(2-O-(metil-(5-N-acetamido-S,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil)onato))-2-oxometil-1H-

1.2.3- triazol-1 -il)etil)amina (14a)

A una solucion de tris(2-azidoetil)amina (0,075 ml, 0,033 mmol) en una mezcla 1:1 de agua (1,7 ml) y THF (1,7 ml) se anadio 2-(prop-2-iniloxi-(5-N-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosilo))onato de metilo (0,0538 g, 0,149 mmol), ascorbato de sodio (5,9 mg, 0,030 mmol) y sulfato de cobre (II) (4,8 mg, 0,030 mmol) mientras se agita. La mezcla se calento primero a 50 °C durante 3,5 horas y a temperatura ambiente durante 18 horas adicionales. Despues de la evaporacion de THF a presion reducida, el residuo se diluyo hasta 2,6 ml con agua destilada y luego se purifico por HPLC preparativa (A: HCOOH al 0,005 % en H2O, B: HCOOH al 0,005 % en CH3CN, gradiente de fase organica de un 5 % a un20 % / 30 min) para dar un producto blanco con un rendimiento de un 76 % despues de la liofilizacion.

1H-RMN (400 MHz, CDC^): 8 7,78 (s, 3H), 4,92 (d, J — 12,6 Hz, 3H), 4,64 (d, J — 12,1 Hz, 3H), 4,30 (t, J — 6,2 Hz, 6H), 3,79-3,93 (m, 18H), 3,60-3,74 (m, 9H), 3,47-3,58 (m, 3H), 3,03 (t, J — 5,9 Hz, 6H), 2,67 (dd, J3eq,4 — 4,6 Hz, J3eq,3ax — 12,8 Hz, 3H), 2,00 (s, 9H), 1,74 (t, J3eq,3ax — 12,3 Hz, 3H).

13C-RMN (100 MHz, CD3OD): 8 175,05, 170,75, 145,52, 126,09, 100,06, 74,98, 72,26, 70,33, 68,53, 64,93, 58,51, 55,09, 53,71,53,59, 41,65, 22,75.

ESI-MS m/z calculado para C51H82N13O27 (M+H)+ 1308,54; encontrado 1309,13.

Tris((4-(2-O-(metil-(5-N-acetamido-S,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil)onato))-2-oxoetil-1H-

1.2.3- triazol-1 -il)etil)amina (14b)

A una solucion de tris(2-azidoetil)amina (0,113 ml, 0,05 mmol) en una mezcla 1:1 de agua (2,5 ml) y THF (2,5 ml) se anadio 2-(but-3-iniloxi-(5-N-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosilo))onato de metilo (0,0845 g, 0,225 mmol), ascorbato de sodio (8,9 mg, 0,0449 mmol) y sulfato de cobre (II) (7,2 mg, 0,0451 mmol) mientras se agita. La mezcla se calento primero a 50 °C durante 3,5 horas y a temperatura ambiente durante 18 horas adicionales. Despues de la evaporacion de THF a presion reducida, el residuo se diluyo hasta 3,0 ml con agua destilada y luego se purifico por HPLC preparativa (A: HCOOH al 0,005 % en H2O, B: HCOOH al

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0,005 % en CH3CN, gradiente de fase organica de un 5 % a un 20 % / 30 min) para dar 35,9 mg (53,2 %) de producto blanco despues de la liofilizacion.

1H-RMN (400 MHz, CD3OD): 8 8,02 (d, J — 8,5 Hz, 3H), 7,66 (s, 3H), 4,30 (t, J — 5,9 Hz, 6H), 4,06 (dt, J — 9,3 Hz, J — 6,5 Hz, 3H), 3,74-3,87 (m, 18H), 3,57-3,72 (m, 12H), 3,50 (dd, J — 1,2 Hz, J — 8,7 Hz, 3H), 3,04 (t, J — 5,7 Hz, 6H), 2,93 (t, J — 6,1 Hz, 6H), 2,65 (dd, J3eq4 = 4,6 Hz, Jseqsax = 12,7 Hz, 3H), 2,00 (s, 9H), 1,72 (t, Jseq.sax = 12,3 Hz, 3H).

13C-RMN (100 MHz, CD3OD): 8 175,16, 170,90, 146,05, 124,81, 100,22, 74,94, 72,44, 70,25, 68,52, 64,86, 64,05, 54,85, 53,80, 53,48, 41,74, 27,27, 22,72. eS|-Ms m/z calculado para C54H88N13O27 (M+H)+ 1350,59; encontrado 1351,70.

Tris((acido 4-(2-O-(5-N-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil6nico))-2-oxometil- 1H-1,2,3-triazol-1-il)etil)amina (M E0462)

El ester metilico (14a) obtenido anteriormente se disolvio en soluciones de MeOH (1,9 ml) y LiOH (0,15 ml,

1.0 M). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 44 horas, seguido de LC-MS, se neutralize con

\rf~\2Q

Amberlite IR120 hasta pH = 7,0, se concentro y se liofilizo para dar 20,2 mg de producto bianco. L“Jd -11,7 (c

1.0 mg/ml, H2O).

1H-RMN (400 MHz, D2O): 8 7,84 (s, 3H), 4,85 (d, J — 12,0 Hz, 3H), 4,61 (d, J — 12,0 Hz, 3H), 4,35 (t, J — 6,0 Hz, 6H), 3,77-3,94 (m, 9 H), 3,49-3,76 (m, 12 H), 3,04 (t, J — 6,0 Hz, 6H), 2,73 (dd, J5eq 4 = 4,5 Hz, J5eq 3ax = 12,4 Hz, 3H), 2,03 (s, 9H), 1,66 (t, J3eq,3ax — 1 2,3 Hz, 3H).

13C-RMN (100 MHz, D2O): 8 174,99, 173,20, 143,93, 125,23, 100,66, 72,64, 71,61, 68,25, 68,21, 62,58, 57,31, 52,67, 51,81,48,17, 40,23, 22,00.

ESI-MS m/z calculado para C48H76N13O27 (M+H)+ 1266,50; encontrado 1267,10.

Tris((acido 4-(2-O-(5-N-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil6nico))-2-oxoetil- 1H-1,2,3-triazol-1-il)etil)amina (ME0461)

Se disolvio metilester (25,8 mg, 14b) en soluciones de MeOH (2,5 ml) y LiOH (0,17 ml, 1,0 M). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 72 horas, seguido de LC-MS, se neutralize con Amberlite IR120, se

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concentro y se liofilizo para dar 22,0 mg (88,0 %) de producto bianco. L iD -5,3 (c 1,0 mg/ml, MeOH).

1H-RMN (400 MHz, D2O): 8 7,68 (s, 3H), 4,47 (t, J — 5,3 Hz, 6H), 3,96-4,10 (m, 3H), 3,66-3,87 (m, 18H), 3,59-3,66 (m, 3H), 3,52-3,58 (m, 3H), 3,30 (t, J — 5,3 Hz, 6H), 2,99 (t, J — 5,8 Hz, 6H), 2,63 (dd, J3eq,4 — 4,4 Hz, J3eq,3ax — 12,7 Hz, 3H), 2,03 (s, 9H), 1,67 (t, J3eq,3ax — 12,5 Hz, 3H).

13C-RMN (100 MHz, D2O): 8 175,01, 173,49, 144,82, 124,00, 100,60, 72,54, 71,68, 68,27, 68,16, 63,21, 62,55, 52,48, 51,85, 48,02, 40,20, 25,67, 22,00.

ESI-MS m/z calculado para C51H82N13O27 (M+H)+ 1308,54; encontrado 1309,29.

Evaluacion biologica Ensayo de union celular

Con el fin de investigar la eficacia de los compuestos recien sintetizados (ME0385, ME0386, ME0407, ME0408, ME0461 y ME0462) para evitar la union de viriones de AdVH-37 a celulas ECH, se llevaron a cabo ensayos de union celular basados en viriones marcados con 35S. En base a los estudios previos, el ME0322, el acido sialico y el glicano de GD1a se usaron como compuestos de referencia (Nilsson et al., N. Nat. Med. 2011, 17, 105 y Spjut et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 6519). Los ensayos se llevaron a cabo (ver a continuacion para mas detalles) esencialmente como se describio previamente (Arnberg et al., J. Virol. 2000, 74, 42 y Arnberg et al., J. Virol. 2000, 74, 7691).

En resumen, los viriones de AdVH-37 marcados con 35S se preincubaron con o sin los derivados trivalentes de acido sialico, el glicano de GD1a y el acido sialico en diversas concentraciones. Las mezclas se incubaron con celulas ECH y los viriones no unidos se lavaron. Finalmente, se conto la radiactividad asociada a celulas usando un contador de centelleo.

Los resultados mostrados en la figura 1a y 2a son muy llamativos y, por lo tanto, la union de viriones de AdVH-37 a celulas ECH se vio obstaculizada de manera drastica en presencia de los acidos sialicos trivalentes de nuevo

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diseno. De hecho, se evaluo el conjunto de nuevos compuestos y se encontro que eran mas de cuatro ordenes de magnitud mas potentes que el acido sialico monovalente (CI50 = 1,2 mM). Ademas, los nuevos compuestos trivalentes eran considerablemente mas potentes que el glicano de GD1a bivalente (CI50 = 91 pM).

Como se puede ver, ME0385, ME0386 y ME0461 son eficientes en la prevencion de la union de viriones de AdVH-37 a celulas ECH con valores de CI50 de 107 nM, 40 nM y 376 nM, respectivamente. El compuesto de partida inicial (ME0322, CI50 = 3,2 pM) resulto ser de menor potencia. Por lo tanto, se puede concluir que los compuestos de la presente invencion son superiores a los conocidos previamente en la tecnica. Se encontro ademas (vease la figura 2b) que el analogo ME0462 (CI50 = 1,4 nM) era incluso mas potente que ME0385, ME0386 y ME0461.

Por ultimo, las derivados W-acil modificados ME0407 y ME0408 con valores de CI50 de 23,4 pM y 4,5 pM, respectivamente, completaron la serie. Desafortunadamente, el aumento de la lipofilia de los ligandos en el resto W-acilo no aumento la potencia en comparacion con ME0385 y ME386, respectivamente, lo que esta respaldado por investigaciones previas (Johansson et al., J. Med. Chem. 2009, 52, 3666).

Detalles experimentales - Ensayo de union celular

Los viriones de AdVH-37 marcados con S (5 x 108/pocillo) se preincubaron en tampon de union (50 pl; BB: medio de Eagle modificado por Dulbecco que contiene BSA al 1 % (Roche AB, Estocolmo, Suecia) y HEPES (20 mM, EuroClone, Milan, Italia), pH 7,5) con o sin derivados trivalentes de acido sialico, glicano de GD1a o acido sialico en diversas concentraciones (vease la figura 1a) en una microplaca de 96 pocillos a +4 °C durante 1 h. Estas mezclas se anadieron despues a las celulas ECH presedimentadas (1 x 105/pocillo) en una microplaca de 96 pocillos. Despues de la resuspension, las mezclas se incubaron a +4 0C durante 1 h. Finalmente, los viriones no unidos se lavaron con BB y se conto la radiactividad asociada a celulas usando un contador de centelleo Wallac 1409.

Ensayo de infeccion

Con el fin de confirmar los resultados de los ensayos de union celular y evaluar adicionalmente nuestro conjunto de compuestos, se realizaron experimentos de infeccion (figuras 1b, 3a y 3b). Los ensayos se llevaron a cabo (ver a continuacion para mas detalles) esencialmente como se describio previamente ((Arnberg et al., J. Virol. 2000, 74, 42 y Arnberg et al., J. Virol. 2000, 74, 7691)).

En resumen, los viriones no marcados se preincubaron con o sin los derivados de acido sialico trivalente, glicano de GD1a o acido sialico a diversas concentraciones. Estas mezclas se anadieron a las celulas ECH y se incubaron a +4 0C. Los viriones no unidos se lavaron, las mezclas resultantes se incubaron a +37 0C y luego se obtuvo una infeccion sincronizada (todos los viriones ingresan en las celulas simultaneamente). Despues de 44 h de infeccion, las celulas se enjuagaron, se fijaron, se incubaron con anticuerpos policlonales anti-AdVH-37 de conejo antes de lavarse y tenirse. Finalmente, las celulas se lavaron y examinaron por microscopia de inmunofluorescencia.

Por lo tanto, las tendencias de los ensayos de union celular (figuras 1a, 2a y 2b) se confirmaron en los experimentos de infeccion (figuras 1b, 3a y 3b). Los compuestos ME0386 y ME0385 previnieron la infeccion de celulas ECH por viriones de AdVH-37 mas eficazmente que ME0322 con valores de CI50 de 118 nM y 166 nM, respectivamente. Se calculo en el presente documento que la mitad de la concentracion inhibidora maxima de ME0322 que se habia estimado previamente en 380 nM era de 228 nM. Ademas, ME0461 y ME0462 previnieron la infeccion de celulas ECH por viriones de AdVH-37 mas eficazmente que ME0322. Ademas, tambien en el ensayo de infeccion (vease la figura 3b), el analogo ME0462 (CI50 = 2,1 nM) fue el mas potente.

Detalles experimentales - Ensayo de infeccion

Se preincubaron 7 x 107 viriones no marcados/pocillo en placas de 48 pocillos en medio de crecimiento libre de suero (200 pE) con o sin derivados trivalentes de acido sialico, glucano GD1a o acido sialico a diversas concentraciones (vease la figura 2B) a +4 0C. Despues de 1 h, las mezclas se transfirieron a nuevas placas de 48 pocillos que contenian 1 x 105 celulas de ECH adherentes/pocillo y se incubaron a +4 °C. Despues de 1 h, los viriones no unidos se lavaron con medio de crecimiento libre de suero y las mezclas resultantes se incubaron con medio de crecimiento que contenia suero fetal bovino (FBS) al 1 % a +37 °C. Despues de 44 h de infeccion, las celulas se enjuagaron en PBS, se fijaron con metanol al 99 % frio (-20 0C) durante 10 min y se incubaron con anticuerpos policlonales anti-AdVH-37 de conejo diluidos 1:200 en PBS (pH 7,4) a temperatura ambiente. Despues de 1 h, las celulas se lavaron en PBS y se tineron con anticuerpos de cerdo anti-IgG de conejo marcados con FITC (Dako-cittomation, Glostrup, Dinamarca) diluidos 1:100 en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Finalmente, las celulas se lavaron en PBS y se examinaron en un microscopio de inmunofluorescencia (Axiovert 25, Carl Zeiss, Alemania, ampliacion 10x).

Resonancia de plasmon superficial (SPR)

Finalmente, se investigaron ME0385, ME0386 y ME0322 en experimentos de resonancia de plasmon superficial (SPR) y se determinaron sus respectivas afinidades de union (Kd) para cabezas de fibra de AdVH-37 inmovilizadas (ver a continuacion para mas detalles). Los datos de SPR corroboraron las tendencias de los 5 ensayos de union celular e infeccion celular y los tres compuestos demostraron interactuar con la cabeza de fibra de AdVH-37 en un modo de union uno a uno. Por lo tanto, se confirmo que ME0386 (Kd = 69 pM) era el que mejor interactuaba con la cabeza de fibra de AdVH-37, seguido de ME0385 y ME0322 (Kd = 76 pM y Kd = 126 pM, respectivamente). Tambien vale la pena senalar la influencia de la construccion de la cabeza de fibra de AdVH-37 en los valores de Kd. De forma similar al ensayo de union e infeccion, ME0462 tenia la mayor 10 afinidad de union (Kd = 9,5 pM).

Detalles experimentales - Resonancia de plasmon superficial

Las mediciones cineticas se realizaron utilizando un instrumento de resonancia de plasmon superficial BIAcore 15 T100. Las proteinas de cabeza de AdVH-37 se acoplaron covalentemente a un chip sensor CM5 utilizando el kit

de acoplamiento de amina (GE Healthcare), a una concentracion de 14-15 ng/mm2 (~15 000 UR). La union de los conjugados trivalentes de acido sialico ME0322, ME0385 y ME0386 a la cabeza inmovilizada se realizo en HEpES 10 mM, NaCl 0,15 M y P20 al 0,05 % a pH 7,4 (1x HBS-EP+, GE Healthcare). Las concentraciones de acido sialico trivalente utilizadas fueron 400, 200, 100, 50 (dos veces), 25, 12,5 (dos veces), 6,25, 3,125, 1,56 y 20 0,78 pM. Las afinidades de union (Kd) se calcularon usando el software de evaluacion Biacore T100.

En resumen, se ha encontrado que los compuestos de la presente invencion, tales como ME0385, ME0386, ME0461 y ME0462, muestran una potencia superior en comparacion con los compuestos de la tecnica, tales como ME0322, en la prevencion de una infeccion ocular causada por un virus, tal como AdVH-37, que se une a 25 residuos sialicos terminales presentes en la superficie celular de la celula que va a resultar infectada por dicho virus. Por lo tanto, se considera que los compuestos de la presente invencion son altamente utiles en el tratamiento de la queratoconjuntivitis epidemica.

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   reivindicaciones

   1. Un derivado tri- o tetravalentes de acido sialico, comprendiendo dicho derivado un resto central al que se unen 3 o 4 grupos de acuerdo con la formula A o B

   imagen1

   en el que

   "X" es O (oxigeno) o S (azufre);

   R1 es alquilo C1-3;

   el numero entero "n1" es de 2 a 8;

   el numero entero "n2" es de 1 a 8; y

   la linea ondulada indica el punto de union al resto central; en el que dicho resto central es un resto de acuerdo con una cualquiera de las formulas II a V

   (CH2)m-|xN^{CH2)mi\ss r'v.

   A

   (CH2)m2 (CH2)rn2 (CH2)m2\

   (CH2)

   v'

   ml

   (CH2)m2

   ' C-,.5 alquilo

   CCHa^a—|—(CH2),

   (II),

   (HI),

   m2\

   (CH2)m2

   /

   r n

   /^(OH2)m2^(CH2)

   m2\j

   (CH2)m2 ^

   (IV), y

   x'

   (V)

   en la que

   el numero entero "m1" de la formula II es de 1 a 8 si los grupos unidos al resto II son grupos de acuerdo con la formula A;

   el numero entero "m1" de la formula II es de 2 a 8 si los grupos unidos al resto II son grupos de acuerdo con la formula B;

   el entero "m2" es de 1 a 8; y

   las lineas onduladas indican el punto de union a los grupos de acuerdo con la formula A o B;

   como una base libre, un acido en su forma protonada no cargada, un zwitterion, una sal de adicion

   farmaceuticamente aceptable, un solvato o un solvato de una sal del mismo.
2. 2. El derivado de acido sialico de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que "X" es O (oxigeno), en el que R1 es metilo y/o en el que el numero entero "n1" es de 2 a 3; y el entero "n2" es 1,2 o 3.
3. 3. El derivado de acido sialico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dichos grupos son grupos de acuerdo con la formula A.
4. 4. El derivado de acido sialico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dichos grupos son grupos de acuerdo con la formula B.
5. 5. El derivado de acido sialico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el peso molecular de dicho derivado en su forma libre es de 1500 Da o menos.
6. 6. El derivado de acido sialico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho resto central es un resto de acuerdo con la formula (II); preferentemente el numero entero "m1" es de 1 a 3.

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45
7. 7. El derivado de acido sialico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho derivado de acido sialico se selecciona del grupo que consiste en:

   Tris((acido 2-O-(5-N-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil6nico))-2-oxometil- 1H-1,2,3-triazol-4-il)etil)amina;

   Tris((acido 3-O-(5-N-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil6nico)-3-oxopropil- 1 H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amina;

   Tris((acido 2-O-(5-N-propanoilamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil6nico)-2- oxoetil-1 H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amina;

   Tris((acido 3-O-(5-N-propanoilamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil6nico)-3- oxopropil-1 H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amina;

   Tris((acido 4-(2-O-(5-N-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil6nico))-2-

   oxometil-1 H-1,2,3-triazol-1 -il)etil)amina; y

   Tris((acido 4-(2-O-(5-N-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-a-D-galacto-2-nonulopiranosil6nico))-2-oxoetil- 1 H-1,2,3-triazol-1 -il)etil)amina.
8. 8. El derivado de acido sialico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho derivado de acido sialico esta presente como un estereois6mero puro o en una mezcla anomerica que comprende dicho compuesto, en el que en la mezcla anomerica predomina el an6mero a.
9. 9. Una composici6n farmaceutica para la administraci6n en el ojo que comprende un derivado de acido sialico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y al menos un excipiente farmaceuticamente aceptable.
10. 10. La composici6n farmaceutica de acuerdo con la reivindicaci6n 9, en la que dicha composici6n es una composici6n acuosa que comprende de 0,001 a 10 mM, tal como de 0,01 a 1 mM, de un derivado de acido sialico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, teniendo dicha composici6n acuosa preferentemente un contenido en agua de al menos un 90 % en peso y que comprende opcionalmente un agente, tal como glicerol o NaCl, para proporcionar una soluci6n isot6nica.
11. 11. La composici6n farmaceutica de acuerdo con la reivindicaci6n 10, en la que dicha composici6n acuosa comprende NaCl para proporcionar una soluci6n isot6nica.
12. 12. La composici6n farmaceutica de acuerdo con la reivindicaci6n 10 u 11, en la que dicha composici6n acuosa esta tamponada y tiene un pH de aproximadamente 6,5 a 8.
13. 13. Un derivado de acido sialico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una composici6n farmaceutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, para uso en terapia.
14. 14. Un derivado de acido sialico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una composici6n farmaceutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, para uso en el tratamiento y/o la prevenci6n de una infecci6n ocular causada por un virus, que se une a residuos sialicos terminales presentes en la superficie celular de la celula que va a resultar infectada por dicho virus.
15. 15. Un derivado de acido sialico o una composici6n farmaceutica para uso segun la reivindicaci6n 14, en el que dicha infecci6n es causada por un virus seleccionado del grupo que consiste en AdVH-8, AdVH-19, AdVH- 37, AdVH-53, AdVH-54 y AdVH-56 y/o en el que dicha infecci6n es una queratoconjuntivitis epidemica.