CN106461657A - 用于乳腺癌检测的试剂和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了多种组合物以及其在检测乳腺癌或疾病复发中的用途，其中所述的组合物包含用于检测对抗至少2种蛋白质的人类自身抗体的试剂，其中所述的蛋白质选自ANGTPL4,DKK1,EPHA2,LAMC2,SPON2,SSR2,GAL1,GFRA1,LRRC15,CD147,CD320,CDH3,LRP10,SPINT2,SUSD2和CST2。

Description

用于乳腺癌检测的试剂和方法
交叉引用
本申请要求2014年3月18日提交的美国临时专利申请系列No.61/954914的优先权，该申请以引用方式全文并入本文。
背景技术
对于乳腺癌(BCa)患者而言，早期且个性化的诊断对于优化可导致长期存活的治疗而言是重要的。尽管乳房摄影术是检测BCa的最广泛使用的方法，但是很大程度上由于高的乳腺密度，大约20％的筛选乳房X照片会得到错误的阴性诊断。此外，在取得乳房X线照片的10名女性中，1名女性需要另外成像。然而，绝大多数的这些女性并未患有BCa，因为每1000个筛选的乳房X线照片中，仅2至4个得到癌症诊断。因此，临床上迫切需要研发用于BCa的早期诊断和监测的新型最低侵入性诊断策略。
发明概述
在第一个方面中，本发明提供了由2至25个抗体检测标志物组成的组合物，其中所述的组合物包含用于检测针对至少2种蛋白质的人类自身抗体的试剂，其中所述的蛋白质选自ANGTPL4,DKK1,EPHA2,LAMC2,SPON2,SSR2,GAL1,GFRA1,LRRC15,CD147,CD320,CDH3,LRP10,SPINT2,SUSD2和CST2。在一个实施方案中，所述的组合物包含用于检测针对至少2种蛋白质的人类自身抗体的试剂，其中所述的蛋白质选自ANGPTL4,DKK1,EPHA2,GAL1,LAMC2,SPON2,CST2,SPINT2和SSR2。在另一个实施方案中，所述的组合物包含用于检测针对所述的组中的至少5种蛋白质的人类自身抗体的试剂。在另一个实施方案中，所述的组合物进一步包含用于检测针对MUC1和/或GRN的人类自身抗体的试剂。在多个实施方案中，所述的组合物由2至20个、4至10个、以及5-10个抗体检测标志物组成。在多个其他的实施方案中，所述的组合物包含用于检测针对以下标志物组的一组标志物的人类自身抗体的试剂，其中所述的标志物组为：
ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1,颗粒体蛋白,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,颗粒体蛋白,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,DKK1,GAL1和LRRC15；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1和LRRC15；
DKK1,GAL1,GFRA1,颗粒体蛋白,LRRC1和5MUC1；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1,颗粒体蛋白和LRRC15；
DKK1,GAL1,颗粒体蛋白,LRRC15和MUC1；
DKK1,GAL1,GFRA1,颗粒体蛋白和LRRC15；
DKK1,GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,颗粒体蛋白和LRRC15；
DKK1,GAL1,GFRA1和LRRC15；
DKK1,GAL1,颗粒体蛋白和LRRC15；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,LRRC15和MUC1；
DKK1,GAL1和LRRC15；
ANGPTL4,GAL1,LRRC15和MUC1；
GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；
GAL1,GFRA1和LRRC15；
ANGPTL4,GAL1和LRRC15；
DKK1,GAL1,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,GAL1,GFRA1和LRRC15；
GAL1,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,GAL1和GFRA1；
DKK1,GAL1和GFRA1；以及
GAL1,GFRA1和MUC1。
在另一个实施方案中，用于检测人类自身抗体的试剂包括至少2种蛋白质，或它们的抗原片段。在另一个实施方案中，至少2种蛋白质或其抗原片段包含天然的细胞外结构域和/或天然分泌的蛋白质或它们的抗原片段。在其他的实施方案中，所述的试剂是可检测标记的。在另一个实施方案中，所述的试剂固定在表面上。
在另一个方面中，本发明提供了用于检测乳腺癌或乳腺疾病复发的方法，其包括将由处于乳腺癌或乳腺癌复发风险下的受试对象得到的体液样品与用于检测自身抗体的一种或多种试剂接触，其中所述的自身抗体对抗以下的一种或多种：ANGTPL4,DKK1,EPHA2,LAMC2,SPON2,SSR2,GAL1,GFRA1,LRRC15,CD147,CD320,CDH3,LRP10,SPINT2,SUSD2和CST2，其中对抗一种或多种蛋白质的自身抗体的存在与受试对象患有乳腺癌或乳腺癌复发的可能性相关。在另一个实施方案中，所述的试剂包含用于检测自身抗体的试剂，其中所述的自身抗体针对以下的一种或多种：ANGPTL4,DKK1,EPHA2,GAL1,LAMC2,SPON2,CST2,SPINT2和SSR2。在多个其他的实施方案中，所述的试剂包含用于检测针对两种或多种、或者五种或多种所述的蛋白质的自身抗体的试剂。在另一个实施方案中，所述的试剂包含用于检测针对以下标志物组的一组标志物的人类自身抗体的试剂，其中所述的标志物组为：
ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1,颗粒体蛋白,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,颗粒体蛋白,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,DKK1,GAL1和LRRC15；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1和LRRC15；
DKK1,GAL1,GFRA1,颗粒体蛋白,LRRC1和MUC1；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1,颗粒体蛋白和LRRC15；
DKK1,GAL1,颗粒体蛋白,LRRC15和MUC1；
DKK1,GAL1,GFRA1,颗粒体蛋白和LRRC15；
DKK1,GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,颗粒体蛋白和LRRC15；
DKK1,GAL1,GFRA1和LRRC15；
DKK1,GAL1,颗粒体蛋白和LRRC15；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,LRRC15和MUC1；
DKK1,GAL1和LRRC15；
ANGPTL4,GAL1,LRRC15和MUC1；
GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；
GAL1,GFRA1和LRRC15；
ANGPTL4,GAL1和LRRC15；
DKK1,GAL1,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,GAL1,GFRA1和LRRC15；
GAL1,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,GAL1和GFRA1；
DKK1,GAL1和GFRA1；以及
GAL1,GFRA1和MUC1。
在另一个实施方案中，所述的试剂包含用于检测针对ANGPTL4,DKK1,GAL1,MUC1,GFRA1,GRN和LRRC15的人类自身抗体的试剂。在另一个实施方案中，所述的一种或多种试剂包含本发明的任意实施方案的或实施方案的组合的组合物。在另一个实施方案中，所述的接触包括ELISA的用途。在另一个实施方案中，体液样品包括得自受试对象的血清样品。在另一个实施方案中，所述的方法将所述的受试对象鉴定为可能患有乳腺癌或乳腺癌复发。在另一个实施方案中，所述的方法进一步包括使用足以治疗乳腺癌或乳腺癌复发的量的治疗试剂来治疗受试对象。
在另一个方面中，本发明提供了用于治疗患有乳腺癌的受试对象的方法，其包括：(a)检验由处于乳腺癌风险下的受试对象得到的体液样品，并鉴定候选受试对象，该受试对象为：
(i)具有对抗ANGPTL4,DKK1,GAL1,MUC1,GFRA1,GRN和LRRC15的至少一者的自身抗体；和/或
(ii)不具有对抗GFRA1,GRN和/或LRRC15的自身抗体；以及
(b)使用足以治疗乳腺癌的量的治疗试剂来治疗候选受试对象。
在一个实施方案中，所述的接触包括使用纵向检测筛选(Longitudinal AssayScreening)，其中在单一的检验和稀释中检测并定量所有的靶物生物标志。在另一个实施方案中，所述的体液样品包含得自受试对象的血液样品。
附图简述
图1.抗原构象影响抗体识别。A.使用抗原进行ELISA分析，其中所述的抗原被设计具有天然构象。使用抗兔IgG涂敷各孔，再使用在293T细胞中形成的HER-2-ECD-rFc蛋白质涂敷各孔。在ELISA中使用针对天然HER-2,3F32(蓝色),Herceptin(绿色)或针对变性的HER-2,3F27(红色)的抗HER-2单克隆抗体的系列稀释。在加入合适的二级抗体后发生反应。O.D.为针对所述的反应读取的吸光率。B.使用变性抗原的ELISA分析。使用在E.coli中形成的纯化的His-HER-2-ECD涂敷各孔，并加入系列稀释的3F32(蓝色),Herceptin(绿色)或3F27(红色)。在加入二级抗体后，发生所述的反应。C.通过流式细胞仪在SKBR3细胞上检测HER-2。荧光显示在SKBR3细胞的表面上的HER-2的抗体识别。D.结合竞争测试，用于证明带有构象抗原的ELISA的特异性。使用抗兔IgG预涂敷各孔，然后使用HER-2-ECD-rFc预涂敷。将纯化的HER-2-Fc(黑色)或CD30-Fc(紫色)的嵌合蛋白质系列稀释，并加入至恒定量的Herceptin，然后加入至各孔中。在与二级抗体温育之后，发生反应。
图2.用于对乳腺癌患者分类的ROC曲线比较。将针对7种抗原(即，ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1,GRN,LRRC15和MUC1)的自身抗体的应答加入至逻辑回归模型中，该模型包括年龄、BMI、种族和目前的吸烟状况。针对所有的受试对象(上方)并通过乳腺癌的特定亚型来确定ROC曲线，其中所述的乳腺癌亚型包括ER阳性、侵入性、最大重量尺寸>1cm、原位的、淋巴结转移和HER-2扩增的(下方)。
发明详述
所引用的所有参考文献均以引用方式全文并入本文。
在本申请中，除非另外陈述，否则所用的技术均可以在多个公知的参考文献的任意一份中找到，例如：Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook,et al.,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press),Gene Expression Technology(Methods inEnzymology,Vol.185,edited by D.Goeddel,1991.Academic Press,San Diego,CA),“Guide to Protein Purification”in Methods in Enzymology(M.P.Deutshcer,ed.,(1990)Academic Press,Inc.)；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Innis,et al.1990.Academic Press,San Diego,CA),Culture of Animal Cells:AManual of Basic Technique,2nd Ed.(R.I.Freshney.1987.Liss,Inc.New York,NY),GeneTransfer and Expression Protocols,pp.109-128,ed.E.J.Murray,The Humana PressInc.,Clifton,N.J.),和the Ambion 1998Catalog(Ambion,Austin,TX)。
在第一个方面中，本发明提供了由2至25个抗体检测标志物组成的组合物，其中所述的组合物包含用于检测针对至少2种人类蛋白质的人类自身抗体的试剂，其中所述的人类蛋白质选自ANGTPL4,DKK1,EPHA2,LAMC2,SPON2,SSR2,GAL1,GFRA1,LRRC15,CD147,CD320,CDH3,LRP10,SPINT2,SUSD2和CST2。本发明意外地发现针对所述的蛋白质的自身抗体提供受试对象是否遭受乳腺癌(BCa)的指示。因此，例如在诊断测试中可以使用本发明的组合物，从而通过检测得自受试对象的样品中的抗体来分辨BCa和健康患者，或者检测乳腺癌患者在治疗后疾病的复发情况。在一个实施方案中，所述的组合物包含用于检测针对至少2种人类蛋白质的人类自身抗体的试剂，其中所述的人类蛋白质选自ANGPTL4,DKK1,EPHA2,GAL1,LAMC2,SPON2,CST2,SPINT2和SSR2。
在多个实施方案中，所述的组合物包含用于检测针对所述的组中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种蛋白质的人类自身抗体的试剂。在多个其他的实施方案中，所述的组合物由2-24,2-23,2-22,2-21,2-20,2-19,2-18,2-17,2-16,2-15,2-14,2-13,2-12,2-11,2-10,2-9,2-8,2-7,2-6,2-5,2-4,2-3,3-25,3-24,3-23,3-22,3-21,3-20,3-19,3-18,3-17,3-16,3-15,3-14,3-13,3-12,3-11,3-10,3-9,3-8,3-7,3-6,3-5,3-4,4-25,4-24,4-23,4-22,4-21,4-20,4-19,4-18,4-17,4-16,4-15,4-14,4-13,4-14,4-13,4-12,4-11,4-10,4-9,4-8,4-7,4-6,4-5,5-25,5-24,5-23,5-22,5-21,5-20,5-19,5-18,5-17,5-16,5-15,5-14,5-13,5-12,5-11,5-10,5-9,5-8,5-7,5-6,6-25,6-24,6-23,6-22,6-21,6-20,6-19,6-18,6-17,6-16,6-15,6-14,6-13,6-12,6-11,6-10,6-9,6-8,6-7,7-25,7-24,7-23,7-22,7-21,7-20,7-19,7-18,7-17,7-16,7-15,7-14,7-13,7-12,7-11,7-10,7-9,7-8,8-25,8-24,8-23,8-22,8-21,8-20,8-19,8-18,8-17,8-16,8-15,8-14,8-13,8-12,8-11,8-10,8-9,9-25,9-24,9-23,9-22,9-21,9-20,9-19,9-18,9-17,9-16,9-15,9-14,9-13,9-12,9-11,9-10,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10-11,12,13,14,15或16种抗体检测试剂组成。
如本领域那些技术人员所理解的那样，所述的组合物可以包含适用于所述的组合物的预期用途的其他的抗体检测标志物和对照。
在一个非限定性的实施方案中，所述的组合物可以进一步包含用于检测针对黏蛋白-1(MUC1),HER-2(41),IGFBP2和颗粒体蛋白(GRN)中的一者或两者的抗体的试剂。
在其他的实施方案中，所述的组合物包含或者由用于检测人类自身抗体的试剂组成，其中所述的人类自身抗体针对以下标志物组中的一者，其中所述的标志物组在以下实施例(参见表5)中示出，从而提供用于诊断乳腺癌的强的预测值：
ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1,颗粒体蛋白,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,颗粒体蛋白,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,DKK1,GAL1和LRRC15；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1和LRRC15；
DKK1,GAL1,GFRA1,颗粒体蛋白,LRRC1和5MUC1；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1,颗粒体蛋白和LRRC15；
DKK1,GAL1,颗粒体蛋白,LRRC15和MUC1；
DKK1,GAL1,GFRA1,颗粒体蛋白和LRRC15；
DKK1,GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,颗粒体蛋白和LRRC15；
DKK1,GAL1,GFRA1和LRRC15；
DKK1,GAL1,颗粒体蛋白和LRRC15；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,LRRC15和MUC1；
DKK1,GAL1和LRRC15；
ANGPTL4,GAL1,LRRC15和MUC1；
GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；
GAL1,GFRA1和LRRC15；
ANGPTL4,GAL1和LRRC15；
DKK1,GAL1,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,GAL1,GFRA1和LRRC15；
GAL1,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,GAL1和GFRA1；
DKK1,GAL1和GFRA1；以及
GAL1,GFRA1和MUC1。
在另一个实施方案中，所述的组合物包含或者由用于检测针对人类ANGPTL4,DKK1,GAL1,MUC1,GFRA1,GRN和LRRC15的人类自身抗体的试剂组成。
抗体检测标志物可以为可以用于检测针对所述的蛋白质的抗体的任何合适的试剂，其中所述的蛋白质包括但不限于所述的蛋白质、分泌型蛋白质(例如天然分泌形式的蛋白质)、或蛋白质的细胞外结构域。分泌的蛋白质更容易于由肿瘤细胞传递至淋巴结，其中发生免疫细胞的相互作用，从而得到丰富的高亲和性抗体。膜表面蛋白质通常以可溶的形式通过金属蛋白酶依赖的切割由肿瘤细胞释放。脱落的蛋白质(shed protein)比细胞内蛋白质更易于转移至淋巴结中。因此，在一个实施方案中，抗体检测标志物为所述的蛋白质的分泌的或膜部分。所述的人类蛋白质的分泌的或膜部分的示例性氨基酸序列如下所示：
ANGTPL4(SEQ ID NO:1)
KSPRFASWDEMNVLAHGLLQLGQGLREHAERTRSQLSALERRLSACGSACQGTEGSTDLPLAPESRVDPEVLHSLQTQLKAQNSRIQQLFHKVAQQQRHLEKQHLRIQHLQSQFGLLDHKHLDHEVAKPARRKRLPEMAQPVDPAHNVSRLHRLPRDCQELFQVGERQSGLFEIQPQGSPPFLVNCKMTSDGGWTVIQRRHDGSVDFNRPWEAYKAGFGDPHGEFWLGLEKVHSITGDRNSRLAVQLRDWDGNAELLQFSVHLGGEDTAYSLQLTAPVAGQLGATTVPPSGLSVPFSTWDQDHDLRRDKNCAKSLSGGWWFGTCSHSNLNGQYFRSIPQQRQKLKKGIFWKTWRGRYYPLQATTMLIQPMAAEAAS
DKK1(SEQ ID NO:2)
VSATLNSVLNSNAIKNLPPPLGGAAGHPGSAVSAAPGILYPGGNKYQTIDNYQPYPCAEDEECGTDEYCASPTRGGDAGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNGICVSSDQNHFRGEIEETITESFGNDHSTLDGYSRRTTLSSKMYHTKGQEGSVCLRSSDCASGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSCRIQKDHHQASNSSRLHTCQRH
EPHA2(SEQ ID NO:3)
KEVVLLDFAAAGGELGWLTHPYGKGWDLMQNIMNDMPIYMYSVCNVMSGDQDNWLRTNWVYRGEAERIFIELKFTVRDCNSFPGGASSCKETFNLYYAESDLDYGTNFQKRLFTKIDTIAPDEITVSSDFEARHVKLNVEERSVGPLTRKGFYLAFQDIGACVALLSVRVYYKKCPELLQGLAHFPETIAGSDAPSLATVAGTCVDHAVVPPGGEEPRMHCAVDGEWLVPIGQCLCQAGYEKVEDACQACSPGFFKFEASESPCLECPEHTLPSPEGATSCECEEGFFRAPQDPASMPCTRPPSAPHYLTAVGMGAKVELRWTPPQDSGGREDIVYSVTCEQCWPESGECGPCEASVRYSEPPHGLTRTSVTVSDLEPHMNYTFTVEARNGVSGLVTSRSFRTASVSINQTEPPKVRLEGRSTTSLSVSWSIPPPQQSRVWKYEVTYRKKGDSNSYNVRRTEGFSVTLDDLAPDTTYLVQVQALTQEGQGAGSKVHEFQTLSPEGSGNL
LAMC2(SEQ ID NO:4)
TSRREVCDCNGKSRQCIFDRELHRQTGNGFRCLNCNDNTDGIHCEKCKNGFYRHRERDRCLPCNCNSKGSLSARCDNSGRCSCKPGVTGARCDRCLPGFHMLTDAGCTQDQRLLDSKCDCDPAGIAGPCDAGRCVCKPAVTGERCDRCRSGYYNLDGGNPEGCTQCFCYGHSASCRSSAEYSVHKITSTFHQDVDGWKAVQRNGSPAKLQWSQRHQDVFSSAQRLDPVYFVAPAKFLGNQQVSYGQSLSFDYRVDRGGRHPSAHDVILEGAGLRITAPLMPLGKTLPCGLTKTYTFRLNEHPSNNWSPQLSYFEYRRLLRNLTALRIRATYGEYSTGYIDNVTLISARPVSGAPAPWVEQCICPVGYKGQFCQDCASGYKRDSARLGPFGTCIPCNCQGGGACDPDTGDCYSGDENPDIECADCPIGFYNDPHDPRSCKPCPCHNGFSCSVMPETEEVVCNNCPPGVTGARCELCADGYFGDPFGEHGPVRPCQPCQCNNNVDPSASGNCDRLTGRCLKCIHNTAGIYCDQCKAGYFGDPLAPNPADKCRACNCNPMGSEPVGCRSDGTCVCKPGFGGPNCEHGAFSCPACYNQVKIQMDQFMQQLQRMEALISKAQGGDGVVPDTELEGRMQQAEQALQDILRDAQISEGASRSLGLQLAKVRSQENSYQSRLDDLKMTVERVRALGSQYQNRVRDTHRLITQMQLSLAESEASLGNTNIPASDHYVGPNGFKSLAQEATRLAESHVESASNMEQLTRETEDYSKQALSLVRKALHEGVGSGSGSPDGAVVQGLVEKLEKTKSLAQQLTREATQAEIEADRSYQHSLRLLDSVSRLQGVSDQSFQVEEAKRIKQKADSLSSLVTRHMDEFKRTQKNLGNWKEEAQQLLQNGKSGREKSDQLLSRANLAKSRAQEALSMGNATFYEVESILKNLREFDLQVDNRKAEAEEAMKRLSYISQKVSDASDKTQQAERALGSAAADAQRAKNGAGEALEISSEIEQEIGSLNLEANVTADGALAMEKGLASLKSEMREVEGELERKELEFDTNMDAVQMVITEAQKVDTRAKNAGVTIQDTLNTLDGLLHLMGM
SPON2(SEQ ID NO:5)
QPLGGESICSARAPAKYSITFTGKWSQTAFPKQYPLFRPPAQWSSLLGAAHSSDYSMWRKNQYVSNGLRDFAERGEAWALMKEIEAAGEALQSVHEVFSAPAVPSGTGQTSAELEVQRRHSLVSFVVRIVPSPDWFVGVDSLDLCDGDRWREQAALDLYPYDAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTVTEITSSSPSHPANSFYYPRLKALPPIARVTLLRLRQSPRAFIPPAPVLPSRDNEIVDSASVPETPLDCEVSLWSSWGLCGGHCGRLGTKSRTRYVRVQPANNGSPCPELEEEAECVPDNCV
SSR2(SEQ ID NO:6)
EEGARLLASKSLLNRYAVEGRDLTLQYNIYNVGSSAALDVELSDDSFPPEDFGIVSGMLNVKWDRIAPASNVSHTVVLRPLKAGYFNFTSATITYLAQEDGPVVIGSTSAPGQGGILAQREFDRRFSPH
GAL1(SEQ ID NO:7)
LRVRGEVAPDAKSFVLNLGKDSNNLCLHFNPRFNAHGDANTIVCNSKDGGAWGTEQREAVFPFQPGSVAEVCITFDQANLTVKLPDGYEFKFPNRLNLEAINYMAADGDFKIKCVAFD
GFRA1(SEQ ID NO:8)
DRLDCVKASDQCLKEQSCSTKYRTLRQCVAGKETNFSLASGLEAKDECRSAMEALKQKSLYNCRCKRGMKKEKNCLRIYWSMYQSLQGNDLLEDSPYEPVNSRLSDIFRVVPFISDVFQQVEHIPKGNNCLDAAKACNLDDICKKYRSAYITPCTTSVSNDVCNRRKCHKALRQFFDKVPAKHSYGMLFCSCRDIACTERRRQTIVPVCSYEEREKPNCLNLQDSCKTNYICRSRLADFFTNCQPESRSVSSCLKENYADCLLAYSGLIGTVMTPNYIDSSSLSVAPWCDCSNSGNDLEECLKFLNFFKDNTCLKNAIQAFGNGSDVTVWQPAFPVQTTTATTTTALRVKNKPLGPAGSENEIPTHVLPPCANLQAQKLKSNVSGNTHLCISNGNYEKEGLGASSHITTKSMAAPPSCGLSPLLVLVVTALSTLLSLTETS
LRRC15(SEQ ID NO:9)
YHGCPSECTCSRASQVECTGARIVAVPTPLPWNAMSLQILNTHITELNESPFLNISALIALRIEKNELSRITPGAFRNLGSLRYLSLANNKLQVLPIGLFQGLDSLESLLLSSNQLLQIQPAHFSQCSNLKELQLHGNHLEYIPDGAFDHLVGLTKLNLGKNSLTHISPRVFQHLGNLQVLRLYENRLTDIPMGTFDGLVNLQELALQQNQIGLLSPGLFHNNHNLQRLYLSNNHISQLPPSVFMQLPQLNRLTLFGNSLKELSPGIFGPMPNLRELWLYDNHISSLPDNVFSNLRQLQVLILSRNQISFISPGAFNGLTELRELSLHTNALQDLDGNVFRMLANLQNISLQNNRLRQLPGNIFANVNGLMAIQLQNNQLENLPLGIFDHLGKLCELRLYDNPWRCDSDILPLRNWLLLNQPRLGTDTVPVCFSPANVRGQSLIIINVNVAVPSVHVPEVPSYPETPWYPDTPSYPDTTSVSSTTELTSPVEDYTDLTTIQVTDDRSVWGMTQAQSG
GRN(SEQ ID NO:10)
TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLL
MUC1(SEQ ID NO:11)
APKPATVVTGSGHASSTPGGEKETSATQRSSVPSSTEKNAFNSSLEDPSTDYYQELQRDISEMFLQIYKQGGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPG
CD147(SEQ ID NO:12)
AAGTVFTTVEDLGSKILLTCSLNDSATEVTGHRWLKGGVVLKEDALPGQKTEFKVDSDDQWGEYSCVFLPEPMGTANIQLHGPPRVKAVKSSEHINEGETAMLVCKSESVPPVTDWAWYKITDSEDKALMNGSESRFFVSS
CD320(SEQ ID NO:13)
AGPSSGSCPPTKFQCRTSGLCVPLTWRCDRDLDCSDGSDEEECRIEPCTQKGQCPPPPGLPCPCTGVSDCSGGTDKKLRNCSRLACLAGELRCTLSDDCIPLTWRCDGHPDCPDSSDELGCGTNEILPEGDATTMGPPVTLESVTSLRNATTMGPPVTLESVPSVGNATSSSAGDQSGSPTAYG
CDH3(SEQ ID NO:14)
EPCRAVFREAEVTLEAGGAEQEPGQALGKVFMGCPGQEPALFSTDNDDFTVRNGETVQERRSLKERNPLKIFPSKRILRRHKRDWVVAPISVPENGKGPFPQRLNQLKSNKDRDTKIFYSITGPGADSPPEGVFAVEKETGWLLLNKPLDREEIAKYELFGHAVSENGASVEDPMNISIIVTDQNDHKPKFTQDTFRGSVLEGVLPGTSVMQMTATDEDDAIYTYNGVVAYSIHSQEPKDPHDLMFTIHRSTGTISVISSGLDREKVPEYTLTIQATDMDGDGSTTTAVAVVEILDANDNAPMFDPQKYEAHVPENAVGHEVQRLTVTDLDAPNSPAWRATYLIMGGDDGDHFTITTHPESNQGILTTRKGLDFEAKNQHTLYVEVTNEAPFVLKLPTSTATIVVHVEDVNEAPVFVPPSKVVEVQEGIPTGEPVCVYTAEDPDKENQKISYRILRDPAGWLAMDPDSGQVTAVGTLDREDEQFVRNNIYEVMVLAMDNGSPPTTGTGTLLLTLIDVNDHGPVPEPRQITICNQSPVRQVLNITDKDLSPHTSPFQAQLTDDSDIYWTAEVNEEGDTVVLSLKKFLKQDTYDVHLSLSDHGNKEQLTVIRATVCDCHGHVETCPGPWKGG
HER2(SEQ ID NO:15)
TQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLT
IGFBP2(SEQ ID NO:6)
EVLFRCPPCTPERLAACGPPPVAPPAAVAAVAGGARMPCAELVREPGCGCCSVCARLEGEACGVYTPRCGQGLRCYPHPGSELPLQALVMGEGTCEKRRDAEYGASPEQVADNGDDHSEGGLVENHVDSTMNMLGGGGSAGRKPLKSGMKELAVFREKVTEQHRQMGKGGKHHLGLEEPKKLRPPPARTPCQQELDQVLERISTMRLPDERGPLEHLYSLHIPNCDKHGLYNLKQCKMSLNGQRGECWCVNPNTGKLIQGAPTIRGDPECHLFYNEQQEARGVHTQRMQ
LRP10(SEQ ID NO:17)
HPDRIIFPNHACEDPPAVLLEVQGTLQRPLVRDSRTSPANCTWLILGSKEQTVTIRFQKLHLACGSERLTLRSPLQPLISLCEAPPSPLQLPGGNVTITYSYAGARAPMGQGFLLSYSQDWLMCLQEEFQCLNHRCVSAVQRCDGVDACGDGSDEAGCSSDPFPGLTPRPVPSLPCNVTLEDFYGVFSSPGYTHLASVSHPQSCHWLLDPHDGRRLAVRFTALDLGFGDAVHVYDGPGPPESSRLLRSLTHFSNGKAVTVETLSGQAVVSYHTVAWSNGRGFNATYHVRGYCLPWDRPCGLGSGLGAGEGLGERCYSEAQRCDGSWDCADGTDEEDCPGCPPGHFPCGAAGTSGATACYLPADRCNYQTFCADGADERRCRHCQPGNFRCRDEKCVYETWVCDGQPDCADGSDEWDCSYVLPRK
SPINT2(SEQ ID NO:18)
ADRERSIHDFCLVSKVVGRCRASMPRWWYNVTDGSCQLFVYGGCDGNSNNYLTKEECLKKCATVTENATGDLATSRNAADSSVPSAPRRQDSEDHSSDMFNYEEYCTANAVTGPCRASFPRWYFDVERNSCNNFIYGGCRGNKNSYRSEEACMLRCFRQQENPPLPLGSKV
SUSD2(SEQ ID NO:19)
QESCSMRCGALDGPCSCHPTCSGLGTCCLDFRDFCLEILPYSGSMMGGKDFVVRHFKMSSPTDASVICRFKDSIQTLGHVDSSGQVHCVSPLLYESGRIPFTVSLDNGHSFPRAGTWLAVHPNKVSMMEKSELVNETRWQYYGTANTSGNLSLTWHVKSLPTQTITIELWGYEETGMPYSQEWTAKWSYLYPLATHIPNSGSFTFTPKPAPPSYQRWRVGALRIIDSKNYAGQKDVQALWTNDHALAWHLSDDFREDPVAWARTQCQAWEELEDQLPNFLEELPDCPCTLTQARADSGRFFTDYGCDMEQGSVCTYHPGAVHCVRSVQASLRYGSGQQCCYTADGTQLLTADSSGGSTPDRGHDWGAPPFRTPPRVPSMSHWLYDVLSFYYCCLWAPDCPRYMQRRPSNDCRNYRPPRLASAFGDPHFVTFDGTNFTFNGRGEYVLLEAALTDLRVQARAQPGTMSNGTETRGTGLTAVAVQEGNSDVVEVRLANRTGGLEVLLNQEVLSFTEQSWMDLKGMFLSVAAGDRVSIMLASGAGLEVSVQGPFLSVSVLLPEKFLTHTHGLLGTLNNDPTDDFTLHSGRVLPPGTSPQELFLFGANWTVHNASSLLTYDSWFLVHNFLYQPKHDPTFEPLFPSETTLNPSLAQEAAKLCGDDHFCNFDVAATGSLSTGTATRVAHQLHQRRMQSLQPVVSCGWLAPPPNGQKEGNRYLAGSTIYFHCDNGYSLAGAETSTCQADGTWSSPTPKCQPGRSYA
CST2(SEQ ID NO:20)
WSPQEEDRIIEGGIYDADLNDERVQRALHFVISEYNKATEDEYYRRLLRVLRAREQIVGGVNYFFDIEVGRTICTKSQPNLDTCAFHEQPELQKKQLCSFQIYEVPWEDRMSLVNSRCQEA
在另一个实施方案中，抗体检测标志物为采用其天然形式的蛋白质，例如上文公开的那些。如所附的实施例中所公开的那样，本发明人利用真核表达系统而形成带有构象的肿瘤抗原，该肿瘤抗原适当地折叠并包含用于自身抗体检测的非连续的抗原表位。所述的蛋白质可以以任何合适的形式使用，在一个非限定性实施方案中，所述的蛋白质可以为Fc融合蛋白质。
在所有上述的实施方案中，可以使用可检测的标签来标记抗体检测试剂。在一个实施方案中，可检测标签(用于检测针对一种蛋白质的自身抗体的试剂)不同于检测针对其他蛋白质的自身抗体的可检测标签。用于检测标签的方法包括但不限于分光镜,光化学,生物化学,免疫化学,物理或化学技术。可以使用任何合适的可检测标签。
所述的组合物可以以冻干形式或者溶液形式冷冻储存。在一个实施方案中，所述的组合物可以放置在固体支撑体上，例如微阵列或微板形式；这种实施方案有利于所述的组合物在对照检测测试中的使用。例如抗IgG可以用于预涂敷微孔板的孔，并且抗体检测试剂(例如本文所讨论的蛋白质)可以加入至预涂敷的孔中。
在第二个方面中，本发明提供了用于检测乳腺癌或乳腺癌复发的方法，其包括将由处于乳腺癌或乳腺癌复发风险下的受试对象得到的液体样品与用于检测自身抗体的一种或多种试剂接触，其中所述的自身抗体针对人类ANGTPL4,DKK1,EPHA2,LAMC2,SPON2,SSR2,GAL1,GFRA1,LRRC15,CD147,CD320,CDH3,LRP10,SPINT2,SUSD2和CST2中的一种或多种，其中针对一种或多种蛋白质的自身抗体的存在与受试对象患有乳腺癌或乳腺癌复发的可能性有关。
在一个实施方案中，所述的组合物包含用于检测人类自身抗体的试剂，其中所述的人类自身抗体针对选自人类ANGPTL4,DKK1,EPHA2,GAL1,LAMC2,SPON2,CST2,SPINT2和SSR2中的至少2种蛋白质。
如本领域那些技术人员所理解的那样，所述的方法可以包括适用于本发明的预期用途的其他抗体检测标志物和对照的用途。在一个非限定性实施方案中，所述的组合物可以进一步包含用于检测针对黏蛋白-1(MUC1),HER-2(41),IGFBP2和颗粒体蛋白中的一种或两种的抗体的试剂。
在本发明的方法的另一个实施方案中，所述的组合物包含或由用于检测针对以下标志物组中的一组的人类自身抗体的试剂组成：
ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1,颗粒体蛋白,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,颗粒体蛋白,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,DKK1,GAL1和LRRC15；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1和LRRC15；
DKK1,GAL1,GFRA1,颗粒体蛋白,LRRC1和5MUC1；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1,颗粒体蛋白和LRRC15；
DKK1,GAL1,颗粒体蛋白,LRRC15和MUC1；
DKK1,GAL1,GFRA1,颗粒体蛋白和LRRC15；
DKK1,GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,颗粒体蛋白和LRRC15；
DKK1,GAL1,GFRA1和LRRC15；
DKK1,GAL1,颗粒体蛋白和LRRC15；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,LRRC15和MUC1；
DKK1,GAL1和LRRC15；
ANGPTL4,GAL1,LRRC15和MUC1；
GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；
GAL1,GFRA1和LRRC15；
ANGPTL4,GAL1和LRRC15；
DKK1,GAL1,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,GAL1,GFRA1和LRRC15；
GAL1,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,GAL1和GFRA1；
DKK1,GAL1和GFRA1；以及
GAL1,GFRA1和MUC1。
在另一个实施方案中，所述的组合物包含或由用于检测针对ANGPTL4,DKK1,GAL1,MUC1,GFRA1,GRN和LRRC15的人类自身抗体的试剂组成。
抗体检测标志物可以为任何合适的试剂，其中所述的试剂可以用于检测针对所述的蛋白质的抗体，所述的蛋白质包括但不限于所述的蛋白质、分泌型蛋白质(例如天然分泌形式的蛋白质)、或蛋白质的细胞外结构域。分泌的蛋白质更容易于由肿瘤细胞传递至淋巴结，其中发生免疫细胞的相互作用，从而得到丰富的高亲和性抗体。膜表面蛋白质通常以可溶的形式通过金属蛋白酶依赖的切割由肿瘤细胞释放。脱落的蛋白质比细胞内蛋白质更易于转移至淋巴结中。因此，在一个实施方案中，抗体检测标志物为所述的蛋白质的分泌的或膜部分。所述的人类蛋白质的分泌的或膜部分的示例性氨基酸序列如本发明所公开。
在另一个实施方案中，所述的抗体检测标志物包含或由本发明的组合物组成。
可以在任何合适的条件下实施所述的接触，其中所述的条件用于促进液体样品中自身抗体与所述的试剂之间的结合，从而形成可以检测的结合复合物。本领域的那些技术人员可以根据本文的教导，基于预期的测试来确定合适的此类条件。类似地，任何合适的其他步骤可以用于所述的方法中，例如一个或多个洗涤或其他步骤以除去未结合的试剂。
可以使用任何合适的检测技术，包括但不限于酶联免疫吸附测试(ELISA)，珠基测试平台(例如the Luminex系统)，2-D阵列基测试平台(例如和the‘Longitudinal Assay Screening’平台，其能够在单一检验和稀释下在临床相关浓度下定量由患者样品得到的所有列举的乳腺癌标志物)。在一个实施方案中，所述的组合物可以放置在固体支撑体上，例如微阵列、载玻片、膜、微板形式或珠。所述的实施方案有利于所述的组合物的用途。示例性的此类测试在实施例中提供。
类似地，可以使用任何合适的液体，包括但不限于得自受试对象的血清样品。血浆样品或血液样品。所述的受试对象可以为任何处于乳腺癌风险之下的受试对象，例如人类受试对象。
在进一步的实施方案中，所述的方法鉴定所述的受试对象可能患有乳腺癌，并且其中所述的方法进一步包括使用足以治疗乳腺癌的量的治疗试剂来治疗受试对象。
在上述任意一个实施方案的一个非限定性实施方案中，ANGPTL4,DKK1,GAL1和MUC1自身抗体应答与BCa有关；并且针对GFRA1,GRN和LRRC15的自身抗体应答与BCa呈负相关。
在一个特定的实施方案中，所述的试剂包括ANGPTL4,DKK1,GAL1,MUC1,GFRA1,GRN和LRRC15；其中针对GFRA1,GRN和LRRC15的自身抗体应答与BCa呈负相关。如实施例中详细描述的那样，当针对7种抗原的自身抗体应答被加入至基础模型(包括年龄、体质指数(BMI)、种族和目前吸烟状况)中时，所述的测试具有以下诊断能力：c-stat(95％CI),0.82(0.78至0.86)；敏感性,73％；特异性,76％；和PLR(95％CI),3.04(2.34至3.94)。所述的模型在风险十分位上校准(Hosmer-Lemeshow,p＝0.13)，并且在BCa的特异性亚型(包括雌激素受体阳性、HER-2阳性、侵入性、原位和肿瘤尺寸>1cm)中实施良好。表5中提供其他示例性标志物组的诊断能力。
在第三个方面中，本发明提供了用于治疗患有乳腺癌的受试对象的方法，其包括：(a)检验由处于乳腺癌风险下的受试对象得到的体液样品，以及鉴定候选受试对象，该受试对象为：
(i)具有对抗ANGPTL4,DKK1,GAL1,MUC1,GFRA1,GRN和LRRC15的至少一者的自身抗体；和/或
(ii)不具有对抗GFRA1,GRN和/或LRRC15的自身抗体；以及
(b)使用足以治疗乳腺癌的量的治疗试剂来治疗候选受试对象。
实施例
实施例1
乳腺癌(BCa)患者激起了对抗癌症蛋白质的自身抗体应答，这反映并放大了与肿瘤发生有关的细胞改变。检测血浆中的自身抗体可以提供用于BCa早期检测的最低侵入性机制。为了鉴定激发激素应答的癌症蛋白质，我们生成针对BCa基因富集的cDNA文库，其中所述的BCa基因编码了膜和分泌的蛋白质，与细胞内蛋白质相比，它们更可能诱导肌体应答。为了生成能够被患者抗体高效识别的带有构象的抗原，建立真核表达策略。针对对抗20种不同抗原的自身抗体的活性，使用ELISA测量由200名BCa患者和200名年龄匹配的健康对照得到的血浆，其中所述的抗原被设计为带有构象的抗原表位。使用条件逻辑回归模型来选择对抗20种不同抗原的自身抗原应答的组合，从而将BCa患者与健康对照分类。最佳组合包括ANGPTL4,DKK1,GAL1,MUC1,GFRA1,GRN和LRRC15，然而，对抗GFRA1,GRN和LRRC15的自身抗体应答与BCa呈负相关。当将对抗7种抗原的自身抗体应答加入至基础模型(包括年龄、BMI、种族和目前吸烟状况)中时，所述的测试具有以下诊断能力：c-stat(95％CI),0.82(0.78至0.86)；敏感性,73％；特异性,76％；和PLR(95％CI),3.04(2.34至3.94)。所述的模型在风险十分位上校准(Hosmer-Lemeshow,p＝0.13)，并且在BCa的特异性亚型(包括雌激素受体阳性、HER-2阳性、侵入性、原位和肿瘤尺寸>1cm)中实施良好。
引言
对于乳腺癌(BCa)患者而言，早期且个性化的诊断对于优化可导致长期存活的治疗而言是重要的。尽管乳房摄影术是检测BCa的最广泛使用的方法，但是很大程度上由于高的乳腺密度，大约20％的筛选乳房X照片会得到错误的阴性诊断(1)。此外，在取得乳房X线照片的10名女性中，1名女性需要另外成像(2)。然而，绝大多数的这些女性并未患有BCa，因为每1000个筛选的乳房X线照片中，仅2至4个得到癌症诊断(3)。因此，临床上迫切需要研发用于BCa的早期诊断的新型最低侵入性诊断策略。
目前，不存在建立的肿瘤标志物，该肿瘤标志物被分泌至外周循环中，可以通过血液检验用于BCa的诊断的测量。当前，临床实践中接收的肿瘤标志物为肿瘤基预测标志物，例如雌激素受体(ER),HER-2扩增,21-基因Oncotype DX和70-基因MammaPrint(6-12)。所有这些都需要侵入性活组织检查或手术过程来获得用于评估的肿瘤组织，从而使患者具有沉重的负担。血清肿瘤标志物是有价值的工具，其允许最低侵入性的取样过程，从而促进癌症的早期诊断，并允许治疗后跟踪预后(4,5)。然而，由肿瘤细胞产生的肿瘤标志物在外周循环中通常具有相对低的浓度，特别是在早期阶段的疾病中。
在此，我们报告了鉴定肿瘤抗原候选物的分子方法的用途，其中所述的肿瘤抗原候选物在BCa患者中激发了抗体应答。之前，我们有膜相关的多核糖体(MAP)RNA生成了BCacDNA文库，其中所述的RNA编码分泌的和膜的蛋白质，并由正常组织中减去该RNA文库(29)。分泌的蛋白质更易于由肿瘤细胞传递至淋巴结，其中发生免疫细胞的相互作用，从而得到丰富的高亲和性抗体。膜表面蛋白质通常以可溶的形式通过金属蛋白酶依赖的切割由肿瘤细胞释放。脱落的蛋白质比细胞内蛋白质更易于转移至淋巴结中(30,31)。因此，使用编码膜和分泌的TAA的克隆子富集所得的扣除文库(称为膜相关的多核糖体cDNA文库(MAPcL))，其中所述的克隆子在BCa中高度丰富，并且优选地应该在患者中诱导抗体应答(29)。此外，我们建立了用于生产重组抗原作为Fc融合蛋白质的方法，其中所述的Fc融合蛋白质被设计成具有天然构象，其是膜和分泌的蛋白质的表达所必需的，其中所述的蛋白质在患者中可以诱导抗体应答。
我们已经研发带有构象的抗原的ELISA基策略，从而通过检测对抗一组TAA的自身抗体来区分BCa和健康患者。20种抗原选自MAPcL中所代表的最丰富的基因，并生成Fc融合蛋白质。由200名新诊断的BCa患者和200名作为年龄匹配的对照的健康女性收集血液。使用ELISA，针对对抗20种不同的MAPcL衍生抗原的自身抗体的存在来筛选400个血浆样品。7种抗原与患者的人口统计学的组合产生最佳的阳性似然比，从而却分健康和BCa患者。
材料和方法
质粒构建
就MAPcL-兔Fc-标记的抗原的制备而言，2种构建体pSecTag2(Invitrogen,Carlsbad,CA)和pFUSE-rIgG-Fc1(InvivoGen,San Diego,CA)因其克隆的限制性位点的可利用性，均用于生成20个MAPcL-rFc表达构建体。使用pFUSE-rIgG-Fc1作为模板，使用引物5’-CCGGATATCAGCAAGCCCACGTGCCCACC-3’(SEQ ID NO:21)和5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTC-ATTTACCCGGAGAGCGGGAG-3’(SEQ ID NO:22)(Integrated DNA Technologies,Coralville,IA)通过扩增兔IgG的Fc部分来修饰pSecTag2。使用EcoRV和NotI消化rFc PCR产物，并加入至被称为pSecTag2-rFc的pSecTag2中，其中所述的pSecTag2-rFc包含用于分泌的IgK信号序列。pFUSE-rIgG-Fc1包含Il2信号序列。为了保持2个质粒之间的信号序列一致性，使用pSecTag2作为模板，通过PCR扩增IgK前导序列。然后，使用IgK信号序列来替换IL2前导序列，从而形成pFUSE-IgK-rFc。
20种MAPcL基因的编号示于表1中，其中所述的基因用作用于克隆和预测信号序列的模板。使用SignalP确定各编码蛋白质的信号序列(32,33)。如果蛋白质包含跨膜结构域，则仅编码的细胞外部分被包含在内。使用TMHMM数据库来预测跨膜结构域(34)。由克隆片段编码的氨基酸编号示于表1中。利用SfiI和KpnI限制性位点将ANGPTL4,CDH3,DKK1,SPON2,SSR2,CST2,GFRA1和GAL1自定义克隆至pSecTag2-rFc中(Genscript,Piscataway,NJ)。利用KpnI和BamHI限制性位点将EPHA2,IGFBP2和LAMC2自定义克隆至pSecTag2-rFc中。利用SfiI和BamHI限制性位点将GRN,MUC1和LRRC15自定义克隆至pSecTag2-rFc中。利用SfiI和XhoI限制性位点将HER-2,LRP10,SPINT2和SUSD2克隆至pFUSE-IgK-rFc中。利用BamHI和SacII限制性位点将CD147克隆至pFUSE-IgK-rFc中。利用EcoRI和XhoI限制性位点将CD320克隆至pFUSE-IgK-rFc中。
表1.用于形成rFc融合蛋白质的MAPcL候选物
*使用SignalP确定各编码的蛋白质的信号序列，并且表达构建体中不包含这些序列(32,33)。氨基酸编号表明在Ig信号序列与兔IgG的Fc部分之间克隆的蛋白质的编码部分，从而生成分泌的MAPcL-rFc融合蛋白质。
就His标记的HER-2的制备而言，使用引物5’-CCCAAGCTTGCAGCACCCAAGTGTGCACCGGCAC-3’(SEQ ID NO:23)和5’-GTGCTCGAGTCACGTC-AGAGGGCTGGCTCTCTGCTCG-3’(SEQ ID NO:24)通过PCR来扩增HER-2。使用HindIII和XhoI消耗产物，并直接克隆至pET-28a表达载体中。
细胞培养物
在具有10％FBS的DMEM中培养293T和SKBR3细胞系。在潮湿的温育箱中将培养物保持在37℃及5％CO2下。对于支原体，所有的细胞系经鉴别和检验为阴性。
蛋白质生产
在293T细胞中生产MAPcL-rFc融合蛋白质。简言之，根据制造商的说明书，使用Effectene(Qiagen,Valencia,CA)转染293T细胞。在转染过程中，将细胞在具有2％FBS的DMEM中培养所述的细胞。收获包含分泌的融合蛋白质的上清液，离心从而清除细胞碎片，并补充0.1％叠氮化钠。在E.coli BL21(Invitrogen,Carlsbad,CA)中生产His-HER-2，并使用IMAC亲和层析进行纯化。
夹心ELISA
使用磷酸盐缓冲的生理盐水稀释的2μg/ml山羊抗兔Fc(JacksonImmunoresearch,West Grove,PA)过夜涂敷微量滴定板(Nalge Nunc,Rochester,NY)。在标准的封闭缓冲液(0.5％牛血清白蛋白和0.1％叠氮化钠，处于磷酸盐缓冲的生理盐水中)中将包含rFc融合蛋白质的上清液进行1:3的系列稀释。将平板洗涤一次，并将系列稀释的上清液转移至微量滴定板上。将已知浓度的兔IgG进行相似的稀释，并将其加入到微量滴定板的一排中，从而定量培养物培养基中存在的融合蛋白质的量。在温育2小时后，将平板洗涤2次，并加入在标准的封闭缓冲液(具有0.05％Tween 20)中以1:3000稀释的50μl HRP-缀合的山羊抗兔IgG(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)。在2小时温育后，将平板洗涤4次，并使用100μl/孔的TMB底物(Pierce,Rockford,IL)显色。在使用50μl/孔的2N H2SO4达到5分钟后，终止显色反应，并在450nm下测量吸光率，从而确定浓度。减去在690nm下的吸光率，从而除去背景信号。
构象的与变性的HER-2蛋白质的抗体识别
对于构象的HER-2测试而言，使用处于PBS中的2μg/ml山羊抗兔Fc(JacksonImmunoresearch,West Grove,PA)过夜涂敷微量滴定板。然后，将HER-2-ECD-rFc加入至各孔(100μl/孔)中。对于变性的HER-2而言，使用处于PBS中的2μg/ml His-HER-2-ECD过夜涂敷微量滴定板。
在所述的测试中使用3种HER-2抗体：抗-HER-2 3F27(US Biological,Swampscott,MA),抗-HER-2 3F32(US Biological,Swampscott,MA)和Herceptin(Genentech,South San Francisco,CA)。将各种抗体在具有0.05％Tween 20的标准封闭缓冲液中稀释成1μg/ml。然后，系列稀释所述的抗体。在洗涤一次后，将50μl/孔系列稀释的抗体加入至平板中，并在室温下温育2小时。将平板洗涤3次，并在稀释1:3000下加入种类的合适的HRP-缀合的二级抗体。将平板洗涤4次，并使用100μl/孔TMB底物显色5分钟。使用50μl/孔2N H2SO4终止显色。在450nm下测量吸光率，并减去造成背景的690nm的吸光率。
使用相同的抗体通过流式细胞仪染色SKBR3BCa细胞中的HER-2。使用CellDissociation Solution Non-enzymatic 1x(Sigma,St.Louis,MO,编号#C5914)使SKBR3细胞由盘上脱离。将2x105细胞与0.5μg/ml各种抗体在室温下温育1小时。然后洗涤细胞，并加入用于合适的种类的1:200稀释的PE-缀合的抗体。再次洗涤细胞，悬浮于FACS缓冲液(具有5％牛血清白蛋白和0.1％叠氮化钠的PBS)中，并通过流式细胞仪分析。
Herceptin结合的竞争
使用4μg/ml山羊抗兔Fc涂敷微量滴定板，并过夜温育。在洗涤1次后，将100μl/孔的HER-2-ECD-rFc加入至各孔中，并过夜温育。将HER-2-Fc和CD30-Fc嵌合蛋白质(R&DSystems,Minneapolis,MN)由10μg/ml的起始浓度进行系列稀释。加入Herceptin至各系列稀释的嵌合蛋白质的最终浓度为10ng/ml。将平板洗涤2次，并将50μl/孔的嵌合蛋白质/Herceptin混合物用于平板中。然后将平板洗涤3次，并将1:3000稀释的HRP山羊抗人IgG用于各孔(50μl/孔)中。在洗涤4次后，将100μl/孔TMB底物加入至各孔中。在5分钟后，使用50μl/孔2N H2SO4终止显色。在450nm下测量吸光率，并减去690nm的吸光率。
患者
该病例的纳入标准为超过30岁的女性，这些女性均在Sanford Health,SiouxFalls,SD被新近诊断为BCa(任何类型)。要求患者提供额外的一10ml EDTA管的血液，然后进行乳房切除术、乳房肿瘤切除术、放疗、化疗或其他治疗。如果受试对象之前具有任何类型的癌症史，则仅排除这种病例的受试对象。健康对照受试对象在6个月内具有阴性乳房X线照片，然后抽血。如果受试对象具有任何类型的早期癌症史或自身免疫疾病史，则排除该健康受试对象。所有患者均提供书面的知情同意书，并且the Sanford Health IRB批准了研究方案。由10/08/09至4/17/12，收集由200名BCa患者得到的血液样品。此外，由10/16/09至1/19/11，收集200名年龄匹配的健康对照血液样品。对于招募的患者的特征，参见表2。
表2.患者临床和病理学特征
血清收集
在10ml EDTA管中收集血液，并在2000x g下离心10分钟。移出管中的血浆，等分并储存在-80℃，直至筛选自身抗体的存在情况。
带有构象的抗原ELISA
使用处于磷酸盐缓冲的生理盐水中的4μg/ml山羊抗兔Fc(JacksonImmunoresearch,West Grove,PA)过夜涂敷微量滴定板(Nalge Nunc,Rochester,NY)。将平板洗涤1次，并加入100μl/孔MAPcL-rFc融合蛋白质。将平板温育2小时，并洗涤2次。然后，使用50μl/孔优化的封闭缓冲液(具有0.5％牛血清白蛋白、0.2％奶粉、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、20mM L-谷氨酰胺、20mM L-精氨酸、0.1％叠氮化钠、10％山羊血清和0.05％Tween20的磷酸盐缓冲的生理盐水)涂敷平板。将平板在37℃下温育1小时，并洗涤1次。加入在优化的封闭缓冲液中以1:100稀释的血清样品，并在室温下温育2小时。然后，将平板洗涤3次，并使用在标准的封闭缓冲液(具有0.05％Tween20)中以1:3000稀释的HRP-缀合的山羊抗人IgG(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)检测自身抗体。将平板在室温下温育1小时，洗涤4次，并使用100μl/孔TMB底物(Pierce,Rockford,IL)显色15分钟。使用50μl/孔2N H2SO4终止显色，并在450nm下测量吸光率。减去690nm下的吸光率，从而除去背景信号。各96孔板均包含得自BCa受试对象的14份样品和得自正常乳房X线照片受试对象的14份样品。在相同的平板上以3次重复检验各样品。仅各平板中的一行经过封闭缓冲液作为ELISA的阴性对照。
统计方法
使用贪婪卡尺匹配算法(35)在3年内以1:1将对照与200名BCa患者单独匹配，同时对测定数据是盲态的。对于各受试对象而言，通过3个重复的测量值的平均值减去封闭缓冲液的平均值来转化抗原的水平。如果差值低于0，则将其设定为0，并且取得平方根，从而产生更对称的分布。
对于连续的和分类的数据而言，分别使用两样本t检验和Chi-squared检验来检验BCa患者和对照之间的人口统计学和自身抗体应答的差异。通过将对各抗原的自身抗体的应答加入至逻辑回归模型(其已经包含年龄、BMI、种族和目前吸烟状况)来检验c-统计(即，一致性指数，受试者工作特征(ROC)曲线下的面积)的增益改善。使用Hosmer-Lemeshow拟合优度测量来检验模型的校准，其中所述的测量通过比较各病例的预测值和观察值(概率的十分位数)而构建了Chi-squared统计(36)。
在评估各抗原之后，具有年龄匹配的阶层的多变量条件逻辑回归分析用于确定使Akaike’s Information Criterion最低的抗原的亚组(37)；针对BMI、种族和目前的吸烟状况来调整所有的模型。进行探索性亚组分析来确定在BCa的特定类型中是否差异地实施了抗原的多变量亚组。在以下亚组中检验多变量模型：侵入性、原位、ER阳性、肿瘤最大尺寸>1cm、淋巴结转移和HER-2阳性。使用the Bonferroni校正，标准水平α设定为≤0.05/20抗原＝0.0025。(Cary,NC)9.3版软件用于所有的分析。
结果
被设计为具有天然构象的肿瘤相关抗原的形成
为了鉴定激发患者中激素应答的TAA，编码膜和分泌的蛋白质的候选基因选自MAPcL中所示的最丰富的基因。由于蛋白质上仅10％的抗原表位为线性连续的序列(24)，所以我们采用真核表达细胞来形成带有构象的肿瘤抗原，该肿瘤抗原适当地折叠，并包含用于检测自身抗体的非连续的抗原表位。编码细胞外结构域(ECD)或分泌的蛋白质的不具有候选MAPcL的信号序列的序列为进入pSecTag2-rFc载体或pFUSE-IgK-rFc(取决于限制性酶的克隆位点)中的兔IgG(rFc)的Fc区域的克隆的5’。载体中所包含的IgK前导序列指导融合蛋白质被分泌。编码融合蛋白质的载体瞬间被转移至293T细胞中，并且相应的融合蛋白质被分泌至培养基中。使用夹心ELISA证实分泌的融合蛋白质的生产，并且通过与建立的CD147-rFc标准(数据未示出)的比较来确定浓度。
为了证明所形成的MAPcL-rFc蛋白质被设计成折叠成天然构象，使用市售可得的对抗天然的(单克隆抗体3F32和Herceptin)或变形的(单克隆抗体3F27)HER-2蛋白质的所形成的抗-HER-2抗体来进行ELISA分析。对由HER-2的ECD组成的2种抗原进行分析：在293T细胞中形成的带有构象的HER-2-ECD-rFc蛋白质和在细菌细胞中生产的并且在镍柱上纯化的His-HER-2-ECD蛋白质。抗天然的HER-2抗体(3F32)识别在293T中产生的HER-2-ECD-rFc(图1A)，但是不能检测在细菌中产生的纯化的His-HER-2-ECD蛋白质(图1B)。此外，Herceptin不能检测由细菌纯化的变性的His-HER-2-ECD蛋白质(图1B)。然而，当HER-2-ECD-rFc蛋白质用作ELISA分析的抗原时，对于Herceptin观察到强烈的应答(图1A)。尽管对抗变性的HER-2而生成的3F27抗体不能检测HER-2-ECD-rFc蛋白质(图1A)，但是该抗体对细菌HER-2-ECD具有强烈的应答(图1B)。
为了证明购买抗体对天然的与变形的抗原表位的特异性识别，对未固定的SKBR3细胞实施流式细胞仪，其中所述的SKBR3细胞为已知具有HER-2扩增的BCa细胞系(38)。由于表面HER-2在未固定的SKBR3细胞上保持了其天然构象，所以对变性的HER-2具有特异性的抗-HER-2 3F27抗体不能通过流式细胞仪检测SKBR3细胞的细胞膜上的表面HER-2(图1C)。当抗-HER-2 3F32抗体和Herceptin(其均识别构象的HER-2)用于流式细胞仪分析时，观察到荧光的大的迁移，表明抗体识别SKBR3细胞膜上存在的HER-2(图1C)。
进行结合竞争测试来证明带有构象的抗原ELISA特异性地识别MAPcL抗原。使用抗兔IgG预涂敷各孔，然后使用HER-2-ECD-rFc预涂敷。对购买的HER-2-Fc和CD30-Fc纯化的嵌合蛋白质(R&D Systems)进行系列稀释，并加入各孔的恒定量的Herceptin(10ng/ml)中。在加入HRP缀合的二级抗人IgG抗体后，进行反应。Herceptin与HER-2-ECD-rFc的结合与加入HER-2-Fc竞争，但是不与CD30-Fc蛋白质竞争(图1D)。该结果表明Herceptin与带有构象的融合蛋白质的HER-2-ECD部分特异性地结合。
使用带有构象的抗原ELISA针对自身抗体，对患者进行筛选
通过克隆编码rFc序列的ECD或分泌的蛋白质5’的序列而形成被设计成包含天然构象的20种MAPcL-rFc融合抗原(对所有20种抗原的特性参见表1)。将表达质粒单独地转染至293T细胞中，并且MAPcL-rFc融合蛋白质分泌至培养基中。通过夹心ELISA分析定量20种融合蛋白质(数据未示出)。为了检测由患者收集的血浆中的自身抗体，使用生成的MAPcL-rFc抗原来进行带有构象的抗原ELISA。为了固定MAPcL-rFc融合蛋白质，使用抗兔IgG对96孔板的孔进行预涂敷。将由转染的293T细胞得到的培养基(其包含生成的MAPcL-rFc融合蛋白质，该蛋白质被设计成具有天然的构象)加入至预涂敷的孔中。为了减少平板的改变并增加测试的重复性，将使用得自各个单独患者的血浆的3个重复样品分布在96孔板上。在加入HRP缀合的二价抗人IgG抗体后，使平板显色，并测量各孔的吸光率。使用带有构象的ELISA，针对对抗20种抗原的自身抗体的反应性来评价由新近诊断为BCa的患者收集得到的200份血浆样品和由200名年龄匹配的健康受试对象得到的血浆。
200名BCa患者和200名健康对照的平均(SD)年龄为59(11)岁，并且97％的这些患者确认为白色人种(表2)。癌症患者是更加超重的(29.7与27.1kg/m2,p<0.0001)并且具有不同吸烟习惯(p＝0.014)，这样在癌症受试对象中的目前的吸烟者比健康对照中更普遍(11％与4％)。200名BCa患者呈现出疾病的不均一性，其中所述的疾病由74％的侵入性、24％淋巴结转移、86％ER阳性、17％HER-2阳性和12％三阴性BCa组成(表2)。分析针对单个抗原的自身抗体应答的吸光率读值，我们确定在BCa患者与对照之间，在对抗12种TAA(即，ANGPTL4,DKK1,EPHA2,GAL1,HER-2,IGFBP2,LAMC2,MUC1,SPON2,CST2,SPINT2和SSR2)的自身抗体应答中存在显著的Bonferroni调整后差异(表3)。在BCa患者中检测较高水平的这些自身抗体。在针对年龄、种族、BMI和目前吸烟状况调节的逻辑回归模型中，针对MUC1(1.83),DKK1(1.77)和GAL1(1.75)(均为p<0.0001)的自身抗体应答具有最大的优势比(OR)，这样在对抗这3种抗原的任意一种的自身抗体的应答中，SD每增加1，患者可能患有BCa为大约1.8倍(表3)。当对抗12种抗原(即，GAL1,DKK1,MUC1,ANGPTL4,EPHA2和IGFBP2)中的6种抗原的自身抗体应答均单独地加入至针对年龄、BMI、种族和目前吸烟状况而调节的基础逻辑回归模型中时，所述的自身抗体的应答还增加ROC曲线下的面积(均为p<0.05)。6个模型中的5个模型在风险十分位上校准(最低Hosmer-Lemeshow p＝0.13)，但是包含IGFBP2的模型未校准(p＝0.016)。
表3.自身抗体的吸光率测量及其与乳腺癌的相关性
数据显示为的平均值(SD)；*使用t检验来检验各组之间的差异；显著的Bonferroni调整后p值<0.05/20＝0.0025以黑体示出；使用针对年龄、种族、BMI和目前吸烟状况调整的逻辑回归模型来确定自身抗体中SD每增加1，乳腺癌患病率的优势比(95％CI)；当将自身抗体加入至调整后逻辑回归模型中时，确定ROC曲线下面积的改变(即，c统计)。
为了增加带有构象的ELISA的预测能力，使用条件逻辑回归分析来确定针对一组抗原的自身抗体的应答，其中所述的条件逻辑回归分析引入了单独的年龄匹配研究设计，并针对BMI、种族和目前吸烟状况进行调节。具有最佳模型拟合的组(即，最低AIC)包含针对以下7种抗原的自身抗体应答：ANGPTL4,DKK1,GAL1,MUC1,GFRA1,GRN和LRRC15(表4)。在这7中抗原中，当被加入至基础模型中时，仅针对ANGPTL4,DKK1,MUC1和GAL1的自身抗体应答单独地显示ROC曲线下面积显著增加(表3)。在完全的调整后逻辑回归模型(包含所述的一组抗原)中，目前吸烟状况在普遍的BCa中具有最大的OR(95％CI)，OR＝7.88(2.68-23.2)；并且BMI还为显著的风险因素，每增加1kg/m2，OR＝1.09(1.04-1.13)(表4)。GAL1的OR为6.73(3.42–13.3)，这样在对抗GAL1的自身抗原应答中，SD每增加1，患者可能患有BCa为几乎7被。当针对对抗其他抗原的应答进行调节时，对抗GFRA1(OR＝0.41),GRN(OR＝0.55)和LRRC15(OR＝0.32)的自身抗体应答均与普遍的BCa的优势值呈负相关(表4)。综上，对抗7种抗原一组的自身抗体应答将ROC曲线下面积由0.64增加至0.82(p<0.0001)，并具有以下诊断量度：敏感性(72.9％)，特异性(76.0％)，和阳性似然比(95％CI)3.04(2.34至3.94)(图2)。所述的模型也在风险十分位上校准(Hosmer-Lemeshow,p＝0.13)。
表4.用于乳腺癌的多变量逻辑回归模型优势比
*由于单独的1:1的年龄匹配。
由于BCa为异质性疾病，所以可行的是对抗抗原的组合的自身抗体应答可以分类BCa的亚型，这不同于将所有BCa亚型作为一个整体进行分析。BCa样品可以分成单独的BCa亚型：侵入性、原位的、ER阳性的、肿瘤最大尺寸>1cm、淋巴结转移和HER-2阳性。除了年龄、BMI、种族和目前吸烟状况以外，使用对抗7种抗原组合的自身抗体反应性来检验各亚型中将所述的病例与对照区分的能力(图2)。在BCa的所有亚型中，相似地形成7种抗原的组合模型；c统计为0.81至0.85。在BCa亚型中，当针对对抗7种抗原的组合的自身抗原应答进行分析时，原位肿瘤具有最大的ROC曲线下面积(0.8520,p<0.0001)。由于4种意外的BCa具有极低的模型概率，所以当仅考虑具有淋巴结转移的这些癌症时，所述的模型未校准(Hosmer-Lemeshow p＝0.0036)。
讨论
BCa的早期检测允许内科医生在疾病转移前的初始阶段进行治疗，由此允许更高比率的减轻或者患者长期存活。检测患者血液中针对肿瘤蛋白质生成的自身抗体的存在是用于BCa检测的理想方法。但是，必须鉴定肿瘤抗原，然后弄清患者中特异性自身抗体的应答。我们生成了编码膜和分泌的蛋白质的文库，其中所述的蛋白质在BCa中高表达，并且可以激发免疫应答。
我们示出在我们的测试中，抗原构象改变了抗体结合亲和性，并且自身抗体的检测受到抗原表位的构象的限制(图1)。我们使用一组有效的样品来研发带有构象的ELISA，其中所述的一组样品由新近诊断为BCa患者在手术、化疗或放射治疗之前收集得到的200份血浆样品组成。此外，由200名年龄匹配的受试对象收集血浆，其中所述的受试对象通过在之前的6个月内的确认的正常的乳房X线照片所定义(表2)。使用ELISA，针对对抗20种TAA的自身抗体应答来单独地筛选所有400份血浆样品，其中所述的TAA被设计为包含它们的天然构象。在我们的测试中所分析的20种TAA中，有4种之前报告为在BCa患者中产生抗体应答：MUC1(39,40),HER-2(41),IGFBP2(15)和GRN(42)。检测对抗20种抗原中的12种抗原的自身抗体对于区分正常的和癌症样品而言是具有统计学意义的(表3，黑体)。但是，在我们的测试中，我们未观察到针对GRN的有意义的自身抗体应答。在12种有意义的抗原中，9种抗原之前与BCa自身抗体无关。就我们所知，这是首次报告在BCa患者中对抗ANGPTL4,CST2,DKK1,EPHA2,GAL1,LAMC2,SPINT2,SPON2和SSR2的自身抗体的检测(表3)。
之前已经显示筛选对抗一组抗原的血清从而检测自身抗体与筛选对抗仅单一的抗原以检测自身抗体相比，会增加测试的敏感性(17)。该发现符合以下事实：BCa为异质性疾病(43)，并且各个单独的患者的免疫系统是不同的。7种TAA的组合(由ANGPTL4,DKK1,GAL1,MUC1,GFRA1,GRN和LRRC15组成)具有最大的诊断能力(表4)。与用于检测BCa自身抗体的之前公开的多个抗原组相比(17,44-46)，这7种TAA的组合是独特的，并且我们的研究包含BCa的最大患者群体和健康样品。有趣地，在7种抗原的组合中，有4种抗原单独地具有统计学意义(表3)，而3种抗原(GFRA1,GRN和LRRC15)本身不具有统计学意义(表3)。而且，GFRA1,GRN和LRRC15是与BCa负相关的，表明患者中较低量的这些自身抗体与较高水平的直接相关的自身抗体组合会增加患有BCa的可能性(表4)。当将7种抗原加入至目前吸烟状况和BMI的了解情况中时，测试的敏感性和特异性分别为72.9％和76.0％。ROC曲线下的面积(95％CI)为0.82(0.77至0.85)，并且带有构象的ELISA的阳性似然比为3.04。由于BCa为异质性疾病，所以患者分为肿瘤特征，包括ER阳性、HER-2阳性、原位、侵入性、肿瘤尺寸和淋巴结转移。对于所有的组而言，7种抗原的组合均良好地实施(图2)。这些结果表明所述的测试具有潜在的临床用途。用于BCa的一种血清复发标志物(目前用于临床)为黏蛋白相关抗原CA27.29。使用识别MUC1的单克隆抗体在患者的血液中检测CA27.29抗原。由于CA27.29肿瘤标志物的低敏感性，所以所述的检验用于跟踪患者的BCa复发(47)。与传统的CA27.29肿瘤标志物相比，本发明所述的带有构象的ELISA显示出大有前途。
目前，乳房摄影术为用于BCa筛选的标准方法。但是，形成乳房X线照片所需的机器是昂贵的，需要专业的医学人员操作，并且在运输至医疗服务不足的地区是一种挑战。用于BCa早期检测的血液检验的研发是用于筛选的大幅的进步。抽血是普通的过程，并且血液可以容易地递送至临床试验室用于分析。本研究证明对抗抗原(被设计成包含构象的抗原表位)的自身抗体的应答的组合是用于BCa检测的有前途的策略。其他研究将集中于其他抗原的鉴定，从而改善所述的测试用于转换至临床的敏感性和特异性。
表5.自身抗体的组合的亚组以及它们与乳腺癌的相关性
＝阳性似然比，敏感性/(100-特异性)；ROC＝受试者工作特征曲线；AUC＝曲线下面积；*当将一组抗体加入至针对年龄、种族、BMI和目前吸烟状况而调节的逻辑回归模型时，确定ROC曲线下面积的改变(即，c统计)(均为p值<0.0001)。
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Claims (26)

1.一种由2至25种抗体检测标志物组成的组合物，其中所述的组合物包含用于检测对抗至少2种蛋白质的人类自身抗体的试剂，其中所述的蛋白质选自ANGTPL4,DKK1,EPHA2,LAMC2,SPON2,SSR2,GAL1,GFRA1,LRRC15,CD147,CD320,CDH3,LRP10,SPINT2,SUSD2和CST2。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述的组合物包含用于检测针对至少2种蛋白质的人类自身抗体的试剂，其中所述的蛋白质选自ANGPTL4,DKK1,EPHA2,GAL1,LAMC2,SPON2,CST2,SPINT2和SSR2。
3.权利要求1或2所述的组合物，其中所述的组合物包含用于检测对抗所述的组中的至少5种蛋白质的人类自身抗体的试剂。
4.权利要求1-3的任意一项所述的组合物，其中所述的组合物进一步包含用于检测对抗MUC1和GRN的一种或两种的人类自身抗体的试剂。
5.权利要求1-4的任意一项所述的组合物，其中所述的组合物由2至20种抗体检测标志物组成。
6.权利要求1-4的任意一项所述的组合物，其中所述的组合物由4至10种抗体检测标志物组成。
7.权利要求1-4的任意一项所述的组合物，其中所述的组合物由5至10种抗体检测标志物组成。
8.权利要求1-7的任意一项所述的组合物，其中所述的组合物包含用于检测对抗以下标志物组中的一种标志物的人类自身抗体的试剂：
ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1,颗粒体蛋白,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,颗粒体蛋白,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,DKK1,GAL1和LRRC15；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1和LRRC15；
DKK1,GAL1,GFRA1,颗粒体蛋白,LRRC1和5MUC1；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1,颗粒体蛋白和LRRC15；
DKK1,GAL1,颗粒体蛋白,LRRC15和MUC1；
DKK1,GAL1,GFRA1,颗粒体蛋白和LRRC15；
DKK1,GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,颗粒体蛋白和LRRC15；
DKK1,GAL1,GFRA1和LRRC15；
DKK1,GAL1,颗粒体蛋白和LRRC15；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,LRRC15和MUC1；
DKK1,GAL1和LRRC15；
ANGPTL4,GAL1,LRRC15和MUC1；
GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；
GAL1,GFRA1和LRRC15；
ANGPTL4,GAL1和LRRC15；
DKK1,GAL1,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,GAL1,GFRA1和LRRC15；
GAL1,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,GAL1和GFRA1；
DKK1,GAL1和GFRA1；以及
GAL1,GFRA1和MUC1。
9.权利要求1-4的任意一项所述的组合物，其中所述的组合物包含用于检测对抗ANGPTL4,DKK1,GAL1,MUC1,GFRA1,GRN和LRRC15的人类自身抗体的试剂。
10.权利要求1-9的任意一项所述的组合物，其中所述的用于检测人类自身抗体的试剂包含所述的至少2种蛋白质、或其抗原片段。
11.权利要求10所述的组合物，其中所述的至少2种蛋白质或其抗原片段包含天然的细胞外结构域和/或天然的分泌蛋白质、或其抗原片段。
12.权利要求1-11的任意一项所述的组合物，其中所述的试剂是可检测标记的。
13.权利要求1-12的任意一项所述的组合物，其中所述的试剂被固定在表面上。
14.一种用于检测乳腺癌或疾病复发的方法，其包括将由处于乳腺癌或乳腺癌复发风险之下的受试对象得到的体液与用于检测自身抗体的一种或多种试剂接触，其中所述的自身抗体对抗以下的一种或多种：ANGTPL4,DKK1,EPHA2,LAMC2,SPON2,SSR2,GAL1,GFRA1,LRRC15,CD147,CD320,CDH3,LRP10,SPINT2,SUSD2和CST2，其中对抗所述的一种或多种蛋白质的自身抗体的存在与患有乳腺癌或乳腺癌复发的受试对象的可能性相关。
15.权利要求14所述的方法，其中所述的试剂包含用于检测对抗ANGPTL4,DKK1,EPHA2,GAL1,LAMC2,SPON2,CST2,SPINT2和SSR2中的一种或多种的自身抗体的试剂。
16.权利要求14或15所述的方法，其中所述的试剂包含用于检测对抗所述的蛋白质的两种或多种的自身抗体的试剂。
17.权利要求14或15所述的方法，其中所述的试剂包含用于检测对抗所述的蛋白质的5种或多种的自身抗体的试剂。
18.权利要求14-17的任意一项所述的方法，其中所述的试剂包含用于检测对抗以下标志物组中的一组标志物的人类自身抗体的试剂：
ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1,颗粒体蛋白,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,颗粒体蛋白,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,DKK1,GAL1和LRRC15；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1和LRRC15；
DKK1,GAL1,GFRA1,颗粒体蛋白,LRRC1和5MUC1；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,GFRA1,颗粒体蛋白和LRRC15；
DKK1,GAL1,颗粒体蛋白,LRRC15和MUC1；
DKK1,GAL1,GFRA1,颗粒体蛋白和LRRC15；
DKK1,GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,颗粒体蛋白和LRRC15；
DKK1,GAL1,GFRA1和LRRC15；
DKK1,GAL1,颗粒体蛋白和LRRC15；
ANGPTL4,DKK1,GAL1,LRRC15和MUC1；
DKK1,GAL1和LRRC15；
ANGPTL4,GAL1,LRRC15和MUC1；
GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；
GAL1,GFRA1和LRRC15；
ANGPTL4,GAL1和LRRC15；
DKK1,GAL1,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,GAL1,GFRA1和LRRC15；
GAL1,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,GAL1,GFRA1,LRRC15和MUC1；
ANGPTL4,GAL1和GFRA1；
DKK1,GAL1和GFRA1；以及
GAL1,GFRA1和MUC1。
19.权利要求14-18的任意一项所述的方法，其中所述的试剂包含用于检测对抗ANGPTL4,DKK1,GAL1,MUC1,GFRA1,GRN和LRRC15的人类自身抗体的试剂。
20.权利要求14-19的任意一项所述的方法，其中所述的一种或多种试剂包含权利要求1-13的任意一项所述的组合物。
21.权利要求14-20的任意一项所述的方法，其中所述的接触包括使用ELISA。
22.权利要求14-21的任意一项所述的方法，其中所述的体液样品包括得自所述的受试对象的血清样品。
23.权利要求14-22的任意一项所述的方法，其中所述的方法将所述的受试对象鉴定为可能患有乳腺癌或乳腺癌复发，并且其中所述的方法进一步包括使用足以治疗所述的乳腺癌或乳腺癌复发的量的治疗试剂来治疗所述的受试对象。
24.权利要求14-23的任意一项所述的方法，其中所述的接触包括使用纵向检测筛选，其中所有靶物生物标志物均可以在单一的检验和稀释中检测和定量。
25.权利要求14-24的任意一项所述的方法，其中所述的体液样品包括得自所述的受试对象的血液样品。
26.一种用于治疗患有乳腺癌的受试对象的方法，其包括：
(a)检验由处于乳腺癌风险之下的受试对象得到的体液样品，并鉴定候选受试对象，该候选受试对象为：
(i)具有对抗ANGPTL4,DKK1,GAL1,MUC1,GFRA1,GRN和LRRC15中的至少一者的自身抗体；和/或
(ii)不具有对抗GFRA1,GRN和/或LRRC15的自身抗体；以及
(b)使用足以治疗所述的乳腺癌的量的治疗试剂来治疗所述的候选受试对象。
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