ES2664576T3 - Un método y un kit para la detección de anticuerpos anti-beta-amiloides - Google Patents

Abstract

Un método in vitro para la cuantificación de anticuerpos anti-proteína beta-amiloide en una muestra de líquido cefalorraquídeo que comprende los siguientes pasos: a) concentrar la cantidad de dichos anticuerpos de dicha muestra con microperlas magnéticas recubiertas con macromoléculas capaces de unirse a dichos anticuerpos; b) analizar la muestra concentrada obtenida en la etapa a) mediante ensayo inmunoenzimático o mediante radioinmunoensayo; c) analizar una muestra que comprende anticuerpos anti-proteína beta-amiloide que tiene un título conocido con el mismo ensayo utilizado en la etapa b) y elaborar la curva de calibración relacionada, donde dicho anticuerpo que tiene un título conocido es un anticuerpo murino perteneciente a la clase IgG2a o IgG2b o un anticuerpo humano o humanizado que pertenece a la clase IgG2b o IgG1 en donde dicha etapa de concentración a) comprende una etapa de absorción de dicha muestra de fluido cerebroespinal sobre dichas microperlas y una etapa de elución de dichos anticuerpos a partir de dichas microperlas; dicho paso de análisis b) comprende los siguientes pasos: I) proporcionar una fase sólida recubierta con proteína beta-amiloide y/o isoformas de la misma; II) incubar dicha fase sólida con el material concentrado obtenido de la etapa a) permitiendo de este modo la unión de dichos autoanticuerpos a la proteína beta-amiloide en dicha fase sólida, seguido de enjuague para eliminar el material no unido; III) incubar la fase sólida obtenida en la etapa II) con una proteína conjugada con una enzima, o un marcador radioactivo capaz de unirse a anticuerpos humanos, seguido de enjuague para eliminar dicha proteína conjugada no unida; IV) detectar la señal de dicha proteína conjugada.

Description

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comprendiendo dicho método opcionalmente también una o más etapas en donde para cada una de dichas muestras la concentración de uno o más marcadores de daño endotelial, como, por ejemplo, de TFPI, se determina de acuerdo con métodos estándar aplicados al CSF como se describe aquí.

Todo lo que se ha descrito anteriormente en relación con el método de cuantificación de anticuerpos anti-proteína beta-amiloide en muestras de líquido cefalorraquídeo y de uno o más marcadores de daño endotelial (como por ejemplo, del TFPI) se aplica al método de terapia y/o (pronóstico) de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1 Procedimiento para concentración con microperlas magnéticas

1) Lavar dos veces con PBS, pH 7.4, + 0.02% Tween, 75 µl de microperlas magnéticas conjugadas con proteína A (Invitrogen Dynal AS Dynabeads® proteína G) para cada muestra por analizar; 2) añadir a las microperlas magnéticas lavadas un volumen de muestra comprendido entre 200 y 500 µl de CSF de

un paciente e incubar bajo agitación durante 40 minutos a temperatura ambiente;

3) colocar las microperlas magnéticas en el imán durante 2 minutos; opcionalmente almacenar sobrenadante en otro tubo de ensayo (actuará como control de la eficiencia del proceso); 4) retirar del imán y lavar con 500 µl de regulador de citrato-fosfato, pH 5 + 0.02% de Tween, repetir dos veces; 5) luego proceder con la fase de elución, agregando 30 µl de citrato 0.1M a pH 3.1 a las microperlas magnéticas; 6) agitar durante 2 minutos; 7) colocar el tubo en el imán durante 1 minuto e inmediatamente transferir el sobrenadante a un tubo de ensayo

limpio (tubo de polipropileno de baja afinidad Eppendorf) que contenga 40 µl de Tris Base 1M, pH 9 (solución reguladora); 8) repetir los pasos 5), 6) y agregar el eluido al mismo tubo de ensayo utilizado en 7) (volumen total: 100 µl); 9) usar los 100 µl completos de eluido para el ELISA. Ejempo 2 Recubrimiento de la microplaca con proteína Abeta42

1) disolver la proteína Abeta42 en regulador Tris Base 1 M, pH 9, a una concentración de 1 µg/µl; 2) preparar una solución de recubrimiento de Abeta en NaHCO3 50 mM, pH 9.6, a una concentración de 0.01 µg/µl;

3) someter a sonicación durante 1 minuto en hielo, esperar 1 minuto, someter a sonicación nuevamente durante 1 minuto; 4) agregar 100 µl de una solución de recubrimiento por pozo de la placa ELISA (concentración final: 1 µg/µl); 5) incubar durante la noche.

Ejemplo 3 dosificación inmunoenzimática 1) el día siguiente al recubrimiento realizado como se describe en el ejemplo 2, llevar a cabo 3 lavados con PBS + Tween al 0.05% (PBST), 200 µl/pozo;

2) realizar bloqueo para excluir unión específica, mediante el uso de una solución compuesta de 5% de suero y 1% de BSA en PBST, 1.5 h a temperatura ambiente bajo oscilación;

3) repetir el paso de lavado descrito en 1); 4) agregar 100 µl de la solución que contiene el anticuerpo primario 4G8 (dirigido hacia la porción de aminoácidos 17-24 de la proteína Abeta), para construir la curva estándar. Los estándares se llevan a cabo mediante diluciones en serie del anticuerpo primario. El rango sugerido para la curva estándar para la dosificación de anticuerpos en el CSF es de 0.24 a 0.03 µg/ml. En los pozos que se utilizarán como blanco, agregar solo 100 µl de PBS. Además, se proporciona un blanco adicional para eluidos, que comprende 60 µl de citrato 0.1 M, pH 3.1, más 40 µl de Tris Base 1M, pH 9.

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Como sujetos de control para la presencia de angiopatía amiloide cerebral, pero sin signos de neuroinflamación, se recolectó CSF de 8 pacientes con CAA no inflamatoria (diagnosticada según los criterios de Boston, Knudsen 2001). Como grupo de control de enfermedad autoinmune e inflamatoria, pero relacionada con CAA, incluimos 14 pacientes sin tratamiento previo con esclerosis múltiple (EM), con bandas oligoclonales positivas (OCB +), diagnosticadas según los criterios de McDonald's. Como controles no CAA, no inflamatorios, incluimos 25 CSF provenientes de 12 sujetos con hidrocefalia de presión normal y 13 pacientes con trastorno de conversión.

Modos de recolección de CSF y dosificación de AB40, AB42, tau y P-181

Todos los CSF se recogieron por punción lumbar a nivel vertebral L4/L5 o L3/L4, divididos en alícuotas de 0.5 ml cada uno en tubos de polipropileno y se almacenaron inmediatamente a -20°C hasta el momento del análisis. Se evaluaron el recuento de células presentes en el CSF, glucosa y proteínas totales. Las concentraciones de Aβ40, Aβ42, tau y P-181 tau se evaluaron mediante kits de ELISA comerciales (Millipore e Innogenetics, respectivamente), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Dosificación de autoanticuerpos anti-Aβ

Para la dosificación de autoanticuerpos, se usó el método in vitro para la cuantificación de anticuerpos anti-proteína beta-amiloide en una muestra de fluido cerebroespinal descrito en este documento. Mediante dicho método, se evaluó la concentración de anticuerpos producidos de forma natural contra Aβ mediante preenriquecimiento con perlas magnéticas y posterior dosificación de anticuerpo con el método ELISA. Para aumentar la sensibilidad de la técnica ELISA, las muestras se concentraron mediante pretratamiento con perlas magnéticas, con el fin de enriquecer el contenido total de IgG. En resumen, se incubaron aproximadamente 200-300 µl de CSF con perlas magnéticas conjugadas con proteína G (Dynebeads Protein G) durante 40 min, bajo agitación continua a temperatura ambiente (rt), y se eluyeron mediante ligera acidificación con citrato 0.1 M (pH 3.1). Después del enriquecimiento magnético, los eluidos se analizaron directamente mediante nuestro novedoso método ELISA. Los pozos de una placa de 96 pozos se recubrieron con Aβ42 (Phoenix Pharmaceuticals, Belmont CA, USA), 1 pg/pozo, se disolvieron en regulador de carbonato 50 mM (pH 9.6) a 4°C, durante la noche. La placa se lavó después con PBS/ Tween 20 al 0.05% (PBST), se bloqueó con FCS al 5%, BSA al 1% en PBST durante 90 minutos, a temperatura ambiente, y se lavó de nuevo. Para la generación de la curva estándar, se utilizó un anticuerpo antiAβ42 humano, producido en ratón y selectivo para el N-terminal de Abeta (clon 4G8, Covance), en diferentes concentraciones, mediante diluciones en serie (0,4 µg/ml a 0.03). ug/mL). Después de cargar las muestras y los patrones, la placa de ELISA se incubó durante la noche, a 4°C. Al día siguiente, los pozos se lavaron con PBST y se incubaron durante 2 horas con proteína A conjugada con HRP (Millipore), a temperatura ambiente. Luego, la placa se lavó de nuevo con TBST y se incubó durante 10 min con TMB, en la oscuridad. Después de la adición de la solución de extinción, se leyó la absorbancia a 450 nm usando un lector de microplacas (BIORAD Modelo 550). La concentración de autoanticuerpos se extrapoló a partir de la curva estándar.

Todas las muestras se analizaron a ciegas, sin que el operador conociera el diagnóstico. Como control de calidad del proceso de enriquecimiento con perlas magnéticas, se analizaron todos los sobrenadantes (descartes de proceso) para confirmar el agotamiento total de IgGs por las perlas. La especificidad de ELISA hacia el Aβ humano se verificó mediante la exclusión de la reactividad cruzada hacia el péptido Aβ1-42 codificado (ANASPEC, Fremont, CA, USA), Mediante el recubrimiento de 1µg de péptido. La recuperación de anticuerpos anti-Aβ en la matriz de CSF se evaluó mediante la prueba de adición de diferentes concentraciones del anticuerpo comercial 4G8 a las diferentes concentraciones utilizadas para generar la curva estándar del ELISA, obteniendo una recuperación del 98%. La precisión intraensayos demostró ser 3.3% del Coeficiente de Variación (CV); la precisión interensayo demostró ser del 3.7% del CV.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se llevó a cabo con el software GraphPad-Prism (Prism 3.0, GraphPad Software, Inc.). Para evaluar las diferencias intergrupales, se utilizó la prueba de análisis de varianza unidireccional, seguida por la prueba de comparación múltiple de Tukey, o se utilizó una prueba t no aparejada para el análisis de grupos de datos que pasaron una prueba de normalidad. Se utilizó una prueba t pareada para evaluar las diferencias en la concentración de anticuerpos antes y después de la remisión clínica. Los valores con p <0.05 se consideraron significativos. Las variables continuas se expresan como media ± desviación estándar (MEAN±SD).

8.2 Resultados, características de los pacientes y análisis histopatológico

La edad fue comparable entre los diferentes grupos de sujetos: controles sanos (59.0 años ± 20.0), CAA (59.6 años ± 11.4), EM (52.5 años ± 12.2), CAA-ri (68.5 años ± 5.6). El número de Hombres/Mujeres resultó ser: controles sanos 12/13, CAA 5/3, MS 11/3, CAA-ri 3/7.

Un análisis sociodemográfico de pacientes con CAA-ri se presenta en la Tabla 1, mientras que las características clínicas y el tratamiento farmacológico adoptado de cada paciente con CAA-ri se presentan a continuación:

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Caso 1: trastorno conductual progresivo y demencia. Se trató con metilprednisolona 1 g/día durante 5 días, con un leve beneficio.

Caso 2: declive cognitivo progresivo y ataques generalizados. Se trató con metilprednisolona, 1 g/día durante 5 días 5 y posteriormente 1 g/semana durante 7 semanas, con una mejoría clínica moderada.

Caso 3: pérdida progresiva de memoria y trastorno del estado de ánimo. Se trató con dexametasona 24 mg /día durante 20 días, con una mejora clínica notable, como se describió previamente.

10 Caso 4: hemiparesia y desorientación izquierdas rápidas y progresivas. Se trató con dexametasona 24 mg /día durante 1 mes, posteriormente se suspendió debido a la aparición de neumonía. Falleció a partir de entonces debido a complicaciones infecciosas.

Caso 5: Hemisíndrome progresivo del lado izquierdo con ataques homolaterales parciales. Inicialmente tratado 6 15 veces con metilprednisolona, 1 g/día durante 3 días, seguido de terapia oral con metilprednisolona. Marcada mejora clínica como se informó anteriormente.

Caso 6: deterioro cognitivo progresivo y confusión mental. Remisión espontánea de los síntomas sin ningún tratamiento farmacológico.

20 Caso 7: declive cognitivo transitorio leve. Remisión espontánea de los síntomas sin ningún tratamiento farmacológico.

Caso 8: confusión mental transitoria. Remisión espontánea de los síntomas sin ningún tratamiento farmacológico.

25 Caso 9: confusión mental transitoria y ataques generalizados. Se trató con prednisona 80 mg/día durante 10 días, con remisión de los síntomas.

Caso 10: deterioro cognitivo progresivo y parkinsonismo. Se trató con dexametasona 12 mg/día durante 15 días y 30 luego se redujo progresivamente durante otras 2 semanas, sin mejoría significativa.

Tabla 1. Características sociodemográficas y clínicas de los pacientes de CAA-ri.

Paciente #

Género (M/F) Edad (a.o.) APOE País Tratamiento rpCAA-ri recolección CSF

1

F 68 ε3/ε4 Brasil I.V: esteroide Si

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M 62 ε3/ε3 Brasil I.V: esteroide Si

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M 68 ε4/ε4 Italia I.V: esteroide Si

4

F 76 No probado Italia I.V: esteroide Si

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M 56 ε3/3ε Japón I.V: esteroide Si

6

M 71 ε3/3ε Italia Sin tratamiento Si

7

M 72 ε4/ε4 Italia Sin tratamiento No

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F 72 ε3/3ε Italia Sin tratamiento Si

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M 71 ε4/ε4 Italia Esteroides orales No

10

M 67 ε4/ε4 Italia I.V: esteroide No

APOE, apolipoproteína E; a.o., edad al inicio de la enfermedad; rpCAA-ri, paciente con angiopatía amiloide cerebral en fase de remisión.

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realizado solo en casos clínicos individuales, y la dosis de la concentración de anticuerpos anti-Aβ que se han realizado con métodos antiguos sujetos a amplios márgenes de error.

También se han avanzado recientemente especulaciones similares en AD, aunque incluso en esta patología la dosificación de autoanticuerpos anti-Aβ ha conducido a resultados escasos y contradictorios, restringidos principalmente a nivel plasmático, solo debido a dificultades técnicas experimentales en la dosificación de anticuerpos en el CSF. En realidad, la dosificación de autoanticuerpos anti-Aβ en pacientes con AD ha demostrado ser reducida para algunos autores, no variada para otros, e incluso aumentada en otro estudio. Como se mencionó, el principal problema de estos resultados contradictorios se debió a la muy baja concentración de estos anticuerpos en el CSF humano, además de los problemas relacionados con el diseño y el poder de los estudios citados anteriormente.

Gracias al método descrito aquí para la concentración y dosificación de anticuerpos, logramos por primera vez confirmar una implicación directa de estos anticuerpos anti-Aβ durante el transcurso de CAA-ri, en un registro de casos compuesto por 10 pacientes. Además, demostramos que la concentración de anticuerpos aumentó durante la fase aguda de la enfermedad, en comparación con los sujetos control sanos, los sujetos con MS y los pacientes con CAA no inflamatoria, hasta alcanzar niveles que pueden considerarse "normales", es decir, comparables a lo que está presente en los controles, durante las fases de remisión clínica y radiológica.

Además, siguiendo la evolución en el tiempo de los anticuerpos anti-Aβ durante el tratamiento con esteroides, demostramos una disminución de los mismos no solo después de la terapia, sino también después de una remisión espontánea, como evidencia adicional de un papel específico del aumento de la concentración de anticuerpos antiAβ en la determinación de la fase aguda de la enfermedad. Esto es particularmente relevante, ya que podríamos demostrar definitivamente que este evento no es secundario a un efecto específico del tratamiento farmacológico, sino que se correlaciona estrictamente con la progresión de la enfermedad. Esta evidencia está respaldada además por la ausencia de un aumento de anticuerpos anti-Aβ en pacientes que padecen una enfermedad autoinmune e inflamatoria no relacionada con CAA, representada por OCB+MS.

En general, los datos divulgados aquí apoyan firmemente la idea de que la patogénesis de CAA-ri es causada por un proceso autoinmune específico hacia la proteína Aβ, directamente mediada por autoanticuerpos anti-Aβ.

El mismo mecanismo patogénico podría ser fundamental en la determinación del edema vasogénico reversible que se puede encontrar en alrededor del 5-10% de los pacientes con AD incluidos en los ensayos clínicos con el anticuerpo monoclonal dirigido contra Aβ, denominado bapineuzumab, efectos adversos que incluso conllevaron interrupción de los protocolos terapéuticos en curso. En consecuencia, las evidencias recientes obtenidas mediante estudios de IRM con las secuencias denominadas ARIA-E (anomalías radiológicas relacionadas con amiloide (imagen) sugestivas de edema vasogénico), destacaron que hasta el 17% de los pacientes tratados con bapineuzumab muestran signos de VE, incluso en ausencia de correlaciones clínicas y en conexión directa con la dosis terapéutica y la presencia del factor de riesgo vascular APOE ε4.

En apoyo, Schroeter et al. demostró además que la inmunización pasiva en ratones PDAPP está estrictamente relacionada con la incidencia de microhemorragias, limitada a la deposición focal de Aβ a nivel perivascular. Parece claro cómo este fenómeno podría estar estrechamente relacionado con el grado de CAA, y modulado (y modulable) por la concentración de la dosis de anticuerpos anti-Aβ. Esto podría significar que una modulación adecuada de la concentración de anticuerpos administrados anti-Aβ, capaz de mantener sus concentraciones dentro de valores que pueden considerarse "seguros", podría eliminar o al menos retrasar drásticamente la deposición de Aβ a nivel cerebral y cerebrovascular, sin incurrir en los efectos adversos enumerados, como VE (ARIA) y daño endotelial.

Además, se destacó un efecto patogénico compartido por AD y CAA por la eliminación demostrada de la proteína Aβ del SNC de pacientes con AD durante los ensayos clínicos con bapineuzumab, lo que sugiere un drenaje masivo de Aβ desde la forma depositada y/o vascular del parénquima a la forma en circulación, particularmente durante las primeras fases del tratamiento y antes de una desaparición completa de las placas amiloides. Esto está perfectamente en línea con lo que observamos en pacientes que sufren de CAA-ri, donde los niveles circulantes de Aβ40 y Aβ42 demostraron ser comparables a los detectables en controles sanos y sujetos apCAA-ri, mientras que dichos niveles vuelven a reducirse significativamente en la remisión fases de la enfermedad, hasta alcanzar incluso las concentraciones normalmente detectables en pacientes con AD. Del mismo modo, los marcadores para la degeneración axonal (tau y P-181 tau) se incrementaron en CAA-ri, junto con el aumento espectacular de los autoanticuerpos anti-Aβ, seguidos por un retorno dentro del rango de controles sanos en rpCAA-ri. Esto demuestra definitivamente que los anticuerpos anti Aβ no son simplemente los principales actores durante la fase aguda de CAA-ri, sino que el aumento de los niveles de Aβ40 y Aβ42 en el CSF parece ser el mecanismo por el cual actúan dichos anticuerpos, eliminando Aβ de las placas y/o los vasos, un mecanismo que, sin embargo, está respaldado por las fuertes correlaciones detectables entre los niveles de proteína amiloide y de los propios anticuerpos. Por otra parte, la alta prevalencia de pacientes portadores de haplotipo APOE ε4 refuerza aún más la mayor susceptibilidad de estos pacientes hacia la predisposición al daño endotelial, como se describió previamente también para la AD.

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