ES2675282B1 - Composicion que comprende extractos de ajo, uso para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de enfermedades, y procedimiento de obtencion - Google Patents

Description

DESCRIPCION

Composition que comprende extractos de ajo, uso para la fabrication de un medicamento para el tratamiento de enfermedades, y procedimiento de obtencion

CAMPO DE LA INVENCION

La invention se refiere a medicamentos para el tratamiento de enfermedades, sepsis, shock septico, enfermedades tumorales y enfermedades dermatologicas. En particular, la invention se refiere a una composition que comprende extracto de ajo liofilizado y extracto de ajo negro.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

El ajo negro es fruto de la transformation del ajo natural en unas condiciones determinadas de temperatura y humedad. El proceso tiene lugar en 4 o 5 etapas dependiendo del fabricante, en las que se varlan las condiciones ambientales en rangos de: 60-90°C de temperatura; 50-100% de humedad relativa, y se prolonga cada una de las etapas entre 6­ 192 h de tiempo.

La reaction de Maillard es el resultado de la glucosilacion no enzimatica de protelnas, es decir, la adicion de un glucido a otra molecula que se denomina aceptora, y que puede tener naturaleza proteica o lipldica. La mayorla de las protelnas almacenadas en el retlculo endoplasmatico rugoso experimentan glucosilacion. El retlculo endoplasmatico rugoso esta formado por una serie de canales o cisternas que se encuentran distribuidos por todo el citoplasma de la celula, generando unos sacos aplanados en los cuales se introducen cadenas polipeptldicas, las cuales forman las protelnas que sufren las reacciones no enzimaticas de glucosilacion.

Como resultado, tenemos un conjunto muy complejo de reacciones qulmicas que traen consigo la production de melanoidinas coloreadas que van desde el amarillo claro, colores tostados de diversa intensidad, e incluso el negro como en el caso de la transformacion del ajo natural a ajo negro. En las reacciones son necesarios un azucar reductor (cetosa o aldosa) y un grupo amino libre, proveniente de un aminoacido o una protelna, y dependiendo de las condiciones en las que se lleven a cabo y la naturaleza del sustrato, pueden derivarse en la transformation de compuestos aromaticos como flavonoides y polifenoles como ocurre en el caso del ajo.

La sepsis se define como una infection (probada o sospechada) mas un smdrome de respuesta inflamatoria sistemica (fiebre, taquicardia, taquipnea y leucocitosis). La sepsis severa se define como una sepsis con disfuncion organica (hipotension, hipoxemia, oliguria, acidosis metabolica, trombocitopenia, etc.). Shock septico sena una sepsis severa con hipotension, a pesar de una adecuada reposition con fluidos. El shock septico y fracaso multiorganico son la causa mas frecuente de muerte en los pacientes con sepsis. La mortalidad asociada a sepsis severa y shock septico oscila entre el 25-30% y el 40-70% respectivamente.

La sepsis es la culminacion final de complejas interacciones entre el microorganismo infectante y la respuesta inmune, inflamatoria y de la coagulation del huesped.

El estado de la tecnica describe que la alicina, principal componente activo contenido en el extracto liofilizado, es capaz de reaccionar con grupos tioles libres y de penetrar las membranas biologicas. Sin embargo, los mecanismos por los cuales la alicina afecta a los sistemas celulares no estan del todo claros. Se ha sugerido que el efecto antiproliferativo de la alicina se debe a la capacidad que tiene la alicina para deplecionar de manera transitoria los depositos de glutation intracelular.

Con respecto al ajo negro, existen trabajos que senalan su potencial efecto anti-tumoral al inhibir la proliferation celular de lmeas tumorales humanas de cancer gastrico.

La integridad fisica y funcional de la piel, el organo de mayor tamano, es crucial en la supervivencia de los mamiferos para evitar la deshidratacion y permitir la vida en un medio terrestre. La funcion principal de la piel consiste en actuar como una barrera de permeabilidad, separando el medio biologico, predominantemente acuoso, del medio aereo que lo rodea.

El compromiso de la funcion barrera epidermica es un evento crucial en la fisiopatologia de muchas dermatosis inflamatorias cronicas (dermatitis atopica, dermatitis irritativa, psoriasis, etc.), ya que crea un estado proinflamatorio en la piel que prolonga los brotes de actividad y acorta los periodos de remision.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

En un primer aspecto, la presente invention proporciona una composition que comprende extracto de ajo liofilizado y extracto de ajo negro.

Otra realization es la composicion segun el primer aspecto, donde la proportion de extracto de ajo liofilizado a extracto de ajo negro es entre 1:1 y 1:5.

En un segundo aspecto, la composicion segun el primer aspecto es una composicion farmaceutica.

Otra realizacion es la composicion farmaceutica segun el segundo aspecto, que comprende farmacos antineoplasicos seleccionados del grupo compuesto por citostaticos, citotoxicos, farmacos biologicos y compuestos de inmunoterapia.

Otra realizacion es la composicion farmaceutica segun el segundo aspecto, donde dicho farmaco antineoplasico es oxaliplatino.

Otra realizacion es la composicion farmaceutica segun el segundo aspecto, que comprende excipientes farmaceuticamente aceptables.

El termino “excipientes” hace referencia a compuestos que estabilizan y favorecen la absorcion de los principios activos, colorantes, endulzantes, saborizantes, protectores frente al aire y/o humedad, aglutinantes, etc.

La composicion farmaceutica puede ser formulada con excipientes farmaceuticamente aceptables, asl como con cualquier otro tipo de portadores o diluyentes farmaceuticamente aceptables, de acuerdo con tecnicas convencionales en la practica farmaceutica.

La composicion farmaceutica puede ser administrada por si sola o en combination con otros principios activos.

La composicion farmaceutica puede ser administrada en dosis simples o multiples.

La composicion farmaceutica del segundo aspecto de la invencion puede ser administrada por cualquier via de administration (por ejemplo, sistemica, oral, sublingual, perioral, parenteral, uretral, vaginal, rectal, intraperitoneal, intramuscular, intranasal, intravenosa, intraarterial, transdermica, subcutanea, topica, etc.) para lo cual dicha composition se formulara en la forma farmaceutica adecuada a la via de administration elegida.

La composicion farmaceutica puede ser formulada para proporcionar la liberation controlada del ingrediente activo como por ejemplo liberacion sostenida o prolongada de acuerdo con metodos que son bien conocidos en la tecnica.

En un tercer aspecto, la composicion segun el primer aspecto es una composicion alimenticia.

Otra realization es la composicion alimenticia segun el tercer aspecto, que comprende aditivos alimenticios.

En un cuarto aspecto, la presente invention proporciona el uso de una composicion segun el primer y segundo aspecto para la fabrication de un medicamento para el tratamiento de enfermedades seleccionadas del grupo compuesto por sepsis, shock septico, enfermedades tumorales y enfermedades dermatologicas.

La composicion comprende un extracto rico en alicina estable, procedente del extracto liofilizado, y s-alil-cistema estable, procedente del ajo negro. Esto proporciona concentraciones controladas de estos dos compuestos activos.

La s-alil-cistema actua sinergicamante con la alicina y el resto de tiosulfinatos y compuestos presentes en el extracto liofilizado.

El extracto de ajo negro es un extracto polar de ajo negro. Con este extracto se consigue un extracto soluble en agua y estabilidad termica de S-alil-L-cistema (SAC) y la potenciacion de la actividad de ambos extractos.

La composicion proporciona estabilizacion para tiosulfinatos, polisulfidos, prostaglandina E1 (PGE1), vitamina E, inulina y ajoeno, compuestos derivados del ajo.

La invencion permite obtener a escala industrial productos estandarizables, formulables y aplicables terapeuticamente con las garantias de estabilidad temporal que se han expuesto anteriormente. Los compuestos obtenidos de los extractos de ajo son estables por periodos de tiempo que permiten su aplicacion en el laboratorio, en animales y en humanos, con totales garantlas de eficacia en relacion con su composition.

En la sepsis, la composicion actua en multiples pasos del proceso, tanto en la respuesta inflamatoria precoz como en la respuesta procoagulante. Hasta ahora las opciones terapeuticas planteadas se han dirigido sobre un punto concreto del proceso, lo que posiblemente haya podido contribuir a resultados pocos satisfactorios.

La composicion interacciona en varios puntos clave y disminuye con ello la respuesta inflamatoria precoz y la respuesta procoagulante mas tardla.

Otra realization es el uso segun el cuarto aspecto de la invention, donde dichas enfermedades tumorales estan seleccionadas del grupo compuesto por cancer de colon, cancer de pulmon, cancer de prostata, cancer de vejiga, cancer de mama, cancer de ovario, cancer de testlculo, cancer de pancreas, cancer de rinon, cancer de hlgado, cancer cervical, cancer gastrico, cancer de cabeza y cuello, cancer de hueso, canceres del sistema nervioso central, tumores neuroendocrinos, carcinoma de tiroides, sarcomas, leucemias, linfomas, mielomas, melanomas.

En enfermedades dermatologicas, considerando las variaciones correspondientes a cada proceso patologico cutaneo (herida por perdida de sustancia o proceso inflamatorio con o sin afectacion de la funcion barrera epidermica), la invencion proporciona una composicion que comprende extracto de ajo liofilizado y extracto de ajo negro para uso topico sobre el lecho de heridas cutaneas por perdida de sustancia, dermatosis inflamatorias cronicas o piel aparentemente indemne con alteraciones de base en la funcion barrera. La via topica cutanea es de facil acceso, no invasiva, suponiendo un aumento de la biodisponibilidad y la eficacia terapeutica de los extractos de ajo con menores efectos adversos que otras vlas de administration. Del mismo modo, el uso sistemico de la composicion que comprende extracto de ajo liofilizado y extracto de ajo negro tiene un efecto favorable en la cicatrization de heridas cutaneas, dermatosis inflamatorias cronicas o piel aparentemente indemne con alteraciones de base en la funcion barrera.

Por tanto, otra realizacion es el uso segun el cuarto aspecto de la invencion, donde dichas enfermedades dermatologicas estan seleccionadas del grupo compuesto por cicatrizacion de heridas cutaneas, modulador de la funcion barrera epidermica, inductor de la production y secrecion de peptidos antimicrobianos epidermicos y dermatosis inflamatoria, dermatitis irritativa, eccema atopico, eccema irritativo y eccema alergico de contacto.

En las enfermedades tumorales, haciendo las pertinentes variaciones espedficas segun la naturaleza del proceso neoplasico (tipo de tumor), la invention proporciona una option terapeutica en la que el extracto de ajo liofilizado y extracto de ajo negro estan combinados con farmacos antineoplasicos seleccionados del grupo compuesto por citostaticos, citotoxicos, farmacos biologicos y compuestos de inmunoterapia. Esta combinacion mantiene el efecto citotoxico deseable sobre las celulas tumorales, permitiendo reducir la dosis del/los farmacos antitumorales de uso habitual en la clmica y disminuyendo los efectos adversos (toxicos) de la administration rutinaria de dichos farmacos a las concentraciones estandar.

En un quinto aspecto, la presente invencion proporciona un procedimiento de obtencion de extracto de ajo negro segun el primer, segundo y tercer aspecto, que comprende las siguientes etapas:

(a) extraction solido-liquido con un disolvente organico y/o inorganico a una presion entre 0,1 y 400 atm y a una temperatura entre -70°C y 150°C con un tiempo de extraccion superior a 1 minuto,

(b) separation fisica de la materia extraida y el lixiviado obtenido,

(c) separacion o recuperation del disolvente y la concentration del lixiviado o extracto obtenido en las etapas anteriores y

(d) estabilizacion quimico-fisica por liofilizacion o mantenimiento en frio.

Otra realization es el procedimiento segun el quinto aspecto, donde la separacion fisica de la etapa (b) se realiza por centrifugado, filtrado o decantation.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1. Seguimiento de peso durante 14 dias. En la grafica se observa como en el grupo II y III tras la infeccion se produce una caida similar del peso. Sin embargo, pasadas las primeras 24 horas, el grupo de la alicina (grupo III) comienza a ganar peso, mientras que el grupo II lo hace a las 48 horas. El panel inferior izquierdo representa la caida de peso en el grupo II y III en el dia 9, 24 horas despues de la infeccion. El panel inferior derecho es una representacion grafica donde se observa que el grupo III comienza en el dia 10 con una recuperacion de peso que no se observa en el grupo II (diferencia estadlsticamente significativa p < 0,01)

Figura 2. Representation grafica del numero de ratas que presentan, en cada uno de los grupos (II y III), los diferentes signos de sufrimiento y estres valorados: secreciones oculares, secreciones nasales, position bigotes, falta de acicalamiento, piloereccion, letargo/hipoactividad y diarrea.

Figura 3. Determination de IL-1, IL-6 y TNF-alfa en cada uno de los grupos en diferentes intervalos de tiempo.

Figura 4. Imagenes mas representativas de cada una de las variables estudiadas.

Figura 5. Morfologla celular resultante tras el tratamiento de celulas de cancer de colon HT-29 con distintas concentraciones de alicina expresadas en pg/mL.

Figura 6. Ensayo del RN sobre celulas Caco-2 tratadas con oxaliplatino (OX), ajo liofilizado (representado por alicina; Ali), ajo negro (representado por SAC; N), y sus combinaciones. En las graficas se representa la viabilidad celular detectada con los distintos tratamientos, en funcion de la concentration de cada uno de ellos. Se muestra el valor promedio (n=6) ± SD.

Figura 7. Ensayo del RN sobre celulas HT-29 tratadas con oxaliplatino (OX), ajo liofilizado (representado por alicina; Ali), ajo negro (representado por SAC; N), y sus combinaciones. En las graficas se representa la viabilidad celular detectada tras 24 h con los distintos tratamientos, en funcion de la concentracion de cada uno de ellos. Se muestra el valor promedio (n=6) ± SD.

Figura 8. Ensayo de LDH sobre celulas HT-29 tratadas con oxaliplatino (OX), ajo liofilizado (representado por alicina; Ali), ajo negro (representado por SAC; N), y sus combinaciones. En las graficas se representa la LDH liberada tras 24 h con los distintos tratamientos, en funcion de la concentracion de cada uno de ellos. Se muestra el valor promedio (n=6) ± SD.

Figura 9. Cierre de la herida por segunda intention a las 24 h (2 administraciones topicas) de extracto de ajo liofilizado a concentracion de 50 pg/mL (los dos ratones de la derecha) respecto del grupo control (los dos animales de la izquierda). El grupo de tratamiento solo recibio tratamiento topico con extracto de ajo liofilizado en la herida del flanco derecho, mientras que la herida contralateral era tratada con vehlculo (V).

Figura 10. Cierre de la herida por segunda intencion el dla 8 del experimento. Observese la diferencia entre el animal del grupo tratado con extracto de ajo liofilizado a concentration 50 pg/mL en el flanco derecho (situado a la derecha) respecto del animal del grupo tratado con extracto de ajo liofilizado a concentracion 1 pg/mL en la herida del flanco derecho (situado a la izquierda). Debajo se muestra un detalle de la imagen dermatoscopica de las heridas de ambos flancos.

Figura 11. Disminucion del eje vertical de la cicatriz (no sometido a las llneas de tension de Langer) en el dla 10 del experimento piloto para determinar la concentracion terapeutica de extracto de ajo liofilizado como procicatrizante. Observese el detalle de la imagen dermatoscopica de las heridas del flanco derecho en un sujeto de los grupos de tratamiento a concentracion 1 pg/mL y 50 pg/mL.

Figura 12. Imagen histologica de la cicatriz re-epitelizada (tincion de Masson). Observese la disminucion del diametro de la cicatriz en la biopsia cutanea de la cicatriz re-epitelizada del raton tratado con extracto de ajo liofilizado 50 pg/mL respecto de la herida re-epitelizada de un raton del grupo control en el dla 14 del experimento. Debajo se puede ver en detalle la densidad de fibroblastos y la aparicion de nuevas fibras de colageno en la cicatriz.

Figura 13. Imagen histologica de la cicatriz re-epitelizada (tincion de Masson) en el dla 14 del experimento. En la parte superior, aparece la cicatriz de un animal del grupo control, por debajo se muestran dos cortes histologicos de las dos heridas realizadas en un mismo animal del grupo tratado con extracto de ajo liofilizado a concentracion 50 pg/mL: 1) la imagen inferior corresponde a la herida tratada con extracto de ajo y 2) la imagen intermedia es una biopsia de la herida contralateral, que solo recibe tratamiento topico con el vehlculo. Observese la graduation en la disminucion del diametro de la cicatriz en las tres imagenes de arriba abajo, demostrando un efecto procicatrizante directo por la administration topica del extracto de ajo liofilizado a concentracion 50 pg/mL (imagen inferior) y un efecto menos intenso, sistemico, sobre la cicatriz del lado contralateral que solo recibio tratamiento topico con vehlculo (imagen intermedia). Ambas cicatrices, del lado tratado y del lado no tratado con extracto de ajo liofilizado en un mismo animal, son menores que la cicatriz de un animal del grupo control el dla 14 del experimento.

Figura 14. Imagen histologica comparando la densidad y distribution de los haces de colageno dermico (tincion de orcelna) en la biopsia de la cicatriz re-epitelizada de un raton del grupo tratado con extracto de ajo liofilizado 50 pg/mL respecto de la biopsia de la cicatriz de un raton del grupo control en el dla 14 del experimento.

Figura 15. La aplicacion topica del extracto liofilizado de Allium sativum (50 pg/mL) acelero el proceso de cicatrization (**p<0.05).

Figura 16. Detalles dermatoscopicos del proceso de cicatrization in vivo cada 2 dlas hasta el dla 10, donde se aprecia el avance de la lengueta de re-epitelizacion (llnea vertical negra) en el grupo de tratamiento (extracto liofilizado de ajo 50 pg/mL) respecto del grupo control.

Figura 17. Histopatologicamente, las heridas (flecha) tratadas con el extracto de ajo liofilizado (50 pg/mL) mostraron un aumento del numero de fibroblastos, densidad de fibras colagenas y re-epitelizacion completa de herida.

Figura 18. La aplicacion topica del extracto fermentado de Allium sativum (10 pg/mL) acelero el proceso de cicatrization (**p<0.05).

Figura 19. Detalles dermatoscopicos del proceso de cicatrization in vivo cada 2 dlas hasta el dla 10, donde se aprecia el avance de la lengueta de re-epitelizacion (llnea vertical negra) en el grupo de tratamiento (extracto de ajo negro 10 pg/mL) respecto del grupo control.

Figura 20. Histopatologicamente, las heridas (flecha) tratadas con el extracto de ajo negro (10 pg/mL) mostraron un aumento en el numero de fibroblastos dermicos (tejido de granulation), densidad de fibras colagenas y re-epitelizacion completa de la herida.

Figura 21. El modelo de wound healing (bordes de la herida lineal con llnea discontinua) con cultivos celulares de queratinocitos (HaCaT) y fibroblastos (CRL-2072) mostraron un aumento significativo (**p<0.05) en los Indices de proliferation y migration bajo el tratamiento con extracto de ajo liofilizado respecto al control.

Figura 22. Los resultados obtenidos a partir de ensayos de proliferation mediante la tecnica del cristal violeta, mostraron que el extracto fermentado de ajo (ajo negro) tiene un efecto dosis dependiente sobre la proliferation tanto en queratinocitos (HaCaT) como de fibroblastos (CRL-2072), produciendo un aumento significativo para ambos tipos celulares.

Figuras 23 y 24. La combination, sobre todo a dosis bajas en un ratio 1:5, del extracto liofilizado de ajo con el derivado fermentado (ajo negro) es capaz de inducir un aumento en la proliferation superior al 80% y 60% en queratinocitos (HaCaT, Figura 23) y fibroblastos (CRL-2072, Figura 24), respectivamente. Estos resultados corroboran que tanto el extracto de ajo como el derivado fermentado de este tienen un efecto positivo sobre la proliferation de los principales componentes de la dermis y la epidermis y apuntan a un efecto sinergico de la combinacion de ambos.

* <0.05

** <0.01

*** <0.001

DESCRIPCION DE MODOS DE REALIZACION

Ejemplo 1. Obtencion de extracto de ajo liofilizado utilizado en la presente invention

El extracto de ajo liofilizado (Aliben®, Patente: ES 2 306 597 B1) empleado en las investigaciones presentes se ha empleado reconstituido en medio acuoso. La alicina ha mostrado actividad por mas de 10 meses si se mantiene a 6°C, mostrando una estabilidad qulmica muy por encima de lo que se establece en otros trabajos para esta especie qulmica. Ademas, el liofilizado obtenido muestra una estabilidad no inferior a 18 meses cuando se conserva en un ambiente opaco y hermetico.

Procedimiento de obtencion de extracto liofilizado a partir de Allium sativum, utilizando etanol en la extraccion

Se tomaron varias cabezas de ajo de la variedad morado y perteneciente a la Indication Geografica Protegida "Ajo Morado de Las Pedroneras" (Castilla-La Mancha, Espana). A estas cabezas se les eliminaron las camisas exteriores y sus dientes se separaron en unidades independientes. La masa total de ajos utilizada en este experimento fue de 850 g. Los dientes se trituraron en una trituradora domestica hasta alcanzar un tamano de partlcula medio de 1 mm. El producto triturado se puso en contacto con 2 litros de etanol (96% v/v) en un tanque cillndrico perfectamente mezclado por medio de un agitador mecanico de helices/paletas (375 rpm) para la extraction solido-llquido. El sistema se mantuvo termostatizado a 33°C durante 90 minutos. El licor mezcla se filtro a vaclo por medio de un Buschtner-Kitasato al que se habla acoplado un filtro con una luz de malla de 0.5 mm. El filtrado fue procesado en un rotavapor para la elimination del disolvente a vaclo. La temperatura del bano del rotavapor fue de 55°C. El producto asl obtenido fue dispuesto en la bandeja de un liofilizador. Se congelo a -37°C y se le aplico un vaclo de 0.2 torrs. La temperatura del condensador se fijo a -55°C y la de la camara a 10°C. El proceso se extendio durante 28 h tras las cuales se recogieron 60 g de extracto liofilizado. El extracto liofilizado se almaceno a temperatura ambiente en recipientes opacos y hermeticos para realizar en distintos momentos ensayos de caracterizacion farmacoterapeutica.

Obtencion de un extracto concentrado

Se siguio el procedimiento operativo de extraction con etanol descrito mas arriba que incluyo las etapas de acondicionamiento, la extraction con etanol, filtrado de cabezas de ajo y elimination del disolvente en el rotavapor. El extracto concentrado asl obtenido fue almacenado en nevera a 6°C en recipientes opacos y hermeticos.

Ejemplo 2. Obtencion de extracto acuoso de ajo negro utilizado en la presente invention

Se utilizo ajo negro comercial (Aurum black®), fruto de la transformation del ajo natural. El proceso tiene lugar en 4 o 5 etapas, en las que se varlan las condiciones ambientales en rangos de: 60-90°C de temperatura; 50-100% de humedad relativa, y se prolonga cada una de las etapas entre 6-192 h de tiempo. El producto sufre una evolution ocasionada por la denominada reaction de Maillard. La reaction de Maillard es el resultado de la glucosilacion no enzimatica de protelnas, es decir, la adicion de un glucido a otra molecula que se denomina aceptora, y que puede tener naturaleza proteica o lipldica. La mayorla de las protelnas almacenadas en el retlculo endoplasmatico rugoso experimentan glucosilacion.

Se siguio el siguiente procedimiento:

i) Se pesaron 133,5 g de ajo negro en dientes sin piel.

ii) Se trituraron junto a 120,1 ml de suero fisiologico (NaCl 0,9%), hasta obtener una mezcla homogenea en forma de pasta.

iii) Se anadieron 100 ml mas de suero fisiologico y se realizo extraction a 50°C durante 50 minutos a una velocidad de agitation de 80 rpm en extractor encamisado tipo tanque agitado de 2 L.

iv) Se realizo centrifugation en viales de 10 ml a 4.000 rpm durante 15 minutos.

v) Se recogio el sobrenadante por pipeteo. La fase solida quedo como residuo en el fondo de los viales.

vi) El extracto se filtro en filtros plasticos de 15 mm x 0,45 pm a presion positiva.

vii) El extracto de ajo negro obtenido, 61,3 ml, se conservo a 4°C hasta su empleo y formulacion para la realization de ensayos biologicos.

viii) Una allcuota de 3 ml se destino a analisis cromatografico de SAC, de acuerdo a las condiciones de HPLC descritas en el documento Ul-Seong Black-Garlic Farming Association. Fuente: Biotechnology Center of Korea University.

La Tabla siguiente, nos muestra la composition del extracto de ajo negro obtenido con el procedimiento anteriormente descrito:

Compuesto Concentracion Compuesto Concentracion (ppm) (ppm)

NC.- No cuantificada. Analisis cualitativo por 1H-RMN<3>.

Ejemplo 3. Sepsis y shock septico

Se ha desarrollado un estudio experimental (ensayo terapeutico) de infection intraabdominal donde se ha utilizado el animal de experimentation rata Sprague-Dawley®, Harlan Laboratories Models SL, macho, 5 semanas, y 100-125 g. Se llevo a cabo en las instalaciones de la Unidad de Investigation Traslacional (UIT) del Hospital General Universitario de Ciudad Real.

Se realizo en identico horario, para evitar la posible influencia del ciclo circadiano en los resultados del trabajo. Todos los animales estaban sanos y no recibieron tratamiento previo.

Las ratas se mantuvieron con comida y agua ad libitum, con un ciclo 12 h de luz y 12 h de oscuridad, y una temperatura ambiente de 22°C ± 2°C con una humedad relativa del aire del 50%-70% y con 15-20 renovaciones/hora sin recirculacion de aire. Fueron estabuladas conforme el RD 53/2013.

Los animales se mantuvieron en estas condiciones ambientales durante al menos 1 semana, para permitir su aclimatacion, antes de la realization del estudio. La localization de los animales y su estabulacion se realizo en el animalario de la Unidad de Investigation Traslacional del Hospital General Universitario de Ciudad Real.

Los desechos convencionales, biologicos, fueron removidos y eliminados de forma regular, segura y conforme a las recomendaciones institucionales de riesgos laborales.

Se realizo un modelo donde se administro una concentration conocida de alicina. Se procedio a una aleatorizacion en tres Grupos de ratas, a partir de ahora nos referiremos a Grupo I -grupo con suero fisiologico-, Grupo II -grupo con ceftriaxona-, Grupo III -grupo con ceftriaxona alicina-. Inclusion de 6 ratas en grupo control y 9 ratas en los Grupos II y III. Se genero un modelo de peritonitis en todos los Grupos. Para la creation del modelo de peritonitis se realizo laparotomla subxifoidea previa anestesia de la rata con ketamina/xilacina 75/10 mg/kg intraperitoneal, de unos 3 cm de longitud para la implantation de dosis subletal de E Coli ATCC 25922, obtenido tras control de unidades formadoras de colonia (1010 UFC/ml) (tras extension de 10 pl de E Coli en MacConkey agar y tras control y lectura tras 18-24 h a 37°C).

El tratamiento a administrar a cada uno de los grupos se llevo a cabo de la siguiente forma:

1) grupo control-Grupo I-: 6 animales que reciben 4,4 ml de SF 0.9% intraperitoneal

2) grupo experimental II: 9 animales que reciben 100 mg/kg de ceftriaxona intraperitoneal (IP)

3) grupo experimental III: 9 animales que reciben 100 mg/kg de ceftriaxona IP alicina 0,5 mg/kg IP

Los animales pesaban aproximadamente 280 g.

Calculo de dosis

100 mg/kg x 0.28 kg= 28 mg de ceftriaxona IP 0,5 mg/kg x 0.28 kg= 0,14 mg de alicina IP. La duracion de la intervention fue de 7 dlas si las ratas sobrevivlan a la infection. Llegados a ese dla se procedla al exitus de las ratas, una vez anestesiadas con ketamina/xilacina 75/10 mg/kg intraperitoneal mas dosis letales de Tiopental 100-120 mg/kg, y tras proceder a realizar peritonectomla total junto a evisceration radical para estudio microbiologico del llquido peritoneal e histologico posterior. La perdida de volumen sangulneo con este tratamiento quirurgico exanguino a la rata, siendo incompatible con la vida.

Se estudiaron las siguientes variables:

p a rAm e t r o s CLINICOS

• Peso en gramos cada uno de los dlas.

• Signos de estres y sufrimiento.

• Tiempo de sobrevida en intervalos de 24 horas.

BIOQUIMICAS

• Determination sangulnea a los 3 y 7 dlas (exitus) para estudio serologico de variables de respuesta inflamatoria, IL-1, IL-6, TNF.

• Estudio microbiologico de SANGRE (hemocultivos) a los 7 dlas.

HISTOLOGICAS

• Estudio microbiologico del llquido peritoneal.

• Se tomaron muestras de hlgado y peritoneo para una evaluation histopatologica.

Los resultados indicaron que el GRUPO III (ceftriaxona alicina) es el grupo con mejor respuesta cllnica (Figuras 1 y 2), encontrando que dicho grupo comienza la recuperation de peso 24 h antes que el GRUPO II. Cabe destacar que todas las ratas del GRUPO I (Grupo control, que no se trata ni con antibiotico ni con alicina, solamente suero fisiologico) mueren tras la infeccion a las 3-4 h de la misma, con independencia del peso del que partieran. En relation al resto de parametro cllnicos (Figura 4), encontramos claras diferencias a favor nuevamente del grupo de tratamiento con alicina, con menos signos de sufrimiento y estres (menos secreciones oculares y nasales, menos erizada la posicion de los bigotes, menos diarrea y con menos letargo y mas activas).

Atendiendo a los parametros bioqulmicos encontramos que las ratas del grupo control en el momento del fallecimiento presentaban (Figura 3) altos valores de todas los factores proinflamatorios estudiados (IL-6, IL-1, TNF), en consonancia con la sepsis generalizada que presentan y que presumiblemente les lleva al fallecimiento.

De igual forma, tanto el analisis microbiologico en los hemocultivos como el cultivo de llquido peritoneal realizados mostraron crecimiento de E Coli ACCT 25922 (Tabla 1).

Tabla 1. Resultados hemocultivos, cultivo llquido peritoneal y antibiograma en cada uno de los grupos de estudio.

Hay que destacar que se detectaron globalmente en el tercer dla menos cantidad de IL en el grupo que anadla alicina. Tanto en el grupo II como en el III al septimo dla no se detecto ningun tipo de IL (lo cual habla a favor de que todas las ratas hablan sobrevivido a la sepsis, tambien lo reflejaba otros parametros cllnicos como la ganancia de peso similar al estado previo a la infeccion).

Atendiendo al estudio histologico tambien encontramos diferencia a favor del grupo de la alicina (Tabla 2 y Figura 4), existiendo menos infiltracion bacteriana y de polimorfonucleares en peritoneo e hlgado.

Tabla 2. Alteraciones histopatologicas encontradas en peritoneo e hlgado en cada uno de los grupos de estudio (congestion en hlgado, polimorfonucleares -PMN- en sinusoides hepaticos, PMN superficie peritoneo, PMN en superficie hlgado, colonizacion bacterias superficie hlgado, colonizacion bacterias superficie peritoneo). Comparacion entre grupo II y grupo III.

Tras el sacrificio se realizaron hemocultivos en todas las ratas, resultando negativos todos ellos, excepto en el grupo II donde se encontro en una de las ratas un Enterococcus faecium sensible a ampicilina, vancomicina y teicoplanina. Tambien cultivo de llquido peritoneal, en el mismo solamente en una rata del grupo II encontramos que aun persiste crecimiento de la bacteria E. coli. Sin embargo, en ambos grupos encontramos sobrecrecimiento de Enterococcus faecium, posiblemente debido al tratamiento prolongado con ceftriaxona durante siete dlas consecutivos que hace que desaparezcan los bacilos GRAM - de la flora intestinal y se produzca el sobrecrecimiento del enterococo (Tabla 1).

Como se indico con anterioridad, todas las ratas control murieron a las 3-4 h tras la infeccion. Todas las ratas del grupo III sobrevivieron hasta el sacrificio al septimo dla y una rata fallecio en el Grupo II de ceftriaxona sobreviviendo las ocho restantes. Nuevamente el grupo de la alicina es el que mejor sobrevida presenta.

Globalmente podemos establecer que el GRUPO al que se le anade alicina tiene mejor evolucion para todas las variables estudiadas.

En nuestro caso particular, al disponer de una composition rica en alicina estable, procedente del extracto liofilizado, con s-alil-cistelna estable procedente del extracto de ajo negro, nos permite afirmar que la mezcla resultante puede actuar conjuntamente o de manera dual o sinergica con otros tiosulfinatos, asl como con otros compuestos presentes en el extracto liofilizado como son los polisulfidos, los vinil-ditiines y la mezcla isomerica E-Z-ajoeno.

Ejemplo 4. Uso de extracto de ajo liofilizado y extracto de ajo negro en terapia coadyuvante con farmacos antitumorales en diversas neoplasias

Se han desarrollado estudios experimentales (ensayos in vitro). Dichos estudios se han basado en el tratamiento de celulas tumorales de cancer de colon, llneas celulares Caco-2 y HT-29, con los extractos de ajo, donde se determino el efecto antiproliferativo. Se usaron estas llneas celulares ya que los compuestos capaces de inhibir la proliferation de celulas tumorales pueden ser utiles como agentes quimiopreventivos y quimioterapeuticos.

Ademas, en el estudio se aplicaron tratamientos combinados de extractos de ajo con quimioterapico de uso cllnico habitual para determinar si se produce un efecto mas acentuado que el producido por cada uno de ellos de forma aislada.

Se muestran los efectos citotoxicos y antiproliferativos que producen el extracto liofilizado que contiene alicina, el extracto de ajo negro que contiene SAC, y el quimioterapico oxaliplatino, de forma aislada y en combination, sobre cultivos de celulas tumorales colorectales. Para ello, se llevaron a cabo metodos que aportan information sobre la afectacion de la viabilidad, proliferacion y citotoxicidad celular tras los diferentes tratamientos. Estos fueron: Ensayo del Rojo Neutro (RN) y Ensayo de la Lactato Deshidrogenasa (LDH).

Resultados de los ensayos de proliferacion, viabilidad y citotoxicidad celular.

Se llevaron a cabo determinaciones fundamentadas en el examen de distintos parametros celulares, mediante los cuales extraer informacion del efecto citotoxico o antiproliferativo producido por los extractos de ajo y un citotoxico, tanto administrados de forma individual como en combinacion, sobre las celulas cancerlgenas de cancer de colon. En la Figura 5 se puede apreciar visualmente al microscopio como, a medida que se incrementa la concentration de alicina en los tratamientos aplicados sobre celulas HT-29 de cancer de colon, la morfologla celular va cambiando. Se observa como para concentraciones bajas de alicina las celulas no parecen afectadas, manteniendo una forma esferica, unidas en cumulos celulares y bien adheridas al soporte empleado. En cambio, para concentraciones mas altas, lo observado son celulas o fragmentos celulares carentes de similitud morfologica con respecto a las celulas control y despegadas totalmente del soporte celular.

Tratamientos con extractos de ajo en ensayos de RN

Se realizo el analisis del efecto de los distintos extractos y combinaciones sobre la perdida de viabilidad celular para evaluar las mas efectivas. Para ello se trataron las celulas con 1 concentration de oxaliplatino (500 pM), 2 concentraciones de alicina (10 y 50 pg/ml), 2 concentraciones distintas de SAC (5 y 25 pg/ml), 4 combinaciones de extracto de ajo liofilizado extracto de ajo negro (N5+Alic10, N5+Alic50, N25+Alic10 y N25+Alic50), combinaciones de extracto de ajo negro oxaliplatino (N5+Oxaliplat y N25+ Oxaliplat), y de extracto de ajo liofilizado extracto de ajo negro oxaliplatino (N5+Alic10+Oxaliplat, N5+Alic50+Oxaliplat, N25+Alic10+Oxaliplat y N25+Alic50+Oxaliplat), y se evaluo el efecto producido mediante el ensayo del RN.

Las celulas cancerlgenas supervivientes al tratamiento poseeran lisosomas funcionales que seran capaces de incorporar y fijar el colorante rojo neutro. Por tanto, a mayor color observado, mayor cantidad de celulas vivas. En las Figuras 6 y 7 se representa en valores porcentuales la viabilidad celular observada mediante el uso de espectrofotometrla, tomando como 100% de viabilidad la absorbancia obtenida en las celulas que no han recibido tratamiento, es decir, las celulas control.

Al examinar estos datos, se observa como al aplicar tratamientos individualizados de los extractos de ajo a celulas tumorales de cancer de colon, se produce una afectacion celular dosis-dependiente, siendo unicamente el tratamiento con ajo negro 25 pg/ml mas efectivo que el oxaliplatino 500 pM. De hecho, se encuentran mas afectadas las celulas que muestran una mayor velocidad de replication celular, es decir, las Caco-2. A pesar de ese efecto mas acentuado en las Caco-2, tambien para las HT-29 se produce una perdida de viabilidad celular.

En las Caco-2, y respecto a la combination de extracto de ajo liofilizado extracto de ajo negro, ciertas combinaciones son mas citotoxicas que sus componentes por separado (N5+Alic10 y N5+Alic50), y ademas combinacion de extracto de ajo liofilizado extracto de ajo negro oxaliplatino (N5+Ali50+Oxaliplat) incrementa aun mas el efecto del oxaliplatino solo (Figura 6).

En las HT-29, y respecto a la combinacion de extracto de ajo liofilizado extracto de ajo negro, se produce mayor afectacion con N5+Alic50, y ademas la combinacion de extracto de ajo liofilizado extracto de ajo negro oxaliplatino (N5+Ali50+Oxaliplat) incrementa aun mas el efecto del oxaliplatino solo (Figura 7).

Tratamientos con extractos de ajo en ensayos de LDH

La LDH es una enzima perteneciente al citosol celular, y en el caso de detectarse en el exterior de la celula, serla un claro indicativo de lisis celular. Tanto la presencia de la LDH liberada en el medio de cultivo, como la LDH que queda en el interior de las celulas, pueden ser determinadas mediante cuantificacion colorimetrica de un metabolito que resulta de la conversion de una sal de tetrazolio en un producto formazan de color rojo, cuya production se debe al efecto enzimatico de la LDH.

La cuantificacion del porcentaje de LDH liberada respecto a la total puede ser utilizada como un Indice de toxicidad celular, ya que si existe LDH en el exterior de la celula es porque se ha debido producir dano o rotura de la membrana celular. Esta determination se realizo mediante el ensayo de liberation de LDH del kit CytoTox 96® Assay (Promega).

En la Figura 8, realizada en celulas HT-29, se puede observar como las combinaciones de ajo negro (N) y ajo liofilizado (alicina) incrementan sensiblemente los efectos individuales, y que la combination de extracto de ajo liofilizado extracto de ajo negro oxaliplatino incrementa aun mas el efecto del oxaliplatino solo.

Estos resultados apoyan el uso del ajo liofilizado, del ajo negro y de su combinacion como option terapeutica combinada con diferentes antineoplasicos para tratamiento de distintos procesos oncologicos. Estas combinaciones mantendrlan o aumentarlan el efecto citotoxico deseable sobre las celulas tumorales, permitiendo reducir la dosis de antineoplasico de uso habitual en la cllnica y, teoricamente, disminuyendo los efectos secundarios adversos de la aplicacion de dichos antineoplasicos a sus concentraciones estandar.

Ejemplo 5. Uso topico o sistemico de extracto de ajo liofilizado y extracto de ajo negro en cicatrizacion

Modelo murino de cicatrization con heridas por perdida de sustancia

Los animales de experimentation que se emplearon son ratones Skh1 (Charles River Laboratories©), desnudos, albinos, microbiologicamente convencionales (no SPF), eutlmicos e inmunocompetentes.

Se realizaron dos biopsias circulares de 5 mm de diametro en sendos flancos de cada raton de cada uno de los grupos de tratamiento por el mismo experimentador y de forma consecutiva (para no tener variaciones entre distintos operarios o variaciones en la tecnica de un mismo operario en momentos distintos de un dla). La biopsia elimino piel completa hasta el nivel de la fascia muscular, que debe dejarse intacta para evitar hematomas. De este modo, cada animal presento dos heridas de igual diametro, realizadas al mismo tiempo y localizadas en la misma situation anatomica de la piel del dorso.

No se utilizaron antibioticos topicos ni otros productos topicos o sistemicos que interfiriesen en la cicatrization de cada individuo excepto la solution con extracto de ajo a distintas concentraciones (segun el grupo de tratamiento) y el vehlculo en la herida-control.

• Estudios histopatologicos

Se recolectaron muestras histologicas procedentes de cada herida quirurgica y 0,5 cm alrededor de la cicatriz, realizando 3 cortes longitudinales y paralelos en la muestra:

1) en el centro de la cicatriz;

2) en la proximidad del borde de la cicatriz; y

3) en la piel situada en el 0,5 cm de margen alrededor de la cicatriz.

Tras dividir la biopsia en estas tres partes y orientar los cortes debidamente en el microtomo, se realizaron las siguientes tinciones histologicas:

1) Hematoxilina-eosina

2) Tricromico de Masson

3) Tincion de orcelna acetica

Determination de la concentration terapeutica del extracto liofilizado de ajo por via topica

Se desarrollo un estudio con 8 ratones macho Skh1 de >1 ano edad, en los que se llevo a cabo el protocolo de cicatrization comentado con anterioridad y se los separo en 3 grupos de 2 animales cada uno: 1) extracto de ajo liofilizado a concentration de 50 pg/mL; 2) extracto de ajo liofilizado a concentration de 10 pg/mL; 3) extracto de ajo liofilizado a concentration de 1 pg/mL; y 4) grupo control. En cada animal de un mismo grupo, la herida quirurgica del lado derecho es la zona de tratamiento, mientras que la herida contralateral actua como control (se aplica el vehlculo). De este modo, cada animal actua como individuo de tratamiento y su propio control dentro de cada uno de los tres grupos de tratamiento, pudiendo compararlos con el grupo control, en el que ambas heridas son tratadas con vehlculo.

Durante el seguimiento del experimento (2 semanas), desde la realization de las heridas quirurgicas hasta observar su cierre en todos los animales del experimento, el grupo tratado con extracto de ajo liofilizado a concentration 50 pg/mL mostro un cierre mas rapido que el grupo tratado con extracto de ajo a concentracion 10 pg/mL y ambos grupos presentaron mejores resultados en cuanto a velocidad de cierre de la herida que el grupo tratado a concentracion 1 pg/mL y las heridas del grupo control (de hecho, no existlan diferencias entre el grupo tratado con concentracion 1 pg/mL y el grupo control). Esta respuesta procicatrizante fue objetivada a las 24 horas de tratamiento (Figura 9). Por tanto, se observo un efecto dosis-dependiente, que es claro para los grupos tratados con concentraciones de 50 y 10 pg/mL (lado derecho) respecto al grupo tratado con 1 pg/mL. En el grupo tratado con extracto de ajo liofilizado a concentracion 1 pg/mL, no se observaron diferencias en la herida tratada (lado derecho) respecto de la herida contralateral (lado izquierdo), que mostro una evolution torpida hacia el cierre por segunda intention durante los 14 dlas del experimento. Sin embargo, los animales de los grupos de tratamiento con extracto de ajo a concentraciones 50 y 10 pg/mL presentaron mayor respuesta cllnica en la herida tratada (lado derecho), que en la contralateral tratada unicamente con vehlculo (Figura 10). No obstante, todos los individuos de los grupos de tratamiento con extracto de ajo a concentracion 50 y 10 pg/mL tambien presentaron una buena respuesta en la herida del lado izquierdo, lo que demuestra un efecto sistemico de la aplicacion topica sobre la herida cutanea del lado derecho del extracto de ajo liofilizado a estas concentraciones (Figuras 10 y 11).

• Estudios histopatologicos

Las tinciones histologicas mostraron un aumento en el grosor epidermico (acantosis) y mayor numero de fibroblastos dermicos en las heridas del grupo tratado con extracto de ajo liofilizado a concentracion 50 pg/mL respecto del grupo control tratado con vehlculo (Figura 12). El efecto sistemico del uso topico de la concentracion de 50 pg/mL se manifesto a nivel histologico, observandose una reduction de la cicatriz del flanco tratado con vehlculo en los animales de grupo tratado con extracto de ajo liofilizado 50 pg/mL en el flanco derecho (Figura 13). Tambien fue destacable el aumento en la production de colageno en la dermis, que estaba bien organizado en haces densos respecto a lo que ocurre en el grupo control (Figura 14).

Respuesta al uso topico de extracto de ajo liofilizado en el modelo murino de cicatrization

Se desarrollo un estudio con 10 ratones macho Skh1 de 8 semanas de edad, en los que se llevo a cabo el protocolo de cicatrizacion comentado con anterioridad y se los separo en 2 grupos de 5 animales cada uno: 1) extracto de ajo liofilizado a concentration de 50 pg/mL; 2) grupo control tratado con el vehlculo de disolucion del extracto de ajo liofilizado.

Durante el seguimiento del experimento (2 semanas), desde la realization de las heridas quirurgicas hasta observar el cierre en los primeros animales (2 semanas), el grupo tratado con extracto de ajo liofilizado a concentracion 50 pg/mL mostro un cierre mas rapido que el grupo control. Esta respuesta procicatrizante fue objetivada midiendo los diametros mayor y menor de cada herida en proceso de cicatrizacion para calcular el area de herida (Figura 15). Tambien se evidencio a traves de la secuencia de fotograflas dermatoscopicas tomadas a intervalos de 2 dlas (Figura 16).

• Estudios histopatologicos

Las tinciones histologicas mostraron mayor numero de fibroblastos dermicos en las heridas del grupo tratado con extracto de ajo liofilizado a concentracion 50 pg/mL respecto del grupo control tratado con vehlculo (Figura 17). Tambien fue destacable el aumento en la produccion de colageno en la dermis, que estaba bien organizado en haces densos respecto a lo que ocurre en el grupo control (Figura 17).

Respuesta al uso topico de extracto de ajo negro en el modelo murino de cicatrizacion

Se desarrollo un estudio con 9 ratones macho Skh1 de 8 semanas de edad, en los que se llevo a cabo el protocolo de cicatrizacion comentado con anterioridad y se los separo en 2 grupos de 5 y 4 animales cada uno: 1) extracto de ajo negro a concentracion de 10 pg/mL (n = 5); 2) grupo control tratado con el vehlculo de disolucion del extracto de ajo liofilizado (n = 4).

Durante el seguimiento del experimento (2 semanas), desde la realizacion de las heridas quirurgicas hasta observar el cierre en los primeros animales (2 semanas), el grupo tratado con extracto de ajo negro a concentracion 10 pg/mL mostro un cierre mas rapido que el grupo control. Esta respuesta procicatrizante fue objetivada midiendo los diametros mayor y menor de cada herida en proceso de cicatrizacion para calcular el area de herida (Figura 18). Tambien se evidencio mediante la secuencia de fotograflas dermatoscopicas tomadas a intervalos de 2 dlas (Figura 19).

• Estudios histopatologicos

Las tinciones histologicas mostraron mayor numero de fibroblastos dermicos en las heridas del grupo tratado con extracto de ajo negro a concentration 10 pg/mL respecto del grupo control tratado con vehlculo (Figura 20). Tambien fue destacable el aumento en la production de colageno en la dermis, que estaba bien organizado en haces densos respecto a lo que ocurre en el grupo control (Figura 20).

Modelo in vitro (wound healing) en cultivos de queratinocitos y fibroblastos dermicos humanos

En cultivos de queratinocitos (HaCaT), se desarrollo un modelo de wound healing para medir su proliferation y migration en respuesta al extracto liofilizado de Allium sativum, el extracto de ajo negro, y la combination de ambos extractos. Tambien se estudio respecto a sus efectos in vitro en la proliferacion de fibroblastos humanos dermicos (CRL-2072).

Los resultados para el extracto de ajo liofilizado en el modelo in vitro de wound healing mostraron un aumento en la migracion y proliferacion de queratinocitos humanos y en la proliferacion de fibroblastos humanos dermicos (Figura 21).

Tambien se evidencio aumento en la proliferacion de queratinocitos y fibroblastos dermicos humanos en los estudios de proliferacion con la tecnica de cristal violeta (Figura 22).

Finalmente, la combinacion de ambos extractos de Allium sativum, ajo liofilizado y ajo negro, en distintas concentraciones, especialmente, 1:5 (ajo liofilizado/ajo negro), mostraba un aumento en la proliferacion tanto de queratinocitos humanos como de fibroblastos dermicos humanos (Figura 23).

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Una composition que comprende extracto de ajo liofilizado y extracto de ajo negro.

2. Composition segun la revindication 1, caracterizada por que la proportion de extracto de ajo liofilizado a extracto de ajo negro es entre 1:1 y 1:5.

3. Composition segun una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada por que es una composition farmaceutica.

4. Composition segun la revindication 3, caracterizada por que comprende farmacos antineoplasicos seleccionados del grupo compuesto por citostaticos, citotoxicos, farmacos biologicos y compuestos de inmunoterapia.

^{5. Composition segun la re}v^{indication 4, caracterizada por que dicho farmaco} antineoplasico es oxaliplatino.

6. Composition segun cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizada por que comprende excipientes farmaceuticamente aceptables.

^{7. Composition segun la re}v^{indication 1, caracterizada por que es una composition} alimenticia.

^{8. Composition segun la re}v^{indication 7, caracterizada por que comprende aditivos} alimenticios.

9. Uso de una composition segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de enfermedades seleccionadas del grupo compuesto por sepsis, shock septico, enfermedades tumorales y enfermedades dermatologicas.

^{10. Uso segun la re}v^{indication 9, caracterizado por que dichas enfermedades tumorales} estan seleccionadas del grupo compuesto por cancer de colon, cancer de pulmon, cancer de prostata, cancer de vejiga, cancer de mama, cancer de ovario, cancer de testlculo, cancer de pancreas, cancer de rinon, cancer de hlgado, cancer cervical, cancer gastrico, cancer de cabeza y cuello, cancer de hueso, canceres del sistema nervioso central, tumores neuroendocrinos, carcinoma de tiroides, sarcomas, leucemias, linfomas, mielomas, melanomas.

^{11. Uso segun la re}v^{indication 9 o 10, caracterizado por que dichas enfermedades} dermatologicas estan seleccionadas del grupo compuesto por cicatrization de heridas cutaneas, modulador de la funcion barrera epidermica, inductor de la production y secretion de peptidos antimicrobianos epidermicos y dermatosis inflamatoria, dermatitis irritativa y eccema atopico, eccema irritativo y eccema alergico de contacto.

12. Procedimiento de obtencion de extracto de ajo negro segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que comprende o puede comprender las siguientes etapas:

(a) extraction solido-llquido con un disolvente organico y/o inorganico a una presion entre 0,1 y 400 atm y a una temperatura entre -70°C y 150°C con un tiempo de extraction superior a 1 minuto,

(b) separation flsica de la materia extralda y el lixiviado obtenido,

(c) separation o recuperation del disolvente y la concentration del lixiviado o extracto obtenido en las etapas anteriores y

(d) estabilizacion qulmico-flsica por liofilizacion o mantenimiento en frlo.

13. Procedimiento segun la revindication 13, caracterizado por que la separation flsica de la etapa (b) se realiza por centrifugado, filtrado o decantation.