ES2670661T3

ES2670661T3 - Nuevos marcadores moleculares de cáncer de pulmón

Info

Publication number: ES2670661T3
Application number: ES13711661.2T
Authority: ES
Inventors: Daniel AJONA MARTÍNEZ-POLO; Leticia CORRALES PECINO; Luis MONTUENGA BADÍA; María José PAJARES VILLANDIEGO; Rubén PÍO OSÉS
Original assignee: Proyecto de Biomedicina CIMA SL
Current assignee: Proyecto de Biomedicina CIMA SL
Priority date: 2012-03-29
Filing date: 2013-03-20
Publication date: 2018-05-31
Anticipated expiration: 2033-03-20
Also published as: US20150072361A1; EP2831590A1; US10545150B2; HUE036806T2; WO2013143940A1; NO2831590T3; EP2831590B1; PT2831590T; DK2831590T3; PL2831590T3

Abstract

Un método de diagnóstico y/o pronóstico de cáncer de pulmón en un sujeto, comprendiendo el método las etapas de: a) determinar, in vitro, el nivel de un fragmento de activación de C4 en una muestra de ensayo del sujeto; y b) comparar el nivel determinado en la etapa (a) con un nivel de control de referencia de dicho fragmento de activación de C4, en el que si el nivel determinado en la etapa (a) es mayor que el nivel de control de referencia, esto indica que el sujeto padece cáncer de pulmón o que el pronóstico es malo.

Description

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(i): medir in vitro el nivel de un fragmento de activación de C4d en una muestra del paciente una vez que ha comenzado la administración del régimen médico;

(ii): comparar el nivel medido en la etapa (i) con un nivel de control de referencia del fragmento de activación de C4d,

5 en el que, si la cantidad del fragmento de activación de C4d medida en la etapa (i) no es mayor que el nivel de control de referencia, esto indica que el régimen médico es eficaz en el tratamiento del cáncer de pulmón.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona el uso de fragmentos de activación de C4d como un marcador para el diagnóstico, pronóstico de cáncer de pulmón, o como un marcador para supervisar el cáncer de pulmón.

En una realización preferida del método del primer aspecto de la invención, así como el uso del quinto aspecto, la molécula a detectar en la etapa (a) es C4a.

15 El término “C4a” se refiere al fragmento de 77 aminoácidos generado por proteólisis entre los aminoácidos 756-757 de la cadena alfa de la secuencia de C4 (cualquiera de C4A o C4B) y corresponde a la SEQ ID NO: 5.

Por tanto, en una realización, la presente invención proporciona un método de diagnóstico y/o pronóstico de cáncer de pulmón en un sujeto, comprendiendo el método las etapas de:

a) determinar, in vitro, el nivel de C4a en una muestra de ensayo del sujeto; y

b) comparar el nivel de la etapa (a) con un nivel de control de referencia de dicho C4a,

25 en el que el si el nivel de C4a es mayor que el del nivel de control de referencia, esto indica que el sujeto padece cáncer de pulmón o que el pronóstico es malo.

Preferentemente, los métodos de la invención son métodos de inmunoensayo. Más preferentemente el método de inmunoensayo es un ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) o RIA (radioinmunoensayo).

Un inmunoensayo es un tipo específico de ensayo bioquímico que mide la presencia o la concentración de una sustancia (denominada “analito”) en soluciones que frecuentemente contienen una mezcla compleja de sustancias. Este tipo de reacción implica la unión de un tipo de molécula, el antígeno, con un segundo tipo, el anticuerpo. Los inmunoensayos pueden realizarse utilizando bien el antígeno o el anticuerpo para ensayar el otro miembro del par

35 antígeno/anticuerpo.

En una realización, para realizar la detección de proteínas en los métodos de la presente invención, pueden utilizarse anticuerpos, o fragmentos de los mismos, que tienen la capacidad de unirse a fragmentos de activación de C4d.

En la presente invención, la expresión “anticuerpo, o un fragmento del mismo, que tiene la capacidad de unirse a fragmentos de activación de C4d” debe entenderse como cualquier inmunoglobulina, o fragmento de la misma, que sea capaz de unirse selectivamente al antígeno definido por SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. Esto incluye anticuerpos monoclonales y policlonales. La expresión “fragmento del mismo” incluye cualquier parte de un anticuerpo que tenga

45 el tamaño y la conformación adecuados para unirse a un epítopo de C4d. Los fragmentos adecuados incluyen F(ab), F(ab’) y Fv. Un “epítopo” es la parte del antígeno reconocida por el sistema inmunitario (linfocitos B, linfocitos T o anticuerpos).

Cuando se realiza cualquiera de los métodos de la presente invención, el experto en la técnica puede seleccionar cómo proceder cuando se seleccionan los anticuerpos. Por ejemplo, el experto en la técnica puede optar por seleccionar un solo anticuerpo o varios anticuerpos. En el caso de que el experto en la técnica opte por un solo anticuerpo para la detección combinada de C4d+C4b+iC4b, este debe de tener la capacidad de unirse a un epítopo de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, siendo dicho epítopo común a todos los fragmentos de C4d, C4b e iC4b. En el caso de que el experto en la técnica opte por varios anticuerpos, estos debe tener la capacidad de unirse a

55 diferentes epítopos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

El anticuerpo, o fragmento del mismo, para la detección de los fragmentos de activación de C4d, pueden incluirse en un kit. El kit puede comprender adicionalmente medios (aditivos, disolventes) para visualizar las interacciones entre el antígeno y el anticuerpo (tiras reactivas, reactivos quimioluminiscentes, reactivos turbidimétricos, etc.). Aunque los ensayos realizados en los Ejemplos, indicados más adelante, se han efectuado con un kit que incluye un solo anticuerpo de captura con capacidad de unirse a todos los fragmentos de C4d, C4b e iC4b, la invención puede realizarse con cualquier otro anticuerpo o combinación de anticuerpos, siempre que estos reconozcan epítopos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

65 En otra realización, para realizar la detección de proteínas en los métodos de la presente invención, pueden

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activación de C4d y C4a como marcadores específicos de la activación de la ruta clásica del complemento. Anteriormente, se había determinado la proteína total en esta serie de pacientes (Pio R. et al., 2010). Los sobrenadantes del lavado broncoalveolar de pacientes con cáncer de pulmón presentaron niveles significativamente más altos de fragmentos de activación de C4, C4d y C4a que los de pacientes sin cáncer (FIG. 4). Las

5 concentraciones de todos los marcadores en los sujetos de control frente a los sujetos con tumor fueron, respectivamente, (media  DT): C4: 2,43  3,12 frente a 5,90  7,59 μg/ml (p=0,013); C5a: 26,33  25,84 frente a 41,37  39,66 ng/ml (p=0,109); fragmentos de activación de C4d: 0,16  0,11 frente a 0,59  0,83 μg/ml (p<0.001); C4a: 32,67  44,07 frente a 134,9  212,2 ng/ml (p=0,003). En el grupo de sujetos con cáncer, no se encontraron diferencias entre los niveles de los marcadores y la histología de los tumores (FIG. 5).

10 Previamente se había descrito que en los líquidos de lavado broncoalveolar había un aumento significativo en las proteínas plasmáticas, tal como el factor H (Pio R. et al., 2010). Teniendo en cuenta esto, la concentración de los componentes del complemento se normalizó (dividió) entre la concentración del factor H. En este análisis, únicamente los niveles de los fragmentos de activación de C4d/factor H y C4a/factor H fueron diferentes entre los

15 sujetos de control y los pacientes con cáncer. Los datos fueron C4/factor H: 2,028  1,071 frente a 2,575  2,515 (p=0,596); C5a/factor H: 0,055  0,067 frente a 0,084  0,206 (p=0,787); fragmentos de activación de C4d/factor H: 0,091  0,021 frente a 0,218  0,294 (p<0,001); C4a/factor H: 0,027  0,019 frente a 0,045  0,033 (p=0,017). Estos resultados demuestran que la determinación de los elementos activados de la ruta clásica del complemento es sustancialmente diferente de la de los componentes inactivos del complemento (por ejemplo, C4) o elementos

20 activados comunes a diferentes rutas de activación (por ejemplo C5a). En el caso de C4 y C5a, su aumento se debe probablemente a un aumento inespecífico de las proteínas plasmáticas en los líquidos de las vías respiratorias; mientras que en el caso de los fragmentos de activación de C4d y C4a, el aumento se debe a un acontecimiento relacionado con cáncer.

25 Se generó una curva ROC (acrónimo de receiver operating characteristics, en español curva de eficacia diagnóstica) para cada uno de los cuatro biomarcadores. Para impedir la influencia ejercida por las proteínas plasmáticas, la concentración de cada marcador se dividió entre la concentración de factor H. Los resultados se muestran en la FIG. 6. C4 y C5a no tuvieron la capacidad de diferenciar pacientes de controles. En cambio, los fragmentos de activación de C4d permitieron discriminar entre pacientes y controles. Se obtuvieron altas

30 sensibilidades y especificidades a diferentes valores límite (por ejemplo, con un límite de 0,00013, la sensibilidad fue de 49 % y la especificidad de 91 %; y con un límite de 0,0007, la sensibilidad fue de 70 % y la especificidad de 81 %). C4a, también fue útil para diferenciar entre pacientes y controles

Este estudio demuestra que los líquidos de las vías respiratorias de pacientes con cáncer de pulmón contienen

35 concentraciones más altas de algunos componentes del complemento en comparación con los fluidos de las vías respiratorias de pacientes con enfermedades pulmonares benignas. Este estudio también ilustra la diferencia crucial en la utilidad de la determinación de los componentes del complemento previamente evaluados (tal como C4 o C5a)

o elementos específicos activados de la ruta clásica (fragmentos de activación de C4d o C4a), que nunca se habían evaluado en los líquidos biológicos de pacientes con cáncer. Basándose en estos resultados, se puede llegar a la

40 conclusión de que la determinación de los fragmentos de activación de C4 puede utilizarse para el diagnóstico de cáncer de pulmón en líquidos de las vías respiratorias.

Ejemplo 3. Los fragmentos de activación de C4d están aumentados en plasma de pacientes con cáncer de pulmón en fases avanzadas

45 Materia y métodos

Se obtuvieron muestras de plasma de cincuenta pacientes con cáncer de pulmón avanzado (fases IIIB y IV) y de cincuenta personas sanas, de la misma edad, sexo y antecedentes de tabaquismo (cajetillas al día por años

50 fumando) procedentes de la Clínica Universitaria de Navarra. Los tumores de pulmón se clasificaron de acuerdo con la clasificación de la Organización Mundial de la Salud 2004 (Travis W. D. et al., 2004). El protocolo del estudio fueaprobado por el Comité de Ética Institucional y todos los pacientes dieron su consentimiento firmado.

Las determinaciones de los fragmentos de activación de C4, C4d y C5a se realizaron como se explica en el Ejemplo

55 2. La proteína total se midió utilizando el ensayo de proteínas BCA (23225, Pierce), con albúmina de suero bovino como patrón. Las diluciones plasmáticas fueron: 1:105 para C4, 1:50 para los fragmentos de activación de C4d,

1:100 para C5a y 1:100 para la proteína total. A las muestras del kit por debajo del límite de cuantificación se las asignó una concentración de la mitad del límite de cuantificación.

60 Resultados

La activación de la ruta clásica del complemento se evaluó en muestras de plasma de pacientes con cáncer de pulmón en fases avanzadas (IIIB y IV) y de controles sanos. Ambos grupos eran del mismo sexo, tenían la misma edad y antecedentes de tabaquismo. Las concentraciones de los fragmentos de activación de C4, C4d y proteína

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Ejemplo 5. Los fragmentos de activación de C4d están asociados a un pronóstico de cáncer de pulmón

Material y métodos

5 Para cada paciente, se analizaron los niveles de los fragmentos de activación de C4d (obtenidos en el Ejemplo 4) junto con información sobre el grado y resultado clínico de la enfermedad.

Resultados

10 Los cambios en la expresión de una proteína no implican ninguna asociación con el pronóstico de la enfermedad. Para evaluar la capacidad de los fragmentos de activación de C4d para predecir el resultado de los pacientes con cáncer de pulmón, se investigó la asociación entre los niveles de este marcador y las características clínicopatológicas, tales como la fase, el tamaño del tumor o la supervivencia.

15 En primer lugar, se evaluaron las diferencias en los niveles del fragmento de activación de C4d en plasma de pacientes con cáncer de pulmón en fase I o II (FIG. 11). Los pacientes en fase I (n=65) tuvieron niveles significativamente más bajos de fragmentos de activación de C4d en comparación con los pacientes en fase II (n=19): 2,80  2,85 frente a 4,49  4,01 μg/ml (p=0,023). Por otra parte, dentro de la fase I, los pacientes en fase IA (n=37) tendieron a tener niveles más bajos de fragmentos de activación de C4d en comparación con los de en fase

20 IB (n=28): 1,96  1,10 frente a 3,89  3,94 μg/ml (p=0,078). No se observaron diferencias estadísticas (p=0,600) entre pacientes en fase IIA (n=8) y IIB (n=11). No se encontraron diferencias cuando los niveles de C4 se compararon con las fases de la enfermedad: fase I frente a fase II: 0,90  0,38 frente a 0,85  0,34 mg/ml (p=0,554); fase IA frente a fase IB: 0,87  0,32 frente a 0,96  0,44mg/ml (p=0,435).

25 También se examinaron las diferencias en la fase T (T1 frente a T2/T3), en el tamaño e implicación de ganglios linfáticos (N0 frente N1). Los niveles de los fragmentos de activación de C4d eran mayores en pacientes con fases T2/T3 (4,05  4,02 μg/ml; n=39) que en pacientes con fase T1 (2,42  2,04 μg/ml, n=45), aunque las diferencias no alcanzaron un significado estadístico (p=0,018). Además, hubo una correlación significativa entre el tamaño del tumor y los niveles del fragmento de activación de C4d (correlación ordinal de Spearman=0,37, p=0,001). En el caso

30 del estado N, los niveles en pacientes con tumores N0 (2,77  2,81 μg/ml, n=68), fueron significativamente más bajos que en los pacientes con tumores N1 (4,84  4,22 μg/ml, n=16) (p=0,017). En el caso de C4, no se encontraron diferencias entre las fases T (0,87  0,32 frente a 0,95  0,43 mg/ml, p=0,791) o estado N (0,89  0,38 frente a 0,89  0,35 mg/ml, p=0,991).

35 Finalmente, el resultado clínico de los pacientes se comparó con los niveles de los fragmentos de activación de C4d

o C4 en plasma (FIG. 12). Niveles altos de fragmentos de activación de C4d se asociaron significativamente con una peor supervivencia específica de cáncer de pulmón (p<0,001). No se encontró asociación entre la supervivencia y los niveles de C4.

40 Por lo tanto, se puede llegar a la conclusión de que la determinación de los fragmentos de activación de C4d puede utilizarse para el pronóstico de pacientes con cáncer de pulmón.

Ejemplo 6. Los fragmentos de activación de C4d pueden utilizarse para identificar individuos con un riesgo alto de desarrollar cáncer de pulmón

45 Material y métodos

Los niveles de los fragmentos de activación de C4d se determinaron en plasma de una cohorte anidada de individuos asintomáticos con o sin cáncer de pulmón.

50 Se utilizaron muestras de plasma de individuos incluidos en un estudio de exploración con TC en la Clínica Universitaria de Navarra. Los criterios de elegibilidad para el programa de exploración incluyeron una edad de ≥40 años y antecedentes de tabaquismo de 1 cajetilla al día durante 10 años. Los sujetos con síntomas de cáncer de pulmón se excluyeron del programa de exploración. El protocolo de estudio se había publicado previamente

55 (Henschke Cl et al., 1999) y fue aprobado por el Comité de Ética Institucional. Todos los pacientes dieron su consentimiento firmado. La serie completa incluyó más de 2500 individuos con alto riesgo.

Se seleccionaron a treinta dos personas diagnosticadas con cáncer de pulmón después de finalizar el protocolo de exploración basándose en la disponibilidad de las muestras. Cada uno de estos casos coincidía en edad, género y

60 antecedentes de tabaquismo, obteniéndose de cuatro a cinco sujetos sin cáncer de la misma cohorte de personas (158 controles en total).

La determinación de los fragmentos de activación de C4d en las muestras de plasma diluidas a 1:50 se realizó como se explica en el Ejemplo 2.

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Se utilizó la prueba de Cochran-Mantel-Haenszel para estimar las razones de probabilidades (OR, odds ratios) y los intervalos de confianza del 95 % para la asociación del riesgo de cáncer de pulmón con los niveles del fragmento de activación de C4d categorizados en altos y bajos utilizando diferentes límites (1, 1,5, y 2 μg/ml) y se ajustaron con

5 respecto a la edad, el sexo y los antecedentes de tabaquismo (cajetillas al día por años fumando).

Resultados

Los niveles de los fragmentos de activación de C4d se determinaron en muestras de plasma de 115 individuos

10 asintomáticos con alto riesgo. Treinta y dos de ellos se diagnosticaron con cáncer de pulmón en el contexto de un programa de exploración con TC. La concentración de los fragmentos de activación de C4d se cuantificó en todos los casos. Los niveles del marcador en los individuos con cáncer de pulmón eran significativamente más altos que en los que no tenían cáncer de pulmón: 1,80  1,36 μg/ml frente a 0,80  0,47 μg/ml (p<0,001).

15 La asociación con el riesgo de cáncer de pulmón se evaluó utilizando una regresión logística condicional. Los niveles de los fragmentos de activación de C4d se dicotomizaron utilizando 1, 1,5 y 2 μg/ml como límite. Los individuos con niveles altos de marcador mostraron un riesgo aumentado estadísticamente significativo de cáncer de pulmón en comparación con los que tenían niveles bajos: límite 1 μg/ml: OR=5,79 (IC de 95 %=2,43-13,76, p<0,001); límite 1,5 μg/ml: OR=9,26 (IC de 95 %= 3,26-26,27, p<0,001); límite 2 μg/ml: OR=54,18 (IC de 95 %= 7,01-418,84,

20 p<0,001). Este análisis pone de manifiesto que la determinación de los fragmentos de activación de C4d es un biomarcador útil para evaluar el riesgo de cáncer de pulmón en individuos asintomáticos.

Ejemplo 7. Los fragmentos de activación de C4d pueden utilizarse como un biomarcador para obtener eficacia en el 25 tratamiento, supervisar la respuesta al tratamiento y el avance de la enfermedad

Material y métodos

La capacidad de los fragmentos de activación de C4d, como un indicador molecular de la activación de la ruta

30 clásica del complemento, para supervisar la respuesta al tratamiento, se evaluó en pacientes con cáncer de pulmón antes y después de la extirpación quirúrgica del tumor.

En el estudio se incluyó a diecinueve pacientes con cáncer de pulmón resecable. De cada paciente, se utilizaron muestras de plasma antes y después de la extirpación quirúrgica completa del tumor (muestras pretratamiento y

35 postratamiento respectivamente). Los pacientes se seleccionaron basándose en la disponibilidad de las muestras y en determinaciones previas de niveles del fragmento de activación de C4d en el plasma de muestra pretratamiento (en todos los pacientes seleccionados, los niveles del fragmento de activación de C4d en el plasma de muestras pretratamiento eran mayores de 2 μg/ml). Para las muestras postratamiento, el número medio de meses después de la cirugía fue de 7 meses (intervalo: 4-44 meses). Las muestras se obtuvieron en la Clínica Universitaria de Navarra.

40 El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética Institucional y todos los pacientes dieron su consentimiento firmado.

45 Resultados

En la mayoría de los casos, los niveles de los fragmentos de activación de C4d se redujeron drásticamente después de la extirpación quirúrgica del tumor (FIG. 13). De hecho, en más del 70 % de los casos (14 de 19), los niveles de

50 los fragmentos de activación de C4d disminuyeron por debajo del límite de cuantificación del ensayo. Esta observación era independiente del tiempo transcurrido entre la cirugía y la recogida de la muestra de seguimiento.

Este resultado pone de manifiesto que los fragmentos de activación de C4d pueden utilizarse como un biomarcador de cáncer para evaluar la eficacia del tratamiento y supervisar el avance de la enfermedad.

55 En resumen, todos estos resultados de los experimentos demuestran que los fragmentos de activación de C4, y particularmente los fragmentos de activación de C4d, pueden utilizarse como una herramienta de diagnóstico y pronóstico para el cáncer de pulmón, con una sensibilidad y especificidad excepcionales sobre otras moléculas componentes del complemento.

60 REFERENCIAS CITADAS EN LA SOLICITUD

-Aberle D.R. et al., “Reduced lung-cancer mortality with low-dose computed tomographic screening”, N. Engl. J. Med., 2011, vol. 365, págs. 395-409. 65

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Claims

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