DESCRIPCIÓN Composición que comprende extractos de ajo, uso para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades, y procedimiento de obtención 5 CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a medicamentos para el tratamiento de enfermedades, sepsis, shock séptico, enfermedades tumorales y enfermedades dermatológicas. En particular, la invención se refiere a una composición que comprende extracto de ajo liofilizado y extracto 10 de ajo negro. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El ajo negro es fruto de la transformación del ajo natural en unas condiciones determinadas 15 de temperatura y humedad. El proceso tiene lugar en 4 o 5 etapas dependiendo del fabricante, en las que se varían las condiciones ambientales en rangos de: 60-90ºC de temperatura; 50-100% de humedad relativa, y se prolonga cada una de las etapas entre 6- 192 h de tiempo. 20 La reacción de Maillard es el resultado de la glucosilación no enzimática de proteínas, es decir, la adición de un glúcido a otra molécula que se denomina aceptora, y que puede tener naturaleza proteica o lipídica. La mayoría de las proteínas almacenadas en el retículo endoplasmático rugoso experimentan glucosilación. El retículo endoplasmático rugoso está formado por una serie de canales o cisternas que se encuentran distribuidos por todo el 25 citoplasma de la célula, generando unos sacos aplanados en los cuales se introducen cadenas polipeptídicas, las cuales forman las proteínas que sufren las reacciones no enzimáticas de glucosilación. Como resultado, tenemos un conjunto muy complejo de reacciones químicas que traen 30 consigo la producción de melanoidinas coloreadas que van desde el amarillo claro, colores tostados de diversa intensidad, e incluso el negro como en el caso de la transformación del ajo natural a ajo negro. En las reacciones son necesarios un azúcar reductor (cetosa o aldosa) y un grupo amino libre, proveniente de un aminoácido o una proteína, y dependiendo de las condiciones en las que se lleven a cabo y la naturaleza del sustrato, 35
pueden derivarse en la transformación de compuestos aromáticos como flavonoides y polifenoles como ocurre en el caso del ajo. La sepsis se define como una infección (probada o sospechada) más un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (fiebre, taquicardia, taquipnea y leucocitosis). La sepsis 5 severa se define como una sepsis con disfunción orgánica (hipotensión, hipoxemia, oliguria, acidosis metabólica, trombocitopenia, etc.). Shock séptico sería una sepsis severa con hipotensión, a pesar de una adecuada reposición con fluidos. El shock séptico y fracaso multiorgánico son la causa más frecuente de muerte en los pacientes con sepsis. La mortalidad asociada a sepsis severa y shock séptico oscila entre el 25-30% y el 40-70% 10 respectivamente. La sepsis es la culminación final de complejas interacciones entre el microorganismo infectante y la respuesta inmune, inflamatoria y de la coagulación del huésped. 15 El estado de la técnica describe que la alicina, principal componente activo contenido en el extracto liofilizado, es capaz de reaccionar con grupos tioles libres y de penetrar las membranas biológicas. Sin embargo, los mecanismos por los cuales la alicina afecta a los sistemas celulares no están del todo claros. Se ha sugerido que el efecto antiproliferativo de la alicina se debe a la capacidad que tiene la alicina para deplecionar de manera transitoria 20 los depósitos de glutation intracelular. Con respecto al ajo negro, existen trabajos que señalan su potencial efecto anti-tumoral al inhibir la proliferación celular de líneas tumorales humanas de cáncer gástrico. 25 La integridad física y funcional de la piel, el órgano de mayor tamaño, es crucial en la supervivencia de los mamíferos para evitar la deshidratación y permitir la vida en un medio terrestre. La función principal de la piel consiste en actuar como una barrera de permeabilidad, separando el medio biológico, predominantemente acuoso, del medio aéreo que lo rodea. 30 El compromiso de la función barrera epidérmica es un evento crucial en la fisiopatología de muchas dermatosis inflamatorias crónicas (dermatitis atópica, dermatitis irritativa, psoriasis, etc.), ya que crea un estado proinflamatorio en la piel que prolonga los brotes de actividad y acorta los periodos de remisión. 35
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende extracto de ajo liofilizado y extracto de ajo negro. 5 Otra realización es la composición según el primer aspecto, donde la proporción de extracto de ajo liofilizado a extracto de ajo negro es entre 1:1 y 1:5. En un segundo aspecto, la composición según el primer aspecto es una composición farmacéutica. 10 Otra realización es la composición farmacéutica según el segundo aspecto, que comprende fármacos antineoplásicos seleccionados del grupo compuesto por citostáticos, citotóxicos, fármacos biológicos y compuestos de inmunoterapia. 15 Otra realización es la composición farmacéutica según el segundo aspecto, donde dicho fármaco antineoplásico es oxaliplatino. Otra realización es la composición farmacéutica según el segundo aspecto, que comprende excipientes farmacéuticamente aceptables. 20 El término “excipientes” hace referencia a compuestos que estabilizan y favorecen la absorción de los principios activos, colorantes, endulzantes, saborizantes, protectores frente al aire y/o humedad, aglutinantes, etc. 25 La composición farmacéutica puede ser formulada con excipientes farmacéuticamente aceptables, así como con cualquier otro tipo de portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables, de acuerdo con técnicas convencionales en la práctica farmacéutica. La composición farmacéutica puede ser administrada por si sola o en combinación con otros 30 principios activos. La composición farmacéutica puede ser administrada en dosis simples o múltiples. La composición farmacéutica del segundo aspecto de la invención puede ser administrada 35 por cualquier vía de administración (por ejemplo, sistémica, oral, sublingual, perioral,
parenteral, uretral, vaginal, rectal, intraperitoneal, intramuscular, intranasal, intravenosa, intraarterial, transdérmica, subcutánea, tópica, etc.) para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida. La composición farmacéutica puede ser formulada para proporcionar la liberación controlada 5 del ingrediente activo como por ejemplo liberación sostenida o prolongada de acuerdo con métodos que son bien conocidos en la técnica. En un tercer aspecto, la composición según el primer aspecto es una composición alimenticia. 10 Otra realización es la composición alimenticia según el tercer aspecto, que comprende aditivos alimenticios. En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona el uso de una composición según el 15 primer y segundo aspecto para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades seleccionadas del grupo compuesto por sepsis, shock séptico, enfermedades tumorales y enfermedades dermatológicas. La composición comprende un extracto rico en alicina estable, procedente del extracto 20 liofilizado, y s-alil-cisteína estable, procedente del ajo negro. Esto proporciona concentraciones controladas de estos dos compuestos activos. La s-alil-cisteína actúa sinérgicamante con la alicina y el resto de tiosulfinatos y compuestos presentes en el extracto liofilizado. 25 El extracto de ajo negro es un extracto polar de ajo negro. Con este extracto se consigue un extracto soluble en agua y estabilidad térmica de S-alil-L-cisteína (SAC) y la potenciación de la actividad de ambos extractos. 30 La composición proporciona estabilización para tiosulfinatos, polisulfidos, prostaglandina E1 (PGE1), vitamina E, inulina y ajoeno, compuestos derivados del ajo. La invención permite obtener a escala industrial productos estandarizables, formulables y aplicables terapéuticamente con las garantías de estabilidad temporal que se han expuesto 35 anteriormente. Los compuestos obtenidos de los extractos de ajo son estables por periodos
de tiempo que permiten su aplicación en el laboratorio, en animales y en humanos, con totales garantías de eficacia en relación con su composición. En la sepsis, la composición actúa en múltiples pasos del proceso, tanto en la respuesta inflamatoria precoz como en la respuesta procoagulante. Hasta ahora las opciones 5 terapéuticas planteadas se han dirigido sobre un punto concreto del proceso, lo que posiblemente haya podido contribuir a resultados pocos satisfactorios. La composición interacciona en varios puntos clave y disminuye con ello la respuesta inflamatoria precoz y la respuesta procoagulante más tardía. 10 Otra realización es el uso según el cuarto aspecto de la invención, donde dichas enfermedades tumorales están seleccionadas del grupo compuesto por cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de testículo, cáncer de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer cervical, 15 cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de hueso, cánceres del sistema nervioso central, tumores neuroendocrinos, carcinoma de tiroides, sarcomas, leucemias, linfomas, mielomas, melanomas. En enfermedades dermatológicas, considerando las variaciones correspondientes a cada 20 proceso patológico cutáneo (herida por pérdida de sustancia o proceso inflamatorio con o sin afectación de la función barrera epidérmica), la invención proporciona una composición que comprende extracto de ajo liofilizado y extracto de ajo negro para uso tópico sobre el lecho de heridas cutáneas por pérdida de sustancia, dermatosis inflamatorias crónicas o piel aparentemente indemne con alteraciones de base en la función barrera. La vía tópica 25 cutánea es de fácil acceso, no invasiva, suponiendo un aumento de la biodisponibilidad y la eficacia terapéutica de los extractos de ajo con menores efectos adversos que otras vías de administración. Del mismo modo, el uso sistémico de la composición que comprende extracto de ajo liofilizado y extracto de ajo negro tiene un efecto favorable en la cicatrización de heridas cutáneas, dermatosis inflamatorias crónicas o piel aparentemente indemne con 30 alteraciones de base en la función barrera. Por tanto, otra realización es el uso según el cuarto aspecto de la invención, donde dichas enfermedades dermatológicas están seleccionadas del grupo compuesto por cicatrización de heridas cutáneas, modulador de la función barrera epidérmica, inductor de la producción 35
y secreción de péptidos antimicrobianos epidérmicos y dermatosis inflamatoria, dermatitis irritativa, eccema atópico, eccema irritativo y eccema alérgico de contacto. En las enfermedades tumorales, haciendo las pertinentes variaciones específicas según la 5 naturaleza del proceso neoplásico (tipo de tumor), la invención proporciona una opción terapéutica en la que el extracto de ajo liofilizado y extracto de ajo negro están combinados con fármacos antineoplásicos seleccionados del grupo compuesto por citostáticos, citotóxicos, fármacos biológicos y compuestos de inmunoterapia. Esta combinación mantiene el efecto citotóxico deseable sobre las células tumorales, permitiendo reducir la 10 dosis del/los fármacos antitumorales de uso habitual en la clínica y disminuyendo los efectos adversos (tóxicos) de la administración rutinaria de dichos fármacos a las concentraciones estándar. En un quinto aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de obtención de 15 extracto de ajo negro según el primer, segundo y tercer aspecto, que comprende las siguientes etapas: (a) extracción sólido-líquido con un disolvente orgánico y/o inorgánico a una presión entre 0,1 y 400 atm y a una temperatura entre -70ºC y 150ºC con un tiempo de extracción superior a 1 minuto, 20 (b) separación física de la materia extraída y el lixiviado obtenido, (c) separación o recuperación del disolvente y la concentración del lixiviado o extracto obtenido en las etapas anteriores y (d) estabilización químico-física por liofilización o mantenimiento en frío. 25 Otra realización es el procedimiento según el quinto aspecto, donde la separación física de la etapa (b) se realiza por centrifugado, filtrado o decantación. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS 30 Figura 1. Seguimiento de peso durante 14 días. En la gráfica se observa como en el grupo II y III tras la infección se produce una caída similar del peso. Sin embargo, pasadas las primeras 24 horas, el grupo de la alicina (grupo III) comienza a ganar peso, mientras que el grupo II lo hace a las 48 horas. El panel inferior izquierdo representa la caída de peso en el grupo II y III en el día 9, 24 horas después de la infección. El panel inferior derecho es una 35 representación gráfica donde se observa que el grupo III comienza en el día 10 con una
recuperación de peso que no se observa en el grupo II (diferencia estadísticamente significativa p < 0,01) Figura 2. Representación gráfica del número de ratas que presentan, en cada uno de los grupos (II y III), los diferentes signos de sufrimiento y estrés valorados: secreciones 5 oculares, secreciones nasales, posición bigotes, falta de acicalamiento, piloerección, letargo/hipoactividad y diarrea. Figura 3. Determinación de IL-1, IL-6 y TNF-alfa en cada uno de los grupos en diferentes intervalos de tiempo. 10 Figura 4. Imágenes más representativas de cada una de las variables estudiadas. Figura 5. Morfología celular resultante tras el tratamiento de células de cáncer de colon HT-29 con distintas concentraciones de alicina expresadas en µg/mL. 15 Figura 6. Ensayo del RN sobre células Caco-2 tratadas con oxaliplatino (OX), ajo liofilizado (representado por alicina; Ali), ajo negro (representado por SAC; N), y sus combinaciones. En las gráficas se representa la viabilidad celular detectada con los distintos tratamientos, en función de la concentración de cada uno de ellos. Se muestra el valor promedio (n=6) ± SD. 20 Figura 7. Ensayo del RN sobre células HT-29 tratadas con oxaliplatino (OX), ajo liofilizado (representado por alicina; Ali), ajo negro (representado por SAC; N), y sus combinaciones. En las gráficas se representa la viabilidad celular detectada tras 24 h con los distintos tratamientos, en función de la concentración de cada uno de ellos. Se muestra el valor 25 promedio (n=6) ± SD. Figura 8. Ensayo de LDH sobre células HT-29 tratadas con oxaliplatino (OX), ajo liofilizado (representado por alicina; Ali), ajo negro (representado por SAC; N), y sus combinaciones. En las gráficas se representa la LDH liberada tras 24 h con los distintos tratamientos, en 30 función de la concentración de cada uno de ellos. Se muestra el valor promedio (n=6) ± SD. Figura 9. Cierre de la herida por segunda intención a las 24 h (2 administraciones tópicas) de extracto de ajo liofilizado a concentración de 50 µg/mL (los dos ratones de la derecha) respecto del grupo control (los dos animales de la izquierda). El grupo de tratamiento sólo 35
recibió tratamiento tópico con extracto de ajo liofilizado en la herida del flanco derecho, mientras que la herida contralateral era tratada con vehículo (V). Figura 10. Cierre de la herida por segunda intención el día 8 del experimento. Obsérvese la diferencia entre el animal del grupo tratado con extracto de ajo liofilizado a concentración 50 5 µg/mL en el flanco derecho (situado a la derecha) respecto del animal del grupo tratado con extracto de ajo liofilizado a concentración 1 µg/mL en la herida del flanco derecho (situado a la izquierda). Debajo se muestra un detalle de la imagen dermatoscópica de las heridas de ambos flancos. 10 Figura 11. Disminución del eje vertical de la cicatriz (no sometido a las líneas de tensión de Langer) en el día 10 del experimento piloto para determinar la concentración terapéutica de extracto de ajo liofilizado como procicatrizante. Obsérvese el detalle de la imagen dermatoscópica de las heridas del flanco derecho en un sujeto de los grupos de tratamiento a concentración 1 µg/mL y 50 µg/mL. 15 Figura 12. Imagen histológica de la cicatriz re-epitelizada (tinción de Masson). Obsérvese la disminución del diámetro de la cicatriz en la biopsia cutánea de la cicatriz re-epitelizada del ratón tratado con extracto de ajo liofilizado 50 µg/mL respecto de la herida re-epitelizada de un ratón del grupo control en el día 14 del experimento. Debajo se puede ver en detalle la 20 densidad de fibroblastos y la aparición de nuevas fibras de colágeno en la cicatriz. Figura 13. Imagen histológica de la cicatriz re-epitelizada (tinción de Masson) en el día 14 del experimento. En la parte superior, aparece la cicatriz de un animal del grupo control, por debajo se muestran dos cortes histológicos de las dos heridas realizadas en un mismo 25 animal del grupo tratado con extracto de ajo liofilizado a concentración 50 µg/mL: 1) la imagen inferior corresponde a la herida tratada con extracto de ajo y 2) la imagen intermedia es una biopsia de la herida contralateral, que sólo recibe tratamiento tópico con el vehículo. Obsérvese la graduación en la disminución del diámetro de la cicatriz en las tres imágenes de arriba abajo, demostrando un efecto procicatrizante directo por la administración tópica 30 del extracto de ajo liofilizado a concentración 50 µg/mL (imagen inferior) y un efecto menos intenso, sistémico, sobre la cicatriz del lado contralateral que sólo recibió tratamiento tópico con vehículo (imagen intermedia). Ambas cicatrices, del lado tratado y del lado no tratado con extracto de ajo liofilizado en un mismo animal, son menores que la cicatriz de un animal del grupo control el día 14 del experimento. 35
Figura 14. Imagen histológica comparando la densidad y distribución de los haces de colágeno dérmico (tinción de orceína) en la biopsia de la cicatriz re-epitelizada de un ratón del grupo tratado con extracto de ajo liofilizado 50 µg/mL respecto de la biopsia de la cicatriz de un ratón del grupo control en el día 14 del experimento. 5 Figura 15. La aplicación tópica del extracto liofilizado de Allium sativum (50 µg/mL) aceleró el proceso de cicatrización (**p<0.05). Figura 16. Detalles dermatoscópicos del proceso de cicatrización in vivo cada 2 días hasta el día 10, donde se aprecia el avance de la lengüeta de re-epitelización (línea vertical negra) 10 en el grupo de tratamiento (extracto liofilizado de ajo 50 µg/mL) respecto del grupo control. Figura 17. Histopatológicamente, las heridas (flecha) tratadas con el extracto de ajo liofilizado (50 µg/mL) mostraron un aumento del número de fibroblastos, densidad de fibras colágenas y re-epitelización completa de herida. 15 Figura 18. La aplicación tópica del extracto fermentado de Allium sativum (10 µg/mL) aceleró el proceso de cicatrización (**p<0.05). Figura 19. Detalles dermatoscópicos del proceso de cicatrización in vivo cada 2 días hasta el 20 día 10, donde se aprecia el avance de la lengüeta de re-epitelización (línea vertical negra) en el grupo de tratamiento (extracto de ajo negro 10 µg/mL) respecto del grupo control. Figura 20. Histopatológicamente, las heridas (flecha) tratadas con el extracto de ajo negro (10 µg/mL) mostraron un aumento en el número de fibroblastos dérmicos (tejido de 25 granulación), densidad de fibras colágenas y re-epitelización completa de la herida. Figura 21. El modelo de wound healing (bordes de la herida lineal con línea discontinua) con cultivos celulares de queratinocitos (HaCaT) y fibroblastos (CRL-2072) mostraron un aumento significativo (**p<0.05) en los índices de proliferación y migración bajo el 30 tratamiento con extracto de ajo liofilizado respecto al control. Figura 22. Los resultados obtenidos a partir de ensayos de proliferación mediante la técnica del cristal violeta, mostraron que el extracto fermentado de ajo (ajo negro) tiene un efecto dosis dependiente sobre la proliferación tanto en queratinocitos (HaCaT) como de 35 fibroblastos (CRL-2072), produciendo un aumento significativo para ambos tipos celulares.
Figuras 23 y 24. La combinación, sobre todo a dosis bajas en un ratio 1:5, del extracto liofilizado de ajo con el derivado fermentado (ajo negro) es capaz de inducir un aumento en la proliferación superior al 80% y 60% en queratinocitos (HaCaT, Figura 23) y fibroblastos (CRL-2072, Figura 24), respectivamente. Estos resultados corroboran que tanto el extracto 5 de ajo como el derivado fermentado de éste tienen un efecto positivo sobre la proliferación de los principales componentes de la dermis y la epidermis y apuntan a un efecto sinérgico de la combinación de ambos. * <0.05 ** <0.01 10 *** <0.001 DESCRIPCIÓN DE MODOS DE REALIZACIÓN Ejemplo 1. Obtención de extracto de ajo liofilizado utilizado en la presente invención 15 El extracto de ajo liofilizado (Aliben®, Patente: ES 2 306 597 B1) empleado en las investigaciones presentes se ha empleado reconstituido en medio acuoso. La alicina ha mostrado actividad por más de 10 meses si se mantiene a 6ºC, mostrando una estabilidad química muy por encima de lo que se establece en otros trabajos para esta especie química. 20 Además, el liofilizado obtenido muestra una estabilidad no inferior a 18 meses cuando se conserva en un ambiente opaco y hermético. Procedimiento de obtención de extracto liofilizado a partir de Allium sativum, utilizando etanol en la extracción 25 Se tomaron varias cabezas de ajo de la variedad morado y perteneciente a la Indicación Geográfica Protegida "Ajo Morado de Las Pedroñeras" (Castilla-La Mancha, España). A estas cabezas se les eliminaron las camisas exteriores y sus dientes se separaron en unidades independientes. La masa total de ajos utilizada en este experimento fue de 850 g. 30 Los dientes se trituraron en una trituradora doméstica hasta alcanzar un tamaño de partícula medio de 1 mm. El producto triturado se puso en contacto con 2 litros de etanol (96% v/v) en un tanque cilíndrico perfectamente mezclado por medio de un agitador mecánico de hélices/paletas (375 rpm) para la extracción sólido-líquido. El sistema se mantuvo termostatizado a 33ºC durante 90 minutos. El licor mezcla se filtró a vacío por medio de un 35 Buschtner-Kitasato al que se había acoplado un filtro con una luz de malla de 0.5 mm. El
filtrado fue procesado en un rotavapor para la eliminación del disolvente a vacío. La temperatura del baño del rotavapor fue de 55ºC. El producto así obtenido fue dispuesto en la bandeja de un liofilizador. Se congeló a -37ºC y se le aplicó un vacío de 0.2 torrs. La temperatura del condensador se fijó a -55ºC y la de la cámara a +10ºC. El proceso se extendió durante 28 h tras las cuales se recogieron 60 g de extracto liofilizado. El extracto 5 liofilizado se almacenó a temperatura ambiente en recipientes opacos y herméticos para realizar en distintos momentos ensayos de caracterización farmacoterapéutica. Obtención de un extracto concentrado 10 Se siguió el procedimiento operativo de extracción con etanol descrito más arriba que incluyó las etapas de acondicionamiento, la extracción con etanol, filtrado de cabezas de ajo y eliminación del disolvente en el rotavapor. El extracto concentrado así obtenido fue almacenado en nevera a 6ºC en recipientes opacos y herméticos. 15 Ejemplo 2. Obtención de extracto acuoso de ajo negro utilizado en la presente invención Se utilizó ajo negro comercial (Aurum black®), fruto de la transformación del ajo natural. El proceso tiene lugar en 4 o 5 etapas, en las que se varían las condiciones ambientales en 20 rangos de: 60-90ºC de temperatura; 50-100% de humedad relativa, y se prolonga cada una de las etapas entre 6-192 h de tiempo. El producto sufre una evolución ocasionada por la denominada reacción de Maillard. La reacción de Maillard es el resultado de la glucosilación no enzimática de proteínas, es decir, la adición de un glúcido a otra molécula que se denomina aceptora, y que puede tener naturaleza proteica o lipídica. La mayoría de las 25 proteínas almacenadas en el retículo endoplasmático rugoso experimentan glucosilación. Se siguió el siguiente procedimiento: i) Se pesaron 133,5 g de ajo negro en dientes sin piel. 30 ii) Se trituraron junto a 120,1 ml de suero fisiológico (NaCl 0,9%), hasta obtener una mezcla homogénea en forma de pasta. iii) Se añadieron 100 ml más de suero fisiológico y se realizó extracción a 50ºC durante 50 minutos a una velocidad de agitación de 80 rpm en extractor encamisado tipo tanque agitado de 2 L. 35 iv) Se realizó centrifugación en viales de 10 ml a 4.000 rpm durante 15 minutos.
v) Se recogió el sobrenadante por pipeteo. La fase sólida quedó como residuo en el fondo de los viales. vi) El extracto se filtró en filtros plásticos de 15 mm x 0,45 µm a presión positiva. vii) El extracto de ajo negro obtenido, 61,3 ml, se conservó a 4ºC hasta su empleo y formulación para la realización de ensayos biológicos. 5 viii) Una alícuota de 3 ml se destinó a análisis cromatográfico de SAC, de acuerdo a las condiciones de HPLC descritas en el documento UI-Seong Black-Garlic Farming Association. Fuente: Biotechnology Center of Korea University. La Tabla siguiente, nos muestra la composición del extracto de ajo negro obtenido con el 10 procedimiento anteriormente descrito: Compuesto Concentración (ppm) Compuesto Concentración (ppm) S-alil-L-cisteína (SAC) 123,20 Cicloalanina NC α-glucosa NC Alanina NC β-glucosa NC Lisina NC Fructosa NC Arginina NC Ácido Cítrico NC Valina NC Ácido Acético NC Leucina NC Ácido Fórmico NC Isoleucina NC Ácido Piroglutámico NC Treonina NC Ácido Láctico NC Colina NC Glutamina NC 5-hidroximetilfurfural NC NC.- No cuantificada. Análisis cualitativo por 1H-RMN(3). Ejemplo 3. Sepsis y shock séptico 15 Se ha desarrollado un estudio experimental (ensayo terapéutico) de infección intraabdominal donde se ha utilizado el animal de experimentación rata Sprague-Dawley®, Harlan Laboratories Models SL, macho, 5 semanas, y 100-125 g. Se llevó a cabo en las instalaciones de la Unidad de Investigación Traslacional (UIT) del Hospital General 20 Universitario de Ciudad Real.
Se realizó en idéntico horario, para evitar la posible influencia del ciclo circadiano en los resultados del trabajo. Todos los animales estaban sanos y no recibieron tratamiento previo. Las ratas se mantuvieron con comida y agua ad libitum, con un ciclo 12 h de luz y 12 h de oscuridad, y una temperatura ambiente de 22ºC ± 2ºC con una humedad relativa del aire del 5 50%-70% y con 15-20 renovaciones/hora sin recirculación de aire. Fueron estabuladas conforme el RD 53/2013. Los animales se mantuvieron en estas condiciones ambientales durante al menos 1 semana, para permitir su aclimatación, antes de la realización del estudio. La localización de 10 los animales y su estabulación se realizó en el animalario de la Unidad de Investigación Traslacional del Hospital General Universitario de Ciudad Real. Los desechos convencionales, biológicos, fueron removidos y eliminados de forma regular, segura y conforme a las recomendaciones institucionales de riesgos laborales. 15 Se realizó un modelo donde se administró una concentración conocida de alicina. Se procedió a una aleatorización en tres Grupos de ratas, a partir de ahora nos referiremos a Grupo I –grupo con suero fisiológico–, Grupo II –grupo con ceftriaxona–, Grupo III –grupo con ceftriaxona + alicina–. Inclusión de 6 ratas en grupo control y 9 ratas en los Grupos II y 20 III. Se generó un modelo de peritonitis en todos los Grupos. Para la creación del modelo de peritonitis se realizó laparotomía subxifoidea previa anestesia de la rata con ketamina/xilacina 75/10 mg/kg intraperitoneal, de unos 3 cm de longitud para la implantación de dosis subletal de E Coli ATCC 25922, obtenido tras control de unidades formadoras de colonia (1010 UFC/ml) (tras extensión de 10 µl de E Coli en MacConkey agar y tras control y 25 lectura tras 18-24 h a 37ºC). El tratamiento a administrar a cada uno de los grupos se llevó a cabo de la siguiente forma: 1) grupo control–Grupo I-: 6 animales que reciben 4,4 ml de SF 0.9% intraperitoneal 30 2) grupo experimental II: 9 animales que reciben 100 mg/kg de ceftriaxona intraperitoneal (IP) 3) grupo experimental III: 9 animales que reciben 100 mg/kg de ceftriaxona IP + alicina 0,5 mg/kg IP 35 Los animales pesaban aproximadamente 280 g.
Cálculo de dosis 100 mg/kg x 0.28 kg= 28 mg de ceftriaxona IP 0,5 mg/kg x 0.28 kg= 0,14 mg de alicina IP. La duración de la intervención fue de 7 días si las ratas sobrevivían a la infección. Llegados 5 a ese día se procedía al éxitus de las ratas, una vez anestesiadas con ketamina/xilacina 75/10 mg/kg intraperitoneal más dosis letales de Tiopental 100-120 mg/kg, y tras proceder a realizar peritonectomía total junto a evisceración radical para estudio microbiológico del líquido peritoneal e histológico posterior. La pérdida de volumen sanguíneo con este tratamiento quirúrgico exanguinó a la rata, siendo incompatible con la vida. 10 Se estudiaron las siguientes variables: PARÁMETROS CLÍNICOS 15 Peso en gramos cada uno de los días. Signos de estrés y sufrimiento. Tiempo de sobrevida en intervalos de 24 horas. BIOQUÍMICAS 20 Determinación sanguínea a los 3 y 7 días (éxitus) para estudio serológico de variables de respuesta inflamatoria, IL-1, IL-6, TNF. Estudio microbiológico de SANGRE (hemocultivos) a los 7 días. 25 HISTOLÓGICAS Estudio microbiológico del líquido peritoneal. Se tomaron muestras de hígado y peritoneo para una evaluación histopatológica. 30 Los resultados indicaron que el GRUPO III (ceftriaxona + alicina) es el grupo con mejor respuesta clínica (Figuras 1 y 2), encontrando que dicho grupo comienza la recuperación de peso 24 h antes que el GRUPO II. Cabe destacar que todas las ratas del GRUPO I (Grupo control, que no se trata ni con antibiótico ni con alicina, solamente suero fisiológico) mueren tras la infección a las 3-4 h de la misma, con independencia del peso del que partieran. En 35 relación al resto de parámetro clínicos (Figura 4), encontramos claras diferencias a favor
nuevamente del grupo de tratamiento con alicina, con menos signos de sufrimiento y estrés (menos secreciones oculares y nasales, menos erizada la posición de los bigotes, menos diarrea y con menos letargo y más activas). Atendiendo a los parámetros bioquímicos encontramos que las ratas del grupo control en el 5 momento del fallecimiento presentaban (Figura 3) altos valores de todas los factores proinflamatorios estudiados (IL-6, IL-1, TNF), en consonancia con la sepsis generalizada que presentan y que presumiblemente les lleva al fallecimiento. De igual forma, tanto el análisis microbiológico en los hemocultivos como el cultivo de líquido 10 peritoneal realizados mostraron crecimiento de E Coli ACCT 25922 (Tabla 1). Tabla 1. Resultados hemocultivos, cultivo líquido peritoneal y antibiograma en cada uno de los grupos de estudio. 15 HEMOCULTIVOS CULTIVO L. PERITONEAL ANTIBIOGRAMA CONTROL_1 POSITIVO E.COLI. ATCC 25922 POSITIVO E.COLI ATCC 25922 MULTISENSIBLE CONTROL_2 POSITIVO E.COLI ATCC 25922 POSITIVO E.COLI ATCC 25922 MULTISENSIBLE CONTROL_3 POSITIVO E.COLI ATCC 25922 POSITIVO E.COLI ATCC 25922 MULTISENSIBLE GRUPO II_1 NEGATIVO Enterococcus faecalis Sensible a: Ampicilina, Vancomicina Teicoplamina. GRUPO II_2 Enterococcus faecalis 100 ufc/ml E. Coli < 100 ufc/ml NEGATIVO Sensible a: Ampicilina, Vancomicina Teicoplamina. MULTISENSIBLE GRUPO II_3 Enterococcus faecalis 200 ufc/ml Enterococcus faecalis Sensible a: Ampicilina,
Vancomicina Teicoplamina. GRUPO II_4 Éxitus primeras 24 h Éxitus primeras 24 h GRUPO II_5 E. Coli < 100 ufc/ml Compatible ATCC 25922 NEGATIVO MULTISENSIBLE GRUPO II_6 Enterococcus faecalis 1300-3000 ufc/ml NEGATIVO Sensible a: Ampicilina, Vancomicina Teicoplamina. GRUPO II_7 Enterococcus faecalis <100 ufc/ml NEGATIVO Sensible a: Ampicilina, Vancomicina Teicoplamina. GRUPO II_8 Enterococcus faecalis 800-2000 ufc/ml NEGATIVO Sensible a: Ampicilina, Vancomicina Teicoplamina. GRUPO II_9 Enterococcus faecalis 100 ufc/ml NEGATIVO Sensible a: Ampicilina, Vancomicina Teicoplamina. GRUPO III_1 NEGATIVO NEGATIVO GRUPO III_2 Enterococcus faecalis 200 ufc/ml NEGATIVO Sensible a: Ampicilina, Vancomicina Teicoplamina. GRUPO III_3 Enterococcus faecalis 80000 ufc/ml Enterococcus faecalis Sensible a: Ampicilina, Vancomicina Teicoplamina. GRUPO III_4 Enterococcus faecalis 1100-2000 ufc/ml NEGATIVO Sensible a: Ampicilina, Vancomicina Teicoplamina.
GRUPO III_5 Enterococcus faecalis <100 ufc/ml NEGATIVO Sensible a: Ampicilina, Vancomicina Teicoplamina. GRUPO III_6 Enterococcus faecalis <100 ufc/ml NEGATIVO Sensible a: Ampicilina, Vancomicina Teicoplamina. GRUPO III_7 Enterococcus faecalis <100 ufc/ml NEGATIVO Sensible a: Ampicilina, Vancomicina Teicoplamina. GRUPO III_8 Enterococcus faecalis <100 ufc/ml NEGATIVO Sensible a: Ampicilina, Vancomicina Teicoplamina. GRUPO III_9 Enterococcus faecalis <100 ufc/ml1 NEGATIVO Sensible a: Ampicilina, Vancomicina Teicoplamina. Hay que destacar que se detectaron globalmente en el tercer día menos cantidad de IL en el grupo que añadía alicina. Tanto en el grupo II como en el III al séptimo día no se detectó ningún tipo de IL (lo cual habla a favor de que todas las ratas habían sobrevivido a la sepsis, también lo reflejaba otros parámetros clínicos como la ganancia de peso similar al estado 5 previo a la infección). Atendiendo al estudio histológico también encontramos diferencia a favor del grupo de la alicina (Tabla 2 y Figura 4), existiendo menos infiltración bacteriana y de polimorfonucleares en peritoneo e hígado. 10 Tabla 2. Alteraciones histopatológicas encontradas en peritoneo e hígado en cada uno de los grupos de estudio (congestión en hígado, polimorfonucleares –PMN– en sinusoides hepáticos, PMN superficie peritoneo, PMN en superficie hígado, colonización bacterias superficie hígado, colonización bacterias superficie peritoneo). Comparación entre grupo II y 15 grupo III.
Variable histopatológica χ2 p valor Congestión hepática 2,22 0,898 PMN sinusoides hep. 5,71 0,456 PMN serosa hep. 4,59 0,597 Colección bacteriana hep. 5,71 0,456 Vacuolización hep. 5,3 0,505 PMN superficie perit. 4,29 0,83 Colección bacteriana perit. 3,99 0,678 Tras el sacrificio se realizaron hemocultivos en todas las ratas, resultando negativos todos ellos, excepto en el grupo II donde se encontró en una de las ratas un Enterococcus faecium 5 sensible a ampicilina, vancomicina y teicoplanina. También cultivo de líquido peritoneal, en el mismo solamente en una rata del grupo II encontramos que aún persiste crecimiento de la bacteria E. coli. Sin embargo, en ambos grupos encontramos sobrecrecimiento de Enterococcus faecium, posiblemente debido al tratamiento prolongado con ceftriaxona durante siete días consecutivos que hace que desaparezcan los bacilos GRAM – de la flora 10 intestinal y se produzca el sobrecrecimiento del enterococo (Tabla 1). Como se indicó con anterioridad, todas las ratas control murieron a las 3-4 h tras la infección. Todas las ratas del grupo III sobrevivieron hasta el sacrificio al séptimo día y una rata falleció en el Grupo II de ceftriaxona sobreviviendo las ocho restantes. Nuevamente el 15 grupo de la alicina es el que mejor sobrevida presenta. Globalmente podemos establecer que el GRUPO al que se le añade alicina tiene mejor evolución para todas las variables estudiadas. 20 En nuestro caso particular, al disponer de una composición rica en alicina estable, procedente del extracto liofilizado, con s-alil-cisteína estable procedente del extracto de ajo negro, nos permite afirmar que la mezcla resultante puede actuar conjuntamente o de manera dual o sinérgica con otros tiosulfinatos, así como con otros compuestos presentes en el extracto liofilizado como son los polisulfidos, los vinil-ditiines y la mezcla isomérica E-Z-25 ajoeno.
Ejemplo 4. Uso de extracto de ajo liofilizado y extracto de ajo negro en terapia coadyuvante con fármacos antitumorales en diversas neoplasias Se han desarrollado estudios experimentales (ensayos in vitro). Dichos estudios se han 5 basado en el tratamiento de células tumorales de cáncer de colon, líneas celulares Caco-2 y HT-29, con los extractos de ajo, donde se determinó el efecto antiproliferativo. Se usaron estas líneas celulares ya que los compuestos capaces de inhibir la proliferación de células tumorales pueden ser útiles como agentes quimiopreventivos y quimioterapéuticos. 10 Además, en el estudio se aplicaron tratamientos combinados de extractos de ajo con quimioterápico de uso clínico habitual para determinar si se produce un efecto más acentuado que el producido por cada uno de ellos de forma aislada. Se muestran los efectos citotóxicos y antiproliferativos que producen el extracto liofilizado 15 que contiene alicina, el extracto de ajo negro que contiene SAC, y el quimioterápico oxaliplatino, de forma aislada y en combinación, sobre cultivos de células tumorales colorectales. Para ello, se llevaron a cabo métodos que aportan información sobre la afectación de la viabilidad, proliferación y citotoxicidad celular tras los diferentes tratamientos. Éstos fueron: Ensayo del Rojo Neutro (RN) y Ensayo de la Lactato 20 Deshidrogenasa (LDH). Resultados de los ensayos de proliferación, viabilidad y citotoxicidad celular. Se llevaron a cabo determinaciones fundamentadas en el examen de distintos parámetros 25 celulares, mediante los cuales extraer información del efecto citotóxico o antiproliferativo producido por los extractos de ajo y un citotóxico, tanto administrados de forma individual como en combinación, sobre las células cancerígenas de cáncer de colon. En la Figura 5 se puede apreciar visualmente al microscopio como, a medida que se incrementa la concentración de alicina en los tratamientos aplicados sobre células HT-29 de cáncer de 30 colon, la morfología celular va cambiando. Se observa como para concentraciones bajas de alicina las células no parecen afectadas, manteniendo una forma esférica, unidas en cúmulos celulares y bien adheridas al soporte empleado. En cambio, para concentraciones más altas, lo observado son células o fragmentos celulares carentes de similitud morfológica con respecto a las células control y despegadas totalmente del soporte celular. 35
Tratamientos con extractos de ajo en ensayos de RN Se realizó el análisis del efecto de los distintos extractos y combinaciones sobre la pérdida de viabilidad celular para evaluar las más efectivas. Para ello se trataron las células con 1 concentración de oxaliplatino (500 µM), 2 concentraciones de alicina (10 y 50 µg/ml), 2 5 concentraciones distintas de SAC (5 y 25 µg/ml), 4 combinaciones de extracto de ajo liofilizado + extracto de ajo negro (N5+Alic10, N5+Alic50, N25+Alic10 y N25+Alic50), combinaciones de extracto de ajo negro + oxaliplatino (N5+Oxaliplat y N25+ Oxaliplat), y de extracto de ajo liofilizado + extracto de ajo negro + oxaliplatino (N5+Alic10+Oxaliplat, N5+Alic50+Oxaliplat, N25+Alic10+Oxaliplat y N25+Alic50+Oxaliplat), y se evaluó el efecto 10 producido mediante el ensayo del RN. Las células cancerígenas supervivientes al tratamiento poseerán lisosomas funcionales que serán capaces de incorporar y fijar el colorante rojo neutro. Por tanto, a mayor color observado, mayor cantidad de células vivas. En las Figuras 6 y 7 se representa en valores 15 porcentuales la viabilidad celular observada mediante el uso de espectrofotometría, tomando como 100% de viabilidad la absorbancia obtenida en las células que no han recibido tratamiento, es decir, las células control. Al examinar estos datos, se observa cómo al aplicar tratamientos individualizados de los 20 extractos de ajo a células tumorales de cáncer de colon, se produce una afectación celular dosis-dependiente, siendo únicamente el tratamiento con ajo negro 25 µg/ml más efectivo que el oxaliplatino 500 µM. De hecho, se encuentran más afectadas las células que muestran una mayor velocidad de replicación celular, es decir, las Caco-2. A pesar de ese efecto más acentuado en las Caco-2, también para las HT-29 se produce una pérdida de 25 viabilidad celular. En las Caco-2, y respecto a la combinación de extracto de ajo liofilizado + extracto de ajo negro, ciertas combinaciones son más citotóxicas que sus componentes por separado (N5+Alic10 y N5+Alic50), y además combinación de extracto de ajo liofilizado + extracto de 30 ajo negro + oxaliplatino (N5+Ali50+Oxaliplat) incrementa aún más el efecto del oxaliplatino solo (Figura 6). En las HT-29, y respecto a la combinación de extracto de ajo liofilizado + extracto de ajo negro, se produce mayor afectación con N5+Alic50, y además la combinación de extracto de 35
ajo liofilizado + extracto de ajo negro + oxaliplatino (N5+Ali50+Oxaliplat) incrementa aún más el efecto del oxaliplatino solo (Figura 7). Tratamientos con extractos de ajo en ensayos de LDH 5 La LDH es una enzima perteneciente al citosol celular, y en el caso de detectarse en el exterior de la célula, sería un claro indicativo de lisis celular. Tanto la presencia de la LDH liberada en el medio de cultivo, como la LDH que queda en el interior de las células, pueden ser determinadas mediante cuantificación colorimétrica de un metabolito que resulta de la conversión de una sal de tetrazolio en un producto formazán de color rojo, cuya producción 10 se debe al efecto enzimático de la LDH. La cuantificación del porcentaje de LDH liberada respecto a la total puede ser utilizada como un índice de toxicidad celular, ya que si existe LDH en el exterior de la célula es porque se ha debido producir daño o rotura de la membrana celular. Esta determinación se realizó 15 mediante el ensayo de liberación de LDH del kit CytoTox 96® Assay (Promega). En la Figura 8, realizada en células HT-29, se puede observar como las combinaciones de ajo negro (N) y ajo liofilizado (alicina) incrementan sensiblemente los efectos individuales, y que la combinación de extracto de ajo liofilizado + extracto de ajo negro + oxaliplatino 20 incrementa aún más el efecto del oxaliplatino solo. Estos resultados apoyan el uso del ajo liofilizado, del ajo negro y de su combinación como opción terapéutica combinada con diferentes antineoplásicos para tratamiento de distintos procesos oncológicos. Estas combinaciones mantendrían o aumentarían el efecto citotóxico 25 deseable sobre las células tumorales, permitiendo reducir la dosis de antineoplásico de uso habitual en la clínica y, teóricamente, disminuyendo los efectos secundarios adversos de la aplicación de dichos antineoplásicos a sus concentraciones estándar. Ejemplo 5. Uso tópico o sistémico de extracto de ajo liofilizado y extracto de ajo negro 30 en cicatrización Modelo murino de cicatrización con heridas por pérdida de sustancia
Los animales de experimentación que se emplearon son ratones Skh1 (Charles River Laboratories©), desnudos, albinos, microbiológicamente convencionales (no SPF), eutímicos e inmunocompetentes. Se realizaron dos biopsias circulares de 5 mm de diámetro en sendos flancos de cada ratón 5 de cada uno de los grupos de tratamiento por el mismo experimentador y de forma consecutiva (para no tener variaciones entre distintos operarios o variaciones en la técnica de un mismo operario en momentos distintos de un día). La biopsia eliminó piel completa hasta el nivel de la fascia muscular, que debe dejarse intacta para evitar hematomas. De este modo, cada animal presentó dos heridas de igual diámetro, realizadas al mismo tiempo 10 y localizadas en la misma situación anatómica de la piel del dorso. No se utilizaron antibióticos tópicos ni otros productos tópicos o sistémicos que interfiriesen en la cicatrización de cada individuo excepto la solución con extracto de ajo a distintas concentraciones (según el grupo de tratamiento) y el vehículo en la herida-control. 15 ● Estudios histopatológicos Se recolectaron muestras histológicas procedentes de cada herida quirúrgica y 0,5 cm alrededor de la cicatriz, realizando 3 cortes longitudinales y paralelos en la muestra: 1) en el centro de la cicatriz; 20 2) en la proximidad del borde de la cicatriz; y 3) en la piel situada en el 0,5 cm de margen alrededor de la cicatriz. Tras dividir la biopsia en estas tres partes y orientar los cortes debidamente en el microtomo, se realizaron las siguientes tinciones histológicas: 25 1) Hematoxilina-eosina 2) Tricrómico de Masson 3) Tinción de orceína acética Determinación de la concentración terapéutica del extracto liofilizado de ajo por vía tópica 30 Se desarrolló un estudio con 8 ratones macho Skh1 de >1 año edad, en los que se llevó a cabo el protocolo de cicatrización comentado con anterioridad y se los separó en 3 grupos de 2 animales cada uno: 1) extracto de ajo liofilizado a concentración de 50 µg/mL; 2) extracto de ajo liofilizado a concentración de 10 µg/mL; 3) extracto de ajo liofilizado a 35 concentración de 1 µg/mL; y 4) grupo control. En cada animal de un mismo grupo, la herida
quirúrgica del lado derecho es la zona de tratamiento, mientras que la herida contralateral actúa como control (se aplica el vehículo). De este modo, cada animal actúa como individuo de tratamiento y su propio control dentro de cada uno de los tres grupos de tratamiento, pudiendo compararlos con el grupo control, en el que ambas heridas son tratadas con vehículo. 5 Durante el seguimiento del experimento (2 semanas), desde la realización de las heridas quirúrgicas hasta observar su cierre en todos los animales del experimento, el grupo tratado con extracto de ajo liofilizado a concentración 50 µg/mL mostró un cierre más rápido que el grupo tratado con extracto de ajo a concentración 10 µg/mL y ambos grupos presentaron 10 mejores resultados en cuanto a velocidad de cierre de la herida que el grupo tratado a concentración 1 µg/mL y las heridas del grupo control (de hecho, no existían diferencias entre el grupo tratado con concentración 1 µg/mL y el grupo control). Esta respuesta procicatrizante fue objetivada a las 24 horas de tratamiento (Figura 9). Por tanto, se observó un efecto dosis-dependiente, que es claro para los grupos tratados con concentraciones de 15 50 y 10 µg/mL (lado derecho) respecto al grupo tratado con 1 µg/mL. En el grupo tratado con extracto de ajo liofilizado a concentración 1 µg/mL, no se observaron diferencias en la herida tratada (lado derecho) respecto de la herida contralateral (lado izquierdo), que mostró una evolución tórpida hacia el cierre por segunda intención durante los 14 días del experimento. Sin embargo, los animales de los grupos de tratamiento con extracto de ajo a 20 concentraciones 50 y 10 µg/mL presentaron mayor respuesta clínica en la herida tratada (lado derecho), que en la contralateral tratada únicamente con vehículo (Figura 10). No obstante, todos los individuos de los grupos de tratamiento con extracto de ajo a concentración 50 y 10 µg/mL también presentaron una buena respuesta en la herida del lado izquierdo, lo que demuestra un efecto sistémico de la aplicación tópica sobre la herida 25 cutánea del lado derecho del extracto de ajo liofilizado a estas concentraciones (Figuras 10 y 11). ● Estudios histopatológicos Las tinciones histológicas mostraron un aumento en el grosor epidérmico (acantosis) y 30 mayor número de fibroblastos dérmicos en las heridas del grupo tratado con extracto de ajo liofilizado a concentración 50 µg/mL respecto del grupo control tratado con vehículo (Figura 12). El efecto sistémico del uso tópico de la concentración de 50 µg/mL se manifestó a nivel histológico, observándose una reducción de la cicatriz del flanco tratado con vehículo en los animales de grupo tratado con extracto de ajo liofilizado 50 µg/mL en el flanco derecho 35 (Figura 13). También fue destacable el aumento en la producción de colágeno en la dermis,
que estaba bien organizado en haces densos respecto a lo que ocurre en el grupo control (Figura 14). Respuesta al uso tópico de extracto de ajo liofilizado en el modelo murino de cicatrización 5 Se desarrolló un estudio con 10 ratones macho Skh1 de 8 semanas de edad, en los que se llevó a cabo el protocolo de cicatrización comentado con anterioridad y se los separó en 2 grupos de 5 animales cada uno: 1) extracto de ajo liofilizado a concentración de 50 µg/mL; 2) grupo control tratado con el vehículo de disolución del extracto de ajo liofilizado. 10 Durante el seguimiento del experimento (2 semanas), desde la realización de las heridas quirúrgicas hasta observar el cierre en los primeros animales (2 semanas), el grupo tratado con extracto de ajo liofilizado a concentración 50 µg/mL mostró un cierre más rápido que el grupo control. Esta respuesta procicatrizante fue objetivada midiendo los diámetros mayor y menor de cada herida en proceso de cicatrización para calcular el área de herida (Figura 15 15). También se evidenció a través de la secuencia de fotografías dermatoscópicas tomadas a intervalos de 2 días (Figura 16). ● Estudios histopatológicos Las tinciones histológicas mostraron mayor número de fibroblastos dérmicos en las heridas 20 del grupo tratado con extracto de ajo liofilizado a concentración 50 µg/mL respecto del grupo control tratado con vehículo (Figura 17). También fue destacable el aumento en la producción de colágeno en la dermis, que estaba bien organizado en haces densos respecto a lo que ocurre en el grupo control (Figura 17). 25 Respuesta al uso tópico de extracto de ajo negro en el modelo murino de cicatrización Se desarrolló un estudio con 9 ratones macho Skh1 de 8 semanas de edad, en los que se llevó a cabo el protocolo de cicatrización comentado con anterioridad y se los separó en 2 grupos de 5 y 4 animales cada uno: 1) extracto de ajo negro a concentración de 10 µg/mL (n 30 = 5); 2) grupo control tratado con el vehículo de disolución del extracto de ajo liofilizado (n = 4). Durante el seguimiento del experimento (2 semanas), desde la realización de las heridas quirúrgicas hasta observar el cierre en los primeros animales (2 semanas), el grupo tratado 35 con extracto de ajo negro a concentración 10 µg/mL mostró un cierre más rápido que el
grupo control. Esta respuesta procicatrizante fue objetivada midiendo los diámetros mayor y menor de cada herida en proceso de cicatrización para calcular el área de herida (Figura 18). También se evidenció mediante la secuencia de fotografías dermatoscópicas tomadas a intervalos de 2 días (Figura 19). 5 ● Estudios histopatológicos Las tinciones histológicas mostraron mayor número de fibroblastos dérmicos en las heridas del grupo tratado con extracto de ajo negro a concentración 10 µg/mL respecto del grupo control tratado con vehículo (Figura 20). También fue destacable el aumento en la producción de colágeno en la dermis, que estaba bien organizado en haces densos respecto 10 a lo que ocurre en el grupo control (Figura 20). Modelo in vitro (wound healing) en cultivos de queratinocitos y fibroblastos dérmicos humanos 15 En cultivos de queratinocitos (HaCaT), se desarrolló un modelo de wound healing para medir su proliferación y migración en respuesta al extracto liofilizado de Allium sativum, el extracto de ajo negro, y la combinación de ambos extractos. También se estudió respecto a sus efectos in vitro en la proliferación de fibroblastos humanos dérmicos (CRL-2072). 20 Los resultados para el extracto de ajo liofilizado en el modelo in vitro de wound healing mostraron un aumento en la migración y proliferación de queratinocitos humanos y en la proliferación de fibroblastos humanos dérmicos (Figura 21). También se evidenció aumento en la proliferación de queratinocitos y fibroblastos dérmicos 25 humanos en los estudios de proliferación con la técnica de cristal violeta (Figura 22). Finalmente, la combinación de ambos extractos de Allium sativum, ajo liofilizado y ajo negro, en distintas concentraciones, especialmente, 1:5 (ajo liofilizado/ajo negro), mostraba un aumento en la proliferación tanto de queratinocitos humanos como de fibroblastos dérmicos 30 humanos (Figura 23).