ES2671473T3 - Reactivos y métodos para la detección de cáncer de mama - Google Patents

Abstract

Una composición que consiste en entre 2 y 25 marcadores de detección de anticuerpos, en la que la composición incluye al menos dos proteínas, en la que las al menos dos proteínas comprenden (a) angiopoyetina tipo 4 (ANGPTL4) o un fragmento antigénico de la misma, y (b) al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste en el inhibidor de la ruta de señalización WNT Dickkopf 1 (DKK1), receptor de de efrina de tipo A 2 (EPHA2), subunidad de laminina gamma 2 (LAMC2), espondina 2 (SPON2), subunidad del receptor de secuencia señal 2 (SSR2), Lectina, unión a galactosa, soluble 1 (GAL1), proteína de anclaje ligada a GPI (GFRA1), repetición rica en leucina que contiene 15 (LRRC15), CD147, CD320, cadherina 3 (CDH3), proteína relacionada con receptor de lipoproteína de baja densidad (LRP10), inhibidor de serina peptidasa Kunitz tipo 2 (SPINT2), dominio de sushi 10 que contiene 2 (SUSD2), y cistatina SA (CST2), o fragmentos antigénicos de los mismos.

Description

DESCRIPCIÓN

Reactivos y métodos para la detección de cáncer de mama 5 Referencia cruzada

Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N.° de Serie 61/954.914, presentada el 18 de marzo de 2014.

10 Antecedentes

Para pacientes con cáncer de mama (BCa), el diagnóstico precoz y personalizado es crucial para optimizar los tratamientos que conducen a la supervivencia a largo plazo. Aunque la mamografía es el método más utilizado para detectar BCa, aproximadamente el 20 % de las mamografías de detección dan como resultado un diagnóstico de 15 falso negativo en gran parte debido a la alta densidad mamaria. Además, 1 de cada 10 mujeres que se hacen una mamografía necesitarán imágenes adicionales. Sin embargo, la abrumadora mayoría de estas mujeres no tendrán BCa, ya que solo de 2 a 4 de cada 1.000 mamografías de detección conducen a un diagnóstico de cáncer. Por lo tanto, existe la necesidad clínica urgente de desarrollar una nueva estrategia de diagnóstico mínimamente invasiva para el diagnóstico precoz y la monitorización de BCa.

20

Resumen de la invención

El alcance de la protección se define por las reivindicaciones adjuntas. Todas las realizaciones mencionadas a continuación incluyen al menos la presencia o detección de ANGPTL4.

25

En un primer aspecto, la invención proporciona composiciones que consisten en entre 2 y 25 marcadores de detección de anticuerpos, en donde la composición incluye reactivos para detectar autoanticuerpos humanos contra al menos dos proteínas seleccionadas del grupo que consiste en ANGTPL4, DKK1, EPHA2, LAMC2, SPON2, SSR2, GAL1, GFRA1, LRRC15, CD147, CD320, CDH3, LRP10, SPINT2, SUSD2, y CST2. En una realización, la 30 composición incluye reactivos para detectar autoanticuerpos humanos contra al menos dos proteínas seleccionadas del grupo que consiste en ANGPTL4, DKK1, EPHA2, GAL1, LAMC2, SPON2, CST2, SPINT2 y SSR2. En una realización adicional, la composición incluye reactivos para detectar autoanticuerpos humanos contra al menos 5 proteínas en el grupo mencionado. En otra realización, la composición incluye además reactivos para detectar autoanticuerpos humanos contra uno o ambos de MUC1 y GRN. En diversas realizaciones, la composición consiste 35 en entre 2 y 20, 4 y 10, y 5-10 marcadores de detección de anticuerpos. En diversas realizaciones adicionales, la composición incluye reactivos para detectar autoanticuerpos humanos contra uno de los siguientes conjuntos de marcadores:

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GFRA1, GRANULINA, LRRC15, y MUC1;

40 ANGPTL4, DKK1, GAL1, GRANULINA, LRRC15, y MUC1;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, y LRRC15;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GFRA1, y LRRC15;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GFRA1, GRANULINA, y LRRC15;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GRANULINA, y LRRC15;

45 ANGPTL4, DKK1, GAL1, LRRC15, y MUC1;

ANGPTL4, GAL1, LRRC15, y MUC1;

ANGPTL4, GAL1, y LRRC15;

ANGPTL4, GAL1, GFRA1, y LRRC15;

ANGPTL4, GAL1, GFRA1, LRRC15, y MUC1;

50 ANGPTL4, GAL1, y GFRA1;

En otra realización, los reactivos para detectar autoanticuerpos humanos comprenden las al menos dos proteínas, o fragmentos antigénicos de las mismas. En una realización adicional, las al menos dos proteínas, o fragmentos antigénicos de las mismas, comprenden dominios extracelulares nativos y/o proteínas secretadas nativas o 55 fragmentos antigénicos de las mismas. En una realización adicional, los reactivos están marcados de forma detectable. En otra realización, los reactivos se inmovilizan en una superficie.

En otro aspecto, la invención proporciona métodos para detectar cáncer de mama o recidiva de la enfermedad, que comprenden poner en contacto una muestra de fluido corporal de un sujeto con riesgo de cáncer de mama o recidiva

de cáncer de mama con uno o más reactivos para detectar autoanticuerpos contra uno o más de ANGTPL4, DKK1, EPHA2, LAMC2, SPON2, SSR2, GAL1, GFRA1, LRRC15, CD147, CD320, CDH3, LRP10, SPINT2, SUSD2 y CST2, en los que la presencia de autoanticuerpos contra la una o más proteínas se correlaciona con la probabilidad de que el sujeto tenga cáncer de mama o recidiva de cáncer de mama. En otra realización, los reactivos comprenden 5 reactivos para detectar autoanticuerpos contra uno o más de ANGPTL4, DKK1, EPHA2, GAL1, LAMC2, SPON2, CST2, SPINT2 y SSR2. En diversas realizaciones adicionales, los reactivos comprenden reactivos para detectar autoanticuerpos dos o más, o cinco o más de las proteínas mencionadas. En otra realización, los reactivos comprenden reactivos para detectar autoanticuerpos humanos contra uno de los siguientes conjuntos de marcadores:

10

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GFRA1, GRANULINA, LRRC15, y MUC1;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GRANULINA, LRRC15, y MUC1;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, y LRRC15;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GFRA1, y LRRC15;

15 ANGPTL4, DKK1, GAL1, GFRA1, GRANULINA, y LRRC15;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GRANULINA, y LRRC15;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, LRRC15, y MUC1;

ANGPTL4, GAL1, LRRC15, y MUC1;

ANGPTL4, GAL1, y LRRC15;

20 ANGPTL4, GAL1, GFRA1, y LRRC15;

ANGPTL4, GAL1, GFRA1, LRRC15, y MUC1;

ANGPTL4, GAL1, y GFRA1.

En una realización adicional, los reactivos comprenden reactivos para detectar autoanticuerpos humanos contra 25 ANGPTL4, DKK1, GAL1, MUC1, GFRA1, GRN y LRRC15. En otra realización, el uno o más reactivos comprenden la composición de cualquier realización o combinación de realizaciones de la invención. En una realización adicional, el contacto comprende el uso de ELISA. En otra realización, la muestra de fluido corporal comprende una muestra de suero del sujeto. En una realización adicional, el método identifica al sujeto como con probabilidad de tener cáncer de mama o recidiva de cáncer de mama. En una realización adicional, el método comprende además tratar al 30 sujeto con una cantidad de un agente terapéutico suficiente para tratar el cáncer de mama o la recidiva de cáncer de mama.

Se desvelan métodos para tratar un sujeto con cáncer de mama, que comprenden:

35 (a) analizar una muestra de fluido corporal de un sujeto con riesgo de cáncer de mama, e identificar sujetos candidatos que:

(i) tienen autoanticuerpos contra al menos uno de ANGPTL4, DKK1, GAL1, MUC1, GFRA1, GRN y LRRC15; y/o

(ii) no tienen autoanticuerpos contra GFRA1, GRN y/o LRRC15; y

40 (B) tratar a los sujetos candidatos con una cantidad de un agente terapéutico suficiente para tratar el cáncer de mama.

El contacto comprende el uso de cribado de ensayo longitudinal, en el que todos los biomarcadores diana pueden detectarse y cuantificarse en un único ensayo y dilución. La muestra de fluido corporal comprende una muestra de 45 suero del sujeto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. La conformación del antígeno afecta al reconocimiento del anticuerpo. A, análisis ELISA usando un 50 antígeno diseñado para tener una conformación nativa. Los pocillos se recubrieron con IgG anti-conejo seguido de la proteína HER-2-ECD-rFc generada en células 293T. Se usaron diluciones en serie de anticuerpos monoclonales anti-HER-2 generados contra HER-2 nativo, 3F32 (azul), Herceptina (verde) o contra HER-2 desnaturalizado, 3F27 (rojo) en ELISA. Las reacciones se desarrollaron después de la adición del anticuerpo secundario apropiado. La O.D. es la lectura de absorbancia para la reacción. B, análisis ELISA usando un antígeno desnaturalizado. Los 55 pocillos se recubrieron con His-HER-2-ECD purificado generado en E. coli, y se añadieron diluciones en serie de 3F32 (azul), Herceptina (verde) o 3F27 (rojo). Después de la adición del anticuerpo secundario, se desarrollaron las reacciones. C, detección de HER-2 nativa en células SKBR3 mediante citometría de flujo. La fluorescencia indica el reconocimiento de anticuerpos de HER-2 en la superficie de las células SKBR3. D, ensayo de competencia de unión para demostrar la especificidad del ELISA de antígeno que lleva la conformación. Los pocillos se recubrieron

previamente con IgG anti-conejo seguido de HER-2-ECD-rFc. Las proteínas quiméricas purificadas HER-2-Fc (negro) o CD30-Fc (púrpura) se diluyeron en serie y se añadieron a una cantidad constante de Herceptina antes de la adición a los pocillos. Las reacciones se desarrollaron después de la incubación con el anticuerpo secundario.

5 Figura 2. Comparación de la curva ROC para la clasificación de pacientes con cáncer de mama. Las respuestas de autoanticuerpos contra siete antígenos (es decir, ANGPTL4, DKK1, GAL1, GFRA1, GRN, LRRC15 y MUC1) se añadieron a un modelo de regresión logística que incluía edad, IMC, raza y estado de fumador actual. Las curvas ROC se determinaron para todos los sujetos (arriba) y por subtipos específicos de cáncer de mama, incluyendo ER positivo, invasivo, dimensión tumoral máxima >1 cm, in situ, afectación de ganglios linfáticos y amplificación de HER- 10 2 (abajo).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Dentro de esta solicitud, a menos que se indique lo contrario, las técnicas utilizadas se pueden encontrar en 15 cualquiera de referencias ya conocidas tales como: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, editado por D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, Calif ), "Guide to Protein Purification" en Methods in Enzymology (M. P. Deutshcer, ed., (1990) Academic Press, Inc.); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, Calif.), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2a Ed. (R. I. 20 Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, N.Y.), Gene Transfer and Expression Protocols, págs. 109-128, ed. E. J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.), y el Ambion 1998 Catalog (Ambion, Austin, Tex.).

En un primer aspecto, la presente invención proporciona composiciones que consisten en entre 2 y 25 marcadores de detección de anticuerpos, en donde la composición incluye reactivos para detectar autoanticuerpos humanos 25 contra al menos dos proteínas humanas seleccionadas del grupo que consiste en ANGTPL4, DKK1, EPHA2, LAMC2, SPON2, SSR2, GAL1, GFRA1, LRRC15, CD147, CD320, CDH3, LRP10, SPINT2, SUSD2, y CST2. Los inventores han descubierto inesperadamente que los autoanticuerpos contra las proteínas mencionadas proporcionan una indicación de si un sujeto padece cáncer de mama (BCa). Por lo tanto, las composiciones de la invención pueden usarse, por ejemplo, en ensayos de diagnóstico para discriminar entre BCa y pacientes sanas 30 mediante la detección de anticuerpos en una muestra del sujeto o para detectar la recidiva de la enfermedad en un paciente con cáncer de mama después del tratamiento. En una realización, la composición incluye reactivos para detectar autoanticuerpos humanos contra al menos dos proteínas humanas seleccionadas del grupo que consiste en ANGPTL4, DKK1, EPHA2, GAL1, LAMC2, SPON2, CST2, SPINT2 y SSR2.

35 En diversas realizaciones, la composición incluye reactivos para detectar autoanticuerpos humanos contra al menos tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince o dieciséis proteínas en el grupo mencionado. En diversas realizaciones adicionales, la composición consiste en entre 2-24, 2-23, 2-22, 2-21, 2-20, 219, 2-18, 2-17, 2-16, 2-15, 2-14, 2-13, 2-12, 2-11,2-10, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 2-4, 2-3, 3-25, 3-24, 3-23, 3-22, 3-21, 3-20, 3-19, 3-18, 3-17, 3-16, 3-15, 3-14, 3-13, 3-12, 3-11, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-25, 4-24, 4-23, 4-22, 440 21, 4-20, 4-19, 4-18, 4-17, 4-16, 4-15, 4-14, 4-13, 4-14, 4-13, 4-12, 4-11,4-10, 4-9, 4-8, 4-7, 4-6, 4-5, 5-25, 5-24, 523, 5-22, 5-21, 5-20, 5-19, 5-18, 5-17, 5-16, 5-15, 5-14, 5-13, 5-12, 5-11, 5-10, 5-9, 5-8, 5-7, 5-6, 6-25, 6-24, 6-23, 6

22, 6-21,6-20, 6-19, 6-18, 6-17, 6-16, 6-15, 6-14, 6-13, 6-12, 6-11,6-10, 6-9, 6-8, 6-7, 7-25, 7-24, 7-23, 7-22, 7-21, 7-20, 7-19, 7-18, 7-17, 7-16, 7-15, 7-14, 7-13, 7-12, 7-11, 7-10, 7-9, 7-8, 8-25, 8-24, 8-23, 8-22, 8-21, 8-20, 8-19, 818, 8-17, 8-16, 8-15, 8-14, 8-13, 8-12, 8-11, 8-10, 8-9, 9-25, 9-24, 9-23, 9-22, 9-21, 9-20, 9-19, 9-18, 9-17, 9-16, 945 15, 9-14, 9-13, 9-12, 9-11, 9-10, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10-11, 12, 13, 14, 15, o 16 reactivos de detección de

anticuerpos.

Como entenderán los expertos en la técnica, las composiciones pueden incluir marcadores y controles de detección de anticuerpos adicionales según sea apropiado para un uso pretendido de la composición. En una realización no 50 limitante, las composiciones pueden comprender además reactivos para detectar anticuerpos contra uno o ambos de mucina-1 (MUC1), HER-2 (41), IGFBP2 y GRANULINA (GRN).

En realizaciones adicionales, las composiciones comprenden o consisten en reactivos para detectar autoanticuerpos humanos contra uno de los siguientes conjuntos de marcadores, que se muestran en los ejemplos que siguen 55 (véase la Tabla 5) para proporcionar un fuerte valor predictivo para diagnosticar el cáncer de mama:

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GFRA1, GRANULINA, LRRC15, y MUC1;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GRANULINA, LRRC15, y MUC1;

5

10

15

20

25

30

ANGPTL4, DKK1, GAL1, y LRRC15;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GFRA1, y LRRC15;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GFRA1, GRANULINA, y LRRC15;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GRANULINA, y LRRC15;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, LRRC15, y MUC1;

ANGPTL4, GAL1, LRRC15, y MUC1;

ANGPTL4, GAL1, y LRRC15;

ANGPTL4, GAL1, GFRA1, y LRRC15;

ANGPTL4, GAL1, GFRA1, LRRC15, y MUC1;

ANGPTL4, GAL1, y GFRA1.

En otra realización, las composiciones comprenden o consisten en reactivos para detectar autoanticuerpos humanos contra ANGPTL4, DKK1, GAL1, MUC1, GFRA1, GRN y LRRC15 humanas.

Los marcadores de detección de anticuerpos pueden ser cualquier reactivo adecuado que pueda usarse para detectar anticuerpos contra las proteínas mencionadas, incluyendo, pero sin limitación, la proteína indicada, una versión secretada de la proteína (tal como una forma nativa secretada de la proteína), o un dominio extracelular de la proteína. Las proteínas secretadas se administran con más facilidad desde las células tumorales a los ganglios linfáticos, donde tienen lugar las interacciones de las células inmunitarias, lo que da como resultado abundantes anticuerpos de alta afinidad. Las proteínas de la superficie de la membrana se liberan comúnmente en forma soluble a partir de células tumorales a través de la escisión dependiente de metaloproteinasas. Las proteínas desprendidas se transfieren más fácilmente a los ganglios linfáticos que la proteína intracelular. Por lo tanto, en una realización, el marcador de detección de anticuerpos es una porción secretada o de membrana de la proteína mencionada. Las secuencias de aminoácidos ejemplares de la porción secretada o de membrana de las proteínas humanas mencionadas se muestran a continuación.

ANGTPL4 (SEQ ID NO: 1)

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DKK1 (SEQ ID NO:2)

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YN V RRTEGFS VTLDDLAPDTTYL VQVQ A LTQEGQGAGSK VHEPQTLSPEGSGNL

LAMC2 (SEQ ID NO:4)

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SQKVSDASDKTGQAERALGSAAiADAQRAKNGAGEALEiSSEIEQElGSLNLEANVTA

DGALAMEKGLASLKSEMREVEGELERKELEFDTNMDAVQMVITEAQKVDTRAKNA

G VTIODTLNTLDGLLH LM G M

SPON2 (SEQ ID NO:5)

5

10

QPLGGESICSARAPAKYS1TFTGKWSQTAFPKQYPLFRPPAQWSSLLGAAHSSDYSM

WRKNQYVSNGLRDFAERGEAWALMKEÍEAAGEALQSVHEVFSAPAVPSGTGQTSA

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SSR2 (SEQ ID NO:6)

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MLNVKWDR1APASNVSHTVVLRPLKAGYFN.FTSAT1TY.LAQEDGPVVIGSTSAPGQG G f LA Q R E F D R R F S PH

GAL1 (SEQ ID NO:7)

LR.VRGEVAPDAKSFVLNLGKDSNNLCLHFNPRFNAHGDAJNTIVCNSKDGGA.WGTE

QREAVFPFQPGSVAEVCTTFDQANLTVKLPDGYEFKFPNRLN'LEATNYMAADGDFKl

KC-VAFD

GFRA1 (SEQ ID NO:8)

DRLDCVKASDQCLKEQSCSTKYRTLRQCVAGKETNFSLASGLEAKDECRSAMEALK

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LRRC15 (SEQ ID NO:9)

YHGCPSECTCSRASQVECTGARTVAVPTPLPWNAMSLQTLNTTTFFELNESPFLNISALÍ

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GRN (SEQ ID NO:10)

TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSC1 FTVSGTSSCCPFP8AVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQF EC PDF STCCV M VDGSWGCCPM PQASCC EDRVH CC PH GAFC D LVHTRCITPTGTH P L AKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDH

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MUC1 (SEQ ID NO:11)

APKPATV VTGSGHASSTPG GEKETS ATQRSS VPS STEKNAFN S SLEDPSTD Y Y QELQR DISEMFLQTYKQGGFLGLSNTKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAA

SR YNL'TTSDV S VSD VFFPF SAQSGAG VPG

CD147 (SEQ ID NO:12)

AAGTVFTTV EDLGSK! LLTCSLN DSATEVTG H R W LKGGV V LK.EDA L.PGQKTEF K.V D SDDQ'WGEYSCVF LPEPMG'T AMTQ LTTGP PRVK A‘VKS SEHTNEGETA M LV CKS ES'WPV

TDWAWYKITDSEDKALMNGSESRFFVSS

CD320 (SEQ ID NO:13)

A GPSSGSCPPTKFQCRTSGLCWLTWR C DRDLDC S DG SDEEECRTEPCTQKGQCPPPP GLPC.PCTGVSDCSGGTDKKLRNCSRLACLAGELRGTLSDDC1PLTWRCDGHPDCPDS SDELGCGTNEJLPEGDATTMGPPVTLESVTSLRNATTMGPPVTLESVPSVGNATSSSA

GDQSGSPTAYG

10

EPCRAVFREAEVTLEAGGAEQEPGQALGKVFMGCPGQEPALFSTDNDDFTVRNGET

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G

HER2 (SEQ ID NO:15)

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IGFBP2 (SEQ ID NO:6)

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5

LRP10 (SEQ ID NO:17)

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5 SPINT2 (SEQ ID NO:18)

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SUSD2 (SEQ ID NO:19)

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S'RCQBA

En una realización adicional, el marcador de detección de anticuerpo es una proteína, tal como la desveladas anteriormente, es decir, en su forma nativa. Como se desvela en los ejemplos adjuntos, los inventores utilizaron un 5 sistema de expresión eucariota para generar antígenos tumorales portadores de conformación que están plegados adecuadamente y que contienen epítopos no continuos para su uso en la detección de autoanticuerpos. La proteína puede usarse en cualquier formato adecuado; en una realización no limitante, la proteína puede ser una proteína de fusión Fc.

10 En todas las realizaciones anteriores, los reactivos de detección de anticuerpos se pueden marcar con un marcador detectable. En una realización, los marcadores detectables para reactivos para detectar autoanticuerpos contra una proteína son distinguibles de los marcadores detectables para detectar autoanticuerpos contra la otra proteína. Los métodos para detectar la etiqueta incluyen, pero sin limitación, técnicas espectroscópicas, fotoquímicas, bioquímicas, inmunoquímicas, físicas o químicas. Se puede usar cualquier etiqueta detectable adecuada.

15

Las composiciones se pueden almacenar congeladas, en forma liofilizada, o como una solución. En una realización, las composiciones pueden colocarse sobre un soporte sólido, tal como en un formato de micromatriz o microplaca; esta realización facilita el uso de las composiciones en diversos ensayos de detección. Por ejemplo, se puede usar anti-IgG para recubrir previamente los pocillos de una placa de micropocillos y los reactivos de detección de 20 anticuerpos (tales como las proteínas analizadas en el presente documento) se pueden añadir a los pocillos recubiertos previamente.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona métodos para detectar cáncer de mama o recidiva de cáncer de mama, que comprenden poner en contacto una muestra de fluido corporal de un sujeto con riesgo de 25 cáncer de mama o recidiva de cáncer de mama con uno o más reactivos para detectar autoanticuerpos contra uno o más de ANGTPL4, DKK1, EPHA2, LAMC2, SPON2, SSR2, GAL1, GFRA1, LRRC15, CD147, CD320, CDH3, LRP10, SPINT2, SUSD2 y CST2 humanas, en los que la presencia de autoanticuerpos contra la una o más proteínas se correlaciona con la probabilidad de que el sujeto tenga cáncer de mama o recidiva de cáncer de mama.

30

En una realización, la composición incluye reactivos para detectar autoanticuerpos humanos contra al menos dos proteínas seleccionadas del grupo que consiste en ANGPTL4, DKK1, EPHA2, GAL1, LAMC2, SPON2, CST2, SPINT2 y SSR2 humanas.

35 Como entenderán los expertos en la técnica, los métodos pueden incluir el uso de marcadores y controles de detección de anticuerpos adicionales según sea apropiado para un uso pretendido de la composición. En una realización no limitante, las composiciones pueden comprender además reactivos para detectar anticuerpos contra uno o ambos de mucina-1 (MUC1), HER-2 (41), IGFBP2 y GRANULINA.

40 En otra realización de los métodos de la invención, las composiciones comprenden o consisten en reactivos para detectar autoanticuerpos humanos contra uno de los siguientes conjuntos de marcadores:

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GFRA1, GRANULINA, LRRC15, y MUC1;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GRANULINA, LRRC15, y MUC1;

45 ANGPTL4, DKK1, GAL1, y LRRC15;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GFRA1, y LRRC15;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GFRA1, GRANULINA, y LRRC15;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GRANULINA, y LRRC15;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, LRRC15, y MUC1;

50 ANGPTL4, GAL1, LRRC15, y MUC1;

ANGPTL4, GAL1, y LRRC15;

ANGPTL4, GAL1, GFRA1, y LRRC15;

ANGPTL4, GAL1, GFRA1, LRRC15, y MUC1;

ANGPTL4, GAL1, y GFRA1.

En otra realización, las composiciones comprenden o consisten en reactivos para detectar autoanticuerpos humanos contra ANGPTL4, DKK1, GAL1, MUC1, GFRA1, GRN y LRRC15.

5 Los marcadores de detección de anticuerpos pueden ser cualquier reactivo adecuado que pueda usarse para detectar anticuerpos contra las proteínas mencionadas, incluyendo, pero sin limitación, la proteína indicada, una versión secretada de la proteína (tal como una forma nativa secretada de la proteína), o un dominio extracelular de la proteína. Las proteínas secretadas se administran con más facilidad desde las células tumorales a los ganglios linfáticos, donde tienen lugar las interacciones de las células inmunitarias, lo que da como resultado abundantes 10 anticuerpos de alta afinidad. Las proteínas de la superficie de la membrana se liberan comúnmente en forma soluble a partir de células tumorales a través de la escisión dependiente de metaloproteinasas. Las proteínas desprendidas se transfieren más fácilmente a los ganglios linfáticos que la proteína intracelular. Por lo tanto, en una realización, el marcador de detección de anticuerpos es una porción secretada o de membrana de la proteína mencionada. Las secuencias de aminoácidos ejemplares de la porción secretada o de membrana de las proteínas humanas son como 15 se desvelan en el presente documento.

En otra realización, el marcador de detección de anticuerpo comprende o consiste en una composición de la invención.

20 La puesta en contacto puede realizarse bajo cualquier condición adecuada para promover la unión entre los autoanticuerpos en la muestra de fluido corporal y el reactivo para formar un complejo de unión que puede detectarse. Los expertos en la técnica pueden determinar tales condiciones apropiadas basándose en el ensayo pretendido, a la luz de las enseñanzas del presente documento. De forma similar, se puede usar cualquier etapa adicional adecuada en los métodos, tales como una o más etapas de lavado u otras etapas para eliminar los 25 reactivos no unidos.

Se puede usar cualquier técnica de detección adecuada, incluyendo, pero sin limitación, ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), plataformas de ensayo basadas en microesferas tales como los sistemas Luminex, plataformas de ensayo basadas en matrices 2-D tales como SearchLight®, y la plataforma de 30 "cribado de ensayo longitudinal" Inanovate® que puede ser capaz de cuantificar todos los biomarcadores de cáncer de mama enumerados de muestras de pacientes en sus concentraciones clínicamente relevantes en una sola prueba y dilución. En una realización, las composiciones se pueden colocar sobre un soporte sólido, tal como en una micromatriz, un portaobjetos de vidrio, una membrana, un formato de microplaca o perlas. La realización facilita el uso de las composiciones. Se proporcionan ejemplos de dichos ensayos en los ejemplos.

35

De manera similar, se puede usar cualquier fluido corporal adecuado, incluyendo, pero sin limitación, una muestra de suero, muestra de plasma o muestra de sangre del sujeto. El sujeto puede ser cualquier sujeto con riesgo de cáncer de mama, tal como un sujeto humano.

40 En una realización adicional, el método identifica al sujeto como con probabilidad de tener cáncer de mama, y en el que el método comprende adicionalmente tratar al sujeto con una cantidad de un agente terapéutico suficiente para tratar el cáncer de mama.

En una realización no limitante de cualquiera de las realizaciones anteriores, la respuesta de autoanticuerpo contra 45 ANGPTL4, DKK1, GAL1 y MUC1 está correlacionada con BCa; y las respuestas de autoanticuerpos contra GFRA1, GRN y LRRC15 están inversamente correlacionadas con BCa.

En una realización específica, los reactivos incluyen ANGPTL4, DKK1, GAL1, MUC1, GFRA1, GRN y LRRC15; donde, las respuestas de autoanticuerpos contra GFRA1, GRN y LRRC15 están inversamente correlacionadas con 50 BCa. Como se detalla en los ejemplos, cuando las respuestas de autoanticuerpos contra los 7 antígenos se añadieron al modelo base, incluida la edad, el índice de masa corporal (IMC), la raza y el hábito de fumar actual, el ensayo tenía las siguientes capacidades de diagnóstico: estadística c (95 % de IC), 0,82 (0,78 a 0,86); sensibilidad, 73 %; especificidad, 76 %; y PLR (95 % de IC), 3,04 (2,34 a 3,94). El modelo se calibró a través de deciles de riesgo (Hosmer-Lemeshow, p = 0,13) y se realizó bien en subtipos específicos de BCa, incluyendo receptores de estrógeno 55 positivos, HER-2 positivos, invasivos, in situ y tamaños tumorales >1 cm. Las capacidades de diagnóstico de otros conjuntos de marcadores ejemplares se proporcionan en la Tabla 5.

Se desvelan métodos para tratar un sujeto con cáncer de mama, que comprenden:

(a) analizar una muestra de fluido corporal de un sujeto con riesgo de cáncer de mama, e identificar sujetos candidatos que:

(i) tienen autoanticuerpos contra al menos uno de ANGPTL4, DKK1, GAL1, MUC1, GFRA1, GRN y LRRC15; y/o

(b) no tienen autoanticuerpos contra GFRA1, GRN y/o LRRC15; y 5

(b) tratar a los sujetos candidatos con una cantidad de un agente terapéutico suficiente para tratar el cáncer de mama.

Ejemplo 1

10

Los pacientes con cáncer de mama (BCa) provocan una respuesta de autoanticuerpo contra las proteínas del cáncer, lo que refleja y amplifica los cambios celulares asociados con la tumorigénesis. La detección de autoanticuerpos en plasma puede proporcionar un mecanismo mínimamente invasivo para la detección temprana de BCa. Para identificar las proteínas del cáncer que provocan una respuesta humoral, se generó una biblioteca de 15 ADNc enriquecida para genes de BCa que codifican proteínas de membrana y secretadas, que tienen más probabilidades de inducir una respuesta de anticuerpos en comparación con las proteínas intracelulares. Para generar antígenos portadores de conformación que sean reconocidos de manera eficiente por los anticuerpos de los pacientes, se estableció una estrategia de expresión eucariota. Se midió el plasma de 200 pacientes de BCa y 200 controles sanos de la misma edad para determinar la actividad de autoanticuerpos contra 20 antígenos diferentes 20 diseñados para tener epítopos conformacionales usando ELISA. Se utilizó un modelo de regresión logística condicional para seleccionar una combinación de respuestas de autoanticuerpos contra los 20 antígenos diferentes para clasificar a los pacientes con BCa de los controles sanos. La mejor combinación incluía ANGPTL4, DKK1, GAL1, MUC1, GFRA1, GRN y LRRC15; sin embargo, las respuestas de autoanticuerpos contra GFRA1, GRN y LRRC15 se correlacionaron inversamente con BCa. Cuando las respuestas de autoanticuerpos contra los 7 25 antígenos se añadieron al modelo base, incluida la edad, IMC, la raza y el hábito de fumar actual, el ensayo tenía las siguientes capacidades de diagnóstico: estadística c (95 % de iC), 0,82 (0,78 a 0,86); sensibilidad, 73 %; especificidad, 76 %; y PLR (95 % de IC), 3,04 (2,34 a 3,94). El modelo se calibró a través de deciles de riesgo (Hosmer-Lemeshow, p = 0,13) y se realizó bien en subtipos específicos de BCa, incluyendo receptores de estrógeno positivos, HER-2 positivos, invasivos, in situ y tamaños tumorales >1 cm.

30

Introducción

Para pacientes con cáncer de mama (BCa), el diagnóstico precoz y personalizado es crucial para optimizar los tratamientos que conducen a la supervivencia a largo plazo. Aunque la mamografía es el método más utilizado para 35 detectar BCa, aproximadamente el 20 % de las mamografías de detección dan como resultado un diagnóstico de falso negativo en gran parte debido a la alta densidad mamaria (1). Además, 1 de cada 10 mujeres que se hacen una mamografía necesitarán imágenes adicionales (2). Sin embargo, la abrumadora mayoría de estas mujeres no tendrán BCa, ya que solo de 2 a 4 de cada 1.000 mamografías de detección conducen a un diagnóstico de cáncer (3). Por lo tanto, existe la necesidad clínica urgente de desarrollar una nueva estrategia de diagnóstico mínimamente 40 invasiva para el diagnóstico precoz de BCa.

Actualmente, no existe un marcador tumoral establecido que se secrete en la circulación periférica que se puede medir mediante un análisis de sangre para el diagnóstico de BCa. Actualmente, los marcadores tumorales que se aceptan en la práctica clínica son marcadores pronósticos basados en tejido, como el receptor de estrógenos (ER), 45 amplificación de HER-2, Oncotype DX de 21 genes y MammaPrint de 70 genes (6-12). Todos requieren una biopsia invasiva o un procedimiento quirúrgico para adquirir tejido tumoral para su evaluación, lo que conlleva una pesada carga para los pacientes. Los marcadores tumorales séricos son herramientas valiosas que permiten procedimientos mínimamente invasivos de muestreo para promover el diagnóstico precoz del cáncer, así como seguir el pronóstico después del tratamiento (4, 5). Sin embargo, los marcadores tumorales producidos por las células tumorales 50 normalmente tienen concentraciones relativamente bajas en la circulación periférica, especialmente en las fases iniciales de la enfermedad.

Aquí se informa el uso de un enfoque molecular para identificar candidatos de antígenos tumorales que provocan una respuesta de anticuerpos en pacientes de BCa. Previamente, se generó una biblioteca de ADNc de BCa a partir 55 de ARN polirribosómico (MAP) asociado a la membrana, que codifica las proteínas secretadas y de membrana, y se sustrajo la biblioteca con ARN de tejidos normales (29). Las proteínas secretadas se administran con más facilidad desde las células tumorales a los ganglios linfáticos, donde tienen lugar las interacciones de las células inmunitarias, lo que da como resultado abundantes anticuerpos de alta afinidad. Las proteínas de la superficie de la membrana se liberan comúnmente en forma soluble a partir de células tumorales a través de la escisión dependiente de

metaloproteinasas. Las proteínas desprendidas se transfieren más fácilmente a los ganglios linfáticos que las proteínas intracelulares (30, 31). En consecuencia, la biblioteca sustraída obtenida, denominada biblioteca de ADNc polirribosómico asociada a membrana (MAPcL), está enriquecida con clones que codifican TAA de membrana y secretados que son muy abundantes en BCa y deberían inducir preferiblemente una respuesta de anticuerpos en los 5 pacientes (29). Además, se ha establecido un método para producir antígenos recombinantes como proteínas de fusión Fc diseñadas para tener conformaciones nativas, lo que es esencial para la expresión de proteínas secretadas y de membrana que pueden inducir una respuesta de anticuerpos en pacientes.

Se ha desarrollado una estrategia basada en ELISA de antígeno portador de conformación para discriminar entre 10 BCa y pacientes sanos mediante la detección de autoanticuerpos contra un panel de TAA. Se seleccionaron veinte antígenos de los genes más abundantes representados en la MAPcL, y se generaron proteínas de fusión Fc. Se recolectó sangre de 200 pacientes con BCa recién diagnosticados y 200 mujeres sanas como controles de la misma edad. Las 400 muestras de plasma se cribaron para determinar la presencia de autoanticuerpos contra los 20 antígenos derivados de MAPcL diferentes usando ELISA. Una combinación de siete antígenos con datos 15 demográficos de los pacientes arrojó la mejor relación de probabilidad positiva para discriminar entre pacientes sanos y BCa.

Materiales y métodos

20 Construcción de plásmidos

Para la producción de antígenos marcados con Fc de MAPcL-conejo, se usaron dos construcciones, pSecTag2 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) y pFUSE-rIgG-Fc1 (InvivoGen, San Diego, CA), para generar las construcciones de expresión de 20 MAPcL-rFc debido a la disponibilidad del sitio de restricción para la clonación. Se modificó 25 pSecTag2 amplificando la porción Fc de IgG de conejo usando los cebadores 5'- CCGGATATCAGCAAGCCCACGTGCCCACC-3' (SEQ ID NO:21) y 5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTC- ATTTACCCGGAGAGCGGGAG-3' (SEQ ID NO:22) (Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa) usando pFUSE- rIgG-Fc1 como plantilla. El producto de PCR de rFc se digirió con EcoRV y NotI y se insertó en pSecTag2, denominado pSecTag2-rFc, que contiene una secuencia de señal de IgK para la secreción. El pFUSE-rIgG-Fc1 30 contiene una secuencia señal IL2. Para mantener la secuencia señal consistente entre los dos plásmidos, la secuencia líder de IgK se amplificó mediante PCR usando pSecTag2 como plantilla. La secuencia líder de IL2 se reemplazó entonces con la secuencia señal de IgK, creando pFUSE-IgK-rFc.

Los números de acceso de los 20 genes MAPcL usados como plantillas para la clonación y las secuencias señal 35 predichas se indican en la Tabla 1. Las secuencias señal de cada proteína codificada se determinaron usando SignalP (32, 33). Si una proteína contenía un dominio transmembrana, solo se incluía la porción extracelular codificada. Los dominios transmembrana se predijeron utilizando la base de datos TMHMM (34). Los números de aminoácidos codificados por el fragmento clonado se muestran en la Tabla 1. ANGPTL4, CDH3, DKK1, SPON2, SSR2, CST2, GFRA1 y GAL1 se clonaron de manera personalizada en pSecTag2-rFc usando los sitios de 40 restricción SfiI y KpnI (Genscript, Piscataway, N.J.). EPHA2, IGFBP2 y LAMC2 se clonaron de manera personalizada en pSecTag2-rFc usando los sitios de restricción KpnI y BamHI. GRN, MUC1 y LRRC15 se clonaron de manera personalizada en pSecTag2-rFc usando los sitios de restricción SfiI y BamHI. HER-2, LRP10, SPINT2 y SUSD2 se clonaron en pFUSE-IgK-rFc usando los sitios de restricción SfiI y XhoI. CD147 se clonó en pFUSE-IgK-rFc usando los sitios de restricción BamHI y SacII. CD320 se clonó en pFUSE-IgK-rFc usando los sitios de restricción EcoRI y 45 XhoI.

Tabla 1. Candidatos MAPcL para la generación de proteínas de fusión rFc

Gen de MAPcL

Acceso N.°

Aminoácidos de secuencia señal*

Fragmento

aminoacídico

codificado!

ANGPTL4 (angiopoyetina de tipo 4)

NM 139314 1-30 31-406

CD147

NM 198589 1-21 22-162

CD320

NM 016579 1-46 47-230

CDH3 (cadherina 3)

NM 001793 1-24 25-654

CST2 (cistatina SA)

NM 001322 1-20 21-141

DKK1 (inhibidor de la ruta de señalización de WNT dickkopf 1)

NM_012242 1-28 29-266

EPHA2 (receptor EPH A2)

NM_004431 1-26 27-535

Gen de MAPcL

Acceso N.° Aminoácidos de secuencia señal* Fragmento aminoacídico

codificadof

GAL1 (lectina, unión a galactósido,

NM 002305 1-17 18-135

soluble, 1)

GFRA1 (proteína de anclaje ligada a GPI)

AF038421 1-24 25-465

GRN (granulina)

NM 002087 1-17 18-593

HER-2

NM 004448 1-22 23-652

IGFBP2 (proteína de unión al factor de crecimiento de tipo insulina 2)

NM_000597 1-39 40-328

LAMC2 (laminina, gamma 2)

NM_005562 1-21 22-1111

LRP10 (proteína relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad

NM_014045 1-16 17-440

10)

LRRC15 (repetición rica en leucina que

NM 001135057 1-27 28-544

contiene 15)

MUC1 (mucina 1)

NM_002456 1-22 23-167

SPINT2 (inhibidor de serina peptidasa,

NM 021102 1-27 28-198

tipo Kunitz, 2)

SP0N2 (esporadina 2)

NM 012445 1-26 27-331

SSR2 (receptor de secuencia señal, beta

NM 003145 1-17 18-146

(proteína beta asociada a translocón))

SUSD2 (dominio de sushi que contiene

NM 019601 1-27 28-785

_________________2)_________________

*Las secuencias señal de cada proteína codificada se determinaron usando SignalP (32, 33) y no se incluyeron en las construcciones de expresión. fLos números de aminoácidos indican la porción codificada de las proteínas clonadas entre la secuencia señal de Ig y la porción Fc de IgG de conejo para generar las proteínas de fusión MAPcL-rFc secretadas.

Para la producción de HER-2 marcado con His, HER-2 se amplificó a través de PCR usando los cebadores 5'- CCCAAGCTT GCAGCACCCAAGTGTGCACCGGCAC-3' (SEQ ID NO: 23) y 5'-GTGCTCGAGTCACGTC- AGAGGGCTGGCTCTCTGCTCG-3'(SEQ ID NO: 24). El producto se digirió con HindlII y Xhol y se clonó 5 direccionalmente en el vector de expresión pET-28a.

Cultivo celular

Se cultivaron las líneas celulares 293T y SKBR3 en DMEM con FBS al 10 %. Los cultivos se mantuvieron a 37 °C 10 con el 5 % de CO2 en una incubadora humidificada. Todas las líneas celulares se autenticaron y se ensayaron negativamente para micoplasma.

Producción de proteínas

15 Las proteínas de fusión MAPcL-rFc se produjeron en células 293T. Brevemente, las células 293T se transfectaron usando Effectene (Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Durante la transfección, las células se cultivaron en DMEM con SFB al 2 %. Los sobrenadantes que contenían las proteínas de fusión secretadas se recogieron, se centrifugaron para limpiar los restos celulares y se suplementaron con azida sódica al 0,1 %. His-HER-2 se produjo en BL21 de E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se purificó usando 20 cromatografía de afinidad IMAC.

ELISA sándwich

Se recubrieron placas de microtitulación (Nalge Nunc, Rochester, N.Y.) durante una noche con 2 pg/ml de Fc anti- 25 conejo de cabra (Jackson Immunoresearch, West Grove, Pa.) diluido con una solución salina tamponada con fosfato. Los sobrenadantes que contenían las proteínas de fusión rFc se diluyeron 1:3 en serie en tampón de bloqueo estándar (albúmina sérica bovina al 0,5 % y azida sódica al 0,1 % en una solución salina tamponada con fosfato). Las placas se lavaron una vez, y los sobrenadantes diluidos en serie se transfirieron a las placas de microtitulación. La IgG de conejo de concentración conocida se diluyó de forma similar y se añadió a una fila de la 30 placa de microtitulación con el fin de cuantificar la cantidad de proteína de fusión presente en el medio de cultivo. Después de incubar durante dos horas, las placas se lavaron dos veces y se diluyeron 50 pl de IgG de cabra anti-

conejo conjugada con HRP (Jackson Immunoresearch, West Grove, Pa.) 1:3000 en tampón de bloqueo estándar con Tween 20 al 0,05 % añadido. Después de una incubación de 2 horas, las placas se lavaron 4 veces y se desarrollaron con 100 pl/pocillo de sustrato de TMB (Pierce, Rockford, IL). La reacción de desarrollo se detuvo después de cinco minutos con 50 pl/pocillo de H<2<SO<4< 2 N, y la absorbancia se midió a 450 nm para determinar 5 la concentración. La absorbancia a 690 nm se sustrajo para eliminar la señal de fondo.

Reconocimiento de anticuerpos de proteína conformacional frente a la proteína HER-2 desnaturalizada

Para el ensayo HER-2 conformacional, se revistieron placas de microtitulación con 2 pg/ml de Fc anti-conejo de 10 cabra (Jackson Immunoresearch, West Grove, Pa.) en PBS durante una noche. Después, se añadió HER-2-ECD-rFc a cada pocillo, 100 pl/pocillo. Para HER-2 desnaturalizado, se recubrieron placas de microtitulación con 2 pg/ml de His-HER-2-ECD en PBS durante una noche.

Se usaron tres anticuerpos HER-2 en el ensayo: anti-HER-2 3F27 (US Biological, Swampscott, Mass.), anti-HER-2 15 3F32 (US Biological, Swampscott, Mass.) y Herceptina (Genentech, South San Francisco, Calif.). Cada anticuerpo se diluyó a 1 pg/ml en tampón de bloqueo estándar con Tween 20 al 0,05 %. A continuación, los anticuerpos se diluyeron en serie. Después de lavar una vez, se añadieron 50 pl/pocillo de los anticuerpos diluidos en serie a las placas y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces, y se añadieron anticuerpos secundarios conjugados con HRP apropiados de la especie a una dilución 1:3000. Las placas se lavaron 20 cuatro veces y se desarrollaron con 100 pl/pocillo de sustrato TMB durante cinco minutos. El desarrollo se detuvo con 50 pl/pocillo de H<2<SO<4< 2 N. La absorbancia se midió a 450 nm, y la absorbancia de 690 nm se restó para tener en cuenta el fondo.

Se usaron los mismos anticuerpos para teñir HER-2 en células SKBR de BCa a través de citometría de flujo. Las 25 células SKBR3 se separaron de la placa utilizando la Solución de Disociación Celular No enzimática 1 x (Sigma, St. Louis, Mo., catálogo N.° C5914). Se incubaron 2 x 10<5< células con 0,5 pg/ml de cada anticuerpo durante 1 hora a temperatura ambiente. Después, las células se lavaron, y se añadió una dilución 1:200 de anticuerpo conjugado con PE para la especie apropiada. Las células se lavaron de nuevo, se resuspendieron en tampón FACS (PBS con albúmina de suero bovino al 5 % y azida sódica al 0,1 %) y se analizaron mediante citometría de flujo.

30

Competición de unión a herceptina

Se revistieron placas de microtitulación con 4 pg/ml de Fc anti-conejo de cabra y se incubaron durante una noche. Después de un lavado, se añadieron 100 pl/pocillo de HER-2-ECD-rFc a cada pocillo y se incubaron durante una 35 noche. Las proteínas quiméricas HER-2-Fc y CD30-Fc (R & D Systems, Minneapolis, Mn) se diluyeron en serie a partir de una concentración de partida de 10 ug/ml. Se añadió herceptina a una concentración final de 10 ng/ml en cada una de las diluciones de proteínas quiméricas en serie. Las placas se lavaron dos veces, y se aplicaron 50 pl/pocillo de mezcla de proteína quimérica/Herceptina a la placa. Después, las placas se lavaron tres veces, y se aplicó una dilución 1:3000 de IgG anti-humano de cabra HRP a cada pocillo, 50 pl/pocillo. Después de cuatro 40 lavados, se añadieron 100 pl/pocillo de sustrato TMB a cada pocillo. El desarrollo se detuvo con 50 pl/pocillo de H<2<SO<4< 2 N después de 5 minutos. La absorbancia se midió a 450 nm con una absorbancia de 690 nm restada.

Pacientes

45

Los criterios de inclusión para casos fueron mujeres mayores de 30 años que fueron diagnosticadas recientemente con BCa (cualquier tipo) en Sanford Health, Sioux Falls, S. Dak. A los pacientes se les pidió que proporcionaran un tubo adicional de EDTA de 10 ml de sangre antes de la mastectomía, tumorectomía, radioterapia, quimioterapia u otro tratamiento. Los sujetos del caso se excluyeron solo si tenían antecedentes previos de cáncer de cualquier tipo. 50 Los sujetos de control sanos tuvieron una mamografía negativa dentro de los seis meses anteriores a la extracción de sangre. Se excluyeron sujetos sanos si había antecedentes de cáncer previo de cualquier tipo o antecedentes de enfermedad autoinmune. Todos los pacientes proporcionaron un consentimiento informado por escrito, y el IRB de Sanford Health aprobó el protocolo de estudio. Se recogieron muestras de sangre de 200 pacientes con BCa de 10/08/09 a 17/07/12. Además, se recogieron 200 muestras de sangre control sanas de la misma edad del 16/10/09 55 al 19/01/11. Véase la Tabla 2 para conocer las características de los pacientes incluidos.

Tabla 2. Características clínicas y patológicas del paciente de los pacientes

Pacientes con cáncer de mama

N = 200

Edad: Media (DE)

58,9 (11,4)

Raza blanca: n (%)

193 (97%)

IMC [kg/m<2>]: Media (DE)

29,7 (6,6)

Hábito de fumar: n (%)

Actual

22 (11 %)

Nueva

120 (60%)

Pasado

58 (29 %)

Antecedentes familiares Sí: n (%)

114 (58%)

Tipo de tumor: n (%)

Invasivo

148 (74%)

in situ

52 (26 %)

Histología: n (%)

Ductal y Lobular

3 (2 %)

Ductal

173 (87%)

Lobular

21 (11 %)

Otro

2 (1 %)

Positivo a ER: n (%)

171 (86%)

Positivo a PR: n (%)

147 (74%)

Amplificación de HER-2: n (%)

Negativo

156 (78%)

Positivo

33 (17 %)

Desconocido

11 (6 %)

Negativo triple Sí: n (%)

18 (12 %)

Dimensión máx. del tumor [cm]: n (%)

<1

66 (36 %)

>1 a <2

65 (35 %)

>2

53 (29 %)

Afectación de los nódulos linfáticos: n (%)

47 (24 %)

Controles de la misma edad con mamograma negativo Edad: Media (DE) Raza blanca: n (%) IMC [kg/m<2>]: Media (DE) Hábito de fumar: n (%) Actual Nueva Pasado

N = 200 58,8 (11,3) 192 (97%) 27,1 (5,5) 7 (4 %) 125 (63%) 67 (34 %)

Recogida de suero 5

Se recogió sangre en un tubo EDTA de 10 ml y se centrifugó a 2000 x g durante 10 minutos. El plasma se eliminó del tubo, se separó en alícuotas y se almacenó a -80 grados Celsius hasta el cribado para determinar la presencia de autoanticuerpos.

10 ELISA de antígenos portadores de conformación

Se recubrieron placas de microtitulación (Nalge Nunc, Rochester, N.Y.) durante una noche con 4 pg/ml de Fc anticonejo de cabra (Jackson Immunoresearch, West Grove, Pa.) en una solución salina tamponada con fosfato. Las placas se lavaron una vez, y se añadieron 100 pl/pocillo de proteína de fusión MAPcL-rFc. Las placas se incubaron 15 durante 2 horas y se lavaron dos veces. Las placas se recubrieron con 50 pl/pocillo de tampón de bloqueo optimizado (solución salina tamponada con fosfato con albúmina de suero bovino al 0,5 %, leche en polvo al 0,2 %, polivinilpirrolidona al 0,1 %, L-glutamina 20 mM, L-arginina 20 mM, azida sódica al 0,1 %, suero de cabra al 10 % y Tween 20 al 0,05 %). Las placas se incubaron durante 1 hora a 37 °C y se lavaron una vez. Se añadieron muestras de suero diluidas 1:100 en tampón de bloqueo optimizado y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. 20 Después, las placas se lavaron tres veces, y los autoanticuerpos se detectaron usando una IgG de cabra antihumana conjugada con HRP (Jackson Immunoresearch, West Grove, Pa.) diluida 1:3000 en tampón de bloqueo estándar con Tween 20 al 0,05 %. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron

cuatro veces y se desarrollaron con 100 pl/pocillo de sustrato TMB (Pierce, Rockford, IL) durante 15 minutos. El desarrollo se detuvo con 50 pl/pocillo de H<2<SO<4< 2 N, y se midió la absorbancia a 450 nm. La absorbancia a 690 nm se sustrajo para eliminar la señal de fondo. Cada placa de 96 pocillos incluyó 14 muestras de sujetos de BCa y 14 muestras de sujetos de mamografía normal. Cada muestra se ensayó por triplicado dentro de la misma 5 placa. Una fila en cada placa se sometió solo a tampón de bloqueo como control negativo para el ELISA.

Métodos estadísticos

Los controles se emparejaron individualmente con 200 pacientes de BCa 1:1 dentro de una ventana de edad de 3 10 años usando un algoritmo voraz de comparación de calibrador (35) mientras se cegó a los datos del ensayo. Para cada sujeto, el nivel de antígeno se transformó restando la media del tampón de bloqueo de la media de las mediciones por triplicado. Si la diferencia fue menor de cero, se ajustó a cero, y se tomó la raíz cuadrada para obtener una distribución más simétrica.

15 Las diferencias en las respuestas demográficas y de autoanticuerpos entre los pacientes con BCa y los controles se ensayaron usando una prueba t de dos muestras y una prueba de Chi cuadrado para datos continuos y categóricos, respectivamente. La mejora creciente de la estadística c (es decir, índice de concordancia, área bajo la curva característica operativa del receptor (ROC)) se ensayó añadiendo la respuesta de autoanticuerpo a cada antígeno a un modelo de regresión lógica que ya incluía edad, IMC, raza y actual hábito de fumar. La calibración del modelo se 20 ensayó usando la medida de bondad de ajuste de Hosmer-Lemeshow, que construye una estadística Chi-cuadrado comparando el número de casos predicho y observado por decil de probabilidad (36).

Después de evaluar los antígenos individuales, se usó un análisis de regresión logística condicional multivariable con estratos para el emparejamiento por edad para determinar el subconjunto de antígenos que minimizaban el 25 criterio de información de Akaike (37); todos los modelos se ajustaron por IMC, raza y hábito de fumar actual. Se realizaron análisis de subgrupos exploratorios para determinar si el subconjunto multivariable de antígenos funcionaba de manera diferente en un tipo particular de BCa. El modelo multivariable se ensayó en los siguientes subgrupos: invasivo, in situ, positivo a ER, dimensión máxima del tumor >1 cm, afectación ganglionar, y positivo a HER-2. El nivel crítico alfa se ajustó a <0,05/20 antígenos = 0,0025 usando la corrección de Bonferroni. Se utilizó el 30 software SAS® (Cary, N.C.) versión 9.3 para todos los análisis.

Resultados

Generación de antígenos asociados a tumores diseñados para tener conformaciones nativas 35

Para identificar TAA que provocan una respuesta humoral en pacientes, se seleccionaron genes candidatos que codifican proteínas secretadas y de membrana a partir de los genes más abundantes representados en el MAPcL. Debido a que solo el 10 % de los epítopos en las proteínas están en una secuencia lineal continua (24), se usó un sistema de expresión eucariota para generar antígenos tumorales portadores de conformación que están plegados 40 adecuadamente y contienen epítopos no continuos para su uso en la detección de autoanticuerpos. Las secuencias que codifican los dominios extracelulares (ECD) o las proteínas secretadas sin la secuencia señal de los genes MAPcL candidatos se clonaron 5' de la región Fc de IgG de conejo (rFc) en el vector pSecTag2-rFc o pFUSE-IgK- rFc, dependiendo de los sitios de clonación con enzimas de restricción. La secuencia líder de IgK contenida en los vectores dirige las proteínas de fusión a secretar. Los vectores que codificaban las proteínas de fusión se 45 transfectaron transitoriamente en células 293T, y las proteínas de fusión correspondientes se secretaron en los medios. La producción de las proteínas de fusión secretadas se confirmó usando un ELISA tipo sándwich, y las concentraciones se determinaron por comparación con un estándar CD147-rFc establecido (datos no mostrados).

Para demostrar que las proteínas MAPcL-rFc generadas se diseñaron para plegarse en una conformación nativa, se 50 realizó un análisis ELISA usando anticuerpos anti-HER-2 disponibles en el mercado generados contra proteína HER- 2 nativa (anticuerpo monoclonal 3F32 y Herceptina) o desnaturalizada ( anticuerpo monoclonal 3F27). Se analizaron dos antígenos que consistían en ECD de HER-2: la proteína HER-2-ECD-rFc portadora de conformación generada en células 293T y una proteína His-HER-2-ECD que se producía en bacterias y se purificaba sobre una columna de níquel. El anticuerpo anti-HER-2 nativo (3F32) reconoció la HER-2-ECD-rFc producida en 293T (Figura 1A), pero no 55 pudo detectar la proteína His-HER-2-ECD purificada producida en bacterias (Figura 1B). Además, la Herceptina no pudo detectar la proteína His-HER-2-ECD desnaturalizada purificada a partir de bacterias (Figura 1B). Sin embargo, se observó una respuesta fuerte para Herceptina cuando se usó la proteína HER-2-ECD-rFc como el antígeno para el análisis ELISA (Figura 1A). Aunque el anticuerpo 3F27 generado contra HER-2 desnaturalizado no detectó la proteína HER-2-ECD-rFc (Figura 1A), este anticuerpo tuvo una respuesta fuerte a HER-2-ECD bacteriano (Figura

1B).

Para confirmar el reconocimiento específico de epítopos nativos frente a desnaturalizados por los anticuerpos adquiridos, se realizó citometría de flujo en células SKBR3 no fijadas, una línea celular BCa que se sabe que tiene 5 amplificación HER-2 (38). Debido a que HER-2 superficial retendría su confirmación nativa en las células SKBR3 no fijadas, el anticuerpo anti-HER-2 3F27, específico para HER-2 desnaturalizado, no pudo detectar HER-2 superficial en la membrana celular de las células SKBR3 mediante citometría de flujo (Figura 1C). Cuando el anticuerpo anti- HER-2 3F32 y Herceptina, ambos de los cuales reconocen HER-2 conformacional, se usaron para el análisis de citometría de flujo, se observó un gran cambio en la fluorescencia que indicaba que los anticuerpos reconocían 10 HER-2 presente en la membrana de las células SKBR3 (Figura 1C).

Se realizó un ensayo de competición de unión para verificar que el ELISA de antígeno portador de conformación reconocía específicamente el antígeno MAPcL. Los pocillos se recubrieron previamente con IgG anti-conejo seguido de HER-2-ECD-rFc. Las proteínas quiméricas purificadas HER-2-Fc y CD30-Fc adquiridas (R & D Systems) se 15 diluyeron en serie y se añadieron a una cantidad constante de Herceptina (10 ng/ml) en cada pocillo. Después de la adición del anticuerpo IgG antihumano secundario conjugado con HRP, se desarrollaron las reacciones. La unión de Herceptina a HER-2-ECD-rFc compitió mediante la adición de HER-2-Fc pero no de la proteína CD30-Fc (Figura 1D). Este resultado indica que Herceptina se une específicamente a la porción HER-2-ECD de la proteína de fusión portadora de conformación.

20

Cribado de pacientes para autoanticuerpos usando el ELISA de antígeno portador de conformación

Se generaron veinte antígenos de fusión MAPcL-rFc diseñados para contener su conformación nativa clonando las secuencias que codificaban ECD o las proteínas secretadas 5' de la secuencia rFc (véase la Tabla 1 para determinar 25 la identidad de los 20 antígenos). Los plásmidos de expresión se transfectaron individualmente en células 293T, y las proteínas de fusión MAPcL-rFc se secretaron en los medios. Las 20 proteínas de fusión se cuantificaron por análisis ELISA tipo sándwich (datos no mostrados). Para detectar autoanticuerpos en plasma recogido de pacientes, se desarrolló un ELISA de antígeno portador de conformación utilizando los antígenos MAPcL-rFc generados. Para inmovilizar las proteínas de fusión MAPcL-rFc, se usó IgG anti-conejo para recubrir previamente los pocillos de una 30 placa de 96 pocillos. Los medios de las células 293T transfectadas, que contienen las proteínas de fusión MAPcL- rFc generadas diseñadas para tener conformaciones nativas, se añadieron a los pocillos recubiertos previamente. Para reducir la variación de la placa y aumentar la repetibilidad del ensayo, se distribuyeron tres muestras replicadas usando el plasma de cada paciente individual a través de la placa de 96 pocillos. Después de la adición de un anticuerpo secundario IgG anti-humano conjugado con HRP, las placas se desarrollaron y la absorbancia de cada 35 pocillo se midió. Las 200 muestras de plasma recogidas de los pacientes recién diagnosticados con BCa y el plasma de 200 sujetos sanos de la misma edad se evaluaron para determinar la reactividad del autoanticuerpo contra los 20 antígenos usando el ELISA portador de la conformación.

Los 200 pacientes de BCa y 200 controles sanos tenían una edad media (DE) de 59 (11) años y el 97 % se 40 identificaron como raza blanca (Tabla 2). Los pacientes con cáncer tenían más sobrepeso (29,7 frente a 27,1 kg/m<2>, p <0,0001) y tenían diferentes hábitos de fumar (p = 0,014), de tal forma que había una mayor prevalencia de fumadores actuales (11 % frente a 4 %) en los sujetos con cáncer en comparación con los sanos. Los 200 pacientes con BCa representaron la heterogeneidad de la enfermedad consistente en 74 % invasiva, 24 % de afectación ganglionar, 86 % positiva a ER, 17 % positiva a HER-2 y 12 % de BCa triple negativo (Tabla 2). 45 Analizando la lectura de absorbancia de las respuestas de autoanticuerpos contra los antígenos individuales, se determinó que había diferencias significativas ajustadas de Bonferroni entre pacientes con BCa y controles en respuestas de autoanticuerpos contra 12 TAA, es decir, ANGPTL4, DKK1, EPHA2, GAL1, HER-2, IGFBP2, LAMC2, MUC1, SPON2, CST2, SPINT2 y SSR2 (Tabla 3). Se detectaron niveles más altos de estos autoanticuerpos en pacientes con BCa. En los modelos de regresión logística ajustados por edad, raza, IMC y actual hábito de fumar, 50 las respuestas de autoanticuerpos contra MUC1 (1,83), DkK1 (1,77) y GAL1 (1,75) (todas p <0,0001) tuvieron las mayores relaciones de probabilidad (OR), de tal forma un paciente tenía aproximadamente 1,8 veces más probabilidades de tener BCa por 1 DE de aumento en la respuesta de autoanticuerpos contra cualquiera de estos tres antígenos (Tabla 3). Las respuestas de autoanticuerpos contra seis de los doce antígenos (es decir, GAL1, DKK1, MUC1, ANGPTL4, EPHA2 e IGFBP2) también aumentaron el área bajo la curva ROC cuando cada uno de 55 ellos se añadió individualmente al modelo de regresión logística base ajustado por edad, IMC, raza y el actual hábito de fumar (todos p <0,05). Cinco de los seis modelos se calibraron bien entre los deciles de probabilidad (Hosmer- Lemeshow mínimo p = 0,13), pero el modelo que incluía IGFBP2 no se calibró (p = 0,016)..

Tabla 3. Mediciones de absorbancia de autoanticuerpos y su asociación con cáncer de mama

Mamografía Cáncer de .. , , Aumento en

,, . Valor de Relación de 95 % . . ..

norma| (n = mama (n = probabilidad+ de IC la estadlstica

___200)_________200)_______p_______probabiiidad+____de |C________________

Autoanticuerpo

CD320

0,15 (0,12)

0,16

(0,12)

0,62

1,10

0,90

1,35

0,000

Valor de p

0,96

EPHA2

0,13 (0,06) 0,16 (0,10) 0,0006

GFRA1

0,18 (0,06) 0,20 (0,08) 0,0081

IGFBP2

0,21 (0,12) 0,25 (0,13) 0,0006

CST2

0,17 (0,09) 0,20 (0,10) 0,0013

GAL1

0,17 (0,06) 0,20 (0,07) <0,0001

HER-2

0,13 (0,04) 0,15 (0,06) <0,0001

LAMC2

0,15 (0,05) 0,17 (0,08) 0,0007

ANGPTL4

0,18 (0,05) 0,20 (0,06) 0,0001

DKK1

0,18 (0,10) 0,24 (0,11) <0,0001

MUC1

0,14 (0,06) 0,18 (0,08) <0,0001

SSR2

0,14 (0,07) 0,17 (0,08) 0,0007

LRP10

0,14 (0,05) 0,15 (0,07) 0,0098

LRRC15

0,11 (0,04) 0,12 (0,05) 0,30

SPINT2

0,15 (0,07) 0,18 (0,09) 0,0022

SPON2

0,14 (0,07) 0,17 (0,08) <0,0001

CD147

0,10 (0,05) 0,12 (0,06) 0,0039

CDH3

0,10 (0,04) 0,12 (0,04) 0,0033

GRN

0,12 (0,06) 0,13 (0,07) 0,19

1,64

1,21 2,24 0,034 0,037

1,28

1,03 1,59 0,013 0,32

1,39

1,10 1,75 0,030 0,050

1,39

1,12 1,73 0,026 0,13

1,75

1,37 2,23 0,051 0,021

1,65

1,28 2,13 0,039 0,054

1,47

1,16 1,88 0,025 0,13

1,57

1,24 1,99 0,041 0,032

1,77

1,40 2,24 0,060 0,0093

1,83

1,41 2,37 0,055 0,012

1,53

1,23 1,92 0,029 0,14

1,35

1,09 1,68 0,011 0,47

1,09

0,89 1,34 0,001 0,82

1,40

1,13 1,74 0,018 0,31

1,65

1,31 2,07 0,042 0,052

1,43

1,15 1,78 0,016 0,38

1,43

1,14 1,79 0,014 0,40

1,16

0,94 1,43 0,004 0,65

SUSD2

0,12 (0,04)

0,13

(0,05)

0,0085

1,36

1,10

1,70

0,013

0,38

Datos mostrados como media (DE) de ^ ' - on o) ; *Las diferencias entre los grupos se ensayaron usando

pruebas t; el valor de p ajustado a Bonferroni significativo <0,05/20 = 0,0025 se muestra en negrita; + Relación de probabilidades (95 % de IC) para la prevalencia de cáncer de mama por 1 DE de aumento en autoanticuerpos se determinó mediante modelos de regresión logística ajustados por edad, raza, IMC y el actual hábito de fumar; $ Se determinó el cambio en el área bajo la curva ROC (es decir, la estadística c) cuando se añadió el autoanticuerpo a los modelos de regresión logística ajustados.

Para aumentar la capacidad predictiva del ELISA portador de conformación, la respuesta de autoanticuerpo contra un grupo de antígenos se determinó usando un análisis de regresión logística condicional que incorporaba el diseño 5 de estudio de coincidencia de edad individual y el ajuste para IMC, raza y actual hábito de fumar. El grupo con el mejor ajuste del modelo (es decir, AIC mínimo) contenía las respuestas de autoanticuerpos contra los siguientes 7 antígenos: ANGPTL4, DKK1, GAL1, MUC1, GFRA1, GRN y LRRC15 (Tabla 4). De estos 7, solamente las respuestas de autoanticuerpos contra ANGPTL4, DKK1, MUC1 y GAL1 mostraron individualmente un aumento significativo en el área bajo la curva ROC cuando se añadieron al modelo base (Tabla 3). En el modelo de regresión

logística completamente ajustado que incluye el grupo de antígenos, el actual hábito de fumar tuvo la mayor OR (95 % de IC) de Or de BCa prevalente = 7,88 (2,68-23,2); y el IMC también fue una OR del factor de riesgo significativo = 1,09 (1,04-1,13) por aumento de 1 kg/m<2> (Tabla 4). GAL1 tenía una OR de 6,73 (3,42-13,3), por lo que un paciente tenía casi 7 veces más probabilidades de tener BCa por 1 DE de aumento en la respuesta de 5 autoanticuerpos contra GAL1. Las respuestas de autoanticuerpos contra GFRA1 (OR = 0,41), GRN (OR = 0,55) y LRRC15 (OR = 0,32) tuvieron asociaciones inversas con las probabilidades de BCa prevalente cuando se ajustaron para determinar las respuestas frente a los demás antígenos (Tabla 4). En conjunto, la respuesta de autoanticuerpos contra el grupo de 7 antígenos aumentó el área bajo la curva ROC de 0,64 a 0,82 (p <0,0001) y tuvo las siguientes medidas de diagnóstico: sensibilidad (72,9 %), especificidad (76,0 %) y relación de probabilidad positiva (95 % de 10 IC) 3,04 (2,34 a 3,94) (Figura 2). El modelo también se calibró a través de deciles de riesgo (Hosmer-Lemeshow, p = 0,13).

Tabla 4. Relaciones de probabilidad del modelo de regresión logística multivariable para cáncer de mama

______Variable________Relación de probabilidad 95 % IC

Edad (por 1 año)

1,00* 0,98 1,02

Raza blanca

0,70 0,19 2,68

IMC (por 1 kg/m<2>)

1,09 1,04 1,13

Actual hábito de fumar

7,88 2,68 23,2

ANGPTL4 (por 1 DE)

1,71 1,16 2,50

DKK1 (por 1 DE)

1,87 1,28 2,73

GAL1 (por 1 DE)

6,73 3,42 13,3

GFRA1 (por 1 DE)

0,41 0,21 0,82

GRN (por 1 DE)

0,55 0,38 0,81

LRRC15 (por 1 DE)

0,32 0,19 0,55

MUC1 (por 1 DE)

1,67 1,16 2,41

*Debido a la correspondencia de edad 1:1 individual.

15 Debido a que BCa es una enfermedad heterogénea, es posible que la respuesta de autoanticuerpos contra una combinación de antígenos pueda categorizar un subtipo de BCa de manera diferente que analizando todos los subtipos de BCa como un todo. Las muestras de BCa se agruparon en subtipos individuales de BCa: invasivo, in situ, positivo a ER, implicación máxima del tumor >1 cm, afectación ganglionar y positivo a HER-2. La capacidad de discriminar casos de controles en cada subtipo se ensayó usando la reactividad de autoanticuerpos contra la 20 combinación de 7 antígenos además de la edad, el IMC, la raza y el actual hábito de fumar (Figura 2). El modelo de combinación de 7 antígenos se realizó de manera similar en todos los subtipos de BCa; la estadística c fue de 0,81 a 0,85. De los subtipos de BCa, los tumores in situ tenían el mayor área bajo la curva ROC (0,8520, p <0,0001) cuando se analizaron las respuestas de autoanticuerpos contra la combinación de 7 antígenos. El modelo no se calibró cuando se consideraron solo aquellos cánceres con afectación de ganglios linfáticos debido a cuatro BC 25 inesperados con muy pocas probabilidades de modelo (Hosmer-Lemeshow p = 0,0036).

ANÁLISIS

La detección precoz de BCa permite a un médico tratar la fase inicial de la enfermedad antes de la metástasis, 30 permitiendo de ese modo una mayor tasa de remisión o supervivencia a largo plazo para el paciente. La detección de la presencia de autoanticuerpos generados contra las proteínas tumorales en la sangre de los pacientes sería un método ideal para la detección de BCa. Sin embargo, es necesario identificar los antígenos tumorales antes de poder determinar las respuestas específicas de autoanticuerpos en pacientes. Se genero una biblioteca que codifica proteínas secretadas y de membrana que están altamente expresadas en BCa y pueden provocar una respuesta 35 inmune.

Se ha demostrado que la conformación del antígeno altera la afinidad de unión al anticuerpo en este ensayo, y la detección de autoanticuerpos está limitada por la conformación del epítopo (Figura 1). Se usó un conjunto de muestras robusto para desarrollar el ELISA portador de conformación que consiste en 200 muestras de plasma 40 recogidas de pacientes con BCa recién diagnosticados antes de la cirugía, la quimioterapia o el tratamiento con radiación. Además, se recolectó plasma de 200 sujetos emparejados por edad definidos por una mamografía normal confirmada en los seis meses anteriores (Tabla 2). Las 400 muestras de plasma se cribaron individualmente para determinar la respuesta de autoanticuerpos contra 20 TAA diseñados para contener su conformación nativa usando ELISA. Cuatro de los 20 TAA analizados en nuestro este han informado previamente que generan una respuesta de 45 anticuerpos en pacientes con BCa: MUC1 (39, 40), HER-2 (41), IGFBP2 (15) y GRN (42). La detección de autoanticuerpos contra 12 de los 20 antígenos fue estadísticamente significativa para discriminar entre muestras

normales y de cáncer (Tabla 3, negrita). Sin embargo, no observó una respuesta de autoanticuerpos significativa contra gRn en este ensayo. De los 12 antígenos significativos, 9 no se han asociado previamente con autoanticuerpos de BCa. Hasta donde se sabe, este es el primer informe de la detección de autoanticuerpos contra ANGPTL4, CST2, DKK1, EPHA2, GAL1, LAMC2, SPINT2, SPON2 y SSR2 en pacientes con BCa (Tabla 3).

5

Anteriormente se ha demostrado que el cribado del suero frente a un panel de antígenos para detectar autoanticuerpos en comparación con un solo antígeno aumenta la sensibilidad del ensayo (17). Este hallazgo es consistente con el hecho de que BCa es una enfermedad heterogénea (43), y el sistema inmune de cada paciente individual es distinto. Una combinación de siete TAA, que consistía en aNgPTL4, DKK1, GAL1, MUC1, GFRA1, 10 GRN y LRRC15, tenía la mayor capacidad de diagnóstico (Tabla 4). En comparación con los paneles de antígenos múltiples publicados previamente utilizados para detectar autoanticuerpos de BCa (17, 44-46), la combinación de estos siete TAA es única, y este estudio contiene la mayor población de pacientes de BCa y muestras sanas. Curiosamente, en la combinación de siete antígenos, cuatro de los antígenos tienen significación estadística individual (Tabla 3), pero tres de los antígenos, GFRA1, GRN y LRRC15, no fueron estadísticamente significativos 15 por sí solos (Tabla 3). Sin embargo, GFRA1, GRN y LRRC15 se asociaron inversamente con BCa, lo que indica que cantidades menores de estos autoanticuerpos en un paciente, en combinación con niveles más altos de los autoanticuerpos directamente asociados, aumentaron la probabilidad de tener BCa (Tabla 4). Cuando los 7 antígenos se añadieron al conocimiento del hábito de fumar actual y el IMC, la sensibilidad y especificidad del ensayo fue del 72,9 % y del 76,0 %, respectivamente. El área bajo la curva ROC (95 % de IC) fue de 0,82 (0,77 a 20 0,85), y la relación de probabilidad positiva fue de 3,04 para el ELISA portador de la conformación. Debido a que BCa es una enfermedad heterogénea, los pacientes se agruparon en las características del tumor, incluyendo positivo a ER, positivo a HER-2, in situ, invasivo, tamaño del tumor y afectación de los ganglios linfáticos. La combinación de 7 antígenos se realizó bien para todos los grupos (Figura 2). Estos resultados sugieren que el ensayo tiene potencial aplicación clínica. Un marcador de recurrencia en suero para BCa que se usa actualmente en 25 la clínica es el antígeno asociado a mucina CA27.29. El antígeno CA27.29 se detecta en la sangre de un paciente que usa un anticuerpo monoclonal que reconoce MUC1. Debido a la baja sensibilidad del marcador tumoral CA27.29, el ensayo se usa para el seguimiento de un paciente con recidiva de BCa (47). En comparación con el marcador tumoral CA27.29 tradicional, el ELISA portador de conformación descrito aquí muestra una gran promesa.

30 Actualmente, la mamografía es el método estándar para el cribado de BCa. Sin embargo, la maquinaria necesaria para realizar una mamografía es costosa, requiere personal médico especializado para la manipulación y es un reto para el transporte a áreas médicamente desatendidas. El desarrollo de una prueba de sangre para la detección precoz de BCa podría aumentar en gran medida el acceso a la detección. La extracción de sangre es un procedimiento común, y la sangre se puede enviar fácilmente a un laboratorio clínico para su análisis. Este estudio 35 demuestra que una combinación de respuestas de autoanticuerpos contra antígenos diseñados para contener epítopos conformacionales es una estrategia prometedora para la detección de BCa. Los estudios futuros se centrarán en la identificación de antígenos adicionales para mejorar la sensibilidad y la especificidad del ensayo para su traslado a la clínica.

40______Tabla 5. Subconjuntos de combinación de autoanticuerpos y su asociación con cáncer de mama

Unidad

Conjuntos de autoanticuerpos % de sensibilidad % de especificidad PLR ROC AUC Aumento en ROC AUC*

7

ANGPTL4 DKK1 GAL1 GFRA1 GRANULINA LRRC15 MUC1 72,9 76,0 3,04 0,818 0,181

6

ANGPTL4 DKK1 GAL1 GRANULINA LRRC15 MUC1 72,4 75,5 2,96 0,810 0,173

4

ANGPTL4 DKK1 GAL1 LRRC15 69,8 74,5 2,74 0,790 0,152

5

ANGPTL4 DKK1 GAL1 GFRA1 LRRC15 69,3 74,5 2,72 0,803 0,165

6

DKK1 GAL1 GFRA1 GRANULINA LRRC15 MUC1 70,4 74,0 2,71 0,809 0,172

6

ANGPTL4 DKK1 GAL1 GFRA1 GRANULINA LRRC15 70,9 73,5 2,68 0,812 0,175

5

DKK1 GAL1 GRANULINA LRRC15 MUC1 69,8 73,0 2,59 0,805 0,167

Unidad

Conjuntos de autoanticuerpos % de sensibilidad % de especificidad PLR ROC AUC Aumento en ROC AUC*

5

DKK1 GAL1 GFRA1 GRANULINA LRRC15 68,3 73,5 2,58 0,799 0,162

5

DKK1 GAL1 GFRA1 LRRC15 MUC1 68,8 73,0 2,55 0,797 0,160

5

ANGPTL4 DKK1 GAL1 GRANULINA LRRC15 68,3 73,0 2,53 0,804 0,166

4

DKK1 GAL1 GFRA1 LRRC15 68,3 73,0 2,53 0,791 0,153

4

DKK1 GAL1 GRANULINA LRRC15 68,8 72,4 2,49 0,796 0,159

5

ANGPTL4 DKK1 GAL1 LRRC15 MUC1 69,8 71,4 2,44 0,794 0,157

3

DKK1 GAL1 LRRC15 66,8 72,4 2,42 0,784 0,147

4

ANGPTL4 GAL1 LRRC15 MUC1 66,8 72,4 2,42 0,784 0,147

4

GAL1 GFRA1 LRRC15 MUC1 68,3 71,4 2,39 0,788 0,151

3

GAL1 GFRA1 LRRC15 66,8 71,9 2,38 0,770 0,132

3

ANGPTL4 GAL1 LRRC15 71,6 69,8 2,37 0,774 0,137

4

DKK1 GAL1 LRRC15 MUC1 67,8 71,4 2,37 0,789 0,152

4

ANGPTL4 GAL1 GFRA1 LRRC15 68,8 70,9 2,36 0,793 0,156

3

GAL1 LRRC15 MUC1 67,3 71,4 2,35 0,778 0,141

5

ANGPTL4 GAL1 GFRA1 LRRC15 MUC1 68,8 69,9 2,29 0,798 0,161

3

ANGPTL4 GAL1 GFRA1 64,8 66,3 1,92 0,753 0,116

3

DKK1 GAL1 GFRA1 65,3 65,8 1,91 0,746 0,109

3

GAL1 GFRA1 MUC1 63,3 64,8 1,80 0,746 0,109

PLR = relación de probabilidad positiva, sensibilidad/(100 - especificidad); ROC = curva característica operativa del receptor; AUC = área debajo de la curva; *El cambio en el área bajo la curva ROC (es decir, estadística c) se determinó cuando el conjunto de autoanticuerpos se añadió a un modelo de regresión logística ajustado por edad, raza, IMC y actual hábito de fumar (todos los valores de p <0,0001).

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Claims (14)

1. Una composición que consiste en entre 2 y 25 marcadores de detección de anticuerpos, en la que la composición incluye al menos dos proteínas, en la que las al menos dos proteínas comprenden (a) angiopoyetina

5 tipo 4 (ANGPTL4) o un fragmento antigénico de la misma, y (b) al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste en el inhibidor de la ruta de señalización WNT Dickkopf 1 (DKK1), receptor de de efrina de tipo A 2 (EPHA2), subunidad de laminina gamma 2 (LAMC2), espondina 2 (SPON2), subunidad del receptor de secuencia señal 2 (SSR2), Lectina, unión a galactosa, soluble 1 (GAL1), proteína de anclaje ligada a GPI (GFRA1), repetición rica en leucina que contiene 15 (LRRC15), CD147, CD320, cadherina 3 (CDH3), proteína relacionada con receptor 10 de lipoproteína de baja densidad 10 (LRP10), inhibidor de serina peptidasa Kunitz tipo 2 (SPINT2), dominio de sushi que contiene 2 (SUSD2), y cistatina SA (CST2), o fragmentos antigénicos de los mismos.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que la composición incluye ANGTPL4, o un fragmento antigénico de la misma, y al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste en ANGPTL4, DKK1, EPHA2,

15 GAL1, LAMC2, SPON2, CST2, SPINT2 y SSR2, o fragmentos antigénicos de los mismos.

3. La composición de la reivindicación 1 o 2, en la que la composición incluye al menos 5 proteínas en el grupo citado, o fragmentos antigénicos de las mismas.

20 4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la que la composición comprende las

siguientes proteínas, o fragmentos antigénicos de las mismas:

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GFRA1, GRANULINA, LRRC15, y MUC1;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GRANULINA, LRRC15, y MUC1;

25 ANGPTL4, DKK1, GAL1, y LRRC15;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GFRA1, y LRRC15;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GFRA1, GRANULINA, y LRRC15;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GRANULINA, y LRRC15;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, LRRC15, y MUC1;

30 ANGPTL4, GAL1, LRRC15, y MUC1;

ANGPTL4, GAL1, y LRRC15;

ANGPTL4, GAL1, GFRA1, y LRRC15;

ANGPTL4, GAL1, GFRA1, LRRC15, y MUC1; o ANGPTL4, GAL1, y GFRA1.

35

5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que las proteínas comprenden ANGPTL4, DKK1, GAL1, MUC1, GFRA1, GRN y LRRC15, o fragmentos antigénicos de los mismos.

6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que las al menos dos proteínas, o 40 fragmentos antigénicos de las mismas comprenden dominios extracelulares nativos y/o proteínas secretadas nativas

o fragmentos antigénicos de las mismas.

7. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que las proteínas están marcadas de forma detectable y/o están inmovilizadas en una superficie.

45

8. Un método ex vivo para detectar cáncer de mama o recidiva de la enfermedad, comprendiendo el

método poner en contacto una muestra de fluido corporal de un sujeto con riesgo de cáncer de mama o recidiva de cáncer de mama con ANGTPL4, o un fragmento antigénico de la misma, en el que la presencia de autoanticuerpos contra ANGTPL4 en la muestra de fluido corporal del sujeto se correlaciona con la probabilidad de que el sujeto

50 tenga cáncer de mama o recidiva de cáncer de mama.

9. El método de la reivindicación 8, en el que el método comprende además poner en contacto la muestra de fluido corporal con uno o más de DKK1, ePhA2, GAL1, LAMC2, SPON2, CSt2, SPINT2 y SSR2, o fragmentos antigénicos de los mismos, en el que la presencia de autoanticuerpos contra la una o más proteínas

55 adicionales o fragmentos antigénicos de las mismas se correlacionan con la probabilidad de que el sujeto tenga cáncer de mama o recidiva de cáncer de mama.

10. El método de la reivindicación 9, en el que el método comprende poner en contacto la muestra de fluido corporal con 5 o más de las proteínas mencionadas.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en el que el método comprende poner en contacto la muestra de fluido corporal con uno de los siguientes conjuntos de marcadores, o fragmentos antigénicos de los mismos:

5

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GFRA1, GRANULINA, LRRC15, y MUC1;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GRANULINA, LRRC15, y MUC1;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, y LRRC15;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GFRA1, y LRRC15;

10 ANGPTL4, DKK1, GAL1, GFRA1, GRANULINA, y LRRC15;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, GRANULINA, y LRRC15;

ANGPTL4, DKK1, GAL1, LRRC15, y MUC1;

ANGPTL4, GAL1, LRRC15, y MUC1;

ANGPTL4, GAL1, y LRRC15;

15 ANGPTL4, GAL1, GFRA1, y LRRC15;

ANGPTL4, GAL1, GFRA1, LRRC15, y MUC1; o ANGPTL4, GAL1, y GFRA1.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 8-11, en el que el método

20 contacto las muestras de fluido corporal con ANGPTL4, DKK1, GAL1, MUC1, GFRA1,

fragmentos antigénicos de los mismos.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 8-12, en el que el método contacto la muestra de fluido corporal con la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

25

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 8-13, en el que la muestra de fluido corporal comprende una muestra de suero o una muestra de sangre del sujeto.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 8-14, en el que los métodos comprenden el uso

30 de cribado de ensayo longitudinal, en el que todos los biomarcadores diana pueden detectarse y cuantificarse en un

único ensayo y dilución.

comprende poner en GRN y LRRC15, o

comprende poner en

Recuento

imagen1

imagen2

Añad ir 7 bi omarcad ores {QJ8184]

Tumor > 1 cm (118 casos. Dif. AUC P <0,0001)

Positivo a ER (171 casos. Dif. AUC P <0,0001)

Invasivo (148 casos. Dif. AUC P <0,0001)

Curva ROC (Área)

- Modelo base(O.Í4$2s

1 Añadir 7 demarcadores (O.óíl i'"

Curva ROC (Área) •Modelo base (0.3350)

Curva ROC (Área) ■Modelo base (0 C32S)

(O Ü-KSK)

(C.S1 üSí

1-Especificidad

1 -Especificidad

Ganglios linfáticos (47 casos. Dif. AUC P <0,0001)

HER2 (3.3 casos. Dif. AUC P <0,0001)

Sitl.1 (52 casos. Dif. AUC P <0,0001)

Curva ROC (Área)

- Modela base fo.g 126!

• Añadir 7 demarcadores ÍD.S3S1

Curva ROC (Área) -Modelo base (O 62&S)

%CC Curve (Area)

■Modelo base (0 6507;-

Anadir 7 biomarcadores (0,54*36)

(0,0520)

1-Especificidad

1-Especificidad

1-Especificidad

1.UU

Curva ROC (Area)

Modelo base (Qb372j

ym

1.00

1-Especificidad

Figura 2