ES2666562T3 - Brazos autorreactivos y profármacos que los comprenden - Google Patents
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Abstract
Compuesto de fórmula general (I): en la que: - X representa OH, NH2, NHOH o R'NH con R' pudiendo representar un radical alquilo en C1 a C10, lineal o ramificado, saturado o insaturado, - Y representa un grupo electroatractor elegido entre NO2, CF3 o un halógeno, - R1 y R2 representan, independientemente uno del otro, H o un radical alquilo en C1 a C10, lineal o ramificado, saturado o insaturado, - F representa una función reactiva activable por química clic.
Description
DESCRIPCIÓN
Brazos autorreactivos y profármacos que los comprenden
5 [0001] La presente invención se refiere al campo de los profármacos y a su preparación. Más
particularmente, la presente invención se refiere a un nuevo brazo autoinmolable o autorreactivo y su uso en la preparación de nuevos profármacos. La presente invención también se refiere a nuevos profármacos que comprenden dicho brazo y que permiten el direccionamiento específico de compuestos activos in vivo. La presente invención se refiere también a un procedimiento de preparación de nuevos profármacos que utilizan un nuevo brazo 10 autoinmolable o autorreactivo, así como composiciones farmacéuticas o de diagnóstico que comprenden estos profármacos.
[0002] Un compuesto activo administrado a un ser vivo, por ejemplo, para fines terapéuticos o de diagnóstico, se caracteriza por un perfil de absorción, distribución, metabolismo y eliminación. El conjunto de parámetros de este
15 perfil participa en la definición de su biodisponibilidad y de sus efectos terapéuticos o de diagnóstico.
[0003] Según las características de este perfil, un compuesto activo podrá ejercer un efecto terapéutico o de diagnóstico de manera más o menos sostenida en el tiempo, de manera más o menos intensa, y podrá estar asociado, en caso necesario, a efectos secundarios más o menos marcados. La forma en que se administra este
20 compuesto activo puede resultar determinante con respecto a su perfil de actividad y su toxicidad.
[0004] Numerosos compuestos activos, por ejemplo, los activos anticancerosos, tienen el inconveniente de ser tóxicos con respecto a los tejidos sanos o células sanas, limitando así su uso.
25 [0005] El cáncer es hoy en día una de las principales causas de muerte en Francia. Entre los diferentes tipos
de tratamiento posible, la quimioterapia es el único que se puede utilizar contra tumores circulantes, como linfomas y leucemias y metástasis. Sin embargo, los activos anticancerosos utilizados clínicamente tienen poca selectividad frente a las células tumorales y atacan también los tejidos sanos. Esta destrucción no selectiva causa efectos secundarios graves y en la mayoría de los casos provoca la interrupción prematura del tratamiento. El desarrollo de 30 nuevos agentes anticancerosos para destruir selectivamente los tumores sin afectar los órganos suscita, por tanto, gran interés en la lucha contra el cáncer.
[0006] Estudios recientes han demostrado que los tejidos tumorales podrían diferenciarse de los tejidos
sanos, por un lado, con respecto al microambiente tumoral que se distingue de los tejidos sanos por un pH más 35 ácido, un potencial reductor más significativo, mayor permeabilidad para las macromoléculas o la presencia de una concentración relativamente elevada de ciertas enzimas, como la p-glucuronidasa y, por otra parte, con respecto a las células malignas que sobreexpresan en su superficie receptores de membrana o antígenos que las diferencian de las células sanas, como los receptores de ácido fólico o el antígeno CD33.
40 [0007] Para reducir la toxicidad de compuestos activos como los activos anticancerosos o mejorar su
biodisponibilidad mediante, por ejemplo, una mejor solubilización y su direccionamiento hacia los tejidos y las células diana, se ha propuesto su vectorización en forma de profármacos. De este modo, estos compuestos, en la mayoría de los casos, se vuelven inertes mediante injertos químicos en una molécula destinada a transportarlos, dentro de un organismo en el que son administrados, hasta los tejidos o células diana donde serán liberados.
45
[0008] Para este fin, numerosas moléculas con función de brazo o espaciador, autoinmolable o autorreactivo, han sido propuestas para vectorizar compuestos activos en una forma inerte, de manera específica y dirigida.
[0009] El brazo autorreactivo está unido de manera covalente, por un lado, al compuesto activo para 50 vectorizar y, por otro lado, a un grupo lábil para garantizar una especificidad celular o tisular y/o a una solubilización
mejorada en los fluidos biológicos. La eliminación del grupo lábil conduce, por reordenamiento intramolecular del brazo autorreactivo, a la liberación del compuesto activo.
[0010] Un brazo autorreactivo debe proporcionar al profármaco una estabilidad suficiente para su 55 administración, por ejemplo, por vía oral o sistémica y debe estar dotado de una reactividad suficiente para permitir
la liberación del compuesto activo de manera inmediata o casi inmediata tras la eliminación del grupo lábil.
[0011] Tranoy-Opalinski et al. (Anti-cancer Agent Med. Chem., 2008, 8:1) describen diferentes tipos de brazos autorreactivos adecuados para la preparación de profármacos. En particular, se describen profármacos que
comprenden, como brazos autorreactivos, un derivado del fenol o la anilina, que provoca una eliminación 1,6 y en los que el compuesto activo está unido a un carbono bencílico por medio de una función carbamato o carbonato y la función fenol está unida a un grupo glucuronil eliminable por la acción de una p-glucuronidasa. La presencia del grupo glucurónido permite garantizar la especificidad tisular de los profármacos para los tumores dentro de los que 5 la p-glucuronidasa es fuertemente expresada.
[0012] Sin embargo, los profármacos cuya especificidad tisular es asegurada por un grupo lábil sustrato de una enzima tienen el inconveniente de necesitar, generalmente, que la enzima que asegura la hidrólisis de este grupo previamente dirigida al tejido o al órgano objetivo. Por ende, los documentos WO81/01145, EP 0 642 799 o
10 EP 0 511 917 describen la implementación de dichos profármacos en terapias de profármacos que se pueden activar mediante enzimas dirigidas por anticuerpos (o “tratamiento enzimático con profármaco dirigido por anticuerpos”, ADEPT).
[0013] Además, Jeffrey et al. (Bioorg. Med., Chem., Lett., 2007, 17: 2278) describen un profármaco que 15 comprende un brazo autorreactivo derivado del fenol sobre el que se injerta un grupo glucuronil sobre la función
fenol, un compuesto activo sobre un carbono bencílico por una función carbamato y en orto de la función fenol, un anticuerpo por una función amida. El direccionamiento específico del compuesto activo es proporcionado por el anticuerpo y la hidrólisis del grupo glucuronil por acción de una p-glucuronidasa intracelular garantiza la liberación del compuesto activo en las células diana. Sin embargo, los anticuerpos son macromoléculas que penetran de 20 manera poco eficaz en la zona tumoral y son eliminados por el organismo solo lentamente.
[0014] También se puede citar a Gopin et al. (Angew. Chem. Inter. Ed., 2003, 42: 327) que describen un profármaco que comprende un compuesto activo unido a un brazo autorreactivo derivado del ácido 4- hidroximandélico, sobre el que se fija, por una parte, un grupo sustrato del anticuerpo catalítico 38C2 y un ligando
25 selectivo, el HPMA. La liberación del compuesto activo a partir de este profármaco resulta ser, sin embargo, relativamente lenta.
[0015] Finalmente, se puede citar el documento EP 2 098 534 que describe un profármaco que comprende una antraciclina unida a un brazo autorreactivo de tipo para aminobencilcarbonilo por una función carbamato sobre
30 el carbono bencílico y un grupo glucuronil (o disparador glucurónido) unido por una función carbamato al fenilo. El grupo glucuronil es funcionalizado además por un grupo propargilo que permite por química clic la fijación de un radical de polietilenglicol para mejorar la hidrosolubilidad del conjunto.
[0016] El desarrollo de profármacos capaces de vectorizar de manera estable, específica y en grandes 35 cantidades compuestos activos en una forma inerte y liberar estos últimos rápidamente y de manera localizada
demuestra ser de primera importancia con respecto a los compuestos activos cuya ventana terapéutica es estrecha, como por ejemplo los activos anticancerosos.
[0017] Por lo tanto, es necesario disponer de un brazo autorreactivo que permita la obtención de manera 40 simple y rápida de profármacos capaces de vectorizar con gran especificidad y en forma inerte compuestos activos
con ventana terapéutica estrecha, especialmente activos anticancerosos.
[0018] Existe la necesidad de disponer de un brazo autorreactivo sobre el que pueda injertarse químicamente, de manera simple y con un gran rendimiento, una amplia variedad de compuestos activos y grupos
45 que permitan garantizar una especificidad tisular y celular y/o una solubilización mejorada en los fluidos biológicos.
[0019] Existe aún la necesidad de disponer de un brazo autorreactivo que permita la preparación de profármacos provistos de alta estabilidad adecuada para la administración por vía oral o en el torrente sanguíneo y que permita una liberación rápida, incluso inmediata o casi inmediata, del compuesto activo en el nivel del tejido o de
50 la célula diana.
[0020] Existe aún la necesidad de disponer de un brazo autorreactivo adecuado para la preparación de profármacos que permitan direccionar, tanto a nivel tisular como a nivel celular, un compuesto activo, en particular, un activo anticanceroso.
55
[0021] Existe también la necesidad de disponer de nuevos profármacos que puedan dirigirse simultáneamente al microambiente tisular y a las células del tejido o del órgano deseado.
[0022] Existe también la necesidad de disponer de profármacos que puedan ser preparados de una manera
simple y con un rendimiento adecuado para la producción industrial.
[0023] Existe aún la necesidad de disponer de profármacos con buena estabilidad, especialmente en el flujo sanguíneo y que permitan la liberación inmediata o casi inmediata del compuesto activo, en especial un activo
5 anticanceroso, en el tejido objetivo bajo la acción de una enzima o de un cambio de condiciones ambientales, como una variación de pH.
[0024] Existe también la necesidad de disponer de nuevos profármacos cuyos parámetros de identificación tanto del entorno tisular como de las células, así como los parámetros de solubilidad puedan ser modulados fácil y
10 cuidadosamente.
[0025] Finalmente, existe aún la necesidad de disponer de un profármaco que pueda ser administrado en una cantidad compatible con un uso terapéutico o de diagnóstico y que permita dirigir una cantidad eficaz de compuestos activos al o a los tejidos o células objetivo.
15
[0026] La presente invención tiene como objeto satisfacer estas necesidades. La presente solicitud describe un compuesto de fórmula general (I):
20
en la que:
- X puede representar OH, NH2, NHOH o R'NH con R' pudiendo representar un radical alquilo en Ci a C10, lineal o ramificado, saturado o insaturado,
25 - Y puede representar H o un grupo electroatractor, particularmente elegido entre NO2, CF3 o un halógeno,
- R1 y R2 pueden representar, independientemente uno del otro, H o un radical alquilo en Ci a C10, lineal o ramificado, saturado o insaturado,
- F puede representar una función reactiva activable por química clic, particularmente elegida entre -CeCR’”, -N3, - SH, -C=CH2, ciclooctinas, maleimida, -SO2N3 o -COSR'”, con R'” representando H o un radical alquilo, lineal o
30 ramificado, saturado o insaturado, en C1 a C10.
De acuerdo con un primer aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula general (I) en la que Y es un grupo electroatractor elegido entre NO2, CF3 o un halógeno, como se define en la reivindicación 1. Sorprendentemente, los inventores han observado que era posible, partiendo de un brazo autorreactivo derivado del 35 fenol y, más particularmente, del tipo para-hidroxibencilcarbonilo, introducir en el carbono bencílico una función reactiva adecuada para la química clic, en especial una función de tipo alqueno, y en particular etinilo, siempre que esté unida al carbono bencílico, directa o indirectamente a través de un carbono sp3. Los inventores también han observado que la cinética de liberación del compuesto activo podría modularse y, en particular, acelerarse variando la naturaleza del sustituyente en una de las posiciones orto o meta con respecto al carbono bencílico, y 40 preferentemente en posición meta.
[0027] Los inventores han desarrollado de este modo un nuevo brazo autorreactivo sobre el que se puede injertar, mediante reacciones químicas simples, un compuesto activo, especialmente terapéutico o de diagnóstico y, en particular, un activo anticanceroso, un ligando selectivo, en particular un grupo derivado de un ácido fólico y un
45 grupo lábil, especialmente mediante hidrólisis enzimática, en particular, un grupo glucuronil.
[0028] De manera sorprendente, un brazo autorreactivo de la invención se puede utilizar provechosamente de una manera simple para la preparación de profármacos para vectorizar inertemente un compuesto activo, en particular un activo anticanceroso y garantizar un direccionamiento tanto con respecto a las especificidades del
microambiente tisular como con respecto a las especificidades celulares.
[0029] Los inventores también han podido observar de manera sorprendente que los profármacos preparados por medio de un brazo autorreactivo según la invención resultaban ser particularmente estables en condiciones
5 fisiológicas y que eran capaces de liberar de manera específica y muy rápidamente una cantidad eficaz de compuestos activos.
[0030] Los profármacos de la invención comprenden cuatro unidades distintas, cada una concebida para ejercer una función particular.
10
[0031] Una primera unidad consiste en un compuesto activo, en particular, responsable de una actividad terapéutica o de diagnóstico, por ejemplo, un activo anticanceroso. El compuesto activo se vuelve inerte por sujeción al brazo autorreactivo de la invención de modo que su posible toxicidad se enmascara ventajosamente para no afectar a los tejidos sanos.
15
[0032] Una segunda unidad consiste en un grupo lábil, en particular enzimáticamente hidrolizable, incluyendo un disparador (o activador) y que garantiza el reconocimiento de un objetivo, en particular una enzima, selectivamente localizada en el microambiente tisular objetivo o en un tipo de célula específica y cuya hidrólisis desencadena la liberación del compuesto activo.
20
[0033] Una tercera unidad consiste en el ligando selectivo (o “targeting ligand”) que reconoce un receptor de membrana expresado específicamente en la superficie de las células del tejido objetivo y que permite la internalización del profármaco por el fenómeno de endocitosis.
25 [0034] Finalmente, una cuarta unidad consiste en el brazo autorreactivo de la invención que garantiza la
cohesión y la estabilidad del profármaco en condiciones fisiológicas y la expulsión del compuesto activo exclusivamente después de la eliminación del grupo lábil.
[0035] Un compuesto de fórmula general (I) de acuerdo con la invención constituye un brazo autorreactivo en 30 el que F, X y -OH en el carbono bencílico constituyen funciones reactivas capaces de movilizarse de manera simple
y específica y sobre las que se pueden injertar diferentes compuestos para formar junto con el brazo autorreactivo de la invención un profármaco según la invención.
[0036] Por lo tanto, según un segundo objeto, la invención se refiere a un compuesto de fórmula general (II): 35
en la que:
40 - Y puede representar H o un grupo electroatractor, particularmente elegido entre NO2, CF3 o un halógeno, R1 y R2 son como se ha definido anteriormente,
- X' puede representar O, NH, NOH, R'N con R' siendo como se ha definido anteriormente,
- E puede representar un grupo lábil sustrato de una enzima elegida entre glucuronidasas, glucosidasas, proteasas, peptidasas y metaloproteasas,
- A puede representar O, S, NH, NR” con R” representando un grupo alquilo en Ci a C10, lineal o ramificado, saturado o insaturado, y preferentemente puede representar NH,
- D puede representar un compuesto activo que puede usarse en terapias o en diagnósticos,
- n = 0 o 1, y Z puede representar un grupo alquileno, lineal o ramificado, saturado o insaturado, en C1-C10, 5 opcionalmente interrumpido por uno o varios heteroátomos elegidos entre O o N, un grupo glicosilo, un grupo O-
(CH3-CHR4-0-)m o N-(CH3-CHR4-O-)m en los que m es un número entero natural que varía de 1 a 20, R3 y R4 son, independientemente el uno del otro, H o CH3, siempre que R3 y R4 no sean simultáneamente CH3, un grupo derivado de un aminoácido o de un péptido o una combinación de estos grupos.
- L puede representar un ligando selectivo elegido entre un péptido, una proteína, un anticuerpo o un fragmento de 10 anticuerpo que reconoce un antígeno, un ligando de un receptor celular, un biopolímero, un monosacárido, un
oligosacárido, una hormona, una vitamina, un dendrímero, una poliamina o una nanopartícula,
- G representa un grupo resultante de una reacción química clic entre un grupo F, como se ha definido anteriormente y un grupo x-(Z)n-L en el que Z y L son como se han definido anteriormente y x representa una función reactiva activable por química clic capaz de reaccionar con F o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
15
[0037] Según aún otro objeto, la presente invención se refiere a un uso de un compuesto de fórmula general
(I) para la preparación de profármaco, en particular representada por los compuestos de fórmula general (II) definidos a continuación.
20 [0038] Según aún otro objeto, la presente invención se refiere a un procedimiento de preparación de un
compuesto de fórmula general (II) como se ha definido anteriormente o a una de sus sales farmacéuticamente aceptables, que consiste en hacer reaccionar un compuesto de fórmula general (I) como se ha definido anteriormente con grupos D-v, E-w y L-(Z)n-x, en los que D, E y L pueden ser como se han definido anteriormente, y v, w y x tienen cada uno una función reactiva de manera que, con respecto al compuesto de fórmula general (I), v 25 reacciona con OH unido al carbono bencílico o dicho OH previamente activado, w reacciona X y x reacciona con F.
[0039] Las funciones reactivas v, w y x pueden estar presentes de forma natural en los grupos D, E y L-(Z)n o
pueden ser introducidas, antes de la etapa de reacción, en los grupos D, E y L-(Z)n.
30 [0040] Según aún otro objeto más, la presente invención se refiere a un compuesto o a una de sus sales
farmacéuticamente aceptables, capaz de ser obtenido según un procedimiento de la invención.
[0041] Según otro aspecto más, la invención se refiere a una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende al menos una cantidad eficaz de al menos un compuesto de fórmula general (II) de acuerdo con la
35 invención o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
[0042] Según aún otro objeto más, la presente invención se refiere a un kit para la preparación de un compuesto de fórmula general (II) como se ha definido anteriormente o de sus sales farmacéuticamente aceptables, comprendiendo al menos un compuesto de fórmula general (I) como se ha definido anteriormente y al menos un
40 grupo elegido entre D-v, E-w y L-x, en los que L, D y E son como se ha definido anteriormente.
[0043] Según una realización, un kit según la invención puede comprender además al menos una instrucción de uso del compuesto de fórmula general (I) con dicho grupo elegido entre D-v, E-w y L-x.
45 [0044] A efectos de la invención, se entiende por “brazo autorreactivo”, un compuesto capaz de liberar,
mediante reordenamiento intramolecular, grupos previamente injertados en el mismo.
[0045] A efectos de la invención, se entiende por “profármaco”, una molécula capaz de transportar en forma inerte un compuesto activo dentro de un organismo y liberar al mismo en un órgano, un tejido o células
50 específicamente dirigidas bajo la acción, por ejemplo, de una enzima específica o condiciones de pH particulares.
[0046] Un brazo autorreactivo según la invención puede ventajosamente permitir la fijación de una manera simple y específica de un compuesto activo y de dos grupos destinados a garantizar la selección del compuesto activo y/o mejorar su solubilidad en un ambiente biológico.
55
[0047] Según otra ventaja, un brazo autorreactivo según la invención está provisto de funciones reactivas que permiten la obtención de manera simple y en cantidades significativas de profármacos.
[0048] Según otra ventaja, un brazo autorreactivo según la invención permite la preparación de profármacos
estables, capaces de transportar un compuesto activo en forma inerte, provistos de una doble especificidad tisular y celular y capaces de liberar de manera dirigida, eficaz y rápida dicho compuesto activo.
[0049] Según otra ventaja, la presente invención permite disponer de profármacos, capaces de ser utilizados 5 en el diagnóstico o la terapia y que permiten el transporte dirigido en forma inerte de un compuesto activo, y su
direccionamiento de manera específica tanto con respecto al microambiente tisular como con respecto a receptores o proteínas presentes en la superficie de las células objetivo.
[0050] Según otra ventaja, la presente invención permite disponer de profármacos estables, provistos de una 10 doble especificidad tisular y celular, y activables en el interior de células específicamente enfocadas.
[0051] Según otra ventaja, la presente invención permite disponer de profármacos estables y activables en el entorno tisular del tejido diana por medio de enzimas específicas presentes dentro de este tejido o previamente dirigidas por acoplamiento con un anticuerpo.
15
[0052] Según otra ventaja, la presente invención permite disponer de profármacos cuya solubilidad puede ser controlada y mejorada fácilmente.
[0053] Según otra ventaja más, un brazo autorreactivo de la invención es particularmente adecuado para la 20 preparación de profármacos destinados a vectorizar compuestos anticancerosos.
Brazo autorreactivo
[0054] Un brazo autorreactivo según la invención se puede representar mediante la siguiente fórmula general 25 (I):
en la que:
30
- X puede representar OH, NH2, NHOH o R'NH con R' que puede representar un radical alquilo en C1 a C10, lineal o ramificado, saturado o insaturado,
- Y puede representar un grupo electroatractor, elegido entre NO2, CF3 o un halógeno,
- R1 y R2 pueden representar, independientemente uno del otro, H o un radical alquilo en C1 a C10, lineal o 35 ramificado, saturado o insaturado,
- F puede representar una función reactiva activable por química clic.
[0055] Según una realización preferida, X puede representar OH, NH2, NH(OH) o R'NH con R' pudiendo representar un radical alquilo lineal o ramificado, saturado o insaturado, en C2 a C8, preferentemente en C3 a C6 y
40 preferentemente en C4 o C5. Más preferentemente R' puede representar un radical alquilo en C1, C2 o C3.
[0056] Más preferentemente, X puede representar OH.
[0057] Según una realización, Y puede representar NO2, un halógeno elegido entre CI o Br o CF3. En 45 particular, Y puede ser NO2 o CI y preferentemente representa NO2.
[0058] De manera preferida, Y puede estar en orto de X.
[0059] Según una variante de realización aún más preferida, Y puede ser NO2 en posición orto con respecto a X.
[0060] Según una realización, R1 y R2 pueden representar, independientemente uno del otro, H o un radical 5 alquilo en C1 a C10, lineal o ramificado, saturado o insaturado, preferentemente en C2 a Os, preferentemente en C3
en C6 y preferentemente en C4 o C5. Más preferentemente, R1 o R2 pueden representar un radical alquilo en Ci, C2 o C3.
[0061] Según una variante de realización, R1 puede representar un grupo alquilo, en particular, un metilo, un 10 etilo o un propilo, y R2 puede representar H. Según otra realización, R1 puede representar H y R2 puede representar
un grupo alquilo, en particular, un metilo, un etilo o un propilo.
[0062] Según una variante de realización preferida, R1 y R2 incluyen cada uno H.
15 [0063] F representa una función reactiva activable por química clic. La química clic es un proceso de reacción
conocido por el experto en la técnica. Al respecto, se puede hacer referencia a la revista de Kolb y col. (Angew. Chem. Int. Ed., 2001,40: 2004).
[0064] Según una realización, F representa una función reactiva activable por química clic elegida entre F 20 que representa -CeCR”', -N3, -SH, -C=CH2, ciclooctinas, maleimida, -SO2N3 o -COSR”' con R'” representando H o un
radical alquilo, lineal o ramificado, saturado o insaturado, en C1 a C10.
[0065] Según una realización preferida, F representa una función reactiva activable por química clic elegida entre -CeCH, -N3, -SH, -C=CH2, ciclooctinas, maleimida, -SO2N3 o -COSR.
25
[0066] Según una realización particularmente preferida, un brazo autorreactivo adecuado para la invención puede tener la siguiente fórmula (la):
30
en la que X y F son como se han definido anteriormente.
[0067] Más preferentemente, un brazo autorreactivo adecuado para la invención puede ser de fórmula (la) en la que X representa OH, y F es como se ha definido anteriormente.
35
[0068] Según otra realización particularmente preferida, un brazo autorreactivo adecuado para la invención puede tener la siguiente fórmula (lb):
s
[0069] Un brazo autorreactivo adecuado para la invención puede ser obtenido, por ejemplo, a partir de 4- hidroxi-3-nitrobenzaldehído o de 4-amino benzaldehído reaccionado en un solvente adecuado y en presencia de un catalizador o catalizadores eventuales con cualquier reactivo capaz de introducir en el carbono bencílico una función
5 reactiva que conduzca a la realización de reacciones posteriores por química clic.
[0070] Según una realización particular, un brazo autorreactivo según la invención que comprende como función reactiva F un grupo -C=CH y como grupo X una función OH puede obtenerse mediante un proceso que comprende una etapa de reacción entre el 4-hidroxi-3nitrobenzaldehído y el organoaluminio del bromuro de
10 propargilo, en un solvente apropiado.
[0071] Un solvente adecuado para dicho procedimiento puede ser, por ejemplo, el tetrahidrofurano.
[0072] Dicho procedimiento puede llevarse a cabo en presencia de un catalizador. Un catalizador adecuado 15 para la invención puede ser, por ejemplo, el cloruro de mercurio (HgCh).
[0073] Según una variante de realización, dicho procedimiento puede comprender una etapa de calentamiento, por ejemplo, por reflujo, del 4-hidroxi-3-nitrobenzaldehído en presencia del catalizador, en particular, el cloruro de mercurio (HgCl2).
20
[0074] Según una variante de realización, dicho procedimiento puede comprender una etapa de hidrólisis del producto obtenido después de la reacción del 4-hidroxi-3-nitrobenzaldehído con el bromuro de propargilo en presencia de HCl.
25 [0075] Un procedimiento según la invención puede comprender además una etapa consistente en aislar y/o
purificar el producto obtenido. Las etapas consistentes en aislar y/o purificar se pueden realizar de acuerdo con cualquier técnica conocida por el experto en la materia.
Profármacos
30
[0076] Un profármaco según la invención puede tener la siguiente fórmula general (II):
en la que:
35
- Y puede representar H o un grupo electroatractor, en particular, elegido entre NO2, CF3 o un halógeno, R1 y R2 son como se ha definido anteriormente,
- X' puede representar O, NH, NOH, R'N con R' siendo como se ha definido anteriormente,
- E puede representar un grupo lábil sustrato de una enzima elegida entre glucuronidasas, glucosidasas, proteasas, 40 peptidasas y metaloproteasas,
- A puede representar O, S, NH, NR” con R” representando un grupo alquilo en C1 a C10, lineal o ramificado, saturado o insaturado, y preferentemente puede representar NH,
- D puede representar un compuesto activo que puede usarse en terapias o en diagnósticos,
- n = 0 o 1, y Z puede representar un grupo alquileno, lineal o ramificado, saturado o insaturado, en C1-C10, opcionalmente interrumpido por uno o varios heteroátomos elegidos entre O o N, un grupo glicosilo, un grupo O- (CH3-CHR4-O-)m o N-(CHR3-CHR4-O-)m en los que m es un número entero natural que varía de 1 a 20, R3 y R4 son, independientemente uno del otro, H o CH3, siempre que R3 y R4 no sean simultáneamente CH3, un grupo derivado
5 de un aminoácido o de un péptido o una combinación de estos grupos,
- L puede representar un ligando selectivo elegido entre un péptido, una proteína, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que reconoce un antígeno, un ligando de un receptor celular, biopolímero, un monosacárido, un oligosacárido, una hormona, una vitamina, un dendrímero, una poliamina o una nanopartícula,
- G representa un grupo resultante de una reacción química clic entre un grupo F, como se ha definido anteriormente 10 y un grupo x-(Z)n-L en el que Z y L son como se han definido anteriormente y x representa una función reactiva
activable por química clic capaz de reaccionar con F o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
[0077] Según una realización preferida, un profármaco de la invención puede ser de fórmula general (II), en la que Y puede representar NO2 en posición orto de X', y R1 y R2 pueden representar H.
15
[0078] Una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula general (II) según la invención puede ser una sal de un compuesto de fórmula general (II) y de un metal alcalino, de un metal alcalinotérreo o de amonio, comprendiendo las sales obtenidas con bases orgánicas de amonio o sales de un compuesto de fórmula general (II) y de ácido orgánico o inorgánico.
20
[0079] Las sales que son más particularmente adecuadas para la invención pueden ser sales de sodio, potasio, calcio, magnesio, sales de amonio cuaternario como tetrametilamonio o tetraetilamonio y sales de adición con amoníaco y aminas farmacéuticamente aceptables, como la metilamina, la dimetilamina, la trimetilamina, la etilamina, la trietilamina, la etanolamina o la tris-(2-hidroxietil)-amina.
25
[0080] Las sales de un compuesto de fórmula general (II) y de ácido inorgánico adecuadas para la invención pueden ser obtenidas con ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico o ácido fosfórico.
[0081] Las sales de un compuesto de fórmula general (II) y de ácido orgánico adecuadas para la invención 30 pueden ser obtenidas con ácidos carboxílicos y ácidos sulfónicos como el ácido fórmico, el ácido acético, el ácido
oxálico, el ácido cítrico, el ácido láctico, el ácido málico, el ácido succínico, el ácido malónico, el ácido benzoico, el ácido maleico, el ácido fumárico, el ácido tartárico, el ácido metanosulfónico, el ácido bencenosulfónico o el ácido p- toluenosulfónico.
35 [0082] Los profármacos según la invención son particularmente adecuados para el tratamiento y/o la
prevención de enfermedades o trastornos que implican la sobreexpresión o la liberación de enzimas intracelulares que pueden segmentar el grupo lábil E.
[0083] Como enfermedades que pueden ser consideradas por la invención, se puede citar en particular, el 40 cáncer, las enfermedades autoinmunes o inflamatorias, las enfermedades inmunológicas o metabólicas o las
artropatías.
[0084] Preferentemente, los profármacos de la invención son particularmente adecuados para el tratamiento y/o la prevención de cánceres, enfermedades inflamatorias y artropatías.
45
[0085] Más preferentemente aún, los profármacos de la invención son particularmente adecuados para el tratamiento y/o la prevención de un cáncer elegido entre cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de riñón, tumores cerebrales y leucemias.
50 [0086] Según una realización, la invención se refiere a una composición farmacéutica o de diagnóstico que
comprende al menos una cantidad eficaz de al menos un compuesto de fórmula general (II) como se ha definido anteriormente o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
[0087] Una composición según la invención puede comprender al menos un excipiente farmacéuticamente 55 aceptable, como aditivos, aglutinantes, agentes inflamatorios o lubricantes o agentes de solubilización usualmente
utilizados en el campo.
[0088] Como excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado para la invención, se puede mencionar el carbonato de magnesio, el dióxido de titanio, la lactosa, el manitol y otros azúcares, el talco, las lactoproteínas, la
gelatina, el almidón, la celulosa y sus derivados, los aceites animales y vegetales, como aceite de hígado de bacalao, aceite de girasol, de nueces o de sésamo, el polietilenglicol y solventes como el agua y mono- o polialcoholes como el glicerol.
5 [0089] En caso necesario, una composición de la invención puede comprender otros compuestos activos
adecuados.
[0090] Una composición según la invención se puede formular en cualquier forma de dosificación apropiada como solución inyectable, comprimidos, cápsulas o parches transdérmicos.
10
[0091] La elección de la forma galénica y los excipientes farmacéuticamente aceptables que se utilizarán, así como, en caso necesario, otros compuestos activos, depende en particular de la vía de administración considerada y de la patología a tratar o prevenir, y corresponden a los conocimientos generales y la práctica habitual del experto en la técnica.
15
[0092] A efectos de la invención, se entiende por “cantidad eficaz”, la cantidad necesaria y suficiente para obtener el efecto deseado según la invención, es decir la actividad farmacológica, terapéutica o de diagnóstico, del compuesto activo D después de la administración de un profármaco según la invención. Según una realización preferida, un efecto farmacológico deseado puede ser un efecto de prevención y/o tratamiento con respecto a un
20 cáncer.
[0093] Una cantidad eficaz depende de la naturaleza del compuesto activo D, del efecto farmacológico deseado, del individuo a quien se le administra un profármaco de la invención y de su condición fisiopatológica.
25 [0094] Se puede determinar fácilmente una cantidad eficaz mediante cualquier procedimiento conocido por el
experto en la materia, en particular, a través de ensayos clínicos.
[0095] A efectos de la invención, se entiende por “prevención” o “prevenir” con respecto a una enfermedad y en particular de un cáncer, el hecho de reducir el riesgo de aparición de esta enfermedad.
30
[0096] Según una realización, una composición farmacéutica de la invención puede comprender un compuesto de fórmula general (II) o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en la que el compuesto activo D representa un activo anticanceroso, en particular como se define a continuación, y la composición está destinada a la prevención y/o tratamiento de un cáncer.
35
Compuesto activo D
[0097] Un compuesto activo D adecuado para la invención puede ser elegido entre compuestos con actividad terapéutica y/o con actividad diagnóstica.
40
[0098] Más particularmente, un compuesto activo D según la invención puede ser elegido entre compuestos terapéuticos activos contra enfermedades del tracto gastrointestinal, enfermedades del sistema cardiovascular, enfermedades del sistema nervioso central, dolor, enfermedades del estado de ánimo, enfermedades del sistema oftálmico, enfermedades del tracto orofaríngeo, enfermedades del tracto respiratorio, enfermedades de las
45 secreciones endocrinas y del metabolismo, enfermedades del sistema reproductor y urinario, infecciones virales, bacterianas o parasitarias, enfermedades del sistema inmunológico, enfermedades alérgicas, cáncer o activos en obstetricia y ginecología, piel o elegidos entre compuestos anticonceptivos.
[0099] Según una realización, un compuesto activo D según la invención puede ser elegido entre hormonas, 50 agonistas o antagonistas de una hormona, tales como progesterona, buserelina, tamoxifeno, mifepristona o
onapristona, entre antinflamatorios, tales como los antinflamatorios no esteroideos, compuestos esteroideos, analgésicos, antipiréticos, anestésicos locales, antiarrítmicos, tales como los antagonistas de canales de calcio, antihistamínicos, simpaticomiméticos, inhibidores de la uroquinasa, antidepresivos, antihipertensivos, activos anticancerosos, compuestos que reducen la resistencia celular a los citostáticos, tales como los inhibidores de 55 calmodulina, inhibidores de la proteína quinasa C, inhibidores de glicoproteína-P, moduladores de hexoquinasa unida a las mitocondrias, inhibidores de g-glutamilcisteína sintetasa o de glutación-S-transferasa, inhibidores de superóxido dismutasa o entre compuestos inmunosupresores, tales como macrólidos, ciclosporina A, rapamicina, FK 506, azotioprina, metotrexato, ciclofosfamida o clorambucil.
[0100] Más particularmente aún, un compuesto activo D según la invención puede ser un activo
anticanceroso elegido entre citostáticos, antimetabolitos, sustancias intercaladoras de ADN, compuestos inhibidores de topoisomerasa I y II, inhibidores de tubulina, agentes alquilantes, neocarcinostatin, calicheamicina, dinemicina o esperamicina A, compuestos inhibidores de ribosomas, inhibidores de tirosinas fosfoquinasas, compuestos que
5 inducen la diferenciación celular o inhibidores de histona deacetilasa.
[0101] Más particularmente aún, un compuesto activo D según la invención puede ser un activo
anticanceroso elegido entre citostáticos y antimetabolitos, tal como la 5-fluorouracilo, la 5-fluorouridina, la citosina arabinósido o el metotrexato, entre sustancias intercaladoras de ADN, tal como la doxorrubicina, la daunomicina, la
10 idarrubicina, la epirrubicina o la mitoxantrona, entre compuestos inhibidores de topoisomerasas I y II, tales como camptotecina, etopósido o m-AMSA, entre inhibidores de tubulina, tal como la vincristina, la vinblastina, la vindesina, el taxol, el nocodazol o la colchicina, entre agentes alquilantes, tal como la ciclofosfamida, la mitomicina C, la rachelmicina, el cisplatino, el gas mostaza fosforamida, el melfalán, la bleomicina, la N-bis(2-cloroetil)-4- hidroxianilina, o entre neocarcinostatin, calicheamicina, dinemicina o esperamicina A, o entre compuestos
15 inhibidores de ribosomas, tal como la verrucarina A, entre inhibidores de tirosina fosfoquinasa, tales como quercetina, genisteína, erbstatina, tirfostina o rohitukina y sus derivados, entre compuestos que inducen la diferenciación celular, tal como ácido retinoico, ácido butírico, ésteres de forbol o aclacinomicina, entre inhibidores de histona deacetilasa, tales como Cl-994 o MS275.
20 [0102] Según una realización particularmente preferida de la invención, un compuesto activo D adecuado
para la invención puede ser elegido entre Cl-994 y doxorrubicina y el MS275.
[0103] Según otra realización, un compuesto activo D adecuado para la invención puede ser un compuesto de diagnóstico, elegido en particular entre radioligandos.
25
[0104] Un radioligando adecuado para la invención puede ser un compuesto portador de un grupo
radioactivo, elegido en particular entre 3H, 14C, 35S, 131l, 125l o 18F.
[0105] Según una realización, D puede consistir en un compuesto activo o alternativamente una pluralidad de 30 compuestos activos. Ventajosamente, cuando D consiste en una pluralidad de compuestos activos, estos están
conectados entre sí por un amplificador químico autoinmolable. Cuando hay varios compuestos activos, pueden ser idénticos o diferentes.
[0106] Un amplificador adecuado para la invención comprende una pluralidad de funciones reactivas y 35 preferentemente, al menos tres funciones reactivas para permitir su unión a un brazo reactivo de la invención y a, al
menos, dos compuestos activos. También está provisto de la capacidad de experimentar una descomposición espontánea que conduce a la liberación de los compuestos activos, después de su liberación a partir de un brazo reactivo de la invención. Más preferentemente, un amplificador autoinmolable adecuado para la invención puede comprender al menos 3 o al menos 4 funciones reactivas.
40
[0107] Como ejemplo de amplificador adecuado para la invención, se puede mencionar el 2,4- bis(hidroximetil)anilina, el 2,4,6-ter(hidroximetil)anilina, el 2,4 bis(hidroximetil)fenol o el 2,4,6-ter(hidroximetil)fenol. Estos amplificadores autoinmolables se unen al brazo reactivo de la invención a través de la función fenol o anilina.
45 [0108] Preferentemente, un amplificador autoinmolable adecuado para la invención puede ser el 2,4-
bis(hidroximetil)anilina.
[0109] Según otra realización más, un amplificador adecuado para la invención puede comprender una
cadena de al menos dos, o 3, o incluso 4 unidades amplificadoras autoinmolables como se han definido 50 anteriormente. Cada unidad amplificadora autoinmolable de dicha cadena está unida a, al menos, otra unidad amplificadora autoinmolable y a, al menos, un compuesto activo. Los compuestos activos son liberados en cascada, después de la descomposición espontánea de cada unidad amplificadora, igualmente liberada en cascada, tras la liberación de la unidad unida al brazo reactivo de la invención.
55 [0110] Un amplificador de la invención puede tener la siguiente fórmula general (III):
en la que
5 - p puede representar un número entero natural que varía de 0 a 3, y preferentemente de 1 a 2. Más preferentemente, p equivale a 0, 1 o 2.
- Q puede representar -NH2 o -OH, y preferentemente representa -NH2,
- cada Q' puede representar, independientemente uno del otro, NH u O y preferentemente representa NH,
- R5 y R6 pueden representar, independientemente uno del otro, H o -CH2OR9, con R9 pudiendo representar R7 o R8 10 como se define a continuación,
- R7 y R8 pueden representar, independientemente uno del otro, H o una subunidad con la siguiente fórmula general (IV):
15
en la que
- # es un enlace con un oxígeno bencílico,
- q puede representar un número entero natural que varía de 0 a 3 y preferentemente de 1 a 2. Más 20 preferentemente, q equivale a 0, 1 o 2,
- Q' es como se ha definido anteriormente,
- R10 puede representar R5 o R6 como se ha definido anteriormente, y
- R11 puede representar R7 o R8 como se ha definido anteriormente.
25 [0111] Preferentemente, al menos uno entre R5 y R6 puede representar H y al menos uno entre R5 y R6
puede representar -CH2OR9, con R9 siendo como se ha definido anteriormente.
[0112] Preferentemente, al menos uno entre R7 y R8 puede representar H y al menos uno entre R7 y R8 puede representar una subunidad de fórmula general (IV) como se ha definido anteriormente.
30
[0113] Ventajosamente, un amplificador autoinmolable adecuado para la invención define una estructura de dendrímero con al menos dos, incluso 3 o 4 generaciones.
[0114] Según una realización, D, en un compuesto de fórmula general (II) como se ha definido anteriormente, 35 puede ser un compuesto de fórmula general (V):
en la que 5
- Q' y p son como se han definido anteriormente,
- * es un enlace con A como se ha definido con respecto a la fórmula general (II),
- R12 y R13 pueden representar, independientemente uno del otro, H o -CH2OD', con D' siendo como se define a continuación, y
10 - D' puede ser un compuesto activo como se ha definido anteriormente o una subunidad con la siguiente fórmula general (VI): en la que
15 - #, Q', D' y q son como se han definido anteriormente,
- R14 puede representar, H o -CH2OD', con D' siendo como se ha definido anteriormente.
[0115] Ventajosamente, un compuesto D de la invención puede representar una estructura de dendrímero con al menos dos, incluso3 o 4 generaciones.
20
Grupo lábil E
[0116] Según una realización, un grupo lábil E adecuado para la invención puede ser, en particular, un sustrato enzimáticamente hidrolizable.
25
[0117] Un grupo lábil E adecuado para la invención es tal que su eliminación, por ejemplo, de manera enzimática o consecutiva a una variación de pH, asegura, mediante reordenamiento intramolecular del brazo autorreactivo, una liberación del compuesto activo D.
30 [0118] Un grupo lábil E, según la invención, particularmente hidrolizable enzimáticamente, puede ser más
particularmente seleccionado para conferir una especificidad tisular y/o celular a los profármacos según la invención.
[0119] Según una realización preferida, un grupo lábil E adecuado para la invención puede ser enzimáticamente hidrolizable.
35
[0120] Según una realización, un grupo lábil E, según la invención, enzimáticamente hidrolizable, puede ser elegido para ser hidrolizado por una enzima o más, cuya expresión está específicamente relacionada a un tejido diana o células diana.
[0121] Entre las enzimas adecuadas para la invención, se pueden mencionar en particular las carboxilesterasas, las alcalinas fosfatasas, las glucuronidasas, y en particular, la p-glucuronidasa, las glicosidasas, las proteasas, las peptidasas o las metaloproteasas.
5
[0122] La selección de un grupo lábil E de sustrato apropiado de una enzima perteneciente al grupo definido anteriormente corresponde a las competencias generales del experto en la materia.
[0123] Según una realización preferida, un grupo lábil E puede ser un sustrato de una enzima elegida entre 10 las glucuronidasas y en particular, la p-glucuronidasa, las glicosidasas, las proteasas, las peptidasas y las
metaloproteasas.
[0124] Según una variante de realización preferida, un grupo lábil E enzimáticamente hidrolizable adecuado para la invención puede ser un sustrato elegido entre los sustratos de galactosidasa y en particular, la p-
15 galactosidasa, la induronidasa, la glucosidasa, la N-acetil-D-glucosaminidasa, la N-acetil-D-galactosaminidasa, la manosidasa, la fucosidasa o la glucuronidasa, en particular, la p-glucuronidasa, los sustratos de catepsinas o los sustratos de etaloproteasas, en particular, el PSMA (antígeno de membrana específico de próstata).
[0125] Según una variante más preferida de la invención, un grupo lábil E enzimáticamente hidrolizable 20 adecuado para la invención puede ser un sustrato de una enzima elegida entre la p-glucuronidasa, la p-
galactosidasa, las catepsinas o las metaloproteasas, y en particular, el PSMA.
[0126] Según una realización, un grupo lábil E enzimáticamente hidrolizable adecuado para la invención puede ser elegido, en particular, entre un grupo glicosilo o un grupo peptídico.
25
[0127] Según una variante de realización, un grupo lábil E enzimáticamente hidrolizable adecuado para la invención puede ser elegido, en particular, entre un grupo glicosilo, en particular un grupo D-glucuronilo, un grupo L- iduronilo, un grupo D-glucopiranosilo, un grupo D-galactopiranosilo, un grupo N-acetil-D-glucosaminilo, un grupo N- acetil-D-galactosaminilo, un grupo D-manopiranosilo, un grupo L-fucopiranosilo.
30
[0128] Según otra variante de realización, un grupo lábil E enzimáticamente hidrolizable adecuado para la invención puede ser, en particular, un polisacárido que comprende de 2 a 20, en particular de 3 a 10, y más particularmente de 4 a 6 unidades de ose elegidas entre los grupos osídicos definidos anteriormente.
35 [0129] Según otra variante de realización preferida, un grupo lábil E enzimáticamente hidrolizable adecuado
para la invención puede ser un grupo elegido entre un grupo D-glucuronil, un grupo D-galactopiranosilo, un grupo D- glucopiranosilo o un grupo manopiranosido.
[0130] Más preferentemente aún, un grupo lábil E enzimáticamente hidrolizable adecuado para la invención 40 puede ser un grupo D-glucuronil.
[0131] La p-glucuronidasa es una enzima presente de manera natural en una concentración significativa en la vecindad de numerosos tumores. Los profármacos de la invención que comprenden como grupo lábil E un grupo glucuronil pueden ser, por tanto, ventajosamente activados a nivel extracelular, durante monoterapias con
45 profármacos o PMT (del inglés Produg Mono-Therapy). Además, la p-glucuronidasa y la p-galactosidasa son dos enzimas lisosómicas que están presentes en la mayoría de las células malignas. Por lo tanto, la activación de los profármacos glucuronilados o galactosilados por las enzimas correspondientes puede realizarse en el medio intracelular después de su internalización por endocitosis.
50 [0132] Según otra realización, un grupo lábil E enzimáticamente hidrolizable puede ser un sustrato de una proteasa o de una peptidasa, en particular un sustrato de una catepsina o de una metaloproteasa, en particular del PSMA.
[0133] Según otra realización, la especificidad tisular y/o celular por un grupo lábil E enzimáticamente 55 hidrolizable puede proporcionarse después del direccionamiento de la enzima capaz de hidrolizar el grupo E hacia
los tejidos o células objetivo, por ejemplo, por medio de un anticuerpo.
[0134] En esta realización, la enzima está unida previamente a un anticuerpo específico de los tejidos o células objetivo y el conjugado así obtenido es administrado antes de la administración de un profármaco de la
invención.
[0135] Este tipo de procedimiento es conocido por el experto en la técnica y se denomina terapia de profármaco dirigida por enzima o ADEPT (tratamiento enzimático con profármaco dirigido por anticuerpos).
5
[0136] Corresponde a las competencias del experto en la técnica seleccionar la naturaleza del grupo X de un brazo autorreactivo según la invención representado por la fórmula general (l) o (la) en función de la reacción enzimática y ,por tanto, de la enzima, que debe conducir a la eliminación del grupo lábil E.
10 [0137] En el caso de las esterasas, X será elegido de modo que E y X' formen juntos una función éster o
carbonato.
[0138] En el caso de las glicosidasas, X será elegido de modo que E y X' formen juntos un enlace glucosídico.
15
[0139] En el caso de las peptidasas y las protesas, X será elegido de modo que E y X' formen juntos una función amida.
[0140] Según una realización cuando el grupo lábil E es un grupo glicosilo, por ejemplo, un grupo D- 20 galactopiranosilo o un grupo D-glucuronil, X puede ser preferentemente un grupo OH.
[0141] Por lo tanto, según una realización preferida, un compuesto de fórmula general (II) adecuado para la invención puede ser tal que X' represente O y E represente un grupo glicosilo, preferentemente elegido entre un grupo D-galactopiranosilo, un grupo D-glucuronil, un grupo D-glucopiranosilo o un grupo manopiranosilo.
25
[0142] Según una realización cuando el grupo lábil E es de naturaleza peptídica o proteínica, X puede ser preferentemente un grupo NH2.
[0143] Por lo tanto, según una realización, un compuesto de fórmula general (II) adecuado para la invención 30 puede ser tal que X' represente NH y E represente un grupo peptídico sustrato de catepsinas o proteasas y, en
particular, sustrato de catepsina tal como Ala-Leu-Ala-Leu.
[0144] Según otra realización preferida, E puede representar un grupo peptídico sustrato del PSMA.
35 Ligando selectivo L
[0145] Un ligando selectivo adecuado para la invención permite ventajosamente dirigir un profármaco de la invención hacia un órgano, un tejido o células específicas.
40 [0146] Más particularmente, un ligando selectivo L adecuado para la invención permite dirigir ventajosamente
un profármaco de la invención hacia un tumor o células malignas.
[0147] Según una realización, un ligando selectivo L puede comprender además un grupo Z destinado a modular la solubilidad y en particular mejorar la solubilidad en los fluidos biológicos, de un profármaco de la
45 invención.
[0148] Según una realización, un ligando selectivo adecuado para la invención puede ser de la forma L-(Z)n- en la que n puede ser igual a 0 o 1 y L y Z son particularmente como se definen a continuación.
50 [0149] Un ligando selectivo L puede ser elegido entre un péptido, una proteína, un anticuerpo o un fragmento
de anticuerpo que reconoce un antígeno, un ligando de un receptor celular, un biopolímero, un monosacárido, un oligosacárido, una hormona, una vitamina, un dendrímero, una poliamina o una nanopartícula, metálica o no.
[0150] Un ligando selectivo L adecuado para la invención puede ser elegido entre los ligandos capaces de
55 identificar, por ejemplo, las integrinas, la nucleolina, la aminopeptidasa N, la endoglina, el receptor del factor de crecimiento endotelial vascular, los receptores de lipoproteínas de baja densidad (LDL), el receptor de transferrina, los receptores de la somatostatina, la bombesina, del Neuropéptido Y, el receptor de la hormona liberadora de hormona luteinizante, los receptores del ácido fólico, los receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF), los receptores del factor de crecimiento transformante (TGF), los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos
(FCF), los receptores de asialoglicoproteínas, los receptores de galectinas, los receptores de selectinas o los receptores de ácido hialurónico.
[0151] Un ligando selectivo L adecuado para la invención puede ser en particular, un ligando descrito por Krat 5 et al. (Chem. Med. Chem., 2008, 3:20).
[0152] Se entiende por “biopolímero”, un biopolímero biocompatible. Un biopolímero adecuado para la invención puede ser el copolímero N-(2-hidroxipropil)metacrilamida. Dicho polímero puede asegurar la selección de un profármaco de la invención hacia los tumores por el fenómeno de retención y de permeabilidad aumentada (EPR,
10 del inglés enhanced permeability and retention effect) unido a la vascularización específica de los tumores.
[0153] Un monosacárido adecuado para la invención puede ser, por ejemplo, glucosa, galactosa o manosa.
[0154] Un oligosacárido adecuado para la invención puede ser, por ejemplo, lactosa.
15
[0155] Un péptido adecuado para la invención puede ser, por ejemplo, un péptido RGD, péptidos que se unen a las paredes de las arterias, un péptido derivado de EGF o un péptido derivado del NGF.
[0156] Una proteína adecuada para la invención puede ser, por ejemplo, una lectina, tal como la concanalina 20 A o la lectina de unión a manosa, una selectina, una galectina, un factor de crecimiento, tal como el VEGF, el FGF o
el NGF, las proteínas de los surfactantes A y B, asialoglicoproteínas, proteínas del circumsporozoito del paludismo o la proteína Rap.
[0157] Un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que reconoce un antígeno adecuado para la invención 25 puede ser, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo anti-CD5, un anticuerpo anti-CD117, un anticuerpo
anti-ErbB2, una lgG, un anticuerpo anti-HER2, un anticuerpo ChCE7, un anticuerpo OV-TL16 Fab', un anticuerpo anti-PECAM, un anticuerpo antitrombomodulina o un anticuerpo anti-Tn, un anticuerpo anti-CD20, un anticuerpo anti-CD33, un anticuerpo anti-CEA, un anticuerpo anti-glicoproteína del tipo mucina (MUC-1, CanAg, Lewis Y, Lewis X), un anticuerpo anti-MAGE o un anticuerpo anti-PSMA.
30
[0158] Un ligando de un receptor celular adecuado para la invención puede ser, por ejemplo, ácido fólico, Neuropéptido Y, leptina, un ligando del receptor de EGF, FGF, TGF o NGF, insulina, un ligando sintético manosilado, transferrina o una catecolamina.
35 [0159] Una hormona adecuada para la invención puede ser, por ejemplo, la progesterona, un estrógeno, la
testosterona, la hormona antidiurética, una hormona del crecimiento o una hormona tiroidea.
[0160] Una poliamina adecuada para la invención puede ser, por ejemplo, una polilisina.
40 [0161] Una nanopartícula adecuada para la invención puede ser, por ejemplo, una nanopartícula metálica o
una nanopartícula no metálica.
[0162] Según una realización preferida, un ligando selectivo L puede representar un ligando de un receptor celular y preferentemente es ácido fólico.
45
[0163] De hecho, el receptor de ácido fólico es sobreexpresado en numerosos tumores tales como los tumores de ovarios, pulmones, mama, riñón, cerebro, endometrio, colon o en leucemias. En cambio, este está poco o no está presente en la superficie de las células sanas.
50 [0164] Según una realización, un ligando selectivo adecuado para la invención puede ser de forma L-(Z)n-
con n = 0 o 1. Z puede estar especialmente destinado a modular la solubilidad y, en particular, mejorar la solubilidad en los fluidos biológicos, de un profármaco de la invención.
[0165] La elección de la naturaleza del grupo Z se determina, por una parte, en función de la naturaleza del 55 compuesto activo D, del grupo lábil E y del ligando selectivo L fijado en un brazo autorreactivo de la invención, y por
otra parte, en función de los parámetros de solubilidad del profármaco que debe ser ajustado.
[0166] Según una realización, n puede ser igual a 0 o 1 y Z puede representar un grupo alquileno, lineal o ramificado, saturado o insaturado, en C1-C10, opcionalmente interrumpido por uno o varios heteroátomos elegidos
entre O o N, un grupo glicosilo, un grupo O-(CHR3-CHR4-O-)m o N-(CH3-CHR4-O-)m en los que m es un número entero natural que varía de 0 a 20, R3 y R4 son, independientemente uno del otro, H o CH3, siempre que R3 y R4 no sean simultáneamente CH3, un grupo derivado de un aminoácido o de un péptido o una combinación de estos grupos.
5
[0167] Según una realización, n puede ser igual a 1 y Z puede representar un grupo alquileno en C1-C5, preferentemente en C1-C3 y más preferentemente un metileno.
[0168] Según otra realización, n puede ser igual a 1 y Z puede representar un grupo glicosilo elegido entre un 10 grupo glucosilo, un grupo galactosilo, un grupo manosilo, un grupo lactosilo.
[0169] Según una variante de realización, Z puede representar un grupo glicosilo como se ha definido anteriormente.
15 [0170] Según otra realización, n puede ser igual a 1 y Z puede representar un grupo O-(CHR3-CHR4-O-)m o
N-(CHR3-CHR4-O)m en los que m es un número entero natural que varía de 2 a 18, preferentemente de 3 a 16 y más preferentemente de 4 a 12.
[0171] Según otra realización, n puede ser igual a 1 y Z puede representar un grupo derivado de un 20 aminoácido o de un péptido. Como ejemplo de aminoácidos adecuados para la invención, se puede mencionar, en
particular, la tirosina.
[0172] Según otra realización, n puede ser igual a 1 y Z puede representar una combinación de los grupos anteriormente definidos. En particular, Z puede representar una combinación de un grupo glicosilo y un grupo O-
25 (CHR3-CHR4-O)m o N-(CHR3-CHR4-O-)m como se han definido anteriormente.
[0173] Según otra realización preferida, n puede ser igual a 0.
Preparación de un profármaco
30
[0174] Un compuesto de fórmula general (II) puede ser preparado a partir de un compuesto de fórmula general (I) y grupos D-v, E-w y L-(Z)n-x, especialmente como se definen a continuación mediante cualquier procedimiento conocido por los expertos en la técnica.
35 [0175] En particular, un compuesto de fórmula general (II) puede ser obtenido mediante un procedimiento de
preparación que consiste en hacer reaccionar un compuesto de fórmula general (l) o (la) como se ha definido anteriormente con grupos D-v, E-w y L-(Z)n-x, en los que D, E y L y Z son como se han definido anteriormente y v, w y x tiene cada uno una función reactiva de manera que, con respecto al compuesto de fórmula general (I), v reacciona con OH unido al carbono bencílico o dicho OH previamente activado, w reacciona X y x reacciona con F. 40
[0176] Las funciones reactivas v, w y x pueden estar presentes de forma natural en los grupos D, E y L-(Z)n o pueden ser introducidas, antes de la etapa de reacción, en los grupos D, E y L-(Z)n.
[0177] Corresponde a los expertos en la materia modificar los grupos D, E y L-(Z)n para introducir las 45 funciones reactivas v, w y x adecuadas para la invención.
[0178] En particular, v, w y x son como se definen a continuación.
[0179] Un procedimiento de preparación de un profármaco según la invención puede comprender al menos 50 las etapas que consisten en hacer reaccionar:
a- un compuesto de fórmula general (l) o (la) con un compuesto E-w, b- el producto de la reacción de la etapa a- con un compuesto D-v, y c- el producto de la reacción de la etapa b- con un compuesto L-(Z)n-,
55
en el que los compuestos de fórmula general (l) o (la), E-w, D-v y L-(Z)n- son en particular como se definen a continuación.
[0180] Un procedimiento de la invención puede comprender además al final de cada etapa a-, b- y c- una
etapa de purificación del producto obtenido.
[0181] Más particularmente, las etapas a-, b- y c- de un procedimiento de la invención pueden ser, en particular, como se definen a continuación.
5
[0182] Según una realización, un brazo autorreactivo según la invención se puede obtener mediante un procedimiento que comprende al menos una etapa que consiste en hacer reaccionar químicamente un compuesto de la invención representado por la fórmula general (l) con un grupo D-v, en el que D es como se ha definido anteriormente y v representa una función reactiva de manera que, con respecto al compuesto de fórmula general (l),
10 v reacciona con OH unido al carbono bencílico.
[0183] Según una variante de realización, la unión por vía química de un compuesto activo D a la función OH del carbono bencílico de un compuesto de la invención de fórmula general (l) puede comprender una etapa preliminar de activación de la función OH, seguida de una etapa de reacción de un grupo D-v con la función OH
15 activada.
[0184] Según una realización, la función OH unida al carbono bencílico de un compuesto de la invención de fórmula general (l) se puede activar por reacción de dicho compuesto con un compuesto elegido entre el cloroformiato de fenilo y sus derivados tal como el para-nitrofenilo cloroformiato, el dinitrofenilo cloroformiato, el
20 fluorofenilo cloroformiato o el diimizadazol carbonilo.
[0185] Según una realización, v es elegida de manera que la reacción química de un grupo D-v con la función OH unida al carbono bencílico de un compuesto de fórmula general (l) o dicha función OH previamente activada, conduce a la formación de un grupo -A(CO)O- uniendo el grupo D al carbono bencílico, en el que A puede ser O, y
25 dicho grupo representa una función carbamato o A puede ser NH y dicho grupo representa una función carbamato.
[0186] Según una realización preferida, se aplica un brazo reactivo de la invención con una función OH unida al carbono bencílico previamente activado, como se ha indicado anteriormente.
30 [0187] Según otra realización preferida, un grupo D-v se hace reaccionar con una función OH unida al
carbono bencílico activada por reacción con un cloroformiato de fenilo y uno de sus derivados, como se ha indicado anteriormente.
[0188] Preferentemente, v es elegido de manera que en el grupo -A(CO)O-, A es NH.
35
[0189] Corresponde a los expertos en la técnica seleccionar la naturaleza del grupo v en dependencia de que la reacción química se realice con la función OH o una función OH activada del carbono bencílico de un compuesto de fórmula general (l).
40 [0190] Cuando D es una pluralidad de compuestos activos unidos a un amplificador como se ha definido
anteriormente, v en la fórmula D-v representa la función anilina o fenol del amplificador.
[0191] Según una realización, v puede ser elegido entre NH2, NHR”, OH o SH, con R” siendo como se ha definido anteriormente. Una función reactiva v puede estar presente en un grupo funcional, por ejemplo, -CONHOH,
45 -CONR”OH, -CONH2, -CONHR” o -NHOH, con R” siendo como se ha definido anteriormente.
[0192] Según otra realización preferida, los compuestos activos D pueden acoplarse con el alcohol bencílico del brazo autorreactivo de la invención previamente activado en forma de carbonato de fenilo y sus derivados tales como un carbonato de p-nitrofenilo, un carbonato de dinitrofenilo, un carbonato de fluorofenilo o un carbonato de
50 diimidazol.
[0193] Según una realización, un brazo autorreactivo según la invención puede ser obtenido mediante un procedimiento que comprende al menos una etapa que consiste en hacer reaccionar químicamente un compuesto de la invención representado por la fórmula general (l) con un grupo E-w, en el que E es como se ha definido
55 anteriormente y w representa una función reactiva de manera que, con respecto al compuesto de fórmula general (l), w reacciona con X.
[0194] Según una realización, cuando X es OH, w puede representar un radical halogenado, en particular Cl o Br, y en particular Br.
[0195] Según otra realización, cuando X es NH2, w puede representar un radical -COOH o -OC(O)Cl.
[0196] Según una realización particular, los grupos lábiles E enzimáticamente hidrolizables de tipo grupo 5 glicosilo pueden ser introducidos en una función fenol de un brazo autorreactivo de la invención a través de una
reacción de glicosilación quimioselectiva.
[0197] Según una realización, un brazo autorreactivo según la invención puede ser obtenido mediante un procedimiento que comprende al menos una etapa que consiste en hacer reaccionar químicamente un compuesto
10 de la invención representado por la fórmula general (l) con un grupo L-(Z)n-x, en el que L, Z y n son como se han definido anteriormente y x representa una función reactiva de manera que, con respecto al compuesto de fórmula general (l), x reacciona con F mediante una reacción de química clic.
[0198] La reacción por química clic entre las funciones reactivas F y x da el grupo G de la fórmula general (II) 15 definida anteriormente. La naturaleza del grupo G depende naturalmente de la naturaleza de las funciones reactivas
iniciales F y x.
[0199] Las reacciones de química clic y los pares de funciones reactivas F y x son conocidas por el experto en la materia. Al respecto, se puede hacer referencia a la revista de Kolb et al. (Angew. Chem. Int. Ed., 2001, 40:
20 2004).
[0200] Según una realización, F representa una función reactiva activable por química clic elegida entre - CeCR’”, -N3, -SH, -C=CH2, ciclooctinas, maleimida, -SO2N3 o -COSR'” con R'” que representa H o un radical alquilo, lineal o ramificado, saturado o insaturado, en Ci a C10, y en particular en C2 a Ca, o incluso en C3 o C4.
25
[0201] Corresponde a los expertos en la técnica seleccionar la naturaleza del grupo x según la naturaleza de un grupo F de un compuesto de fórmula general (l).
[0202] Según una realización, x y F pueden ser elegidos entre los pares de funciones reactivas activables en 30 química clic siguientes, (-N3, -CeCR’”), (-sH, -C=CH2), (-N3, ciclooctinos), (-SH, maleimida), (-SO2N3, -COSR”'), con
R'” representando H o un radical alquilo, lineal o ramificado, saturado o insaturado, en C1 a C10, y en particular en C2 a Ca, o en C3 o C4.
[0203] Según otra realización particular, un ligando selectivo L-(Z)n-x puede unirse al conjunto grupo E/brazo 35 autorreactivo/compuesto activo por reacción de “química clic” o “click chemistry” con una función alquino.
[0204] A lo largo de la solicitud, o sea la descripción presentada anteriormente y los ejemplos que se presentan a continuación, la expresión “entre... y ...” relacionada con un rango de valor debe entenderse que incluye los límites de este rango.
40
[0205] Los ejemplos que se dan a continuación se presentan a modo de ilustración del objeto de la invención. FIGURAS
45 [0206]
Figura 1: ilustra el esquema de síntesis de un vector según la invención, compuesto 7, por reacción en un brazo autorreactivo de la invención de un fármaco D, doxorrubicina, un grupo lábil o disparador E, galactósido y un ligando selectivo L, folato. En la Figura 1, a) representa 1-bromo-(2,3,4,6-O-tetra-O-acetil)-p-D-galactopiranósido, Ag2CO3, 50 HMTTA, CH3CN, 84 %; b) representa p-nitrofenil-cloroformiato, piridina, CH2O2, 92 %; c) representa doxorrubicina, Et3N, DMF, 65 %; d) representa NaOMe, MeOH/CH2Cl2, -15 %, 80 %; e) representa CusO4, ascorbato de sodio, DMSO/H2O, 75 %.
Figura 2: ilustra la capacidad de un profármaco de la invención (compuesto 7, DOX-GAL-AF) para ser 55 específicamente internalizado en células que expresan un receptor para el ligando selectivo (HeLa, receptor de ácido fólico) en comparación con un compuesto no de acuerdo con la invención (compuesto 5, DOX-GAL) y un compuesto activo no vectorizado en forma de profármaco (DOX), y con respecto a células que no expresan dicho receptor (A549). La saturación del medio de cultivo de las células en ácido fólico (+AF) evita la entrada del compuesto DOX-GAL-AF en las células HeLa.
Figura 3: ilustra la citotoxicidad específica de un profármaco de la invención (compuesto 7, DOX-GAL-AF) en un medio de cultivo denudado (triángulo negro, línea discontinua), en comparación con un compuesto no de acuerdo a la invención (compuesto 5, DOX-GAL) en un medio de cultivo denudado (cuadrado negro, línea continua), o 5 saturado en p-galactosidasa (cuadrado negro, línea discontinua), un compuesto activo no vectorizado en forma de profármaco (DOX, círculo negro), frente a células que expresan un receptor para el ligando selectivo (HeLa, receptor de ácido fólico, Figura 3A) y células que no expresan dicho receptor (A549, Figura 3B).
Figura 4 y 5: ilustran el esquema de síntesis de un vector dendrítico según la invención, compuesto (221), por 10 reacción en un brazo autorreactivo de la invención de un fármaco D constituido por una pluralidad de compuestos activos, doxorrubicina, unidos a un amplificador, de un grupo lábil o disparador E, galactósido y de un ligando selectivo L, folato.
Figura 6: ilustra la citotoxicidad específica de dos profármacos de la invención, compuesto (7), DOX-GAL-AF, 15 (triángulo) y vector dendrítico (221) (cuadrado) con respecto a la Doxorrubicina (círculo) en una línea de células cancerosas LAM de tipo KG1.
EJEMPLOS
20 Ejemplo 1
1- Procedimiento general de síntesis
[0207] Todas las reacciones han sido realizadas bajo atmósfera de nitrógeno N2. A menos que se especifique 25 lo contrario, los solventes utilizados son de calidad de Cromatografía líquida de alta resolución (CLAr).
[0208] Los reactivos químicos utilizados son de calidad analítica, obtenidos a partir de fuentes comerciales y utilizados sin purificación adicional.
30 [0209] La evolución de las reacciones ha sido seguida en cromatografía en capa fina (CCF) utilizando placas
recubiertas previamente con un gel de sílice MACHEREY-NAGEL ALUGRAM® SILG/UV254 (0,2 mm de gel de sílice 60). Las manchas fueron visualizadas después de la exposición de la placa a la luz ultravioleta (250 nm) y/o mediante impregnación de la placa CCF en una solución de 3 g de ácido fosfomolíbdico en 100 ml de etanol seguido de un secado con secador de cabello.
35
[0210] La cromatografía flash en columna ha sido realizada usando un gel de sílice MACHEREY-NAGEL 60 (15-40 pm) como fase estacionaria.
[0211] Los espectros RMN 1H y 13C han sido registrados a 400 MHz en un instrumento BRUKER 400 40 AVANCE III. Los desplazamientos químicos (5) son reportados en parte por millón tomando el tetrametilsilano como
referencia interna. Las constantes de acoplamiento (J) son reportadas en Hertz (Hz).
[0212] Las abreviaturas estándar que indican una multiplicidad son indicadas de la siguiente manera: b = grande, s = singulete, d = doblete, t = triplete, m = multiplete.
45
[0213] Los puntos de fusión han sido medidos en un aparato Büchi Melting Point b-545 y no se han corregido.
[0214] La espectrometría de masa ESI ha sido realizada por el Centro Regional Occidental para Mediciones Físicas (CRNPO) de la Universidad de Rennes 1.
50
[0215] La CLHP analítica de fase inversa (RP-HPLC) ha sido realizada en un dispositivo Dionex Ultimate 3000 equipado con un detector de longitud de onda variable UV/Visible y una columna de cromatografía de fase inversa aCcLAIM® (120, C18, 251X4,6 mm, 5 pm, 120 Á) a 30 °C y 1 ml.min-1. El gradiente de elución estaba compuesto por A (0,2 % de TFA en agua) y B (CH3CN).
55
[0216] El análisis en espectrometría de masa acoplada a una cromatografía líquida (SM-CL o LCMS) ha sido realizado con un equipo WATERS provisto de un detector de masa 3100, un módulo Separator WATERS 2695 y un detector de longitud de onda variable UV/visible WATERS 2489. La columna de cromatografía de fase inversa utilizada ha sido una columna ACCLAIM® (120, C18, 251x4,6 mm, 5 pm, 120 Á) a 30 °C y 1 ml.min-1. El gradiente de
elución estaba compuesto por A (0,2 % de TFA en agua) y B (CH3CN).
[0217] La CLHP de fase inversa preparativa ha sido realizada con un dispositivo VARIAN PREPSTAR. Se ha aplicado un flujo de solvente de 20 ml.min-1 en una columna semipreparativa VARIAN Dynamax (250x21,4 mm
5 Microsorb 100-5 C18). El gradiente de elución estaba compuesto por A (0,2 % de TFA en agua) y B (CH3CN).
[0218] Método 1 (para el análisis CLHP y SM-CL): gradiente lineal que comienza con A/B = 80/20 V/V, alcanzando A/B = 70/30 V/V en 20 minutos y luego mantenido constante durante 20 minutos.
10 [0219] Método 2 (para la CLPH preparativa): gradiente lineal que comienza con A/B = 80/20, V/V alcanzando
A/B = 70/30, V/V en 20 minutos.
2- Síntesis del compuesto (7) DOX-GAL-AF
15 2a- Preparación del compuesto (1)
[0220]
20
[0221] En un matraz de tres bocas de 250 mL, 648 mg (24 mmol, 1 eq.) de aluminio y una cantidad catalítica de HgCl2 son recubiertos de THF previamente destilado (10 mL). Se agregan 2,6 mL (24 mmol, 1 eq.) de bromuro de propargilo puro hasta que comienza la reacción (aparición de ebullición en el matraz y ennegrecimiento de la solución). Cuando la adición ha finalizado, se deja en reflujo durante 6 horas. Posteriormente, se enfría la solución a
25 0 °C y se agrega gota a gota una solución compuesta de 650 mg (3,84 mmol) de 4-hidroxi-3-nitro-benzaldehído en 5 mL de THF destilado. Después de 30 minutos de agitación, el producto de partida ha desaparecido por completo, la reacción se hidroliza con 10 mL de HCl (1N) y luego se extrae tres veces con AcOEt. La fase orgánica se seca en MgSO4 y luego se evapora en seco para conducir a un aceite marrón que se purifica por cromatografía flash (70/30, EP/AcOEt), se obtiene un aceite amarillo que se diluye en 30 mL de diclorometano. Esta fase orgánica se lava tres 30 veces con NaOH (1N). La fase acuosa es acidificada con HCl concentrado y extraída tres veces con cloroformo para conducir después de la evaporación al compuesto 1 en forma de aceite marrón con un rendimiento del 94 % (754 mg, 3,6 mmol).
Fórmula bruta: C10H9O4N y M = 207,19 g/mol
35 RMN 1H (CDCI3) 5 (ppm): 2,05 (d, 1H, J = 2,6 Hz Hf); 2,58 (dd, 2H, J = 6,3 y 2,1 Hz, He); 3,25 (sl, 1H, OHbencílico); 4,81 (t, 1H, J = 6,2 Hz, Hd); 7,09 (d, 1H, J = 8,7 Hz, Ha); 7,59 (dd, 1H, J = 8,7 y 2,2 Hz, Hb); 8,07 (d, 1H, J = 2,2 Hz, Hc); 10,48 (sl, 1 H, OHfenol).
RMN 13C (CDCl3) 5 (ppm): 30,0 (Ce); 70,9 (Cd); 72,1 (Cf); 79,7 (Calquino); 120,5 (Ca o b); 122,3 (Ca o b); 132,9 (Caro);
133,2 (Cc); 135,1 (Caro); 154,6 (Cno2).
40
2b- Preparación del compuesto (2)
[0222]
[0223] 200 pL (0,7 mmol) de HMTTA y 1,0 g de Ag2CÜ3 (3,7 mmol) son disueltos en 1,5 mL de acetonitrilo. Esta solución se agita durante 2 horas y luego se añaden sucesivamente 209 mg (1 mmol) de 1 y 830 mg de
5 galactosa bromada (2 mmol). Después de agitar durante 4 horas, se agrega el agua destilada y se extrae tres veces con el AcOEt. Las fases orgánicas se combinan y se lavan con una solución de HCl (1N). Después del secado en MgSO4 y evaporación en seco, el producto es purificado por cromatografía flash (60/40 %, 50/50 y 40/60 EP/AcOEt) para conducir a 453 mg del producto 2 en forma de un aceite amarillo (0,84 mmol) con un rendimiento del 84 %.
10 Fórmula bruta: C24H27O13N y M = 537,48 g/mol F: 71 °C
[a]o20: +42(c 0,1, CHCb)
RMN 1H (CDCI3) 5 (ppm): 2,01 (s, 3H, Hacetato); 2,03 (s, 3H, Hacetato); 2,05 (s, 4H, Hacetato y Hf); 2,65 (d, 2H, J = 4,2 Hz, He); 4,08-4,27 (m, 3H, Ha,6); 4,92 (t, 1H, J= 5,7 Hz, Hd); 5,07-5,15 (m, 2H, Hazúcar); 5,39-5,56 (m, 2H, Hazúcar); 7,35 (d, 15 1H, J = 8,6 Hz, Ha); 7,58 (t, 1H, J = 8,7 Hz, Hb); 7,86 (d, 1H, j = 8,6 Hz, Hc).
RMN 13C (CDCl3) 5 (ppm): 20,6 (Cacetato); 20,7 (Cacetato); 20,8 (Cacetato); 21,0 (Cacetato); 29,4 (Ce); 61,4 (C6); 66,7 (Cazúcar); 68,9 (Cazúcar); 70,4 (Cazúcar); 71,4 (Cazúcar); 71,9 (Cf); 79,6 (Cd); 100,7 (C1); 119,6 (CoHaro); 122,7 (CoHaro);
131,1 (CCHaro); 138,8 (Caro cuaternario); 141,1 (Caro cuaternario); 148,7 (Caro cuaternario); 169,5 (Ccarbonilo); 170,2 (Ccarbonilo); 170,4 (Ccarbonilo); 171,1 (Ccarbonilo).
20
2c- Preparación del compuesto (3)
[0224]
25
[0225] 453 mg (0,84 mmol, 1 eq.) de alcohol bencílico 2 y 339 mg (1,68 mmol, 2 eq.) de cloroformiato de
paranitrofenol son disueltos en 10 mL de DCM. La solución se enfría a 0 °C y luego se agregan 230 pL de piridina (2,1 mmol, 2,5 eq.). Después de la desaparición total del producto de partida, se agrega agua destilada en el medio 30 y se extrae en tres veces con diclorometano. La fase orgánica se seca en MgSO4 y luego se evapora en seco. Una cromatografía flash (60/40 y 50/50 EP/AcOEt) permite aislar 384 mg del compuesto 3 (0,55 mmol) en forma de sólido amarillo con un rendimiento del 65 %.
Fórmula bruta: C31H30O17N2 y M = 702,59 g/mol 35 F: 94 °C
[a]D20: + 32 (c 0,1, CHCb)
RMN 1H (CDCI3) 5 (ppm): 2,02 (s, 3H, Hacetato); 2,05-2,07 (s, 3H, Hacetato); 2,10 (s, 3H, Hacetato); 2,15 (s, 3H, Hacetato); 2,89 (m, 2H, He); 4,11-4,24 (m, 3H, H5,a); 5,10 (m, 2H, Hazúcar); 5,50 (m, 2H, Hazúcar); 5,81 (t, 1H, J = 5,7 Hz, Hd); 7,34
(d, 2H, J = 7,0 Hz, Hg); 7,41 (d, 1H, J = 8,7 Hz, Ha); 7,61 (dd, 1H, J = 8,7 y 2,1 Hz, Hb); 7,92 (d, 1H, J = 2,1 Hz, Hc); 8,23 (d, 2H, J = 7,1 Hz, Hh).
5 RMN 13C (CDCI3) 5 (ppm): 25,2 (Cacetato); 25,3 (3*Cacetato); 31,0 (Ce); 6,9 (Ca); 72,8 (Cazúcar); 73,5 (Cazúcar); 76,0 (Cazúcar); 77,1 (Cazúcar); 78,1 (Cd); 82,73 (Cf); 83,9 (Calquino); 105,2 (C1); 123,8 (Cch aro); 127,8 (Cch aro); 128,8 (Cch aro); 130,8 (CCH aro) ; 137,8 (CCH aro) ; 139,0 (Caro) ; 146,5 (Caro) ; 151,5 (Caro) ; 154,8 (Caro) ; 157,1 (Caro) ; 161,1 (Ccarbonato); 174,2 (Ccarbonilo); 174,9 (Ccarbonilo); 175,2 (Ccarbonilo); 175,5 (Ccarbonilo).
SMHR: C31H30N2Ü17Na(M+Na)+ teórico: 725,1442, encontrado : 725,1449 10 C31H30N2Ü17K(M+K)+ teórico: 741,1182, encontrado: 741.1186
2d- Preparación del compuesto (4)
[0226]
15
[0227] 702 mg (1 mmol) de nitrofenol 3 y 580 mg (1 mmol) de doxorrubicina hidroclorada son disueltos en 15 mL de DMF. Se agregan 350 |jL de trietilamina (2,5 mmol) al medio. La solución se agita toda la noche, luego se
20 añaden 25 mL de una solución saturada de NaCl y la mezcla se extrae en tres veces con diclorometano. La fase orgánica se seca en MgSÜ4 y luego se evapora. El producto es purificado mediante cromatografía flash (1,5/98,5, 3/97 y 4/96 MeÜH/DCM) en gel de sílice. El compuesto 4 se aísla en forma de sólido rojo con un rendimiento del 50 % (554 mg, 0,50 mmol).
25 Fórmula bruta: C52H54O25N2 y M = 1107,02 g/mol F: 172 °C
[a]D20: + 180 (c 0,1, CHCla)
RMN 1H (CDCl3) 5 (ppm): 1,25 (m, 3H, Hdox 6'); 1,81-2,38 y 2,68-3,23 (m, 23H); 3,47 (s, 1H); 3,58-3,83 (m, 2H); 4,074,21 (m, 7H); 4,51 (s, 1H); 4,74 (m, 2H); 5,25 (sl, 1H); 5,47 (m, 4H); 5,68 (m, 1H); 7,38 (d, 1H, J = 8,4 Hz, Haro); 7,48 30 (dd, 1H, J= 8,7 y 2,1 Hz, Haro); 7,77 (m, 2H, Haro); 7,99 (dd, J = 7,3 y 2,3 Hz, Haro); 13,15 (d, 1H, OHfenol); 13,92 (d, 1 H, OHfenol).
RMN 13C (CDCl3) 5 (ppm): 16,8; 20,6 (2*); 26,4 (2*); 31,5; 33,8; 35,6; 36, 5; 47,2; 56,6; 61,3; 65,5; 66,7; 67,4; 67,8; 69,4; 69,5; 69,6; 70,5; 71,4; 71,8; 72,4; 72,5; 78,5 (2*); 100,5; 111,2; 111,4; 118,6; 119,3; 119,7; 120,6; 123,3; 131,8; 133,6; 135,3; 135,4; 135,8; 140,9; 149,1; 155,5; 156,1; 161,0; 162,7; 169,4; 170,1; 170,2; 170,3 (2*); 186,5; 186,9; 35 213,8.
SMHR: C52H54N2Ü25Na(M+Na)+ teórico: 1129,2913, encontrado: 1129,2897 C52H53N2Ü25Na2 (M-2H+2Na)+ teórico: 1151,2733, encontrado: 1151,2726
2e- Preparación del compuesto (5) DÜX-GAL 40
[0228]
[0229] 104 mg (94 |jmol, 1 eq.) de profármaco 4 son diluidos en 34 mL de MeOH y 6 mL de DCM. La solución es enfriada a - 15 °C con la ayuda de un criostato. Se agregan 79 mg de MeONa (1,5 mmol, 16 eq.) al medio. La
5 solución se agita entre 2 h 15 y 2 h 30 a -15 °C y luego, después de la desaparición total del producto de partida, se
neutraliza el medio con una resina ácida (IRC 50) durante 20 minutos. La mezcla se filtra en algodón, se enjuaga en
MeOH, y luego se evapora en seco. Una purificación por cromatografía flash (6/94, 10/90 y 15/85 MeOH/DCM) permite aislar 71 mg del producto 5 (75 jmol) en forma de sólido rojo con un rendimiento del 80 %.
10 Fórmula bruta: C44H48O21N2 y M = 940,87 g/mol F: 131 °C
[a]o20: + 128 (c 0,05, MeOH)
RMN 1H (MeOD) 5 (ppm): 1,26 (m, 3H, H&); 1,82 (m, 1H, Hdox 2); 1,87-2,15 (m, 2H, Hdox 8a/b y Hdox 2); 2,25 (m, 2H, Hf y H8a/b); 2,68 (m, 3H, He y Hdox 10a/b); 2,91 (m, 1H, Hdox 10a/b); 3,53-3,89 (m, 11H, H2,3,4,5,6,3',4',OMe); 4,20 (m, 1H, H5); 15 4,70 (m, 2H, H14); 4,87 (m, 1H, Hdox 7); 5,0 (d, 1H, J = 7,7 Hz, H1) ; 5,33 (m, 1H, H1); 5,65 (dt, 1H, Hd); 7,22 (d, 0,5 H,
J = 8,8Hz, Ha); 7,31 (m, 1H, Hdox 3); 7,41 (d, 0,5H, J= 8,7 Hz, Ha); 7,50-7,63 (m, 3H, Hdox 1,2 y Hb); 7,75 (d, 0,5H, J =
1,9 Hz, Hc); 7,82 (d, 0,5H, J = 2,0 Hz, Hc).
RMN 13C (MeOD) 5 (ppm): 16,1; 17,2; 26,0; 29,6; 32,9; 36,1; 55,9; 61,2; 64,6; 66,4; 69,0; 70,8; 71,5; 71,8; 72,9; 73,7; 76,2; 76,8; 78,9; 98,2; 101,9; 117,6; 119,0; 119,2; 131,9; 134, 4; 135,0; 136,1; 140,6; 150,0; 155,1; 155,7; 20 161,1; 186,3; 214,0.
SMHR: C44H46N2O21Na(M+Na)+ teórico: 961,2491, encontrado: 961,2497 C44H45N2O21Na2(M-H+2Na)+ teórico: 983,2310, encontrado: 983,2276
2f- Preparación del compuesto (6)
25
[0230]
30 [0231] A una solución de ácido fólico deshidratado (600 mg, 1,26 mmol) en DMSO (20 ml) y piridina (10 ml)
se ha añadido 2-2(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etamina(0,3 ml, 1,2 equiv.) (comercialmente disponible o preparado como descrito por Schwabacher y col., J. Org. Chem. 1998, 63 : 1727) y diciclohexilcarbodiimida (DCC) (650 mg, 2,5 equiv.). La mezcla de reacción ha sido agitada durante la noche, en la oscuridad, a temperatura ambiente, para provocar la formación de un precipitado de diciclohexilurea (DCU). Después de la eliminación del precipitado, el 5 filtrado se ha vertido en una solución de éter anhidro (400 ml) enfriado a 0 °C. El precipitado amarillo obtenido de esta manera ha sido recuperado por filtración y luego lavado con EfeO para eliminar las trazas de DMSO. Un análisis CLPH del precipitado (Método 1) ha mostrado que los dos isómeros 6a y 6b fueron obtenidos en una relación de 7/3. El sólido (812 mg) ha sido disuelto en una solución (8 ml) 8:2:0,3:0,3 H2O/ACN/DMSO/Et3N, y ha sido purificado mediante una CLHP preparativa de fase inversa (Método 2). La fracción que contiene los isómeros 6a y 6b 10 inseparables ha sido concentrada bajo presión reducida. El residuo ha sido disuelto posteriormente en metanol a reflujo y ha sido vertido en una solución de Et2O enfriada a 0 °C. El precipitado ha sido recuperado por filtración y lavado con Et2O para dar un polvo amarillo (240 mg, 30 %).
RMN 1H (DMSO-da) 5 (ppm): 8.69 (s, 1H), 7.99 (d, 1H, J = 8.3Hz), 7.89 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 7.68 (d, 2H, J= 9.7 Hz), 15 7.19 (bs, 1H), 6.66 (d, 2H, J= 9.7 Hz), 4.53 (s, 2H), 4.4 (m, 1H), 3.72-3.19 (m, 20H), 2.30-2.20 (m, 2H), 2.11-1.82 (m, 2H)
RMN 13C (DMSO-da) 5 (ppm): 174.1, 171.8, 166.7, 154.9, 153.5, 150.7, 149.2, 148.4, 129.1, 127.9, 121.2, 69.8, 69.7, 69.6, 69.5, 69.3, 68.4, 52.6, 50.0, 48.6, 45.9, 43.6, 38.5, 30.5, 27.1 SMHR: C27H34N11O8 (M-H)- teórico: 640.2593, encontrado: 640.2586
20
2g- Preparación del compuesto (7) (DOX-GAL-AF)
[0232]
25
[0233] A una solución del compuesto (5) (25 mg, 26 pmol) y del compuesto (6) (16 mg, 0,95 equiv.) en DMSO
(1,5 ml) conteniendo 10 % de agua se ha añadido ascorbato sódico (10,5 mg, 2 equiv.) y CuSO4 (4 mg, 0,6 equiv.). La solución ha sido agitada a temperatura ambiente y la reacción ha sido seguida por CLHP (Método 1). Tres 30 fracciones de CuSO4 (2 mg, 0,3 equiv.) han sido añadidas seguidamente de manera regular hasta la desaparición del compuesto (6). Después de 6 horas, la mezcla de reacción ha sido diluida con MeOH (2 ml) y ha sido vertida en una solución de éter enfriada a 0 °C. El precipitado obtenido de esta manera ha sido filtrado y lavado con MeOH y Et2O para dar un polvo de color púrpura (40 mg). Este sólido ha sido disuelto a 0 °C en DMSO (1 ml) y una solución de EDTA. 2Na.2H2O (56 mg, 6 equiv.) en tampón de fosfato (1 ml, 0,2 M, pH 7). La solución ha sido agitada a 35 temperatura ambiente durante 5 horas. El color luego se torna rojo. La solución ha sido filtrada y el filtrante ha sido disuelto con MeOH y vertido en éter a 0 °C. El precipitado obtenido entonces ha sido filtrado y lavado con MeOH y Et2O para dar el compuesto (7) (30 mg, 75 %) en forma de polvo rojo. El análisis de CLHP (Método 1) ha mostrado cuatro picos (tiempo de retención: 23,7 min, 24,4 min, 25,3 min y 26,1 min) correspondientes a los cuatros isómeros del compuesto (7) (DOX-GAL-AF).
RMN 1H (DMSO-da) 5 (ppm): 8.63 (s, 1H), 7.90 (m, 5H), 7.65 (m, 4H), 7.6 (m, 2H), 7.35 (m, 2H), 6.91 (m, 2H), 6.64 (m, 2H), 5.76 (m, 1H), 5.21 (m, 1H), 4.94 (m, 3H), 4.56 (s, 3H), 4.56-4.33 (m, 7H), 4.14-3.99 (m, 7H), 2.97(m, 3H),
2.70 (m, 1H), 2.35 (m, 1H), 2.23-2.13 (m, 4H), 2.10-1.85 (m, 4H), 1.45 (m, 1H), 1.12 (m, 3H)
SMHR: C71H80N13O29 (M-H)- teórico: 1578.51904, encontrado: 15785115
Ejemplo 2
5
Selectividad del compuesto (7) DOX-GAL-AF
[0234] El compuesto (7) ha sido probado en dos líneas celulares, las células Hela, expresando el receptor del ácido fólico (FR) y las células A549 expresando poco o nada estos receptores.
10
[0235] Las células Hela y A549 han sido cultivadas en un medio RPMI 1640 suplementado con suero de ternero fetal al 10 % (InVitrogen), a 37 °C en una atmósfera al 5 % de CO2.
[0236] Para experiencias en microscopía confocal, las células han sido cultivadas en un recipiente con fondo 15 de vidrio.
[0237] Las células han sido incubadas durante 1 hora en presencia o en ausencia de 1 pm de ácido fólico antes de su tratamiento, con una solución tampón (testigo), doxorrubicina a 10 pM, con un conjugado de doxorrubicina galactosa (DOX-GAL), compuesto (5), con la concentración de 10 pM, el compuesto (7) (DOX-GAL-
20 AF) con la concentración de 10 pM, el compuesto (7) en presencia de ácido fólico con concentraciones respectivas de 10 pM.
[0238] Después del tratamiento, las células han sido enjuagadas con PBS y fijadas con una solución PBS- formaldehído al 3,7 % durante 20 minutos a temperatura ambiente.
25
[0239] Las células fijadas han sido enjuagas con PBS y luego montadas con un medio Vectashield Médium en presencia de DAPI (Victor Laboratories Inc., Abcys, París, Francia) antes de la observación microscópica confocal (FV 1000, Olympus IX-81, Tokio, Japón). Las longitudes de onda de excitación de 405 nm y 488 nm han sido utilizadas respectivamente para la adquisición de las imágenes en azul (450 nm) para el DAPI y en rojo (590 nm)
30 para la doxorrubicina.
[0240] La internacionalización por endocitosis de la doxorrubicina de los compuestos (5) y (7) y del compuesto (7) en presencia de ácido fólico (AF) ha sido seguida por microscopía confocal gracias a la fluorescencia de la doxorrubicina en las células Hela y en las células A549.
35
[0241] Los resultados obtenidos durante este estudio han sido agrupados en la Figura 9.
[0242] Los resultados muestran que el compuesto (7) DOX-GAL-AF se internaliza solo en las células Hela, mientras que la doxorrubicina (DOX) penetra de manera no específica, a través de las membranas de las dos líneas
40 celulares y que el compuesto (5) DOX-GAL no está internalizado en ninguna de las líneas celulares.
[0243] Además, cuando el medio de cultivo ha sido previamente saturado con ácido fólico, la fluorescencia intracelular de la doxorrubicina en las células Hela incubadas en presencia del compuesto (7) DOX-GAL-AF es claramente atenuada.
45
[0244] Todos estos resultados demuestran que el compuesto (7) DOX-GAL-AF permite la internacionalización selectiva y específica de la doxorrubicina en las células diana que expresan el receptor del ácido fólico.
50 Ejemplo 3
Toxicidad del compuesto (7) DOX-GAL-AF
[0245] Para comprobar que a la endocitosis del compuesto (7) DOX-GAL-AF le sucede la liberación del 55 fármaco en el medio intracelular, se han realizado pruebas de proliferación en células Hela y A549 incubadas en
presencia de concentraciones crecientes (de 0 a 1000 nM) de doxorrubicina (DOX), de compuesto (5) (DOX-GAL) y de compuesto (7) (DOX-GAL-AF) durante 4 días.
[0246] Se ha utilizado el kit “cell proliferation kit II” (XTT; Roche) para evaluar la proliferación celular. El kit se
ha utilizado según las recomendaciones del fabricante.
[0247] En resumen, 3x103 células/sumideros han sido introducidos en placas de cultivo 96 y luego en 100 pl de medio.
5
[0248] Las células han sido cultivadas como se ha indicado anteriormente.
[0249] Las células son cultivadas durante 24 horas antes de la adición de los compuestos probados con la concentración indicada.
10
[0250] Después de 4 días de tratamiento, se han añadido 50 pl de una mezcla de marcado XTT al sumidero. Posteriormente, las células han sido incubadas durante 4 horas a 37 °C antes de determinar la absorbancia a 480 nm.
15 [0251] Los resultados, ilustrados por la Figura 3 (A y B) muestran que el compuesto (7) DOX-GAL-AF,
triángulo negro, línea continua, inhibe la proliferación de las células Hela (0,1 pM < IC50 < 0,2 pM) (Figura 3A), aunque no presenta toxicidad para las células A549 (Figura 3B).
[0252] En cambio, el compuesto (5) (DOX-GAL), cuadrado negro, línea continua, es ineficaz en las dos líneas 20 celulares, y la doxorrubicina, círculo negro, inhibe la proliferación de estas dos líneas.
[0253] Para comprobar que la activación enzimática del compuesto (7) DOX-GAF-AF puede efectivamente producirse en el medio celular, las pruebas de citotoxicidad se han repetido en un medio de cultivo previamente suplementado en p-galactosidasa (E. coli) (40 U.mL-1) (líneas curvas discontinuas).
25
[0254] En este caso, el compuesto (7) ejerce una actividad antiproliferativa similar sobre las dos líneas celulares (HeLa expresando el receptor del ácido fólico y A589 no expresando este receptor), la misma actividad antiproliferativa.
30 [0255] La presente invención se refiere, por tanto, a un nuevo brazo autorreactivo, de nuevos profármacos
que comprenden dicho brazo concebidos para tratar selectivamente los tejidos diana. La invención se refiere, en
particular, a nuevos agentes anticancerosos concebidos para destruir selectivamente los tumores sin afectar los órganos sanos.
35 [0256] La presente invención permite, ventajosamente, una mejor orientación terapéutica o de diagnóstico, y
más eficaz, a través del uso de profármacos capaces de ser dirigidos específicamente a las células diana y al microambiente de las células diana.
[0257] Más particularmente, la invención se refiere a nuevos profármacos anticancerosos capaces de orientar
40 por una parte las células tumorales y, por otra parte, el microambiente de las células tumorales.
[0258] La presente invención se refiere también a un procedimiento de síntesis de nuevos profármacos
basados en una reactividad específica del brazo autorreactivo de la invención. El procedimiento de síntesis de la invención permite acceder de manera simple y eficaz a una amplia gama de profármacos de acuerdo con la
45 invención.
[0259] Los profármacos de la invención ventajosamente no tienen ningún efecto con respecto a las células o tejidos no objetivos.
50 Ejemplo 4
Síntesis del vector dendrítico (221)
Preparación del compuesto 227:
55
[0260]
[0261] El carbonato mixto 222 (100 mg, 0,142 mmol) y la anilina 117 (43,6 mg, 0,285 mmol, 2 eq.) son diluidos en 2 mL de DMF. Se agrega en el medio HOBt (19,2 mg, 0,142 mmol, 1 eq.). La solución es agitada durante
5 3 horas a 50 °C. El DMF se evapora luego al vacío. Una purificación por cromatografía flash (50/50, 75/25 AcOEt/EP) permite aislar el producto 227 en forma de espuma blanca con un rendimiento del 98 % (100 mg, 0,139 mmol).
Fórmula bruta: C33H36N2O16 10 M = 716,62 g/mol Rf = 0,5 (AcOEt)
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) 5 (ppm): 2,00 (s, 3H, CH3COO); 2,04-2,1 (m, 7H, 2* CH3COO, H4); 2,17 (s, 3H, CH3COO); 2,65 (sl, 1H, CH2OH); 2,78 (m, 2H, H2); 3,15 (sl, 1H, CH2OH); 4,15 (m, 3H, H5a, H6a); 4,53 (s, 2H, Hc); 4,61 (s, 2H, Hc); 5,09 (m, 2H, H3a, H1a); 5,44 (d, 1H, JH4a-H3a = 3,0 Hz, H4a); 5,51 (dd, 1H, JH2a-H3a = 11,0 Hz, JH2a-H1a = 15 8,0 Hz, H2a); 5,82 (t, 1H, Jhi'-h2' = 6,5 Hz, Hr); 7,09 (d, 1H, Jh3c-h5c = 1 Hz, Hac); 7,18 (d, 1H, Jh5c-h6c = 8,3 Hz, H5c); 7,34 (d, 1H, JH6b-H5b = 8,6 Hz, H6b); 7,58 (d, 1H, JH5b-H6b = 8,6 Hz, H5b); 7,75 (d, 1H, Jh6c-h5c = 8,3 Hz, H6c). 7,88 (s, 1H, Hsb); 8,19 (sl, 1H, NH)
RMN 13C (100 MHz, (CD3)OD) 5 (ppm): 20,5-20,6 (4*OCOCH3); 26,3-26,39 (C2, dia); 61,3 (C6a); 63,9 (Cc); 64,4 (Cc); 66,7 (C4a); 67,9 (C2a); 70,5 (Csa); 71,4 (Caa); 71,9 (C4); 72,9 (Hr); 78,51 (C3); 100,5 (C1a) ; 119,4 (C6b); 121,0 (C6b);
20 123,2-123,4 (C3b dia); 127,5 (C5c); 127,6 (Csc); 129,6 (C4b); 132,0-132,3 (C3b dia); 135,1 (C2b); 136,3-136,4 (C3b dia);
140,9 (C2c); 141,0 (C4c); 149,2-149,0 (C1c dia); 152,7 (C1b); 169,5-170,5 (4*COacetato)
SMHR (ESI): C33H36N2O16Na [M+Na]+ m/z teórico: 739,19625 m/z encontrado: 739,1961 C33H36N2O16K [M+K]+ m/z teórico: 755,17019 m/z encontrado: 755,1684
25 Preparación del compuesto 228:
[0262]
30
[0263] El dialcohol 227 (335 mg, 0,47 mmol), disuelto en 3 mL de DCM se agrega a una solución de
cloroformiato de para-nitrofenilo (376 mg, 1,87 mmol, 4 eq.) y piridina (151,3 pL, 1,87 mmol, 4 eq.) en 6 mL de DCM a 0 °C. Después de agitar durante 1 hora, el producto de reacción bruto se hidroliza con una solución saturada de NaCl y luego se extrae 3 veces en el DCM. El producto de reacción en bruto se purifica por cromatografía flash 35 (eluyente: MeOH/DCM : 0/1 y 1/99) para conducir al compuesto 228 en forma de espuma blanca con un rendimiento
del 89 % (441 mg, 0,42 mmol).
Fórmula bruta: C47H42N4O24 M = 1046,84 g/mol 5 Rf = 0,5 (60/40 : AcOEt/EP)
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) 5 (ppm): 2,02 (s, 3H, CH3COO); 2,06-2,12 (m, 7H, 2* CH3COO, N4); 2,19 (s, 3H, CH3COO); 2,83 (m, 2H, H2); 4,20 (m, 3H, H5a, H6a); 5,12 (m, 2H, H3a, H1a); 5,28 (s, 2H, Hc); 5,34 (s, 2H, Hc); 5,48 (d, 1H, JH4a-H3a = 3,4 Hz, H4a); 5,55 (dd, 1H, JH2a-H3a = 10,0 Hz, JH2a-Hia = 8,0 Hz, H2a); 5,88 (t, 1H, Jhv-hz = 6,5 Hz, Hr);
7,37 (m, 5H, 5H, 4*H2d, H6b); 7,49 (dd, 1H, Jh5c-h6c = 8,3 Hz, Jh5c-h3c = 1,8 Hz, Hbc); 7,51 (d, 1H, Jh3c-h5c = 1,8 Hz, H3c); 10 7,59 (dd, 1H, JH5b-H6b = 8,7 Hz, JH5b-H3b = 1,6 Hz, Hbb); 7,68 (sl, 2H, NHcarbamato); 7,84 (m, 1H, H6c); 7,91 (s, 1H, H3b); 7,26 (m, 4H, 4*H3d)
RMN 13C (100 MHz, CDCh) 5 (ppm): 20,5-20,6-20,7 (4* Cacetato); 26,3 (C2); 61,3 (C6a); 66,7 (C4a); 67,5 (Cc); 67,8
67,8 (C2a dia); 70,0 (Cc); 70,5 (Csa); 71,4 (C5a), 72,0 (C4); 73,3 (C2a); 78,3-78,4 (C3 dia); 100,5-100,6 (C1adia); 119,3119,5 (C6b dia); 121,8 (4*C2d), 123,2 (Cab); 123,3 (C6c); 125,3-125,4 (4*C3d); 130,9 (C5c); 131,7 (Cac); 132,1-132,2
15 (C5b); 134,8-134,8 (2*C4d); 137,0 (C1c); 141,0-141,1 (2*C1d); 145,4 (C4b); 145,6 (C2b); 149,3 (C4c); 152,4 (C2c); 152,6 (C1b); 152,9 (COcarbamato); 155,1-155,4 (2*COcarbonato); 169,3-170,1-170,2-170,3 (4*COacetato)
SMHR (ESI): C47H42N4O24Na [M+Na]+ m/z teórico: 1069,20812 m/z encontrado: 1069,2081 C47H42N4O24K [M+K]+ m/z teórico: 1085,18206 m/z encontrado: 1085,1810
20 Preparación del compuesto 229:
[0264]
25
[0265] El clorhidrato de doxorrubicina (119,7 mg, 0,206 mmol, 2 eq.) es disuelto en 1 mL de DMF. Se agrega
la trietilamina (28,7 pL, 0,206 mmol, 2 eq.) y se pone a agitar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Seguidamente, se añade HOBt (27,8 mg, 0,206 mmol, 2 eq.) y luego una solución de carbonato 228 (108 mg, 0,103 mmol) en 1 mL de DMF. Después de agitar durante 3 horas a temperatura ambiente, el producto de reacción bruto 30 se hidroliza con una solución saturada de NaCl y luego se extrae 4 veces con DCM y 1 vez con AcOEt. Una purificación por cromatografía flash (0/1, 1/24: MeOH/DCM) permite aislar el producto 229 en forma de polvo rojo con un rendimiento del 62 % (119 mg, 0,064 mmol).
Fórmula bruta: C89H90N4O40
35 M = 1854,51 g/mol
Rf = 0,2 (7/93 : MeOH/DCM)
Punto de fusión: descomposición 215 °C
RMN 1H (400 MHz, DMSO-Ó6) 5 (ppm): 1,19 (d, 6H, JH6d-H5d =6,1 Hz, 2*H6d); 1,57-1,61 (m, 2H, H2d); 1,85-1,91 (m, 2H, H2d); 2,01-2,27 (m, 17H, 4* CH3COO, H2', H4', 2*Hse); 2,88-2,98 (m, 6H, 2*H10e, H2); 3,51 (m, 1H, 2*H4d); 3,75 (m,
2H, 2*H3d); 3,97 (2*s, 6H, 2*O]Me); 4,19 (m, 4H, Haa, 2*H5d); 4,53 (t, 1H, JH5a-H6a - 6,1 Hz, H5a); 4,65 (2*s, 4H, 2*Hi4e); 4,74-4,79 (m, 2H, 2*H7e, 4,92-5,09 (m, 7H, 2*Hc, 3*OH); 5,27-5,34 (m, 3H, H2a, H3a, OH); 5,42 (m, 1H, H4a) 5,46 (sl, 1H, OH); 5,48 (sl, 1H, OH); 5,65 (d, 1H, JHia-H2a - 7,1 Hz, H1a); 5,84 (m, 1H, Hr); 6,88 (d, 1H, Jnh-hsj - 7,7 Hz, NHcarbamato); 6,97 (d, 1H, JNH-H3d = 7,7 Hz, NHcarbamato); 7, 25 (d, 1H, JH5c-H6c - 8,4 Hz, H5c); 7,33-7,36 (m, 2H, H6b, H3c); 5 7,45 (dd, 1H, JH5b-H3b - 3,4 Hz, H5b); 7,63 (m, 2H, 2*H1e); 7,80 (d, 1H, Jh6c-h5c - 8,5 Hz, H6c); 7,84
7,92 (m, 4H, 2*H1e, 2*H2e); 7,99 (s, 1H, H3b); 9,32 (sl, 1H, NHcarbamato); 13,24 (2*s, 2H, OHfenoi); 13,97 (2*s, 2H, OHfenol)
RMN 13C (100 MHz, DMSO-d6) 5 (ppm): 16,9 (2*C6d); 20,2-20,3-20,4-20,5 (Cacetato); 25,4 (C2); 29,7 (2*C2d); 32,1 (2*C10e); 36,5 (2*Cse); 47,1 (2*C3d); 56,4-56,4 (OMe); 61,2 (C6a); 63,6 (2*C14e); 64,7 (2*Cc); 66,6 (2*C5d); 67,0-67,610 67,8-69,7-69,8-70,7-73,8-74,9-75,0 (2*C4d, C2a, C3a, C4a, C5a, 2*C7e, Cr, C4', 2*C9e); 79,6 (C3); 98,4 (C1a); 100,3 (2*C1d); 110,4-110,6 (Ccuaternano); 117,5 (C6b); 118,8 (C6c); 119,5-119,9 (2*C3e); 122,5 (Csb); 124,3 (Cac); 127,6 (Cab,
C5c); 130,2 (Ccuaternario); 132,0 (C6c); 133,0-134,4-134,8-135,4-135,5 (Ccuaternario); 136,0 (2*C2e, 2*C1e); 139,9-147,9 (Ccuaternano); 153,2-154,4-155,1-156,0-160,6 (3*COcarbamato, 4*Cfenol); 168,8-169,5-169,8-169,9 (4*COacetato); 186,1186,3 (4*COquinona); 213,7-213,8 (COcetona)
15 SMHR (ESI): Cs9H90N4O40Na [M+Na]+ m/z teórico: 1877,5029 m/z encontrado: 1877,5048 Preparación del compuesto 225:
[0266]
20
[0267] El compuesto protegido 229 (156 mg, 84 |jmol) se disuelve en 6 mL de DCM y 10 mL de MeOH. Se
agrega metanolato de sodio (72,6 mg, 1,34 mmol, 16 eq.) con agitación a -15 °C. Se agita a -10 °C durante 5 horas. 25 Después de la desaparición total del compuesto de partida, el medio es neutralizado con una resina ácida (IRC 50) durante 15 minutos. La mezcla se filtra en algodón, se enjuaga con MeOH y luego se evapora en seco. Una purificación por cromatografía flash (5/95, 10/90 MeOH/DCM) permite aislar el producto 225 (115 mg, 68 jmol) en forma de sólido rojo con un rendimiento del 81 %.
30 Fórmula bruta: C81H82N4O36 M - 1686,47 g/mol Rf - 0,2 (15/85: MeOH/DCM)
Punto de fusión: descomposición 185 °C
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5 (ppm): 1,11 (s, 6H, 2*H6d); 1,22-1,87 (m, 7H, H2', H4', 2*H2d); 1,98-2,21(m, 4H, 35 2*H8e); 2,81-2,96 (m, 4H, 2*H10e); 3,37 (m, 4H, H2a-H3a-H4a-H5a, enmascarado por HOD pico residual del solvente); 3,65 (m, 6H, 2*H3d, 2*H5d, 2*H7e); 3,90 (s, 6H, 2*OMe); 4,13 (m, 3H, 2*H4d, OH); 4,57 (m, 4H, 2*H14e); 4,70 (sl, 2H, 2*OH); 4,85-5,06 (m, 9H, 2*CH2carbamato, Hr, H6a, 2*OH) ; 5,14-5,32 (m, 4H, H1a, 2*H1d, OH), 5,40-5,54 (m, 4H, 4*OH); 6,83 (d, 1 H, JNH-H3d — 8,0 Hz, NHcarbamato); 6,93 (d, 1H, JNH-H3d — 8,0 Hz, NHcarbamato); 7,20 (d, 1H, JH5c-H6c — 10,0 Hz, H5c); 7,25 (s, 1H, H3c); 7,35 (m, 1H, H6c); 7,54 (d, 2H, JHie-H2e - 8,0 Hz, 2*H1e); 7,63 (d, 1H, JH6b-H5b - 8,0 Hz, H6b); 40 7,75-7,90 (m, 6H, H3b, H6b, 2*H2e, 2*H3e); 9,08 (sl, 1H, NHcarbamato); 13,15 (s, 2H, 2*Hfenol); 13,88 (s, 2H, 2*Hfenol)
RMN 13C (100 MHz, DMSO-d6) 5 (ppm): 16,9 (2*C6d); 29,4-31,5 (Cz-2*C2d); 34,3 (2*Cioe); 36,5 (2*Cae); 47,1 (2*C3d);
51,9 (2*C7e); 56,4 (2*COMe); 61,5-63,6-64,7-66,5-67,8 (C6a, Cr, 2*Ci4e, C4); 69,5-71,1-72,7-74,8-74,9-75,1-75,6 (C2a, C3a, C4a, C5a, C3’, CHbencílico, 2*C4d, 2*C9e); 99,7-100,2 (C1a- 2*C1d); 110,4-110,5 (Cuaternario); 116,8 (C6b); 118,7
118,8-119,5-119,7 (2*C1e-2*C3e-Ccuatemario); 124,1-124,4 (C3b-C6c); 127,7-128,0 (C3c-C5c); 130,7 (Ccuaternario); 133,75 133,8-134,4-134,9-136,0 (C5b-2*C2e-Ccuatemario); 139,8 (Ccuaternario); 148,6 (Ccuaternario); 153,9-154,4-155,1-155,2-156,0 (Ccuaternario, 3*COcarbamato, 4*Cfenol); 186,0-186,2 (4*COquinona); 213,8 (2*COcetona)
SM (ESI): [M+Na]+ m/z = 1710,49
SMHR (ESI): C81Hs2N4O36Na [M+Na]+ m/z teórico: 1709,4601 m/z encontrado: 1709,4601 C81H82N4O36Na2 [M+2Na]++ m/z teórico: 866,22466 m/z encontrado: 866,222 (z=2)
10
Preparación del compuesto 221:
[0268]
15
[0269] El compuesto 225 (30,0 mg, 17,7 |jmol) se disuelve en una mezcla de 700 |jl de DMSO. Se agrega el
compuesto de folato 223 (11,4 mg, 17,7 jmol), el sulfato de cobre (2,2 mg, 8,9 jmol, 0,5 eq.) y 300 mL de una solución de ascorbato de sodio (3,5 mg, 17,7 jmol) en un tampón de fosfato pH 7 0,2M. Después de agitar durante 20 una noche a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se disuelve en metanol y luego se vierte en éter dietílico enfriado. El precipitado se filtra y luego se descompone con EDTA.2Na (41,2 mg, 4 eq.) en 1 mL de un tampón de fosfato pH 7 0,2M. Después de agitar durante dos horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se disuelve en etanol y luego se vierte en éter dietílico enfriado. Después de la filtración, se obtiene el producto 221 (11 mg, 4,7 jmol) en forma de polvo rojo. Una purificación por CLHP semipreparativa permite obtener el compuesto 221 en 25 forma de 4 isómeros con una pureza del 89 %.
Fórmula bruta: C108H117N15O44 M = 2327,73 g/mol
SMHR (ESI): C108Hn7N15O44Na [M+Na]+ m/z teórico: 2350,7277 m/z encontrado: 2350,7279 30
Ejemplo 5
Toxicidad del vector dendrítico (221
35 [0270] La eficacia del vector dendrítico (221) ha sido comparada a la del compuesto (7) DOX-GAL-AF y a la
de la Doxorrubicina sola en una línea de células cancerosas LAM de tipo KG-1.
[0271] Se han colocado 3x103 células/sumideros en placas de cultivo 96 y luego en 100 jl de medio Iscove modificado de Dulbecco suplementado con un 20 % de suero de ternero fetal (InVitrogen) y 1 % de
40 penicilina/estreptomicina, a 37 °C en una atmósfera al 5 % de CO2. Las células se cultivan durante 24 horas antes de añadir compuestos probados.
[0272] Las células son incubadas en presencia de concentraciones crecientes (de 0 a 2000 nM) de doxorrubicina (DOX), de compuesto (7) (DOX-GAL-AF) y de vector dendrítico (221) durante 4 días.
[0273] Después de 4 días de tratamiento, se ha probado la viabilidad de las células con el kit “Cell Proliferation Kit II” (XTT; Roche), utilizado según las recomendaciones del fabricante, mediante la adición de 50 pl de una mezcla de marcado XTT por sumidero. Esta prueba se basa en la segmentación del XTT mediante las células metabólicamente activas, lo que resulta en la producción de una sonda formazán naranja, que se puede cuantificar
5 por espectrofotometría.
[0274] Las células han sido incubadas nuevamente durante 3 horas adicionales, a 37 °C, antes de medir la absorbancia en 480 nm. Los valores de CI50 se han determinado gráficamente.
10 [0275] Los resultados, ilustrados en la Figura 5 muestran que el vector dendrítico (221) (cuadrado) reduce la
viabilidad de las células LAM de tipo KG 1 de un factor de alrededor de 4 a 5 veces superior que el compuesto (7) (triángulo) (0,1 pM < IC50 < 0,15 pM vs IC50 = 0,5 pM) (Figura 5) y es casi equivalente al de la Doxorrubicina (círculo).
15 [0276] El vector dendrítico (221) comprende dos moléculas de doxorrubicina para un solo ligando selectivo
(ácido fólico). Con respecto al compuesto (7), este vector puede conducir a la liberación de una cantidad de fármaco en el interior de las células diana o en el microambiente tumoral dos veces superior. Por lo tanto, gracias al aumento de la proporción [número de fármacos liberados/número de ligandos selectivos] el vector dendrítico (221) es más eficaz en células cancerosas que expresan el receptor de ácido fólico. Además, el aumento de la proporción [número
20 de fármacos liberados/número de sustratos enzimáticos] permite obtener una actividad citotóxica superior sin modificar el número de eventos enzimáticos.
Claims (13)
- REIVINDICACIONES1. Compuesto de fórmula general (I):5
imagen1 en la que:- X representa OH, NH2, NHOH o R'NH con R' pudiendo representar un radical alquilo en C1 a C10, lineal o 10 ramificado, saturado o insaturado,- Y representa un grupo electroatractor elegido entre NO2, CF3 o un halógeno,- R1 y R2 representan, independientemente uno del otro, H o un radical alquilo en C1 a C10, lineal o ramificado, saturado o insaturado,- F representa una función reactiva activable por química clic.15 - 2. Compuesto según la reivindicación anterior, en el que X representa OH.
- 3. Compuesto según la reivindicación 1 o 2, en el que Y representa NO2, preferentemente en posiciónorto con respecto a X.20
- 4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R1 y R2 representan H.
- 5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que F representa -C=CR”', -N3, -SH, -C=CH2, ciclooctinas, maleimida, -SO2N3 o -COSR”', con R”' representando H o un radical alquilo, lineal o25 ramificado, saturado o insaturado, en C1 a C10.
- 6. Compuesto de fórmula general (II):30en la que:
imagen2 - R1 y R2 son como se ha definido en las reivindicaciones 1 a 5,- Y representa H o un grupo electroatractor, elegido en particular entre NO2, CF3 o un halógeno,- X' representa O, NH, NOH, R'N con R' siendo como se ha definido en la reivindicación 1,- E representa un grupo lábil sustrato de una enzima elegida entre glucuronidasas, glicosidasas, proteasas, peptidasas y metaloproteasas,5 - A representa O, S, NH, NR” con R” representando un grupo alquilo en C1 a C10, lineal o ramificado, saturado o insaturado y preferentemente puede representar NH,- D representa un compuesto activo que puede ser utilizado en terapia o diagnóstico,- n = 0 o 1, y Z puede representar un grupo alquileno, lineal o ramificado, saturado o insaturado, en C1-C10, opcionalmente interrumpido por uno o varios heteroátomos elegidos entre O o N, un grupo glicosilo, un grupo O-10 (CHR3-CHR4-O-)m en los que m es un número entero natural que varía de 1 a 20, R3 y R4 son, independientemente uno del otro, H o CH3, siempre que R3 y R4 simultáneamente no sean CH3, un grupo derivado de un aminoácido o de un péptido o una combinación de estos grupos,- L representa un ligando selectivo elegido entre un péptido, una proteína, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que reconoce un antígeno, un ligando de un receptor celular, un biopolímero, un monosacárido, un15 oligosacárido, una hormona, una vitamina, un dendrímero, una poliamina o una nanopartícula,- G representa un grupo resultante de una reacción de química clic entre un grupo F, como se ha definido en la reivindicación 1 y un grupo x-(Z)n-L en el que Z y L son como se ha definido anteriormente y x representa una función reactiva activable por química clic capaz de reaccionar con F20 o una de sus sales farmacéuticamente aceptables. - 7. Compuesto según la reivindicación 6, en el que Y representa NO2 en posición orto de X' y R1 y R2representan H.25 8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, en el que el grupo lábil E es un sustrato dela p-glucuronidasa.
- 9. Procedimiento de preparación de un compuesto como se ha definido según cualquiera de lasreivindicaciones 6 a 8, consistente en hacer reaccionar un compuesto de fórmula general (I):30
imagen3 en la que:35 - X representa OH, NH2, NHOH o R'NH con R' pudiendo representar un radical alquilo en C1 a C10, lineal o ramificado, saturado o insaturado,- Y representa H o un grupo electroatractor, elegido particularmente entre NO2, CF3 o un halógeno,- R1 y R2 representan H o un radical alquilo en C1 a C10, lineal o ramificado, saturado o insaturado,- F representa una función reactiva activable por química clic,40con grupos D-v, E-w y L-(Z)n-x, en los que D, E y L y Z son como se ha definido en las reivindicaciones 6 u 8 y v, w y x son cada uno una función reactiva de manera que, con respecto al compuesto de fórmula general (I), v reacciona con OH unido al carbono bencílico o dicho OH previamente activado, w reacciona con X y x reacciona con F.45 10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que v es elegido entre NH2, NHR”, OH o SH, con R”siendo como se ha definido en la reivindicación 6. - 11. Procedimiento según la reivindicación 9 o 10, en el que w es elegido entre un radical halógeno, en particular Cl o Br, y en particular Br, -COOH o -OC(O)Cl.
- 12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 en el que x y F son elegidos entre los 5 pares de funciones reactivas activables en química clic siguientes, (-N3, -CeCR’”), (-Sh, -C=CH2), (-N3, ciclooctinas),(-SH, maleimida), (-SO2N3, -COSR”'), con R”' representando H o un radical alquilo, lineal o ramificado, saturado o insaturado, en C1 a C10 y en particular en C2 a C6, o incluso C3 o C4.
- 13. Compuesto o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, capaz de ser obtenido según el 10 procedimiento como se ha definido según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.
- 14. Composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende al menos una cantidad eficaz de al menos un compuesto de fórmula general (II) como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 y 13 o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.15
- 15. Kit para la preparación de un compuesto de fórmula general (II) como se ha definido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 y 13 o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, que comprende al menos un compuesto de fórmula general (I):20
imagen4 en la que:- X representa OH, NH2, NHOH o R'NH con R' pudiendo representar un radical alquilo en C1 a C10, lineal o 25 ramificado, saturado o insaturado,- Y representa H o un grupo electroatractor, particularmente elegido entre NO2, CF3 o un halógeno,- R1 y R2 representan H o un radical alquilo en C1 a C10, lineal o ramificado, saturado o insaturado,- F representa una función reactiva activable por química clic,30 y al menos un grupo elegido entre D-v, E-w y L-(Z)n-x, en los que L, Z, n, D y E son como se ha definido en las reivindicaciones 6 a 8 y v, w y x son como se ha definido en las reivindicaciones 9 a 12, el compuesto de fórmula general (I) y el grupo elegido entre D-v, E-w y L-(Z)n-x estando condicionados por separado.
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