ES2647077T5 - Construcciones de silenciamiento del gen de P0 y su uso - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

Construcciones de silenciamiento del gen de P0 y su uso

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para transmitir resistencia o tolerancia viral a uno o más virus, en particular al virus de la amarillez de la remolacha (BMYV, por sus siglas en inglés) y al virus de la amarillez necrótica de las nervaduras de la remolacha (BNYVV, por sus siglas en inglés), o al BMYV en solitario, en una planta, en particular en una planta de remolacha azucarera. Además, la presente invención se refiere a una planta resistente o tolerante al virus obtenida según este método, así como también a las semillas y a la progenie obtenida a partir de ellas.

La presente invención también se refiere a construcciones de silenciamiento génico, especialmente a construcciones en horquilla que median el silenciamiento del ARN de BMYV, o de BMYV y BNYVV, y a su uso.

Antecedentes de la invención

Los virus de las plantas son un serio problema para muchos de los principales cultivos agrícolas dado que las infecciones por virus causan grandes pérdidas en las cosechas.

En la remolacha azucarera, las causas principales de enfermedades son: (i) la amarillez causada por un Polerovirus, el virus de la amarillez suave de la remolacha azucarera (BMYV), transmitido por su vector principal Myzus persicae de forma persistente; (ii) la rizomanía de la remolacha azucarera provocada por un Benyvirus, el virus de la amarillez necrótica de las nervaduras de la remolacha (BNYVV), transmitido por la Polymyxa betae. El uso extensivo de resistencia a BNYVV permitió mantener los rendimientos; no obstante, están apareciendo aislados virales con resistencia resentida y hay necesidad urgente de obtener nuevas variedades resistentes.

Los virus transmitidos por hongos, tal como el BNYVV, pueden quedar retenidos en esporas en reposo en el suelo durante años una vez infectado el campo. Dado que no existe ningún método químico o físico eficaz para eliminar los virus, ni en las plantas ni en el suelo, la única opción para el productor de remolacha azucarera es el uso de cultívares genéticamente resistentes. Varias empresas han proporcionado cierta cantidad de variedades tolerantes, incluso parcialmente resistentes, mediante una mejora genética. Sin embargo, se trata de un proceso muy tedioso y prolongado que generalmente lleva un largo tiempo antes de obtener plantas resistentes y útiles.

La rápida revolución en los ámbitos de la ingeniería botánica ha llevado al desarrollo de nuevas estrategias para conferir resistencia genética a los virus. La resistencia a las enfermedades virales mediante la introducción de porciones de secuencias genómicas virales a través de las cuales la secuencia viral (construcción) es transformada en una célula vegetal y una planta, ha pasado a ser una nueva fuente de resistencia.

Se sabe que la remolacha azucarera es una especie recalcitrante en ingeniería genética, lo que complica la posible inducción exitosa de resistencia viral.

Se han publicado unos pocos ejemplos de tolerancia de ingeniería, por ejemplo, a BNYVV, transformando y expresando la secuencia de proteína de cápside de BNYVV en el genoma de la remolacha azucarera (WO91/13159), aunque solo hay informes esporádicos sobre plantas enteras de remolacha azucarera transgénicas funcionales, tales como las descritas en el documento EP 1169463 B1. En particular, los informes muestran datos limitados sobre el nivel de resistencia observado en condiciones infectadas con plantas de remolacha azucarera transgénicas transformadas con un gen codificante de una secuencia de proteína de cápside de BNYVV.

El genoma del Furovirus de la amarillez necrótica de las nervaduras de la remolacha (BNYVV) consiste en cinco ARNs de sentido positivo, dos de los cuales (ARNs 1 y 2) codifican funciones esenciales para la infección de todas las plantas mientras que los otros tres (ARNs 3, 4 y 5) están involucrados en la infección mediada por vectores de las raíces de remolacha azucarera (Beta vulgaris). El movimiento de célula a célula de el BNYVV está regido por un grupo de tres genes virales sucesivos, ligeramente superpuestos, en el ARN 2 conocido como triple bloque de genes (TGB, por sus siglas en inglés), que codifican, en orden, las proteínas virales P42, P13 y P15 (los productos génicos son designados por su Mr calculada en kilodalton).

El genoma del BMYV consiste en un ARN de sentido positivo lineal con seis marcos abiertos de lectura principales (ORFs, por sus siglas en inglés, 0-5). Los ORFs 1 y 2 codifican proteínas involucradas en la replicación viral, mientras que cada uno de los otros tres ORFs (ORFs 3, 4 y 5) codifica las proteínas estructurales (proteínas de cápside mayores y menores) y una proteína con función motora putativa.

Se ha demostrado que la proteína P0 del BMYV tiene una expresión deficiente, una consecuencia del contexto del codón de inicio desfavorable del AUG de P0 y una fuerte tendencia a mantener una baja expresión. Además, esta parte del genoma es altamente variable, y esta diversidad de secuencias ha sido explotada para discriminar las diferentes especies.

Se demostró que las enfermedades provocadas por el BNYVV se extienden geográficamente a una velocidad que depende de la combinación de numerosos factores agrícolas y ambientales locales. Por lo tanto, existe una necesidad de mejorar los mecanismos de resistencia genética que pueden conferir, solos o en combinación, una resistencia estable y duradera de las plantas de remolacha azucarera cultivadas para uso industrial.

Estado de la técnica

La solicitud de patente WO 2007/128755 describe una secuencia de TGB-3 usada para reducir y/o suprimir los efectos nocivos de TGB-3 de tipo salvaje en las plantas, para generar plantas transgénicas resistentes a los virus, especialmente remolachas azucareras resistentes al virus de la amarillez necrótica de las nervaduras de la remolacha.

Carmen Simon-Mateo et al., "Biochimica et Biophysica Acta", 1809 N° 11-12, páginas 722-731, 2011, describe diferentes estrategias antivirales usadas para obtener plantas resistentes a los virus en los últimos 25 años.

A. Kozlowska-Makulska et al., "Journal of General Virology", Vol. 91, N° 4, páginas 1082-1091, 2010, describe la actividad supresora del silenciamiento del ARN en proteínas P0 de diferentes aislados de polerovirus en remolachas infectadas, virus de la clorosis de la remolacha y virus de la amarillez de la remolacha.

Pu Yan et al., "Journal of Virological Methods", Vol. 166, N° 1-2, páginas 101-105, 2010, describe construcciones de silenciamiento de ARN para desarrollar plantas resistentes a los virus mediante la expresión de ARNs en horquilla derivados de virus.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona métodos y medios para conferir tolerancia o resistencia viral sin presentar las desventajas del estado de la técnica, preferiblemente métodos y medios que confieren tolerancia, resistencia, preferiblemente resistencia extrema o total, especialmente tolerancia o resistencia viral al BMYV (virus de la amarillez de la remolacha azucarera) (incluso resistencia extrema o total al BMYV) o preferiblemente tolerancia o resistencia al BMYV (virus de la amarillez de la remolacha azucarera) y al BNYVV (virus de la amarillez necrótica de las nervaduras de la remolacha) combinados (incluso resistencia extrema o total al BMYV y al BNYVV) en una célula vegetal o en una planta, particularmente en una célula vegetal de remolacha azucarera o en una planta de remolacha azucarera (posiblemente generada a partir de esta célula vegetal).

La presente invención proporciona, además, células vegetales genéticamente modificadas o transformadas que pueden obtenerse como tales, u obtenidas a partir de este método, y que pueden ser generadas en las plantas que muestran esta mayor tolerancia o resistencia a los virus de plantas mencionados.

Asimismo, la invención proporciona progenie, es decir, progenie, semillas u otros órganos o estructuras reproducibles resistentes a los virus o tolerantes a los virus que se originan a partir de estas células vegetales o plantas transformadas.

Un primer aspecto de la presente invención es una construcción de ARN que comprende una secuencia de segmentos sentido y una secuencia de segmentos antisentido con secuencias deducidas a partir del gen de P0 (o a partir del gen codificante de la proteína P0) del genoma del BMYV o a partir de un gen ortólogo, en donde dichas secuencias de segmentos sentido y dichas secuencias de segmentos antisentido comprenden, ambas, un fragmento de nucleótidos en donde la secuencia comparte al menos el 95% de identidad de secuencia con el gen de P0 del genoma del BMYV o de un gen ortólogo y que tiene un tamaño de al menos 20 nucleótidos..

Preferiblemente, en esta construcción de ARN, la o las secuencias de segmentos sentido y/o antisentido comprende(n), además, un fragmento de nucleótidos en donde la o las secuencias comparte(n) al menos el 95% de identidad de secuencia con la secuencia no traducida del extremo 5' (5'UTR) adyacente a la secuencia de nucleótidos del gen de P0.

Más preferiblemente en esta construcción de ARN, las secuencias de segmentos sentido y de segmentos antisentido comprenden un fragmento de nucleótidos en donde las secuencias comparten al menos el 100% de identidad de secuencia con el gen de P0 del genoma del BMYV.

Ventajosamente, en esta construcción de ARN, las secuencias de segmentos sentido y de segmentos antisentido comprenden, además, un fragmento de nucleótidos en el que las secuencias comparten al menos el 95% de identidad de secuencia con el gen de P1 del genoma del BMYV.

Posiblemente, en estas construcciones de ARN, el segmento sentido comprende o consiste en la secuencia SEQ. ID. NO: 1 y/o el segmento antisentido comprende o consiste en la secuencia SEQ. ID. NO: 3.

Ventajosamente, en estas construcciones de ARN, las secuencias de segmentos sentido y de segmentos antisentido comprenden, ambas, además, un fragmento de nucleótidos que comparte al menos el 95% de la identidad de secuencia con el genoma del BNYVV.

Un aspecto relacionado de la presente invención es una construcción de ADN con capacidad de transcribirse en esta/estas construcción(es) de ARN.

Otro aspecto relacionado es un vector que comprende la secuencia de nucleótidos de estas construcciones de ácido nucleico (ADN).

Otro aspecto relacionado es una molécula de ARN autocomplementaria de doble cadena expresada por este vector o construcción de ADN.

La presente invención también se refiere a un método para inducir tolerancia o resistencia, preferiblemente resistencia total a al menos el virus BMYV y posiblemente a otros virus, en una planta o en una célula vegetal, método que comprende las etapas de: preparar la construcción de ácido nucleico de la presente invención (por ejemplo, que comprende una secuencia deducida del gen de P0 y/o del genoma del BMYV), operativamente unido a una o más secuencias reguladoras activas en la planta o la célula vegetal, y transformar la célula vegetal con la construcción de ácido nucleico, lo que induce resistencia a al menos el virus BMYV en la planta o en la célula vegetal.

Ventajosamente, este método induce, además, tolerancia a otro virus, que se selecciona del grupo que consiste en el virus del mosaico amarillo del nabo, el virus de la amarillez de las cucurbitáceas transmitido por pulgones, el virus del enrollamiento de la hoja de la patata, el virus de la hoja amarilla de la caña de azúcar, el virus del mosaico del guisante, el virus de la amarillez de la remolacha occidental (EE. UU.), el virus de la clorosis de la remolacha, el virus de enanismo amarillo del cereal y el virus del BNYVV, preferiblemente el virus BNYVV.

Otro aspecto relacionado es el uso de una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia deducida del gen de P0 y/o del genoma del BMYV y/o del ARN, ADN o del vector de la presente invención para inducir la tolerancia o la resistencia, preferiblemente la resistencia total al virus del BMYV y/o al virus BNYVV, en una planta o en una célula vegetal.

Otro aspecto es una planta transgénica o una célula vegetal transgénica tolerante o resistente, preferiblemente completamente resistente a al menos el virus BMYV y posiblemente, a uno o más de otros virus y que comprende una construcción de ácido nucleico capaz de expresar la secuencia de nucleótidos de la presente invención (que comprende una secuencia deducida del gen de P0 y/o del genoma del BMYV), operativamente unida a una o más secuencias reguladoras activas en la planta o en la célula vegetal, que comprende el vector de la presente invención, o que comprende una molécula de ARN autocomplementaria de doble cadena de la presente invención. Preferiblemente, esta planta transgénica o célula vegetal transgénica es resistente a otro virus, que se selecciona del grupo que consiste en el virus del mosaico amarillo del nabo, el virus de la amarillez de las cucurbitáceas transmitido por pulgones, el virus del enrollamiento de la hoja de la patata, el virus de la hoja amarilla de la caña de azúcar, el virus del mosaico del guisante, el virus de la amarillez de la remolacha occidental (EE. UU.), el virus clorosis de la remolacha, el virus de enanismo amarillo del cereal y el virus BNYVV, preferiblemente el virus BNYVV. Preferiblemente, esta planta transgénica o célula vegetal transgénica se selecciona del grupo que consiste en lechuga, pepino, patata, caña de azúcar, guisante, cebada y remolacha azucarera, prefiriéndose una remolacha azucarera o una célula de remolacha azucarera.

Un aspecto relacionado es un tejido vegetal transgénico y/o estructura reproducible obtenida a partir de esta célula vegetal transgénica (según la presente invención), en el que dicho tejido se selecciona del grupo que consiste en fruto, tallo, raíz, tubérculo y semilla o en el que dicha estructura reproducible se selecciona del grupo que consiste en callos, yemas o embriones.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A y 1B representan un fragmento de la secuencia de P0 viral según la invención (las Figuras 1A y 1B; SEQ. ID. NO: 13) con una secuencia de nucleótidos de P0 sentido (SEQ. ID. NO: 1, más corta que toda la secuencia de P0 SEQ. ID. NO: 17) y una secuencia de nucleótidos de P0 antisentido homóloga correspondiente (en negrilla, SEQ. ID. NO: 3) intercalada con una secuencia intrón de petunia de 1.352 pb (en negrilla, subrayada, SEQ. ID. NO: 11). Unos pocos nucleótidos de la Figura 1B se indican en negrilla y bastardilla. Estos corresponden a la 5'UTR del genoma del BMYV viral. Otros pocos nucleótidos en bastardilla y subrayados de la Figura 1B que no pertenecen al P0 ni al intrón pero que aún están presentes como tales son los restos de la estrategia de clonación. Una construcción que comprende la horquilla completa (SEQ. ID. NO: 13) también se designa como construcción hpP01. La Figura 2 (A y B) representa otro fragmento de la secuencia de P0 viral según la invención (Figuras 2A y 2B; SEQ. ID. NO: 14) con una secuencia de nucleótidos de P0 sentido y una secuencia de nucleótidos de P0 antisentido (en negrilla) intercalada con una secuencia de intrón de remolacha de 91 pb (en negrilla, subrayada, SEQ. ID. NO: 12). Unos pocos nucleótidos de la Figura 2B se indican en negrilla y bastardilla. Estos corresponden a la 5'UTR del genoma del virus BMYV. Otros pocos nucleótidos en bastardilla y subrayados de la Figura 2B que ni pertenecen al P0 ni pertenecen al intrón pero que aún están presentes como tales son los restos de la estrategia de clonación. Las secuencias de nucleótidos de P0 sentido y antisentido de la presente memoria son las mismas que las dadas en la Figura 1B. Una construcción que comprende la horquilla completa (SEQ. ID. NO: 14) también es mencionado como construcción hpP02.

La Figura 3 destaca las diferencias en el extremo 5' de la SEQ. ID. NO:1 comparado con el extremo 5' de la secuencia de codificación del BMYV del P0 representada por la SEQ. ID. NO: 17. La secuencia subrayada de la Figura 3 corresponde a la secuencia líder 5' no funcional de la SEQ. ID. NO: 1.

La Figura 4 (A y B) es una representación esquemática del vector pFGC5941 en el que se introdujo un fragmento del gen de P0 en orientación sentido (SEQ. ID. NO: 1) y antisentido (SEQ. ID. NO: 3), intercalado con una secuencia intrónica del gen chalcona sintasa A de petunia (CHSA; SEQ. ID. NO: 11) (Figura 4A, pFGC5941, construcción 1; SEQ. ID. NO:13) o intercalado con una secuencia intrónica de remolacha (SEQ. ID. NO:12) de 91 nt (Figura 4B, pFGC5941, construcción 2; SEQ. ID. NO: 14). Promotor CaMV 35S: promotor 35S de CaMV; OCS 3': señal de poliadenilación del gen de octopina sintasa; promotor de MAS: promotor del gen de manopina sintasa; MAS 3': señal de poliadenilación del gen de manopina sintasa; BAR: gen de resistencia al herbicida Basta; pVS1: origen de replicación de pVS1; NPTII: gen de resistencia a la kanamicina; LB, RB: límites izquierdo y derecho del ADN de transferencia.

La Figura 5 es un análisis estadístico del ensayo de resistencia obtenido con la construcción 1 (hpP0u con el intrón de petunia). Cada histograma representa el título medio del BMYV con error típico en 10 plantas inoculadas con BMYV (Y). hp: horquilla; Inf: infectado. En el eje Y: densidad óptica (A⁴⁰⁵) obtenida por ELISA 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1, 1,2. En el eje X, de izquierda a derecha: líneas transgénicas: hpP0-7, hpP0-8, hpP0-9, hpP0-10, hpP0-11 y hpP0-12; control infectado por BMYV: Col0 Inf; Col0 saludable.

La Figura 6 es un análisis estadístico del ensayo de resistencia obtenido con la construcción 2 (hpP0u con el intrón de remolacha). Cada histograma representa el título medio del BMYV con error típico en 10 plantas inoculadas con BMYV (Y). hp: horquilla; hpP0: construcción 1; hpP0remolacha: construcción 2; Inf: infectado. En el eje Y: densidad óptica (A⁴⁰⁵) obtenida por ELISA 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3. En el eje X, de izquierda a derecha: líneas transgénicas: hpP0-12 (construcción 1), hpP0remolacha-1 (construcción 2), hpP0remolacha-2, hpP0remolacha-3, hpP0remolacha-4, hpP0remolacha-5, hpP0remolacha-6, hpP0remolacha-7 y hpP0remolacha-8, control infectado con BMYV: Col0 Inf; Col0 saludable.

La Figura 7 es un análisis estadístico del ensayo de resistencia obtenido con las construcciones 1 y 2, respectivamente. Cada histograma representa el título medio del virus con error típico en 10 plantas inoculadas (Y). Los histogramas de color gris oscuro representan la infección con clon de BMYV-EK y los histogramas en gris claro, la infección por aislado de BMYV-2itb con el método de transmisión de pulgones, respectivamente. hp: horquilla; hpP0: construcción 1; hpP0remolacha: construcción 2; Inf: infectado. En el eje X: densidad óptica (A⁴⁰⁵) obtenida por ELISA 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5. En el eje X, de izquierda a derecha: líneas transgénicas: hpP0-9 (construcción 1), hpP0-10, hpP0-12, hpP0remolacha-2 (construcción 2), hpP0remolacha-7 y hpP0remolacha-8; control infectado: Col0 Inf; Col0 saludable.

La Figura 8 representa la secuencia de WT P0 (SEQ. ID. NO: 17 y 18).

La Figura 9 (A y B) representa la secuencia de la construcción en horquilla hpP15A4-P0 según la invención (Figuras 9A y 9B, SEQ. ID. nO: 15) con una secuencia de nucleótidos P15A4-P0 sentido (SEQ. ID. NO: 7, nucleótidos en bastardilla para la secuencia P15A4 con las 3 mutaciones subrayadas y nucleótidos usuales para la secuencia de P0; comparado con WT P15: A es reemplazado con C y AG con GC) y SEQ. ID. NO: 8 correspondiente a una secuencia de nucleótidos P15A-4-P0 antisentido (en negrilla y bastardilla para P15A4 y en negrilla para P0) intercalada con una secuencia intrón de remolacha de 91 pb (en negrilla, subrayada, SEQ. ID. NO: 12). Unos pocos nucleótidos de la Figura 9B se indican en negrilla, bastardilla y subrayados. Estos corresponden a la 5'UTR del genoma del BMYV viral. Otros pocos nucleótidos subrayados de la Figura 9B que ni pertenecen al P15A4-P0 ni pertenecen al intrón pero que aún están presentes como tales son los restos de la estrategia de clonación. Una construcción que comprende la horquilla completa (SEQ. ID. NO: 15) también es mencionado como construcción 1 hpP15A4-P0.

La Figura 10 (A y B) representa la secuencia de las construcciones en horquilla hpP0-P15A4-A y hpP0-P15A4-B según la invención (Figuras 10A y 10B, SEQ. ID. NO: 16) con una secuencia de nucleótidos P0-P15A4 sentido (SEQ. ID. NO: 9 nucleótidos usuales para la secuencia de P0 y nucleótidos en bastardilla para la secuencia de P15A4 con las 3 mutaciones subrayadas) y SEQ. ID. NO: 10 correspondiente a una secuencia de nucleótidos P0-P15A4 antisentido (en negrilla para P0 y en negrilla y bastardilla para P15A4) intercalada con una secuencia intrón de la remolacha de 91 pb (en negrilla, subrayado, SEQ. ID. NO: 12). La diferencia entre las dos construcciones en horquilla es la presencia de dos nucleótidos adicionales en la secuencia de P15A4 (nucleótidos en los recuadros) para la construcción hpP0-P15A4-B. Unos pocos nucleótidos de la Figura 10B se indican en negrilla, bastardilla y subrayado. Estos corresponden a la 5'UTR del genoma del BMYV viral. Otros pocos nucleótidos subrayados de la Figura 10B que ni pertenecen al P0-P15A4 ni pertenecen al intrón pero que aún están presentes como tales son los restos de la estrategia de clonación. Una construcción que comprende la horquilla completa (SEQ. ID. NO: 16) también es mencionado como construcción 2 hpP0-P15A4-A y como construcción 3 hpP0-P15A4-B.

La Figura 11 (A y B) es una representación esquemática del vector pFGC5941 en el que se introdujo una secuencia de P15A4-P0 o una secuencia de P0-P15A4 en orientación sentido y antisentido, intercalada con una secuencia intrónica de la remolacha de 91 nt (Figura 11 A, pFGChpP15A4-P0, construcción 1, y Figura 11B, pFGChpP0-P15A4-A y pFGChpP0-P15A4-B, construcción 2 y 3, respectivamente). Promotor CaMV 35S: promotor 35S de CaMV; OCS 3': señal de poliadenilación del gen octopina sintasa; promotor de MAS: promotor del gen manopina sintasa; MAS 3': señal de poliadenilación del gen manopina sintasa; BAR: gen de resistencia al herbicida Basta; pVS1: origen de replicación de pVS1; NPTII: gen de resistencia a la kanamicina; LB, RB: límites izquierdo y derecho del ADN de transferencia.

Descripción detallada de la invención

Considerando la presencia de ambos virus dentro de las zonas de crecimiento de la remolacha azucarera, los inventores han desarrollado plantas transgénicas resistentes a uno o a ambos virus (BMYV y/o BNYVV), o incluso a virus adicionales capaces de infectar la misma planta.

De hecho, el BNYVV es la principal preocupación y los inventores anticipan que la prevalencia del BMYV también corre el riesgo de aumentar.

Un primer aspecto de la presente invención se refiere a una construcción de ARN (tal como un ARN en horquilla preferiblemente descrita más adelante como hpP0) que comprende un segmento sentido (ARN) y un segmento antisentido (ARN) (ambos) que tienen secuencias deducidas (es decir, que comparten al menos el 95% de la identidad de secuencia) del gen de P0 (o secuencia de nucleótidos) o del gen (secuencia de nucleótidos que codifica la proteína P0) del genoma del BMYV o de genes ortólogos o que tienen secuencias deducidas (es decir, que comparten al menos el 95% de la identidad de secuencia) del genoma del BMYV y que tienen un tamaño de al menos 20 nucleótidos.

Ventajosamente, esta construcción de ARN (en horquilla, hpP0) comprende un segmento sentido (ARN) y un segmento antisentido (ARN) (ambos) que comprenden, además, fragmentos (sentido y/o antisentido) (ARN) deducidos (es decir, que comparten al menos el 95% de identidad) de la región 5' no traducida (5'UTR) del BMYV (adyacente a este gen codificante de P0 de BMYV o genes ortólogos) y/o esta construcción de ARN (horquilla) comprende un segmento de ARN sentido y un segmento de ARN antisentido con secuencias deducidas tanto de un fragmento de nucleótidos de 5'UTR como de un fragmento de nucleótidos (adyacente) de la secuencia de nucleótidos de P0 del BMYV o de genes ortólogos.

Preferiblemente, estos fragmentos de la 5'UTR y de la secuencia de nucleótidos de P0 son adyacentes en el genoma del BMYV.

Esta horquilla de ARN, cuando comprende un fragmento de la 5'UTR y del P0, es preferiblemente mencionada en la presente invención como secuencia de nucleótidos hpP0u.

Posiblemente (pero menos preferiblemente), esta(s) construcción(es) (horquilla(s) de hpP0 y/o hpP0u (ARN)) según la invención no comprende(n) un fragmento con una secuencia deducida de otro virus, tal como el genoma del BNYVV.

Ventajosamente, esta(s) construcción(es) de ARN (horquilla; hpP0 y/o hpP0u) según la invención comprende(n) un segmento de ARN sentido y un segmento de ARN antisentido que tiene, además, (un fragmento que son) secuencias deducidas del genoma del BNYVV, preferiblemente además de la secuencia de 5'UTR del genoma del BMYV (adyacente al P0) y/o esta/estas construcción(es) de ARN (horquilla; hpP0 y/o hpP0u) comprende(n) un segmento de ARN sentido y un segmento de ARN antisentido (que comprenden un fragmento con una secuencia deducida del gen de P0) en los que ambos comprenden un fragmento de nucleótidos que comparte al menos el 95% de la identidad de secuencia con (una parte) del genoma del BNYVV.

Más preferiblemente, estos segmentos de ARN sentido y antisentido deducidos del genoma de la BNYV son secuencias sentido y/o antisentido correspondientes a (una parte de) la secuencia P15 del genoma del BNYVV (cuando es una horquilla, son mencionados en la presente más abajo como hpP0-P15 o hpP0u-P15, donde este último contiene, además, un fragmento de nucleótidos deducido de la secuencia de 5'UTR del genoma del BMYV. Ventajosamente, esta(s) construcción(es) del ARN de hpP0 y/o hpP0u (horquilla) también comprende(n) fragmentos de nucleótidos sentido y antisentido (ARN) con secuencias deducidas de la secuencia de nucleótidos P1 del BMYV. En el contexto de la presente invención, el término "ortólogos" hace referencia a genes de diferentes especies que mantienen la misma función (por ejemplo, en el curso de la evolución). La Tabla 1 proporciona un ejemplo de genes ortólogos del gen de P0 (o secuencia de nucleótidos) del genoma del BMYV.

Tabla 1. Lista no taxativa de ortólogos de secuencia de P0 identificados

En el contexto de la presente invención, el término "segmento" hace referencia a una/s secuencia/s de nucleótidos sentido y/o antisentido de nucleótido (ARN) capaz/capaces de ser usada/s en el silenciamiento génico. Por lo tanto, un segmento puede ser tan corto como de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35 o 40 nucleótidos, pero también puede abarcar varios genes y/o genes y regiones no traducidas adyacentes (5') (5'UTR). El segmento preferido abarca (la parte 5' del) gen de P0 (o secuencia de nucleótidos) y la 5'UTR adyacente.

En el contexto de la presente invención, el término "fragmento" hace referencia a una secuencia de nucleótidos sentido y/o antisentido de nucleótidos (ARN) con una secuencia deducida de una secuencia de nucleótidos viral diana. Por lo tanto, un fragmento puede ser tan corto como de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35 o 40 nucleótidos, pero también puede abarcar más de un gen.

En el contexto de la presente invención, posiblemente, se asocian varios fragmentos para formar segmento/s sentido y/o antisentido (ARN).

Posiblemente (en especial en el caso de dos fragmentos deducidos del genoma de diferentes virus asociados), los fragmentos se asocian mediante una secuencia enlazante o espaciadora (que no deriva de la secuencia viral diana) para formar un segmento sentido (ARN) y/o un/os segmento/s antisentido (ARN).

Preferiblemente, en la presente invención, el fragmento de la 5'UTR y el fragmento de P0 adyacente se asocian sin una secuencia enlazante o espaciadora.

Estas construcciones pueden comprender secuencias modificadas (secuencias mutadas).

Por lo tanto, la expresión "secuencia deducida" hace referencia a secuencias de nucleótidos con al menos el 95% (más preferiblemente al menos el 96%, 97%, 98%, 99% o incluso el 100%) de la identidad de secuencia con el gen mencionado. Por ejemplo, una secuencia deducida del gen de P0 (o secuencia) del genoma del BMYV hace referencia a una secuencia de nucleótidos con al menos el 95% de la identidad de secuencia con la secuencia SEQ. ID. NO: 17 y que tiene un tamaño de al menos 20 nucleótidos.

Preferiblemente, estas construcciones no contienen más del 5% de restos mutados en comparación con la secuencia de tipo silvestre (SEQ. ID. NO: 17) y/o con la secuencia SEQ. ID. NO: 1 o la secuencia SEQ. ID. NO: 3. Ventajosamente, estas construcciones (ARN) (incluso los segmentos y, más preferiblemente, los fragmentos) tienen un tamaño mayor que aproximadamente 50 nucleótidos.

Posiblemente, estas construcciones (ARN) (en forma de segmento sentido y/o de segmento antisentido) tienen un tamaño menor a aproximadamente 10.000 nucleótidos, posiblemente menor a aproximadamente 5.000, aproximadamente 3.000, aproximadamente 2.000 o aproximadamente 1.000 nucleótidos.

Preferiblemente, el segmento sentido (ARN) y/o el segmento antisentido (ARN) (con una secuencia deducida de la 5'UTR del P0) comprenden uno o más fragmentos que abarcan al menos 5 nucleótidos, más preferiblemente al menos 10 nucleótidos, más preferiblemente aún al menos 20 nucleótidos de la 5'UTR (adyacente al gen de P0), pero posiblemente menos de 40 nucleótidos y preferiblemente menos de 30 nucleótidos de esta 5'UTR (adyacente al gen de P0).

La caracterización molecular del material vegetal demostró la presencia de pequeñas moléculas de ARN complementarias tanto a la secuencia sentido como antisentido del P0 del BMYV, indicando que se obtuvo el mecanismo de silenciamiento y que se disparó la degradación del ARN genómico.

Estas construcciones de ARN (horquilla) disparan eficazmente el silenciamiento génico postranscripcional (PTGS, por sus siglas en inglés), disparando la degradación del ARN transcrito del BMYV (o tanto del BMYV como de el BNYVV).

Los inventores descubrieron, de hecho, una inhibición más potente del BMYV (y de el BNYVV) mediante las construcciones que albergan una 5'UTR del BMYV, además del P0 (posiblemente además de secuencias (fragmentos) deducidas del genoma de el BNYVV).

Por ejemplo, al usar la construcción de nucleótido hpP0-P15, los inventores advirtieron la producción de ARNsi dirigiendo la secuencia del BMYV, pero también la secuencia de ARN2 del BNYVV, dando lugar a una inhibición muy eficaz e inesperada de ambas infecciones virales.

En el caso de esta construcción doble, los inventores advirtieron una reducción más pronunciada de ambas infecciones virales (BMYV y/o BNYVV) que si se usara una construcción comparable dirigido exclusivamente al BNYVV o al BMYV.

Un aspecto relacionado es una construcción de ARN (tal como un ARN en horquilla) que comprende un segmento sentido (ARN) y un segmento antisentido (ARN) (ambos) con secuencias deducidas (es decir, que comparten al menos el 95% de la identidad de secuencia) del genoma del BMYV (o su secuencia de nucleótidos).

Preferiblemente, la construcción de ARN (tal como un ARN en horquilla) deducida del genoma del BMYV que comprende un segmento sentido (ARN) y un segmento antisentido (ARN) tiene una secuencia sentido deducida (es decir, que comparten al menos el 95% de la identidad de secuencia) de la mitad 5' del genoma del BMYV y/o del grupo que consiste en nucleótidos del genoma del BMYV que codifica las proteínas P0, P1, P2, P3, P4 y P5, más preferiblemente de los nucleótidos del genoma del BMYV que codifica las proteínas P1 o P2.

Ventajosamente, estas construcciones (ARN) deducidas del genoma del BMYV (incluso los segmentos y, más preferiblemente los fragmentos) tienen un tamaño mayor que aproximadamente 50 nucleótidos.

Posiblemente, estas construcciones (ARN) deducidas del genoma del BMYV (en forma de segmento sentido y/o de segmento antisentido) tienen un tamaño menor a aproximadamente 10.000 nucleótidos, posiblemente menor a aproximadamente 5.000, aproximadamente 3.000, aproximadamente 2.000 o aproximadamente 1.000 nucleótidos. Por el contrario, los inventores realizaron ensayos sobre el efecto de las construcciones de ARN (en forma de horquillas) con una secuencia deducida exclusivamente del genoma del BMYV.

Estas construcciones hpP0 y especialmente hpP0u en horquilla deducidas del BMYV dieron lugar a una infección de BMYV reducida en plantas infectadas con ambos virus (en comparación con las construcciones control), pero también indujeron una reducción de los síntomas del BNYVV (en comparación con las construcciones control). Se realizaron ensayos sobre dos secuencias de nucleótidos del BMYV como construcción de nucleótido hpP0u (secuencia SEQ. ID. NO: 13 o 14).

La secuencia de nucleótidos de SEQ. ID. NO: 1, 13 o 14 puede ser comparada con la secuencia SEQ. ID. NO: 17, que es la secuencia del nucleótido del P0 de tipo silvestre (véase Figura 8). La longitud de la secuencia SEQ. ID. NO: 1 es más corta que la secuencia de nucleótidos de la secuencia SEQ. ID. NO: 17 (659 nt frente a 720 nt) y consiste en la 5'UTR del genoma viral (nucleótidos subrayados) salvo el primer nucleótido del extremo 5'.

Ventajosamente, las secuencias de nucleótidos del P0 sentido y antisentido están comprendidas en una molécula, y/o el segmento de ARN del P0 sentido y el segmento de ARN del P0 antisentido están comprendidos en una sola molécula de ARN. Ventajosamente, la molécula de ARN según la invención es capaz de plegarse de manera que dichos segmentos de ARN comprendidos en ella formen una molécula de ARN en horquilla de doble cadena.

Como se emplea en esta memoria, la expresión "ARN en horquilla" hace referencia a cualquier molécula de ARN de doble cadena de autohibridación. En su representación más simple, un ARN en horquilla consiste en un cuerpo de doble cadena formado por hebras de ARN de hibridación, conectadas a un bucle de ARN de cadena simple. Sin embargo, la expresión "ARN en horquilla" también pretende abarcar estructuras de ARN secundarias más complejas que comprenden secuencias de ARN de doble cadena de autohibridación, pero también bucles y protuberancias internas. La estructura secundaria específica adaptada será determinada por la energía libre de la molécula de ARN, y puede predecirse para diferentes situaciones usando los programas informáticos apropiados, tales como FOLDRNA.

Alternativamente, las secuencias de nucleótidos del P0 sentido y antisentido pueden estar presentes (o codificadas) en o sobre dos moléculas o secuencias de nucleótidos separadas, que pueden administrarse o proporcionarse a una célula vegetal simultáneamente y/o en forma consecutiva, de forma que, al transcribirla, pueda formarse una molécula de ARN de doble cadena mediante apareamiento de bases.

La presente invención también se refiere a una construcción de ADN con capacidad de transcribirse en la/las construcción(es) de ARN de la invención y a un vector que comprende esta construcción de ADN, en particular un vector de expresión (y/o vector autorreplicante (tal como un plásmido o un vector viral)) o un casete (o sistema) de expresión, preferiblemente codificando un segmento de ARN sentido y un segmento de ARN antisentido con secuencias deducidas de la o las secuencias del P0, unidas operativamente con una o más secuencias reguladoras (secuencia operadora o promotora, inclusive una secuencia poliA), activas en una planta o en una célula vegetal, preferiblemente en un tejido específico (preferiblemente la raíz) de la planta.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una planta o a una célula vegetal transgénica, tal como Arabidopsis thaliana o una planta de remolacha azucarera (Beta vulgaris) que es transformada con la construcción (ADN) de nucleótido, el vector y/o la molécula de ARN según la invención.

Ventajosamente, hay una amplificación viral baja o incluso nula en la planta inoculada transformada con el o los fragmentos de la o las secuencias de nucleótidos del P0 según la invención.

Preferiblemente, las secuencias de ADN según la invención son integradas en forma estable en el genoma de la célula vegetal que está siendo transformada con las secuencias virales del P0 genéticamente modificado según la invención y/o con un vector que comprende estas secuencias.

Alternativamente, el transgén que comprende una secuencia de nucleótidos del P0 genéticamente modificado según la invención puede ser ubicado sobre un episoma o un vector autorreplicante. Ejemplos de vectores autorreplicantes son los virus, en particular los virus Geminiviridae o plásmidos.

Los expertos en la técnica conocen numerosos vectores de transformación disponibles para la transformación de plantas, y pueden usarse las construcciones de nucleótidos o ADN según la presente invención (que comprenden la secuencia viral del P0 genéticamente modificada) junto con cualquiera de dichos vectores. La selección del vector depende de la técnica de transformación preferida.

Se pueden modificar los componentes del sistema de expresión, por ejemplo, para aumentar la expresión de los segmentos de ARN sentido y antisentido.

El promotor operativamente unido a las secuencias de nucleótidos sentido y/o antisentido según la invención puede ser un promotor nativo de la célula a transformar. Alternativamente, el promotor puede ser un promotor heterólogo, por ejemplo, un promotor de tejido específico, un promotor de desarrollo regulado, un promotor constitutivo o un promotor inducible. Los expertos en la técnica conocen bien los promotores apropiados. En la presente invención, se prefieren los promotores heterólogos fuertes activos en tejidos de raíz o principalmente activos en los mismos (cuando no se desea una expresión en otros tejidos).

Una variedad de terminadores transcripcionales está disponible para ser empleada en casetes de expresión. Estos son los responsables de la terminación de la transcripción más allá del transgén y su correcta poliadenilación. Los terminadores transcripcionales apropiados son aquellos que se sabe funcionan en plantas e incluyen el terminador 35S del CaMV, el tm/terminador, el terminador de opalina sintasa y el terminador rbcS E9 del guisante y similares. Las secuencias (segmentos) de nucleótidos sentido y antisentido en la secuencia viral del P0 (genéticamente modificada) según la invención, preferiblemente están bajo el control de un solo promotor, especialmente cuando ambos segmentos están comprendidos en una sola secuencia de nucleótidos (horquilla). Sin embargo, también pueden estar, cada uno, bajo el control de un promotor diferente (por ejemplo, cuando la construcción de ARN está formado por segmentos que son 2 moléculas diferentes). Esto es que la secuencia de ADN sentido puede estar operativamente unida a un primer promotor y la secuencia de ADN antisentido, operativamente unida a un segundo promotor. El primer promotor y el segundo promotor pueden ser el mismo promotor o pueden ser promotores diferentes. El promotor puede ser un promotor divergente o bidireccional capaz de iniciar la transcripción de secuencias de ADN (en los dos segmentos de ARN) a cada lado del promotor.

La secuencia o construcción de ARN o de ADN según la invención, además de una secuencia de nucleótidos (fragmentos) virales (P0) modificados sentido y antisentido, ventajosamente comprende, además, una secuencia de nucleótidos enlazante o espaciadora entre las secuencias de ADN que codifican los segmentos de ARN sentido y antisentido.

Se espera que no haya límites de longitud o requisitos de secuencia asociados con la región espaciadora, siempre que estos parámetros no interfieran con la capacidad de las regiones de ARN con la secuencia de nucleótidos (segmento) sentido y antisentido para formar un ARN de doble cadena. Preferiblemente, la secuencia o región espaciadora varía en longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 1.000 pb, más preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 500 pb, más preferiblemente aún de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 pb.

Una secuencia de nucleótidos enlazante o espaciadora preferida es una secuencia intrón, preferiblemente de orientación sentido, que mejora la eficacia de la reducción de la expresión de la secuencia de nucleótidos diana. El mejoramiento en la eficacia puede ser expresado como un aumento en la frecuencia de las plantas en las que se produce el silenciamiento o como un aumento en el nivel de reducción de la expresión viral.

Las secuencias preferidas de nucleótidos de intrones (o intrones) derivan de genes vegetales, como los genes de ARN ribosomal presuntos o genes vegetales altamente transcritos. Estos intrones pueden derivar de cualquier gen vegetal, prefiriéndose los derivados de genes vegetales de dicotiledóneas, por ejemplo, genes de petunia, siendo los más preferidos los derivados de genes de remolacha (azucarera). También es posible emplear solo parte de estos intrones (planta), por ejemplo, al menos los bordes que contienen señales se unión (véase más abajo). La totalidad de estos intrones y sus partes en el contexto de la invención son mencionados como "fragmentos de intrones" o "secuencias de intrones".

Una longitud preferiblemente para dichas secuencias de nucleótidos de intrones está comprendida entre aproximadamente 5 y aproximadamente 1.000 pb, preferiblemente entre aproximadamente 50 y aproximadamente 600 pb, más preferiblemente entre aproximadamente 90 y aproximadamente 550 pb. Las secuencias de intrones preferidas comprenden la secuencia SEQ. ID. NO: 11 o 12, o inclusive más preferiblemente consisten en la secuencia SEQ. ID. NO: 11 o 12.

La construcción de ARN, que comprende las secuencias de nucleótidos (segmento) sentido y antisentido capaces de formar, por ejemplo, una estructura en horquilla, que son producidas por la transcripción del ADN recombinante correspondiente, también puede ser introducido directamente en una célula vegetal.

Podrían producirse dichas moléculas de ARN, por ejemplo, mediante:

- clonación de la región de ADN capaz de ser transcrita en una molécula de ARN con una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos (segmento) sentido de al menos 20 (preferiblemente al menos 21, 22, 23, 24, 25 o más) nucleótidos consecutivos con una identidad de secuencia de entre 95% y 100% con (al menos parte de) la secuencia de nucleótidos de interés y un (segmento) nucleótido antisentido con al menos 20 nucleótidos, (preferiblemente al menos aproximadamente 50 nt, más particularmente al menos aproximadamente 100 nt, especialmente al menos aproximadamente 150 nt, más especialmente al menos aproximadamente 200 nt, 250 nt, 300 nt, bastante especialmente al menos aproximadamente 350 nt o aproximadamente 400 nt), y con entre aproximadamente 95% y aproximadamente 100% de una identidad de secuencia con el complemento de nucleótidos de la secuencia de nucleótidos sentido (y con el ARNm diana), por el cual esta construcción de ARN (que comprende un segmento sentido y un segmento antisentido) es capaz de formar un ARN de doble cadena por apareamiento de bases entre las regiones con secuencias de nucleótidos sentido y antisentido, dando lugar, por ejemplo, a una estructura de ARN en horquilla;

- realización de una reacción de transcripción in vitro agregando inter alia la polimerasa de ARN que depende del ADN adecuado, así como los reactivos requeridos para generar las moléculas de ARN; y

- aislamiento de las moléculas de ARN.

La invención también proporciona una planta resistente o tolerante al BMYV y posiblemente al BNYVV que comprende en el genoma de al menos parte de sus células, preferiblemente en sustancialmente todas sus células, una secuencia de P0 (sentido y/o antisentido y/o en horquilla; genéticamente modificada) (y posiblemente también una secuencia sentido y/o antisentido y/o en horquilla deducida del genoma del BNYVV) según la invención y/o un vector que la comprende, que, al transcribirse, da una molécula de ARN que dispara el PTGS del BMYV y posiblemente del BNYVV. Asimismo, se proporciona una planta resistente o tolerante al BMYV y posiblemente al BNYVV que comprende, en al menos parte de sus células, preferiblemente en sustancialmente todas sus células, una molécula de ARN según la invención para lograr el efecto descrito más arriba.

El término "planta" hace referencia a cualquier planta o parte de una planta en cualquier etapa de su desarrollo. En él también se incluyen esquejes, cultivos de células o tejidos y semillas. Tal como se la emplea junto con la presente invención, la expresión "tejido vegetal" incluye, sin limitaciones, plantas enteras, células vegetales, órganos de plantas, semillas de plantas, protoplastos, callos, cultivos celulares y cualquier otro grupo de células vegetales organizadas en unidades estructurales y/o funcionales. Estas últimas son también mencionadas como estructuras (vegetativamente) reproducibles, lo que significa que pueden ser regeneradas en una planta completa.

El material vegetal, la planta y los tejidos vegetales transformados que se obtienen pueden ser usados en una mejora genética convencional y en multiplicación de plantas o proyectos de regeneración para producir más plantas transformadas con las mismas características (resistencia o tolerancia a los virus) o para introducir la construcción de ADN según la presente invención en otras variedades de la misma especie vegetal o de especies vegetales relacionadas.

La expresión "resistencia o tolerancia a los virus" significa en la presente memoria que una célula o una planta resistente o tolerante no es susceptible ni tiene una susceptibilidad reducida a uno o más virus comparado con una célula o una planta sensible. En este caso, se contempla la resistencia y preferiblemente la resistencia extrema a infecciones por BMYV y posiblemente BNYVV. El término "tolerancia", por ejemplo, significa que hay una ausencia de síntomas usuales de una infección viral o una presencia reducida de los mismos, o que se evita o reduce la acumulación o replicación del virus en la célula, o que se evita o reduce el movimiento del virus, por ejemplo de célula a célula.

Ahora, se describirá la invención adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos detallados (no excluyentes).

Ejemplos

Para estudiar la funcionalidad de la secuencia del P0 que induce el PTGS, se construyó un vector binario de Agrobacterium, por ejemplo, según las Figuras 4A y 4B.

Se crearon las construcciones de ADN según la invención y la clonación de estas construcciones en Agrobacterium tumefaciens (cepa GV3010 (desarmada)) según los métodos y técnicas conocidos en la técnica. Los fragmentos sentido y antisentido (P0) y los intrones fueron generados por amplificación genética (reacción en cadena de la polimerasa o PCR, por sus siglas en inglés) que incluye sitios de restricciones específicas en los extremos. Mezclados junto con el esqueleto del vector, fue posible solo una recombinación/inserción de los fragmentos en base a la compatibilidad de estos sitios específicos en el extremo de los fragmentos.

Se usó la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens que porta una construcción en horquilla para mediar la transformación de Arabidopsis thaliana por el método de inmersión floral.

Se infectó material foliar de Arabidopsis thaliana transgénica con aislado natural de BMYV-2itb usando transmisión por pulgones o por cepa de BMYV-EK obtenida de un clon infeccioso y transmitida por pulgones.

En los experimentos de transmisión por pulgones: para adquirir el virus, se les dio a los pulgones un período de acceso y adquisición (AAP, por sus siglas en inglés) de 48 horas sobre una suspensión purificada de aislado de BMYV-2itb o clon de BMYV-EK. Después del AAP, se transfirieron los pulgones con un pincel de punta fina sobre hojas de Arabidopsis thaliana transgénica (10 pulgones por planta) por un período de acceso e inoculación (IAP, por sus siglas en inglés) de 96 horas. Luego, se mataron los pulgones mediante un tratamiento insecticida y se realizó una detección de virus por ELISA 3 semanas después en las hojas sistémicas.

Para todos los experimentos siguientes, los datos de ELISA fueron evaluados mediante el programa informático SAS 9.1 (método ANOVA) seguido de la prueba de Tukey. El valor P <0,05 indicó una diferencia significativa.

Ejemplo 1

El mecanismo silenciador de ARN se dirigió a las secuencias conservadas e indujo su degradación. Las secuencias más conservadas dentro de los Polerovirus residen en la mitad 3' del ARN.

Se supone que la expresión de las construcciones en horquilla con secuencias deducidas de partes conservadas del genoma viral da lugar (in planta) a la formación de ARNds que es reconocido y cortado en bicatenarios de aproximadamente 21-24 nt (ARNsi) por la enzima Dicer. Los ARNsi específicos serán cargados en un complejo RISC (complejo de silenciamiento inducido por ARN) que a su vez, dirigirá el ARN genómico viral homólogo e inducirá la degradación de este último. Como tal, el metabolismo del virus se verá gravemente perjudicado, y se reducirán los síntomas de la infección viral. En los casos más favorables, se obtendrá una resistencia total.

En primer lugar, los inventores generaron dos secuencias en horquilla derivadas del extremo 3' viral del genoma viral (BMYV).

La primera construcción albergó la secuencia CP (proteína de cápside) denominada hpCP y el segundo, el extremo 3' de la secuencia RT (proteína readthrough) con la secuencia sin codificar del extremo 3' del genoma del BMYV denominado hpRT+Nc.

Se emplearon ambas construcciones para transformar plantas de Arabidopsis thaliana y para cada uno, se obtuvieron diez líneas transgénicas independientes y se las sometió a ensayo para comprobar su resistencia con la BMYV.

Las plantas que expresan ARNsi específico del extremo 3' del genoma viral fueron inoculadas con el virus. Ninguna de las plantas transgénicas fue resistente al BMYV sea cual fuera la horquilla usada, hoCP p hpRT+Nc.

Ejemplo 2

Las construcciones hpP0(u) según la invención que codifican Arabidopsis thaliana transgénica fueron luego inoculados con aislado de BMYV-2itb.

Se crearon seis líneas independientes de Arabidopsis thaliana transgénica que expresaron el ARNm de hpP0 (o hp0u). Los resultados obtenidos con la construcción 1 (Figura 4A) están resumidos en la Figura 5. El análisis estadístico ANOVA realizado reveló diferencias existentes dentro de los valores de ELISA de plantas transgénicas y de tipo silvestre (p<0,0001). La prueba de Tukey reveló la ausencia de una diferencia significativa entre líneas transgénicas mientras que todas las líneas fueron significativamente diferentes de Col0 Inf (p<0,05) revelando la resistencia de las líneas transgénicas respecto de la inoculación de BMYV.

Se detectaron moléculas de ARNsi de P0 específico en seis líneas, pero en niveles más elevados en tres líneas resistentes (hpP0-9, -10 y -12). No se detectó ARNsi en las plantas susceptibles (Col 0).

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una construcción de ARN que comprende una secuencia de segmentos sentido y una secuencia de segmentos antisentido que tienen secuencias deducidas del gen de P0 del genoma del BMYV o de un gen ortólogo, en donde dichas secuencias de segmentos sentido y de segmentos antisentido comprenden, ambas, un fragmento de nucleótidos que tienen una secuencia que comparte al menos el 95% de la identidad de secuencia con el gen de P0 (SEQ. ID. NO: 17) del genoma del BMYV o de un gen ortólogo y que tiene un tamaño de al menos 20 nucleótidos.

2. La construcción de ARN según la reivindicación 1, en donde la o las secuencias de segmentos sentido y/o de segmentos antisentido comprende(n), además, un fragmento de nucleótidos que tienen secuencia(s) que comparte(n) al menos el 95% de la identidad de secuencia con la secuencia no traducida del extremo 5' (5'UTR) adyacente a la secuencia de nucleótidos del gen de P0 del genoma del BMYV.

3. La construcción de ARN según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde las secuencias de segmentos sentido y de segmentos antisentido comprenden un fragmento de nucleótidos que tienen secuencias que comparten 100% de la identidad de secuencia con el gen de P0 del genoma del BMYV.

4. La construcción de ARN según la reivindicación 3, en donde las secuencias de segmentos sentido y de segmentos antisentido comprenden, además, un fragmento de nucleótidos que tienen secuencias que comparten al menos el 95% de la identidad de secuencia con el gen de P1 del genoma del BMYV.

5. La construcción de ARN según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el segmento sentido comprende o consiste en la secuencia SEQ. ID. NO: 1 y/o el segmento antisentido comprende o consiste en la secuencia SEQ. ID. NO: 3.

6. La construcción de ARN según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde las secuencias de segmentos sentido y de segmentos antisentido comprenden ambas, además, un fragmento de nucleótidos que comparte al menos el 95% de la identidad de secuencia con el genoma de el BNYVV y preferiblemente en donde dicho segmento sentido comprende un fragmento de la SEQ. ID. NO: 5 y dicho segmento antisentido comprende un fragmento de la SEQ. ID. NO: 6.

7. Una construcción de ADN con capacidad de transcribirse en la construcción de ARN según cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 6.

8. Un vector que comprende una secuencia de nucleótidos de la construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 7.

9. Una molécula de ARN autocomplementaria de doble cadena expresada por la construcción de ADN según la reivindicación 7 o el vector según la reivindicación 8.

10. Un método para inducir tolerancia o resistencia, preferiblemente resistencia total a al menos el virus BMYV y posiblemente a otros virus, en una planta o en una célula vegetal, método que comprende las etapas de: preparar la construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 8, operativamente unida a una o más secuencias reguladoras activas en la planta o la célula vegetal, y transformar la célula vegetal con la construcción de ácido nucleico, lo que induce a la resistencia a al menos el virus BMYV en la planta o en la célula vegetal.

11. El método según la reivindicación 10, en donde el otro virus se selecciona del grupo que consiste en el virus del mosaico amarillo del nabo, el virus de la amarillez de las cucurbitáceas transmitido por pulgones, el virus del enrollamiento de la hoja de la patata, el virus de la hoja amarilla de la caña de azúcar, el virus del mosaico del guisante, el virus de la amarillez de la remolacha occidental (EE. UU.), el virus de la clorosis de la remolacha, el virus del enanismo amarillo del cereal y el virus BNYVV, preferiblemente el virus BNYVV.

12. Una planta transgénica o una célula vegetal transgénica tolerante o resistente, preferiblemente completamente resistente a al menos el virus BMYV y posiblemente a uno o más de otros virus y que comprende una construcción de ácido nucleico capaz de expresar la secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, preferiblemente la construcción de ADN según la reivindicación 7 operativamente unida a una o más secuencias reguladoras activas en la planta o en la célula vegetal, y/o que comprende un vector según la reivindicación 8, y/o que comprende una molécula de ARN autocomplementaria de doble cadena según la reivindicación 9.

13. La planta transgénica o célula vegetal transgénica según la reivindicación 12, seleccionada del grupo que consiste en lechuga, pepino, patata, caña de azúcar, guisante, cebada y remolacha azucarera, prefiriéndose una remolacha azucarera o una célula de remolacha azucarera.

14. Un tejido vegetal transgénico y/o estructura reproducible derivada de la célula vegetal transgénica según las reivindicaciones 12 o 13, en donde dicho tejido se selecciona del grupo que consiste en fruto, tallo, raíz, tubérculo y semilla o en donde dicha estructura reproducible se selecciona del grupo que consiste en callos, yemas o embriones.