ES2659946T3 - Método para la producción mejorada de proteínas en hongos filamentosos - Google Patents

Método para la producción mejorada de proteínas en hongos filamentosos Download PDF

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Abstract

Un método para modificar genéticamente un hospedador Trichoderma para aumentar la producción de proteínas o la actividad de CBHI, EGI o xilanasa, que comprende modificar genéticamente el hospedador para sobreexpresar el gen tre122523 que tiene la SEQ ID NO: 4 o una región codificante del gen o una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con dicho gen, siendo capaz dicho hospedador de una producción aumentada de CBHI, EGI o xilanasa en comparación con la cepa parental.

Description

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productos proteicos. La cepa hospedadora es preferentemente una cepa recombinante modificada mediante medios tecnológicos génicos para producir de forma eficaz un producto de interés. El hospedador fúngico puede pertenecer, por ejemplo, al género Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Neurospora, Talaromyces, Phanerochaete, Chrysosporium o Penicillium. Normalmente, el hospedador es un hospedador Trichoderma o Aspergillus.
El “homólogo más cercano de un gen de Trichoderma” en otras especies de hongos filamentosos significa en este caso un gen que tiene el porcentaje más alto de nucleótidos idénticos con el gen de Trichoderma entre todos los genes del organismo o un gen cuya producción de proteínas tiene el porcentaje más alto de aminoácidos idénticos con el producto proteico que codifica el gen de Trichoderma entre todos los productos génicos del organismo. La identidad de secuencia de genes reguladores homólogos en distintos organismos es normalmente muy baja. Normalmente, los sitios de unión a ADN u otros factores proteicos implicados en los acontecimientos de regulación comparten homología, pero las secuencias intermedias entre estos sitios pueden no estar conservadas. Por lo tanto, el % total de identidad de secuencia de los genes reguladores homólogos en distintos organismos sigue siendo muy bajo. Sin embargo, el porcentaje de identidad de secuencia en la secuencia de nucleótidos alineada puede utilizarse como una medida para identificar el homólogo del gen más cercano en el otro organismo, por lo tanto un probable equivalente funcional del gen en el otro organismo. Existen programas informáticos y algoritmos para las búsquedas de homología, así como bases de datos públicas con la información de secuencias genómicas completas para una diversidad de especies, tal como el programa BLAST (Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller y David J. Lipman (1997), “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs”, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Reference for compositional score matrix adjustment: Stephen F. Altschul, John C. Wootton, E. Michael Gertz, Richa Agarwala, Aleksandr Morgulis, Alejandro A. Schaffer y Yi-Kuo Yu (2005) “Protein database searches using compositionally adjusted substitution matrices”, FEBS J. 272: 5101-5109) y la base de datos del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov /sutils/genom_table.cgi?organism=fungi).
Un “gen” específico está representado en este caso por una secuencia específica (SEQ ID NO)”. El efecto del gen se ha demostrado utilizando la secuencia de una SEQ ID NO específica (que es en este caso una secuencia de Trichoderma). La secuencia puede comprender una secuencia adicional por delante y/o por detrás de la región codificante del gen. Como se describe en este caso, en lugar de la secuencia de Trichoderma podría utilizarse el homólogo más cercano de otro hongo filamentoso. Como sabe un experto en la materia, también podrían utilizarse secuencias que hibridan en condiciones rigurosas con la secuencia de Trichoderma o con su homólogo más cercano, en las que condiciones rigurosas se refiere en este caso a una incubación durante una noche a 42 grados C en una solución que comprende formamida al 50 %, SSC 5x (NaCl 750 mM, citrato trisódico 75 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5x, sulfato de dextrano al 10 % y ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado 20 μg/ml, seguido del lavado de los filtros en SSC 0,1 x a aproximadamente 65 grados C.
Los métodos de detección de la actividad de celulasa, la actividad de CBHI o la actividad de EGI son bien conocidos para los expertos en la materia. Los métodos se describen, por ejemplo, en Bailey y Tähtiharju, 2003; Collen et al., 2005; van Tilbeurgh et al., 1982, 1985, 1988. Collén, A., Saloheimo, M., Bailey, M., Penttilä, M. y Pakula, T. M. (2005) Protein production and induction of the unfolded protein response in Trichoderma reesei strain Rut-C30 and its transformant expressing endoglucanase I with a hydrophobic tag. Biotech. Bioeng. 89, 335-344. Bailey MJ, Tähtiharju J. 2003. Efficient cellulose production by Trichoderma reesei in continuous cultivation on lactose medium with a computer-controlled feeding strategy. Appl Microbiol Biotechnol 62:156-62. van Tilbeurgh H, Claeyssens M, de Bruyne C. 1982. The use of 4-methylumbelliferyl and other chromophoric glycosidases in the study of cellulolytic enzymes. FEBS Lett 149: 152-156. van Tilbeurgh H, Loontiens FG, de Bruyne CK, Claeyssens M. 1988. Fluorogenic and chromogenic glycosides as substrates and ligands of carbohydrates. Methods Enzymol 160: 45-59. van Tilbeurgh H, Pettersson G, Bhikabhai R, De Boeck H, Claeyssens M. 1985. Studies of the cellulolytic system of Trichoderma reesei QM 9414. Reaction specificity and thermodynamics of interactions of small substrates and ligands with the 1,4-beta-glucan cellobiohydrolase II. Eur J Biochem 148: 329-34.
El patrón de proteínas producidas para los genes reguladores puede analizarse más en detalle en los cultivos de las cepas modificadas utilizando un conjunto más amplio de mediciones de la actividad enzimática específico para distintas enzimas. Además, el patrón de proteínas producidas puede analizarse utilizando electroforesis en gel 2D seguido de la identificación de las proteínas por espectrometría de masas. El análisis en gel 2D puede revelar también diferencias cuantitativas en los patrones de proteínas producidas entre los cultivos de las distintas cepas. Esta información puede revelar conjuntos específicos de proteínas producidas que están afectados por la modificación genética específica. Además, pueden construirse cepas genéticamente modificadas adicionales para tener la capacidad de analizar los efectos de la sobreexpresión y la deficiencia (normalmente deleción) del gen, y por revelar por estos medios los genes diana y las proteínas cuya función está afectada por la modificación del gen, y para demostrar el efecto de la modificación del gen específico sobre el patrón de proteínas producidas. Estas cepas genéticamente modificadas también pueden someterse a una caracterización transcripcional para elucidar el efecto de la modificación genética sobre los niveles de expresión génica y para revelar los genes diana afectados por la modificación. Con la información de los efectos de la modificación genética sobre el patrón de proteínas producidas (a partir de los ensayos enzimáticos y del análisis en gel 2D de los sobrenadantes de cultivo) así como la información sobre las respuestas transcripcionales que provoca la modificación genética, y los genes diana para los acontecimientos reguladores, es posible modificar las propiedades y la eficacia de la producción de proteínas, así
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deficiente al menos uno de dichos genes. La sobreexpresión de los genes anteriormente mencionados en hongos filamentosos hospedadores se ejemplificó en este caso construyendo cepas de Trichoderma que expresan estos genes. La expresión de los mismos o de los genes correspondientes, es decir, los homólogos más cercanos de dichos genes, en otros hongos filamentosos hospedadores, está dentro del ámbito de protección de la presente divulgación.
Como se describe anteriormente, los genes correspondientes también pueden sobreexpresarse o hacerse deficientes en otros hongos filamentosos hospedadores.
En algunas otras aplicaciones es conveniente adaptar un producto proteico, en el que, por ejemplo, se desean niveles mayores de actividad de EGI y xilanasa. Para esa aplicación, debería sobreexpresarse en el hongo hospedador el gen tre112524 (SEQ ID NO: 2) o el homólogo más cercano de dicho gen en Trichoderma, Aspergillus, Fusarium, Neurospora, Chrysosporium o Penicillium o un fragmento o derivado de dicho gen u otra secuencia de nucleótidos que hibride en condiciones rigurosas con dicho gen, o con al menos uno de dichos homólogos.
También están dentro del ámbito de protección de la presente divulgación secuencias que hibridan en condiciones rigurosas con los genes de Trichoderma o sus homólogos más cercanos en otros hongos filamentosos hospedadores. En el siguiente texto, por “gen” se entiende también el homólogo más cercano del gen o las secuencias que hibridan en dicho gen o dicho homólogo, como se describe en el presente documento. En el siguiente texto, por “gen” también se entiende cualquier fragmento o derivado, o forma modificada, que comprenda deleciones, sustituciones, inserciones u otras modificaciones genéticas, pero que tenga la misma función o una equivalente que dicho “gen”.
Para ejemplificar el efecto de los genes sobre la producción de proteínas, los genes se sobreexpresaron en el hospedador T. reesei QM9417 como se describe en los Ejemplos 4-6.
La estructura de los genes es similar ya que todos comprenden un dominio de secuencia típico de los genes que codifican proteínas reguladoras, tales como factores de transcripción, como se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2.
ID del gen
IPR00113 8, proteína reguladora transcripcional fúngica, N-terminal IPR00721 9, factor de transcripción específico fúngico IPR00168 0, repetición de WD40 IPR00018 2, Nacetiltransferasa relacionada con GCN5
tre123668
pMH 18 x
tre66966
pMH 35 x
tre122523
pMH 29 x
tre120120
pMH 22 x
tre112524
pMH 17 x x
El efecto del gen tre66966 (Fig. 1), representado para la SEQ ID NO: 1, se ejemplificó construyendo la cepa T. reesei 35-10, que sobreexpresa el gen. La sobreexpresión de este gen provocó una producción aumentada de celulasa, medida como actividad de Mulac total, actividad de CBHI y actividad de EGI. En particular, la actividad de CBHI aumentó en comparación con el hospedador parental. Además, la producción de hemicelulasa medida como producción de actividad de xilanasa y la producción de proteína extracelular total aumentó en comparación con la producción por parte de la cepa hospedadora parental. La sobreexpresión del gen tre66966 puede utilizarse para aumentar en particular la producción de celulasa o hemicelulasa, o la producción de otras proteínas secretadas. Además, la producción de diversas proteínas heterólogas bajo los promotores de los genes de la celulasa o hemicelulasa (o promotores regulados de forma similar) puede producirse a un mayor nivel por parte de las cepas que sobreexpresan el gen en comparación con la cepa hospedadora parental.
El efecto del gen tre112524 (Fig. 2), representado por la SEQ ID NO: 2, se ejemplificó construyendo la cepa T. reesei 17-, que sobreexpresa el gen. En los cultivos de la cepa 17-6, el nivel máximo de proteína extracelular total producida se alcanzó antes que en los cultivos de la cepa hospedadora parental. Mediante la sobreexpresión del gen se puede obtener un procedimiento de producción más rápido para las proteínas secretadas. En concreto, las cepas 17-6 produjeron una mayor cantidad de actividad de hemicelulasa, medida frente a sustrato de xilano, así como una cantidad ligeramente mayor de actividad de celulasa, medida como actividad de MULac o actividad de EGI total. Sin embargo, la producción de actividad de CBHI no se vio afectada por la sobreproducción. La producción mejorada de actividad de hemicelulasa o de actividades de celulasa seleccionadas puede obtenerse sobreexpresando el gen 112524. En la cepa que sobreexpresa también puede obtenerse una producción mejorada
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Ejemplo 3. Análisis de los cultivos inducidos por micromatriz de expresión
Los cultivos inducidos ya sea con Avicel, soforosa, paja de trigo pretratada o abeto pretratado se sometieron a análisis de expresión por micromatriz. Se utilizaron para el análisis los puntos temporales de 0 h, 6 h, 17 y 41 h de los cultivos no inducidos o inducidos con soforosa, y se seleccionaron los puntos temporales de 0 h, 6 h y 17 h para los cultivos inducidos con Avicel, trigo y abeto. El análisis por micromatriz se realizó utilizando micromatrices de oligonucleótidos por encargo, por Roche NimbleGen, Inc. El diseño para las sondas y portaobjetos de micromatriz se realizó de acuerdo con la versión v2.0 del genoma de T. reesei (http://genome.jgipsf.org/Trire2/Trire2.home.html). Los datos de micromatriz sin procesar se analizaron utilizando los paquetes de programas informáticos de R y de Bioconductor Oligo, Limma y Mfuzz.
El análisis mostró una coexpresión de un grupo de genes junto con los genes de la celulasa o hemicelulasa. Estos genes incluían genes nuevos no descritos anteriormente, con dominios de secuencia típicos de genes de distintos tipos de proteínas reguladoras, incluyendo genes de factores de transcripción, quinasas y proteínas implicadas en la modificación de histonas y el remodelado de la cromatina, proteínas de transferencia de fosfatidilinositol/fosfatidilcolina. Para evaluar el efecto de estos genes sobre la producción de proteínas y, en concreto, la producción de enzimas hidrolíticas, como celulasas y hemicelulasas, se clonó un conjunto de estos genes y se sobreexpresó en T. reesei QM9414 (ATCC 26921). Los genes seleccionados tenían una expresión significativamente mayor al menos en tres de las condiciones de inducción estudiadas, en comparación con los cultivos no inducidos en el mismo punto temporal, o el perfil de expresión de los genes era similar a los perfiles de expresión de los genes de la hemicelulasa o celulasa conocidos (de acuerdo con un agrupamiento difuso de M de los datos de expresión). Los genes seleccionados con su correspondiente número de identidad de proteína, la predicción funcional predicha a base de los dominios de secuencia y la información sobre su inducción en presencia de distintas sustancias inductoras en distintos puntos temporales del experimento de inducción se enumeran en la Tabla 3.
La información proporcionada sobre los genes incluye el número de ID de acuerdo con la versión 2.0 del genoma del JGI (http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html), la función predicha del gen a base de los datos de secuencia y los datos sobre la inducción del gen en presencia de distintos inductores (Avicel, paja de trigo pretratada, abeto pretratado o soforosa) en distintos puntos temporales de la inducción. La inducción estadísticamente significativa (mayor nivel de expresión en comparación con los cultivos no inducidos de control en el mismo punto temporal) en los cultivos inducidos con Avicel, Abeto, Trigo o Soforosa en los puntos temporales de 0 h, 6 h, 17 h o 41 h, se indica por “1” y la reducción estadísticamente significativa del nivel de expresión por “-1”.
Tabla 3. Los genes inducidos que codifican supuestos factores reguladores y seleccionados para la sobreexpresión en T. reesei.
Inductor
ID del gen
Clase Extensión Avicel Avicel Avicel Trigo Trigo Trigo Abeto Abeto Abeto Soforosa Soforosa Soforosa Soforosa
0 h
6 h 17 h 0 h 6 h 17 h 0 h 6 h 17 h 0 h 6 h 17 h 41 h
TRIRE0066966 TRIRE0112524 TRIRE0123668 TRIRE0122523 TRIRE0120120
Regulación Regulación Regulación Regulación Regulación repeticiones WD40 de Proteína G beta Factor de transcripción N-aceiltransferasa relacionada con GCN5 Factor de transcripción N-aceiltransferasa relacionada con GCN5 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1
Tiempo (h)
Ejemplo 4.
Los cebadores utilizados para la amplificación de los genes del genoma de T. reesei QM6a (CBS383.78) fueron los siguientes:
El cebador del extremo 5’ contenía una parte general que consiste en cuatro G 5’ terminales, 25 nt del sitio attB1 (ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT) (SEQ ID NO: 6) y una región de 8 nt cadena arriba del codón de iniciación del gen cbh1 (TGCGCATC), formando en conjunto la secuencia GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGCGCATC (SEQ ID NO: 7)
El componente general del oligonucleótido estaba seguido de la secuencia específica del gen correspondiente al extremo 5’ del gen.
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El cebador del extremo 3’ contenía cuatro G 5’ terminales, 25 nt del sitio attB2 (ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT) (SEQ ID NO: 8) y los nucleótidos CTTA, seguido de la secuencia específica del gen que corresponde con el extremo 3’ del gen.
La parte de los cebadores específica del gen se diseñó a base de la predicción de la ORF en la versión v2.0 del genoma (http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html) o, en algunos casos, como se indica a continuación, de acuerdo con la versión v1.2 del genoma (http://genome.jgi-psf.org/trire1/trire1.home.html)
Los cebadores utilizados para la amplificación de los genes, utilizando como molde el ADN genómico de T. reesei, fueron los siguientes:
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pMH17 112524 3’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACACATTCATCCCTGCGCCCAG (SEQ ID NO: 10) pMH18 123668
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pMH18 123668 3’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAATTGAGCAGCGGCTCGCG (SEQ ID NO: 12) pMH22 120120
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pMH22 120120 3’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTACTCGGTGCTGATACTTCT (SEQ ID NO: 14) pMH29 122523
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pMH29 122523 3’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCATATCGGCACCATGTCGACGT (SEQ ID NO: 16) pMH35 66966
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pMH35 66966 3’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCTAGGCGCCGTTGACGACTC (SEQ ID NO: 18)
La reacción de amplificación por PCR utilizando los cebadores mencionados anteriormente dio como resultado fragmentos de ADN que contenían las secuencias génicas específicas descritas a continuación insertadas entre las secuencias 5’ y 3’ terminales, que se originan de las partes generales de los cebadores.
Ejemplo 5. Construcción de cepas de T. reesei que sobreexpresan los genes reguladores seleccionados a base de los datos de transcriptoma, procedentes del experimento de inducción en medios que contienen Avicel, trigo, abeto o soforosa
Los genes que codifican los supuestos factores reguladores coexpresados con los genes de celulasa o hemicelulasa conocidos se amplificaron por PCR a partir del genoma de Trichoderma (T. reesei QM6a; CBS383.78) y se clonaron en un vector de expresión que después se transformó en T. reesei QM9414. Los transformantes se seleccionaron a base de la función del gen marcador de selección AmdS presente en el casete de expresión, los transformantes se purificaron a partir de colonias que se originaron a partir de esporas individuales y la integración del casete de expresión en el genoma se confirmó mediante amplificación por PCR del casete. En la Fig. 8 se muestra una vista esquemática de los plásmidos utilizados para la transformación.
Ejemplo 6. Cultivo de las cepas de T. reesei que sobreexpresan los supuestos factores reguladores y análisis del crecimiento y la producción de proteínas de los cultivos.
Las cepas modificadas que sobreexpresan los genes que codifican los supuestos factores reguladores se cultivaron en matraces de agitación en medio que contenía (NH4)2SO4 7,6 g/l, KH2PO4 15,0 g/l, MgSO4.7H2O 2,4 mM, CaCl2.H2O 4,1 mM, CoCl2 3,7 mg/l, FeSO4.7H2O 5 mg/l, ZnSO4.7H2O 1,4 mg/l, MnSO4.7H2O 1,6 mg/l y complementado con lactosa al 4 % y extracto de granos procesados al 2 %. Se analizó el crecimiento y la producción de proteínas de los cultivos, incluyendo ensayos para analizar la actividad de celulasa y hemicelulasa. La
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CN104087568A (zh) * 2014-06-11 2014-10-08 华南理工大学 一种制浆造纸漂白预处理用半纤维素酶的制备和应用
CN106190874B (zh) * 2015-05-06 2020-06-26 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种强化丝状真菌蛋白质生产的方法
CN106119137B (zh) * 2015-05-06 2020-06-26 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种改善丝状真菌蛋白分泌能力的方法
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CN112105740A (zh) * 2018-02-23 2020-12-18 诺维信公司 真菌宿主中的长链非编码rna表达
EP3981882A1 (en) * 2020-10-08 2022-04-13 Clariant Produkte (Deutschland) GmbH Process for the production of a filamentous fungus whole broth enzyme composition with low viscosity
CN117716039A (zh) 2021-07-19 2024-03-15 丹尼斯科美国公司 用于增强真菌细胞中的蛋白质产生的组合物和方法
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001072783A2 (en) * 2000-03-24 2001-10-04 Genencor International, Inc. Production of secreted proteins by recombinant eukaryotic cells
US8216844B2 (en) * 2006-08-29 2012-07-10 Danisco Us Inc. Compositions and methods for improved protein production
CN101680019A (zh) * 2007-06-15 2010-03-24 丹尼斯科美国公司 有用的真菌菌株的选择

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