JP6360895B2 - 多価シアル酸誘導体 - Google Patents

Description

本発明は、新規多価シアル酸誘導体、そのような誘導体を含む医薬組成物、ならびに、流行性角結膜炎（ＥＫＣ）、および細胞表面上に存在する末端シアル残基と結合するウイルスによって引き起こされる他の眼疾患を、そのような化合物の使用によって治療するまたは予防する方法に関する。

ヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶ：ｓ）は、哺乳類アデノウイルス属（Ｍａｓｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）に属し、一般的に遭遇する感染因子である。ヒトにおいて、アデノウイルスは、結膜炎および流行性角結膜炎（ＥＫＣ）等の眼疾患を含む種々の臨床症状に関連している。

これまでのところ、残念なことに、アデノウイルス感染の治療に利用可能な特異的な抗ウイルス薬はない。アデノウイルスは偏性細胞内寄生体であり、これはしたがって、アデノウイルスが細胞の複製機構に完全に依存していることを示している。したがって、抗ウイルス性化合物によるアデノウイルス複製の選択的阻害は、宿主細胞の必須機能の一部も改変され得ることから、実現することが非常に困難である。しかしながら、今日の抗ウイルス薬研究における１つのアプローチは、ウイルスが細胞に結合して細胞に侵入することが不可能になるようにウイルスの細胞受容体を遮断することにある。流行性角結膜炎（ＥＫＣ）の治療において使用するためのそのような遮断に基づく薬物は記録されていない。

アデノウイルスは自然界に偏在しており、したがって、未だに新たなセロタイプが発見されている。このように最初のＨＡｄＶ：ｓの単離から約６０年で、７つの種（Ａ〜Ｇ）にグループ分けされる、５０を超える新たなセロタイプが同定されている。

ＥＫＣは、毎年数百万人の個人がかかる、重度かつ伝染性の高い眼感染である。ＥＫＣの原因となるアデノウイルスセロタイプの中で、ＨＡｄＶ−８、ＨＡｄＶ−１９およびＨＡｄＶ−３７が依然として感染の主な原因因子であるが、最近、ＨＡｄＶ−５３、ＨＡｄＶ−５４およびＨＡｄＶ−５６も新規ＥＫＣ誘発型として出現した。随伴症状は、角膜炎、結膜炎、浮腫、疼痛、流涙、偽膜の形成および視力減退である。これらのウイルスは接触（例えば、手から眼への接触）によって広がるため、ＥＫＣは、人口密集地域において、および衛生予防措置が不十分な病棟において頻出する。感染は、一般的に最大２週間にわたって持続するが、一部の患者は、数か月、数年またはさらには永久に、視力機能障害に罹患し続ける。

ウイルスのライフサイクルは、角膜および／または結膜内の上皮細胞上に位置するシアル酸含有グリカンへの、アデノウイルスのホモ三量体ファイバーノブを介する結合によって始まる。ファイバーノブは、アデノウイルスビリオンから突出している１２本のファイバーのそれぞれの最遠位部に位置しており、糖質認識ドメインを保持する。最近になって、ＧＤ１ａガングリオシドにおけるグリカンに対応するグリカンを持つ糖タンパク質が、ＥＫＣ誘発アデノウイルスによる眼細胞の感染のための機能的受容体として証拠付けられた。ＨＡｄＶ−３７−ＧＤ１ａ複合体の結晶構造は、ＧＤ１ａグリカンの２本の分枝のそれぞれ上に位置する末端シアル酸残基が、ＨＡｄＶ−３７ファイバーノブの頂部にある３つの糖質認識部位のうち２つに収容されていることを示した。

故に、天然または合成シアル酸誘導体によるアデノウイルスの阻害は、ビリオンが、新たな細胞と結合し、その中に侵入し、感染するのを防止し得る（中でも、ＷＯ０１／０３７８４６を参照）。結果として、感染は限定されるであろう。ＥＫＣの事例において重要なことに、とりわけ、迅速な血清クリアランスおよび乏しい細胞取り込みを含む糖質ベースの薬物の乏しい薬理学的特性は、局所モードの投与（例えば、クリーム剤、軟膏剤、点眼剤）の使用によって避けることができる。

ＷＯ０１／０３７８４６は、アデノウイルス感染および特に眼性アデノウイルス感染、例えば角結膜炎が、治療有効量の、シアル酸等、ウイルスとシアル酸受容体との間の相互作用を妨げる物質の投与によって、治療または緩和され得ることを開示している。残念なことに、糖質とタンパク質との間の弱い相互作用は、薬物としての糖質の使用を限定する。

前記限定を克服する試みが、グリココンジュゲートを、ヒト血清アルブミンに連結したいくつかのシアル酸誘導体（ＳＡ−ＨＳＡ：ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）とともに使用することによって為された。しかしながら、そのような多価グリココンジュゲートは、いくつかの理由で医薬品として好適ではない。ＳＡ−ＨＳＡの正確な構造および組成は、異なる分子間で変動するであろう。したがって、ＳＡ−ＨＳＡは、構造的に定義することが難しいある種の構造を表す。さらに、ＳＡ−ＨＳＡ誘導体の組成は、同じ様式で製造された場合であっても、異なるバッチ間で変動するであろう。安全および調節の観点から、これは著しい欠点である。加えて、ヒト血漿に由来するタンパク質、すなわちＨＳＡの使用は、主要な不利点である。ＨＳＡの起源は、ＨＳＡに基づくより多量の医薬品を製造することを難しくしている。さらに、ウイルスまたはプリオン等の感染因子による汚染は、ヒト血漿由来のＨＳＡにおいて排除されないことがある。したがって、ＨＳＡに基づく製品は医薬製品として好適ではなく、多価代替物が非常に望ましいであろう。

ＷＯ２０１１／００３８７６において、水溶液中で多価凝集体を形成する新規両親媒性シアル酸誘導体が開示されている。凝集体は、ＳＡ−ＨＳＡに関連する欠点を克服し、それにより、ＥＫＣを治療するのに有用であることが開示されている。そのような誘導体のさらなる態様は、Ａｐｌａｎｄｅｒらにより、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１１、５４、６６７０において開示されている。

さらに、ヒト角膜上皮（ＨＣＥ）細胞のＨＡｄＶ−３７感染に対する、共有結合している多価で効率的なシアル酸ベースの阻害剤が当技術分野において報告されている（Ｓｐｊｕｔら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．編、２０１１、５０、６５１９；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ ２００５、６、３５８；およびＪｏｈａｎｓｓｏｎら、Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｒｅｓ．２００７、７３、９２を参照）。一価シアル酸誘導体の比較的低い有効性を回避するために、著者らは、ＨＡｄＶ−３７ファイバーノブにおける三量体結合部位を利用した。１つのノブ当たり１つを超える糖質認識ドメインと同時に結合することができる三価および四価シアル酸誘導体の使用は、Ｓｐｊｕｔらによって開示されている通り、一価シアル酸化合物と比較して阻害能を大幅に改善した。

例えば、ＭＥ０３２２と表示される化合物は、スクアリン酸がシアル酸を中央コアユニットと連結させるために使用される合成三価シアル酸誘導体であり、天然シアル酸単糖よりも４桁大きく強力であると報告された。さらに、ＭＥ０３２２は、ファイバーノブへのウイルスの結合を防止する上で、１７価シアル酸−ＨＳＡコンジュゲートと同程度に有効であった。興味深いことに、ＭＥ０３２２は、ＨＡｄＶ−３７によるヒト角膜上皮（ＨＣＥ）細胞の感染を阻害する上で、ＨＳＡ−コンジュゲートよりもはるかに強力であることが分かった。

前記化合物は確かに興味深い特性を示すが、ヒト角膜上皮（ＨＣＥ）細胞へのＨＡｄＶ−３７ビリオンの結合を防止する観点から、さらに一層改善された効能を有する多価シアル酸誘導体を提供することは、依然として有用であろう。

故に、当技術分野において、ヒト角膜上皮（ＨＣＥ）細胞へのＨＡｄＶ−３７ビリオンの結合を防止する上で高い有効性を見せる、低分子、多価シアル酸誘導体が依然として必要である。そのような誘導体は、ＥＫＣを治療および予防するのに有用である。

よって、本発明は、三価または四価シアル酸誘導体を提供することによって、当技術分野における上で特定した欠陥および不利点の１つまたは複数を、単独でまたは任意の組合せで、軽減、緩和、解消または回避しようと努めるものであり、前記誘導体は、式ＡまたはＢによる３つまたは４つの基が結合しているコア部分

［式中、
「Ｘ」は、Ｏ（酸素）、ＮＨまたはＳ（硫黄）であり、
Ｒ１は、Ｃ１〜３アルキル、フェニル、ＯＣ１〜２アルキル、ＣＦ３またはＮＨＣ１〜２アルキルであり、
整数「ｎ１」は２から８であり、
整数「ｎ２」は１から８であり、
波線はコア部分との結合点を示す］
を、遊離塩基、その非荷電プロトン化形態の酸、両性イオン、薬学的に許容される付加塩、溶媒和物、またはその塩の溶媒和物として含む。

本発明の態様によれば：
「Ｘ」はＯ（酸素）であってよく；Ｒ１はメチルであってよく、整数「ｎ１」は２から３であってよく；前記基は式Ａによる基であってよく；かつ／または前記誘導体のその遊離形態での分子量は１，５００Ｄａ以下であるか；あるいは
「Ｘ」はＯ（酸素）であってよく；Ｒ１はメチルであってよく、整数「ｎ２」は、１、２または３であってよく；前記基は式Ｂによる基であってよく；かつ／または前記誘導体のその遊離形態での分子量は１，５００Ｄａ以下である。

さらに、前記コア部分は、式ＩからＶ

［式中、
部分Ｉと結合している基は式Ａによる基であり、
部分ＩＩへの基が式Ａによる基であるならば、式ＩＩ中の整数「ｍ１」は１から８であり、
部分ＩＩと結合している基が式Ｂによる基であるならば、式ＩＩ中の整数「ｍ１」は２から８であり、
整数「ｍ２」は１から８であり、
波線は、式ＡまたはＢによる基との結合点を示す］
のいずれか１つによる部分であってよい。

別の態様によれば、本明細書において上述した種類のシアル酸誘導体と、少なくとも１つの薬学的な（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）許容される添加剤とを含む、眼への投与用の医薬組成物が提供される。医薬組成物は、０．０１から１ｍＭ等、０．００１から１０ｍＭのシアル酸誘導体を含む水性組成物であってよい。そのような水性組成物中における水分含有量は、少なくとも９０ｗｔ％であってよい。さらにそのような水性組成物は、等張溶液となるようにグリセロール等の作用剤を含んでよい。

別の態様によれば、本明細書において上述したシアル酸誘導体またはそのような誘導体を含む医薬組成物は、療法において使用するためのものである。

別の態様によれば、本明細書において上述したシアル酸誘導体またはそのような誘導体を含む医薬組成物は、ウイルスに感染する細胞の細胞表面上に存在する末端シアル残基と結合する前記ウイルスによって引き起こされる眼感染の治療および／または予防において使用するためのものである。感染は、ＨＡｄＶ−８、ＨＡｄＶ−１９、ＨＡｄＶ−３７、ＨＡｄＶ−５３、ＨＡｄＶ−５４およびＨＡｄＶ−５６からなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる感染であってよい。さらに、感染は流行性角結膜炎であってよい。

さらに、本発明の種々の実施形態の有利な特色が、従属請求項において、および以下の詳細な説明内で定義される。

ＨＣＥ細胞とのＨＡｄＶ−３７の結合および該細胞の感染に対する三価シアル酸誘導体のセットの効果−異なる濃度の阻害剤の存在下でのビリオン結合を示す図である（データは、阻害剤の非存在下で得られた値であるコントロールの％として提示される）。 ＨＣＥ細胞とのＨＡｄＶ−３７の結合および該細胞の感染に対する三価シアル酸誘導体のセットの効果−異なる濃度の阻害剤での感染を示す図である（データは、阻害剤の非存在下で得られた値であるコントロールの％として提示される）。

本明細書において使用される場合、用語「付加塩」は、有機もしくは無機酸等の薬学的な許容される酸、または薬学的な許容される塩基の付加によって形成された塩を意味するように意図されている。有機酸は、酢酸、プロパン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、乳酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸またはマレイン酸であってよいがこれらに限定されない。無機酸は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸またはリン酸であってよいがこれらに限定されない。塩基は、アンモニアおよびアルカリまたはアルカリ土類金属の水酸化物であってよいがこれらに限定されない。用語「付加塩」は、水和物およびアルコラート等の水和物および溶媒付加形態も含む。

本明細書において使用される場合、単独でまたは接尾辞もしくは接頭辞として使用される「アルキル」は、特定数の炭素原子を有する分枝鎖および直鎖両方の飽和脂肪族炭化水素基を含むように意図されている。例えば、「Ｃ１〜６アルキル」は、１、２、３、４、５または６個の炭素原子を有するアルキルを表示する。

化合物
ＭＥ０３２２と表示される三価シアル酸誘導体（以下を参照）は、ＨＡｄＶ−３７ヒト角膜上皮細胞の結合を阻害することが当技術分野で公知であり、３つの主要な要素、コア部分、シアル酸残基、ならびにコア部分およびシアル酸残基を接続するリンカーを有する。リンカー中に、スクアリン酸に基づくカップリング残基が存在する。三価シアル酸誘導体ＭＥ０３２２は、ファイバーノブの３つすべてのシアル酸結合部位との相互作用を同時に可能にするように十分な柔軟性をもたらすような様式で設計された。一見したところ、ＨＡｄＶ−３７ファイバーヘッドおよびＭＥ０３２２の複合体の分解結晶構造は、化合物が確かに３つすべてのシアル酸結合部位と同時に結合できることを裏付けるものであり、これにより、リンカーによってもたらされた柔軟性が十分であることを裏付けられる。

スクアリン酸残基を別のカップリング残基と置きかえること、ＨＡｄＶ−３７ファイバーノブにおける糖質認識部位との追加の接触を確立するための手段を提供することは、結合親和性を潜在的にさらに一層増大させると推測された。驚くべきことに、本発明者らは、ＭＥ０３２２中に存在するようなスクアリン酸カップリング残基をトリアゾール酸カップリング残基と置きかえることが、ヒト角膜上皮細胞へのＨＡｄＶ−３７の結合を防止するための効能が増大した多価シアル酸誘導体を確かにもたらすことも裏付けた。

故に、ある実施形態は、三価または四価シアル酸誘導体であって、式ＡまたはＢによる３つまたは４つの基が結合しているコア部分

［式中、
「Ｘ」は、Ｏ（酸素）、ＮＨまたはＳ（硫黄）であり、
Ｒ１は、Ｃ１〜３アルキル、フェニル、ＯＣ１〜２アルキル、ＣＦ３またはＮＨＣ１〜２アルキルであり、
整数「ｎ１」は２から８であり、
整数「ｎ２」は１から８であり、
波線はコア部分との結合点を示す］
を含む、前記誘導体に関する。

そのような化合物は、遊離塩基として、その非荷電プロトン化形態の酸として、薬学的に許容される付加塩として、溶媒和物として、または薬学的に許容される付加塩の溶媒和物として存在し得る。化合物は、アルカリ性トリアゾール残基および酸性カルボン酸部分を含むため、両性イオンとして存在してもよい。さらに、前記化合物は、純粋な立体異性体として、または前記化合物を含む、ラセミ、ジアステレオマー、スケールミックもしくはアノマー混合物中に存在し得る。好ましくは、前記化合物は、純粋な立体異性体として、またはアノマー混合物として存在する。

アノマー混合物中に存在する場合、α−アノマーが優勢であるならば好ましい。したがって、化合物の９０％、９５％、９９％超、またはさらに９９，９％超等、７５％以上がα−アノマーとして存在するならば好ましい。対応するβ−アノマーを以下に描写する。

Ｎ−およびＳ−グリコシドも興味深いが、Ｏ−グリコシドが好ましい。故に、式ＡおよびＢ中の「Ｘ」は、ある実施形態によれば「Ｏ」（酸素）である。

本発明のＨＳＡ誘導体と多少関連している以前のものについて、Ｒ１は、ＨＡｄＶ−３７ファイバーノブの糖質認識部位に対する親和性を有する化合物においてはメチルに制限されないことが以前に示されている（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００９、５２、３６６）。しかしながら、本明細書において開示されている三価または四価シアル酸誘導体におけるＲ１はメチルに制限されないが、Ｒ１がメチルならば好ましい。

本明細書において開示されている三価または四価シアル酸誘導体において、シアル酸残基は、アルキレンを介してトリアゾール残基と結合している。アルキレンが好ましいが、アルキレンを、例えば短鎖ＰＥＧリンカーまたはシクロプロピル等のシクロアルキル部分を含むリンカーと置きかえることを想定することもできる。アルキレンは、種々の長さのもの、すなわち、式Ａによる基を含む三価または四価シアル酸誘導体ではエチレンからオクチレン、および式Ｂによる基を含む三価または四価シアル酸誘導体ではメチレンからオクチレンであってよい。しかしながら、アルキレンがエチレンまたはプロピレンであるならば好ましい。故に、整数「ｎ１」が、式Ａによる基を含む三価または四価シアル酸誘導体においては２または３であれば好ましい。同様に、整数「ｎ２」が、式Ｂによる基を含む三価または四価シアル酸誘導体においては、１、２または３であれば好ましい。

本明細書において開示されている通りの三価または四価シアル酸誘導体は、アジド基を含むシアル酸残基を、エチン基を含むコア部分と、銅（ｃｕｐｐｅｒ）（Ｉ）触媒アジド−アルキンヒュスゲン環化付加においてカップリングさせることによって得ることができる（さらに以下の実験詳細を参照）。同様に、エチン基を含むシアル酸残基を、アジド基を含むコア部分と、銅（Ｉ）の存在下でカップリングしてよい。ある実施形態によれば、本明細書において開示されている通りの三価または四価シアル酸誘導体は、式Ａによる基を含む。別の実施形態によれば、本明細書において開示されている通りの三価または四価シアル酸誘導体は、式Ｂによる基を含む。一見したところ、式Ｂによる基を含む化合物は、少なくともある特定のリンカー長を持つ、式Ａによる基を含む化合物よりも、多少強力であり得る。

トリプロパルギルアミンおよびトリス（２−アジドエチル）アミンは、それぞれ、ＨＡｄＶ−３７ファイバーノブにおける糖質認識部位に対する親和性が増大した三価または四価シアル酸誘導体を得る際にコア部分として有用であることが分かったが、本発明は、この種類の三価コア部分のみに限定されるわけでは決してない。３つまたは４つのエチンまたはアジド基を含む、他の小分子、構造的に明確に定義された化合物を、シアル酸残基と、銅（Ｉ）の存在下でカップリングして、三価または四価シアル酸誘導体を得てもよい。

ある実施形態によれば、三価または四価シアル酸誘導体のその遊離形態での分子量は、２，０００以下、または１，５００Ｄａ以下等、２，５００Ｄａ以下である。ファイバーノブの３つのシアル酸結合部位は互いにかなり近くに（すなわち、およそ１０Å）位置するため、三価または四価シアル酸誘導体のシアル酸残基の間隔が離れすぎていないならば好ましい。さらに、柔軟性がありすぎるコア部分またはシアル酸残基間の大きすぎる距離は、ファイバーノブへの誘導体の結合に悪影響を及ぼし得る。小さくより硬い誘導体は、ファイバーノブタンパク質と結合する際により少ないエントロピー損失ももたらし、故に、効能改善に寄与する。

既に説明した通り、コア部分は種々の種類のものであってよい。ある実施形態によれば、コア部分は、式ＩからＶ

［式中、
部分Ｉと結合している式ＡまたはＢによる基は、式Ａによる基であり、
部分ＩＩと結合している式ＡまたはＢによる基が式Ａによる基であるならば、式ＩＩ中の整数「ｍ１」は１から８であり、
部分ＩＩと結合している式ＡまたはＢによる基が式Ｂによる基であるならば、式ＩＩ中の整数「ｍ１」は２から８であり、
整数「ｍ２」は１から８であり、
波線は、式ＡまたはＢによる基との結合点を示す］
のいずれか１つによる部分である。

コア部分の正確な性質は結合親和性にとってあまり重要ではないが、いずれにせよ、コア部分が式ＩＩによる部分であるならば好ましいことが分かっている。さらに、好ましくは、整数「ｍ１」は１から３であり、整数「ｍ２」は１から３である。さらに、部分ＩＩと結合している式ＡまたはＢによる基は、ある実施形態によれば、式Ａによる基である。別の実施形態によれば、それらは式Ｂによる基である。

一実施形態によれば、本明細書において開示されている通りの三価または四価シアル酸誘導体は、式Ａによる基を含み、
トリス（（１−（２−Ｏ−（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸））−２−オキソエチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミン；
トリス（（１−（２−Ｏ−（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸））−３−オキソプロピル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミン；
トリス（（１−（２−Ｏ−（５−Ｎ−プロパノイルアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸））−２−オキソエチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミン；および
トリス（（１−（２−Ｏ−（５−Ｎ−プロパノイルアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸））−３−オキソプロピル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミン
からなる群から選択される。

そのような実施形態によれば、三価または四価シアル酸誘導体が、トリス（（１−（２−Ｏ−（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸））−３−オキソプロピル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミン、すなわち

であるならば好ましい。

別の実施形態によれば、本明細書において開示されている通りの三価または四価シアル酸誘導体は、式Ｂによる基を含み、
トリス（（４−（２−Ｏ−（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸））−２−オキソメチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）エチル）アミン；
トリス（（４−（２−Ｏ−（５−Ｎ−プロパノイルアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸））−２−オキソメチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）エチル）アミン；
トリス（（４−（２−Ｏ−（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸））−２−オキソエチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）エチル）アミン；および
トリス（（４−（２−Ｏ−（５−Ｎ−プロパノイルアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸））−２−オキソエチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）エチル）アミン
からなる群から選択される。

そのような実施形態によれば、三価または四価シアル酸誘導体が、トリス（（４−（２−Ｏ−（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸））−２−オキソメチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）エチル）アミン、すなわち

であるならば好ましい。

医薬組成物
本発明の別の実施形態は、本明細書において開示されている通りの三価または四価シアル酸誘導体を含む医薬組成物、例えば、ＥＫＣの治療および／または予防用の医薬に関する。そのような医薬組成物は、担体、賦形剤および／または安定剤等の薬学的に許容される添加剤をさらに含んでよい。適用可能な調節に応じて、医薬組成物は、眼における感染の治療または予防のための、医薬品として、または医療デバイスとしてのいずれかに分類され得る。組成物が本明細書において医薬組成物と称されるという事実だけで、医療デバイスとしての組成物の登録を除外するものと解釈すべきではない。三価または四価シアル酸誘導体のウイルス結合特性は、例えば、レンズ溶液の形態で等、コンタクトレンズの汚染を防止するためにも使用され得ることを暗示している。

この文脈では、「薬学的に許容される」は、用いられる投薬量および濃度で、それが投与される対象においていかなる望ましくない効果も引き起こさない添加剤を意味する。そのような薬学的に許容される添加剤は、当技術分野において周知である。

一実施形態によれば、本明細書において開示されている通りのそのような医薬組成物は、眼への投与に好適な医薬組成物である。限定されないが、眼への投与に好適な医薬組成物の典型的な例は、点眼剤、軟膏剤、スプレー剤、包帯剤およびゲル剤を含む。

眼への投与に好適な医薬組成物は、水性組成物であってよい。そのような水性組成物は、９０から９９．９、９５から９９、または９５から９８ｗｔ％の水等、９０ｗｔ％の水またはそれ以上の水分含有量を有し得る。さらに、本明細書において開示されている通りの三価または四価シアル酸誘導体を含む水性組成物は、０．０１から１ｍＭ等、０．００１から１０ｍＭの三価または四価シアル酸誘導体を含み得る。

さらに、水性組成物は、等張溶液となるように作用剤を含んでよい。したがって、水性組成物は、塩化ナトリウム、グリセロール、ポリエチレングリコール、単糖、例えばグルコースおよびマンニトール、ならびに二糖、例えばスクロース等の糖からなる群から選択される作用剤を含んでよい。

一実施形態によれば、本明細書において開示されている通りの医薬組成物は、塩化ナトリウム等の電解質を含む水性組成物である。好ましくは、電解質の含有量は、塩化ナトリウムについては約０．９ｗｔ％等、等浸透圧濃度の近くであるべきである。

別の実施形態によれば、本明細書において開示されている通りの医薬組成物は、グリセロールを含む水性組成物である。グリセロールの含有量は、２．３から２．３または２．５から２．７ｗｔ％等、２から３ｗｔ％であってよい。好ましくは、前記含有量は、約２．６ｗｔ％等、等浸透圧濃度の近くであるべきである。

さらに、生理学的ｐＨに近いｐＨを有する組成物を提供するために、医薬組成物のｐＨを調整することに興味を持たれ得る。故に、一実施形態による医薬組成物は、約６．５から８のｐＨを有する水性医薬組成物である。好ましくは、前記ｐＨは、約７．２から７．８等、生理学的ｐＨにより近い。

本明細書において開示されている三価または四価シアル酸誘導体は、酸性カルボン酸部分、およびトリアゾール部分を含むアルカリ性部分を含むため、医薬組成物は、ｐＨを所望のレベルに調整するために、薬学的な許容される酸および／または塩基を含んでよい。また、医薬組成物は緩衝化されていてもよい。緩衝化されている医薬組成物は、典型的には、ＨＣＯ₃ ^-／ＣＯ₃ ^2-またはＨ₂ＰＯ₄ ^-／ＨＰＯ₄ ^2-等の緩衝種を含む。さらに、緩衝化されている医薬組成物は、ホウ酸塩緩衝化されていてよい。

別の実施形態によれば、医薬組成物のｐＨは、約５から７等、生理学的ｐＨよりもわずかに低い。酸性、すなわち７を下回るｐＨを持つ組成物は、微生物の増殖の影響を受けにくいという利点を有する。さらに、微生物の増殖は、医薬組成物に保存料を添加することによって防止され得る。一実施形態によれば、本明細書において開示されている通りの医薬組成物は、故に保存料を含む。そのような保存料の例は、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、パラベン、例えばブチルパラベン、プロピルパラベン、エチルパラベン、メチルパラベンおよびそれらの混合物等、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコールまたはソルビン酸である。保存料を含む医薬組成物は、貯蔵により好適となり得る。さらに、本明細書において開示されている通りの医薬組成物は、加熱滅菌または滅菌濾過等によって滅菌されてよい。

本明細書において開示されている通りの医薬組成物は、酸化防止剤、追加の等張性剤、着色剤等の他の薬学的に許容される添加剤をさらに含んでもよい。

水性医薬組成物に関する実施形態において、組成物は、非イオン性界面活性剤、親水性ポリマー等の懸濁剤および安定剤を含んでよい。

一実施形態によれば、本明細書において開示されている通りの医薬組成物は、増粘剤を含んでよい。典型的には、増粘される医薬組成物は水性である。増粘された液剤、ゲル剤、シロップ剤、クリーム剤または軟膏剤を作成するために、増粘剤を用いてよい。増粘された液剤またはゲル剤を形成するために、ヒドロゲル形成材料を用いてよい。そのようなヒドロゲル形成材料は、合成ポリマー、半合成ポリマーおよび天然ガムからなる群から選択され得る。

合成ポリマーの例は、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｏｌｉｄｏｎｅ）、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポロキサマーブロックコポリマーを含む。半合成ポリマーの例は、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびエチルヒドロキシエチルセルロース等のセルロースエーテルを含む。天然ガムの例は、アカシア、アルギン酸塩、カラギーナン（ｃａｒｒａｇｅｎａｎ）、キトサン、ペクチン、デンプン、キサンタンガムを含む。

増粘された液剤またはゲル剤は、ヒアルロン酸およびその誘導体、カルボマーおよびポリカルボフィル型の架橋ポリアクリル酸、ならびにゲル剤を容易に形成するポリマー等、粘膜に強く接着することが公知である材料の採用によって、粘膜付着性にされ得る。

一実施形態によれば、本明細書において開示されている通りの医薬組成物は、ポロキサマー型のブロックコポリマーを含んでよい。水中に分散したある特定のポロキサマーは熱可逆性であるため、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールブロックを含むポリマー等のポロキサマー型のブロックコポリマーを使用することは有利である。熱可逆性ポロキサマーの例は、ポロキサマー１８８およびポロキサマー４０７である。

水中に分散した熱可逆性ポロキサマーは低粘度を有するが、昇温で著しい粘度増大を呈し、体温でゲル形成をもたらす。それにより、比較的温かい角膜に投与された医薬製剤の接触時間は延長され得る。したがって、本発明の一実施形態は、熱可逆性である本明細書において開示されている通りの医薬組成物に関する。

一実施形態によれば、本明細書において開示されている通りの医薬組成物は、追加の抗ウイルス性化合物を含んでよい。そのような化合物の例は、Ｎ−クロロタウリンおよびポビドン−ヨウ素（ＰＶＰ−Ｉ）を含む。

Ｎ−クロロタウリン（Ｃｌ−ＨＮ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＯ３Ｈ）は、内因性抗菌物質である。これは、酸化的破壊中に顆粒球および単球によって生成された弱活性塩素化合物である。その非特異的な反応機構、すなわち、アミノ基、チオおよび芳香族化合物の酸化により、Ｎ−クロロタウリンは防腐剤と同様の広域スペクトル殺菌活性を有する。Ｎ−クロロタウリン（Ｃｌ−ＨＮ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＯ３Ｎａ）のナトリウム塩溶液は、細菌および糸状菌をｉｎ ｖｉｔｒｏで死滅させることが示されている。加えて、殺ウイルス効果が実証されている。ポビドン−ヨウ素は、ポリビニルピロリドン（ポビドン、ＰＶＰ）および元素状ヨウ素の安定な化学的複合体である。

一実施形態によれば、本明細書において開示されている通りの医薬組成物は、追加の抗ウイルス性化合物を含んでよく、ここで、前記抗ウイルス性化合物は、ヘルペスによって引き起こされた感染を局所的に治療するために有用な化合物である。そのような化合物の例は、グアノシン類似体アシクロビル、バラシクロビル、ペンシクロビルおよびファムシクロビル、ならびにホスカルネット（ナトリウムホスホンホルメート六水和物）を含む。

一実施形態によれば、本明細書において開示されている通りの医薬組成物は、局所麻酔薬を含んでよい。ＥＫＣは非常に痛みを伴う疾患であり得るため、鎮痛を提供するために局所麻酔薬を含むことが有利となり得る。さらに、そのような鎮痛は、投与自体が痛みを伴い得るが、患者が治療を続けるように促すという利点を有し得る。加えて、急速に発現する局所麻酔薬の使用は、角膜への直接的な組成物のさらなる投与を可能にするために、患者が眼を実際に開けることを可能にし得る。有用な局所麻酔薬の例は、リドカイン、プリロカインおよびロピバカインを含む。

療法
別の実施形態によれば、本明細書において開示されている通りの三価もしくは四価シアル酸誘導体または医薬組成物は、療法において使用されてよい。

眼感染の治療
上記で既に開示した通り、本明細書において開示されている通りの三価または四価シアル酸誘導体は、ヒト角膜細胞へのＨＡｄＶ−３７の結合を阻害することが分かった。

したがって、本発明の一実施形態は、ウイルスに感染する細胞の細胞表面上に存在する末端シアル残基と結合する前記ウイルスによって引き起こされる眼感染の治療および／または予防において使用するための、本明細書において開示されている通りの三価もしくは四価シアル酸誘導体または医薬組成物に関する。

同様に、本発明の一実施形態は、ウイルスに感染する細胞の細胞表面上に存在する末端シアル酸残基と結合する前記ウイルスによって引き起こされる眼感染の治療および／または予防において使用するための医薬の製造のための、本明細書において開示されている通りの三価もしくは四価シアル酸誘導体または医薬組成物の使用に関する。

さらに別の実施形態は、ＥＫＣ等、ウイルスに感染する細胞の細胞表面上に存在する末端シアル酸残基と結合する前記ウイルスによって引き起こされる眼感染の予防および／または治療の方法であって、そのような予防および／または治療を必要とする、ヒトを含む哺乳動物に、治療有効量の本明細書において開示されている通りの三価または四価シアル酸誘導体、あるいは治療有効量の、本明細書において開示されている通りの三価または四価シアル酸誘導体を含む医薬組成物を投与するステップを含む方法に関する。好ましくは、前記三価もしくは四価シアル酸誘導体または医薬組成物は、そのような方法で眼に投与される。

細胞表面上に存在する末端シアル酸残基と結合し、それにより、前記細胞への感染を可能として眼感染等の感染を引き起こすウイルスの例は、ＨＡｄＶ−８、ＨＡｄＶ−１９、ＨＡｄＶ−３７、ＨＡｄＶ−５３、ＨＡｄＶ−５４およびＨＡｄＶ−５６を含む。細胞表面上に存在する末端シアル酸残基と結合することによって眼感染を引き起こすアデノウイルスの例は、ＨＡｄＶ−８、ＨＡｄＶ−１９およびＨＡｄＶ−３７を含み、典型的な例はＨＡｄＶ−３７である。

一実施形態によれば、本発明の三価もしくは四価シアル酸誘導体または組成物の使用によって治療されるおよび／または予防される眼感染は、流行性角結膜炎（ＥＫＣ）である。

本明細書における実施形態による医薬組成物は、患者に薬学的有効用量で投与されてよい。「薬学的有効用量」が意味するのは、それが投与される条件との関連で所望の効果を生ずるために十分な用量である。正確な用量は、三価または四価シアル酸誘導体の活性、投与様式、障害および／または疾患の性質および重症度、ならびに患者の年齢および体重等の一般的条件に依存し得る。

一実施形態によれば、本明細書において開示されている通りの医薬組成物は、１日当たり１回または数回投与される。典型的には、そのような医薬組成物は１日３回投与されることになるが、他の用量レジメンを使用してもよい。

本明細書において使用される場合、「予防する／予防すること」は、予防を実現するための本明細書において開示されている実施形態による化合物または医薬組成物の使用後、状態および／または疾患が決して再度発生しないことを意味すると解釈されるべきではない。さらに、該用語は、ある状態を予防するためのそのような使用後、前記状態が少なくともある程度発生しないことを意味すると決して解釈されるべきではない。むしろ、「予防する／予防すること」は、予防すべき状態が、そのような使用にもかかわらず発生するとしても、そのような使用のない場合ほどには重度にならないことを意味するように意図されている。

一実施形態によれば、治療は、前治療、すなわち予防的治療も網羅する。

概論
特定の例証的な実施形態を参照して本発明について上述してきたが、本発明を本明細書で説明されている特定の形態に限定することは意図されていない。上記で言及した実施形態の任意の組合せは、本発明の範囲内にあるものとして理解されるべきである。むしろ、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定され、上記の特定のもの以外の実施形態は、これらの添付の特許請求の範囲内で等しく可能である。

特許請求の範囲において、用語「を含む／含むこと」は、他の種またはステップの存在を除外するものではない。加えて、個々の特色が異なる請求項に含まれていてよいが、これらはおそらく有利に組み合わせることができ、異なる請求項への包含は、特色の組合せが実現可能かつ／または有利でないことを暗示するものではない。加えて、単数形の参照は複数を除外するものではない。用語「１つの（ａ）」、「「１つの（ａｎ）」、「第１の」、「第２の」等は、複数を不可能にするものではない。語句「少なくとも１つ」または「１つまたは複数」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０等、１または１よりも大きい数を指す。

実験
下記の例は単なる例にすぎず、本発明の範囲を限定するものであるとは決して解釈されるべきではない。むしろ、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

一般的な化学的手順
¹Ｈ ＮＭＲおよび¹³Ｃ ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＤＲＸ−４００分光計で、それぞれ４００ＭＨｚおよび１００ＭＨｚにおいて記録した。ＮＭＲ実験は、２９８ＫにてＣＤＣｌ₃中で行った（残留溶媒ピーク＝７．２６ｐｐｍ（δＨ））、ＣＤ₃ＯＤ（残留溶媒ピーク＝３．３１ｐｐｍ（δＨ）および４９．００ｐｐｍ（δＣ））およびＤ₂Ｏ（残留溶媒ピーク＝４．７９ｐｐｍ（δＨ））。

ＬＣＭＳは、エクステラＣ１８カラム（５０×１９ｍｍ、５μｍ、１２５Å）を備えたＷａｔｅｒｓ ＬＣシステムを用いて行い、水中ＣＨ₃ＣＮの線形勾配で溶離し、そのいずれもギ酸（０．２％）を含有していた。１．５ｍＬ／分の流速を使用し、検出は２１４ｎｍで実施した。質量スペクトルは、ＷａｔｅｒマイクロマスＺＱ２０００で、正および負エレクトロスプレーイオン化を使用して得られた。

半分取ＨＰＬＣ分離は、ＧｉｌｓｏｎシステムＨＰＬＣで、流速２０ｍＬ／分のヌクレオデュアＣ−１８カラムＨＴＥＣ５μｍ（ＶＰ２５０／２１）、２１４ｎｍでの検出、ならびに溶離液システム：Ａ．０．００５％ＣＦ₃ＣＯＯＨ水溶液およびＢ．ＣＨ₃ＣＮ中０．００５％ＣＦ₃ＣＯＯＨを使用して実施した。

カラムクロマトグラフィーは、シリカゲル（Ｍｅｒｃｋ、６０Å、７０〜２３０メッシュＡＳＴＭ）上で実施した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、シリカゲル６０Ｆ₂₅₄（Ｍｅｒｃｋ）上で、ＵＶ光および／またはＥｔＯＨ中５％Ｈ₂ＳＯ₄での展開ならびに加熱下での検出を用いて実施した。

旋光度は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ３４３偏光計を用い、２０℃で測定した。分子篩３Åで乾燥させたＣＨ₃ＣＮおよびＭｅＯＨ以外は、有機溶媒はＧｌａｓｓ Ｃｏｎｔｏｕｒ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＳＧ Ｗａｔｅｒ ＵＳＡ）を使用して乾燥させた。

市販の試薬はすべて受け取った通りのものを使用した。

ＭＥ０３２２と表示される化合物は、公開されている手順（Ｓｐｊｕｔら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．編、２０１１、５０、６５１９を参照）に従って合成した。すべての標的化合物は、ＨＰＬＣ ＵＶ痕跡によれば純度９５％以上であった。統計は、ＧｒａｐｈＰａｄプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して計算した。

合成手順
一般
本発明の化合物は、反応性末端基、すなわちアジド基（以下で左側に描写されている化合物を参照）またはエチン基（以下で右側に描写されている化合物を参照）を有するリンカー、典型的にはアルキレンリンカーを持つシアル酸を提供することによって得ることができる。

反応性末端基が設けられたシアル酸を、３つまたは４つの反応基を有するコア部分、すなわちアジドまたはエチン部分と、アジド−アルキンヒュスゲン環化付加において、典型的には触媒として作用する銅（Ｉ）の存在下で反応させることによって、本発明の化合物を得ることができる。当業者には容易に認識されるように、合成の種々の段階において種々の基を保護することは、有利、または必要にさえなり得る。当業者は、どの基を使用すべきか熟知している。

コア部分としてのトリプロパルギルアミンの使用
トリス（（１−（２−Ｏ−（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸））−２−オキソエチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミン（ＭＥ０３８５）およびトリス（（１−（２−Ｏ−（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸））−３−オキソプロピル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミン（ＭＥ０３８６）等の非変性Ｎ−アシル三価シアル酸への経路は、簡単であることが判明し、市販の化学物質から８ステップで、または重要中間体１から５ステップで実現できた（スキーム１）。市販のシアル酸から容易に調製されるシアル酸チオフェニル誘導体１の合成は、公開されている手順（Ｍａｒｒａら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９８９、１８７、３５）に従って実施した。次いで、シアロシド３ａおよび３ｂは、対応するアルコール（それぞれ２−ブロモエタノールおよび３−ブロモプロパン−１−オール）を化合物１によりグリコシル化することによって、良好な変換率で得られた。他のブロモアルコールを使用すれば、他の長さのリンカーを持つビルディングブロックが得られるはずである。この反応により、アノマーからなる分離できない混合物が、得られた脱離生成物と一緒に生じ、この段階では脱離生成物はさらに精製しなかった。ブロモ誘導体３ａおよび３ｂは、それらのアジド類似体５ａおよび５ｂに容易に変換された。その後の標準的なツェンプレン（Ｚｅｍｐｌｅｎ）条件を使用するＯ−脱アシル化により、アノマー的に（ａｎｏｍｅｒｉｃａｌｌｙ）純粋な７ａおよび７ｂを、３ステップにわたってそれぞれ４０％および５８％収率で得た。次いで、化合物７ａおよび７ｂをトリプロパルギルアミンと、銅触媒によるアジド−アルキン環化付加反応（「クリック」反応）において反応させた。このようにして、メチルエステル９ａおよび９ｂがそれぞれ５１％および４５％収率で得られた。その後の鹸化により、最終標的化合物ＭＥ０３８５およびＭＥ０３８６をそれぞれ７６％および４１％収率で提供した。

銅触媒によるアジド−アルキン環化付加におけるトリプロパルギルアミン以外のエチン誘導体の使用によって、他の種類の三価または四価シアル酸誘導体が得られる。

スキーム1.^aME0385およびME0386の合成
^a試薬および条件:(a)i:分子篩3Å、2-ブロモエタノールまたは3-ブロモプロパン-1-オール、CH₃CN/CH₂Cl₂(3:2)、室温、2時間、ii:AgOTf、IBr、-73℃、4.5時間、iii:DIPEA、-73℃、30分。(b)NaN₃、TBAI、DMSO、室温、6時間。(c)i:NaOMe、MeOH、室温、3時間、ii:H⁺イオン交換樹脂。(d)トリプロパルギルアミン、CuSO₄、アスコルビン酸ナトリウム、THF/H₂O(1:1)、50℃、3時間、次いで室温、18時間。(e)i:LiOH、MeOH、室温、9時間、ii:H⁺イオン交換樹脂。

Ｎ−変性三価シアル酸である、トリス（（１−（２−Ｏ−（５−Ｎ−プロパノイルアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸））−２−オキソエチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミンＭＥ０４０８およびトリス（（１−（２−Ｏ−（５−Ｎ−プロパノイルアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸））−３−オキソプロピル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミンＭＥ０４０７は、市販のシアル酸から１３ステップで、または重要中間体２から５ステップで生成できた（スキーム１）。化合物２の合成は、公開されている手順（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００９、５２、３６６６）に従って実施した。次のステップは、化合物ＭＥ０３８５およびＭＥ０３８６への先述した合成経路と類似していた。こうして、連続するグリコシル化、アジド形成およびＯ−脱アシル化反応により、アノマー的に純粋な生成物８ａおよび８ｂを、３ステップにわたってそれぞれ４６％および５５％収率で得た。その後の「クリック」反応により、三価化合物１０ａおよび１０ｂをそれぞれ５０％および３４％収率で提供した。最後に、メチルエステル１０ａおよび１０ｂの鹸化により、標的生成物ＭＥ０４０８およびＭＥ０４０７を良好な収率で得た。

グリコシル化反応のための一般的方法。
グリコシルドナー１または２（１．０当量）および新たに砕いた分子篩３Å（１．５ｇ／ｍｍｏｌ）を、ＣＨ₃ＣＮ／ＣＨ₂Ｃｌ₂の混合物（３：２；３５ｍＬ／ｍｍｏｌ）に室温および窒素雰囲気下で溶解／懸濁した。２−ブロモエタノールまたは３−ブロモプロパン−１−オール（４．５当量）を添加し、混合物を２時間撹拌した。反応物を光から保護し、ＣＨ₃ＣＮ中の銀トリフレート（２．０当量）の溶液を添加した。混合物を−７３℃（−７０℃＜ｔ＜−７５℃）に冷却し、ＩＢｒ（１．４当量、ＣＨ₂Ｃｌ₂中１Ｍ）を添加した。反応を−７３℃で４．５時間進行させた。完了後、ＤＩＰＥＡ（６．０当量）を添加した。反応混合物を−７３℃でさらに３０分間撹拌し、次いで、室温に加温させた。混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）パッドに通して濾過し、ＣＨ₂Ｃｌ₂またはＣＨ₃ＣＮで洗浄し、溶媒を濃縮乾固した。

メチル（２−ブロモエトキシ（５−Ｎ−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノニロピラノシル））−オネート（３ａ）。化合物３ａは、グリコシル化反応のための一般的方法に準じて合成した。カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／ＥｔＯＡｃの勾配）による精製により、化合物３ａおよび対応する逆アノマーを得た。化合物３ａを、さらに精製することなく次のステップにおいて使用した。

メチル（３−ブロモ−プロピルオキシ（５−Ｎ−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノニロピラノシル））−オネート（３ｂ）。化合物３ｂは、グリコシル化反応のための一般的方法に準じて合成した。カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／ＥｔＯＡｃの勾配）による精製により、化合物３ｂおよび対応する逆アノマーを得た。化合物３ｂを、さらに精製することなく次のステップにおいて使用した。

メチル（２−ブロモエトキシ（５−Ｎ−プロパノイルアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノニロピラノシル））−オネート（４ａ）。化合物４ａは、グリコシル化反応のための一般的方法に準じて合成した。カラムクロマトグラフィー（トルエン／ＥｔＯＨ、１０：１）による精製により、化合物４ａおよび対応する逆アノマー（３９０ｍｇ、９５％；α／β（６：１））を得た。化合物４ａを、さらに精製することなく次のステップにおいて使用した。

メチル（３−ブロモ−プロピルオキシ（５−Ｎ−プロパノイルアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノニロピラノシル））−オネート（４ｂ）。化合物４ｂは、グリコシル化反応のための一般的方法に準じて合成した。カラムクロマトグラフィー（トルエン／ＥｔＯＨ、８：１）による精製により、化合物４ｂおよび対応する逆アノマー（４００ｍｇ、９８％；α／β（２２：３））を得た。化合物４ｂを、さらに精製することなく次のステップにおいて使用した。

アジド誘導体の合成のための一般的方法。
ＤＭＳＯ（４０ｍＬ／ｍｍｏｌ）に溶解したブロモ誘導体（１．０当量）に、アジ化ナトリウム（６．０当量）およびＴＢＡＩ（２．０当量）を連続的に小分けにして添加した。反応を、室温および窒素雰囲気下で６時間進行させた。完了後、混合物をＣＨ₂Ｃｌ₂で希釈し、水およびブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、濾過し、濃縮乾固した。

メチル（２−アジドエトキシ（５−Ｎ−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノニロピラノシル））−オネート（５ａ）。化合物５ａは、アジド誘導体の合成のための一般的方法に準じて合成した。カラムクロマトグラフィー（ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＭｅＯＨ、９５：５）による精製により、化合物５ａおよび対応する逆アノマー（α／β（５：１））を得た。化合物５ａを、さらに精製することなく次のステップにおいて使用した。

メチル（３−アジド−プロピルオキシ（５−Ｎ−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノニロピラノシル））−オネート（５ｂ）。化合物５ｂは、アジド誘導体の合成のための一般的方法に準じて合成した。カラムクロマトグラフィー（ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＭｅＯＨ、９５：５）による精製により、化合物５ｂおよび対応する逆アノマー（α／β（データなし））を得た。化合物５ｂを、さらに精製することなく次のステップにおいて使用した。

メチル（２−アジドエトキシ（５−Ｎ−プロパノイルアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノニロピラノシル））−オネート（６ａ）。化合物６ａは、アジド誘導体の合成のための一般的方法に準じて合成した。カラムクロマトグラフィー（トルエン／ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＭｅＯＨ、１０：２：０．５）による精製により、化合物６ａおよび対応する逆アノマー（３６６ｍｇ、定量的；α／β（６：１））を得た。化合物６ａを、さらに精製することなく次のステップにおいて使用した。

メチル（３−アジド−プロピルオキシ（５−Ｎ−プロパノイルアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノニロピラノシル））−オネート（６ｂ）。化合物６ｂは、アジド誘導体の合成のための一般的方法に準じて合成した。カラムクロマトグラフィー（トルエン／ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＭｅＯＨ、８：２：０．５）による精製により、化合物６ｂおよび対応する逆アノマー（４１９ｍｇ、定量的；α／β（２２：３））を得た。化合物６ｂを、さらに精製することなく次のステップにおいて使用した。

シアロシドのＯ−脱アシル化のための一般的方法。
ＭｅＯＨ（７０ｍＬ）に溶解したペルアシル化シアロシド（１．０当量）に、ナトリウムメトキシド（３．９当量）を添加した。反応を、室温および窒素雰囲気下で３時間進行させた。完了後、溶液を、氷ＡｃＯＨの滴下添加によってまたはＡｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）１５によって中和した。次いで、溶媒を濃縮乾固した。

メチル（２−アジドエトキシ（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノニロピラノシル））−オネート（７ａ）。化合物７ａは、シアロシドのＯ−脱アシル化のための一般的方法に準じて合成した。カラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ＥｔＯＨ／Ｈ₂Ｏ、４：１：０．１）による精製により、化合物７ａ（３ステップにわたって２５６ｍｇ、４６％収率）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ3.93-4.02 (m, 1H, -OCH_2b-), 3.85 (s, 3H, OCH₃), 3.80-3.84 (m, 2H, H-8, H-9_b), 3.77 (t, J_5,4 ≒ J_5,6 = 10.2 Hz, 1H, H-5), 3.60-3.73 (m, 3H, H-4, H-9_a, -OCH_2a-), 3.58 (dd, J_6,5 = 10.7およびJ_6,7 = 1.8 Hz, 1H, H-6), 3.51 (dd, J_7,8 = 8.7およびJ_6,7 = 1.8 Hz, 1H, H-7), 3.27-3.43 (m, 2H, -CH₂N₃), 2.72 (dd, J_3eq,3ax = 12.8およびJ_3eq,4 = 4.6 Hz, 1H, H-3_eq), 2.00 (s, 3H, COCH₃), 1.77 (dd, J_3eq,3ax = 12.8およびJ_3ax,4 = 11.8 Hz, 1H, H-3_ax).
¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ175.22, 170.71, 100.20, 75.05, 72.37, 70.18, 68.49, 64.74, 64.47, 53.79, 53.42, 51.74, 41.57, 22.66.
ESI-MS m/z:計算値はC₁₄H₂₆N₄O₉ (M+H)⁺ 392.15およびC₁₄H₂₅N₄NaO₉ (M+Na)⁺ 415.14; 実測値は各々392.56および415.31.

メチル（３−アジド−プロピルオキシ（５−Ｎアセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノニロピラノシル））−オネート（７ｂ）。化合物７ｂは、シアロシドのＯ−脱アシル化のための一般的方法に準じて合成した。カラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ＥｔＯＨ／Ｈ₂Ｏ、４：１：０．１）による精製により、化合物７ｂ（３ステップにわたって２８９ｍｇ、５５％収率）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ3.80-3.92 (m, 6H, -OCH_2b-, H-9_b, H-8, OCH₃), 3.77 (t, J_5,4 ≒ J_5,6 = 10.2 Hz, 1H, H-5), 3.61-3.69 (m, 2H, H-9_a, H-4), 3.59 (dd, J_6,5 = 10.3およびJ_6,7 = 2.0 Hz, 1H, H-6), 3.51 (dd, J_7,8 = 9.2およびJ_6,7 = 1.9 Hz, 1H, H-7), 3.43-3.50 (m, 1H, OCH_2a-), 3.38 (t, J = 6.6 Hz, 2H, -CH₂N₃), 2.68 (dd, J_3eq,3ax = 12.8およびJ_3eq,4 = 4.7 Hz, 1H, H-3_eq), 2.00 (s, 3H, COCH₃), 1.75-1.85 (m, 2H, -CH₂-), 1.74 (dd, J_3eq,3ax = 12.8およびJ_3ax,4 = 11.8 Hz, 1H, H-3_ax).
¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ175.22, 171.06, 100.21, 74.97, 72.45, 70.20, 68.52, 64.71, 62.09, 53.83, 53.38, 48.98, 41.69, 30.14, 22.65.
ESI-MS m/z:計算値はC₁₅H₂₆N₄O₉ (M+H)⁺ 407.17およびC₁₅H₂₅N₄NaO₉ (M+Na)⁺ 429.16; 実測値は各々406.87および428.56.

メチル（２−アジドエトキシ（５−Ｎ−プロパノイルアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノニロピラノシル））−オネート（８ａ）。化合物８ａは、シアロシドのＯ−脱アシル化のための一般的方法に準じて合成した。カラムクロマトグラフィー（トルエン／ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＭｅＯＨ、３．５：６：０．５から３：６：１）による精製により、化合物８ａ（３ステップにわたって１２０ｍｇ、４６％収率）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ3.94-4.00 (m, 1H, -OCH_2b-), 3.85 (s, 3H, OCH₃), 3.80-3.84 (m, 2H, H-8, H-9_b), 3.77 (t, J_5,4 ≒ J_5,6 = 10.4 Hz, 1H, H-5), 3.67-3.72 (ddd, J_4,3ax = 11.6, J_5,4 = 10.4, J_4,3eq = 4.6 Hz, 1H, H-4), 3.60-3.66 (m, 2H, H-9_a, -OCH_2a-), 3.57 (dd, J_6,5 = 10.2およびJ_6,7 = 1.6 Hz, 1H, H-6), 3.49 (dd, J_7,8 = 8.9およびJ_6,7 = 1.6 Hz, 1H, H-7), 3.32-3.35 (m, 1H, -CH_2bN₃), 2.72 (dd, J_3eq,3ax = 12.8およびJ_3eq,4 = 4.6 Hz, 1H, H-3_eq), 2.27 (q, J = 7.6 Hz, 2H, -COCH₂-), 1.76 (dd, J_3eq,3ax = 12.8およびJ_3ax,4 = 11.6 Hz, 1H, H-3_ax), 1.14 (t, J = 7.6 Hz, 3H, -COCH₂).
¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ179.01, 170.73, 100.19, 75.09, 72.36, 70.17, 68.40, 64.72, 64.47, 53.64, 53.43, 51.73, 41.64, 30.16, 10.28.
ESI-MS m/z:計算値はC₁₅H₂₇N₄O₉ (M+H)⁺ 407.18およびC₁₅H₂₆N₄NaO₉ (M+Na)⁺ 429.16; 実測値は各々407.09および429.02.

メチル（３−アジド−プロピルオキシ（５−Ｎ−プロパノイルアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノニロピラノシル））−オネート（８ｂ）。化合物８ｂは、シアロシドのＯ−脱アシル化のための一般的方法に準じて合成した。カラムクロマトグラフィー（トルエン／ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＭｅＯＨ、３．５：６：０．５から３：６：１）による精製により、化合物８ｂ（３ステップにわたって１５７ｍｇ、５５％収率）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ3.80-3.89 (m, 3H, -OCH_2b-, H-9_b, H-8), 3.84 (s, 3H, OCH₃), 3.76 (t, J_5,4 ≒ J_5,6 = 10.2 Hz, 1H, H-5), 3.60-3.69 (m, 2H, H-9_a, H-4), 3.58 (dd, J_6,5 = 10.2およびJ_6,7 = 1.6 Hz, 1H, H-6), 3.49 (dd, J_7,8 = 8.9およびJ_6,7 = 1.6 Hz, 1H, H-7), 3.43-3.50 (m, 1H, OCH_2a-), 3.38 (t, J = 6.6 Hz, 2H, -CH₂N₃), 2.68 (dd, J_3eq,3ax = 12.8およびJ_3eq,4 = 4.6 Hz, 1H, H-3_eq), 2.27 (q, J = 7.6 Hz, 2H, -COCH₂-), 1.75-1.83 (m, 2H, -CH₂-), 1.74 (dd, J_3eq,3ax = 12.8およびJ_3ax,4 = 11.8 Hz, 1H, H-3_ax), 1.13 (t, J = 7.6 Hz, 3H, COCH₂ CH ₃).
¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ178.99, 171.08, 100.20, 75.01, 72.43, 70.18, 68.42, 64.69, 62.07, 53.68, 53.39, 48.78, 41.76, 30.16, 30.13, 10.28.
ESI-MS m/z:計算値はC₁₆H₂₉N₄O₉ (M+H)⁺ 421.19およびC₁₆H₂₈N₄NaO₉ (M+Na)⁺ 443.18; 実測値は各々420.99および442.93.

三価シアル酸の合成のための一般的方法。
ＴＨＦ／Ｈ₂Ｏ（１：１、８１ｍＬ／ｍｍｏｌ）に溶解したアジド誘導体（３．７当量）に、トリプロパルギルアミン（１．０当量）、ＣｕＳＯ₄（０．９当量）およびアスコルビン酸ナトリウム（０．９当量）を連続的に添加した。反応を５０℃で３時間および室温でさらに１８時間進行させた。出発アジドの完全消費後、ＴＨＦを真空下で蒸発させ、粗製物をフリーズドライした。粗固体をＤＭＳＯに溶解し、ＨＰＬＣ（Ａ：Ｈ₂Ｏ中０．００５％ＣＦ₃ＣＯＯＨ水溶液、Ｂ：ＣＨ₃ＣＮ中０．００５％ＣＦ₃ＣＯＯＨ水溶液、７％から２５％の有機相勾配）によって精製した。収集された化合物含有画分をフリーズドライして、純粋生成物を得た。

トリス（（１−（２−Ｏ−（（メチル（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノニロピラノシル）−オネート））−２−オキソエチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミン（９ａ）。化合物９ａは、三価シアル酸の合成のための一般的方法に準じて合成した（４０ｍｇ、５１％収率）。
¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ8.08 (s, 3H, 3ArCH), 8.01 (d, J_5,NH = 8.4 Hz, 3H, 3NH), 4.60 (t, J = 5.0 Hz, 6H, 3-CH₂-ArN), 4.15-4.27 (m, 3H, 3-OCH_2b), 3.70-3.97 (m, 27H, 3-OCH_2a, 3H-9_b,-N(CH₂)₃, 3H-8, 3H-5, 3-OCH₃), 3.55-3.67 (m, 9H, 3H-4, 3H-9_b, 3H-6), 3.48 (dd, J_7,8 = 8.8およびJ_6,7 = 1.4 Hz, 3H, H-7), 2.58 (dd, J_3eq,3ax = 12.8およびJ_3eq,4 = 4.7 Hz, 3H, 3H-3_eq), 1.99 (s, 9H, 3-COCH₃), 1.71 (dd, J_3eq,3ax = 12.8およびJ_3ax,4 = 11.7 Hz, 3H, 3H-3_ax).
¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ175.12, 170.47, 144.25, 126.94, 100.28, 75.07, 72.25, 70.16, 68.40, 64.84, 63.91, 53.68, 53.55, 51.47, 48.73, 41.44, 22.70.
ESI-MS m/z:計算値はC₅₁H₈₂N₁₃O₂₇ (M+H)⁺ 1308.54; 実測値1309.47.

トリス（（１−（２−Ｏ−（メチル（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノニロピラノシル）−オネート））−３−オキソプロピル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４，１−イル）メチル）アミン（９ｂ）。化合物９ｂは、三価シアル酸の合成のための一般的方法に準じて合成した（６０ｍｇ、４５％収率）。
¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ8.01 (s, 3H, 3ArCH), 4.50 (t, J = 6.6 Hz, 6H, 3-CH₂-ArN), 3.70-3.88 (m, 27H, 3-OCH_2b-,3H-9_b, 3-OCH₃, -N(CH₂)₃, 3H-8, 3H-5), 3.54-3.69 (m, 9H, 3H-4, 3H-9_b, 3H-6), 3.49 (dd, J_7,8 = 9.0およびJ_6,7 = 1.3 Hz, 3H, 3H-7), 3.35-3.43 (m, 3H, 3-OCH_2a), 2.68 (dd, J_3eq,3ax = 12.8およびJ_3eq,4 = 4.7 Hz, 3H, 3H-3_eq), 2.09-2.20 (m, 6H, 3-CH₂-), 2.00 (s, 9H, 3-COCH₃), 1.74 (dd, J_3eq,3ax = 12.7およびJ_3ax,4 = 11.8 Hz, 3H, 3H-3_ax).
¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ175.20, 170.86, 145.26, 125.97, 100.12, 74.92, 72.43, 70.19, 68.50, 64.77, 61.77, 53.80, 53.54, 48.48, 48.10, 41.65, 31.29, 22.72.
ESI-MS m/z:計算値はC₅₄H₈₈N₁₃O₂₇ (M+H)⁺ 1350.58; 実測値1350.21.

トリス（（１−（２−Ｏ−（メチル（５−Ｎ−プロパノイルアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノニロピラノシル）−オネート））−２−オキソエチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミン（１０ａ）。化合物１０ａは、三価シアル酸の合成のための一般的方法に準じて合成した（６０ｍｇ、５０％収率）。
¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ8.04 (s, 3H, 3ArCH), 4.50 (t, J = 5.1 Hz, 6H, 3-CH₂-ArN), 4.16-4.23 (m, 3H, 3-OCH_2b), 3.86-3.92 (m, 3H, 3-OCH_2a), 3.74-3.84 (m, 15H, 3H-9_b,-N(CH₂)₃, 3H-8, 3H-5), 3.72 (s, 9H, 3-OCH₃), 3.59-3.67 (m, 6H, 3H-4, 3H-9_b), 3.57 (dd, J_6,5 = 10.4およびJ_6,7 = 1.3 Hz, 3H, 3H-6), 3.47 (dd, J_7,8 = 8.9およびJ_6,7 = 1.3 Hz, 3H, H-7), 2.58 (dd, J_3eq,3ax = 12.4およびJ_3eq,4 = 4.6 Hz, 3H, 3H-3_eq), 2.25 (q, J = 7.6 Hz, 6H, 3-COCH₂-), 1.74 (見かけ上t, J_3eq,3ax ≒ J_3ax,4 = 12.4 Hz, 3H, 3H-3_ax), 1.12 (t, J = 7.6 Hz, 9H, 3-COCH₂CH₃).
¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ178.88, 170.43, 145.08, 126.66, 100.23, 75.04, 72.15, 69.97, 68.29, 64.73, 63.95, 53.60, 53.45, 51.43, 49.07, 41.52, 31.15, 10.36.
ESI-MS m/z:計算値はC₅₄H₈₈N₁₃O₂₇ (M+H)⁺ 1350.59; 実測値1351.56.

トリス（（１−（２−Ｏ−（メチル（５−Ｎ−プロパノイルアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノニロピラノシル）−オネート））−３−オキソプロピル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミン（１０ｂ）。化合物１０ｂは、三価シアル酸の合成のための一般的方法に準じて合成した（４５ｍｇ、３４％収率）。
¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ8.03 (s, 3H, 3ArCH), 7.89 (d, J_5,NH = 8.5 Hz, 3H, 3NH), 4.50 (t, J = 6.5 Hz, 6H, 3-CH₂-ArN), 3.73-3.86 (m, 18H, 3-OCH_2b-,3H-9_b,-N(CH₂)₃, 3H-8, 3H-5), 3.81 (s, 9H, 3-OCH₃), 3.58-3.70 (m, 6H, 3H-4, 3H-9_b), 3.56 (dd, J_6,5 = 10.4およびJ_6,7 = 1.3 Hz, 3H, 3H-6), 3.47 (dd, J_7,8 = 8.9およびJ_6,7 = 1.3 Hz, 3H, 3H-7), 3.35-3.43 (m, 3H, 3-OCH_2a), 2.68 (dd, J_3eq,3ax = 12.4およびJ_3eq,4 = 4.6 Hz, 3H, 3H-3_eq), 2.27 (q, J = 7.6 Hz, 6H, 3-COCH₂-), 2.10-2.20 (m, 6H, 3-CH₂-), 1.74 (見かけ上t, J_3eq,3ax ≒ J_3ax,4 = 12.4 Hz, 3H, 3H-3_ax), 1.13 (t, J = 7.6 Hz, 9H, 3-COCH₂ CH ₃).
¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ178.92, 170.88, 143.82, 126.16, 100.12, 75.01, 72.44, 70.22, 68.44, 64.72, 61.73, 53.67, 53.52, 49.28, 49.07, 41.75, 31.28, 30.17, 10.32.
ESI-MS m/z:計算値はC₅₇H₉₄N₁₃O₂₇ (M+H)⁺ 1392.64およびC₅₇H₉₃N₁₃NaO₂₇ (M+Na)⁺ 1414.62; 実測値は各々1392.50および1414.47.

メチルエステルの鹸化のための一般的方法。
ＭｅＯＨ（１３５ｍＬ／ｍｍｏｌ）に溶解した三価メチルエステル誘導体（１．０当量）に、ＬｉＯＨの水溶液（１Ｍ、９．０当量）を添加した。混合を室温で９時間進行させた。完了後、反応混合物をダウエックス５０Ｗ８（Ｈ⁺）で中和した。ダウエックス樹脂の除去後、溶媒を真空下で蒸発させ、水に溶解した粗製物を、Ｃ−１８プラグ上でＨ₂Ｏを用いて溶離した。化合物含有画分をフリーズドライすると、純粋な三価シアル酸誘導体を生じた。

トリス（（１−（２−Ｏ−（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノニロピラノシロン酸（ｎｏｎｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ）））−２−オキソエチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミン（ＭＥ０３８５）。ＭＥ０３８５は、メチルエステルの鹸化のための一般的方法に準じて合成した（２２ｍｇ、７６％収率）。

¹H NMR (400 MHz, D₂O): δ8.40 (s, 3H, 3ArCH), 4.72 (t, J = 5.2 Hz, 6H, 3-CH₂-ArN), 4.60 (bs, 6H, -N(CH₂)₃), 4.14-4.27 (m, 3H, 3-OCH_2b), 3.93-4.02 (m, 3H, 3-OCH_2a), 3.85 (dd, J_9a,9b = 11.7およびJ_9b,8 = 2.3 Hz 3H, 3H-9_b), 3.73-3.82 (m, 6H, 3H-8, 3H-5), 3.59-3.72 (m, 9H, 3H-4, 3H-6, 3H-9_a), 3.56 (dd, J_7,8 = 9.3およびJ_6,7 = 1.7 Hz, 3H, H-7), 2.66 (dd, J_3eq,3ax = 12.5およびJ_3eq,4 = 4.6 Hz, 3H, 3H-3_eq), 2.04 (s, 9H, 3-COCH₃), 1.67 (見かけ上t, J_3eq,3ax ≒ J_3ax,4 = 12.0 Hz, 3H, 3H-3_ax).
¹³C NMR (100 MHz, D₂O): δ175.05, 172.55, 135.87, 128.64, 100.05, 72.72, 71.42, 68.10, 67.88, 62.68, 62.58, 51.73, 50.57, 46.49, 39.64, 22.0.
ESI-MS m/z:計算値はC₄₈H₇₆N₁₃O₂₇ (M+H)⁺ 1266.49; 実測値1266.29.

トリス（（１−（２−Ｏ−（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノニロピラノシロン酸））−３−オキソプロピル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミン（ＭＥ０３８６）。ＭＥ０３８６は、メチルエステルの鹸化のための一般的方法に準じて合成した（２７ｍｇ、７５％収率）。

¹H NMR (400 MHz, D₂O): δ8.02 (s, 3H, 3ArCH), 4.45-4.64 (m, 6H, 3-CH₂-ArN), 3.92 (bs, 6H, N(CH₂)₃), 3.56-3.87 (m, 24H, 3H-9_b, 3-OCH₂-, 3H-8, 3H-5, 3H-4, 3H-6, 3H-9_a), 3.46-3.54 (m, 3H, 3H-7), 2.73 (dd, J_3eq,3ax = 12.5およびJ_3eq,4 = 4.7 Hz, 3H, 3H-3_eq), 2.15-2.25 (m, 6H, 3-CH₂-), 2.05 (s, 9H, COCH₃), 1.63 (見かけ上t, J_3eq,3ax ≒ J_3ax,4 = 12.1 Hz, 3H, 3H-3_ax).
¹³C NMR (100 MHz, D₂O): δ175.05, 173.52, 142.34, 125.79, 100.48, 72.56, 71.71, 68.28, 68.16, 62.51, 61.22, 51.89, 47.54, 47.30, 40.29, 29.64, 22.02.
ESI-MS m/z:計算値はC₅₁H₈₂N₁₃O₂₇ (M+H)⁺ 1308.54; 実測値1308.51.

トリス（（１−（２−Ｏ−（５−Ｎ−プロパノイルアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノニロピラノシロン酸））−２−オキソエチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミン（ＭＥ０４０８）。ＭＥ０４０８は、メチルエステルの鹸化のための一般的方法に準じて合成した（１９ｍｇ、７２％収率）。

¹H NMR (400 MHz, D₂O): δ8.17 (s, 3H, 3ArCH), 4.64 (bs, 6H, 3-CH₂-ArN), 4.07-4.20 (m, 9H, 3-OCH_2b, -N(CH₂)₃), 3.87-3.93 (m, 3H, 3-OCH_2a), 3.82 (dd, J_9a,9b = 11.7およびJ_9b,8 = 2.4 Hz 3H, 3H-9_b), 3.75 (ddd, J_8,7 = 8.9, J_8,9a = 5.6 Hz , J_9b,8 = 2.4 Hz 3H, 3H-8), 3.72 (t, J_5,6 ≒ J_5,4 = 10.1 Hz, 3H, 3H-5), 3.63-3.69 (m, 3H, 3H-4), 3.56-3.63 (m, 6H, 3H-6, 3H-9_a), 3.51 (dd, J_7,8 = 8.9およびJ_6,7 = 1.6 Hz, 3H, H-7), 2.66 (dd, J_3eq,3ax = 12.3およびJ_3eq,4 = 4.6 Hz, 3H, 3H-3_eq), 2.28 (q, J = 7.6 Hz, 6H, 3-COCH₂-), 1.74 (見かけ上t, J_3eq,3ax ≒ J_3ax,4 = 12.3 Hz, 3H, 3H-3_ax), 1.10 (t, J = 7.6 Hz, 9H, 3-COCH₂CH₃).
¹³C NMR (100 MHz, D₂O): δ179.90, 174.12, 127.82, 101.35, 73.50, 72.50, 69.00, 68.91, 63.74, 63.40, 52.51, 51.39, 49.84, 40.87, 30.05, 10.36.
ESI-MS m/z:計算値はC₅₁H₈₂N₁₃O₂₇ (M+H)⁺ 1308.54; 実測値1308.44.

トリス（（１−（２−Ｏ−（５−Ｎ−プロパノイルアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノニロピラノシロン酸）−３−オキソプロピル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミン（ＭＥ０４０７）。ＭＥ０４０７は、メチルエステルの鹸化のための一般的方法に準じて合成した（２７ｍｇ、７５％収率）。

¹H NMR (400 MHz, D₂O): δ8.31 (s, 3H, 3ArCH), 4.53-4.63 (m, 12H, 3-CH₂-ArN, N(CH₂)₃), 3.82 (dd, J_9b,9a = 11.8およびJ_9b,8 = 2.4 Hz, 3H, H-9_b), 3.74-3.83 (m, 12H, 3-OCH_2b-, 3H-8, 3H-5), 3.67-3.73 (m, 3H, 3H-4), 3.67 (dd, J_6,5 = 10.4およびJ_6,7 = 1.5 Hz, 3H, 3H-6), 3.60 (dd, J_9a,9b = 11.8およびJ_9a,8 = 5.9 Hz, 3H, 3H-9_a), 3.53 (dd, J_7,8 = 8.9およびJ_6,7 = 1.5 Hz, 3H, 3H-7), 3.42-3.50 (m, 3H, 3-OCH_2a), 2.69 (dd, J_3eq,3ax = 12.4およびJ_3eq,4 = 4.5 Hz, 3H, 3H-3_eq), 2.29 (q, J = 7.6 Hz, 6H, 3-COCH₂-), 2.15-2.25 (m, 6H, 3-CH₂-), 1.65 (見かけ上t, J_3eq,3ax ≒ J_3ax,4 = 12.4 Hz, 3H, 3H-3_ax), 1.11 (t, J = 7.6 Hz, 9H, 3-COCH₂ CH ₃).
¹³C NMR (100 MHz, D₂O): δ178.87, 173.77, 136.66, 128.98, 100.86, 73.47, 72.34, 69.04, 68.66, 63.47, 61.82, 52.52, 48.52, 47.57, 40.83, 30.17, 30.01, 10.30.
ESI-MS m/z:計算値はC₅₄H₈₈N₁₃O₂₇ (M+H)⁺ 1350.59; 実測値1350.28.

コア部分としてのトリス（２−アジドエチル）アミンの使用
トリス（（４−（２−Ｏ−（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸））−２−オキソエチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）エチル）アミン（ＭＥ０４６１）およびトリス（（４−（２−Ｏ−（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸））−２−オキソメチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）エチル）アミン（ＭＥ０４６２）等のＮ−アシル三価シアル酸への経路は、簡単であることが判明し、市販の化学物質から７ステップで、または重要中間体１から４ステップで実現できた（スキーム２）。市販のシアル酸から容易に調製されるシアル酸チオフェニル誘導体１の合成は、公開されている手順（Ｍａｒｒａら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９８９、１８７、３５）に従って実施した。シアロシド１１ａおよび１１ｂは、対応するアルコール（それぞれプロパルギルアルコールおよび３−ブチン−１−オール）を化合物１によりグリコシル化することによって、適度な変換率で得られた。他のアルキンアルコールを使用すれば、他の長さのリンカーを持つビルディングブロックが得られるはずである。この反応により、アノマーからなる分離できない混合物が、得られた排出生成物と一緒に生じ、この段階では脱離生成物はさらに精製しなかった。

その後の標準的なツェンプレン条件を使用するＯ−脱アシル化により、アノマー的に純粋な１２ａおよび１２ｂを、２ステップによりそれぞれ４８％および３１％収率で得た。

次いで、化合物１２ａおよび１２ｂをトリス（２−アジドエチル）アミン（１３）と、銅触媒によるアジド−アルキン環化付加反応（「クリック」反応）において反応させた。

トリスアジド誘導体１３は、市販のトリエタノールアミンから２ステップで合成した。最初に、トリエタノールアミンを公開されている手順（Ｍ．Ｓｕｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２、１３４（５１）、２０５８１）に従ってトリス（２−クロロエチル）アミンに変換した。次いで、クロロ誘導体は、そのアジド類似体１３に容易に変換された（注：１３は爆発性が高く、したがって、常に溶液中および暗所で貯蔵することが不可欠である）。メチルエステル１４ａおよび１４ｂは、それぞれ７６％および５３％収率で得られた。

その後の鹸化により、最終標的化合物ＭＥ０４６２およびＭＥ０４６１をそれぞれ定量的および８８％収率で提供した。

スキーム2.^aME0462およびME0461の合成
^a試薬および条件:(a)i:分子篩3Å、3-ブチン-1オールまたはプロパルギルアルコール、CH₃CN/CH₂Cl₂(3:2)、室温、2時間、ii:AgOTf、IBr、-73℃、4.5時間、iii:DIPEA、-73℃、30分。(b)i:NaOMe、MeOH、室温、3時間、ii:H⁺イオン交換樹脂。(c)CuSO₄、アスコルビン酸ナトリウム、THF/H₂O(1:1)、50℃、3時間、次いで、室温、18時間。(d)i:LiOH、MeOH、室温、9時間、ii:H⁺イオン交換樹脂。

グリコシル化反応のための一般的方法。
グリコシルドナー１（１．０当量）および新たに砕いた分子篩３Å（１．５ｇ／ｍｍｏｌ）を、ＣＨ₃ＣＮ／ＣＨ₂Ｃｌ₂の混合物（３：２；３５ｍＬ／ｍｍｏｌ）に室温および窒素雰囲気下で溶解／懸濁した。３−ブチン−１−オールまたはプロパルギルアルコール（４．５当量）を添加し、混合物を２時間撹拌した。反応物を光から保護し、ＣＨ₃ＣＮ中の銀トリフレート（２．０当量）の溶液を添加した。混合物を−７３℃（−７０℃＜ｔ＜−７５℃）に冷却し、ＩＢｒ（１．４当量、ＣＨ₂Ｃｌ₂中１Ｍ）を添加した。反応を−７３℃で４．５時間進行させた。完了後、ＤＩＰＥＡ（６．０当量）を添加した。反応混合物を−７３℃でさらに３０分間撹拌し、次いで、室温に加温させた。混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）パッドに通して濾過し、ＣＨ₂Ｃｌ₂またはＣＨ₃ＣＮで洗浄し、溶媒を濃縮乾固した。

メチル２−（プロパ−２−イニルオキシ（５−Ｎ−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシル））−オネート（１１ａ）。化合物１１ａは、グリコシル化反応のための一般的方法に準じて合成した。カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／ＥｔＯＡｃの勾配）による精製により、化合物１１ａおよび対応する逆アノマーを得た。化合物１１ａを、さらに精製することなく次のステップにおいて使用した。

メチル２−（ブタ−３−イニルオキシ（５−Ｎ−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシル））−オネート（１１ｂ）。化合物１１ｂは、グリコシル化反応のための一般的方法に準じて合成した。カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／ＥｔＯＡｃの勾配）による精製により、化合物１１ｂおよび対応する逆アノマーを得た。化合物１１ｂを、さらに精製することなく次のステップにおいて使用した。

シアロシドのＯ−脱アシル化のための一般的方法。
ＭｅＯＨ（７０ｍＬ）に溶解したペルアシル化シアロシド（１．０当量）に、ナトリウムメトキシド（３．９当量）を添加した。反応を、室温および窒素雰囲気下で３時間進行させた。完了後、溶液を、氷ＡｃＯＨの滴下添加によってまたはＡｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）１５によって中和した。次いで、溶媒を濃縮乾固した。

メチル２−（プロパ−２−イニルオキシ（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシル））−オネート（１２ａ）。化合物１２ａは、シアロシドのＯ−脱アシル化のための一般的方法に準じて合成した。ＨＰＬＣ（Ａ：Ｈ₂Ｏ中０．００５％ＨＣＯＯＨ水溶液、Ｂ：ＣＨ₃ＣＮ中０．００５％ＨＣＯＯＨ水溶液、５％から２０％の有機相勾配）による精製により、化合物１２ａ（２ステップにわたって１７８ｍｇ、４８％収率）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ4.40 (dd, J=4.3 Hz, J=15.9 Hz, 1H), 4.33 (dd, J=4.3 Hz, J=15.9 Hz, 1H), 3.81-3.91 (m, 5H), 3.78 (d, J=10.3 Hz, 1H), 3.63-3.72 (m, 2H), 3.60 (dd, J=1.5 Hz, J=10.4 Hz, 1H), 3.52 (dd, J=1.4 Hz, J=9.0 Hz, 1H), 2.86 (t, J=2.4 Hz, 1H), 2.72 (dd, J_3eq,4 =4.6 Hz, J_3eq,3ax =12.7 Hz, 1H), 2.01 (s, 3H), 1.75 (dd, J_3eq,3ax =12.7 Hz, J_3ax,4 = 11.8 Hz, 1H).

メチル２−（ブタ−３−イニルオキシ（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシル））−オネート（１２ｂ）。化合物１２ｂは、シアロシドのＯ−脱アシル化のための一般的方法に準じて合成した。カラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ＥｔＯＨ／Ｈ₂Ｏ、４：１：０．１）による精製により、化合物１２ｂ（２ステップにわたって２１８ｍｇ、３１％収率）を得た。
¹H NMR (360 MHz, CD₃OD): δ3.72-3.95 (m, 7H), 3.45-3.71 (m, 6H), 2.69 (dd, J_3eq,4 =4.6 Hz, J_3eq,3ax =12.8 Hz, 1H), 2.35-2.45 (m, 2H), 2.26 (t, J = 2.7 Hz, 1H) 2.00 (s, 3H), 1.73 (dd, J_3eq,3ax =12.3 Hz, J_3ax,4 = 12.0 Hz, 1H).

トリス（２−アジドエチル）アミン（１３）
０．５ｍＬのＣＨＣｌ₃中のトリエタノールアミン（０．２９８ｇ、２．０ｍｍｏｌ）の溶液を、０．８ｍＬのＣＨＣｌ₃中の塩化チオニル（０．５２ｍＬ、７．０ｍｍｏｌ）の溶液に撹拌しながらゆっくり添加した。添加後、反応混合物を還流温度に４時間加熱した。室温に冷却した後、白色固体生成物を濾過し、ジクロロメタン（１．０ｍＬ×２）で洗浄して、真空で終夜乾燥させた後、トリス（２−クロロエチル）アミン塩酸塩を０．３９５ｇ（８２％）収率で得た。続いて、トリス（２−クロロエチル）アミン塩酸塩（０．１９８ｇ、０．８２ｍｍｏｌ）およびアジ化ナトリウム（０．３２０ｇ、４．９２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（７．０ｍＬ）に添加し、得られた混合物を９２℃で２２時間撹拌した。冷却した後、混合物を蒸留水（４０．０ｍＬ）に注ぎ入れ、溶液をＮａ₂ＣＯ₃（１０％水溶液）でｐＨ＝１０にアルカリ化し、ジクロロメタン（１５．０ｍＬ×３）で抽出した。有機相を水（２０．０ｍＬ）で洗浄し、次いで、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。ジクロロメタンを１ｍＬに濃縮し、次いで、１５．０ｍＬのＴＨＦを添加し、再度１．０ｍＬに濃縮し、１５．０ｍＬのＴＨＦを添加し、１．８ｍＬに濃縮した。０．８ｍｍｏｌのトリス（２−アジドエチル）アミンを含有するこのＴＨＦ溶液を次のステップにおいて使用することができた（注：１３は爆発性が高く、したがって、常に溶液中および暗所で貯蔵することが不可欠である）。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ3.33 (t, J=6.2 Hz, 6H), 2.76 (t, J=6.2 Hz, 6H).
ESI-MS m/z:計算値はC₆H₁₃N₁₀ (M+H)⁺ 225.13; 実測値225.33.

参考文献 Ｍ．Ｓｕｎ、Ｃ−Ｙ．Ｈｏｎｇ、Ｃ−Ｙ．Ｐａｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１２、１３４（５１）、２０５８１〜２０５８４。

トリス（（４−（２−Ｏ−（メチル（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシル）−オネート））−２−オキソメチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）エチル）アミン（１４ａ）
水（１．７ｍＬ）およびＴＨＦ（１．７ｍＬ）の１：１混合物中のトリス（２−アジドエチル）アミン（０．０７５ｍＬ、０．０３３ｍｍｏｌ）の溶液に、メチル２−（プロパ−２−イニルオキシ（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシル））−オネート（０．０５３８ｇ、０．１４９ｍｍｏｌ）、アスコルビン酸ナトリウム（５．９ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）および硫酸銅（ＩＩ）（４．８ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）を撹拌しながら添加した。混合物を最初に５０℃で３．５時間および室温で追加で１８時間加熱した。減圧下でのＴＨＦの蒸発後、残留物を蒸留水で２．６ｍＬに希釈し、次いで、分取ＨＰＬＣ（Ａ：Ｈ₂Ｏ中０．００５％ＨＣＯＯＨ水溶液、Ｂ：ＣＨ₃ＣＮ中０．００５％ＨＣＯＯＨ、５％から２０％／３０分の有機相勾配）で精製して、凍結乾燥後、白色生成物を７６％収率で得た。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.78 (s, 3H), 4.92 (d, J=12.6 Hz, 3H), 4.64 (d, J=12.1 Hz, 3H), 4.30 (t, J=6.2 Hz, 6H), 3.79-3.93 (m, 18H), 3.60-3.74 (m, 9H), 3.47-3.58 (m, 3H), 3.03 (t, J=5.9 Hz, 6H), 2.67 (dd, J_3eq,4 =4.6 Hz, J_3eq,3ax =12.8 Hz, 3H), 2.00 (s, 9H), 1.74 (t, J_3eq,3ax =12.3 Hz, 3H).
¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 175.05, 170.75, 145.52, 126.09, 100.06, 74.98, 72.26, 70.33, 68.53, 64.93, 58.51, 55.09, 53.71, 53.59, 41.65, 22.75.
ESI-MS m/z:計算値はC₅₁H₈₂N₁₃O₂₇ (M+H)⁺ 1308.54; 実測値1309.13.

トリス（（４−（２−Ｏ−（メチル（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシル）−オネート））−２−オキソエチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）エチル）アミン（１４ｂ）
水（２．５ｍＬ）およびＴＨＦ（２．５ｍＬ）の１：１混合物中のトリス（２−アジドエチル）アミン（０．１１３ｍＬ、０．０５ｍｍｏｌ）の溶液に、メチル２−（ブタ−３−イニルオキシ（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシル））−オネート（０．０８４５ｇ、０．２２５ｍｍｏｌ）、アスコルビン酸ナトリウム（８．９ｍｇ、０．０４４９ｍｍｏｌ）および硫酸銅（ＩＩ）（７．２ｍｇ、０．０４５１ｍｍｏｌ）を撹拌しながら添加した。混合物を最初に５０℃で３．５時間および室温で追加で１８時間加熱した。減圧下でのＴＨＦの蒸発後、残留物を蒸留水で３．０ｍＬに希釈し、次いで、分取ＨＰＬＣ（Ａ：Ｈ₂Ｏ中０．００５％ＨＣＯＯＨ水溶液、Ｂ：ＣＨ₃ＣＮ中０．００５％ＨＣＯＯＨ、５％から２０％／３０分の有機相勾配）で精製して、凍結乾燥後、３５．９ｍｇ（５３．２％）の白色生成物を得た。
¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 8.02 (d, J=8.5 Hz, 3H), 7.66 (s, 3H), 4.30 (t, J=5.9 Hz, 6H), 4.06 (dt, J=9.3 Hz, J=6.5 Hz, 3H), 3.74-3.87 (m, 18H), 3.57-3.72 (m, 12H), 3.50 (dd, J=1.2 Hz, J=8.7 Hz, 3H), 3.04 (t, J=5.7 Hz, 6H), 2.93 (t, J=6.1 Hz, 6H), 2.65 (dd, J_3eq,4 =4.6 Hz, J_3eq,3ax =12.7 Hz, 3H), 2.00 (s, 9H), 1.72 (t, J_3eq,3ax =12.3 Hz, 3H).
¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 175.16, 170.90, 146.05, 124.81, 100.22, 74.94, 72.44, 70.25, 68.52, 64.86, 64.05, 54.85, 53.80, 53.48, 41.74, 27.27, 22.72.
ESI-MS m/z:計算値はC₅₄H₈₈N₁₃O₂₇ (M+H)⁺ 1350.59; 実測値1351.70.

トリス（（４−（２−Ｏ−（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸））−２−オキソメチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）エチル）アミン（ＭＥ０４６２）
上記で得られたメチルエステル（１４ａ）をＭｅＯＨ（１．９ｍＬ）およびＬｉＯＨ（０．１５ｍＬ、１．０Ｍ）溶液に溶解した。混合物を室温で４４時間撹拌し、続いてＬＣＭＳを行い、アンバーライトＩＲ１２０でｐＨ＝７．０に中和し、濃縮し、凍結乾燥して、２０．２ｍｇの白色生成物を得た。

¹H NMR (400 MHz, D₂O): δ7.84 (s, 3H), 4.85 (d, J=12.0 Hz, 3H), 4.61 (d, J=12.0 Hz, 3H), 4.35 (t, J=6.0 Hz, 6H), 3.77-3.94 (m, 9H), 3.49-3.76 (m, 12H), 3.04 (t, J=6.0 Hz, 6H), 2.73 (dd, J_3eq,4 =4.5 Hz, J_3eq,3ax =12.4 Hz, 3H), 2.03 (s, 9H), 1.66 (t, J_3eq,3ax =12.3 Hz, 3H).
¹³C NMR (100 MHz, D₂O): δ174.99, 173.20, 143.93, 125.23, 100.66, 72.64, 71.61, 68.25, 68.21, 62.58, 57.31, 52.67, 51.81, 48.17, 40.23, 22.00.
ESI-MS m/z:計算値はC₄₈H₇₆N₁₃O₂₇ (M+H)⁺ 1266.50; 実測値1267.10.

トリス（（４−（２−Ｏ−（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸））−２−オキソエチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）エチル）アミン（ＭＥ０４６１）
メチルエステル（２５．８ｍｇ、１４ｂ）をＭｅＯＨ（２．５ｍＬ）およびＬｉＯＨ（０．１７ｍＬ、１．０Ｍ）溶液に溶解した。混合物を室温で７２時間撹拌し、続いてＬＣＭＳを行い、アンバーライトＩＲ１２０で中和し、濃縮し、凍結乾燥して、２２．０ｍｇ（８８．０％）の白色生成物を得た。

¹H NMR (400 MHz, D₂O): δ 7.68 (s, 3H), 4.47 (t, J=5.3 Hz, 6H), 3.96-4.10 (m, 3H), 3.66-3.87 (m, 18H), 3.59-3.66 (m, 3H), 3.52-3.58 (m, 3H), 3.30 (t, J=5.3 Hz, 6H), 2.99 (t, J=5.8 Hz, 6H), 2.63 (dd, J_3eq,4 =4.4 Hz, J_3eq,3ax =12.7 Hz, 3H), 2.03 (s, 9H), 1.67 (t, J_3eq,3ax =12.5 Hz, 3H).
¹³C NMR (100 MHz, D₂O): δ 175.01, 173.49, 144.82, 124.00, 100.60, 72.54, 71.68, 68.27, 68.16, 63.21, 62.55, 52.48, 51.85, 48.02, 40.20, 25.67, 22.00.
ESI-MS m/z:計算値はC₅₁H₈₂N₁₃O₂₇ (M+H)⁺ 1308.54; 実測値1309.29.

生物学的評価
細胞結合アッセイ
新たに合成された化合物（ＭＥ０３８５、ＭＥ０３８６、ＭＥ０４０７、ＭＥ０４０８、ＭＥ０４６１およびＭＥ０４６２）が、ＨＣＥ細胞へのＨＡｄＶ−３７ビリオンの結合を防止する効率を調べるために、³⁵Ｓ標識ビリオンに基づく細胞結合アッセイを実施した。過去の研究に基づき、ＭＥ０３２２、シアル酸およびＧＤ１ａグリカンを基準化合物として使用した（Ｎｉｌｓｓｏｎら、Ｎ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０１１、１７、１０５およびＳｐｊｕｔら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．編、２０１１、５０、６５１９）。アッセイは、本質的に先述の通りに行った（さらなる詳細は以下を参照）（Ａｒｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０００、７４、４２およびＡｒｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０００、７４、７６９１）。

手短に述べると、³⁵Ｓ標識ＨＡｄＶ−３７ビリオンを、種々の濃度の三価シアル酸誘導体、ＧＤ１ａグリカンおよびシアル酸とともに、またはそれらなしで、プレインキュベートした。混合物をＨＣＥ細胞とともにインキュベートし、次いで、非結合ビリオンを洗い流した。最後に、シンチレーションカウンターを使用して細胞関連放射能をカウントした。

図１ａおよび２ａに表示されている結果は非常に顕著であり、故に、ＨＣＥ細胞へのＨＡｄＶ−３７ビリオンの結合は、新たに設計された三価シアル酸の存在下では劇的に妨げられた。実際、新たな化合物のセットを評価したところ、これらは一価シアル酸よりも４桁大きく強力である（ＩＣ₅₀＝１．２ｍＭ）ことが分かった。また、新たな三価化合物は、二価ＧＤ１ａグリカンよりもはるかに強力であった（ＩＣ₅₀＝９１μＭ）。

以上のように、ＭＥ０３８５、ＭＥ０３８６およびＭＥ０４６１は、ＨＡｄＶ−３７ビリオンのＨＣＥ細胞への結合を、それぞれ１０７ｎＭ、４０ｎＭおよび３７６ｎＭのＩＣ₅₀値で防止するのに効率的である。最初のリード化合物（ＭＥ０３２２、ＩＣ₅₀＝３．２μＭ）は、効能が低いことが証明された。故に、本発明の化合物は、当技術分野においてこれまでに公知のものよりも優れていると結論付けることができる。さらに、類似体ＭＥ０４６２（ＩＣ５０＝１．４ｎＭ）は、ＭＥ０３８５、ＭＥ０３８６およびＭＥ０４６１よりもさらに一層強力であることが分かった（図２ｂを参照）。

最後に、それぞれ２３．４μＭおよび４．５μＭのＩＣ₅₀値を持つＮ−アシル変性誘導体ＭＥ０４０７およびＭＥ０４０８でシリーズの完成となった。残念なことに、Ｎ−アシル部分におけるリガンドの脂溶性を増大させても、効能は、ＭＥ０３８５およびＭＥ３８６と比較して増大しなかった。このことはそれぞれ過去の研究によって立証されている（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００９、５２、３６６６）。

実験詳細−細胞結合アッセイ
Ｓ標識ＨＡｄＶ−３７ビリオン（５×１０⁸／ウェル）を、結合緩衝液（５０μＬ；ＢＢ：１％ＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）およびＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ、ＥｕｒｏＣｌｏｎｅ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）を含有するダルベッコ変法イーグル培地、ｐＨ７．５）中、種々の濃度の三価シアル酸誘導体、ＧＤ１ａグリカンもしくはシアル酸とともに、またはそれらなしで（図１ａを参照）、９６ウェルマイクロプレート内、＋４℃で１時間プレインキュベートした。次いで、これらの混合物を、９６ウェルマイクロプレート内で予めペレット化されたＨＣＥ細胞に添加した（１×１０⁵／ウェル）。再懸濁後、混合物を＋４℃で１時間インキュベートした。最後に、非結合ビリオンをＢＢで洗い流し、Ｗａｌｌａｃ１４０９シンチレーションカウンターを使用して細胞関連放射能をカウントした。

感染アッセイ
細胞結合アッセイからの結果を裏付けるため、および本発明者らの化合物のセットをさらに評価するために、感染実験を実施した（図１ｂ、３ａおよび３ｂ）。アッセイは、本質的に先述の通りに行った（さらなる詳細は以下を参照）（（Ａｒｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０００、７４、４２およびＡｒｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０００、７４、７６９１））。

手短に述べると、非標識ビリオンを、種々の濃度の三価シアル酸誘導体、ＧＤ１ａグリカンもしくはシアル酸とともに、またはそれらなしで、プレインキュベートした。次いで、これらの混合物をＨＣＥ細胞に添加し、＋４℃でインキュベートした。非結合ビリオンを洗い流し、得られた混合物を＋３７℃でインキュベートし、次いで、同期感染が得られた。同期感染とは、すべてのビリオンが同時に細胞に入ることである。感染の４４時間後、細胞をすすぎ、固定し、ウサギポリクローナル抗ＨＡｄＶ−３７抗体とともにインキュベートした後、洗浄し、染色した。最後に、細胞を洗浄し、免疫蛍光顕微鏡法によって検査した。

故に、細胞結合アッセイの動向（図１ａ、２ａおよび２ｂ）は、感染実験（図１ｂ、３ａおよび３ｂ）において裏付けられた。化合物ＭＥ０３８６およびＭＥ０３８５は、ＨＣＥ細胞の感染を、ＨＡｄＶ−３７ビリオンにより、それぞれ１１８ｎＭおよび１６６ｎＭのＩＣ５０値でＭＥ０３２２よりも効率的に予防した。３８０ｎＭと以前に推定されていたＭＥ０３２２の半数阻害濃度は、ここでは２２８ｎＭと算出された。また、ＭＥ０４６１およびＭＥ０４６２は、ＨＡｄＶ−３７ビリオンのＨＣＥ細胞への感染を、ＭＥ０３２２よりも効率的に予防した。さらに、感染アッセイ（図３ｂを参照）においても、類似体ＭＥ０４６２（ＩＣ５０＝２．１ｎＭ）が最も強力であった。

実験詳細−感染アッセイ
４８ウェルプレート内の７×１０⁷の非標識ビリオン／ウェルを、無血清増殖培地（２００μＬ）中、種々の濃度の三価シアル酸誘導体、ＧＤ１ａグリカンもしくはシアル酸とともに、またはそれらなしで（図２Ｂを参照）、＋４℃でプレインキュベートした。１時間後、混合物を、１×１０⁵の接着ＨＣＥ細胞／ウェルを含有する新たな４８ウェルプレートに移し、＋４℃でインキュベートした。１時間後、非結合ビリオンを無血清増殖培地で洗い流し、得られた混合物を、１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する増殖培地とともに、＋３７℃でインキュベートした。感染の４４時間後、細胞をＰＢＳですすぎ、冷（−２０℃）９９％メタノールで１０分間固定し、ＰＢＳ中で１：２００希釈したウサギポリクローナル抗ＨＡｄＶ−３７抗体（ｐＨ７．４）とともに室温でインキュベートした。１時間後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ中で１：１００希釈したＦＩＴＣ標識ブタ抗ウサギｌｇＧ抗体（Ｄａｋｏ−ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）により、室温で１時間染色した。最後に、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、免疫蛍光顕微鏡（アキシオバート２５、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ；倍率１０倍）において検査した。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
最後に、ＭＥ０３８５、ＭＥ０３８６およびＭＥ０３２２を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験において調べ、固定化されたＨＡｄＶ−３７ファイバーノブに対するそれぞれの結合親和性（Ｋｄｓ）を決定した（さらなる詳細は以下を参照）。ＳＰＲデータは、細胞結合および細胞感染アッセイ両方の動向を十分に補強するものであり、３つの化合物は、ＨＡｄＶ−３７ファイバーノブと１対１結合モードで相互作用することが証明された。故に、ＭＥ０３８６（Ｋｄ＝６９μＭ）がＨＡｄＶ−３７ファイバーノブと最もよく相互作用し、続いてＭＥ０３８５およびＭＥ０３２２（それぞれＫｄ＝７６μＭおよびＫｄ＝１２６μＭ）であることが裏付けられた。Ｋｄ値に対するＨＡｄＶ−３７ファイバーノブ構築物の影響も注目に値する。結合および感染アッセイと同様に、ＭＥ０４６２が最も高い結合親和性（Ｋｄ＝９．５μＭ）を有していた。

実験詳細−表面プラズモン共鳴
動力学的測定は、表面プラズモン共鳴ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ１００機器を使用して実施した。アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＨＡｄＶ−３７ノブタンパク質をＣＭ５センサーチップと共有結合的にカップリングさせ、１４〜１５ｎｇ／ｍｍ²（約１５０００ＲＵ）の濃度とした。固定化されたノブへの三価シアル酸コンジュゲートＭＥ０３２２、ＭＥ０３８５およびＭＥ０３８６の結合を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０５％Ｐ２０ ｐＨ７．４（１×ＨＢＳ−ＥＰ＋、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中で実施した。使用した三価シアル酸の濃度は、４００、２００、１００、５０（２回）、２５、１２．５（２回）、６．２５、３．１２５、１．５６および０．７８μＭであった。結合親和性（Ｋｄｓ）は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェアを使用して算出した。

要約すれば、ＭＥ０３８５、ＭＥ０３８６、ＭＥ０４６１およびＭＥ０４６２等の本発明の化合物は、ＨＡｄＶ−３７等のウイルスに感染する細胞の細胞表面上に存在する末端シアル残基と結合する前記ウイルスによって引き起こされる眼感染を予防する上で、ＭＥ０３２２等の当技術分野の化合物と比較して優れた効能を示すことが分かった。故に、本発明の化合物は、流行性角結膜炎の治療において非常に有用であると認められる。

Claims (19)

1. 三価または四価シアル酸誘導体であって、式ＡまたはＢによる３つまたは４つの基が結合しているコア部分
   ［式中、
   「Ｘ」は、Ｏ（酸素）、またはＳ（硫黄）であり、
   Ｒ１は、Ｃ１〜３アルキルであり、
   整数「ｎ１」は２から８であり、
   整数「ｎ２」は１から８であり、
   波線は前記コア部分との結合点を示す］
   を、遊離塩基、その非荷電プロトン化形態の酸、両性イオン、薬学的に許容される付加塩、溶媒和物、またはその塩の溶媒和物として含み、
   前記コア部分が、式ＩＩからＶ
   ［式中、
   部分ＩＩと結合している基が式Ａによる基であるならば、式ＩＩ中の整数「ｍ１」は１から８であり、
   前記部分ＩＩと結合している基が式Ｂによる基であるならば、前記式ＩＩ中の整数「ｍ１」は２から８であり、
   整数「ｍ２」は１から８であり、
   波線は、式ＡまたはＢによる基との結合点を示す］
   のいずれか１つによる部分である、
   前記シアル酸誘導体。
2. 「Ｘ」がＯ（酸素）であり、Ｒ１がメチルである、請求項１に記載のシアル酸誘導体。
3. 整数「ｎ１」が２から３であり、整数「ｎ２」が１、２または３である、請求項１または２に記載のシアル酸誘導体。
4. 前記基が式Ａによる基である、請求項１から３のいずれか一項に記載のシアル酸誘導体。
5. 前記基が式Ｂによる基である、請求項１から３のいずれか一項に記載のシアル酸誘導体。
6. 前記誘導体のその遊離形態での分子量が、１，５００Ｄａ以下である、請求項１から５のいずれか一項に記載のシアル酸誘導体。
7. 前記コア部分が式（ＩＩ）による部分である、請求項１から６のいずれか一項に記載のシアル酸誘導体。
8. 整数「ｍ１」が１から３である、請求項７に記載のシアル酸誘導体。
9. トリス（（２−Ｏ−（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸）−２−オキソエチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミン；
   トリス（（３−Ｏ−（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸）−３−オキソプロピル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミン；
   トリス（（２−Ｏ−（５−Ｎ−プロパノイルアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸）−２−オキソエチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミン；
   トリス（（３−Ｏ−（５−Ｎ−プロパノイルアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸）−３−オキソプロピル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミン；
   トリス（（４−（２−Ｏ−（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸））−２−オキソメチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）エチル）アミン；および
   トリス（（４−（２−Ｏ−（５−Ｎ−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシロン酸））−２−オキソエチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）エチル）アミン
   からなる群から選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載のシアル酸誘導体。
10. 純粋な立体異性体として、または前記化合物を含むアノマー混合物中に存在し、前記アノマー混合物中でα−アノマーが優勢である、請求項１から９のいずれか一項に記載のシアル酸誘導体。
11. 請求項１から１０のいずれか一項に記載のシアル酸誘導体と、少なくとも１つの薬学的な許容される添加剤とを含む、眼への投与用の医薬組成物。
12. ０．００１から１０ｍＭの請求項１から１０のいずれか一項に記載のシアル酸誘導体を含む水性組成物であって、前記水性組成物が少なくとも９０ｗｔ％の水分含有量を有する、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 前記水性組成物が、等張溶液となるようにＮａＣｌを含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 前記水性組成物が緩衝化されている、請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
15. 前記水性組成物が約６．５から８のｐＨを有する、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. 療法において使用するための、請求項１から１０のいずれか一項に記載のシアル酸誘導体、または請求項１１もしくは１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
17. ウイルスに感染する細胞の細胞表面上に存在する末端シアル残基と結合する前記ウイルスによって引き起こされる眼感染の治療および／または予防において使用するための、請求項１から１０のいずれか一項に記載のシアル酸誘導体、または請求項１１もしくは１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
18. 前記感染が、ＨＡｄＶ−８、ＨＡｄＶ−１９、ＨＡｄＶ−３７、ＨＡｄＶ−５３、ＨＡｄＶ−５４およびＨＡｄＶ−５６からなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる、請求項１７に記載のシアル酸誘導体または医薬組成物。
19. 前記感染が流行性角結膜炎である、請求項１７または１８に記載のシアル酸誘導体または医薬組成物。