ES2674583T3 - Regulación de genes de toxina y antitoxina para el confinamiento biológico - Google Patents

Abstract

Método para prevenir la propagación involuntaria de un microorganismo, en el que el método comprende cultivar un microorganismo recombinante manipulado genéticamente para que comprenda dos o más genes exógenos de toxina de tipo II, codificando cada gen una toxina de tipo II diferente y encontrándose cada uno operablemente ligado a un promotor regulable al que cada gen de toxina de tipo II no se encuentra naturalmente ligado, en el que dos o más genes de toxina de tipo II codifican, cada uno, una endorribonucleasa, y en el que la secuencia de los dos o más genes de toxina de tipo II han sido modificados, cada uno, para eliminar por lo menos un sitio diana de la endorribonucleasa codificada en el ARN transcrito de toxina de tipo II y en el que el promotor regulable está regulado por uno o más de luz, temperatura, pH o presencia o ausencia de uno o más nutrientes o compuestos en el mdio de cultivo o entorno del microorganismo.

Description

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DESCRIPCION

Regulación de genes de toxina y antitoxina para el confinamiento biológico Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de patente estadounidense n° 61/503.306, presentada el 30 de junio de 2011, titulada "Regulation of Toxin and Antitoxin Genes for Biological Containment".

Referencia a listado de secuencias

La presente solicitud contiene referencias a secuencias de aminoácidos y/o secuencias de ácidos nucleicos que han sido presentadas concurrentemente con la presente memoria como el listado de secuencias en archivo de texto "60977590_1.txt", tamaño del archivo: 76 KiloBytes (KB), creado el 27 de junio de 2012.

Campo técnico

La presente invención se refiere a la regulación génica de la expresión de una toxina y/o antitoxina en un microorganismo, en particular para la prevención de la propagación involuntaria o incontrolada de los microorganismos. Asimismo, la presente invención se refiere a métodos de control del crecimiento y/o supervivencia de un microorganismo, tal como un alga procariótica o eucariótica manipulada genéticamente.

Antecedentes

Los microorganismos modificados genéticamente han atraído mucha atención recientemente como fábricas biológicas para la producción de alimentos, cmpuestos bioactivos y biocombustibles. Sin embargo, la propagación de microorganismos modificados genéticamente fuera del sitio de cultivo deseado a los ecosistemas naturales es una importante preocupación normativa. Algunas estrategias de confinamiento biológico pueden resultar en microorganismos modificados genéticamente que se autodestruyen mediante la expresión de genes heterólogos codificantes de proteínas letales. Varias toxinas bacterianas han sido consideradas buenas candidatas para la utilización en sistemas de confinamiento bacteriano, entre ellas proteínas desestabilizadoras de la membrana o proteínas formadoras de poros y enzimas que atacan el material genético de la célula. Sin embargo, en muchos casos la mutación de los genes de toxina introducidos en los microorganismos resulta en una eficacia reducida de los genes de toxina durante el tiempo.

Los sistemas de toxina-antitoxina de tipo II son comunes entre los procariotas (Van Melderen y De Bast, PLoS Genetics 5:e1000437, 2009; Marakova et al., Biology Direct 4:19, 2009). Dichos genes de toxina típicamente codifican proteínas que interfieren con la transcripción (p.ej. mediante la inhibición de la ADN girasa) o la traducción mediante la interferencia con la función ribosómica o mediante la degradación de los transcritos de ARN. Las toxinas con actividad endorribonucleolítica en ocasiones se denominan "ARN interferasas" y entre ellas se nicluyen, por ejemplo, las toxinas bacterianas MazF, pemK, RelE, HicB, HipA, Doc, VapC, yafQ, yhaV y tasB, entre otras. La expresión de los genes de toxina se encuentra estrechamente controlada por los genes antitoxina que residen en un operón con el gen de toxina. Típicamente, la antitoxina es el primer gen del transcrito y se solapa con el gen de toxina en 1 a 10 nucleótidos, permitiendo que la antitoxina se traduzca más eficientemente que la toxina. La antitoxina forma un complejo estable con la toxina, resultando en la inactivación de la toxina. El complejo de antitoxina-toxina también se une al promotor del sistema toxina-antitoxina (STA), reprimiendo la transcripción. De esta manera, bajo circunstancias normales, la expresión del STA se encuentra parada: la antitoxina, que se produce en mayor abundancia, se une e inactiva la toxina y evita la transcripción ulterior del operón de la toxina. Sin embargo, la proteína antitoxina es lábil cuando no se encuentra asociada a la toxina y si el sistema se desequilibra, por ejemplo mediante una producción incrementada de la antitoxina, la toxina puede persistir en la célula sin la antitoxina, en donde su actividad endorribonucleolítica (en los casos en que la toxina es una "ARN interferasa") podrá detener la traducción.

Los complejos mecanismos utilizados para limitar la expresión de la toxina en los sistemas endógenos (ver, por ejemplo, Diago Navarro et al., FEBS J. 277: 3097-3117, 2009, para una revisión completa o la regulación de STA parDE) subraya la importancia de controlar estrechamente la expresión de un gen de toxina exógeno introducido en la célula. La presión selectiva para mutar la toxina a una forma inactiva ha limitado el potencial de los genes de toxina en la biocontención. Además, en los últimos años varios grupos han propuesto que el STA nativo podría servir para promocionar la citostasis y no el crecimiento celular bajo condiciones limitantes del crecimiento y que en muchos casos por lo menos una parte de una población en la que se encuentra activada una toxina se recupera posteriormente (ver, por ejemplo, Cataudella et al., Nucl. Acids Res., 2012). La capacidad de las células de sobrevivir a la expresión de una toxina activa también se observa al expresarse genes exógenos en los sistemas heterólogos (p.ej. Kristofferesen et al., Appl. Environ. Microbiol. 66: 5524-5526, 2000), planteando dudas también sobre la practicidad de utilizar los STA de tipo II en las estrategias de biocontención.

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Los microorganismos realizan diversos ajustes metabólicos en respuesta al agotamiento de los nutrientes, incluyendo, por ejemplo, respuestas transcripcionales que permiten una mayor incorporación a partir de fuentes externas de nutrientes, así como del secuestro de fuentes internas. Muchas de las respuestas al estrés alimentario se basan en la regulación transcripcional de transportadores, enzimas, proteínas de la maquinaria de traducción, etc.

Los microorganismos fotosintéticos que se basan en la luz para la energía química y la fijación del carbono suponen retos adicionales en el aspecto de que el aparato fotosintético debe ajustarse para evitar excesivos daños lumínicos en la célula en el caso de que no resulte posible mantener un transporte de electrones fotosintético o la fijación de carbono en niveles óptimos. La incapacidad de ajustar la recolección de luz y la función de los fotosistemas puede conducir a daños permanentes en estos sistemas. No resulta inesperado el hallazgo de muchos estudios de que las alteraciones del aparato fotosintético son cambios observados en la respuesta transcripcional a la limitación de nitrógeno (Miller et al., Plant Physiol. 154: 1737-1752, 2010), fosfato (Yehudai-Resheff et al., The Plant Cell 19: 1023-1038, 2007; Wurch et al., Environ Microbiol 13: 468-481, 2011), azufre (Moseley et al., Genetics 181: 889-905, 2009), hierro (Merchant et al., Biochim. Bioophys. Acta 1763: 578-594, 2006), cobre (Castruita et al., The Plant Cell 23: 1273-1292, 2011) y CO2 (Wang et al., Phototsynth Res 109: 115-122, 2001) en microalgas y han enconrado que la incapacidad de ajustarse a la limitación de nutrientes resulta en la muerta de los cultivos microalgales (Moseley et al., Eukaryot. Cells 5: 26-44, 2006).

La solicitud de patente n° US 2009/124012 da a conocer la expresión heteróloga de toxinas y endotoxinas en las células huésped utilizando promotores heterólogos constitutivos o inducibles; las proteínas heterólogas que han sido modificadas para eliminar secuencias que son cortables por la ARNm interferasa y entre las toxinas utilizadas en dicha solicitud se incluyen MazF, ChpBK, PemK, YdcE; entre las antitoxinas se incluyen MazE, ChpB, PemI, YdcD; en dicha solicitud, entre los ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar a la transcripción por promotores inducibles se incluyen condiciones anaeróbicas, temperaturas elevadas, sequía o la presencia de luz. La tesina de máster de Ye Sen, titulada "The Research on the Chromosomal Toxin-antitoxin Genes ssr1114/slr0664 and ssl2920/ssl2921 of Synechocystis sp. PCC6803", en
www.cnki.net, publicada el 8 de junio de 2010, da a conocer sistemas de toxina-antitoxina (TA) de Synechocystis sp. PCC 6803; slr0664 o ssl2921 y ssr1114/slr0664 o slr2920/ssl2921 se expresaron utilizando el promotor PpetE, que es inducible por cobre. También se realizó la expresión en E. coli utilizando promotores sensibles a IPTG y arabinosa. Se identificó posteriormente la misma toxina/antitoxina como relE/relB. El documento n° WO 2004/113498 da a conocer usos de las ARN interferasas (toxinas) y sus antitoxinas y usos de los mismos; en algunos casos, los inhibidores de las toxinas pueden ser secuencias antisentido o aRn catalíticos capaces de interferir con la expresión de un inhibidor endógeno de una ARNm interferasa (p.ej. MazE o PemI) o un ortólogo del mismo. La solicitud de patente n° US 2010/035346 da a conocer un vector que comprende un promotor y un gen de toxina de tipo II, MazF, que ha sido modificado para eliminar las secuencias de reconocimiento de interferasa. La solicitud de patente n° US 2008/206840 da a conocer métodos para la contención biológica de microorganismos, denominados sistemas suicidas, utilizando genes de toxina, tales como RelE, CcgB, PemK, ParE y Doc; estos pueden aplicarse a bacterias, tales como E. coli, Pseudomonas, incluso especies de Synechosystis (cianobacteria); se da a conocer además la utilización de las antitoxinas. En la presente solicitud, resulta posible seleccionar un promotor regulable, tal como regulado por la ausencia o la presencia de compuestos.

Descripción resumida de la invención

En algunos aspectos, la invención se refiere a un microorganismo procariótico o eucariótico recombinante que incluye por lo menos una molécula de ácidos nucleicos exógena codificante de una toxina de tipo II, en la que la secuencia de ácidos nucleicos codificante de la toxina de tipo II se liga operablemente a un promotor heterólogo. El microorganismo recombinante puede ser, por ejemplo, una especie bacteriana, arqueobacteriana, cianobacteriana, fúngica, heteroconta o algal. El microorganismo procariótico o eucariótico recombinante puede ser un microorganismo fotosintético, tal como una cianobacteria, por ejemplo, una especie de Acaryochloris, Agmenellum, Anabaena, Anabaenopsis, Anacystis, Aphanizomenon, Arthrospira, Asterocapsa, Borzia, Calothrix, Chamaesiphon, Chlorogloeopsis, Chroococcidiopsis, Chroococcus, Crinalium, Cyanobacterium, Cyanobium, Cyanocystis, Cyanospira, Cyanothece, Cylindrospermopsis, Cylindrospermum, Dactylococcopsis, Dermocarpella, Fischerella, Fremyella, Geitleria, Geitlerinema, Gloeobacter, Gloeocapsa, Gloeothece, Halospirulina, Iyengariella, Leptolyngbya, Limnothrix, Lyngbya, Microcoleus, Microcystis, Myxosarcina, Nodularia, Nostoc, Nostochopsis, Oscillatoria, Phormidium, Planktothrix, Pleurocapsa, Prochlorococcus, Prochloron, Prochlorothrix, Pseudanabaena, Rivularia, Schizothrix, Scytonema, Spirulina, Stanieria, Starria, Stigonema, Symploca, Synechococcus, Synechocystis, Thermosynechocystis, Tolypothrix, Trichodesmium, Tychonema o Xenococcus. Alternativamente, el microorganismo puede ser una microalga eucariótica, por ejemplo una especie de Achnanthes, Amphiprora, Amphora, Ankistrodesmus, Asteromonas, Boekelovia, Borodinella, Botryococcus, Bracteococcus, Chaetoceros, Carteria, Chlamydomonas, Chlorococcum, Chlorogonium, Chlorella, Chroomonas, Chrysosphaera, Cricosphaera, Crypthecodinium, Cryptomonas, Cyclotella, Dunaliella, Ellipsoidon, Emiliania, Eremosphaera, Ernodesmius, Euglena, Franceia, Fragilaria, Gloeothamnion, Haematococcus, Halocafeteria, Hymenomonas, Isochrysis, Lepocinclis, Micractinium, Monoraphidium, Nannochloris, Nannochloropsis, Navicula, Neochloris, Nephrochloris, Nephroselmis, Nitzschia, Ochromonas, Oedogonium, Oocystis, Ostreococcus, Pavlova, Parachlorella, Pascheria, Phaeodactylum, Phagus, Picochlorum, Platymonas, Pleurochrysis, Pleurococcus, Prototheca, Pseudochlorella, Pseudoneochloris,

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Pyramimonas, Pyrobotrys, Scenedesmus, Schizochiamydella, Skeletonema, Spyrogyra, Stichococcus, Tetrachorella, Tetraselmis, Thalassiosira, Viridiella o Volvox.

El gen de toxina de tipo II puede derivar de una especie eubacteriana o arqueobacteriana, y opcionalmente puede derivarse de una especie cianobacteriana, por ejemplo cualquiera de las especies cianobacterianas anteriormente indicadas y puede ser homóloga o heteróloga respecto al huésped procariótico recombinante. La toxina, en algunas realizaciones adicionales, puede ser una endorribonucleasas que corta secuencias de ARN específicas. En algunas realizaciones adicionales, la secuencia de nucleótidos del gen de toxina puede diseñarse para excluir secuencias de reconocimiento de endonucleasa que convierten al ARN codificado en susceptible de corte por la toxina.

El gen de toxina exógeno puede codificar, en algunas realizaciones alternativas, una toxina de la familia de la toxina CcdB, la familia de la toxina RelE, la familia de la toxina MazF, la familia de la toxina ParE, la familia de la toxina PIN, la familia de la toxina AhaI, la familia de la toxina MNT, la familia de la toxina Doc, la familia de la toxina VapC, la familia de la toxina zeta, la familia de la toxina HipA o la familia de la toxina HigB. Por ejemplo, la toxina de tipo II puede ser una toxina CcdB, RelE, MazF, ParE, pIn, AhaI, MNT, Doc, VapC, zeta, HipA, HigB, ChpI, StbE, Txe, YafQ, o YoeB, o un ortólogo u homólogo de cualquiera de dichas toxinas, u otras toxinas de tipo II.

El promotor heterólogo operablemente ligado al gen de toxina en realizaciones preferentes puede ser un promotor regulable y puede ser un promotor reglado por un compuesto que puede encontrarse presente en el cultivo celular o medio celular, tal como, a modo de ejemplos no limitativos, un azúcar, un ácido orgánico, un ácido graso, un aminoácido o análogo de aminoácido, un lípido, un hidrocarburo, fosfato, nitrato, amonio, un metal, un compuesto de 'percepción de quorum', una lactona, una vitamina, una proteína o péptido secretado, o cualquier combinación de los mismos. En algunos ejemplos, el promotor regula la expresión en un microorganismo procariótico y se selecciona de entre el grupo que consiste en un promotor rha, un promotor inducible por arabinosa (p.ej. un promotor inducible por L-arabinosa, o un promotor ara o "BAD"), un promotor inducible por IpTG (isopropil-p-D-tiogalactopiranósido) (p.ej. un promotor lac, tac, trc, trcE o trcY), un promotor trp, un promotor glnA, un promotor cys, un promotor secA, un promotor psbA, un promotor nar, un promotor ntc, un promotor nir, un promotor nr, un promotor pho, un promotor pst, un promotor nrs, un promotor tet, un promotor de metalotioneína, un promotor ftf, un promotor de choque térmico, un promotor inducible por frío, un promotor inducible por luz, un promotor vírico, un promotor hin, un promotor cin, un promotor gin y un promotor fimA.

En diversos ejemplos, el gen de toxina puede regularse mediante un promotor inducido por limitación de nutrientes. Por ejemplo, el promotor que regula la expresión del gen de toxina en un microorganismo procariótico puede ser un promotor que sea sensible al agotamiento de nutrientes, tal como, por ejemplo, un promotor regulado positivamente por carencia de nitrógeno, tal como, por ejemplo, un promotor nr, nar (nitrato reductasa), nir (nitrito reductasa), ntc, ntr o gln, o un promotor regulado positivamente por carencia de fosfato, tal como, por ejemplo, un promotor pho o pst. Además, el microorganismo manipulado puede incluir además un gen codificante de una antitoxina análoga en la que el gen de antitoxina se encuentra regulado por un promotor que no resulta inducido por la limitación de nutrientes que regula la toxina. En ejemplos en que el microorganismo manipulado es un microorganismo eucariótico, el promotor operablemente ligado a un gen de toxina endógeno puede ser un promotor que es funcional en una célula eucariótica y puede ser, por ejemplo, un promotor que responde al agotamiento de un nutriente, por ejemplo nitrato, fosfato, azufre, cobre, hierro o CO2. En algunos ejemplos, el promotor de toxina comprende por lo menos una parte de SEC ID n° 56, SEC ID n° 57, SEC ID n° 58, SEC ID n° 59, SEC ID n° 60 o SEC ID n° 65. En diversos ejemplos en los que el gen de toxina se encuentra regulado por un promotor inducido por limitación de nutrientes, el microorganismo manipulado incluye además un gen codificante de una antitoxina análoga en la que el gen de antitoxina se encuentra regulado por un promotor que no resulta inducido por la limitación de nutriente que regula la toxina. Por ejemplo, el gen de antitoxina puede encontrarse regulado por como mínimo una parte de la SEC ID n° 62, SEC ID n° 63 o SEC ID n° 64.

Alternativamente, el promotor que regula un gen de toxina transformado en un microorganismo huésped puede ser un promotor sintético, por ejemplo un promotor que incluye una secuencia que puede resultar reconocida y unirse a un factor de transcripción, que puede ser, por ejemlo, un factor de transcripción manipulado, en el que la secuencia se sitúa cadena arriba de un promotor mínimo que es operable en el microorganismo huésped.

La invención se refiere además a microorganismos manipulados para la biocontención que incluyen una o más moléculas o secuencias de ácidos nucleicos exógenas codificantes de dos o más toxinas de tipo II, por ejemplo el microorganismo manipulado puede incluir dos o más genes exógenos en que dos o más genes codifican diferentes toxinas de tipo II. Dos o más secuencias de ácidos nucleicos codificantes de toxina pueden encontrarse en las mismas o en diferentes moléculas de ácidos nucleicos. Los dos o más genes de toxina pueden ligarse operablemente de manera independiente a copias del mismo promotor heterólogo o pueden ligarse operablemente a diferentes promotores heterólogos. Opcionalmente, en realizaciones en las que el microorganismo recombinante incluye dos o más genes de toxina exógenos diferentes, puede optimizarse la secuencia de uno o ambos genes de toxina exógenos para que resulten resistentes a una actividad de ARN endonucleasa de uno, dos o más de dos de las toxinas codificadas por los dos o más genes de toxina exógenos diferentes.

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En algunos ejemplos en que el microorganismo recombinante es un microorganismo procariótico, el microorganismo procariótico que incluye una molécula de ácidos nucleicos exógena codificante de una toxina de tipo II puede incluir además un gen endógeno codificante de una antitoxina que inactiva la toxina de tipo II codificada por el gen exógeno, es decir, una antitoxina "análoga de" la toxina codificada por el gen exógeno. Alternativamente, un microorganismo procariótico recombinante que incluye un gen de toxina exógeno puede no incluir un gen de antitoxina endógeno análogo al gen de toxina. Alternativamente o adicionalmente a cualquiera de dichas exposiciones, el microorganismo procariótico recombinante que incluye una molécula de ácidos nucleicos exógeno codificante de una toxina de tipo II puede incluir además una molécula de ácidos nucleicos exógeno codificante de una antitoxina análoga. En realizaciones en las que la cianobacteria recombinante incluye una secuencia de ácidos nucleicos exógena codificante de una antitoxina, la secuencia codificante de antitoxina puede encontrarse, en realizaciones alternativas, en la misma molécula de ácidos nucleicos exógena que codifica la toxina de tipo II, o puede encontrarse en una molécula de ácidos nucleicos exógena diferente. En cualquiera de dichas exposiciones, el microorganismo procariótico puede ser un microorganismo fotosintético y puede ser, por ejemplo, una cianobacteria.

En cualquiera de dichas exposiciones, el promotor heterólogo que regula el gen de toxina puede ser un promotor regulado por la escasez de un nutriente, por ejemplo por el agotamiento de nitrógeno, fósforo, azufre, CO2, hierro, cobre, etc. en el medio de crecimiento.

Un huésped procariótico que incluye dos o más genes exógenos codificantes de toxinas puede incluir opcionalmente además uno, dos o más genes de antitoxina endógenos análogos de una, dos o más de las toxinas. Alternativamente o adicionalmente, un huésped procariótico que incluye dos o más genes exógenos codificantes de toxinas puede incluir opcionalmente además por lo menos un gen de antitoxina exógeno análogo de una, dos o más de las toxinas.

La presente invención se refiere además a un método de control del crecimiento y/o supervivencia de un microorganismo, tal como una cianobacteria, en el que el método comprende las etapas de introducir una molécula de ácidos nucleicos exógena codificante de una toxina de tipo II en un microorganismo procariótico, en el que el gen de toxina exógeno se encuentra operablemente ligado a un promotor heterólogo, en el que la expresión del gen de toxina induce la muerte celular o perjudica el crecimiento o viabilidad del microorganismo. Opcionalmente, aunque preferentemente, el promotor heterólogo operablemente ligado al gen de toxina de tipo II puede encontrarse regulado por la presencia o ausencia de un nutriente o compuesto que puede encontrarse presente en el cultivo celular o medio celular, o por una condición ambiental, tal como, por ejemplo, la salinidad, el pH, la temperatura o la intensidad de la luz. La expresión del gen de toxina de tipo II regulado por un promotor heterólogo inhibe el crecimiento o perjudica la viabilidad de las células. En algunas exposiciones preferentes, el microorganismo puede ser un microorganismo fotosintético y la expresión del gen de toxina regulado por un promotor heterólogo puede inducir clorosis y/o perjudicar la fotosíntesis.

En algunos ejemplos, el microorganismo puede incluir un gen endógeno codificante de una antitoxina análoga de la toxina codificada por la molécula de ácidos nucleicos exógena. El gen de antitoxina exógeno puede encontrarse ligado operablemente a un promotor heterólogo, preferentemente un promotor regulable, tal como, por ejemplo, un promotor inducible o un promotor reprimible. El promotor heterólogo operablemente ligado al gen de antitoxina exógeno puede activar la transcripción durante las condiciones permisivas de crecimiento, por ejemplo bajo condiciones de confinamiento del crecimiento y/o producción. Además, en dichas exposiciones, el gen de antitoxina endógeno del STA endógeno del microorganismo huésped puede resultar inactivado y/o atenuado. Por ejemplo, en algunos ejemplos ilustrativos, el microorganismo huésped incluye un STA pemI/pemK, en el que el microorganismo huésped se manipula para que incluya un gen exógeno codificante de la antitoxina pemI operablemente ligado a un promotor heterólogo regulable y el gen PemI endógeno resulta inactivado, por ejemplo, por recombinación homóloga. En algunos ejemplos ilustrativos adicionales, el microorganismo huésped incluye un STA axe/txe, en el que el microorganismo huésped se ha manipulado para que incluya un gen exógeno codificante de la antitoxina axe operablemente ligado a un promotor heterólogo regulable y el gen axe endógeno resulta inactivado, por ejemplo, por recombinación homóloga. En ejemplos ilustrativos todavía adicionales, el microorganismo huésped incluye un STA phd/doc, en el que el microorganismo huésped se ha manipulado para que incluya un gen exógeno codificante de la antitoxina phd operablemente ligado a un promotor heterólogo regulable y el gen phd endógeno resulta inactivado, por ejemplo, por recombinación homóloga. Entre los ejemplos adicionales pueden incluirse, a modo de ejemplos no limitativos, sTa mazE/mazF, un STA hicB/hicA, un STA vapB/vapC o cualquier otro STA, en el que el gen de antitoxina (p.ej. mazE, hicB, vapB u otro gen de antitoxina) se introduce en la célula en ligamiento operable con un promotor heterólogo y el gen de antitoxina endógeno (p.ej. mazE, pemI, hicB, vapB, dinJ u otro gen de antitoxina) se desactiva o de otro modo se inactiva, por ejemplo mediante recombinación homóloga que introduce una inserción o mutación inactivadora. En algunas exposiciones, el gen de antitoxina exógeno descrito en la presente memoria puede incluir, aunque sin limitación, un gen de antitoxina codificante de una antitoxina de la familia de la antitoxina CcdA, de la familia de la antitoxina RelB, de la familia de la antitoxina MazE, de la familia de la antitoxina ParD, de la familia de la antitoxina PIN, de la familia de la antitoxina MNT, de la familia de la antitoxina Phd, de la familia de la antitoxina VapB, de la familia de la antitoxina zeta y/o de la familia de la antitoxina HipB. Adicional o alternativamente, el gen de antitoxina puede seleccionarse de entre el grupo que consiste en homólogos cianobacterianos de axe, phd, mazE, hicB, vapB, pemI, relB, parD, kisS, ccdA, yafN, stbD, yoEm, dinJ, PIN y

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combinaciones de los mismos. El gen de antitoxina exógeno puede ser homólogo o heterólogo respecto al microorganismo huésped.

En exposiciones adicionales, un microorganismo procariótico huésped recombinante puede incluir dos o más STA endógenos y puede incluir dos o más genes de antitoxina exógenos ligados operablemente a promotores heterólogos, en los que el microorganismo huésped contiene genes de antitoxina endógena correspondientes a los genes de antitoxina endógenos inactivados correspondientes a los genes de antitoxina introducidos que pueden encontrarse regulados mediante inducción, represión o desrepresión de promotores heterólogos operablemente ligados. Los promotores heterólogos operablemente ligados a dos genes de antitoxina diferentes pueden ser copias diferentes del mismo promotor o pueden ser promotores diferentes. En algunas exposiciones, por ejemplo, dos o más promotores operablemente ligados a dos o más genes de antitoxina pueden estar regulados por diferentes compuestos o condiciones ambientales.

En algunas exposiciones preferentes, el promotor heterólogo que regula la expresión del gen de antitoxina exógeno se encuentra activo en presencia de un compuesto que puede proporcionarse en el medio de crecimiento que no se encuentra presente típicamente en el medio externo en cantidad suficiente para activar el promotor, o se encuentre reprimido o inactivo bajo determinadas condiciones ambientales que pueden producirse al escapar el organismo de condiciones controladas (por ejemplo, un intervalo o umbral de disponibilidad o concentración de nutrientes, intensidad lumínica, salinidad, pH o temperatura).

La presente invención se refiere además a un método de control del crecimiento y/o supervivencia de un microorganismo procariótico, tal como una cianobacteria, en el que el método comprende las etapas de introducir una molécula de ácidos nucleicos exógena codificante de una antitoxina en un microorganismo huésped procariótico, en el que el gen de antitoxina exógeno se encuentra operablemente ligado a un promotor heterólogo, y el microorganismo huésped procariótico incluye un STA endógeno que incluye un gen codificante de una toxina que es análoga a la antitoxina codificada por el gen introducido. El método incluye además inactivar el gen de antitoxina del STA endógeno. El gen de antitoxina exógeno se expresa reguladamente bajo condiciones en las que se desea el crecimiento del microorganismo huésped, por ejemplo mediante una molécula de nutriente o regulador incluida en el medio de cultivo, o mediante una condición ambiental, tal como, por ejemplo, la salinidad, el pH, la temperatura o la intensidad de la luz. Preferentemente, en el caso de que el microorganismo huésped se encuentre fuera del lugar de crecimiento confinado, la molécula de nutriente o regulador ya no se encuentra disponible o las condiciones ambientales se encuentran alteradas de manera que el gen de antitoxina exógeno regulado por un promotor heterólogo ya no se expresa y el crecimiento o viabilidad de las células resulta perjudicado. En algunas realizaciones, el huésped procariótico puede ser una cianobacteria y la expresión reducida del gen de antitoxina regulado por un promotor heterólogo puede perjudicar la fotosíntesis y/o puede resultar en clorosis.

En un aspecto adicional, se da a conocer en la presente memoria un microorganismo procariótico que comprende un STA endógeno en el que ha sido insertado un promotor heterólogo cadena arriba del operón antitoxina-toxina del STA. Por ejemplo, el promotor heterólogo puede sustituirse el promotor endógeno del operón antitoxina-toxina. Sin limitación de la invención a ningún mecanismo particular, la sustitución del promotor endógeno del operón antitoxina- toxina puede alterar la regulación de la transcripción del operón antitoxina-toxina de ser reprimible por un complejo proteico de antitoxina-toxina a encontrarse regulado por factores que regulan el promotor heterólogo. Por ejemplo, un compuesto presente en el medio de crecimiento o medio externo, temperatura, intensidad de la luz, etc. que induce (o desreprime) la transcripción a partir del promotor heterólogo puede resultar de esta manera en la transcripción y traducción de una toxina estable que puede conducir a un crecimiento o viabilidad deficientes de la célula huésped.

Se refieren adicionalmente a la invención microorganismos procarióticos, tales como cianobacterias, que incluyen dos o más STA endógenos en los que un promotor heterólogo ha sido insertado cadena arriba del operón antitoxina- toxina de por lo menos dos de los dos o más STA endógenos. Los promotores heterólogos operablemente ligados a dos operones antitoxina-toxina diferentes pueden ser copias diferentes del mismo promotor o pueden ser promotores diferentes. En algunos aspectos de la exposición, por ejemplo, dos o más promotores operablemente ligados a dos o más operones STA pueden estar regulados por diferentes compuestos y/o condiciones ambientales.

La presente invención se refiere además a un método de control del crecimiento y/o supervivencia de un microorganismo procariótico, tal como una cianobacteria, el método comprende las etapas de introducción de un promotor regulable heterólogo cadena arriba de un operón STA endógeno. En dichas realizaciones, la expresión del operón STA puede inducir la muerte celular o puede perjudicar el crecimiento y/o viabilidad del huésped microbiano. Opcionalmente, aunque preferentemente, el promotor heterólogo puede estar regulado por la disponibilidad de un nutriente o compuesto que puede encontrarse presente en el cultivo celular o medio celular, o por condiciones ambientales, tales como, por ejemplo, la salinidad, el pH, la temperatura o la intensidad luminosa. Preferentemente, la expresión del operón antitoxina-toxina regulado por un promotor heterólogo puede inhibir el crecimiento o perjudicar la viabilidad de las células huésped procarióticas. En algunas realizaciones preferentes, el microorganismo huésped procariótico puede ser una cianobacteria y la expresión del operón antitoxina-toxina regulado por un promotor heterólogo puede perjudicar la fotosíntesis.

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En aspectos adicionales, la invención se refiere además a un microorganismo procariótico recombinante que comprende un constructo antisentido antitoxina, en el que el constructo génico antisentido antitoxina comprende una secuencia de nucleótidos antisentido que se hibrida con por lo menos una parte de por lo menos un gen de antitoxina de un STA endógeno al microorganismo procariótico recombinante, en el que la secuencia de nucleótidos antisentido se encuentra operablemente ligada a un promotor heterólogo. En algunas exposiciones preferentes, el constructo antisentido puede integrarse en el genoma del organismo procariótico recombinante. El microorganismo procariótico en algunas exposiciones puede ser una cianobacteria.

En algunas exposiciones, el gen de antitoxina descrito en la presente memoria incluye, aunque sin limitación, una antitoxina de la familia de la antitoxina CcdA, de la familia de la antitoxina RelB, de la familia de la antitoxina MazE, de la familia de la antitoxina ParD, de la familia de la antitoxina Pin, de la familia de la antitoxina MNT, de la familia de la antitoxina Phd, de la familia de la antitoxina VapB, de la familia de la antitoxina zeta o de la familia de la antitoxina HipB. Adicional o alternativamente, el gen de antitoxina puede seleccionarse de entre el grupo que consiste en homólogos cianobacterianos de axe, phd, mazE, hicB, vapB, pemI, relB, parD, kisS, ccdA, yafN, stbD, yoEm, dinJ, PIN y combinaciones de los mismos.

En exposiciones adicionales, la invención puede incluir microorganismos procarióticos, tales como las cianobacterias que pueden incluir dos o más constructos antisentido de antioxina, incluyendo promotores regulables. Los promotores regulables operablemente ligados a dos o más de las secuencias antisentido antitoxina diferentes pueden ser copias diferentes del mismo promotor o pueden ser promotores diferentes. En algunas exposiciones, por ejemplo, dos o más promotores diferentes operablemente ligados a dos o más secuencias antisentido de antitoxina pueden estar regulados por diferentes compuestos o condiciones ambientales.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere además a un vector que comprende una secuencia de promotor ligada operablemente a una secuencia de ácidos nucleicos codificante de un oligonucleótido antisentido que se hibrida con por lo menos una parte de un gen endógeno de antitoxina de un sistema toxina-antitoxina en un microorganismo procariótico. El promotor es preferentemente un promotor inducible.

La presente invención se refiere además a un método de control del crecimiento y/o supervivencia de un microorganismo procariótico que comprende un STA endógeno mediante la introducción de un constructo antisentido exógeno en el microorganismo procariótico, en el que la expresión del constructo antisentido antitoxina se encuentra regulado por uno o más compuestos o condiciones ambientales, de manera que el microorganismo procariótico presenta una viabilidad reducida o crecimiento deficiente en el caso de que las condiciones de cultivo o ambientales estimulen la expresión del constructo génico antisentido de antitoxina. El microorganismo procariótico en dichas exposiciones incluye un gen de antitoxina endógeno complementario a por lo menos una parte de la secuencia antisentido del constructo antisentido. Opcionalmente, aunque preferentemente, el promotor heterólogo está regulado por un compuesto que puede encontrarse presente en el cultivo celular o medio celular o por condiciones ambientales, tales como, por ejemplo, la salinidad, el pH, la temperatura o la intensidad luminosa.

Preferentemente, la expresión de la secuencia antisentido está regulada por un promotor heterólogo que inhibe el crecimiento o perjudica la viabilidad de las células. En algunas expresiones preferentes, el huésped procariótico puede ser una cianobacteria y la expresión del constructo antisentido regulado por un promotor heterólogo puede perjudicar la fotosíntesis.

En aspectos adicionales, la presente invención se refiere a un microorganismo procariótico que comprende un sistema endógeno de toxina-antitoxina (STA), en el que por lo menos un elemento regulador heterólogo se encuentra operablemente ligado al gen de toxina del STA endógeno. El sistema endógeno de toxina-antitoxina puede ser un sistema de toxina-antitoxina de tipo II en el que por lo menos un elemento regulador heterólogo se encuentra operablemente ligado al gen de toxina del operón STA de tipo II endógeno.

En exposiciones particulares, el elemento regulador heterólogo puede insertarse en el genoma del microorganismo procariótico cadena arriba del gen de toxina. Además, el elemento regulador heterólogo puede comprender un promotor que dirige la expresión del gen de toxina. Además, el elemento regulador heterólogo puede incluir también en algunas exposiciones un terminador transcripcional cadena arriba del promotor. En exposiciones particulares, la inserción de un elemento regulador heterólogo puede realizarse mediante recombinación homóloga en el genoma del huésped. El elemento regulador heterólogo puede insertarse, por ejemplo, mediante recombinación homóloga de un constructo de ácidos nucleicos que puede incluir, en determinadas exposiciones ejemplares, una parte de por lo menos el extremo 3' del gen de antitoxina de un operón antitoxina-toxina endógeno, uno o más elementos reguladores génicos y una parte de por lo menos una porción del extremo 5' del gen de toxina del operón antitoxina- toxina endógeno.

El promotor introducido en el operón STA endógeno puede ser un promotor que está regulado por un compuesto que puede encontrarse presente o ser proporcionado en el cultivo celular o medio celular, tal como, a modo de ejemplos no limitativos, un azúcar, un ácido orgánico, un ácido graso, un lípido, un hidrocarburo, fosfato, nitrato, amonio, azufre, un metal (p.ej. cobre, hierro, níquel o cadmio), un compuesto detector de quórum, un flavonoide, una lactona, un compuesto fenólico, una proteína o péptido secretado o cualquier combinación de los mismos. En

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algunos ejemplos, el promotor se selecciona de entre el grupo que consiste en un promotor rha, promotor inducible por arabinosa (por ejemplo, un promotor inducible por L-arabinosa, o un promotor ara o "BAD"), un promotor inducible por IPTG (isopropil-p-D-tiogalactopiranósido) (por ejemplo, un promotor lac, tac, trc, trcE o trcY), un promotor trp, un promotor glnA, un promotor cys, un promotor secA, un promotor psbA, un promotor nar, un promotor ntc, un promotor nir, un promotor nr, un promotor pho, un promotor pst, un promotor nrs, un promotor tet, un promotor metalotioneína, un promotor ftf, un promotor de choque térmico, un promotor inducible en frío, un promotor vírico, un promotor hin, un promotor cin, un promotor gin y un promotor fimA. En algunos ejemplos, el promotor es inducido al agotarse un compuesto en el medio o entorno de cultivo, por ejemplo el promotor puede ser inducido por limitación de nitrógeno, fósforo, azufre, hierro, cobre o CO2.

Además, el operón STA manipulado del microorganismo procariótico puede comprender un segundo promotor, en el que el segundo promotor se encuentra situado cadena arriba del primer promotor insertado que dirige la expresión del gen de toxina y se encuentra situado cadena abajo del gen de antitoxina. El segundo y primer promotores en las presentes realizaciones dirigen la transcripción en direcciones contrarias. El segundo promotor puede dirigir la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos codificante de un oligonucleótido antisentido que se hibrida con por lo menos una parte del gen de antitoxina del sistema toxina-antitoxina endógeno, en el que el primer promotor puede dirigir la expresión del gen de toxina del operón antitoxina-toxina. En algunas realizaciones, el segundo promotor cadena abajo del gen de antitoxina está regulado opcionalmente por el mismo compuesto que el promotor que dirige la expresión del gen de toxina. Adicional o alternativamente, puede situarse un promotor bidireccional en el lado 3' del gen de antitoxina y 5' respecto al gen de toxina en un operón antitoxina-toxina endógeno, en el que el promotor bidireccional puede dirigir la expresión del gen de toxina y la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos codificante de un oligonucleótido antisentido que se hibrida con por lo menos una parte del gen de antitoxina.

Además, en algunas exposiciones, el microorganismo procariótico puede comprender dos o más sistemas de toxina- antitoxina endógenos y por lo menos dos de los sistemas de toxina-antitoxina pueden incluir un promotor heterólogo ligado operablemente a genes de toxina de los dos o más operones de toxina-antitoxina. Los dos o más sistemas de toxina-antitoxina pueden comprender el mismo promotor heterólogo o diferentes promotores heterólogos operablemente ligados a los genes de toxina de los operones de toxina-antitoxina.

La presente invención se refiere en algunos aspectos a un método de control del crecimiento y/o supervivencia de un microorganismo procariótico que comprende un STA de tipo II endógeno, en el que por lo menos uno de los elementos reguladores heterólogos se encuentra operablemente ligado al gen de toxina del STA endógeno. En exposiciones particulares, el elemento regulador heterólogo puede insertarse en el genoma del microorganismo procariótico cadena arriba del gen de toxina. Además, el elemento regulador heterólogo puede comprender un promotor que dirige la expresión del gen de toxina. Además, el elemento regulador heterólogo puede incluir también en algunas exposiciones un terminador transcripcional cadena arriba del promotor. En exposiciones particulares, la inserción de un elemento regulador heterólogo puede realizarse mediante recombinación homóloga en el genoma del huésped, tal como se da a conocer en la presente memoria. Los métodos pueden comprender una etapa de introducción de por lo menos un elemento regulador heterólogo en el genoma de un microorganismo procariótico, de manera que por lo menos un elemento regulador heterólogo se encuentra operablemente ligado a un gen de toxina de un operón STA del microorganismo procariótico. En dichas realizaciones, la expresión del constructo antisentido antitoxina puede regularse con uno o más compuestos o condiciones ambientales, de manera que el microorganismo procariótico presenta una viabilidad reducida o un crecimiento deficiente en el caso de que las condiciones de cultivo o ambientales estimulen la expresión del gen de toxina regulado por el elemento regulador heterólogo. Opcionalmente, aunque preferentemente, el elemento regulador heterólogo que puede ser o incluir un promotor, está regulado por un compuesto que puede encontrarse presente en el cultivo celular o medio celular o por condiciones ambientales, tales como, por ejemplo, la salinidad, el pH, la temperatura o la intensidad luminosa.

Preferentemente, la expresión del gen de toxina inhibe el crecimiento o perjudica la viabilidad de las células. En algunas realizaciones preferentes, el huésped procariótico es una cianobacteria y la expresión del gen de toxina regulado por un promotor heterólogo puede perjudicar la fotosíntesis.

En algunas exposiciones, el microorganismo procariótico descrito en cualquiera de las realizaciones puede ser un microorganismo fotosintético. Además, el microorganismo procariótico puede ser una especie cianobacteriana. En realizaciones adicionales, el microorganismo procariótico indicado en la presente memoria es una especie de Acaryochloris, Agmenellum, Anabaena, Anabaenopsis, Anacystis, Aphanizomenon, Arthrospira, Asterocapsa, Borzia, Calothrix, Chamaesiphon, Chlorogloeopsis, Chroococcidiopsis, Chroococcus, Crinalium, Cyanobacterium, Cyanobium, Cyanocystis, Cyanospira, Cyanothece, Cylindrospermopsis, Cylindrospermum, Dactylococcopsis, Dermocarpella, Fischerella, Fremyella, Geitleria, Geitlerinema, Gloeobacter, Gloeocapsa, Gloeothece, Halospirulina, Iyengariella, Leptolyngbya, Limnothrix, Lyngbya, Microcoleus, Microcystis, Myxosarcina, Nodularia, Nostoc, Nostochopsis, Oscillatoria, Phormidium, Planktothrix, Pleurocapsa, Prochlorococcus, Prochloron, Prochlorothrix, Pseudanabaena, Rivularia, Schizothrix, Scytonema, Spirulina, Stanieria, Starria, Stigonema, Symploca, Synechococcus, Synechocystis, Thermosynechocystis, Tolypothrix, Trichodesmium, Tychonema o Xenococcus.

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En aspectos adicionales de la exposición, el sistema de toxina-antitoxina endógeno descrito en cualquiera de las realizaciones puede incluir, aunque sin limitación, un STA de la familia de la toxina ccdB, de la familia de la toxina RelE, de la familia de la toxina MazF, de la familia de la toxina ParE, de la familia de la toxina PIN, de la familia de la toxina Ahal, de la familia de la toxina MNT, de la familia de la toxina Doc, de la familia de la toxina VapC, de la familia de la toxina zeta, de la familia de la toxina HipA o de la familia de la toxina HigB. Adicional o alternativamente, el gen de toxina del operón de antitoxina-toxina puede ser cualquiera de entre txe, doc, mazF, hicA, vapC, pemK, ccdB, relE, parE, PIN, kiD, yafQ, rv3182, stbE, yoeB y Z5902 y/o el gen de antitoxina del operón antitoxina-toxina puede ser cualquier homólogo (por ejemplo ortólogo o parálogo) de axe, phd, mazE, hicB, vapB, pemI, relB, parD, kiS, ccdA, yafN, stbD, yoeM, dinJ y PIN.

La presente invención se refiere además a un método de introducción de un gen de toxina en un microorganismo, que comprende transformar un vector que comprende un gen de toxina y un gen de antitoxina análogo en el microorganismo, en el que la toxina se encuentra en una parte integrada del vector y el gen de antitoxina se encuentra en una parte no integrada del vector. Adicional o alternativamente, el gen de toxina se encuentra bajo el control de un promotor regulable y/o el gen de antitoxina se encuentra bajo el control de un promotor que se encuentra activo bajo condiciones de cultivo, por ejemplo bajo condiciones de abundancia de nutrientes. El promotor de gen antitoxina puede, en diversos ejemplos, encontrarse reprimido en el caso de que uno o más nutrientes sean limitantes o en el caso de que se retire un compuesto presente en el medio de cultivo. Alternativamente, el promotor génico de antitoxina puede ser un promotor constitutivo, por ejemplo un promotor no regulado negativamente en respuesta al agotamiento de nutrientes o a la ausencia de un compuesto.

En la presente memoria se proporcionan además microorganismos tales como, aunque sin limitación, microorganismos fotosintéticos eucarióticos o procarióticos que incluyen un gen de toxina de tipo II exógeno y que incluyen además un gen de antitoxina de tipo II exógeno. En algunos ejemplos, la secuencia de ácidos nucleicos codificante de la toxina de tipo II se encuentra operablemente ligada a un promotor activado por el agotamiento de un nutriente del medio de crecimiento o medio del microorganismo. Además, el microorganismo puede incluir un gen codificante de una antitoxina análoga a la toxina, en la que el gen de antitoxina está operablemente ligado a un promotor que no resulta inducido por limitación de uno o más de entre nitrógeno, fosfato, azufre, hierro, cobre o CO2. En algunos ejemplos, la expresión del gen de toxina de tipo II bajo condiciones de limitación de nutrientes resulta en la incapacidad de un microorganismo fotosintético de ajustarse a la limitación de nutrientes. En algunos ejemplos, un microorganismo fotosintético que expresa una toxina de tipo II bajo limitación de nutrientes puede experimentar un deterioro fotosintético.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra el curso temporal de crecimiento del cultivo de E. coli tras la inducción de la expresión génica de diferentes genes de antitoxina con isopropil-p-D-tio-galactósido (IPTG).

La figura 2 ilustra el curso temporal del crecimiento del cultivo de E. coli tras la inducción de la expresión génica de la endorribonucleasa pemK o la expresión de pemI con L-arabinosa.

La figura 3 ilustra un mapa de un vector de integración RS-1 que aloja los casetes de expresión pARA-pemK y pemI. En esta ilustración, el gen de toxina pemK se encuentra en la parte integrante del vector, mientras que el gen de antitoxina pemI se encuentra en la parte no integrante del vector.

La figura 4 ilustra un gráfico que muestra el crecimiento de los cultivos de aislados de las cepas PH-SGI-E-0601 (que contiene pARA-GFP) y PH-SGI-E-0599 (que contiene pARA-pemK y pTet-pemI) no inducidas (-) e inducidas (+) con L-arabinosa al 2% p/v.

La figura 5 ilustra un gráfico que muestra el crecimiento de los cultivos de aislados de las cepas PH-SGI-E-0601 (que contiene pARA-GFP) y PH-SGI-E-0600 (que contiene pARA-pemK y pTet-pemI) no inducidas (-) e inducidas (+) con L-arabinosa al 2% p/v.

La figura 6 muestra los cultivos, de izquierda a derecha, de las cepas PH-SGI-E-0599, no inducido [verde oscuro]; cepa PH-SGI-E-0599 [verde pálido], inducida; cepa PH-SGI-E-0600, no inducida [verde oscuro]; cepa PH-SGI-E-0600, inducida [verde pálido]; cepa PH-SGI-E-0601, no inducida [verde oscuro]; cepa PH-SGI-E-060l, inducida [verde oscuro]; cepa PH-SGI-E-0606, no inducida [moderadamente verde] y cepa PH-SGI-E-0606, inducida [moderadamente verde]

La figura 7 es una alineación del gen MazF de E. coli nativo (SEC ID n° 68) y una versión de secuencia alterada del gen MazF que excluye el sitio de reconocimiento de ribonucleasa ACA de MazF ("MazE insens", SEC ID n° 69). Los sitios de endorribonucleasa en el gen de E. coli nativo están subrayados y los nucleótidos mutados se muestran en negrita.

La figura 8 es una alineación del gen pemK de E. coli nativo (SEC ID n° 73) y una versión de secuencia alterada del gen pemK que excluye el sitio de reconocimiento de ribonucleasa TA(A/C/T) de pemK ("pemK_insens", SEC ID n° 74). Los sitios de endorribonucleasa en el gen de E. coli nativo están subrayados y los nucleótidos mutados se muestran en negrita.

La figura 9 es una alineación del gen YafQ de E. coli nativo (SEC ID n° 78) y una versión de secuencia alterada del gen YafQ que excluye el codón AAA seguido de A o G, así como el sitio de reconocimiento de ribonucleasa ACA de MazF ("MazE, YafQ-insens", SEC ID n° 79). Los sitios de endorribonucleasa en el gen de E. coli nativo están subrayados y los nucleótidos mutados se muestran en negrita.

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Descripción detallada

El alcance de la presente invención es el definido según las reivindicaciones. La presente invención se refiere a microorganismos, constructos de ácidos nucleicos y métodos para la contención biológica de microorganismos recombinantes, tal como, aunque sin limitación, microalgas eucarióticas y cianobacterias, mediante la expresión de genes de toxina de tipo II y/o mediante la inhibición de la expresión de genes de antitoxina exógenos o endógenos. En ejemplos particulares, un gen de toxina de tipo II introducido en un microorganismo para el bioconfinamiento puede codificar una ribonucleasa y el gen de toxina puede presentar una secuencia que ha sido alterada con respecto al gen de toxina de tipo II nativo para eliminar una o más secuencias que resultan reconocidas (transcritas en secuencias de ARN) por la toxina de tipo II misma. La invención se refiere además a exposiciones de bioconfinamiento que pueden utilizar múltiples genes de toxina de tipo II, en los que el microorganismo manipulado opcionalmente, aunque preferentemente, incluye además los genes de antitoxina análogos. Se dan a conocer además estrategias para la utilización de STA endógenos para el bioconfinamiento, por ejemplo mediante la alteración de la expresión del gen de toxina y/o el gen de antitoxina de un RAS endógeno. También se encuentra comprendida dentro del alcance de la invención la utilización de diversas realizaciones de los aspectos de la invención en cualquier combinación.

Sistemas toxina-antitoxina (STA)

El componente toxina del sistema toxina-antitoxina (STA) puede incluir una proteína que típicamente causa citostasis y/o muerte celular en caso de expresarse a un nivel superior a un nivel determinado, mientras que el componente antitoxina (análogo) puede regular la expresión de la toxina, puede inactivar la toxina y/o puede contrarrestar el efecto citostático/tóxico de la toxina, evitando de esta manera la muerte celular. Los STA pueden clasificarse en dos tipos principales basados en la naturaleza de la antitoxina. Los STA de tipo I pueden comprender una antitoxina de aRn antisentido complementaria al ARNm de toxina y que puede evitar su traducción. Por otra parte, los STA de tipo II utilizan una antitoxina proteica para mantener inactivada la toxina, por ejemplo mediante una interacción proteína-proteína. Los STA de tipo II están codificados generalmente por genes organizados en operones, en los que un único promotor se encuentra presente típicamente cadena arriba de un gen de antitoxina, que está seguido de un gen de toxina que comúnmente puede solapar el gen de antitoxina, de manera que el extremo 5' del gen de toxina típicamente se encuentra a diez o menos nucleótidos cadena arriba del extremo 3' del gen de antitoxina.

La toxina de un STA de tipo II puede utilizar diversos mecanismos en la eliminación de las células. En un aspecto, las toxinas de los STA de tipo II consideradas en la presente memoria pueden funcionar como ARNasas (también denominadas "ARN interferasas") que pueden actuar como endonucleasas basadas en ARN, incluyendo, aunque sin limitación, las toxinas colicina E3, VapC, Doc, HigB, RelE y MazF, así como combinaciones de las mismas. Adicional o alternativamente, las toxinas pueden funcionar como inhibidores de ADN girasa que pueden anular la reproducción celular, por ejemplo mediante el bloqueo de la replicación del ADN, incluyendo, aunque sin limitación, la toxina CcdB. Todavía adicionalmente, o alternativamente, las toxinas pueden funcionar como proteína quinasas que pueden anular la reproducción del microorganismo y/o pueden convertir el microorganismo en latente, por ejemplo mediante la inhibición de la traducción mediante fosforilación del factor de alargamiento EF-Tu. Entre dichas proteína quinasas pueden incluirse, aunque sin limitación, la toxina HipA.

La antitoxina del STA de tipo II puede ser una proteína de dos dominios de doble función que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en por lo menos un dominio de interacción proteína-proteína y por lo menos un dominio de unión a ADN. En el caso de que no se acomplejen con otras proteínas, las antitoxinas pueden presentar estructuras en gran medida desordenadas y pueden ser altamente susceptibles a la proteolisis y, por lo tanto, pueden ser relativamente inestables. Tras la interacción con la toxina o toxinas respectivas mediante su dominio o dominios de interacción proteína-proteína, la antitoxina o antitoxinas pueden asumir una o más estructuras compactas y de esta manera, resultar estabilizadas. En muchas realizaciones, la unión de la antitoxina puede inhibir la actividad de la toxina análoga y/o el complejo toxina-antitoxina (TA) estable puede unirse al operador del operón STA correspondiente, por ejemplo mediante el dominio de unión a ADN de la antitoxina, (auto)reprimiendo su transcripción. De esta manera, en algunas exposiciones, la antitoxina en el STA de tipo II puede ejercer un control sobre la actividad del STA en por lo menos dos niveles, mediante la inhibición directa de la toxina y mediante la represión de la expresión de ambos componentes del STA.

El gen de toxina puede ser un gen codificante de cualquier proteína toxina, por ejemplo que puede presentar una actividad letal tal como se indica en la presente memoria y que interactúe con una antitoxina análoga, de manera que su actividad letal resulte inhibida y/o bloqueada. Por ejemplo, el gen de toxina del STA puede codificar un polipéptido con actividad letal que es un elemento de la familia de la toxina HicA, de la familia de la toxina PemK, de la familia de la toxina CcdB, de la familia de la toxina RelE, de la familia de la toxina MazF, de la familia de la toxina ParE, de la familia de la toxina PIN, de la familia de la toxina AhaI, de la familia de la toxina MNT, de la familia de la toxina Doc, de la familia de la toxina VapC, de la familia de la toxina zeta, de la familia de la toxina HipA y de la familia de la toxina HigB. En exposiciones adicionales, el gen de toxina puede ser un homólogo (por ejemplo, un ortólogo) de txe, doc, mazF, hicA, vapC, pemK, ccdB, relE, parE, PIN, kiD, yafQ, rv3182, stbE, yoeB y/o Z5902.

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Entre los ejemplos de los genes de toxina que pueden utilizarse en los métodos y microorganismos en la presente memoria pueden incluirse, aunque sin limitación, genes de toxina de E. coli, genes codificantes de proteína Txe de Cyanothece sp. (números de acceso de proteína de Genbank ADN15973.1; YP_003139280.1; yP_003889248.1; ACV02445.1; YP_003139223.1; YP_003136478.1; YP_002372701.1; YP_002372643.1; ACV02388.1; ACU99642.1; ACK66545.1; ACK66487.1), proteína Txe de Arthrospira maxima (números de acceso de proteína de Genbank ZP_03274874.1; EDZ93600.1), proteína Txe de Microcystis aeruginosa (número de acceso de proteína de Genbank CAO88400.1; CAO91243.1), proteína MazF de Synechococcus elongatus (número de acceso de proteína de Genbank YP_173189.1), proteína MazF de Cyanothece sp. (números de acceso de proteína de Genbank ADN14780.1; ADN14211.1; ADN12516.1; ADN12516.1; YP_002381166.1; YP_002484833.1; YP_002484117.1; YP_002483246.1; YP_002373821.1; YP_002373765.1; YP_002373335.1; YP_002364823.1; YP_002364811.1; YP_003888055.1; YP_003887486.1), proteína HicA de Microcystis aeruginosa (números de acceso de proteína de Genbank BAG03061.1; YP_001658253.1), proteína HicA de Cyanothece sp. (números de acceso a proteína de Genbank YP_001806450.1; ACB54384.1; YP_001803995.1; ACB51929.1; ZP_01732465.1; ZP_01729969.1; ZP_01729199.1; ZP_01727862.1; EAZ92576.1), proteína HicA de Nostoc sp. (números de acceso de proteína de Genbank YP_001806450.1; BAB76976.1; NP_489317.1), proteína HicA de Oscilatoria sp. (números de acceso de proteína de Genbank CBN54076.1; ZP_07108930.1), proteína HicA de Acaryochloris marina (números de acceso de proteína de Genbank YP_001517092.1; ABW27776.1), proteína HicA de Crocosphaera watsonii (números de acceso de proteína de Genbank ZP_00515166.1), proteína HicA de Arthrospira platensis (número de acceso de proteína de Genbank BAI89981.1), proteína HicA de Arthrospira platensis str. (número de acceso de proteína de Genbank ZP_06382218.1), proteína VapC de Synechocystis sp. (números de acceso de proteína de Genbank BAA17012.1; BAA10330.1; NP_442260.1; NP_440332.1; ZP_07974844.1), proteína RelE de Synechocystis sp. (números de acceso de proteína de Genbank ZP_01085890.1; EAQ74219.1), proteína RelE de Nostoc punctiforme (números de acceso de proteína de Genbank ACC80417.1; ACC83798.1; Yp_001865360.1; YP_001868741.1), proteína RelE de Cyanothece sp. (números de acceso de proteína de Genbank YP_002370903.1; YP_002377124.1; YP_003886168.1; YP_003890925.1; ADN18560.1; ACK70256.1; ACK64747.1; ADN12780.1; YP_003900060.1; YP_003900263.1; YP_003900263.1), proteína PIN de Synechocystis sp. (números de acceso de proteína de Genbank ACA99984.1; ACA98072.1; ACB00865.1; ACB00290.1; ZP _01079375.1; ACB01033.1; ACB00960.1; EAQ70500.1), proteína PemK de Nostoc punctiforme (número de acceso de proteína de Genbank ACC80280.1), proteína PemK de Cyanothece sp. (números de acceso de proteína de Genbank ADN14780.1; ADN14211.1; YP_003136988.1; YP_002381166.1; YP_002484833.1; YP_002484117.1; YP_002483246.1; YP_002373821.1; YP_002373335.1; YP_002364823.1; YP_003888055.1; YP_003887486.1; ACK69644.1; ACV00153.1; ACL46472.1; ACL45756.1; ACL44885.1) y combinaciones de los mismos. La lista anterior es ejemplar y no limitativa. Entre otros ejemplos pueden incluirse homólogos de dichas toxinas, tales como sus ortólogos en otras especies o cepas, así como variantes de dichas toxinas, tales como variantes que presentan una identidad de las secuencias de aminoácidos de por lo menos 60%, por ejemplo de por lo menos 65%, de por lo menos 70%, de por lo menos 75%, de por lo menos 80%, de por lo menos 85%, de por lo menos 90%, de por lo menos 95%, de por lo menos 96%, de por lo menos 97%, de por lo menos 98% o de por lo menos 99% respecto a una toxina de tipo II identificada y/o a un análogo de un antitoxina identificada.

El gen de antitoxina puede ser un gen codificante de cualquier proteína antitoxina, por ejemplo que puede interactuar con un gen de toxina y que puede presentar una actividad de antídoto tal como se indica en la presente memoria, es decir, el gen/proteína de antitoxina puede inhibir, reducir y/o neutralizar la expresión y/o de otro modo la actividad letal del gen/proteína de toxina análogo, por ejemplo mediante la unión a la proteína toxina. Por ejemplo, un gen de antitoxina utilizado en los métodos y microorganismos proporcionado en la presente memoria puede codificar un polipéptido que presenta actividad de antídoto que es un elemento de la familia de la antitoxina HiC, de la familia de la antitoxina PemI, de la familia de la antitoxina CcdA, de la familia de la antitoxina RelB, de la familia de la antitoxina MazE, de la familia de la antitoxina ParD, de la familia de la antitoxina RHH, de la familia de la antitoxina ArsR, de la familia de la antitoxina HEPN, de la familia de la antitoxina Phd, de la familia de la antitoxina VapB, de la familia de la antitoxina epsilón, de la familia de la antitoxina HipB, de la familia de la antitoxina HigA, de la familia HTH, de la familia de la antitoxina similar a MJ1172, de la familia de la antitoxina StbD/axe y combinaciones de las mismas. En realizaciones adicionales, el gen de antitoxina puede ser un homólogo de axe, phd, mazE, hicB, vapB, pemI, relB, parD, kiS, ccdA, yafN, stbD, yoeM, dinJ o PIN.

Entre los ejemplos de los genes de antitoxina tales como los indicados en la presente memoria pueden incluirse, aunque sin lmitación, genes codificantes de antitoxinas de E. coli, proteína Axe de Cyanobium sp. (números de acceso de proteína de Genbank ZP_05045974.1; EDY39283.1), proteína Axe de Acaryochloris marina (números de acceso de proteína de Genbank YP_001516924.1; YP_001515235.1; ABW27750.1; ABW27610.1; ABW25921.1; YP_001522298.1; ABW32984.1), proteína Phd de Synechocystis sp. (Números de acceso de proteína de Genbank YP_001734097.1; ACA98841.1; ZP_01085949.1; ZP_01470857.1; EAU74652.1; EAQ74278.1; ZP_07974939.1; ZP_07974866.1; ZP_07974840.1; ZP_07974105.1; ZP_07970842.1; ZP_01086419.1; ZP_01086044.1;

ZP_01085889.1; ZP_01085677.1; ZP_01085189.1), proteína MazE de Cyanobium sp. (números de acceso de proteína de Genbank ADN14210.1; YP_002482420.1; YP_002373117.1; YP_003887485.1; ACK69643.1; ACK69029.1; ACV01977.1; ACL45755.1; ACL44059.1), proteína StbD de Cyanobium sp. (números de acceso de proteína de Genbank ZP_01730833.1; EAZ89789.1) y combinaciones de los mismos. La lista anterior es ejemplar y no limitativa. Entre otros ejemplos se incluyen ortólogos de dichas antitoxinas, así como variantes de dichas antitoxinas y sus ortólogos en otras especies, tales como variantes que presentan una identidad de secuencias de

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aminoácidos de por lo menos 55%, de por lo menos 60%, de por lo menos 65%, de por lo menos 70%, de por lo

menos 75%, de por lo menos 80%, de por lo menos 85%, de por lo menos 90%, de por lo menos 95%, de por lo

menos 96%, de por lo menos 97%, de por lo menos 98% o de por lo menos 99% respecto a una antitoxina identificada y/o a un análogo de una toxina de tipo II identificada.

Tal como se ha comentado anteriormente, las antitoxinas referidas a la presente invención pueden interactuar ventajosamente con las toxinas dadas a conocer en la presente memoria. Las toxinas y antitoxinas que interactúan entre sí de manera que la toxina puede reducir significativamente su actividad (p.ej. inactivarse) por la antitoxina se denominan en la presente memoria toxinas o antitoxinas análogas. Los elementos de determinadas familias de toxina pueden interactuar con elementos de determinadas familias de antitoxinas. Por ejemplo, una antitoxina de una familia de antitoxina CcdA, de la fmailia de la antitoxina RelB, de la familia de la antitoxina MazE, de la familia de la antitoxina ParD, de la familia de la antitoxina RHH, de la familia de la antitoxina ArsR, de la familia de la antitoxina HEPN, de la familia de la antitoxina Phd, de la familia de la antitoxina VapB, de la familia de la antitoxina epsilón, de

la familia de la antitoxina HipB y/o de la familia de la antitoxina HigA, puede interactuar con una toxina de la famlia

dela toxina CcdB, de la familia de la antitoxina RelE, de la familia de la antitoxina MazF, de la familia de la antitoxina ParE, de la familia de la antitoxina PIN, de la familia de la antitoxina AhaI, de la familia de la antitoxina MNT, de la familia de la antitoxina Doc, de la familia de la antitoxina VapC, de la familia de la antitoxina zeta, de la familia de la antitoxina HipA y/o de la familia de la antitoxina HigB, respectivamente. Además, una antitoxina relacionada con la presente invención puede interactuar con toxinas de más de una familia de toxinas y una toxina relacionada con la presente invención puede interactuar con antitoxinas de diversas familias de antitoxina. Por ejemplo, algunas antitoxinas de la familia de la antitoxina Phd pueden interactuar con toxinas particulares que pueden pertenecer, por ejemplo, a las familias de la toxina MazF, Doc, PIN y/o RelE, y algunas toxinas de la familia de la toxina RelE pueden interactuar con antitoxinas particulares de cualquiera de las familias de las antitoxinas HTH, antitoxina similar a MJ1172, StbD/axe y RHH. Otros STA de tipo II y métodos para identificar el STA y sus toxinas/antitoxinas se describen en, por ejemplo, Makarova, Biology Direct 4:19, 2009, y Melderen, PloS Genetics 5:3, 2009.

Los genes de toxina, referidos a algunas realizaciones de la presente invención, pueden comprender txe (SEC ID n° 1; proteína de SEC ID n° 2) y doc (SEC ID n° 3; proteína de SEC ID n° 4) derivado de Synechococcus, mazF (SEC ID n° 5; proteína de SEC ID n° 6) derivado de Anabaena (también denominado Nostoc), hicA (SEC ID n° 7; proteína de SEC ID n° 8) y vapC (SEC ID n° 9; proteína de SEC ID n° 10) derivado de Nostoc y pemK (SeC ID n° 11; proteína de SEC ID n° 12) derivado de Microcystis aeruginosa. Los genes de antitoxina, referidos a algunas realizaciones de la presente invención, pueden comprender axe (SEC ID n° 13; proteína de SEC ID n° 14) y phd (SEC ID n° 15; proteína de SEC ID n° 16) derivado de Synechococcus, mazE (SEC ID n° 17; proteína de SEC iD n° 18) derivado de Anabaena (SEC ID n° 19; proteína de sEc ID n° 20) y vapB (SeC ID n° 21; proteína de SEC ID n° 22) derivado de Nostoc y pemI (SEC ID n° 23; proteína de SEC ID n° 24) derivado de Microcystis aeruginosa. Entre los ejemplos no limitativos adicionales de E. coli se incluyen mazF (SEC ID n° 70; proteína de SEC ID n° 72) o su versión insensible a mazF de secuencia alterada (SEC iD n° 69), pemK (SEC ID n° 73, proteína de SEC ID n° 75) o su versión insensible a pemK de secuencia alterada (SEC iD n° 74) y YafQ (SEC ID n° 78; proteína de SEC ID n° 80) o su versión insensible a pemK de secuencia alterada (SEC iD n° 79).

Por ejemplo, un gen que presenta homología, en términos de la secuencia de aminoácidos, respecto a una toxina que presenta una actividad de endorribonucleasa para reconocer una secuencia de nucleótidos específica y cortar el ARNm (por ejemplo PemK) puede ser un candidato para el gen de toxina que debe insertarse en el microorganismo.

Por ejemplo, dicho gen puede obtenerse a partir de un grupo de cianobacterias, tal como Synechocystis. Entre dichos genes se incluyen los definidos en la presente memoria como pertenecientes a la familia del gen PemK. Se ha encontrado otra toxina de la familia de PemK en Pyrococcus horikoshii.

Sin embargo, los genes codificantes de toxinas de otros sistemas proteicos de eliminación y que, por lo tanto, son equivalentes funcionales de las toxinas de la familia de pemK, pueden utilizarse adicional o alternativamente de acuerdo con la invención para el control del crecimiento y/o supervivencia del microorganismo. Dichos genes pueden incluir genes codificantes de la familia de la toxina RelE, de la familia de la toxina ParE y de la familia de la toxina Doc, tal como se indica en Jensen, Mol. Microbiol. 17:211-220, 1995.

Se entenderá que en el presente contexto, la expresión "equivalente funcional" incluye variantes y/o derivados de cualquiera de las toxinas anteriormente indicadas, las secuencias de las cuales han sido modificadas mediante sustitución, deleción o adición de uno o más aminoácidos, y el producto génico del cual ha conservado por lo menos parte de la función del producto génico de la secuencia no modificada.

Los genes codificantes de equivalentes funcionales de la antitoxina PemI pueden utilizarse según la invención para el control del crecimiento y/o supervivencia de microorganismos. Dichos genes pueden incluir los genes codificantes de la familia de la antitoxina RelB, de la familia de la antitoxina CcdA, de la familia de la antitoxina ParD y de la familia de la antitoxina Phd.

Debido a que pueden existir algunas diferencias de secuencia de ADN entre géneros y/o cepas de cianobacterias, el gen o genes de toxina y/o antitoxina pueden no encontrarse necesariamente limitados a los genes especificados en

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la presente memoria y entre ellos pueden incluirse homólogos (p.ej. ortólogos) de dichos genes u otros elementos de familia de toxina y/o antitoxina, así como genes homólogos codificantes de proteínas variantes de la familia de toxina y/o antitoxina indicadas en la presente memoria. En particular, la identidad de secuencia puede ser de por lo menos aproximadamente 55%, por ejemplo de por lo menos aproximadamente 65%, de por lo menos aproximadamente 75%, de por lo menos aproximadamente 85%, de por lo menos aproximadamente 90%, de por lo menos aproximadamente 95%, de por lo menos aproximadamente 98%, de por lo menos aproximadamente 99% o de aproximadamente 100%.

Tal como se utiliza en la presente memoria, un "homólogo" de un gen se refiere al gen de referencia descendiente de un gen ancestral común. El término "ortólogo", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un gen derivado de un gen ancestral común, en el que los genes presentan una o más funciones aproximadamente similares; de esta manera, "ortólogo" puede utilizarse para referirse al mismo gen en una especie diferente.

La homología/identidad al nivel de la secuencia de nucleótidos/aminoácidos puede determinarse mediante análisis de BLAST (por sus siglas en inglés, herramienta básica de búsqueda de alineaciones locales) utilizando el algoritmo utilizado por los programas blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx (Altschul, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997 y Karlin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990) que se ajustan para la búsqueda de similitudes de secuencia. El enfoque utilizado por el programa BLAST es considerar en primer lugar los segmentos similares, con y sin huecos, entre una secuencia problema y una secuencia de base de datos; después se evalúa la significancia estadística de todas las correspondencias identificadas y finalmente se resumen únicamente aquellas correspondencias que satisfacen un umbral preseleccionado de significancia. Para un comentario de las cuestiones básicas de búsqueda de similitudes de la base de datos de secuencias, ver Altschul, Nature Genetics 6:119-129, 1994. Los parámetros de búsqueda para histogramas, descripciones, alineaciones, esperanza (es decir, el umbral de significancia estadística para informar de correspondencias frente a secuencias de base de datos), valores de corte, matrices y filtros (baja complejidad) pueden ser los parámetros por defecto. La matriz de puntuación por defecto utilizada por blastp, blastx, tblastn y tblastx es la matriz BLOSUM62 (Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992), recomendado para secuencias problema de más de 85 (bases nucleótidas o aminoácidos) de longitud).

Para blastn, diseñado para comparar secuencias de nucleótidos, la matriz de puntuaciones se fija con las proporciones de M (es decir, la puntuación premio para una pareja de residuos correspondientes) a N (es decir, la puntuación de penalización para residuos no correspondientes), en el que los valores por defecto para M y N puede ser de +5 y -4, respectivamente. Cuatro parámetros de blastn pueden configurarse de la manera siguiente: Q=10 (penalización por creación de hueco); R=10 (penalización por extensión de hueco); wink=1 (genera aciertos de término en cada posición wink-ésima a lo largo de la secuencia problema) y gapw=16 (fija la anchura de ventana dentro de la que se generan alineaciones con hueco). La configuración de parámetros de Blastp equivalente para la comparación de secuencias de aminoácidos puede ser: Q=9; R=2; wink=1 y gapw=32. Una comparación de Bestfit entre secuencias, disponible en el paquete GCG versión 10.0, puede utilizar los parámetros de ADN siguientes: GAP=50 (penalización por creación de hueco) y LEN=3 (penalización por extensión de hueco) y la configuración equivalente en las comparaciones de proteínas puede ser GAP=8 y LEN=2.

En algunas realizaciones adicionales, una secuencia de nucleótidos del gen o genes de toxina y/o antitoxina relacionados con la invención puede encontrarse mutada, p. ej. de manera que se incremente la actividad biológica y/o se potencien las interacciones. Entre dichas mutaciones puede incluirse, aunque sin limitación, la optimización de los codones para potenciar la expresión de la secuencia de tipo salvaje en cianobacterias transgénicas (p.ej. Burgess-Brown, Protein Expr. Purif. 59:94-102, 2008) y mutaciones que resultan de la mutagénesis específica de sitio para alterar la secuencia de aminoácidos del gen o genes de toxina y/o antitoxina. Dicha alteración de la secuencia de aminoácidos puede incrementar la actividad biológica y/o potenciar la especificidad del gen o genes de toxina y/o antitoxina en una o más especies de microorganismo procariótico.

En algunos ejemplos particulares, un gen de toxina codifica una "interfase de ARN", es decir, una proteína que presenta actividad riboendonucleolítica y la secuencia de nucleótidos de un gen de toxina puede mutarse de manera que se reduzca o elimine la susceptibilidad del transcrito de toxina mismo frente a la degradación por la proteína toxina. Lo anterior preferentemente se lleva a cabo para mantener la secuencia de aminoácidos de la proteína toxina codificada, o en el caso de que se introduzcan cambios de aminoácidos, los cambios de aminoácidos no reducen la actividad de la toxina. Por ejemplo, la toxina MazF de E. coli (SEC ID n° 70) es una ribonucleasa que reconoce la secuencia ACA en los transcritos de ARN. La secuencia ACA puede ser completamente eliminada de la secuencia codificante de la toxina (la secuencia alterada se proporciona en SEC ID n° 69), tal como se muestra en la figura 7.

Otro ejemplo es la toxina pemK de E. coli (SEC ID n° 75), una ribonucleasa que reconoce la secuencia: UA(A/C/U) en los transcritos de RNA. La secuencia UA(A/C/U) puede ser completamente eliminada de la secuencia codificante de la toxina (la secuencia alterada se proporciona en SEC ID n° 69), tal como se muestra en la figura 8. Todavía otro ejemplo es la toxina YafQ de E. coli (sEc ID n° 80), que corta después de un codón AAA, en el caso de que al codón AAA siga una A o G. Se proporciona en la figura 9 un gen de toxina YafQ manipulado para excluir las secuencias ACA (reconocimiento de MazF) y codones AAA seguidos de A o G. Dichas alteraciones de secuencia pueden convertir al transcrito de ARN de la toxina en insensible a la actividad endonucleolítica de su propia toxina

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codificada, prolongando de esta manera los efectos tóxicos y reduciendo la probabilidad de persistencia frente a las condiciones en que se expresa la toxina (p.ej. la limitación de nutrientes). Las mutaciones dirigidas, tales como las que eliminan secuencias diana de toxina, pueden crearse, por ejemplo, mediante reacción en cadena de polimerasa, síntesis química o cualesquiera medios convenientes.

Una secuencia de ácidos nucleicos dada también puede modificarse, por ejemplo mediante métodos de mutagénesis estándar, evolución artificial o intercambio de dominios a fin de producir secuencias modificadas. Se describen métodos de evolución acelerada en, por ejemplo, Stemmer, Nature 370:389-391, 1994, y en Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751, 1994. La alteración química y/o enzimática de los ácidos nucleicos y polipéptidos expresados puede llevarse a cabo mediante métodos estándares. Por ejemplo, una secuencia puede modificarse mediante la adición de grupos fosfato, grupos metilo, lípidos, azúcares, péptidos, compuestos orgánicos y/o inorgánicos, mediante la inclusión de nucleótidos o aminoácidos modificados, y similares, o mediante combinaciones de los mismos. Además, el gen o genes de toxina y/o antitoxina puede derivarse de una colección de transcritos, tales como una biblioteca de ADNc, y la secuencia del transcrito puede ser desconocida.

Los "ácidos nucleicos" o "moléculas de ácidos nucleicos" relacionadas con la invención pueden ser de ADN o ARN, por ejemplo ARNm. Los ácidos nucleicos pueden ser moléculas de cadena sencilla o de doble cadena, es decir, híbridos de ADN:ARN:ADN-ADN, ADN-ARN o ARN-ARN, ácidos péptido-nucleicos (APN) formados mediante la conjugación de bases con un esqueleto de aminoácidos, o similares. Los ácidos nucleicos pueden ser adicional o alternativamente oligonucleótidos, tales como oligonucleótidos antisentido, polímeros quiméricos de ADN-ARN y ribozimas, así como versiones modificadas de dichos ácidos nucleicos, en las que la modificación puede encontrarse en la base, la fracción sacárida, el enlace fosfato o en cualquier combinación de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden comprender un gen esencial o fragmento del mismo, en el que la célula o células diana pueden ser deficientes de algún modo. Lo anterior puede producirse en el caso de que el gen puede encontrarse ausente o en el caso de que el gen se encuentre mutado, resultando en la infraexpresión o sobreexpresión. Los ácidos nucleicos pueden comprender oligonucleótidos antisentido, por ejemplo los que pueden construirse para inhibir la expresión de un gen diana. Si se desea, la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico aislado puede incluir secuencias no codificantes adicionales, tales como secuencias 3' y 5' no codificantes (incluyendo secuencias reguladoras, por ejemplo).

La invención puede referirse además a fragmentos de las moléculas de ácidos nucleicos aisladas que se describen en la presente memoria, que pueden comprender una parte de una secuencia de nucleótidos indicada en la presente memoria, que puede presentar una longitud de por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos contiguos, por ejemplo entre aproximadamente 20 y aproximadamente 50 nucleótidos contiguos o por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos contiguos. Dichos fragmentos pueden resultar útiles como sondas y/o cebadores. En particular, los cebadores y sondas pueden hibridarse selectivamente con la molécula de ácidos nucleicos codificante de los polipéptidos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, los fragmentos que codifican polipéptidos que conservan actividad, tal como se indica posteriormente, pueden resultar particularmente útiles.

La invención puede referirse además a moléculas de ácidos nucleicos que pueden hibridarse bajo condiciones de hibridación de alta astringencia, tal como para la hibridación selectiva, con las secuencias de nucleótidos indicadas en la presente memoria (p.ej. moléculas de ácidos nucleicos que pueden hibridarse específicamente con una secuencia de nucleótidos codificante de polipéptidos descritos en la presente memoria). Las sondas de hibridación pueden incluir oligonucleótidos sintéticos que pueden unirse de una manera específica de base con una cadena complementaria de ácidos nucleicos. Entre las sondas adecuadas pueden incluirse los ácidos péptido-nucleicos, tal como se describen en Nielsen, Science 254:1497-1500, 1991.

Dichas moléculas de ácidos nucleicos pueden detectarse y/o aislarse mediante hibridación específica, por ejemplo bajo condiciones de astringencia relativamente alta. Las "condiciones de astringencia" para la hibridación es una expresión de la técnica que se refiere a las condiciones de incubación y lavado, p.ej. las condiciones de temperatura y la concentración del tampón, que permiten la hibridación de un ácido nucleico particular a un segundo ácido nucleico; el primer ácido nucleico puede ser perfectamente complementario, es decir, 100% complementario respecto al segundo, o el primero y el segundo pueden compartir cierto grado de complementariedad, que es menos que perfecta, por ejemplo de 60%, 75%, 85%, 95% o superior. Por ejemplo, pueden utilizarse determinadas condiciones de alta astringencia para distinguir los ácidos nucleicos alta/perfectamente complementarios de los menos complementarios.

Las "condiciones de alta astringencia", las "condiciones de astringencia moderada" y las "condiciones de baja astringencia" para las hibridaciones de ácidos nucleicos se explican en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 2011. Las condiciones exactas que determinan la astringencia de la hibridación dependen no sólo de la fuerza iónica (p.ej., ~0,2* SSC o ~0,1* SSC de los tampones de lavado), de la temperatura (p.ej., ~23°C, ~42°C, ~68°C, etc.) y de la concentración de agentes desestabilizadores y/o agentes desnaturalizantes (tales como SDS) sino también de factores tales como la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos, la composición de bases, el porcentaje de no correspondencia entre secuencias hibridantes, la frecuencia de incidencia de subgrupos de dicha secuencia dentro de otras secuencias no idénticas, y similares. De esta manera, las condiciones de alta, moderada y baja astringencia pueden determinarse empíricamente.

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Mediante la modificación de las condiciones de hibridación de un nivel de astringencia al que no se produce ninguna hibridación hasta el nivel al que se observa hibridación, pueden determinarse las condiciones que permiten que una secuencia dada se hibride con las secuencias más similares en la muestra.

Se describen condiciones ejemplares en Krause, Methods in Enzymology 200:546-556, 1991. El lavado es la etapa en la que se fijan habitualmente las condiciones que determinan un nivel mínimo de complementariedad de los híbridos. Generalmente, partiendo de la temperatura más baja a la que sólo se produce hibridación homóloga, cada grado (°C) por el que se reduce la temperatura final de lavado, mientras se mantiene la concentración de SSC constante, puede permitir un incremento de aproximadamente 1% del grado máximo de no correspondencia entre las secuencias que se hibridan. Generalmente, la duplicación de la concentración de SSC puede resultar en un incremento de la Tm. Utilizando dichas directrices, puede determinarse la temperatura de lavado empíricamente para astringencia elevada, moderada o baja, dependiendo del nivel de no correspondencia buscado. Entre las condiciones de alta astringencia ejemplars se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, la hibridación en ~50% de formamida, NaCl ~1 M, SDS al ~1% a aproximadamente 37°C y lavado en ~0,1* SSC a aproximadamente 60°C. Entre las condiciones de astringencia progresivamente más alta se incluyen, tras la hibridación, el lavado con ~0,2* SSC y SDS al ~0,1% a aproximadamente temperatura ambiente (condiciones de baja astringencia); lavado con ~0,2* SSC y SDS al ~0,1% a aproximadamente 42°C (condiciones de astringencia moderada) y lavado con ~0,1* SSC a aproximadamente ~68°C (condiciones de alta astringencia). El lavado puede llevarse a cabo utilizando únicamente una de dichas condiciones, p.ej. bajo condiciones de alta astringencia, o el lavado puede comprender dos o más de las condiciones de astringencia, p.ej. con el fin de incrementar la astringencia. Las condiciones óptimas pueden variar, p.ej. dependiendo de la reacción de hibridación particular implicada y típicamente pueden determinarse empíricamente.

Pueden determinarse condiciones equivalentes mediante la modificación de uno o más de los parámetros proporcionados a título de ejemplo tal como es conocido de la técnica, manteniendo simultáneamente un grado similar de identidad/similitud entre la molécula de ácidos nucleicos diana y el cebador/sonda utilizado. Las secuencias de nucleótidos hibridables pueden resultar útiles como sondas y/o cebadores para la identificación de organismos que comprenden un ácido nucleico de la invención y/o para aislar un ácido nucleico de la invención, por ejemplo.

Elemento regulador heterólogo.

La presente invención se refiere en algunos aspectos a un microorganismo, tal como un alga eucariótica o cianobacteria que comprende una molécula de ácidos nucleicos exógena codificante de una toxina de tipo II en la que el gen de toxina puede ligarse operablemente a un elemento regulador heterólogo, tal como un promotor. Además, el microorganismo manipulado para el bioconfinamiento puede incluir un gen de antitoxina que puede ser un gen de antitoxina exógeno o, por ejemplo (en el caso de un microorganismo procariótico), un gen de antitoxina endógeno, en el que el gen de antitoxina puede ligarse operablemente a un promotor heterólogo. En aspectos adicionales o alternativos, la invención puede implicar constructos antisentido de antitoxina, en los que la secuencia antisentido de antitoxina puede ligarse operablemente a un elemento regulador heterólogo, tal como un promotor.

En aspectos adicionales o alternativos adicionales, la presente invención se refiere a un microorganismo procariótico que comprende un sistema de toxina-antitoxina (STA) endógeno en elq ue por lo menos un elemento regulador heterólogo puede ligarse operablemente a un gen de toxina, p.ej. de un operón antitoxina-toxina.

Entre los promotores considerados para la utilización en la regulación de los genes de toxina o antitoxina en los eucarióticos pueden incluirse, aunque sin limitación, un promotor inducible tal como un promotor GAL1, MET25, Lys7 o Leu, o un promotor reprimible por tiamina nmtl, un promotor regulable con uracilo (p.ej., Watt et al., PLoS One 3:e1428, 2008) por ejemplo de una levadura u hongo, un promotor Tet-On o Tet-Off, un promotor CYC6 (regulado por cobre), NIT1 (regulado por amonio) o un promotor CA1 (regulado por CO2) de algas (Ferrante et al., PLos one 3:e3200, 2008), así como un Pnr algal (regulado por nitrógeno) (Poulsen y Kroger, FEbS J. 3413-3423, 2005), un promotor de transportador algal de fosfato inorgánico (Wurch et al., Environ. Microbiol. 113: 468-481, 2011) o un promotor regulado por el estado del fosfato, p.ej. un promotor PNP o PSR (Yehudai-Resheff et al., The Plant Cell 19: 1023-1038, 2007). También se consideran para la utilización en la regulación de los genes de antitoxina, los promotores de Nannochloropsis dados a conocer en la solicitud de patente US, en tramitación con la presente, n° 13/486,930, titulada "Promoters and Terminators for Use in Eukaryotic Cells", presentada el 1 de junio de 2012. Se consideran específicamente los promotores de genes que es conocido que están regulados bajo condiciones particulares, p.ej. el estado de nutrientes y los promotores de sus ortólogos en otras especies. Por ejemplo, un gen de una especie algal puede utilizarse para identificar su ortólogo en una segunda especie algal y el promotor del gen en la segunda especie puede aislarse y someterse a ensayo para su regulación en respuesta, por ejemplo, a la disponibilidad de nutrientes.

El promotor puede ser un promotor que es funcional en una célula eucariótica y puede ser un promotor que es sensible al agotamiento de uno o más nutrientes del medio de crecimiento. Por ejemplo, puede inducirse el promotor al alcanzar las células, que pueden ser, por ejemplo, algas eucarióticas, la limitación de nitrógeno. Entre los ejemplos de promotores que pueden ser inducidos por limitación de nitrógeno se incluyen, aunque sin limitación, los

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promotores de nitrato reductasa (Poulsen y Kroger, FEBS J. 272: 3413-3423, 2005), los promotores génicos de amonio o de transportador de amonio (ver, por ejemplo, Wurch et al., Environ. Microbiol. 13: 468-481, 2011), los transportadores de glutamina sintetasa (p.ej. Miller et al., Plant Physiology 154: 737-52, 2010) u otros promotores de genes regulados positivamente al nivel de transcripción durante el ayuno de nitrógeno, incluyendo los dados a conocer en la presente memoria y proporcionados como SEC ID n° 56, SEC ID n° 57, SEC ID n° 58, SEC ID n° 59, SEC ID n° 60 y SEC ID n° 61, o fragmentos activos de los mismos. El promotor puede, alternativa o adicionalmente, regularse mediante agotamiento de fosfato, un promotor génico de PNPasa (Yehudai-Reseheff et al., The Plant Cell 19: 1023-1038, 2007), un promotor génico de transportador de fosfato inorgánico (Wurch et al., Environ. Microbiol. 13: 468-481, 2011) o un promotor génico de fosfato permeasa (p.ej. SEC ID n° 65). Entre los promotores candidatos regulados por el agotamiento de cobre se incluyen los genes de transportador de ion cobre de tipo CTR (Castruita et al., The Plant Cell 23: 1273-1292, 2011), así como los promotores algales CYC6 y CPX1 (Quinn et al., J. Biol. Chem. 275: 6080-6089, 2000). Entre los promotores regulados por la deficiencia de hierro pueden incluirse, por ejemplo, el gen FOX1 o el gen FTR1 (La Fontaine et al., Eukaryotic Cell 1: 736-757, 2000).

Un promotor utilizado para regular un gen de toxina o antitoxina en un eucariótica también puede ser un promotor sintético, por ejemplo un promotor que incluye un dominio de unión a ADN que puede ser reconocido y unirse a un factor de transcripción manipulado que se sitúe cadena arriba de un promotor mínimo que es operable en el microorganismo huésped. El microorganismo puede incluir un gen exógeno codificante de un factor de transcripción sintético que se une al promotor sintético. El factor de transcripción sintético puede incluir, además de un dominio de unión a ADN que reconoce el promotor sintético, un dominio de activación (p.ej. VP16, CREB, GAL10 o GCN4) y un dominio regulador, en el que el dominio regulador puede unirse a uno o más compuestos que pueden añadirse al medio de cultivo para inducir o reprimir la transcripción (Weber y Fussenegger, Curr. Opinion in Chem. Biol. 15: 414420, 2011).

En microorganismos procarióticos, pueden utilizarse secuencias reguladoras para alterar la expresión génica de los STA endógenos. Tal como se utiliza en la presente memoria, un STA "endógeno" de un microorganismo se refiere a un STA que es nativo del microorganismo, mientras que un gen "exógeno", por ejemplo, se refiere a un gen que ha sido introducido en el microorganismo (y/o su progenitor) mediante intervención humana. El término "homólogo" se refiere a la misma especie, mientras que "heterólogo" se refiere a una molécula de ácidos nucleicos o proteína de una especie diferente. Un promotor o elemento regulador génico "heterólogo", sin embargo, se refiere a un promotor o elemento regulador ligado operablemente a un gen al que el promotor o elemento regulador no se encuentra operablemente ligado de manera natural. "Ligamiento operable" es un ligamiento funcional entre dos secuencias de ácidos nucleicos, de manera que el elemento regulador y la secuencia ligada, que típicamente es una secuencia que codifica una proteína y/o ARN funcional (p.ej. un ARN antisentido o ARNdc). Por lo tanto, un promotor se encuentra en ligamiento operable con un gen de toxina en el caso de que pueda mediar en la transcripción del gen de toxina. En particular, en algunas realizaciones, puede insertarse un elemento regulador heterólogo descrito en la presente memoria en el genoma del microorganismo procariótico cadena arriba de un gen de toxina. En algunas realizaciones adicionales, un elemento regulador heterólogo insertado puede situarse adicional o alternativamente cadena abajo del gen de antitoxina.

Un elemento regulador puede ser, por ejemplo, un promotor, un intensificador y/o un terminador transcripcional. En particular, según algunas realizaciones de la presente invención, un elemento regulador operablemente ligado al gen de toxina descrito en la presente memoria puede comprender un promotor que puede dirigir la expresión del gen de toxina.

Con el fin de insertar un elemento regulador heterólogo cadena arriba del gen de toxina de un operón STA endógeno, p.ej. entre el gen de antitoxina y el gen de toxina que, en muchos casos, presenta un solapamiento de secuencias corto (p.ej. de uno a diez nucleótidos), puede diseñarse un constructo de recombinación homóloga que puede incluir, en tándem, el extremo 3' del gen de antitoxina, el elemento regulador heterólogo que puede incluir un promotor y el extremo 5' del gen de toxina, en donde el solapamiento génico antitoxina/toxina puede de hecho repetirse en cualquiera de los dos lados de la secuencia de elemento regulador heterólogo de manera que, en el constructo de integración, la región reguladora (p.ej. el promotor) puede encontrarse entre genes completos separados de antitoxina y toxina, lo que a continuación puede reflejarse en la organización del operón STA manipulado en el genoma del huésped. En este caso puede encontrarse presente dicha estructura en el genoma del huésped después de la recombinación homóloga. Además, puede insertarse opcionalmente un terminador en el lado 3' del gen de antitoxina (y 5' respecto al promotor heterólogo ligado operablemente al gen de toxina). De acuerdo con lo anterior, en algunas realizaciones, el elemento regulador que comprende un promotor indicado anteriormente puede comprender además un terminador transcripcional cadena arriba del promotor, de manera que el terminador transcripcional puede ligarse operablemente a un gen de antitoxina cadena arriba del gen de toxina. El terminador puede inhibir/bloquear ventajosamente la transcripción inapropiada del gen de toxina. Por ejemplo, uno de los terminadores adecuados puede ser el terminador de transcripción rpoCt aislado a partir del plásmido pHBA 102rpoCt (Squires, Nucleic Acid Res. 9:6827-6839, 1981). Entre los ejemplos adicionales de posibles terminadores se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, psbA, psaAB, rbc, secA, la proteína de cubierta de T7, rrnB y similares, y combinaciones de los mismos.

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Según la invención, el promotor descrito en la presente memoria puede ser un promotor inducible o un promotor regulable, es decir, un promotor que media en la transcripción de un gen operablemente ligado en respuesta a un estímulo particular, p.ej. mediante inducción, represión y/o desrepresión. A menos que se indique lo contrario, los términos "inducción", "inducido", "inductor" y similares tal como se utilizan en la presente memoria también se entiende que incluyen "desrepresión", "desreprimido", "desrepresor" y similares. La actividad del promotor inducible puede regularse con uno o más factores reguladores de promotor. Dichos factores pueden incluir factores que por su presencia pueden garantizar la expresión del gen codificante de una proteína toxina y/o antitoxina o pueden, alternativamente, incluir factores que pueden suprimir la expresión del gen de manera que su ausencia causa la expresión del polipéptido.

Diversos factores pueden afectar/regular la actividad del promotor. De esta manera, la expresión del gen codificante de una proteína toxina y/o antitoxina puede estar determinada por el cultivo celular, por las condiciones ambientales y/o por el estado fisiológico de las células. La expresión "estado fisiológico de las células" se refiere a factores tales como la densidad celular y la etapa de crecimiento de las células.

Según la invención, un promotor en algunas realizaciones puede estar regulado por factores reguladores del promotor, tales como la presencia o ausencia de una sustancia química o compuesto en el cultivo celular o medio externo, es decir, puede encontrarse presente fuera de las condiciones de cultivo confinadas. En algunas realizaciones, el promotor descrito en la presente memoria puede estar regulado por las condiciones físicas en el medio, tales como la temperatura prevalente y/o otros factores físicos (p.ej. la intensidad de la luz en el medio). Por ejemplo, en diversos sistemas de confinamiento contemplados en la presente memoria, el gen codificante de la proteína toxina y/o un constructo antisentido de antitoxina puede expresarse en el caso de que determinada sustancia química/compuesto, presente en un primer cultivo/medio celular en el que se propaga la célula, se encuentra ausente de un segundo medio en el que no resulta deseable el crecimiento de la célula y/o en el caso de que un factor requerido para el crecimiento y/o la supervivencia de la célula ya no se encuentra presente y/o en el caso de que el factor es uno que, al empobrecerse/agotarse de un medio de la célula, resulta en la expresión de una toxina activa y/o constructo antisentido antitoxina. El promotor que regula la transcripción del gen codificante del polipéptido citotóxico y/o secuencia antisentido antitoxina puede adicional o alternativamente resultar activado en un segundo medio de la célula, p.ej. por una sustancia/compuesto químico que no se encuentra presente en un primer medio de la célula pero que se encuentra presente en el segundo medio en cantidades suficientes para activar el promotor. Más adicional o alternativamente, el promotor puede activarse mediante un cambio de temperatura, tal como un cambio de una temperatura más alta en un primer medio, p.ej. un recipiente de fermentación, a una temperatura más baja predominante en un segundo medio exterior, y/o mediante un cambio de intensidad de luz, de manera que el promotor puede resultar activado en presencia de luz de suficiente intensidad pero puede permanecer inactivo bajo condiciones de cultivo estándares en las que la luz es menos intensa y/o en las que las células no se encuentran suficientemente expuestas (continuamente) a la luz de suficiente intensidad.

En realizaciones en las que se utilice más de un constructo de expresión génica de toxina, operón STA endógeno manipulado y/o constructo antisentido de antitoxina, pueden utilizarse múltiples promotores (por lo menos uno de los cuales y/o todos los cuales son heterólogos), en los que los promotores pueden resultar inducidos/regulados por diferentes compuestos o condiciones. De esta manera, pueden diseñarse en el microorganismo, sistemas de respaldo para controlar la proliferación celular. Por ejemplo, un primer gen de toxina endógeno de un operón STA puede ligarse operablemente a un promotor inducido por la ausencia de un nutriente de cultivo, un segundo gen de toxina exógeno puede ligarse operablemente a un promotor heterólogo inducido por la presencia de un metal y/o compuesto orgánico, y un constructo antisentido génico de antitoxina puede encontrarse regulado por un promotor sensible a la intensidad luminosa elevada. De esta manera, pueden contemplarse diversas combinaciones de promotores heterólogos, genes de toxina endógenos y exógenos, y constructos antisentido de antitoxina.

En el caso de promotores regulables químicamente, la sustancia química o compuesto, la presencia o ausencia del cual puede determinar la activación del promotor puede seleccionarse convenientemente de entre fuentes de carbono y/o nitrógeno, metabolitos, aminoácidos, nucleósidos, bases purinas y/o pirimidinas, iones metálicos o similares, o combinaciones de los mismos. En particular, la sustancia química/compuesto descrita en la presente memoria puede ser un azúcar, un ácido orgánico, un ácido graso, un lípido, un hidrocarburo, fosfato, nitrato, amonio, un metal, un compuesto detector de quórum, una proteína o péptido sintetizado/secretado o cualquier combinación de los mismos. En el caso de que la sustancia química o compuesto sea una que, en caso de hallarse presente, suprima la actividad del promotor, preferentemente comprende o es una sustancia presente raramente a concentraciones a las que la actividad del promotor resultará suprimida al liberar las células al medio natural. Un ejemplo de dicho promotor es el promotor trp que se encuentra reprimido en presencia de triptófano en el medio celular pero que se encuentra desreprimido en ausencia de cantidades suficientes de triptófano en el medio. Un sistema de confinamiento según la invención utilizando el promotor trp u otro promotor regulado de la misma manera podría comprender, por lo tanto, una cantidad de triptófano en un primer medio, tal como un recipiente de fermentación, suficiente para reprimir el promotor en dicho medio, desreprimiéndose el promotor, sin embargo, al liberar la célula del primer medio a un segundo medio, p.ej. el medio externo, que habitualmente contiene cantidades muy bajas de triptófano o nada de triptófano en absoluto.

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Entre otros promotores útiles aislados a partir de operones bacterianos se incluyen los promotores inducibles por L- arabinosa, incluyendo los contenidos en el plásmido pBAD (Guzman, J. Bacteriol. 177:4121-30, 1995). Sin adición de L-arabinosa al medio de cultivo, el promotor pBAD típicamente se encuentra completamente desactivado. Sin embargo, en presencia de L-arabinosa, puede inducirse una transcripción fuerte. Dicho promotor particular es reprimible mediante la adición de glucosa al medio de cultivo. De esta manera, mediante la adición de glucosa, la transcripción a partir de pBAD puede inhibirse y/o desactivarse rápida y eficientemente. El efecto de represión con glucosa puede ser epistático respecto al efecto inductor por la L-arabinosa. Por lo tanto, en el caso de que las células con un plásmido portador de pBAD se cultivan en un medio que contiene tanto L-arabinosa como glucosa, el promotor típicamente no resulta inducido. Sin embargo, en el caso de que el crecimiento celular agote la glucosa del medio, el promotor generalmente resultará inducido por un agotamiento suficiente. Por lo tanto, dicho plásmido puede resultar adecuado para activar y desactivar condicionalmente la expresión de un gen, en particular un gen codificante de toxina tal como se describe en la presente memoria. En algunas especies, puede resultar necesario introducir el gen araC en el microorganismo huésped para la expresión regulada a partir del promotor pBAD. En algunas especies, puede resultar deseable introducir un gen transportador de L-arabinosa en el microorganismo huésped para permitir la expresión regulada a partir del promotor pBAD.

La invención puede utilizar métodos para contener células microbianas en las que las células que incluyen un gen de toxina y/o un constructo antisentido bajo el control de un promotor puede ser suprimible por un primer tipo de compuesto químico e inducible por un segundo tipo de compuesto químico, de manera que, en el caso de que primer tipo de compuesto se agote en el medio, el promotor puede resultar inducido por el segundo tipo de compuesto.

Otro ejemplo de un promotor regulable, la activación del cual puede determinarse mediante una sustancia química/compuesto, es el promotor lac que es inducible, p.ej. por isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG). Entre los ejemplos adicionales de promotores regulables pueden incluirse, aunque sin limitación, un promotor tet (p.ej. la patente US n° 5.851.796), un promotor trp, un promotor híbrido que incluye una o más partes de un promotor tet, trp o lac. Las secuencias de promotor pueden proceder de cualquier organismo, con la condición de que sean funcionales en el organismo huésped. Los promotores regulables pueden utilizar una o más partes/dominios de los promotores anteriormente indicados y/o otros promotores regulables fusionados con por lo menos una parte de un promotor diferente que puede funcionar en el organismo huésped, p.ej. confiriendo inducibilidad a un promotor que puede operar en la especie huésped.

Puede utilizarse una diversidad de promotores que funcionan en un microorganismo procariótico, entre ellos, aunque sin limitación, promotores lac, tac y trc, así como derivados, tales como, aunque sin limitación, los promotores trcE y trcY que son inducibles por la adición de isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG), promotores que se encuentran naturalmente asociados a genes de resistencia a antibióticos transportados por transposón y/o cromosoma bacteriano (p.ej. neomicina fosfotransferasa, cloranfenicol acetiltransferasa, espectinomicina adeniltransferasa o similares, o combinaciones de los mismos), promotores asociados a diversos genes bacterianos heterólogos y cianobacterianos nativos, promotores de virus y fagos, promotores sintéticos o similares, o combinaciones de los mismos. Entre los ejemplos de dichos promotores pueden incluirse, aunque sin limitarse a ellos, promotores aislados a partir de cianobacterias, tales como los siguientes: secA (secreción; controlada por lo menos en parte por el estado redox de la célula), rbc (operón Rubisco), psaAB (proteínas de centro de reacción PSI; reguladas por la luz), promotor NtcA, glnA o glnB, y psbA (proteína D1 de PSII, inducible por la luz). Entre otros ejemplos pueden incluirse promotores regulados por compuestos de nitrógeno, tales como, por ejemplo, los promotores nar, ntc, nir o nrt. Entre los ejemplos adicionales pueden incluirse los promotores pho y/o pst regulados por fosfato, y un promotor nrs sensible al níquel. Los promotores para la utilización en cianobacterias pueden adicional o alternativamente modificarse respecto a los promotores naturales y pueden incluir combinaciones de promotores naturales, incluyendo, aunque sin limitación, los dados a conocer en la presente memoria. Entre los ejemplos todavía adicionales, pueden incluirse promotores procarióticos de un abanico de especies, incluyendo especies eubacterianas y cianobacterianas, tales como, por ejemplo, un promotor Pm, un promotor ara, un promotor rha, un promotor nir, un promotor nar, un promotor pho, un promotor tet, un promotor cys, un promotor metalotioneína, un promotor ftf, un promotor gln, un promotor de choque térmico, un promotor inducible por frío, un promotor vírico o similar, o una combinación de los mismos. Las listas anteriores son ejemplares y no limitativas.

Además, tal como se ha indicado anteriormente, el promotor regulable puede estar regulado por la temperatura predominante en el medio de una célula que contiene el gen codificante de la proteína toxina y/o antitoxina y un promotor regulable que regula la expresión del gen. En dicho caso, la regulación del promotor puede obtenerse ventajosamente por la presencia en la célula de un gen codificante de un represor sensible a la temperatura para el promotor. Como ejemplo típico, los promotores A, incluyendo los indicados anteriormente, pueden estar regulados por un represor Acl sensible a la temperatra que también puede expresarse en la célula huésped.

La presente invención en algunas realizaciones se refiere a un microorganismo procariótico que contiene un elemento regulador heterólogo operablemente ligado a un gen de toxina de un STA endógeno, en el que el elemento regulador comprende un primer promotor que dirige la expresión del gen de toxina y un segundo promotor que dirige la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos codificante de un oligonucleótido antisentido que se hibrida con una parte del gen de antitoxina del STA endógeno. En algunas realizaciones, dicho segundo promotor puede estar

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situado cadena abajo del gen de antitoxina. En diversas realizaciones, el segundo promotor de la presente invención puede estar regulado por el mismo compuesto o un compuesto diferente como promotor que dirige la expresión del gen de toxina. Por ejemplo, un promotor puede estar regulado por la presencia de un inductor, tal como un metal, mientras que otro promotor puede estar regulado por la falta de un nutriente, tal como fosfato o amonio.

La presente invención se refiere además a un microorganismo procariótico que contiene un elemento regulador heterólogo operablemente ligado a un gen de toxina de un sTa endógeno, en el que el elemento regulador comprende un promotor bidireccional que puede dirigir la expresión del gen de toxina y la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos codificante de un oligonucleótido antisentido que puede hibridarse con una parte del gen de antitoxina del STA endógeno. Mediante la utilización del promotor bidireccional, la toxina puede encontrarse regulada estrechamente y simultáneamente puede expresarse el oligonucleótido antisentido, regulando de esta manera la expresión del gen de antitoxina.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "promotor bidireccional" se refiere a un promotor capaz de dirigir la transcripción tanto en la orientación directa como inversa. Los promotores bidireccionales pueden dirigir la transcripción de dos transcritos situados en cualquier orientación (es decir, cadena abajo o cadena arriba) del promotor simultáneamente (p.ej., las cadenas de "sentido" y "antisentido" de un gen). En otras palabras, un promotor bidireccional puede dirigir la transcripción de cualquiera de las cadenas de la región del promotor, tal como, por ejemplo, el promotor fepD-ybdA de E. coli, que, en presencia de la proteína codificada por el gen fur, puede estar regulada por hierro (J. Bacteriol. 183: 2059-2070, 2001). El promotor bidireccional puede ser un promotor bidireccional natural o un promotor unidireccional y/o polar natural que puede convertirse en un promotor bidireccional, por ejemplo mediante el método mostrado en Xie, Nature Biotechnology 19:677-679, 2001.

Debido a que pueden existir diferencias en las secuencias de promotor de los géneros y/o cepas de microorganismos procarióticos, tales como, por ejemplo, especies de cianobacterias, los promotores no se encuentran limitados a las secuencias de promotores particulares especificados en la presente memoria pero pueden incluir promotores que, en diversas especies, incluyendo una especie huésped de la invención, pueden estar operablemente ligadas a un gen codificante de la misma proteína regulada por un promotor ejemplar descrito en la presente memoria.

Oligonucleótidos antisentido

La presente invención se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos codificante de un oligonucleótido antisentido que se hibrida con un gen de antitoxina de un STA endógeno. Según la invención, la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos codificante de un oligonucleótido antisentido que puede hibridarse con por lo menos una parte del gen de antitoxina puede regular la expresión del gen de antitoxina. En particular, la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos codificante de un oligonucleótido antisentido que puede hibridarse con por lo menos una parte del gen de antitoxina puede inhibir y/o bloquear la expresión de la proteína antitoxina.

En una realización, un ARN antisentido se refiere a un ácido nucleico que presenta una identidad sustancial o completa respecto a un gen diana. La secuencia del ARN antisentido puede corresponder al gen diana de longitud completa o a una subsecuencia del mismo.

La secuencia de ácidos nucleicos codificante de un oligonucleótido antisentido según algunas realizaciones de la presente invención puede hibridarse con un gen de antitoxina de un STA endógeno tal como se indica en la presente memoria, incluyendo, aunque sin limitación, los genes de antitoxina codificantes de un polipéptido con actividad de antídoto que es un elemento de la familia de la antitoxina HicB, de la familia de la antitoxina PemI, de la familia de la antitoxina CcdA, de la familia de la antitoxina RelB, de la familia de la antitoxina MazE, de la familia de la antitoxina ParD, de la familia de la antitoxina RHH, de la familia de la antitoxina ArsR, de la familia de la antitoxina HEPN, de la familia de la antitoxina Phd, de la familia de la antitoxina VapB, de la familia de la antitoxina epsilón, de la familia de la antitoxina HipB, de la familia de la antitoxina HigA, de la familia de la antitoxina HTH, de la familia de la antitoxina de tipo MJ1172 o de la familia de la antitoxina StbD/axe. Adicional o alternativamente, la secuencia de ácidos nucleicos codificante de un oligonucleótido antisentido según la presente invención puede hibridarse generalmente con un gen de antitoxina que es un homólogo (p.ej. un análogo) de axe, phd, mazE, hicB, vapB, pemI, relB, parD, kiS, ccdA, yafN, stbD, yoeM o PIN

Tal como se utiliza en la presente memoria, un "oligonucleótido antisentido" se refiere en particular a una secuencia de ácidos nucleicos, p.ej. un ribonucleótido, de por lo menos una parte de la cadena no codificante de una molécula de ADN de doble cadena de un gen que codifica una proteína, o a una secuencia sustancialmente homóloga respecto a por lo menos una parte de la cadena no codificante. Tal como se utiliza en la presente memoria, una secuencia antisentido puede ser complementaria a la secuencia de la cadena codificante de por lo menos una parte de una molécula de ADN de doble cadena codificante de una proteína. No se requiere que la secuencia antisentido sea complementaria a la parte codificante de la cadena codificante de la molécula de ADN o incluso complementaria únicamente a la parte codificante de la cadena codificante de la molécula de ADN. En algunas realizaciones, la secuencia antisentido puede ser complementaria total o parcialmente respecto a secuencias especificadas en la cadena transcrita de una molécula de ADN codificante de una proteína, por ejemplo una región 5' no traducida

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(UTR, por sus siglas en inglés) y/o intrón. El término "complementario", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un concepto amplio de complementariedad de secuencia de subunidad entre dos ácidos nucleicos, p.ej. dos moléculas de ADN. En el caso de que una posición nucleótida en ambas moléculas se encuentra ocupada por nucleótidos normalmente capaces de apareamiento de bases entre sí, se considera que los ácidos nucleicos son complementarios entre sí en esa posición. De esta manera, dos ácidos nucleicos pueden ser complementarios entre sí en el caso de que un número sustancial (p.ej. Por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 98%,por lo menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100%) de las posiciones correspondientes en cada molécula se encuentren ocupadas por nucleótidos que normalmente aparean sus bases entre sí. Los oligonucleótidos antisentido preferentemente son por lo menos 85% complementarios a la secuencia de ácidos nucleicos diana.

Múltiples STA

Un microorganismo procariótico relacionado con algunas realizaciones de la presente invención puede contener dos o más STA endógenos. Por ejemplo, los genomas de Nitrosomonas europaea, Sinorhizobium meliloti y Mycobacterium bovis pueden contener más de 50 STA putativos, mientras que algunos otros contienen menos de tres STA putativos, tales como Rickettsia prowazeki, Campylobacter jejuni o Bacillus subtilis. Además, los genomas de algunas especies cianobacterianas pueden contener un número variable de parejas de STA endógenos, según el análisis de Makarova, Biology Direct 4:19, 2009 (Tabla 1, a continuación).

Tabla 1. Número total de genes codificantes de proteína, genes de toxina, genes de antitoxina y sistemas de toxina____________________antitoxina en genomas de diversas especies cianobacterianas.____________________

Especie

N° de proteínas Genes de toxina y antitoxina detectados N° de parejas de STA

Cyanothece sp. ATCC 51142

5304 306 50

Microcystis aeruginosa NIES-843

6312 524 113

Synechococcus elongatus PCC 6301

2527 56 9

Synechococcus elongatus PCC 7942

2662 68 13

Synechococcus sp. CC9311

2892 27 3

Synechococcus sp. JA-2-3B'a(2-13)

2862 50 1

Synechococcus sp. JA-3-3Ab

2760 47 1

Synechococcus sp. PCC 7002

3186 137 29

Synechococcus sp. WH 7803

2533 18 1

Synechococcus sp. WH 8102

2519 42 11

Synechocystis sp. PCC 6803

3569 175 30

Thermosynechococcus elongatus BP-1

2476 20 1

Gloeobacter violaceus PCC 7421

4430 304 56

Anabaena variabilis ATCC 29413

5661 204 29

Nostoc punctiforme PCC 73102

6690 266 28

Nostoc sp PCC 7120

6130 269 38

Trichodesmium erythraeum IMS101

4451 60 6

Acaryochloris marina MBIC11017

8383 235 32

Sin limitación de la invención a ningún mecanismo particular, los inventores contemplan que la combinación de dos o más STA manipulados puede reducir el riesgo de que una cepa se torne resistente a los efectos de una toxina, por ejemplo mediante la extensión de una mutación que resulta en que una cepa ya no responde al efecto letal del gen/proteína tóxico. Por ejemplo, incluso en el caso de que un STA en un microorganismo experimente una mutación, el otro STA no mutado todavía puede responder al efecto letal del gen/proteína tóxico, ofreciendo de esta manera poca o ninguna ventaja selectiva en términos de supervivencia al microorganismo con una mutación individual. Además, en algunas realizaciones de la exposición, la combinación de dos o más STA puede incrementar la eficiencia de un confinamiento biológico basándose en la combinación de diferentes dianas celulares moduladas por dos o más de los STA en el confinamiento. En algunas realizaciones de la exposición, por lo menos dos de los sistemas de toxina-antitoxina en un microorganismo procariótico manipulado pueden comprender los mismos promotores o promotores diferentes (p.ej. heterólogos) ligados operablemente a los genes de toxina y/o a constructos antisentido de antitoxina de los STA. En algunas realizaciones de la exposición, por lo menos dos de los genes de toxina y/o antitoxina manipulados en un microorganismo procariótico indicado anteriormente pueden ligarse operablemente a diferentes promotores heterólogos que pueden estar regulados por diferentes compuestos y/o condiciones ambientales.

También pueden introducirse múltiples genes exógenos de toxina de tipo II en los microorganismos eucarióticos o procarióticos. Los genes de tipo II exógenos pueden ligarse operablemente al mismo promotor (p.ej. diferentes copias del mismo promotor) o pueden ligarse operablemente a diferentes promotores que pueden estar regulados por las mismas condiciones o condiciones diferentes. Por ejemplo, un primer gen de toxina de tipo II puede

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encontrarse ligado operablemente a un promotor que se encuentra reprimido por la presencia de un compuesto presente en el medio de cultivo, mientras que un segundo gen de toxina de tipo II puede encontrarse ligado operablemente a un promotor activado por agotamiento de un nutriente. Alternativa o adicionalmente, dos o más genes de antitoxina de tipo II pueden encontrarse operablemente ligados a diferentes promotores regulados por agotamiento del mismo nutriente o nutrientes diferentes. Uno, dos o más de los múltiples genes exógenos de toxina de tipo II de un microorganismo manipulado pueden modificarse en su secuencia a fin de excluir secuencias que son diana de una, dos o más toxinas de tipo II codificadas por los múltiples genes de toxina.

Vectores

La expresión "vector de expresión" o "constructo de expresión" se refiere a un ácido nucleico que ha sido generado mediante intervención humana, incluyendo por medios recombinantes y/o síntesis química directa, con una serie de "elementos de control de la expresión" de ácidos nucleicos especificados que pueden permitir la transcripción y/o la traducción de un ácido nucleico particular en una célula huésped. El vector de expresión puede ser un plásmido, una parte de un plásmido, un constructo vírico, un fragmento de ácidos nucleicos o similar, o una combinación de los mismos. Típicamente, el vector de expresión puede incluir un ácido nucleico que debe transcribirse operablemente ligado a un promotor en un casete de expresión. En algunas realizaciones de la exposición, la presente invención puede implicar microorganismos procarióticos transformados con el elemento regulador heterólogo tal como se indica en la presente memoria.

En diversas realizaciones de la exposición, la presente invención se refiere a vectores que incluyen una secuencia de promotor ligada operablemente a una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una toxina y/o a un oligonucleótido antisentido que puede hibridarse con una parte de un gen de antitoxina endógeno de un sistema de toxina-antitoxina. Los vectores pueden ser vectores de integración, por ejemplo con regiones de homología para la integración en el cromosoma del huésped y/o pueden ser vectores de replicación autónoma, tal como episomas. En realizaciones adicionales de la exposición, los vectores pueden incluir secuencias de ácidos nucleicos para la integración en el genoma del huésped que pueden incluir, en el orden siguiente, por lo menos la parte 3' de un gen de antitoxina de un sistema/operón STA endógeno al organismo huésped, un elemento regulador heterólogo y por lo menos la parte 5' de un gen de toxina de un sistema/operón STA.

En algunas realizaciones de la exposición, un gen codificante de una toxina y/o un gen de antitoxina/constructo antisentido puede ser clonado en un vector de expresión para la transformación en un microorganismo.

Según la exposición, un gen codificante de una toxina de un STA puede ser proporcionado en un microorganismo en un sitio en donde puede expresarse eficazmente. De esta manera, en algunas realizaciones útiles, el gen puede encontrarse presente en el cromosoma de las células, mientras que en otras realizaciones preferentemente puede estar situado en un elemento extracromosómico, tal como un plásmido y/o episoma. Los microorganismos según la invención pueden, en algunas realizaciones específicas, no contener un gen codificante de una antitoxina capaz de contrarrestar el efecto tóxico para la célula de la toxina o el equivalente funcional del mismo.

En otras realizaciones útiles de la exposición, el microorganismo puede comprender un gen codificante de una antitoxina que puede unirse a toxinas de la familia de toxina del gen de toxina introducido/endógeno manipulado (y/o el equivalente funcional del mismo), resultando en que el efecto letal de la toxina resulta por lo menos parcialmente contrarrestado.

La invención se refiere además a un vector para introducir un gen de toxina en un microorganismo en el que el vector incluye un gen de toxina y un gen de antitoxina (análogo), en el que el gen de toxina es una parte integrante del vector y el gen de antitoxina se encuentra en una parte no integrante del vector. Dichos genes de toxina y de antitoxina en algunas realizaciones de la invención pueden derivarse de una especie cianobacteriana descrita en la presente memoria. El vector puede incluir además un promotor regulable tal como se indica en la presente memoria, que puede controlar la expresión del gen de toxina.

Alternativamente, en el caso de que el vector no contenga un promotor en ligamiento operable con el gen de toxina, el gen puede transformarse en las células de manera que se vuelva operablemente ligado a un promotor endógeno mediante recombinación homóloga, integración específica de sitio y/o integración del vector. El vector puede incluir adicional o alternativamente un promotor constitutivo para controlar el gen de antitoxina.

Los vectores de transformación pueden incluir adicional o alternativamente un marcador seleccionable, tal como, aunque sin limitación, un gen de resistencia a fármaco, un gen de resistencia a herbicida, un enzima y/o factor metabólico requerido para la supervivencia del huésped (por ejemplo, un marcador auxotrófico) o similar, o una combinación de los mismos. Las células transformadas pueden seleccionarse opcionalmente basándose en la capacidad de crecer en presencia del antibiótico y/o otro marcador seleccionable bajo condiciones en las que las células que no poseen el casete de resistencia y/o marcador auxotrófico no pueden crecer. Además, adicional o alternativamente, puede encontrarse presente un marcador no seleccionable en un vector, tal como un gen codificante de na proteína o enzima fluorescente que puede generar un producto de reacción detectable.

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Un vector puede ser, adicional o alternativamente, un vector de integración que incluye una o más secuencias que estimulan la integración de un gen de interés (es decir, el gen exógeno que debe transformarse en el microorganismo huésped) y/o el casete de expresión génica en el genoma del microorganismo huésped. Por ejemplo, un vector de integración utilizado para transformar cianobacterias puede incluir por lo menos una secuencia de por lo menos 50, por ejemplo de por lo menos 100, de por lo menos 200, de por lo menos 300, de por lo menos 400, de por lo menos 500 o de por lo menos 600 nucleótidos con homología respecto a una secuencia en el genoma del organismo huésped para permitir que ocurra la integración del transgén y/o casete de expresión en el genoma del microorganismo huésped mediante recombinación homóloga. En algunos ejemplos, el transgén y/o casete de expresión puede encontrarse flanqueado por una secuencia homóloga a una región del cromosoma del huésped, por ejemplo para estimular la integración del gen de interés en el cromosoma del huésped. Alternativa o adicionalmente, un vector de integración puede incluir una o más secuencias que estimulan la recombinación específica de sitio y/o la integración aleatoria, tal como, aunque sin limitación, (secuencias reconocidas por) una recombinasa, integrasa y/o transposasa.

Para la expresión óptima de una proteína recombinante, en muchos casos puede resultar beneficioso utilizar secuencias codificantes que producen ARNm con codones utilizados preferentemente por la célula huésped que debe transformarse. De esta manera, para una expresión incrementada de los transgenes, el uso de los codones del transgén puede corresponderse con el sesgo de codones específico del organismo en el que se desea que se exprese el transgén. Por ejemplo, se describen métodos de recodificación de genes para la expresión en microalgas, en la patente US n° 7.135.290. Los mecanismos exactos que subyacen a este efecto se cree que son múltiples pero podrían incluir el equilibrio correcto de pools de ARNt aminoacilados disponibles con las proteínas que se sintetizan en la célula, acoplados con una traducción más eficiente del ARNm transgénico al satisfacerse dicha necesidad. En algunas realizaciones de la exposición, sólo puede cambiarse una parte de los codones para reflejar un uso de codones preferente de un microorganismo huésped, y en algunas realizaciones, puede cambiarse uno o más codones por codones que no son necesariamente el codón más preferente del microorganismo huésped codificante de un aminoácido particular. Se encuentra disponible información adicional para la optimización de codones por ejemplo en la base de datos de uso de codones de GenBank.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la presente invención puede relacionarse, en algunas realizaciones, con microorganismos recombinantes transformados con una molécula de ácidos nucleicos aislada tal como se indica en la presente memoria que incluye una secuencia de ácidos nucleicos de codones optimizados para la expresión en el microorganismo recombinante.

Pueden introducirse vectores en los microorganismos, tales como microalgas y cianobacterias, mediante técnicas convencionales de transformación y/o transfección. Los términos transformación y transfección, conjugación y transducción, tal como se utilizan en el presente contexto, pretenden comprender una multiplicidad de métodos conocidos por el experto en la materia para la introducción de ácidos nucleicos foráneos (por ejemplo ADN exógeno) en una célula huésped, incluyendo la coprecipitación con fosfato de calcio y/o cloruro de calcio, la transfección mediada por DEAE-dextrano, la lipofección, la competencia natural, la transferencia mediada químicamente, la electroporación o el bombardeo con partículas, o similar, o combinaciones de los mismos. Pueden encontrarse ejemplos de métodos adecuados para la transformación y/o transfección de células huésped, p.ej., en Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2010.

Por ejemplo, pueden transformarse microorganismos, incluyendo cianobacterias y microalgas, mediante cualesquiera métodos adecuados, incluyendo, a modo de ejemplos no limitativos, la incorporación natural de ADN (Zang, J. Microbiol. 45:241-245, 2007), la conjugación, la transducción, la transformación con perlas de vidrio (Feng, Mol. Biol. Rep. 36:1433-9, 2009), la transformación con fibras de carburo de silicio (Dunahay, Methods Mol. Biol. 62:503-9, 1997), biolística (Kroth, Methods Mol. Biol. 390:257-267, 2007), electroporación (Ludwig, Appl. Microbiol. Biotechnol. 78:729-35, 2008), transformación mediada por láser (documento n° WO2009/140701), incubación con ADN en presencia de o después del tratamiento con cualquier dendrímero de poli(amidoamina) (Pasupathy, Biotechnol. J. 3:1078-82, 2008), polietilenglicol (Ohnuma, Plant Cell Physiol. 49:117-120, 2008), lípidos catiónicos (Muradawa, J. Biosci. Bioeng. 105:77-80, 2008), dextrano, fosfato de calcio y/o cloruro de calcio (Mendez-Alvarez, J. Bacteriol. 176:7395-7397, 1994), opcionalmente después del tratamiento con enzimas degradantes de la pared celular (Perrone, Mol. Biol. Cell 9:3351-3365, 1998), o similares, o combinaciones de los mismos. La transformación mediada por Agrobacterium puede llevarse a cabo, adicional o alternativamente, en células de algas, por ejemplo tras eliminar o romper la pared celular del alga (Kumar, Plant Sci. 166:731-738, 2004).

Microorganismo recombinante

Los microorganismos recombinantes relacionados con la presente invención, en algunas realizaciones de la exposición, pueden transformarse con genes exógenos mediante la introducción de los vectores apropiados descritos en la presente memoria. En particular, la presente invención en algunas realizaciones puede referirse a un microorganismo recombinante que comprende una molécula de ácidos nucleicos exógena que incluye una secuencia de ácidos nucleicos codificante de un gen de toxina operablemente ligado a un promotor heterólogo. En algunas realizaciones relacionadas con la invención, el gen de toxina puede ser una "ARN interferasa" o endonucleasa que puede cortar el ARN en o en proximidad a secuencias de reconocimiento particulares, y la

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secuencia del gen de toxina puede diseñarse (optimizarse para sus codones) de manera que el gen de toxina no incluya secuencias que, al ser transcritas en ARN, son susceptibles de degradación por la toxina. Por ejemplo, en realizaciones de la exposición que utilizan un gen pemK, la secuencia del gen puede modificarse respecto a los codones a fin de minimizar y/o eliminar las secuencias UAH, en donde H puede ser C, A o U. En determinadas realizaciones de la exposición, puede utilizarse un gen mazF y la secuencia ACA puede evitarse mediante la utilización de codones alternativos. En realizaciones adicionales de la exposición, puede introducirse un gen axe en el microorganismo huésped y puede evitarse la secuencia AUG mediante la utilización de codones alternativos. En realizaciones todavía adicionales, puede introducirse un gen ChpI en el microorganismo huésped y puede evitarse cualquiera de las secuencias ACA, ACG y ACU, en las que pueden utilizarse codones alternativos para reducir la incidencia de dichas secuencias en el gen. Los presentes ejemplos pretenden ser ilustrativos y no limitativos.

Un microorganismo procariótico que incluye una molécula exógena de ácidos nucleicos codificante de una toxina puede incluir preferentemente un gen endógeno de antitoxina, p.ej. en el que la antitoxina resultante de la expresión del gen de antitoxina puede ser análoga a la toxina resultante de la expresión del gen de toxina.

En algunas realizaciones de la exposición, el promotor heterólogo operablemente ligado al gen de toxina exógeno puede estar regulado por un compuesto, por ejemplo un compuesto que puede encontrarse presente en el medio o en el medio, o puede encontrarse regulado por una condición ambiental. La presente invención se refiere además a un microorganismo recombinante que comprende un promotor exógeno operablemente ligado a una secuencia de ácidos nucleicos codificante de un oligonucleótido antisentido que puede hibridarse con por lo menos una parte de un gen de antitoxina endógeno o exógeno del microorganismo. Algunas realizaciones todavía adicionales relacionadas con la invención pueden comprender un microorganismo procariótico que incluye un sistema y/o operón STA manipulado, p.ej. en el que un sistema/operón STA endógeno puede modificarse mediante recombinación homóloga para que incluya un elemento regulador heterólogo entre los genes de toxina y de antitoxina. El elemento regulador heterólogo puede ser un promotor, tal como un promotor regulable, y puede incluir además un terminador transcripcional y/o un segundo promotor o ambos cadena arriba del primer promotor. Un segundo promotor proporcionado en el operón manipulado puede dirigir la transcripción en una dirección contraria a la del primer promotor y puede opcionalmente dirigir la transcripción de una secuencia complementaria a la del gen de antitoxina del sistema y/o operón STA. En todavía otras realizaciones relacionadas con la invención, en particular en las que el operón STA contiene tanto gen de toxina como de antitoxina, el elemento regulador heterólogo puede ser un promotor bidireccional que dirige la transcripción de tanto el gen de toxina como de una secuencia antisentido de antitoxina.

En algunas realizaciones relacionadas con la invención, un microorganismo procariótico puede presentar múltiples STA endógenos y, por ejemplo, puede transformarse con una o más moléculas exógenas de ácidos nucleicos codificantes de una toxina operablemente ligada a un promotor heterólogo y/o uno o más constructos antisentido de antitoxina en donde el microorganismo puede incluir un gen endógeno codificante de la antitoxina. Alternativa o adicionalmente, un microorganismo procariótico puede presentar múltiples operones STA endógenos manipulados, en los que un elemento regulador heterólogo ha sido insertado entre el gen de antitoxina y el gen de toxina de (cada uno) del operón u operones respectivos, tal como se indica en la presente memoria.

La exposición relacionada con la invención en un aspecto describe un microorganismo procariótico, tal como una cianobacteria, que comprende una molécula exógena de ácidos nucleicos que incluye un gen de toxina en el que por lo menos un elemento regulador heterólogo se encuentra operablemente ligado al gen de toxina. Opcionalmente, el gen de toxina puede codificar una ribonucleasa, y en algunas realizaciones, el gen de toxina puede optimizarse para su secuencia de manera que una o más secuencia reconocidas por la toxina sean sustituidas por secuencias que no son dianas de la endorribonucleasa. El microorganismo puede, en algunas realizaciones de la exposición, incluir además un gen de antitoxina endógeno, en el que la antitoxina producida por el gen de antitoxina endógeno puede interactuar con (y típicamente puede inactivar) la toxina producida por el gen de toxina introducido. En dichas realizaciones de la exposición, el confinamiento biológico de la cianobacteria transgénica puede llevarse a cabo mediante inducción y/o permitiendo la transcripción a partir del elemento regulador heterólogo, de manera que puede expresarse el gen de toxina.

La presente exposición en otro aspecto describe un microorganismo procariótico que incluye un operón STA endógeno, en el que el promotor endógeno del operón STA puede sustituirse por un promotor heterólogo y preferentemente regulable. Por ejemplo, el promotor puede ser un promotor inducible o desreprimible, tal como, por ejemplo, cualquiera dado a conocer en la presente memoria.

En realizaciones todavía adicionales, la invención se refiere a un microorganismo procariótico recombinante que incluye una molécula exógena de ácidos nucleicos codificante de una antitoxina operablemente ligada a un promotor heterólogo, en el que el microorganismo procariótico recombinante puede incluir un STA que contiene un gen codificante de una toxina que es análoga a la antitoxina codificada por la molécula exógena de ácidos nucleicos. En realizaciones preferentes relacionadas con la invención, el promotor heterólogo puede ser regulable, por ejemplo inducible y/o reprimible. Adicional o alternativamente, el gen de antitoxina endógeno del STA puede resultar atenuado y/o inactivado, por ejemplo mediante recombinación homóloga.

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En aspectos todavía adicionales, en la presente memoria se da a conocer un microorganismo procariótico recombinante que puede incluir un microorganismo procariótico que comprende un constructo antisentido que incluye una secuencia antisentido que presenta homología respecto a por lo menos una parte de un gen de antitoxina endógeno respecto al huésped. La expresión regulada de la secuencia antisentido puede resultar en la expresión disminuida de la antitoxina endógena, por ejemplo permitiendo la expresión de una toxina análoga endógena.

En todavía otros aspectos, la invención se refiere a un microorganismo procariótico que comprende un sistema endógeno de toxina-antitoxina (STA), en el que por lo menos un elemento regulador heterólogo se encuentra operablemente ligado al gen de toxina del STA endógeno tal como se describe en la presente memoria. El elemento regulador heterólogo puede ser un promotor regulable, en algunas realizaciones de la exposición insertado entre el gen de antitoxina y de toxina de un operón STA. En dichas realizaciones de la exposición, puede proporcionarse un terminador cadena arriba del promotor heterólogo insertado. En realizaciones adicionales o alternativas de la exposición, puede proporcionarse un segundo promotor heterólogo cadena arriba del primer promotor, en el que el segundo promotor puede dirigir la transcripción en una orientación contraria a la del primer promotor y puede, de esta manera, dirigir la transcripción de una secuencia antisentido de antitoxina. Todavía adicional o alternativamente, puede insertarse un promotor bidireccional entre el gen de antitoxina y el gen de toxina de un operón STA, en el que el promotor bidireccional puede dirigir la expresión del gen de toxina y una secuencia antisentido complementaria a por lo menos una parte del gen antisentido.

El término "gen" se utiliza ampliamente para referirse a cualquier segmento de molécula de ácidos nucleicos (típicamente de ADN aunque opcionalmente de ARN) codificante de una proteína o ARN expresado. De esta manera, los genes incluyen secuencias codificantes de ARN expresado (que puede incluir secuencias codificantes de polipéptido) y, con frecuencia, las secuencias reguladoras requeridas para su expresión. Los genes pueden obtenerse a partir de una diversidad de fuentes, incluyendo la clonación a partir de una fuente de interés o mediante síntesis a partir de información de secuencia conocida o predicha y puede incluir secuencias diseñadas para que presenten parámetros deseados.

Una molécula de ácidos nucleicos "recombinante" o "manipulada" es una molécula de ácidos nucleicos que ha sido sintetizada y/o alterada mediante la manipulación humana. A modo de ejemplos no limitativos, una molécula de ácidos nucleicos recombinante: (1) puede incluir secuencias de nucleótidos vinculadas que no se encuentran vinculadas naturalmente, (2) puede haber sido manipulado mediante técnicas de clonación molecular de manera que no presente uno o más nucleótidos con respecto a la secuencia de la molécula de ácidos nucleicos natural, o (3) puede haber sido manipulada mediante técnicas de clonación molecular de manera que presente uno o más cambios o reorganizaciones de la secuencia con respecto a la secuencia de ácidos nucleicos natural. A modo de ejemplos no limitativos, un ADNc es una molécula de ADN recombinante, del mismo modo que cualquier molécula de ácidos nucleicos que ha sido generada por una o más reacciones in vitro de polimerasa, o a la que se han unido conectores, o que ha sido integrada en un vector, tal como un vector de clonación o vector de expresión.

En su aplicación a organismos, los términos recombinante, manipulado y genéticamente manipulado se refieren en conjunto a organismos que han sido manipulados mediante la introducción de una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga o recombinante en el organismo, e incluye desactivaciones génicas, mutaciones dirigidas y sustitución, deleción o inserción de genes, sustitución de promotores, así como la introducción de transgenes y genes sintetizados en el organismo. La molécula de ácidos nucleicos heteróloga y/o recombinante puede integrarse en el genoma del organismo recombinante/manipulado genéticamente o, en otros casos, no integrada en el genoma del organismo recombinante/manipulado genéticamente.

La expresión "proteína recombinante" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una proteína producida mediante manipulación genética.

Un "casete de expresión" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un gen codificante de una proteína o ARN funcional (p.ej. ARNt, microARN, ARN ribosómico, etc.) ligado operablemente a elementos de control de la expresión, tales como un promotor, y opcionalmente, cualquiera o una combinación de otras secuencias de ácidos nucleicos que afectan a la transcripción o traducción del gen, tales como, aunque sin limitación, un terminador transcripcional, un sitio de unión ribosómica, un sitio de procesamiento o una secuencia de reconocimiento del procesamiento, un intrón, un intensificador, una señal de poliadenilación, un sitio interno de entrada ribosómica, etc.

En referencia a una secuencia reguladora génica o a una secuencia de ácidos nucleicos auxiliar utilizada para el mantenimiento o la manipulación de una secuencia génica (p.ej. Una región 5' no traducida, una región 3' no traducida, una secuencia de adición de poli-A, una secuencia de intrón, un sitio de corte y empalme, un sitio de unión ribosómica, una secuencia interna de entrada ribosómica, una región de homología del genoma, un sitio de recombinación, etc.), "heterólogo" se refiere a que la secuencia reguladora o secuencia auxiliar procede de una fuente diferente que la del gen respecto al que la secuencia de ácidos nucleicos reguladora o auxiliar es contigua en un constructo, genoma, cromosoma o episoma. De esta manera, un promotor operablemente ligado a un gen al que no se encuentra operablemente ligado en su estado natural (es decir, en el genoma de un organismo no manipulado

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genéticamente) en la presente memoria se denomina "promotor heterólogo", aunque el promotor puede derivar de la misma especie (o en algunos casos, del mismo organismo) a la que pertenece al gen al que se encuentra ligado.

La expresión "molécula exógena de ácidos nucleicos" o "gen exógeno" se refiere a una molécula de ácidos nucleicos o gen que ha sido introducido ("transformado") en una célula. Una célula transformada puede denominarse célula recombinante, en la que puede introducirse uno o más genes exógenos adicionales. (Un descendiente de una célula que ha sido transformada con una molécula de ácidos nucleicos también se denomina "transformada" en el caso de que haya heredado la molécula exógena de ácidos nucleicos). El gen exógeno puede ser de una especie diferente o haber sido sintetizado (y por lo tanto es "heterólogo") o ser de la misma especie (y por lo tanto es "homólogo") respecto a la célula que se transforma. Una molécula de ácidos nucleicos y/o proteína "endógena" representa la molécula de ácidos nucleicos, gen y/o proteína propia del organismo tal como ocurre, o es producida naturalmente, en el organismo.

El término "heterólogo" se utiliza ampliamente en el presente aspecto para indicar que las moléculas de ácidos nucleicos dadas a conocer en la presente memoria que se introducen en un microorganismo procariótico pueden sintetizarse o derivarse de un organismo diferente de las cianobacterias. Un elemento regulador heterólogo descrito en la presente memoria puede presentar un equivalente en el huésped transformado, es decir, uno que normalmente lleva a cabo la misma función o una función similar, o elemento regulador heterólogo exógeno puede no presentar un homólogo endógeno en la cepa huésped.

Las moléculas de ácidos nucleicos heterólogas respecto a una cepa huésped procariótica pueden ser moléculas de ácidos nucleicos no naturales en las células de este tipo, variedad o especie. En algunas realizaciones, el elemento regulador heterólogo puede comprender una secuencia codificante de, y/o derivada de, un organismo diferente de un microorganismo procariótico.

Los microorganismos o células huésped recombinantes de la invención pueden ser de origen procariótico o eucariótico, incluyendo, aunque sin limitación, hongos, heterocontos, algas, eubacterias, arqueobacterias, bacterias verdes no del azufre, bacterias púrpuras no del azufre o cianobacterias. Las células huésped recombinantes pueden ser, aunque sin limitación, organismos fotosintéticos. Entre los organismos fotosintéticos se incluyen las plantas superiores (es decir, las plantas vasculares), los briofitos, las algas y las bacterias fotosintéticas. El término "alga" incluye cianobacterias (cianofíceas), algas verdes (clorofíceas), algas verde-amarillas (xantofíceas), algas doradas (crisofíceas), algas pardas (feofíceas), algas rojas (rodofíceas), diatomeas (bacilariofíceas) y "picoplancton" (prasinofíceas y eustigmatofíceas). En el término alga se incluyen además elementos de las clases taxonómicas Dinophyceae, Cryptophyceae, Euglenophyceae, Glaucophyceae y Prymnesiophyceae. Las microalgas son algas unicelulares o coloniales que pueden observarse como organismos individuales con ayuda de un microscopio. Entre las microalgas se incluyen algas tanto eucarióticas como procarióticas (p.ej. cianobacterias). Por ejemplo, en la presente memoria se consideran microalgas eucarióticas tales como las especies de Achnanthes, Amphiprora, Amphora, Ankistrodesmus, Asteromonas, Boekelovia, Borodinella, Botryococcus, Bracteococcus, Chaetoceros, Cartería, Chlamydomonas, Chlorococcum, Chlorogonium, Chlorella, Chroomonas, Chrysosphaera, Cricosphaera, Crypthecodinium, Cryptomonas, Cyclotella, Dunaliella, Ellipsoidon, Emiliania, Eremosphaera, Ernodesmius, Euglena, Franceia, Fragilaria, Gloeothamnion, Haematococcus, Halocafeteria, Hymenomonas, Isochiysis, Lepocinclis, Micractinium, Monoraphidium, Nannochloris, Nannochloropsis, Navicula, Neochloris, Nephrochloris, Nephroselmis, Nitzschia, Ochromonas, Oedogonium, Oocystis, Ostreococcus, Pavlova, Parachlorella, Pascheria, Phaeodactylum, Phagus, Picochlorum, Platymonas, Pleurochrysis, Pleurococcus, Prototheca, Pseudochlorella, Pseudoneochloris, Pyramimonas, Pyrobotrys, Scenedesmus, Schizochlamydella, Skeletonema, Spyrogyra, Stichococcus, Tetrachorella, Tetraselmis, Thalassiosira, Viridiella o Volvox.

Un microorganismo según algunas realizaciones adicionales de la presente exposición puede ser un microorganismo procariótico, incluyendo sin limitación, una eubacteria, una arqueobacteria, una cianobacteria o similar. En particular, el microorganismo que incluye un elemento regulador heterólogo operablemente ligado a un gen de toxina de un sistema tóxico-antitóxico endógeno puede ser cualquier microorganismo procariótico. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "microorganismo procariótico" se refiere a un grupo de microorganismos que habitualmente no presenta un núcleo celular o cualesquiera otros orgánulos unidos a membranas. En algunas realizaciones de la exposición, entre los microorganismos procarióticos pueden incluirse, aunque sin limitación, una eubacteria, una arqueobacteria, una bacteria verde no del azufre, una bacteria púrpura no del azufre o una cianobacteria. Según algunas realizaciones de la exposición, el microorganismo huésped puede ser un microorganismo fotosintético. En realizaciones adicionales de la exposición, el microorganismo puede incluir, aunque sin limitación, los géneros de cianobacterias siguientes: Acaryochloris, Agmenellum, Anabaena, Anabaenopsis, Anacystis, Aphanizomenon, Arthrospira, Asterocapsa, Borzia, Calothrix, Chamaesiphon, Chroococcus, Chlorogloeopsis, Chroococcidiopsis, Chroococcus, Crinalium, Cyanobacterium, Cyanobium, Cyanocystis, Cyanospira, Cyanothece, Cylindrospermopsis, Cylindrospermum, Dactylococcopsis, Dermocarpella, Fischerella, Fremyella, Geitleria, Geitlerinema, Gloeobacter, Gloeocapsa, Gloeothece, Halospirulina, Iyengariella, Leptolyngbya, Limnothrix, Lyngbya, Microcoleus, Microcystis, Myxosarcina, Nodularia, Nostoc, Nostochopsis, Oscillatoria, Phormidium, Planktothrix, Pleurocapsa, Prochlorococcus, Prochloron, Prochlorothrix, Pseudanabaena, Rivularia, Schizothrix, Scytonema, Spirulina, Stanieria, Starria, Stigonema, Symploca, Synechococcus, Synechocystis, Tolypothrix, Trichodesmium, Tychonema y Xenococcus.

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Se conocen varias especies de cianobacterias y han sido manipuladas utilizando técnicas de biología molecular, incluyendo las cianobacterias unicelulares Synechocystis sp. PCC6803 y Synechococcus elongates PCC7942, los genomas de las cuales han sido secuenciados por completo.

Métodos de control de la supervivencia de un microorganismo

La invención puede incluir, en aspectos adicionales, un método de control del crecimiento de un microorganismo procariótico, mediante la ejecución de las etapas de introducción en el microorganismo procariótico de una molécula exógena de ácidos nucleicos que codifica una toxina de tipo II, en la que el gen de toxina puede ligarse operablemente a un promotor heterólogo y cultivar el microorganismo bajo condiciones en las que el promotor heterólogo no resulta inducido, en donde la exposición del microorganismo a condiciones bajo las que el promotor resulta inducido puede resultar en una viabilidad reducida y/o un crecimiento deficiente del microorganismo. El gen de toxina puede ser modificado en su secuencia para producir que el transcrito de ARN de la toxina sea insensible a la actividad de toxina endonucleasa codificada. El microorganismo puede ser, por ejemplo, un eucariota o procariota y puede ser un microorganismo fotosintético.

En el caso de que el microorganismo sea un microorganismo procariótico, el microorganismo procariótico en realizaciones preferentes de los métodos puede incluir un gen endógeno que codifica una antitoxina análoga a la toxina codificada por el gen exógeno introducido. En dichos métodos, el microorganismo procariótico puede cultivarse bajo condiciones permisibles en las que el microorganismo puede crecer, mientras que, al alterar una o más condiciones de crecimiento, por ejemplo mediante escape del microorganismo al medio, puede inducirse la expresión de la toxina a partir del promotor heterólogo y el crecimiento/viabilidad del microorganismo puede deteriorarse/reducirse. En algunas realizaciones preferentes, el huésped procariótico es una cianobacteria y la expresión del gen de toxina regulado por un promotor heterólogo puede perjudicar la fotosíntesis. De esta manera, el crecimiento del microorganismo puede restringirse a condiciones de crecimiento particulares que pueden incluir, a modo de ejemplos no limitativos, la presencia de un compuesto particular en el medio, la ausencia de un compuesto particular del medio, un intervalo de temperaturas, pH o salinidad, o grado de intensidad luminosa y/o duración, o una combinación de los mismos.

La presente invención puede referirse además a un método de control del crecimiento de un microorganismo procariótico que comprende un STA endógeno mediante la introducción de un constructo antisentido en el microorganismo procariótico, en el que el constructo antisentido puede incluir una secuencia complementaria respecto a por lo menos una parte de la cadena no codificante de un gen de antitoxina del STA endógeno, y la expresión del constructo antisentido de antitoxina puede estar regulado por uno o más compuestos y/o condiciones ambientales, de manera que el microorganismo procariótico puede presentar una viabilidad reducida y/o un crecimiento deficiente en el caso de que las condiciones de cultivo/ambientales estimulen la expresión del constructo antisentido del gen de antitoxina. Opcionalmente aunque preferentemente, el promotor heterólogo puede estar regulado por un compuesto que puede encontrarse presente (o ausente) del cultivo celular o medio celular y/o por una o más condiciones ambientales, por ejemplo salinidad, pH, temperatura, intensidad luminosa y/o duración de la luz.

En realizaciones en las que la expresión del constructo antisentido de antitoxina reduce la viabilidad y/o deteriora el crecimiento del microorganismo manipulado, la expresión del constructo antisentido de antitoxina puede resultar en la regulación negativa del gen de antitoxina, en el que la regulación negativa del gen de antitoxina puede resultar en una expresión y/o actividad incrementados de la toxina correspondiente (análoga). La expresión "regulación negativa" referido a genes inhibidos por el método antisentido de la invención, se refiere a una disminución del nivel de expresión de uno o más genes en presencia de uno o más constructos antisentido, en comparación con el nivel en ausencia de dicho constructo o constructos de ARN antisentido. La expresión "regulación negativa" se utiliza en la presente memoria para indicar que la expresión del gen diana se reduce en 1% a 100%. Por ejemplo, la expresión puede reducirse en por lo menos aproximadamente 10%, en por lo menos aproximadamente 20%, en por lo menos aproximadamente 30%, en por lo menos aproximadamente 40%, en por lo menos aproximadamente 50%, en por lo menos aproximadamente 60%, en por lo menos aproximadamente 70%, en por lo menos aproximadamente 80%, en por lo menos aproximadamente 90%, en por lo menos aproximadamente 95% o en por lo menos aproximadamente 99%.

La presente invención puede referirse además a un método de control del crecimiento y/o supervivencia de un microorganismo procariótico que incluye un STA de tipo II endógeno, en le que por lo menos un elemento regulador heterólogo puede ligarse operablemente al gen de toxina del STA endógeno. En realizaciones particulares, el elemento regulador heterólogo puede insertarse en el genoma del microorganismo procariótico cadena arriba del gen de toxina del operón. Además, el elemento regulador heterólogo puede incluir un promotor que dirige la expresión del gen de toxina. Además, el elemento regulador heterólogo puede incluir en alguunas realizaciones un terminador transcripcional cadena arriba del promotor. En realizaciones particulares, la inserción de un elemento regulador heterólogo puede realizarse mediante recombinación homóloga en el genoma del huésped. Los métodos pueden comprender una etapa de introducción de por lo menos un elemento regulador heterólogo en el genoma de un microorganismo procariótico, de manera que por lo menos un elemento regulador heterólogo puede ligarse operablemente a un gen de toxina de un sistema/operón STA del microorganismo procariótico. En algunas

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determinadas de dichas realizaciones, la expresión del constructo antisentido de antitoxina puede regularse con uno o más compuestos y/o condiciones ambientales, de manera que el microorganismo procariótico puede presentar una viabilidad reducida y/o un crecimiento deficiente del gen de toxina regulado por el elemento regulador heterólogo.

Opcional aunque preferentemente, el elemento regulador heterólogo, que puede ser o incluir un promotor, puede estar regulado por un compuesto que puede encontrarse presente en el cultivo celular o medio celular y/o por condiciones ambientales, tales como, por ejemplo, salinidad, pH, temperatura, intensidad luminosa y/o duración luminosa. Preferentemente, la expresión del gen de toxina puede inhibir el crecimiento y/o reducir la viabilidad del organismo. En algunas realizaciones preferentes, el huésped procariótico es una cianobacteria y la expresión del gen de toxina regulado por un promotor heterólogo puede perjudicar la fotosíntesis.

En algunas realizaciones de los métodos, el microorganismo puede incluir más e un STA manipulado, tal como se ha descrito anteriormente en la presente memoria, es decir, más de uno de entre cualquiera de: a) un gen exógeno codificante de una toxina (de tipo II) operablemente ligada a un promotor heterólogo, que en algunas realizaciones particulares puede ser un gen de toxina de codones que han sido optimizados para la resistencia a toxinas, b) un constructo antisentido de antitoxina, y c) un sistema/operón STA endógeno manipulado para incluir un promotor heterólogo ligado operablemente al gen de toxina del sistema/operón STA. Puede manipularse un microorganismo procariótico para incluir cualquier combinación de a), b) y/o c). En dichas realizaciones, la cepa huésped procariótica puede cultivarse preferentemente bajo condiciones de confinamiento, en las que no se expresa ninguno de los constructos manipulados.

En dichas realizaciones, los constructos manipulados pueden regularse opcionalmente con diferentes promotores sensibles a diferentes compuestos y/o a diferentes condiciones. Por ejemplo, un gen de toxina endógeno puede ligarse operablemente a un promotor que responde a la intensidad luminosa elevada, mientras que un constructo exógeno que incluye una secuencia antisentido de antitoxina puede responder a niveles bajos de amonio. Un elemento regulador heterólogo operablemente ligado a un gen de toxina de un sistema/operón STA endógeno puede, a modo de ejemplo ilustrativo, responder a un compuesto en el medio de cultivo, por ejemplo níquel. Dichas ilustraciones pretenden ser ilustrativas y no limitativas. En el caso de que el organismo se encuentre fuera del área de crecimiento confinada, puede activarse uno, dos o más sistemas de toxina mediante inducción de un promotor operablemente ligado a un gen de toxina y/o a un constructo antisentido de antitoxina.

En los presentes métodos, el microorganismo procariótico manipulado puede cultivarse bajo condiciones de crecimiento permisibles en las que su crecimiento no resulta perjudicado por la actividad de una toxina, mientras que, al alterar una o más condiciones de crecimiento, por ejemplo mediante escape del microorganismo a un medio externo, el crecimiento del microorganismo puede resultar perjudicado por la actividad de una toxina. De esta manera, el crecimiento del microorganismo puede restringirse a condiciones de crecimiento particulares que pueden incluir, a modo de ejemplos no limitativos, la presencia de un compuesto particular en el medio, la ausencia de un compuesto particular en el medio, la temperatura, el pH, la intensidad luminosa y/o la duración luminosa.

En algunas realizaciones, entre los métodos proporcionados en la presente memoria se incluyen el control del crecimiento y/o la supervivencia de un microorganismo procariótico fotosintético, tal como una cianobacteria. Además, el microorganismo fotosintético procariótico puede mostrar una fotosíntesis deficiente y/o clorosis al exponer al microorganismo a condiciones bajo las que la expresión de por lo menos uno de los genes de toxina (de tipo II) exógena resulta inducida o desreprimida.

En los métodos proporcionados en la presente memoria, la expresión de un gen de toxina y/o la expresión de una secuencia antisentido de antitoxina puede resultar en la inhibición del crecimiento y/o en una viabilidad deficiente del microorganismo procariótico manipulado. En algunas realizaciones preferentes, el huésped procariótico es un microorganismo fotosintético, tal como una cianobacteria, y la expresión de un gen de toxina y/o un constructo antisentido de antitoxina regulado por un promotor heterólogo (incluyendo la expresión mediante un elemento regulador heterólogo en un operón STA manipulado) puede resultar en clorosis y/o fotosíntesis deficiente en el procariota fotosintético manipulado.

La fotosíntesis deficiente puede evaluarse mediante diversos métodos, entre ellos, aunque sin limitación, la evolución de oxígeno, la fijación de CO2 y/o las mediciones de la fluorescencia. Por ejemplo, las mediciones de fluorescencia pueden proporcionar una proporción de fluorescencia variable a máxima ("Fv/Fm") que puede utilizarse para evaluar la salud o deterioro fotosintético, en donde una reducción de Fv/Fm con respecto a una célula o cultivo celular puede ser indicativo de deterioro fotosintético.

Un procariota fotosintético utilizado en los métodos de la invención puede ser una cianobacteria y puede ser, por ejemplo, una especie de Acaryochloris, Agmenellum, Anabaena, Anabaenopsis, Anacystis, Aphanizomenon, Arthrospira, Asterocapsa, Borzia, Calothrix, Chamaesiphon, Chlorogloeopsis, Chroococcidiopsis, Chroococcus, Crinalium, Cyanobacterium, Cyanobium, Cyanocystis, Cyanospira, Cyanothece, Cylindrospermopsis, Cylindrospermum, Dactylococcopsis, Dermocarpella, Fischerella, Fremyella, Geitleria, Geitlerinema, Gloeobacter, Gloeocapsa, Gloeothece, Halospirulina, Iyengariella, Leptolyngbya, Limnothrix, Lyngbya, Microcoleus, Microcystis, Myxosarcina, Nodularia, Nostoc, Nostochopsis, Oscillatoria, Phormidium, Planktothrix, Pleurocapsa,

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Prochlorococcus, Prochloron, Prochlorothrix, Pseudanabaena, Rivularia, Schizothrix, Scytonema, Spirulina, Stanieria, Starria, Stigonema, Symploca, Synechococcus, Synechocystis, Thermosynechocystis, Tolypothrix, Trichodesmium, Tychonema o Xenococcus.

Otro aspecto de la invención se refiere a métodos para producir un producto en un microorganismo procariótico, en el que el microorganismo de producción es manipulado genéticamente para el bioconfinamiento, por ejemplo para el crecimiento limitado a un medio de cultivo contenido y/o restringido. En dichos métodos, el cultivo puede proporcionarse con nutrientes para el crecimiento y/o para la producción de un producto, tal como una o más biomoléculas y las condiciones de cultivo y ambientales pueden ser permisivas del crecimiento del organismo. El microorganismo manipulado puede incluir una o más moléculas exógenas de ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos para la producción de un producto, tal como una biomolécula. En algunas realizaciones de la exposición, el microorganismo procariótico puede manipularse para producir un lípido, hidrocarburo, ácido graso y/o derivado de ácido graso, tal como se da a conocer en, por ejemplo, las publicaciones internacionales n° Wo 2007/136762, n° WO 2008/119082, n° WO 2009/009391, n° WO 2009/076559, n° WO 2010/044960, n° WO 2010/118410, n° WO 2010/126891, n° WO 2011/008535 y n° WO 2011/019858.

La invención se refiere además a métodos para producir un producto en un microorganismo transgénico, incluyendo un sistema de bioconfinamiento tal como se describe en la presente memoria, en el que entre los métodos se incluye cultivar un microorganismo transgénico que contiene por lo menos una molécula exógena de ácidos nucleicos codificante de un gen de toxina de tipo II operablemente ligada a un promotor heterólogo, por lo menos un constructo antisentido de antitoxina y/o por lo menos un sistema/operón STA manipulado, bajo condiciones en las que el microorganismo transgénico produce por lo menos un producto y aislar el producto a partir del microorganismo o del medio de cultivo.

El microorganismo que presenta un sistema de control biológico basado en una toxina de tipo II puede no resultar afectada o afectada mínimamente por la presencia del sistema de control biológico basado en una toxina bajo condiciones de cultivo y ambientales de confinamiento, pero puede mostrar un crecimiento y/o una salud deficientes bajo condiciones de cultivo y/o ambientales de no confinamiento. En algunas realizaciones preferentes, el microorganismo transgénico que presenta un sistema de control biológico basado en una toxina no se divide y/o no es viable bajo condiciones de cultivo y/o ambientales de no confinamiento. En algunas realizaciones preferentes, el microorganismo huésped utilizado para sintetizar un producto es una microalga eucariótica o una cianobacteria, y puede mostrar clorosis y/o una función fotosintética deficiente bajo condiciones de cultivo y/o ambientales de no confinamiento.

Opcionalmente, los métodos pueden incluir proporcionar un compuesto en el medio de cultivo, en el que la presencia del compuesto puede evitar, inhibir y/o reducir la expresión del gen de toxina y/o de un constructo antisentido de antitoxina. Alternativa o adicionalmente, los métodos pueden incluir opcionalmente no proporcionar un compuesto en el medio, en el que la ausencia del compuesto puede evitar, inhibir y/o reducir la expresión del gen de toxina y/o de un constructo antisentido de antitoxina. Todavía adicional o alternativamente, los métodos pueden incluir opcionalmente proporcionar condiciones de cultivo bajo las que la expresión del gen de toxina y/O de un constructo antisentido de antitoxina puede reducirse y/o eliminarse. En dichas realizaciones, que pueden utilizarse en combinación, en particular aunque no exclusivamente en las que el microorganismo transgénico incluye más de un constructo de toxina y/o más de un constructo antisentido de antitoxina, con un microorganismo que crece bajo condiciones de cultivo confinadas puede crecer y/o producir un producto, aunque bajo condiciones no controladas, uno o más genes de toxina y/o uno o más constructos antisentido de antitoxina probablemente se expresarán y las células, de esta manera, probablemente morirán.

Según la presente invención, entre los métodos de cultivo descritos en mayor detalle en la presente memoria pueden incluirse la inducción de transcripción a partir del promotor heterólogo para expresar el gen de toxina y/o para inducir la transcripción de la secuencia de ácidos nucleicos codificante de un oligonucleótido antisentido que puede hibridarse con por lo menos una parte de un gen de antitoxina endógeno, bajo condiciones en las que la proliferación del microorganismo puede resultar no deseable. La inducción de la transcripción puede incluir la adición de un nutriente/compuesto al medio de cultivo, la eliminación de uno o más componentes del medio de cultivo, el incremento o reducción de la luz y/o temperatura, y/o otras manipulaciones que pueden estimular la expresión del gen de interés. Dichas manipulaciones pueden depender en gran medida de la naturaleza del promotor heterólogo tal como se ha indicado anteriormente.

El cultivo se refiere a potenciar deliberadamente el crecimiento (p.ej. incremento de tamaño celular, de contenido celular y/o de la actividad celular) y/o la propagación (p.ej. incremento del número de células, tal como mediante mitosis) de uno o más microorganismos celulares mediante la utilización de condiciones seleccionadas y/o controladas. La combinación de tanto crecimiento como propagación puede denominarse proliferación. Entre los ejemplos no limitativos de condiciones seleccionadas y/o controladas pueden incluirse la utilización de un medio definido (con características conocidas, tales como el pH, la fuerza iónica y/o la fuente de carbonos), una temperatura especificada, la tensión de oxígeno, los niveles de dióxido de carbono, el crecimiento en un biorreactor o similar, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el microorganismo puede cultivarse heterotróficamente, utilizando una fuente de carbono reducida, o mixotróficamente, utilizando tanto luz como una

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fuente de carbono reducido. Adicional o alternativamente, el microorganismo puede cultivarse fototrópicamente. En el cultivo fototrópico, el microorganismo puede utilizar ventajosamente la luz como fuente de energía. Una fuente de carbono inorgánico, tal como CO2 o bicarbonato, puede utilizarse para la síntesis de biomoléculas por el microorganismo. La expresión "carbono inorgánico", tal como se utiliza en la presente memoria, incluye compuestos que contienen carbono o moléculas que no pueden ser utilizadas como fuente de energía sostenible por un organismo. Típicamente, el "carbono inorgánico" puede encontrarse en forma de CO2 (dióxido de carbono), ácido carbónico, sales bicarbonato, sales carbonato, sales hidrogenocarbonato o similares, o como una combinación de los mismos, los cuales no pueden oxidarse adicionalmente para obtener energía sostenible ni ser utilizadas como fuente de poder reductor por organismos. En el caso de que se proporcione una molécula o compuesto de carbono orgánico en el medio de cultivo de un microorganismo cultivado fototrópicamente, generalmente no puede ser incorporado y/o metabolizado por la célula para obtener energía y/o típicamente no se encuentra presente en cantidad suficiente para proporcionar energía sostenible para el crecimiento del cultivo celular.

Los microorganismos que pueden resultar útiles de acuerdo con los métodos de la presente invención pueden encontrarse en diversas localizaciones y entornos en todo el mundo. Sin restringirse a ninguna teoría en particular, se observa que, tal vez como consecuencia de su aislamiento de otras especies y/o su divergencia evolutiva, el medio de cultivo particular para el crecimiento óptimo y la generación de productos de interés puede variar. En algunos casos, determinadas cepas de microorganismos podrían ser incapaces de crecer en un medio de cultivo particular debido a la presencia de algún componente inhibidor o la ausencia de algún requisito nutricional esencial requerido por la cepa particular de microorganismo.

Se encuentran generalmente disponibles medios de cultivo sólidos y líquidos de una amplia diversidad de fuentes, al igual que instrucciones para la preparación de medios particulares adecuados para una amplia diversidad de cepas de microorganismos. Por ejemplo, entre diversos medios de agua dulce y de agua salada pueden incluirse los indicados en Barsanti, Algae: Anatomy, Biochemistry & Biotechnology, CRC Press, 2005, como medios y métodos de cultivo de algas. Las recetas de medios algales también pueden encontrarse en los sitios web de diversas colecciones de cultivos algales, incluyendo, a modo de ejemplos no limitativos, la UTEX Culture Collection of Algae (sbs.utexas.edu/utex/media.aspx); la Culture Collection of Algae and Protozoa (ccap.ac.uk/media/pdfrecipes); y la Katedra Botaniky (botany.natur.cuni.cz/algo/caup-media.html).

En algunas realizaciones de la presente invención, los microorganismos recombinantes pueden cultivarse en un biorreactor. El término "biorreactor" se refiere a un recinto o recinto parcial en el que se cultivan las células, opcionalmente en suspensión y, en suspensión, preferentemente en un líquido acuoso. El biorreactor puede utilizarse para cultivar células (microalgales) a través de las diversas etapas de su ciclo fisiológico. Los biorreactores pueden ofrecer muchas ventajas para la utilización en los métodos de crecimiento y propagación heterotrófica. Para producir biomasa para la utilización en alimentos, los microorganismos preferentemente se fermentan en grandes cantidades en líquido, tal como en cultivos en suspensión a título de ejemplo. Los biorreactores, tales como los fermentadores de acero, pueden contener volúmenes de cultivo muy grandes (pueden utilizarse biorreactores de más de 40.000 litros de capacidad en diversas realizaciones de la invención). Los biorreactores también pueden permitir típicamente el control de una o más condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH, la tensión de oxígeno, los niveles de dióxido de carbono y similares, así como combinaciones de los mismos. Los biorreactores típicamente pueden ser configurables, por ejemplo utilizando puertos unidos a tubos, para permitir que componentes gaseosos tales como CO2, aire enriquecido en CO2, oxígeno y/o nitrógeno, entren en contacto con (p.ej. mediante burbujeo) un cultivo líquido. Otros parámetros de cultivo, tales como el pH del medio de cultivo, la identidad y/o la concentración de elementos traza y/o nutrientes, la identidad y/o concentración de otros constituyentes del medio, o similares, o combinaciones de los mismos, típicamente pueden ser más fácilmente manipulados utilizando un biorreactor.

Las células pueden, adicional o alternativamente, cultivarse en un biorreactor dotado de una fuente de luz artificial, es decir, un "fotobiorreactor", que puede presentar una o más paredes suficientemente transparentes a la luz, incluyendo la luz solar, para permitir, facilitar y/o mantener un crecimiento aceptable de los microorganismos.

Todavía adicional o alternativamente, los microorganismos fotosintéticos manipulados genéticamente pueden cultivarse en estanques, canales, zanjas, pistas, canales o similares, o combinaciones de los mismos. Respecto a los biorreactores estándares, puede suministrarse al cultivo una fuente de carbono inorgánico (tal como, aunque sin limitación, CO2, bicarbonato, sales de carbonato y similares), incluyendo, aunque sin limitación, aire, aire enriquecido en CO2, gases de escape o similares, o combinaciones de los mismos. Al suministrar gas de escape y/o otras fuentes inorgánicas que pueden contener CO además de CO2, puede resultar necesario pretratar dichas fuentes de manera que el nivel de CO introducido en el (foto)biorreactor no constituya una dosis peligrosa y/o letal para el crecimiento y/o supervivencia de los microorganismos.

La invención puede referirse además a métodos de introducción de un gen de toxina en un microorganismo mediante la transformación de un vector que comprende un gen de toxina y un gen de antitoxina (análogo) correspondiente en el microorganismo, en el que el gen de toxina puede integrarse en una parte integrada del vector y el gen de antitoxina puede encontrarse en una parte no integrada del vector. En particular, dichos genes de toxina y de antitoxina en algunas realizaciones pueden derivarse de una especie cianobacteriana tal como se indica en la

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presente memoria. El vector puede incluir además un promotor regulable que puede controlar el gen de toxina y/o un promotor constitutivo que puede controlar el gen de antitoxina. Tal como se utiliza en la presente memoria, un "promotor constitutivo" se refiere a un promotor no regulado que puede permitir la transcripción continua de su gen (análogo).

Se entenderá que en el presente contexto, la expresión "equivalente funcional" incluye variantes y/o derivados de cualquiera de las toxinas/antitoxinas indicadas en la presente memoria, las secuencias de las cuales pueden haber sido modificadas mediante sustitución, deleción o adición de uno o más aminoácidos, y el producto génico del cual puede haber conservado por lo menos parte de la función del producto génico de la secuencia no modificada.

Producción de lípidos e hidrocarburos

Un microorganismo recombinante que incluye una toxina manipulada, antitoxina o sistema/operón de toxina- antitoxina tal como se da a conocer en la presente memoria puede manipularse para la síntesis de lípidos y/o hidrocarburos, por ejemplo para la producción de biocombustibles. El microorganismo manipulado puede ser, en realizaciones particulares, un microorganismo fotosintético, tal como una especie cianobacteriana. En algunas realizaciones, un microorganismo huésped que presenta un sistema de bioconfinamiento manipulado basado en un sistema de toxina-antitoxina puede incluir un gen exógeno de tioesterasa y/o lipasa para la producción de ácidos grasos libres y/o derivados de ácidos grasos (tal como, por ejemplo, un alcohol graso, un éster de cera, un alcano y/o un alqueno). En el caso de que se produzca uno o más ácidos grasos (en forma de ácidos o sales de ácidos) por lo menos algunos (p.ej. una mayoría, o más de 50% en peso, y en algunas realizaciones preferentes, por lo menos 95% en peso o por lo menos 99% en peso) de los ácidos grasos puede presentar ventajosamente una longitud de cadena de acilo de entre 8 y 24 carbonos.

Una tioesterasa exógena expresada en el microorganismo huésped puede ser, por ejemplo, una acil-ACP tioesterasa (tal como, por ejemplo, cualquiera dada a conocer en las patentes US n° 5.455.167, n° 5.654.495 o n° 5.455.167 o las solicitudes publicadas de patente US n° 20009/0298143 o n° 2011/0020883), una acil-CoA tioestearasa (p.ej. Un gen codificante de la TesA o TesB tioesterasa de E. coli o una variante de la misma, por ejemplo una acil-CoA tioesterasa tal como, aunque sin limitación, una variante tal como se da a conocer en la publicación de patente PCT n° WO2010/076483) y/o una hidroxilbenzoil tioesterasa.

Adicional o alternativamente a proporcionar un sistema de expresión para uno o más genes recombinantes apropiados, tal como genes de tioesterasa y/o de lipasa, pueden realizarse modificaciones adicionales en el microorganismo que ha sido manipulado para el bioconfinamiento tal como se indica en la presente memoria. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un microorganismo manipulado genéticamente que contiene un gen de toxina recombinante, un gen de antitoxina y/o un constructo antisentido de antitoxina y/o un sistema/operón endógeno de toxina-antitoxina manipulado para incluir por lo menos un promotor heterólogo operablemente ligado, puede incluir una o más moléculas de ácidos nucleicos codificantes de acil-CoA reductasa, ácido carboxílico reductasa y/o acil- ACP reductasa. Todavía adicional o alternativamente, el microorganismo fotosintético manipulado genéticamente puede producir un alcohol graso y puede incluir por lo menos una molécula de ácidos nucleicos codificante de una acil-CoA reductasa, ácido carboxílico reductasa y/o acil-ACP reductasa y/o un aldehído graso reductasa. Todavía más adicional o alternativamente, el microorganismo fotosintético manipulado genéticamente de la invención descrita puede producir un éster de cera y puede incluir una o más moléculas de ácidos nucleicos codificantes de una acil-CoA reductasa, ácido carboxílico reductasa y/o acil-ACP reductasa, y una cera sintasa. Entre los ésteres de cera se incluyen una cadena A y una cadena B (de acilo) unidas mediante un enlace éster, uno o ambos posiblemente derivados de un ácido graso y/o un derivado de ácido graso generado por una proteína de dominio de factor de transcripción. Los ésteres de cera producidos por un microorganismo transgénico, incluyendo una molécula de ácidos nucleicos codificante de una proteína de dominio de factor de transcripción puede, por lo tanto, presentar longitudes de la cadena A de, por ejemplo, 8 a 24 carbonos y longitudes de la cadena B de, por ejemplo, 8 a 24 carbonos. Adicional o alternativamente, los ésteres de cera sintetizados por el microorganismo huésped fotosintético pueden presentar longitudes de cadena A+B de 16 a 48 carbonos, por ejemplo de 16 a 36 carbonos, de 16 a 32 carbonos o de 24 a 32 carbonos.

En otras realizaciones adicionales o alternativas, el microorganismo fotosintético que incluye un sistema/operón de toxina-antitoxina manipulado tal como se da a conocer en la presente memoria puede producir un alcano y/o alqueno y puede incluir por lo menos una molécula de ácidos nucleicos codificante de una ácido graso descarboxilasa y/o una aldehído graso descarbonilasa exógena, opcionalmente incluyendo además por lo menos una molécula de ácidos nucleicos codificante de una acil-CoA reductasa, una ácido carboxílico reductasa y/o una acil-ACP reductasa. Los alcanos y alquenos producidos por un microorganismo fotosintético que incluye una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína de dominio de factor de transcripción puede presentar longitudes de cadena de 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 y/o 23 carbonos, p.ej. Con longitudes de cadena de 7, 9, 11, 13, 15 y/o 17 carbonos, longitudes de cadena de 7, 9, 11, 13 y/o 15 carbonos, o longitudes de cadena de 11, 13 y/o 15 carbonos.

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Adicionalmente, un microorganismo manipulado genéticamente que produce un alcohol graso, aldehído graso, éster de cera, alcano y/o alqueno puede incluir opcionalmente una molécula de ácidos nucleicos codificante de una acil- Co sintetasa.

Un microorganismo manipulado genéticamente que incluye por lo menos un gen de toxina para el bioconfinamiento también puede ser un microorganismo, tal como, aunque sin limitación, una microalga, manipulada para la biosíntesis de lípidos, y/o puede incluir, por ejemplo, un gen exógeno codificante de una acetil-CoA carboxilasa, una malonil ácido graso sintasa de tipo 1, una subunidad de ácido graso sintasa de tipo 2, una beta cetoacil-ACP sintasa, una malonil-CoA-malonil-ACP aciltransferasa, una acil-ACP tioesterasa, una acil-CoA tioesterasa, una 4- hdiroxibenzoil tioesterasa, una acil reductasa formadora de alcohol, una cera sintasa, una aldehído descarbonilasa, una ácido graso descarboxilasa, una lipasa, una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, una acil-CoA sintetasa, una fosfolípido diacilglicerol aciltransferasa, una glicerol-3-fosfato aciltransferasa, una ácido lisofosfatídico aciltransferasa, una ácido fosfatídico fosfatasa, una diacilglicerol aciltransferasa o una deshidrogenasa. Por ejemplo, el microorganismo puede manipularse para producir triglicéridos.

Sin descripción adicional, se cree que un experto ordinario en la materia puede, utilizando la descripción anterior y los ejemplos ilustrativos a continuación, llevar a cabo y utilizar la presente invención y poner en práctica los métodos reivindicados. Los ejemplos de trabajo siguientes, por lo tanto, señalan específicamente realizaciones representativas de la presente invención, algunas preferentes, y no deben interpretarse como limitativas en modo alguno del resto de la exposición.

Ejemplos

Los Ejemplos a continuación han sido incluidos para proporcionar una guía para el experto ordinario en la materia para la práctica de realizaciones representativas de la materia dada a conocer en la presente memoria. A la luz de la presente exposición y el nivel general del experto en la materia, éste apreciará que los Ejemplos a continuación pretenden ser ejemplares únicamente y que pueden realizarse numerosos cambios, modificaciones y/o alteraciones sin apartarse del alcance de la materia dada a conocer en la presente memoria.

Ejemplo 1: expresión de genes de antitoxina en microorganismos procarióticos

Se identificaron operones STA en especies cianobacterianas mediante la identificación de parejas génicas en la que los dos genes estuviesen orientados en tándem y en proximidad muy estrecha, en las que por lo menos uno de los genes se anotó como toxina o antitoxina ("culpa por asociación"). Por ejemplo, el marco de lectura abierta anotada como toxina vapC en el genoma de Anabaena PCC 7120 se encontró en el mismo locus que otro ORF inmediatamente cadena arriba y solapante del codón de inicio de vapC en 8 pares de bases (el diagrama de la configuración del operón se encuentra disponible en genome.kazusa.or.jp/cyanobase). Se infirió que lo anterior era un operón STA debido a que la asociación de los genes era estrecha y el pequeño tamaño de oRf (300 a 400 pb) se correlacionaba con toxinas y antitoxinas caracterizadas anteriormente.

Además de la identificación de componentes de STA dentro del genoma de Anabaena, se llevaron a cabo análisis en el genoma de la cianobacteria Synechococcus PCC 7942. Las búsquedas con BLAST identificaron un operón STA putativo que presentaba componentes axe/txe. El ORF de txe (Synpcc_7942_1207) se anota como tal, mientras que el gen cadena arriba (Synpcc_7942_1208) se anotó putativamente como una "proteína de prevención de muerte del huésped". Las similitudes de secuencia respecto a las proteínas axe de E. coli y de cianobacteria sugiere que dicho oRf es en efecto la antitoxina axe. El gen axe de Synechococcus PCC 7942 se encuentra presente en un operón axe/txe, CON el gen axe predicho solapante del codón de inicio de txe en 7 pares de bases. Tal como se observa en otros operones STA, el pequeño tamaño de los dos ORF (511 pb) se correlaciona con el tamaño esperado de un operón STA. (Esta región del genoma incluye además por lo menos un operón antitoxina-toxina adicional, que incluye Synpcc_7942_1204 (anotado como "proteína de prevención de muerte del huésped") y Synpcc_7942_1204 (anotado como "proteína hipotética") que pertenecen a la familia de la toxina VapC PIN.

Dichas secuencias genómicas se utilizaron para diseñar cebadores para clonar los operones, además de otros genes de toxina y de antitoxina de tres operones STA predichos de Synechococcus pCc 7942 y Anabaena PCC 7120. Se diseñaron cebadores directos cadena arriba (UF, por sus siglas en inglés) e inversos internos (IR, por sus siglas en inglés) para clonar dichos genes de toxina y antitoxina cianobacterianos (Tabla 2).

Tabla 2. Cebadores utilizados para clonar componentes de STA de Synechoccus PCC 7942 y Anabaena PCC 7120.

Cebador UF PCC7942-axe

atgaaagttgtttccttcagtgacgcca (SEC ID n° 25)

Cebador IR PCC7942-axe

ttacgcatctaatagatttcgctcgactg (SEC ID n° 26)

Cebador UF PCC7942-fxe

atgcgtaagctggcttggacaaac (SEC ID n° 27)

Cebador IR PCC7942-fxe

ttaatcgctgtagtggtagcgaca (SEC ID n° 28)

Cebador UF PCC7942-phd

gtgcgggtgaacctgaattttgaaag (SEC ID n° 29)

Cebador IR PCC7942-phd

tcatgcccgccgcccagtatca (SEC ID n° 30)

Cebador UF PCC7942-doc

atgagctttgtgttggatgtctcactg (SEC ID n° 31)

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Cebador IR PCC7942-doc

ttaggtcggcagtaacgtaactcc (SEC ID n° 32)

Cebador UF PCC7120-mazE

atgacaacagttgtagctaaatggggaaac (SEC ID n° 33)

Cebador IR PCC7120-mazE

ctaccaagcttcattccccacag (SEC ID n° 34)

Cebador UF PCC7120-mazF

gtgaagccgccttactttcccaata (SEC ID n° 35)

Cebador IR PCC7120-mazF

ctataaaattaatgtttcgagttttgcttgtacttct (SEC ID n° 36)

Los fragmentos de ADN correspondientes a las antitoxinas axe (SEC iD n° 13; secuencia de proteína SEC ID n° 14), phd (SEC ID n° 15; secuencia de proteína SEC ID n° 16), mazE (SEC ID n° 17; secuencia de proteína SEC ID n° 18), hicB (SEC ID n° 19; secuencia de proteína SEC iD n° 20), vapB (SEC ID n° 21; secuencia de proteína SEC ID n° 22) y pemI (SEC ID n° 23; secuencia de proteína SEC ID n° 24) (también denominados "represores") se subclonaron en el vector pTrc-His inducible con IPTG (Invitrogen, Carlsbad, CA) y éste se transformó en células TOP10F (Invitrogen). Se utilizaron colonias individuales para inocular cultivos en Lb líquidos y se cultivaron durante la noche a 30°C en presencia de 50 pg/ml de carbenicilina. A la mañana siguiente, se midió la DO600 de los cultivos y las células se reinocularon en cultivos por duplicado (7 en total, incluyendo los vectores de sólo vector pTrc-His). Los cultivos se cultivaron hasta una DO600 de 0,3 (aproximadamente 2,5 horas) y se añadió IPRG hasta una concentración final de 1 mM. Los cultivos se dejaron incubar y se midió la DO600 tras una, dos, cuatro y seis horas de la inducción. Se muestran los resultados en la figura 1, que demuestra que la adición de IPTG a las células que alojaban componentes de STA no presentó un impacto negativo sobre el crecimiento celular durante el curso temporal. No pudieron detectarse las antitoxinas en el análisis en gel de poliacrilamida y la tinción en cualquier punto del curso temporal; sin embargo, lo anterior probablemente se debe a la elevada producción de antitoxinas cuando no se encuentran unidas a sus toxinas correspondientes, mediada por la proteasa Lon. Dicha premisa se vio apoyada por los datos de RT-PCR que mostraba la transcripción de los genes de antitoxina en E. coli.

Ejemplo 2: inhibición del crecimiento celular en E. coli mediante la expresión inducida de la pemK endorribonucleasa

Se inocularon dos clones de E. coli portadores del gen de toxina (codificante de pemK etiquetado con FLAG, SEC ID n° 37) y dos clones portadores del gen de antitoxina (codificante de pemI etiquetado con FLAG, SEC ID n° 38) junto con un clon con un control de vector vacío (vector pBAD), en 20 ml de LB-Kan (50 pg/ml) y se cultivaron durante la noche a 30°C. La línea celular utilizada era E. coli TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Al día siguiente, se registraron mediciones de DO600 de los cultivos y estos se diluyeron a DO600 de 0,1 en 20 ml de LB-Kan 50 fresco por triplicado (15 tubos en total). Se añadió arabinosa hasta un volumen final de 0,2% en el tiempo cero. Los cultivos se incubaron a 30°C con lecturas de DO600 registrados durante un periodo de tiempo de 5 horas.

Tal como se observa en la figura 2, la expresión inducida por arabinosa de ambos clones de toxina pemK causó un defecto del crecimiento bacteriano que se inició aproximadamente 2-3,5 horas después de la adición, mientras que los clones pBAD y pemI no mostraron ningún efecto sobre el crecimiento celular. Estos resultados sugieren que el ADNc de MAE58160 (pemK) es en efecto una toxina y antagoniza el crecimiento celular, mientras que MAE58150 (pemI) no muestra ningún efecto discernible sobre el crecimiento bacteriano durante el curso del presente ensayo.

Ejemplo 3: análisis de transferencia western de la expresión de proteína pemIK en células TOP10.

Durante el curso del experimento indicado anteriormente, se recogieron muestras de 1 ml de cada clon (6 en total, incluyendo el control negativo de lacZ) en el tiempo 0 y 4 horas después de la adición de arabinosa a fin de verificar que las proteínas de toxina y antitoxina se expresaban en las células. Se recolectaron las células mediante centrifugación a 14.000 rpm durante 5 minutos. A continuación, se separó el sobrenadante y se congelaron los pellets celulares a -20°C durante la noche. Al día siguiente, se añadieron 100 pl de tampón de muestras de SDS al 5% a las muestras de tiempo cero, mientras que se añadieron 150 pl de tampón para muestras a las muestras de 5 horas. Se resuspendieron los pellets mediante pipeteado repetido y después se calentaron durante 5 minutos a 95°C. Tras el calentamiento, las muestras se dejaron enfriar hasta la temperatura ambiente, después se agitaron con vórtex vigorosamente durante 30 segundos para romper el ADN genómico. Los insolubles se peletizaron a partir de las muestras mediante centrifugación a 14.000 rpm durante 1 min. Se cargaron 5 pl de cada muestra en un gel de gradiente Bis-Tris al 4-12% (Invitrogen) y se separaron las proteínas mediante electroforesis. A continuación, las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF y se bloqueó la membrana con BSA al 5% en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Seguidamente la membrana se sometió a anticuerpo primario anti-FLAG (Sigma, St. Louis, MO) a una dilución de 1:2.000 durante la noche a 4°C. La membrana se lavó con PBS durante 1 hora (4 lavados) a la mañana siguiente y después se sometió a solución de anticuerpo secundario antiratón conjugado con AP (Invitrogen) durante 1 h a temperatura ambiente. La membrana se lavó nuevamente durante 1 h en total con 1x PBS (4 lavados). La membrana se reveló mediante adición de reactivo NBT/BCIP (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 5 minutos y después se lavó repetidamente con agua.

No se observó ninguna inmunorreactividad anti-FLAG en el tiempo 0, inmediatamente antes de la adición de arabinosa, mientras que tras 4 h, en los clones pemI y pemK se observaron bandas reactivas de anti-FLAG en aproximadamente los pesos moleculares para la antitoxina (9 kDa) y la toxina (13 kDa). Estos resultados apoyan los datos de que la expresión de la proteína pemK en efecto era responsable del defecto de crecimiento observado y que, aunque se expresaba la proteína pemI, no presentó efectos deletéreos sobre el crecimiento bacteriano.

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Ejemplo 4: expresión de la toxina PemK.

Fragmentos de ADN utilizados en el presente estudio:

Se clonó una región de 1,2 kb de la secuencia de factor de transcripción/promotor araC-pBAD (SEC ID n° 39, renombrada "pARA") mediante PCR de colonias a partir de E. coli cepa ER2508 (región genómica 70.048 a 71.265). Se generaron los dos brazos de homología de RS-1 (RS-1 "arriba" (SEC ID n° 40) y RS-1 "abajo" (SEC ID n° 41)) del genoma de Synechocystis mediante amplificación por PCR a partir del plásmido KF01. Los ADNc de ccdA (SEC ID n° 42; secuencia de proteína SEC ID n° 43) y ccdB (SEC ID n° 44; secuencia de proteína SEC ID n° 45) de E. coli se generaron mediante amplificación por PCR de ADN sintéticos (utilizando el ensamblaje de ultrámeros y minigenes, respectivamente).

Los ADNc de las tres metacaspasas cianobacterianas se generaron mediante amplificación por PCR de ORF predichos a partir de preparaciones de ADN genómico procedentes de una cepa de Leptolyngbya propietaria ("metacaspasa 1", SEC ID n° 46; proteína, SEC ID n° 47); Anabaena sp. ("Metacaspasa 2", SEC ID n° 48; proteína, SEC ID n° 49) y Synechocystis sp. PCC 6803 ("metacaspasa 3", SEC ID n° 50; proteína, SEC ID n° 51). Las versiones etiquetadas con FLAG del gen pemI (SEC ID n° 52), gen pemK (SEC ID n° 53) y un operón codificante de los genes de antitoxina y toxina pemIK (SEC ID n° 54) se generaron mediante amplificación por PCR a partir de genes sintéticos de codones optimizados para la expresión en Synechocystis PCC 6803. Los ADNc para los ORF de control de GFP y YFP se generaron mediante amplificación por PCR a partir de los plásmidos TurboGFP y TurboYFP obtenidos de Evrogen (Moscow, Rusia).

Construcción de los plásmidos:

Se diseñó un vector utilizando el esqueleto de pBR322 unido a dos brazos que comprendían secuencias de homología de RS-1 respecto del genoma de Synechocystis PCC 6803. Se ensambló el plásmido de manera que los brazos de homología flanqueasen las secuencias que contenían un casete de resistencia a canamicina controlado por su promotor nativo (950 pb) y la región de promotor araC de pARA (1,2 kb, SEC ID n° 39) que controlaba la expresión del transgén de la toxina. Se proporcionó el gen de antitoxina correspondiente en la parte no integrante del vector. Sustituyó el gen de resistencia a tetraciclina de pBR322 y se unió al mismo promotor utilizado para controlar el gen de resistencia a tetraciclina en pBR322 (SEC ID n° 55). (Ver la figura 3 para un mapa representativo del plásmido). El gen pemI se encuentra regulado por el promotor tet. En dicho esquema, el ORF de pemI se utiliza como herramienta de clonación para la amplificación del gen pemK en E. coli y la integración en el genoma de Synechocystis únicamente incorpora el casete pARA-pemK situado entre los brazos de homología de RS-1.

Generación de cepas de Synechocystis:

Se generaron cepas transgénicas de Synechocystis mediante un protocolo de transformación natural. Brevemente, los cultivos en fase logarítmica (DO730=0,8) en medio BG-11 se recolectaron y se concentraron 10 veces. Las suspensiones celulares (300 jl) se mezclaron con 800 |jg de ADN plasmídico y se incubaron bajo luz tenue durante 5 h a 30°C en presencia de 1% de CO2. A continuación, las suspensiones celulares se extendieron sobre un filtro sobre una placa de ágar BG-11 no selectiva y se dejó que se recuperasen durante la noche a 30°C bajo luz tenue. Al día siguiente, se transfirieron los filtros a una placa de BG-11 fresca que contenía 20 jg/ml de canamicina y después se incubaron durante 9 días adicionales a 30°C con 1% de CO2. Tras 10 días, se recolectaron las colonias de los filtros y se sembraron en placas de BG-11 frescas con 20 jg/ml de canamicina y se dejaron bajo incubación hasta acumular una biomasa suficiente para llevar a cabo el cribado. Se identificaron los clones y se seleccionaron basándose en la presencia de una señal de PCR específica de un gen obtenida mediante cribado por PCR de colonias utilizando la mezcla RedTaq JumpStart (Sigma). Se utilizaron los clones positivos para iniciar cultivos líquidos en BG-11 en presencia de 20 jg/ml de canamicina.

Ensayo de placa de 24 pocillos de muerte celular inducida en Synechocystis:

Con el fin de demostrar la muerte celular inducible y/o los defectos de crecimiento en cianobacterias, las cepas de Synechocystis transformadas con los componentes de dos sistemas de toxina-antitoxina de cianobacterias y bacterias se sometieron a ensayo para un fenotipo de defecto del crecimiento con la expresión inducida por L- arabinosa de genes de muerte celular putativos en un ensayo de placa multipocillo.

Tabla 3. Lista de cepas de Synechocystis PCC 6803 GMO transformadas con vectores de integración en el sitio de RS-1 con el promotor de pARA que controla proteínas fluorescentes, toxinas o parejas de toxina-antitoxina.

ID de cepa

ID de plásmido Descripción del plásmido

PH-SGI-E-0601

pSGE05152 pARA-GFP

PH-SGI-E-0599

pSGE05144 pARA-pemK-FLAG + pTet-pemI

PH-SGI-E-0600

pSGE05151 pARA- pemK -FLAG (Microcystis aeruginosa)

PH-SGI-E-0602

pSGE05153 pARA- metacaspasa 1-FLAG (Leptolyngbya)

PH-SGI-E-0603

pSGE05154 pARA-metacaspasa 2-FLAG (Anabaena)

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PH-SGI-E-0604

pSGE05155 pARA-metacaspasa 3-FLAG (Synechocystis)

PH-SGI-E-0606

pSGE05157 pARA-pemlK (Microcystis aeruginosa)

PH-SGI-E-0605

pSGE05156 pARA-YFP

PH-SGI-E-0598

pSGE05081 pARA-ccdB-FLAG (E. coli)

PH-SGI-E-0607

pSGE05158 pARA-ccdB-FLAG + pTet-ccdA

Se midieron las densidades ópticas de los cultivos y se diluyeron los cultivos hasta una DO730 de 0,1 en BG-11 + H20, BG-11 + L-arabinosa al 1% o BG-11 + L-arabinosa al 2%. Todos los cultivos sometidos a ensayo se incubaron en presencia de 20 pg/ml de canamicina y el volumen final fue de 1 ml. Se incubaron los cultivos a 3o°C con 1% de CO2 con 180 pE de luz y se agitaron a 150 rpm.

Seis días después de la adición de vehículo o L-arabinosa, los cultivos se inspeccionaron visualmente y se puntuó la reducción de color (clorosis), indicativa de una reducción anormal de clorofila, como indicativa de la muerte celular o de un defecto del crecimiento. Tal como se esperaba, las cepas que alojaban el casete de expresión pARA-GFP o pARA-YFP (PH-SGI-E-0602, PH-SGI-E-0605) aparentemente no resultaron afectadas negativamente por la adición de L-arabinosa o la expresión de la proteína fluorescente. Además, las tres cepas transformadas con los tres genes putativos de metacaspasa cianobacteriana (PH-SGI-E-0603, plásmido psGE05153; PH-SGI-E-0603, plásmido pSGE05154 y PH-SGI-E-0604, plásmido pSGE05155) no mostraron defectos de crecimiento en presencia de L- arabinosa al puntuarlas visualmente para clorosis. Sin embargo, las cepas de Synechocystis PCC 6803 transformadas con toxina pemK sola (PH-SGI-E-0600, plásmido pSGE05151) o con los genes pemK y pemI separados regulados por promotores diferentes (PH-SGI-E-0599, plásmido pSGE05144) o con el apareamiento génico de antitoxina-toxina del operón pemlK (PH-SGI-E-0606, plásmido pSGE05157) mostraron un fenotipo de color verde más pálido al puntuarlas visualmente, demostrando el operón pemIK la reducción más drástica de color. Inesperadamente, ninguna de las cepas que alojaba la toxina ccdB sola o la pareja de toxina-antitoxina ccdB+ccdA en una configuración similar al plásmido pSGE05144 (pemK + pemI) mostró ningún defecto de crecimiento al añadir L-arabinosa, incluso hasta el 2%. Aunque la expresión de ccdB es letal para E. coli, esta toxina no afecta al crecimiento de Synechocystis.

Además de la clorosis observada en la placa, el análisis de las muestras en el microscopio el día seis reveló un defecto morfológico en la cepa que alojaba el casete pARA-pemlK (PH-SGI-E-0606/pSGE05157) que se encontraba presente en el cultivo inducido (L-arabinosa al 2%) y no se observó en las muestras no inducidas de PH-SGI-E- 0606/pSGE05157 o la cepa de control pARA-GFP (PH-SGI-E-0601/pSGE05152) con cualquier tratamiento. El fenotipo observado consistía en una población mixta de células, en la que una mayoría presentaba un incremento del tamaño celular y una acumulación de células que mostraba agrupaciones de tres a cuatro células, mientras que las muestras no inducidas mostraban una distribución homogénea de tamaños y números celulares. Dichos defectos morfológicos no se observaron en ninguna de las metacaspasas de control (GFP/YFP) o en las líneas celulares expresantes de ccdB, ni siquiera en presencia de L-arabinosa al 2%.

Curso temporal de la muerte celular inducida por pemK en Synechocystis:

Basándose en los datos anteriores descritos anteriormente, que sugieren la expresión de la toxina pemK a partir de los resultados con Microcystis de apariencia de clorosis y un supuesto defecto de crecimiento, los presentes inventores decidieron llevar a cabo un experimento más detallado y cuantitativo que comparase únicamente las cepas de Synechocystis que contenían pemK (PH-SGI-E-0599/0600/0606) con la cepa de control de proteína fluorescente PH-SGI-E-0601 (pARA-GFP). Se generaron cultivos escalados (50 ml) en BG-11 con 20 pg/ml de canamicina mediante la incubación a 30°C con 1% de CO2, 180 pE de luz y se agitaron a 150 rpm.

Tabla 4. Lista de cepas de Synechocystis PCC 6803 GMO transformadas con vectores de integración en el sitio de RS-1 con el promotor de pARA que controla proteínas fluorescentes, toxinas o parejas de toxina-antitoxina.

ID de cepa

ID de plásmido Descripción del plásmido

PH-SGI-E-0601

pSGE05152 pARA-GFP

PH-SGI-E-0599

pSGE05144 pARA-pemK + pTet-pemI

PH-SGI-E-0600

pSGE05151 pARA- pemK

PH-SGI-E-0606

pSGE05157 pARA-pemIK

El día 0, se midieron las densidades ópticas de los cultivos y se diluyeron los cultivos hasta una DO730 de 0,3 en BG-11 + H20 o BG-11 + L-arabinosa al 2%. Todos los cultivos sometidos a ensayo se incubaron en presencia de 20 pg/ml de canamicina y el volumen final fue de 50 ml. Se incubaron los cultivos a 30°C con 1% de CO2 con 180 pE de luz y se agitaron a 145 rpm. Durante los 8 días, se registró diariamente la DO730 de los cultivos. Además, los cultivos se puntuaron para la apariencia de clorosis y el día final, también se midió Fv/Fm (una medida de la salud fotosintética).

La presencia de L-arabinosa al 2% no presentó ningún efecto negativo sobre la cepa de control PH-SGI-E-0601 al medir el crecimiento a partir de la DO730. Aunque debe indicarse que las tres líneas celulares de pemK mostraban una tasa de crecimiento basal más lenta que las células de control (potencialmente debido a los bajos niveles de

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expresión de toxina durante el crecimiento no inducido), en las cepas PH-SGI-E-0599 ("144" en la figura 4) y PH- sGl-E-0600 ("151" en la figura 5), la adición de L-arabinosa al 2% resultó en una reducción drástica del crecimiento celular durante el curso del experimento en comparación con cultivos no inducidos y líneas celulares de control. En el caso de la cepa PH-SGI-E-0606, no se observó ninguna diferencia de crecimiento entre los cultivos inducidos y no inducidos.

Además, se observó un cambio de color (clorosis) en las cepas expresantes de pemK inducidas con L-arabinosa (PH-SGI-E-0599, -0600 y -0606) con las dos cepas que contenían pemK solo en el genoma (PH-SGI-E-0599 y - 0600), mostrando la reducción más grande de coloración (figura 6). En el presente experimento, la cepa pARA- pemIK (PH-SGI-E-0606) no mostró el mismo grado de clorosis al observado en el experimento con placas de 24 pocillos; sin embargo, ello podría deberse a las diferentes condiciones de crecimiento utilizadas para el experimento de curva de crecimiento a gran escala (50 ml vs. 1 ml), que potencialmente indujo un menor estrés sobre los cultivos de mayor volumen durante el periodo prolongado de crecimiento (8 días). Los cultivos de la línea celular de control que expresaban GFP (PH-SGI-E-0601) crecieron hasta un color verde oscuro, tal como se esperaba, y no resultaron afectadas negativamente por la adición de L-arabinosa al 2%.

Fv/Fm (fluorescencia variable dividida por la fluorescencia máxima, p.ej. Macedo et al., Toxicology InVitro 22:716- 722, 2008) se midió para evaluar la capacidad fotosintética, un indicador de la "salud" fotosintética de las células. Tal como se muestra en la Tabla 5, a continuación, las mediciones de Fv/Fm obtenidas el último día del experimento indicaban que las cepas con manipulación de pemK eran fotosintéticamente defectuosas en comparación con los controles al inducir la expresión de pemK con L-arabinosa al 2%.

Tabla 5. Valores de Fv/Fm para las cepas de Synechocystis PCC 6803 que expresaban la toxina pemK en ____respuesta a la inducción con arabinosa ^ (+) o no inducidas (-) para la expresión de toxina pemK._____

Cepa

0599- 0599+ 0600- 0600+ 0601- 0601 + 0606- 0606+

Fv/Fm

0,369 0,08 0,414 0,102 0,429 0,444 0,238 0,218

Los datos demuestran que la cepa de control PH-SGI-E-0601 proporcionaba el rendimiento Fv/Fm más alto y no mostraba una diferencia significativa de Fv/Fm en ausencia o en presencia de L-arabinosa al 2% (0,429 vs. 0,444, Tabla 5). En contraste, las dos cepas que mostraban un defecto del crecimiento, al ser tratadas con L-arabinosa al 2%, PH-SGI-E-0599 y PH-SGI-E-0600, que incluían el gen de toxina pemK operablemente ligado al promotor inducible con arabinosa, mostraron rendimientos Fv/Fm ligeramente más bajos (0,369 y 0,414) en caso de no inducción, pero al ser tratadas con arabinosa, los valores medidos de Fv/Fm fueron de 0,080 y 0,102, una reducción drástica respecto a los cultivos no inducidos de la misma cepa. Estos datos indican que la pérdida de color observada en los cultivos inducidos en efecto es clorosis y que el estado general de salud, así como las capacidades fotosintéticas de las cianobacterias, resultan muy comprometidas por la expresión inducida de pemK en estas cepas, aunque, de acuerdo con la DO y el examen visual, no se observó diferencia entre los cultivos inducidos y no inducidos.

PH-SGI-E-0606, que expresaba induciblemente la antitoxina pemI además de la toxina pemK, no perdió capacidad fotosintética con la inducción de dichos genes, señalando al efecto protector de la antitoxina al expresarse a partir del mismo promotor que el gen de toxina.

Ejemplo 5: cultivo de un alga eucariótica bajo condiciones de escasez y abundancia de nutrientes.

Se cultivó una cepa de Nannochloropsis gaditana aislada a partir de un cultivo obtenido de la colección de cultivos CCMP (CCMP1894), bajo condiciones de abundancia de nutrientes, así como bajo limitación de nitrógeno y de fosfato con el fin de identificar los genes cuyos transcritos se encontraban elevados bajo falta de nutrientes con respecto a las condiciones de abundancia de nutrientes y viceversa. Se cultivaron cultivos de trescientos ml en matraces de agitación de 500 ml a 125 pm en un agitador orbital bajo un ciclo diario (16 h de luz:8 h de oscuridad), utilizando luz constante de 90 a 100 pE y 1% de CO2 a 25°C. Se midió la intensidad de la luz utilizando un medidor de luz LI-COR LI-250A. Se preparó medio con abundancia de nutrientes mediante la disolución de 35 g de sales Instant Ocean (Aquatic Eco Systems, Apopka, FL), 5,71 ml de una solución madre de NaNO3 1,75 M y 5,41 ml de una solución madre de K2PO43H2O 77 mM en 981 ml de agua filtrada milliQ para preparar 1 litro. La solución se filtró a esterilidad mediante el paso a través de un filtro de cuello de botella de 0,2 micrómetros (Corning n° 430513).

El día de la utilización, se añadió una mezcla madre de vitaminas y solución madre de metales traza quelados y el medio se mezcló bajo agitación. La mezcla vitaminas incluía 0,01% de HCl de tiamina, cianocobalamina 0,37 pM y biotina 0,41 pM. La solución de metales traza quelados incluía EDTA disódico 11,71 mM, FeCl3, 11,65 mM, CuSO4 39,2 pM, ZnSo4 77.5 pM , CoCh 42 pM , MnCh 91 pM y Na2MoO4 26 pM. Se utilizó medio libre de nitrógeno de la misma receta aunque sin solución de NaNO3, mientras que el medio libre de fosfato utilizó la misma receta pero sin la solución de K3PO4.

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Ejemplo 6: identificación de las secuencias de promotor.

Se utilizó el perfilado de transcritos para identificar nuevas regiones reguladoras de promotor y terminador. Se cultivó la cepa de N.gaditana separadamente en medios de cultivo sin nitrógeno, sin fosfato y con abundancia de nutrientes y se recolectó el ARN total aproximadamente 6 horas después del inicio del experimento, así como el mediodía de los días 1 y 2 (aproximadamente 24 y 48 horas después del inicio del experimento).

Se secuenciaron las muestras de ARN en Ambry Genetics (Aliso Viejo, CA) tras la purificación con poli-A y la fragmentación. Se secuenció el ARNm utilizando la secuenciación por síntesis (Illumina HiSeq) para generar lecturas de 'paired-end' (extremos apareados) utilizando el procedimiento de ARNm-Seq (descrito en Mortazavi et al., Nature Methods 5:621-628, 2008). Las lecturas localizadas en el mapa se alinearon a la secuencia del genoma de referencia de N. gaditana utilizando el software CLC Genomics Workbench. Se calcularon los niveles de expresión para cada gen anotado, normalizado para la longitud génica y el número total de lecturas localizadas por muestra, y se informan en unidades FPKM para cada muestra. FPKM es una medida de los niveles transcripcionales relativos que normaliza para la diferencia en longitudes de los transcritos. Los niveles de expresión en FPKM se calcularon para cada gen y para cada condición utilizando parámetros estándares, permitiendo la localización de las lecturas hasta 50 pb cadena arriba y cadena abajo de cada gen.

Para la expresión de los genes de toxina, se identificaron los transcritos de Nannochloropsis con un nivel bajo o despreciable de expresión bajo condiciones de abundancia de nutrientes y un nivel elevado de expresión bajo condiciones de falta de nitrógeno y/o de falta de fosfato (Tabla 6). Dichos transcritos se localizaron en el mapa de Nannochloropsis y las secuencias hasta 1.000 pares de bases cadena arriba del ATG de inicio supuesto se identificaron como secuencias putativamente contenedoras de promotor. Por ejemplo, la región cadena arriba 5' del gen transportador de amoníaco o amonio de la familia de AMT (SEC ID n° 56), la región cadena arriba 5' del gen del transportador de amonio Rh tipo B (SEC ID n° 57), la región cadena arriba 5' del gen de amina oxidasa con cobre/dominio 3 (SEC ID n° 58), la región cadena arriba 5' del gen del antiportador de Na+/H+ de membrana plasmática (SEC ID n° 59), la región cadena arriba 5' del gen de la E3 ubiquitín-proteína ligasa ARI5 (SEC ID n° 60) o la región cadena arriba 5' del gen del dominio de unión a NAD(P) de tipo Rossmann (SEC ID n° 61) o subfragmentos de cualquiera de dichas regiones 5' con actividad de promotor que resulta inducida por agotamiento de nitrógeno son secuencias reguladoras candidatas que pueden clonarse cadena arriba de un gen de toxina de manera que el gen de toxina puede expresarse al llegar un microorganismo a limitación de nitrógeno, por ejemplo en el caso de que un microorganismo, tal como un alga eucariótica, escape de la zona de crecimiento en donde los nutrientes, tales como el nitrógeno, son abundantes. La región cadena arriba 5' de la proteína de tipo fosfato permeasa reprimible por fosfato (SEC ID n° 65) o un subfragmento de la misma es otra secuencia que puede utilizarse para la expresión de una proteína toxina. En este caso, la toxina se expresaría al experimentar los microorganismos escapados, por ejemplo algas, la limitación por fosfato. Con el fin de identificar los promotores utilizados en la expresión heteróloga de genes de antitoxina, también se identificaron los transcritos de Nannochloropsis con un nivel elevado de expresión bajo condiciones de abundancia de nutrientes y un nivel más bajo o despreciable de expresión bajo condiciones de falta de nitrógeno o falta de fósforo (Tabla 6). Por ejemplo, la región cadena arriba 5' de la hidrolasa de plegamiento alfa/beta (SEC ID n° 62), la región cadena arriba 5' de la hidroxilamina reductasa 1 (SEC iD n° 63) y la región cadena arriba 5' del componente ferredoxina (SEC ID n° 64) o subfragmentos de cualquiera de dichas regiones 5' con actividad de promotor bajo condiciones de abundancia de nutrientes, y preferentemente actividad más baja bajo falta de nitrógeno y/o fosfato son secuencias reguladoras candidatas que pueden clonarse cadena arriba de un gen de antitoxina, de manera que el gen de antitoxina puede expresarse al cultivar un microorganismo, tal como un alga eucariótica, en una zona de crecimiento en donde nutrientes tales como el nitrógeno son abundantes, aunque preferentemente no se expresa o se expresa a un nivel bajo al encontrarse el microorganismo con limitación de nitrógeno o fosfato.

Tabla 6. Genes expresados diferencialmente bajo limitación de nutrientes en Nannochloropsis.

Descripción de la traducción

Complet o 16 h Complet o 32 h Menos N, 16 h Menos N, 32 h Menos P, 16 h Menos P, 32 h Secuencia genómica cadena arriba

Familia de AMT de transportadores de amonio o de amoníaco

68 32 375 646 66 43 SEC ID n° 56

transportador de amonio Rh tipo B

33 31 151 240 40 25 SEC ID n° 57

Amina oxidasa con cobre/dominio 3

6 3 33 35 6 3 SEC ID n° 58

Antiportador Na+/H+ de la membrana plasmática

7 5 39 52 9 6 SEC ID n° 59

E3 ubiquitín-proteína ligasa ArI5

2 6 23 25 6 8 SEC ID n° 60

Dominio de unión a NAD(P) de tipo Rossmann

19 3 20 24 2 3 SEC ID n° 61

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hidrolasa de plegamiento alfa/beta

24 23 7 9 36 28 SEC ID n° 62

hidroxilamina reductasa 1

104 108 15 12 125 140 SEC ID n° 63

Componente ferredoxina

24 105 1 1 6 11 SEC ID n° 64

Proteína de tipo fosfato permeasa reprimible con fosfato

15 13 12 17 40 38 SEC ID n° 65

Ejemplo 7: Construcciones de vector y transformación

Pueden construirse vectores para la transformación mediante recombinación in vitro utilizando un método de clonación de Gibson (Gibson et al., Nat. Methods 63:343-345, 2009) utilizando fragmentos de PCR tratados con exonucleasa para exponer las secuencias solapantes o mediante técnicas de clonación estándares. Pueden utilizarse secuencias de promotor-5'-UTR y 3'-UTR-terminador del virus 40 del simio (SV40) para controlar la expresión del gen ble codificante de resistencia a zeocina, para formar un marcador seleccionable SV40-ble en el vector de trasformación.

Los vectores, incluyendo un gen de antitoxina operablemente ligado a una región de promotor que regula la expresión bajo condiciones de abundancia de nutrientes (p.ej. SEC ID n° 62, SEC ID n° 63 o SEC iD n° 64, o un subfragmento activo de cualquiera de las mismas) pueden transformarse en Nannochloropsis gaditana mediante linearización del ADN con endonucleasas de restricción y purificación del ADN digerido mediante extracción con fenol-cloroformo. Se preparó un cultivo en etapa logarítmica de Nannochloropsis gaditana para la transformación mediante lavado de las células tres veces con sorbitol 384 mM y la resuspensión en sorbitol 384 mM a una densidad de 1x1010 células/ml. Se mezclaron cuidadosamente 100 jl de células lavadas con 5 |jg de ADN plasmídico linearizado en una cubeta de electroporación de 2 mm enfriada con hielo. La electroporación puede llevarse a cabo con un pulsador génico BioRad configurado a una capacitancia de 50 jF, resistencia de 500 O y 2,2 kV. Tras la electroporación, se añadió 1 ml de sorbitol 384 mM y las células se transfirieron a 10 ml de medio PM024. Se incubó el cultivo a 25°C durante la noche bajo luz tenue (5 jE/m2/s). A continuación, se extendieron 5x108 células sobre medio agar con abundancia de nutrientes en placas Petri de poliestireno de 80 mm con 5 jg/ml de zeocina. Las células se incubaron a temperatura ambiente bajo luz constante (70 a 80 jE/m2/s) durante tres semanas. Los transformantes se parchearon sobre agar con abundancia de nutrientes con 5 jg/ml de zeocina. Pueden cultivarse cultivos en suspensión líquidos en medios ricos en nutrientes con 5 jg/ml de zeocina.

Las cepas transformadas con el gen de antitoxina no se esperaba que mostrasen ningún defecto de crecimiento. A continuación, dichas cepas podían transformarse con constructos que incluían un gen de toxina análogo al gen de antitoxina que se encontraba operablemente ligado a una región de promotor que regulaba la expresión bajo condiciones de falta de nutrientes (p.ej. SEC ID n° 56, SEC ID n° 57, SEC ID n° 58, SEC ID n° 59, SEC ID n° 60 o SEC ID n° 65, o un subfragmento activo de cualquiera de las mismas).

Por ejemplo, una especie algal eucariótica, tal como, por ejemplo, una alga de una especie de Nannochloropsis, Chlamydomonas, Chlorella, Tetraselmis, Cyclotella u otra especie algal eucariótica puede transformarse con el gen de antitoxina pemI de E. coli (SEC ID n° 71, secuencia de proteína, SEC ID n° 72) operablemente ligado a la región cadena arriba 5' de la hidrolasa de plegamiento alfa/beta (SEC ID n° 62) o un fragmento activo de la misma, o el promotor de un gen ortólogo de la especie huésped, de manera que la antitoxina pemI se expresa bajo condiciones de abundancia de nutrientes pero se desactiva bajo falta de nitrógeno. La cepa de Nannochloropsis que incluye el constructo de promotor de hidrolasa de plegamiento alfa/beta-gen de antitoxina pemI seguidamene puede transformarse con un constructo que incluye el gen de la toxina pemK de E. coli que presenta una secuencia alterada para eliminar los sitios diana de la pemK endonucleasas (SEC ID n° 74; secuencia de proteína: SEC ID n° 75) operablemente ligada a la región cadena arriba 5' del gen de antiportador de Na+/H+ de membrana plasmática (SEC ID n° 59) o un fragmento activo del mismo o el promotor de un gen ortólogo de la especie huésped, de manera que el gen de la toxina pemK se expresa bajo condiciones de limitación de nitrógeno. La cepa de Nannochloropsis que incluye el constructo de promotor de hidrolasa de plegamiento alfa/beta-gen de antitoxina pemI y el constructo de promotor de antiportador de Na+/H+ de membrana plasmática-gen pemK insensible a toxina se manipula para el bioconfinamiento, de manera que la cepa se encontrase protegida frente a los potenciales efectos de la expresión 'con pérdidas' ('leaky') del gen de toxina bajo condiciones de abundancia de nitrógeno, pero presentase una expresión sostenida del gen de toxina en caso de que experimentase limitación de nutrientes si escapaba de la zona de cultivo.

En otro ejemplo, puede transformarse una cepa de Nannochloropsis con el gen de antitoxina MazE de E. coli (SEC ID n° 66; secuencia de proteína: SEC ID n° 67) operablemente ligado a la región cadena arriba 5' del componente ferredoxina (SEC ID n° 64) o un fragmento activo del mismo, de manera que la antitoxina pemI se expresa bajo condiciones de abundancia de nutrientes pero se encuentra desactivado bajo falta de nitrógeno o fosfato. La cepa de Nannochloropsis que incluye el constructo de promotor componente ferredoxina-gen de antitoxina MazE seguidamente puede transformarse con un constructo que incluye el gen de toxina MazF de E. coli que presenta una secuencia alterada para eliminar los sitios diana de la MazF endonucleasa (SEC ID n° 69; secuencia de proteína: SEC ID n° 70) operablemente ligada a la región cadena arriba 5' del gen de amina oxidasa con cobre/dominio 3

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(SEC iD n° 58) o un fragmento activo del mismo. La cepa de Nannochloropsis que incluye el constructo de promotor de componente ferredoxina-gen de antitoxina MazE y el constructo de promotor de amina oxidasa con cobre/dominio 3-gen de MazF insensible a toxina se manipuló para el bioconfinamiento de manera que la cepa se encontrase protegida frente a los potenciales efectos de la expresión con pérdidas del gen de toxina bajo condiciones de abundancia de nutrientes pero presentase una expresión sostenida del gen de toxina al experimentar limitación de nutrientes si escapaba de la zona de cultivo.

En un ejemplo adicional, la cepa de Nannochloropsis descrita inmediatamente antes transformada para el bioconfinamiento utilizando el gen de MazE y el gen de MazE manipulado puede transformarse adicionalmente con el gen de antitoxina dinJ de E. coli (SEC ID n° 76; secuencia de proteína: SEC ID n° 77) operablemente ligado a la región cadena arriba 5' del componente ferredoxina (SEC ID n° 64) o un fragmento activo del mismo, de manera que la antitoxina dinJ se expresa bajo condiciones de abundancia de nutrientes pero se encuentra desactivado bajo condiciones de falta de nitrógeno. La cepa de Nannochloropsis que incluye los genes MazE y MazF exógenos indicados anteriormente y el constructo de promotor de componente ferredoxina-gen de antitixona dinJ seguidamente puede transformarse con un constructo que incluye el gen de toxina YafQ de E. coli que presenta una secuencia alterada para eliminar los sitios diana de las endonucleasas YafQ y MazF (SEC ID n° 79; secuencia de proteína: SEC ID n° 80) operablemente ligada a la región cadena arriba 5' del gen antiportador de Na+/H+ de membrana plasmática (SEC ID n° 59) o un fragmento activo del mismo de manera que ambos genes de toxina, MazF y YafQ, se expresan bajo condiciones de limitación de nitrógeno. La cepa de Nannochloropsis que incluía el promotor de componente ferredoxina-gen de antitoxina dinJ, el constructo de promotor de componente ferredoxina- gen de antitoxina MazE, el constructo de promotor de amina oxidasa con cobre/dominio 3-gen de MazF insensible a toxina y el constructo de promotor de antiportador de Na+/H+ de membrana plasmática-gen de YafQ insensible a doble toxina se manipuló para el bioconfinamiento de manera que la cepa se encontrase protegida frente a los potenciales efectos de la expresión con pérdidas de los genes de toxina bajo condiciones de abundancia de nitrógeno pero presentase una expresión sostenida del gen de toxina al experimentar limitación de nutriente si escapaba de la zona de cultivo.

La terminología utilizada en la presente memoria pretende describir realizaciones particulares de ejemplo únicamente y no pretende ser limitativa. Los términos "comprende", "comprendiendo", "incluyendo" y "presentando" son inclusivos y, por lo tanto, especifican la presencia de las características, números enteros, etapas, operaciones, elementos y/o componentes indicados pero no excluyen la presencia o adición de otra u otras características, números enteros, etapas, operaciones, elementos, componentes y/o grupos de los mismos. Las etapas de método, procedimientos y operaciones descritos en la presente memoria no debe interpretarse que necesariamente requieren su ejecución en el orden particular comentado o ilustrado, a menos que ello se indique específicamente como un orden de ejecución. Se entiende además que pueden utilizarse etapas adicionales o alternativas.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> ExxonMobil Research and Engineering Company

Bielinski, Vincent

Bauman, Nicholas

Lyons Boyd, Kate

Akella, Srividya

Bower, Stanley

Roessler, Paul

<120> Regulación de genes de toxina y antitoxina para el confinamiento biológico <130> 2011EM192-PCT / 16244-000017/WO/POA

<150> US 61/503,306 <151> 2011-06-30

<160> 80

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1 <211> 264 <212> DNA

<213> Synechococcus elongatus

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atgcgtaagc tggcttggac aaacgaggnt tgggaagatt gacaagaaga ccttaaatcg catcaacaag ctcattaccg gaggggattg gtaagocaga agcgctcagg gagaacotga attgacgaca ccaatcgctt agtttacgca gtagcagatg tgtcgctacc actacagcga ttaa

acctgtattg gcaagggcag

60

aaaccttgcg

atcgcccttt 120

ctgggttttg gtcacgccgc

180

actacctgac

cattatttcc 240

264

<210> 2 <211> 87 <212> PRT

<213> Synechococcus elongatus <400>2

Met Arg Lys Leu Ala Trp Thr Asn Glu Ala Trp Glu Asp Tyr Leu Tyr 15 10 15

Trp Gln Gly Gln Asp Lys Lys Thr Leu Asn Arg lie Asn Lys Leu lie 20 25 30

Thr Glu Thr Leu Arg Ser Pro Phe Glu Gly lie Gly Lys Pro Glu Ala 35 40 45

Leu Arg Glu Asn Leu Thr Gly Phe Trp Ser Arg Arg lie Asp Asp Thr 50 55 60

Asn Arg Leu Val Tyr Ala Val Ala Asp Asp Tyr Leu Thr lie lie Ser

65 70 75 80

Cys Arg Tyr His Tyr Ser Asp

B5

<210> 3 <211> 414 <212> ADN

<213> Synechococcus elongatus <400> 3

tgttggatgt

ctcactggct tgtgcttggt gttttgcgga tgaggcaaca 60

gggctttatt

ggagcagttg caacaatctc cagcagttgt ccctgcactt 120

aagttgggca

tgtcttggtg caagcagagc gccggcaaag gattagcgcc 180

gtgagttttt

atcgctgcta gagatgttgc cgattgaggt agaacccgct 240

ccgtttggca

tgacacattg gcgatcgctt gcagtcaaca gctgactgct 300

cttatttgga

gctggcgatg cggcggggat tcgctctggc aacttgcgat 360

tcagtgctgc

ggaagccgtg ggagttacgt tactgccgac ctaa 414

<210> 4 <211> 137 <212> PRT

<213> Synechococcus elongatus

5

10

Met Ser 1

Asp Glu

Ser Pro

Leu Val

50

Phe

Val Leu 5 Asp Val Ser Leu Ala 10 Cys Ala Trp

Ala

Thr 20 Pro Glu Ser Trp Ala 25 Leu Leu Glu Gln

Ala 35

Val Val Pro Ala Leu 40 Trp Leu Trp Glu Val 45

Gln

Ala Glu Arg Arg Gln Arg lie Ser Ala Ala

Cys Phe Ala 15

Leu Gln Gln 30

Gly His Val

Ala Ser Arg

55

60

Glu Phe Leu Ser Leu Leu Glu Met Leu Pro lie Glu Val Glu Pro Ala 65 70 75 80

Ala Val Gly Thr Val Trp His Asp Thr Leu Ala lie Ala Cys Ser Gln 85 90 95

Gln Leu Thr Ala Tyr Asp Ala Ala Tyr Leu Glu Leu Ala Met Arg Arg 100 105 110

Gly Phe Ala Leu Ala Thr Cys Asp Arg Ala Leu lie Ser Ala Ala Glu 115 120 125

Ala Val Gly Val Thr Leu Leu Pro Thr 130__________________135_________

<210>5 <211> 441 <212> ADN

<213> Anabaena PCC7120

<400> 5

gtgaagccgc

caacagttca

tttgatgata

ggctatcgcc

ttagcttgtc

ggaatgaaaa

agaaaagtaa

ctcgaaacat

cttactttcc

caatagagga gacattgtta aattagagtt tggctctgca 60

cggctgaatc

aattcagcgt gtatttaccc ttcgtaattc tggaatgtca 120

ttgccataac

actaaataac gagctacaac aacaagggcg tgagcaaact 180

ctgttcttgt

tatatctcca attaagtaca atcaaatggc ttctttagtt 240

ctataactac

taacgcaaag gggcttaggt ttgaagttcc ccttattgaa 300

caaaaggggt

tgtgttagca gatcaaatta aaacactaga ttggaaagct 360

aatttgttga

aagtgtaaca gaagatttaa tagaagaagt acaagcaaaa 420

taattttata

g 441

<210>6 <211> 146 <212> PRT

<213> Anabaena PCC7120

5

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Met Lys Pro Pro 1

Phe Gly Ser Ala 20

Thr Leu Arg Asn 35

Asn Asn Glu Leu

50

Val Leu Val lie 65

Leu Ala Cys Pro

Pro Leu lie Glu

Tyr Phe Pro Asn

5

Gln Gln Phe Thr

Ser Gly Met Ser 40

Gln Gln Gln Gly 55

Ser Pro lie Lys 70

lie Thr Thr Asn 85

Gly Met Lys Thr

Arg Gly Asp lie 10

Ala Glu Ser lie 25

Phe Asp Asp lie

Arg Glu Gln Thr 60

Tyr Asn Gln Met

75

Ala Lys Gly Leu 90

Lys Gly Val Val

Val Lys Leu Glu 15

Gln Arg Val Phe 30

Ala lie Thr Leu 45

Gly Tyr Arg Pro

Ala Ser Leu Val 80

Arg Phe Glu Val 95

Leu Ala Asp Gln

100 105 110

lie Lys Thr Leu Asp Trp Lys Ala Arg Lys Val Lys Phe Val Glu Ser 115 120 125

Val Thr Glu Asp Leu lie Glu Glu Val Gln Ala Lys Leu Glu Thr Leu 130 135 140

lie Leu 145

<210>7 <211> 297 <212> ADN

<213> Anabaena PCC7120 <400>7

atgggactta

acagtaaaca tcaaaaaana ctggatgaca tttttgaaaa tcccgttaga 60

tccaatattc

cttggagtga tattgagtct atgctaattg cccttggtgc ggaagtgtca 120

gaaggaaggg

ggtcaagggt gagaatagct cttaatggtg tcaaggcgac ttttcacaga 180

ccacacocgg

aaaaagaaac cgataaaggt gctgttaagt ctatgcggcg cttcttaaca 240

gagtctgggg

ttcaagagga cttggagacg ggaggactta gtgacaatga aatataa 297

<210>8 <211> 98 <212> PRT

<213> Anabaena PCC7120

5

10

Met

Gly Leu Asn Ser Lys HÍS Gln Lys Thr Leu Asp Asp lie Phe Glu

1

5 10 15

Asn

Pro Val Arg Ser Asn lie Pro Trp Ser Asp lie Glu Ser Met Leu

20 25 30

lie

Ala Leu Gly Ala Glu Val Ser Glu Gly Arg Gly Ser Arg Val Arg

35 40 45

lie

Ala Leu Asn Gly Val Lys Ala Thr Phe His Arg Pro His Pro Glu

50 55 60

Lys

Glu Thr Asp Lys Gly Ala Val Lys Ser Met Arg Arg Phe Leu Thr

65

70 75 80

Glu

Ser Gly Val Gln Glu Asp Leu Glu Thr Gly Gly Leu Ser Asp Asn

85 90 95

Glu lie

<210>9 <211> 390 <212> ADN

<213> Anabaena PCC7120

<400> 9

atgagtggtg agattgcatt agatacttct gttgcaatac gttttttgaa tggtgatcct 60 gatgttgttt caagggtgtt ggcgttaccg gaaatatttt tgtcggtggt agtagttgga 120 gagttactgt ttggggctga gaactcgact cgaccgttga aaaatcttcc tcgatatttg 180 gagtttatgg aagtttgtac ggttgtgcct gtggaaaaga gaacagcagt tatctatgct 240 caaactcgtt ctgctttaaa gcgcaaagga cgaccaattc cgatgaatga tgtttggatt 300 gcagcgcatt gtctggaaca tggttgggtg cttgtgaccg ataattcaga ttttgattat 360 gtggatggat tggttataga gcattggtaa__________________________________________390

<210> 10 <211> 129 <212> PRT

<213> Anabaena PCC7120

5

10

Met

Ser Gly Glu lie Ala Leu Asp Thr Ser Val Ala lie Arg Phe Leu

1

5 10 15

Asn

Gly Asp Pro Asp Val Val Ser Arg Val leu Ala Leu Pro Glu lie

20 25 30

Phe

Leu Ser Val val Val Val Gly Glu Leu Leu Phe Gly Ala Glu Asn

35 40 45

Ser

Thr Arg Pro Leu Lys Asn Leu Pro Arg Tyr Leu Glu Phe Met Glu

50 55 60

Val

Cys Thr Val Val Pro Val Glu Lys Arg Thr Ala Val lie Tyr Ala

65

70 75 80

Gln

Thr Arg Ser Ala Leu Lys Arg Lys Gly Arg Pro lie Pro Met Asn

85 90 95

Asp

Val Trp lie Ala Ala His Cys Leu Glu His Gly Trp Val Leu Val

100 105 110

Thr

Asp Asn Ser Asp Phe Asp Tyr Val Asp Gly Leu Val lie Glu His

115 120 125

imagen1

<210> 11 <211> 357 <212> ADN

<213> Microcystis aeruginosa

<400> 11

atgacgattt

ttcaaggaga gatttattgg attgatttag gagaaccaca aggttctgaa 60

cctgcttatc

ttcgtccttg tgttgtggtg caaaatgatg ctctgaatca gtcacaaatt 120

gggacggtta

ttgtgtgtcc attaacaacc aatttgagac gagcaaaagc tattggtaat 180

gttttattga

atgagggtga agggaattta ccagaatcca gtgttgttaa tgtttcgcag 240

gttttcacgg

ttgataagcg tcttttaaca gagtctatcg gaagactttc t cgggaaaaa 300

atcaaattaa

ttattcaggg aattaatttg gttattgaac ctcaagaact cgaataa 357

<210> 12 <211> 118 <212> PRT

<213> Microcystis aeruginosa

5

10

Met Thr Ile 1

Gln Gly Ser

Asp Ala Leu 35

Phe

Gln Gly Glu lie Tyr Trp lie Asp Leu Gly Glu Pro

5 10 15

Glu

Pro Ala Tyr Leu Arg Pro Cys Val Val Val Gln Asn

20

25 30

Asn

Gln Ser Gln lie Gly Thr Val lie val Cys Pro Leu

40

45

Thr Thr Asn Leu Arg Arg Ala Lys Ala lie Gly Asn Val Leu Leu Asn 50 55 60

Glu Gly Glu Gly Asn Leu Pro Glu Ser Ser Val Val Asn Val Ser Gln 65 70 75 80

Val Phe Thr Val Asp Lys Arg Leu Leu Thr Glu Ser lie Gly Arg Leu 85 90 95

Ser Arg Glu Lys lie Lys Leu lie lie Gln Gly lie Asn Leu Val lie 100 105 110

Glu Pro Gln Glu Leu Glu 115

<210> 13 <211> 255 <212> ADN

<213> Synechococcus elongatus

<400> 13

atgaaagttg tttccttcag tgacgccaga aaaaatctca agactgtctt

gtcaacgacg ctgactacac gatcattact cgccgcaatg ccgaggaagt

tccctcgact ccttcaatag cctgatcgaa accttccacc tgctcaaatc

gctgctcacc tacaacgctc gatcgctcag taccagcaag gtcaaacagt

ctattagatg cgtaa

ggatgaagtc

60

cgtggtcatg

120

ccctgccaat

180

cgagcgaaat

240

255

<210> 14 <211> 84 <212> PRT

<213> Synechococcus elongatus

5

10

Met

Lys Val Val Ser Phe Ser Asp Ala Arg Lys Asn Leu Lys Thr Val

1

5 10 15

Leu

Asp Glu Val Val Asn Asp Ala Asp Tyr Thr lie lie Thr Arg Arg

20 25 30

Asn

Ala Glu Glu Val Val val Met Ser Leu Asp Ser Phe Asn Ser Leu

35 40 45

He

Glu Thr Phe His Leu Leu Lys Ser Pro Ala Asn Ala Ala His Leu

50 55 60

Gln

Arg Ser He Ala Gln Tyr Gln Gln Gly Gln Thr Val Glu Arg Asn

65

70 75 80

Leu

Leu

Asp Ala

<210> 15 <211> 315 <212> ADN

<213> Synechococcus elongatus <400> 15

gtgcgggtga acctgaattt tgaaagcttt agcgatcgct tagactggtt ggcctctagt G0

tgtttgcttg ccatgcaaac tgttggcgcg tttgaagcca agacccatct ctccagcctg 120

ctcgactccg tctgtcaggg ggagcagatc gtgattaccc gccacggttg cccgatcgcc 180

cgtttggtgc cagcagaagg tcctgatcag tctgcggtcc aagccgcgat cgcccgtctt 240

cggcagctca geeaaggtca aaccctcaac ggaattacgg tgcaggaact ccgtgatact 300

gggcggcggg catga 315

<210> 16 <211>104 <212> PRT

<213> Synechococcus elongatus

5

10

Met Arg Val Asn Leu Asn Fhe Glu Ser Fhe Ser Asp Arg Leu Asp Trp 15 10 15

Leu Ala Ser Ser Cys Leu Leu Ala Met Gln Thr Val Gly Ala Phe Glu 20 25 30

Ala Lys Thr His Leu Ser Ser Leu Leu Asp Ser Val Cys Gln Gly Glu 35 40 45

Gln lie Val lie Thr Arg His Gly Cys Pro lie Ala Arg Leu Val Pro 50 55 60

Ala Glu Gly Pro Asp Gln Ser Ala Val Gln Ala Ala lie Ala Arg Leu 65 70 75 80

Arg Gln Leu Ser Gln Gly Gln Thr Leu Asn Gly lie Thr Val Gln Glu 85 90 95

Leu Arg Asp Thr Gly Arg Arg Ala 100

<210> 17 <211> 243 <212> ADN

<213> Anabaena PCC7120

<400> 17

imagen2

<210> 18 <211> 80 <212> PRT

<213> Anabaena PCC7120

<400> 18

imagen3

5

10

15

20

<210> 19 <211> 327 <212> ADN

<213> Nostoc sp. PCC7120

<400> 19

gtgacaatga aatataaagg atatgaagcc attgtagaat ttgatgatga

tttcatgggg aagtaattaa ccttcgagat gtgattacat ttcagggtga

gagctaaagc aagcttttca tgattcagta gacgattatt tagaattttg

ggcgaagaac ctgaaaaacc cttttcagga aaactcatgc tcagaattaa

cataaaatca tcgccatcaa agcgaagaaa gagggacaaa gccttaattc

aaatgcttgt gtatgtatgt tccttag

agctgaaatt

60

cagcgtcaaa

120

tcaagaacgt

180

ccctgaatta

240

ttggatagaa

300

327

<210> 20 <211> 108 <212> PRT

<213> Nostoc sp. PCC7120

<400> 20 Met Thr 1

Glu Ala

Thr Phe

Ser Val 50

Glu Lys G5

Met

Lys Tyr Lys Gly Tyr Glu Ala lie Val Glu

5 10

Glu

lie Phe His Gly Glu Val lie Asn Leu Arg

20 25

Gln

Gly Asp Ser Val Lys Glu Leu Lys Gln Ala

35

40 45

Asp

Asp

Tyr Leu Glu Phe Cys Gln Glu Arg Gly

55 60

Pro

Phe Ser Gly Lys Leu Met Leu Arg lie Asn

70

75

Phe Asp Asp 15

Asp Val lie 30

Phe His Asp

Glu Glu Pro

Pro Glu Leu 80

His Lys lie lie

Ser Trp lie Glu 100

Ala

He Lys Ala Lys Lys

85

90

Lys

Cys Leu Cys Met Tyr

Glu Gly Gln Ser Leu Asn 95

Val Pro

105

<210> 21 <211> 210 <212> ADN

<213> Nostoc sp. PCC7120

<400> 21

atgactagcc gcgagcagct tatccaagaa cttgcagagg ttccagatga gttagttaaa 60

gtaatgttag attttttaca tcgtcttcag acaacgcgca gtcatcatcc tctagcgaaa 120

tttgctggta ttttgagtga taatgaggcg gccgatttac aggaagcaat tcaagctgat 180

tgtcgtcagg ttgatttaaa tgagtggtga 210

5

10

15

<210> 22 <211> 69 <212> PRT

<213> Nostoc sp. PCC7120 <400> 22

Met Thr Ser Arg Glu Gln Leu lie Gln Glu Leu Ala Glu Val Pro Asp 15 10 15

Glu Leu Val Lys Val Met Leu Asp Phe Leu His Arg Leu Gln Thr Thr 20 25 30

imagen4

Leu Ser Asp Asn 45

Cys Arg Gln Val

Asp Leu Asn Glu Trp 65

<210> 23 <211> 231 <212> ADN

<213> Microcystis aeruginosa

<400> 23

atgttatctt ctctgataat tgaactggaa aaacaatggt tattggagca gttacatcaa

caaaagttac gagactgttc tcttgaagat caattaggat tgaataatca aaaaacaact

60

120

aaacaacgat taatagatag ttggaatgaa gcttatagtg atggattgga cgaatcagaa 180

actttaatgt tagagcgaat acggcatcat caaagccaat tatctgagta a_______________231

<210> 24 <211> 76 <212> PRT

<213> Microcystis aeruginosa

<400> 24

Met

Leu Ser Ser Leu lie lie Glu Leu Glu Gln Lys Leu Arg Asp Cys

1

5 10 15

Ser

Leu Glu Asp Lys Gln Trp Leu Leu Glu Gln Leu His Gln Gln Leu

20 25 30

Gly

Leu Asn Asn Gln Lys Thr Thr Lys Gln Arg Leu lie Asp Ser Trp

35 40 45

Asn

Glu Ala Tyr Ser Asp Gly Leu Asp Glu Ser Glu Thr Leu Met Leu

50 55 60

Glu

Arg lie Arg His His Gln Ser Gln Leu Ser Glu

65

70 75

5

10

15

20

25

30

35

40

<210> 25 <211> 28 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador UF PCC7942-axe

<400> 25

atgaaagttg tttccttcag tgacgcca 28

<210> 26 <211> 29 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador IR PCC7942-axe

<400> 26

ttacgcatct aatagatttc gctcgactg 29

<210> 27 <211> 24 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador UF PCC7942-txe

<400> 27

atgcgtaagc tggcttggac aaac 24

<210> 28 <211> 24 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador IR PCC7942-txe

<400> 28

ttaatcgctg tagtggtagc gaca 24

<210> 29 <211> 26 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador UF PCC7942-phd <400> 29

gtgcgggtga acctgaattt tgaaag 26

<210> 30 <211> 22 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

<220>

<223> Cebador IR PCC7942-phd <400> 30

tcatgcccgc cgcccagtat ca 22

<210> 31 <211> 27 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador UF PCC7942-doc <400> 31

atgagctttg tgttggatgt ctcactg 27

<210> 32 <211> 24 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador IR PCC7942-doc <400> 32

ttaggtcggc agtaacgtaa ctcc 24

<210> 33 <211> 30 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador UF PCC7120-mazE <400> 33

atgacaacag ttgtagctaa atggggaaac 30

<210> 34 <211> 23 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador IR PCC7120-mazE <400> 34

ctaccaagct tcattcccca cag 23

<210> 35 <211> 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador UF PCC7120-mazF

5

10

15

20

25

30

<400> 35

gtgaagccgc cttactttcc caata 25

<210> 36 <211> 37 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador IR PCC7120-mazF <400> 36

ctataaaatt aatgtttcga gttttgcttg tacttct 37

<210> 37 <211> 384 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> pemK de Microcystis de codones optimizados para Synechocystis, con etiqueta FLAG

<400> 37_____________________________________________________________________

atgacgattt ttcaaggaga gatttattgg attgatttag gagaaccaca aggttctgaa 60

cctgcttatc ttcgtccttg tgttgtggtg caaaatgatg ctctgaatca gtcacaaatt 120

gggacggtta ttgtgtgtcc attaacaanc aatttgagac gagcaaaagc tattggtaat 180

gttttattga atgagggtga agggaattta ccagaatcca gtgttgttaa tgtttcgcag 240

gttttcacgg ttgataagcg tcttttaaca gagtctatcg gaagactttc tcgggaaaaa 300

atcaaattaa ttattcaggg aattaatttg gttattgaac ctcaagaact cgaaggoagt 360

gactataaag atgacgatga caaa 384

<210> 38 <211> 258 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Microcystis de codones optimizados para Synechocystis, con etiqueta FLAG <400> 38

atgttatctt

ctctgataat tgaactggaa caaaagttac gagactgttc tcttgaagat 60

aaacaatggt

tattggagca gttacatcaa caattaggat tgaataatca aaaaacaact 120

aaacaacgat

taatagatag ttggaatgaa gcttatagtg atggattgga cgaatcagaa 180

actttaatgt

tagagcgaat acggcatcat caaagccaat tatctgaggg cagtgactat 240

aaagatgacg

atgacaaa 258

<210> 39 <211> 1217 <212> ADN <213> Escherichia coli

cgtttcactc

gtcaggtagg

cgtgcaaata

ttgtcatggc

gggttagcga

aattggtttc

ccctgctgcc

ccaacggtta

atctcaccat

cgggtgatat

ctcgcgaatg

ttaactggcc

cgcatttcag

cggagctgct

acgagtcgct

atcacctggc

cgtcgcgtct

aggaccaacg

ccgtcggtcg

gcaccggggc

ccgtcaagtt

catccaaaaa

atccgctaat

atcaatgtgg

tttggtcccg

gaagagccag

ttctctgaat

gggatactcg

tctcgatttt

tcgcggtcag

tttgctgttc

gtatcaccag

gtcaatattt

cgacctgttt

ggcgataaat

ccatccaccg

agacagcaat

gtcacatctt

cattagtcag

caatgttggt

cagcccgagc

gtcataa

aacgggtatg gagaaacagt agagagttgc gataaaaagc cttatggata aaaatgctat ggcatagcaa agtgtgacgc acttttctgc cgtgattata gacacttttg ttacgcgttt ctttgttaca gaatgatttt aataagcggg gttaccggtt taaaagacgc agtgacggca atgtctgatg caatatggac ggtgggagta tgaaaagtat ggctgaagcg caaaatgatc tttaacgccc atctggtggc gggtttaacg ccgattgagg tttatcgacc gaccgctggg aatgaaaggt tatattctca ggggtggtga aaaatcaggg acgagaattt gtctgccgac ccgccaggag agattcatca ctacggtcgt catccggagg tgggtttact ttcgtccgcg cgcctactgg catgaatggc gccaatacgg gtttctttcg cccggatgaa gcgcaccagc gggcaaatca ttaacgccgg gcaaggggaa gggcgctatt ctgcttgagc aattgttact gcggcgcatg gaagcgatta atggataatc gggtacgcga ggcttgtcag tacatcagcg tttgatatcg ccagcgtcgc acagcatgtt tgcttgtcgc ttccgccagc agttagggat tagcgtctta agctggcgcg gcgaagctgc ttttgagcac tacccggatg cctatcgcca tttgacgatc aactctattt ctcgcgagta tttaaaaaat gagtttcgtg ccggttgtga agaaaaagtg aatgatgtag

60

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1217

5 <210> 40

<211> 989 <212> ADN

<213> Synechocystis PCC6803

attgctgaag

nggaatccct ggttaatgcc gncgccgatg ccaattgcat tctccaagtg 60

gggcacattg

aacgcttcaa cccggcattt ttagagctaa ccaaaattct caaaacggaa 120

gagttattgg

cgatcgaagc ccatcgcatg agtccctatt cccagcgggc caatgatgtc 180

tccgtggtat

tggatttgat gatccatgac attgacctgt tgctggaatt ggtgggttcg 240

gaagtggtta

aactgtccgc cagtggcagt cgggcttctg ggtcaggata tttggattat 300

gtcaccgcta

cgttaggctt ctcctccggc attgtggcca ccctcaccgc cagtaaggtc 360

acccatcgta

aaattcgttc catcgccgcc cactgcaaaa attccctcac cgaagcggat 420

tttctcaata

acgaaatttt gatccatcgc caaaccaccg ctgattggag cgcggactat 480

ggccaggtat

tgtatcgcca ggatggtcta atcgaaaagg tttacaccag taatattgaa 540

cctctccacg

ctgaattaga aeattttatt cattgtgtta ggggaggtga tcaaccetea 600

gtggggggag

aacaggccct caaggccctg aagttagcca gtttaattga agaaatggcc 660

ctggacagtc

aggaatggca tgggggggaa gttgtgacag aatatcaaga tgccaccctg 720

gccctcagtg

cgagtgttta aatcaactta attaatgcaa ttattgcgag ttcaaactcg 780

ataactttgt

gaaatattac tgttgaatta atctatgact attcaataca cccccctagc 840

cgatcgcctg

ttggcctacc tcgccgccga tcgcctaaat ctcagcgcca agagtagttc 900

cctcaacacc

agtattctgc tcagcagtga cctattcaat caggaagggg gaattgtaac 960

agccaactat

ggctttgatg gttatatgg 989

<210> 41 <211> 989 5 <212> ADN

<213> Synechocystis PCC6803

5

10

ccggtatgga

tggcaccgat gcggaatcGC aacagattgc ctttgacaac aatgtggcct 60

ggaataacct

gggggatttg tccaccacca cccaacgggc ctacacttcg gctattagca 120

cagacacagt

gcagagtgtt tatggcgtta atctggaaaa aaacgataac attcccattg 180

tttttgcgtg

gcccattttt cccaccaccc ttaatcccac agattttcag gtaatgctta 240

acacggggga

aattgtcacc ccggtgatcg cctctttgat tcccaacagt gaatacaacg 300

aacggcaaac

ggtagtaatt acgggcaatt ttggtaatcg tttaacccca ggcacggagg 360

gagcgattta

tcccgtttcc gtaggcacag tgttggacag tactcctttg gaaatggtgg 420

gacccaacgg

cccggtcagt gcggtgggta ttaccattga tagtctcaac ccctacgtgg 480

ccggcaatgg

tcccaaaatt gtcgccgcta agttagaccg cttcagtgac ctgggggaag 540

gggctcccct

ctggttagcc accaatcaaa ataacagtgg cggggattta tatggagacc 600

aagcccaatt

tcgtttgcga atttacacca gcgccggttt ttcccccgat ggcattgcca 660

gtttactacc

cacagaattt gaacggtatt ttcaactcca agcggaagat attacgggac 720

ggacagttat

cctaacccaa actggtgttg attatgaaat tcccggcttt ggtctggtgc 780

aggtgttggg

gctggcggat ttggccgggg ttcaggacag ctatgacctg acttacatcg 840

aagatcatga

caactattac gacattatcc tcaaagggga cgaagccgca gttcgccaaa 900

ttaagagggt

tgctttgccc tccgaagggg attattcggc ggtttataat cccggtggcc 960

ccggcaatga

tccagagaat ggtccccca 989

<210> 42 <211> 216 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADNc para ccdA de Escherichia coli

<400> 42

atgaagcagc gtattacagt gatgtcaata tctccggtct cccgaacgtt ggaaagtggc atgaacggct cttttgctga

ggcaggtgac agcgacaact ggtaagcacc cccatgcaga aaatcaggaa gggatggctg cgagaacagg gactgg

atcagttgct

caaggcatat 60

atgaagcccg

tcgtctgcgt 120

aggtcgcccg

gtttattgaa 180

216

<210> 43

<211> 72

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 43

Met Lys Gln Arg lie Thr Val Ala Gly Asp Ser Asp Asn Tyr Gln leu 15 10 15

5

10

15

Leu Lys Ala Tyr Asp Val Asn lie Ser Gly Leu Val Ser Thr Pro Met 20 25 30

Gln Asn Glu Ala Arg Arg Leu Arg Pro Glu Arg Trp Lys Val Ala Asn 35 40 45

Gln Glu Gly Met Ala Glu Val Ala Arg Phe lie Glu Met Asn Gly Ser 50 55 G0

Phe Ala Asp Glu Asn Arg Asp Trp 65 70

<210> 44 <211> 303 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> ADNc para ccdB de Escherichia coli

<400> 44

atgcagttta

cagagtgaca

ctgctgtcag

tggcgcatga

gctgatctca

ata

aggtttacac

ctataaaaga gagagccgtt atcgtctgtt tgtggatgtt 60

ttattgacac

gcccgggcga cggatggtga tccccctggc cagtgcccgc 120

acaaagtctc

ccgtgagctt tacccggtgg tgcatgtcgg ggatgaaagc 180

tgaccaccga

tatggccagt gtgccggtct ccgttatcgg ggaagaagtg 240

gtcaccgcga

aaatgacatc aaaaacgcca ttaacctgat gttctgggga 300

303

<210> 45

<211> 101

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 45

Met Gln Phe Lys Val Tyr Thr Tyr Lys Arg Glu Ser Arg Tyr Arg Leu 15 10 15

Phe Val Asp Val Gln Ser Asp lie lie Asp Thr Pro Gly Arg Arg Met 20 25 30

Val lie

Glu Leu 50

Pro

Leu Ala Ser Ala Arg Leu Leu Ser Asp Lys

35

40 45

u >1 E4

Pro Val Val His Val Gly Asp Glu Ser Trp

Val Ser Arg

Arg Met Met

55

G0

Thr Thr Asp Met Ala Ser Val Pro Val Ser Val lie Gly Glu Glu Val 65 70 75 80

Ala Asp Leu Ser His Arg Glu Asn Asp lie Lys Asn Ala lie Asn Leu 85 90 95

Met Phe Trp Gly lie _____________100

<210> 46 <211> 2244 <212> ADN

<213> Leptolyngbya sp.

<400> 46

atgccccgga.

ggattgagcc

agtagtcagc

tcgcttcagg

ggttttgcga

gagccggaga

ccgtctactc

gatcccctca

ggaaagcctg

tcaggtgaag

acaaacaatg

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tttgtcaatt

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acggctccct

tggttgggcg

atcgatggtg

gggacgggca

gaacaggtgc

ttaaacgtcg

ccatttcttg caagctgctg gatcgagtct tgctgcgatc 60

agttggatgt

gtttcggcaa gcggaacagt atggcaaagt attagctcag 120

gtaagcttgc

actactcgtt gggatcaatg gctatcccga atctgttggc 180

gatgtcttac

ggatctggaa atgcagtatg aattattgag atatcgttat 240

agaatgatat

tttagtgctt gccgatcgga ggttatcgtt tcttgactat 300

agccgacacg

ccagaacatt ctaaatgcgt ttcagaaaca tttgattgat 360

cagatagcgt

tgttgttttt cattattctg ggcatggttc gctcatccct 420

ttaagacgcc

tttgttggat gctgacggga agaagattgt gacacagagt 480

cgagtgggac

gattgtgccg ctagatcgct atgcgaccaa tgggagacgt 540

tgcaagatat

tatggggcgc agtttgtttt tgttgatgag atcgctgaag 600

tgactgcggt

tttggatagt tgccattcgg gcggaggaac gcgagggaat 660

^ ^ La La^ La La

La L-.^ La La La laLkaLL-a^J La La^J LaLabl^ LLaLaLaul^

agaagcgatt

aatccaggat cggggtttaa agtttgaaga gatcgaagca 780

aggatgttgc

taaaggggtg gcgatcgggt cagctcgata taaccagcag 840

gtacgtttgg

caatagtgaa gatggcagtc aatttcatgc 95?9?cgttt 900

tgactagcta

tctctggcaa caatcggttt cagattcgtt taagacaacc 960

tgcagcggag

cactcaagtt gttgcgagta acggtgggat tgagcagatc 1020

atggcaatcc

gcagcagaat ctggatcaac ccttctactt tttatcggcg 1080

atgcggaggc

ggtggtgcgg agcgtggagg cgaatgagac aattcgattt 1140

ggttgtcttc

ggtgagtttg gagcggggtg agaagtcgat ttttagcgcg 1200

ctggaaatga

gattggggaa attgagcagg aaggtcgcag agggatggtg 1260

aactgcgcaa

gggtgatctg aacgcgatta aaccgggcgt gctattgcgg 1320

gagggttgaa

gcctgatttt aagttaagaa tcgggttaga tccgtcgttg 1380

5

gggaaggatc

gagtcgcaag

tctcgctcta

ccgttgacgg

attcagccat

gtggcatctg

ggacaggtgg

aatggtgata

tttttgtatc

acgggggagg

gtgatggtga

gcggcgcgag

gaggatgcgt

gattctgttc

tcgacgccga

tcgaagccgc gaagcaattg cattcatgca ctatcgggtg ctaatttgcc gaatattggc cgacatttag ggagacgagt tgaagacgtt tttggcgaag gggttcgacc tgcggggttg gtgcgaatcg ctttaagccg aatccctcta tgtggcggcg cgccttctga ggcgatggac agaaggttgt gaagggttgg tttcgagtgg gcagcctgtc gaagaggtgt gtcttctagc tggaggcgat gagtgcgctg cggtttcccg cgatgtgaaa ttgaggtggt gaag

ctgagccagg tgaagaattt ggacggatga cgcaggagat agtacagggc tgatgacggg gaggggattg aggatgcgat gagattctga atgcgatcgg agtgtgcggg tagatgcgat gaaacacctt accaggtgac atttcgattg ggtcggcggg aatgtttccg aggatagtgc cagactggga aattgccagg tatgatgcgc tgaaggcttt cgaggtccat ctagtgcgcc ctgggggatc tggatcgcaa ggggtggcga ctcgtcagat

cgaggtggtg

1440

tcaaactgcg

1500

ggcactgagt

1560

cgcgcgtctc

1620

gggcgttgat

1680

taagccaggt

1740

gattcggaac

1800

tcggctgcgc

1860

tcggattggg

1920

gacggtggag

1980

gaaggcgatc

2040

tgcgacgggt

2100

tactcgcagc

2160

tagtgtgatt

2220

2244

<210> 47 <211> 748 <212> PRT

<213> Leptolyngbya sp.

<400> 47

Met Pro Arg lie Lys Arg Arg His Phe Leu Gln Ala Ala Gly Ser Ser 15 10 15

Leu Ala Ala lie Gly Leu Ser Gln Leu Asp Val Phe Arg Gln Ala Glu 20 25 30

Gln Tyr Gly Lys Val Leu Ala Gln Ser Ser Gln Arg Lys Leu Ala Leu 35 40 45

Leu Val Gly lie Asn Gly Tyr Pro Glu Ser Val Gly Ser Leu Gln Gly 50 55 60

Cys Leu Thr Asp Leu Glu Met Gln Tyr Glu Leu Leu Arg Tyr Arg Tyr 65 70 75 80

Gly Phe Ala Lys Asn Asp lie Leu Val Leu Ala Asp Arg Arg Leu Ser 85 90 95

Claims (14)

1. 5

   10
2. 2.

   15
3. 3.

   20
4. 4.

   25

   30

   35

   40

   45
5. 5.

   50
6. 6.

   55
7. 7.

   60

   Método para prevenir la propagación involuntaria de un microorganismo, en el que el método comprende cultivar un microorganismo recombinante manipulado genéticamente para que comprenda dos o más genes exógenos de toxina de tipo II, codificando cada gen una toxina de tipo II diferente y encontrándose cada uno operablemente ligado a un promotor regulable al que cada gen de toxina de tipo II no se encuentra naturalmente ligado, en el que dos o más genes de toxina de tipo II codifican, cada uno, una endorribonucleasa, y en el que la secuencia de los dos o más genes de toxina de tipo II han sido modificados, cada uno, para eliminar por lo menos un sitio diana de la endorribonucleasa codificada en el ARN transcrito de toxina de tipo II y en el que el promotor regulable está regulado por uno o más de luz, temperatura, pH o presencia o ausencia de uno o más nutrientes o compuestos en el mdio de cultivo o entorno del microorganismo.

   Método según la reivindicación 1, en el que el promotor regulable está regulado por el pH o la presencia o ausencia de nitrógeno, fósforo, azufre, hierro, cobre o CO2, y opcionalmente en el que el promotor es un promotor sintético.

   Método según la reivindicación 1 o 2, en el que los genes de toxina se encuentran operablemente ligados a promotores regulados por la presencia o ausencia de diferentes nutrientes o compuestos.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se satisface por lo menos una de las condiciones siguientes:

   (1) el microorganismo recombinante es un microorganismo fotosintético, por ejemplo un microalga eucariótica, opcionalmente de una especie deAchnanthes, Amphiprora, Amphora, Ankistrodesmus, Asteromonas, Boekelovia, Borodinella, Botryococcus, Bracteococcus, Chaetoceros, Cartería, Chlamydomonas, Chlorococcum, Chlorogonium, Chlorella, Chroomonas, Chrysosphaera, Cricosphaera, Crypthecodinium, Cryptomonas, Cyclotella, Dunaliella, Ellipsoidon, Emiliania, Eremosphaera, Ernodesmius, Euglena, Franceia, Fragilaria, Gloeothamnion, Haematococcus, Halocafeteria, Hymenomonas, Isochrysis, Lepocinclis, Micractinium, Monoraphidium, Nannochloris, Nannochloropsis, Navicula, Neochloris, Nephrochloris, Nephroselmis, Nitzschia, Ochromonas, Oedogonium, Oocystis, Ostreococcus, Pavlova, Parachlorella, Pascheria, Phaeodactylum, Phagus, Picochlorum, Platymonas, Pleurochrysis, Pleurococcus, Prototheca, Pseudochlorella, Pseudoneochloris, Pyramimonas, Pyrobotrys, Scenedesmus, Schizochlamydella, Skeletonema, Spyrogyra, Stichococcus, Tetrachorella, Tetraselmis, Thalassiosira, Viridiella o Volvox, o

   (2) el microorganismo recombinante es una cianobacteria, opcionalmente de una especie de Acaryochloris, Agmenellum, Anabaena, Anabaenopsis, Anacystis, Aphanizomenon, Arthrospira, Asterocapsa, Borzia, Calothrix, Chamaesiphon, Chlorogloeopsis, Chroococcidiopsis, Chroococcus, Crinalium, Cyanobacterium, Cyanobium, Cyanocystis, Cyanospira, Cyanothece, Cylindrospermopsis, Cylindrospermum, Dactylococcopsis, Dermocarpella, Fischerella, Fremyella, Geitleria, Geitlerinema, Gloeobacter, Gloeocapsa, Gloeothece, Halospirulina, Iyengariella, Leptolyngbya, Limnothrix, Lyngbya, Microcoleus, Microcystis, Myxosarcina, Nodularia, Nostoc, Nostochopsis, Oscillatoria, Phormidium, Planktothrix, Pleurocapsa, Prochlorococcus, Prochloron, Prochlorothrix, Pseudanabaena, Rivularia, Schizothrix, Scytonema, Spirulina, Stanieria, Starria, Stigonema, Symploca, Synechococcus, Synechocystis, Thermosynechocystis, Tolypothrix, Trichodesmium, Tychonema o Xenococcus.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el microorganismo recombinante incluye además un gen de antitoxina operablemente ligado a un promotor al que el gen de antitoxina no se encuentra ligado naturalmente, opcionalmente en el que el promotor operablemente ligado al gen de antitoxina se encuentra regulado de manera diferente al promotor operablemente ligado a por lo menos un gen de toxina.

   Método según la reivindicación 5, en el que el promotor operablemente ligado al gen de antitoxina es encuentra activo bajo condiciones de abundancia de nutrientes y por lo menos un promotor operablemente ligado a por lo menos un gen de toxina se encuentra activo bajo condiciones de falta de uno o más nutrientes, tales como nitrógeno, fósforo, azufre, hierro, cobre o CO2.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el microorganismo recombinante es un alga eucariótica y el promotor operablemente ligado a por lo menos un gen de toxina es un promotor constitutivo y/o una secuencia de ácidos nucleicos que comprende por lo menos 100 pares de bases contiguas de SEC ID n° 56, SEC ID n° 57, SEC ID n° 58, SEC ID n° 59, SEC ID n° 60, SEC ID n° 61, SEC ID n° 62, SEC ID n° 63, SEC ID n° 64 o SEC ID n° 65

   Método según la reivindicación 6 o 7, en el que el microorganismo recombinante incluye por lo menos un gen de toxina de tipo II manipulado para ser insensible a por lo menos dos de las toxinas codificadas por uno o más genes de toxina de tipo II.

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55
8. 9. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se satisface una o más cualesquiera de las condiciones siguientes:

   (1) el gen de toxina codifica una toxina de la familia de la toxina CcdB, de la familia de la toxina RelE, de la familia de la toxina MazF, de la familia de la toxina ParE, de la familia de la toxina PIN, de la familia de la toxina AhaI, de la familia de la toxina MNT, de la familia de la toxina Doc, de la familia de la toxina VapC, de la familia de la toxina zeta, de la familia de la toxina HipA, o de la familia de la toxina HigB; el gen de toxina se selecciona de entre el grupo que consiste en homólogos de txe, doc, mazF, hicA, vapC, pemK, ccdB, relE, parE, PIN, kiD, yafQ, rv3182, stbE, yoeB, Z5902 y combinaciones de los mismos.

   (2) el microorganismo o cianobacteria es un microorganismo fotosintético,

   (3) el microorganismo recombinante es una cianobacteria, opcionalmente de una especie de Acaryochloris, Agmenellum, Anabaena, Anabaenopsis, Anacystis, Aphanizomenon, Arthrospira, Asterocapsa, Borzia, Calothrix, Chamaesiphon, Chlorogloeopsis, Chroococcidiopsis, Chroococcus, Crinalium, Cyanobacterium, Cyanobium, Cyanocystis, Cyanospira, Cyanothece, Cylindrospermopsis, Cylindrospermum, Dactylococcopsis, Dermocarpella, Fischerella, Fremyella, Geitleria, Geitlerinema, Gloeobacter, Gloeocapsa, Gloeothece, Halospirulina, Iyengariella, Leptolyngbya, Limnothrix, Lyngbya, Microcoleus, Microcystis, Myxosarcina, Nodularia, Nostoc, Nostochopsis, Oscillatoria, Phormidium, Planktothrix, Pleurocapsa, Prochlorococcus, Prochloron, Prochlorothrix, Pseudanabaena, Rivularia, Schizothrix, Scytonema, Spirulina, Stanieria, Starria, Stigonema, Symploca, Synechococcus, Synechocystis, Thermosynechocystis, Tolypothrix, Trichodesmium, Tychonema o Xenococcus.
9. 10. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la toxina y/o antitoxina es una toxina o antitoxina de Acaryochloris, Anabaena, Chlorobium, Cyanothece, Gloeobacter, Microcystis, Nostoc, Prochlorococcus, Rhodopseudomonas, Synechococcus, Synechocystis, Thermosynochocystis o Trichodesmium.
10. 11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en el que el gen de antitoxina codifica una antitoxina de tipo II.
11. 12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, en el que el gen de antitoxina codifica una

    antitoxina de la familia de la antitoxina CcdA, de la familia de la antitoxina CcdB, de la familia de la antitoxina RelB, de la familia de la antitoxina MazE, de la familia de la antitoxina ParD, de la familia de la

    
    antitoxina PIN, de la familia de la antitoxina MNT, de la familia de la antitoxina RHH, de la familia de la

    
    antitoxina ArsR, de la familia de la antitoxina HEPN, de la familia de la antitoxina Phd, de la familia de la

    
    antitoxina VapB, de la familia de la antitoxina epsilón, de la familia de la antitoxina zeta, de la familia de la

    antitoxina HipB o de la familia de la antitoxina HigA.
12. 13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, en el que el gen de antitoxina se selecciona de entre el grupo que consiste en homólogos cianobacterianos de axe, phd, mazE, hicB, vapB, pemI, relB, parD, kiS, ccdA, yafN, stbD, yoeM, PIN y combinaciones de los mismos.
13. 14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13, en el que el gen de toxina y el gen de antitoxina comprende un sistema u operón de toxina-antitoxina de tipo II.
14. 15. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se satisface por lo menos una de las condiciones siguientes:

    (1) el promotor regulable está regulado por la presencia o ausencia de un compuesto en el cultivo celular, medio y/o entorno celular,

    (2) el promotor regulable es sensible a la luz, temperatura, pH, estado metabólico o una combinación de los mismos,

    (3) el promotor regulable se selecciona de entre el grupo que consiste en el promotor trp, el promotor inducible por arabinosa (p.ej. L-arabinosa), el promotor inducible por IPTG (isopropil-p-D- tiogalactopiranósido), el promotor lac, el promotor tac , el promotor trc, el promotor trcE, el promotor trcY, el promotor secA, el promotor glnA, el promotor psbA, el promotor nar, el promotor ntc, el promotor nir, el promotor nr, el promotor pho, el promotor pst, el promotor nrs, el promotor ara, el promotor rha, el promotor tet, el promotor cys, el promotor metalotioneína, el promotor ftf, el promotor de choque térmico, el promotor inducible por frío, un promotor vírico, el promotor hin, el promotor cin, el promotor gin, el promotor fimA, una variante o híbrido de los mismos, y una combinación de los mismos.

    imagen1

    imagen2

    imagen3

    imagen4

    imagen5

    imagen6

    E. coli_MazF

    CD

    MazE-i nsens

    CD

    E. coli_MazF

    (81)

    MazE-i nsens

    (81)

    E. coli_MazF

    (161)

    MazE-i nsens

    (161)

    E. coli_MazF

    (241)

    MazE-i nsens

    (241)

    E. coli_MazF

    (321)

    MazE-i nsens

    (321)

    1 80 AT GGT AAGCCGATACGTACCCGATATGGGCGATCTGATTTGGGTTGATTTTGACCCGACAAAAGGTAGCGAGCAAGCTGG ATGGT AAGCCGATACGT ACCCGATATGGGCGAT CT GATTT GGGTT GATTTTGACCCGACCAAAGGTAGCGAGCAAGCTGG 81 160 ACATCGTCCAGCTGTTGTCCTGAGTCCTTTCATGTACAACAACAAAACAGGTATGTGTCTGTGTGTTCCTTGTACAACGC GCATCGTCCAGCTGTTGTCCTGAGTCCTTTCATGTATAATAATAAAACCGGTATGTGTCTGTGTGTTCCTTGTACCACGC 161 240

    AAT CAAAAGGATATCCGTTCGAAGTTGTTTTATCCGGTCAGGAACGTGATGGCGTAG CGTTAGCTGATCAGGTAAAAAGT AAT CAAAAGGAT AT CCGTT CGAAGTTGTTTTATCCGGTCAGGAACGTGATGGCGTAG CGTTAGCTGATCAGGTAAAAAGT 241 320

    ATCGCCTGGCGGGCAAGAGGAGCAACGAAGAAAGGAACAGTTGCCCCAGAGGAATTACAACTCATTAAAGCCAAAATTAA ATCGCCTGGCGGGCAAGAGGAGCAACGAAGAAAGGAACCGTTGCCCCAGAGGAATTGCAACTCATTAAAGCCAAAATTAA 321 336

    CGTACTGATTGG GTAG CGTACTGATTGG GTAG

    Figura 7

    pemK_native pemK_ insens

    pemK_nati ve pemK_ insens

    pemK_native pemK_ insens

    pemK_native pemK_ insens

    pemK_nati ve pemK_ insens

    pemK_native pemK_ insens

    1 80 (1) ATGCTGAAATATCAGCTGAAGAACGAGAATGGCTGGATGCACCGGCGACTGGTCAGGAGGAAATCTGACATGGAAAGAGG (1) ATGCTGAAATACCAGCTGAAGAACGAGAATGGCTGGATGCACCGGCGACTGGTCAGGAGGAAATCTGACATGGAAAGAGG 81 160 (81) GGAAATCTGGCTTGTCTCGCTTGATCCTACCGCAGGTCATGAGCAGCAGGGAACGCGGCCGGTGCTGATTGTCACACCGG (81) GGAAATCTGGCTTGTCTCGCTTGATCCCACCGCAGGTCATGAGCAGCAGGGAACGCGGCCGGTGCTGATTGTCACACCGG 161 240

    (161) CGGCCTTTAATCGCGTGACCCGCCTGCCTGTTGTTGTGCCCGTAACCAGCGGAGGCAATTTTGCCCGCACTGCCGGCTTT (161) CGGCCTTCAATCGCGTGACCCGCCTGCCTGTTGTTGTGCCCGTGACCAGCGGAGGCAATTTTGCCCGCACTGCCGGCTTT 241 320

    (241) GCGGTGTCGTTGGATGGTGTTGGCATACGTACCACAGGTGTTGTACGTTG CGATCAACCCCGGACAATTGATATGAAAGC (241) GCGGTGTCGTTGGATGGTGTTGGCATCCGCACCACAGGTGTTGTGCGTTGCGATCAACCCCGGACAATTGACATGAAAGC 321 400

    (321) ACGGGGCGGAAAACGACTCGAACGGGTTCCGGAGACTATCATGAACGAAGTTCTTGGCCGCCTGTCCACTATT CTGACTT (321) ACGGGGCGGAAAACGACTCGAACGGGTTCCGGAGACCATCATGAACGAAGTTCTTGGCCGCCTGTCCACTATTCTGACTT 401

    (401) GA (401) GA

    Figura 8

    yafQ (1) MazE,YafQ-insens (1)

    yafQ (81) MazE,YafQ-insens(81)

    yafQ (161) MazE,YafQ-i nsen(161)

    yafQ (241) MazE,YafQ-i nsen(241)

    
    1 80

    
    AT GATT CAAAGGGAT ATT GAATACT CGGGACAAT ATT CAAAGGATGTAAAACTTGCACAAAAGCGT CATAAGGATATGAA AT GATTCAAAGGGATATTGAATACT CGGGCCAATATTCAAAGGATGTAAAACTTGCTCAAAAGCGTCATAAGGATATGAA 81 160

    
    TAAATT GAAAT AT CTT AT GACGCTT CTT AT CAATAAT ACTTTACCG CTT CCAGCT GTTTAT AAAGACCACCCGCTGCAAG TAAATT GAAATATCTTATGACGCTT CTTATCAATAATACTTTACCG CTTCCAGCTGTTTATAAAGACCACCCGCTGCAAG 161 240

    
    GTT CAT GGAAAGGTT AT CGCGATGCTCATGTCGAACCGGACTG GAT CCTGATTTACAAACTTACCGATAAACTTTTACGA GTT CAT GGAAGGGTTATCG CGATGCTCATGTCGAACCGGACTGGATCCTGATTTATAAACTTACCGATAAACTTTTACGA 241 279

    TTT GAGAGAACTGGAACTCACGCGGCGCTCTTTGGGTAA TTT GAGAGAACTGGAACTCACGCGGCGCTCTTTGGGTAA

    Figura 9