EA029359B1 - Конструкции для сайленсинга гена p0 и их применение - Google Patents

Конструкции для сайленсинга гена p0 и их применение Download PDF

Info

Publication number
EA029359B1
EA029359B1 EA201490160A EA201490160A EA029359B1 EA 029359 B1 EA029359 B1 EA 029359B1 EA 201490160 A EA201490160 A EA 201490160A EA 201490160 A EA201490160 A EA 201490160A EA 029359 B1 EA029359 B1 EA 029359B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
sequence
rna
plant
virus
gene
Prior art date
Application number
EA201490160A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201490160A1 (ru
Inventor
Элодье Кляйн
Вероник Графф
Давид Жильмер
Вероник Бро
Ги Вейен
Марк Лефевр
Original Assignee
СЕСВандерХаве НВ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44907563&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA029359(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by СЕСВандерХаве НВ filed Critical СЕСВандерХаве НВ
Publication of EA201490160A1 publication Critical patent/EA201490160A1/ru
Publication of EA029359B1 publication Critical patent/EA029359B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8283—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for virus resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Изобретение относится к рекомбинантной нуклеотидной последовательности Р0 вируса BMYV, которая при транскрибировании в клетке способна образовывать последовательность двухцепочечной самокомплементарной РНК.

Description

Изобретение относится к рекомбинантной нуклеотидной последовательности Р0 вируса ВΜΥV, которая при транскрибировании в клетке способна образовывать последовательность двухцепочечной самокомплементарной РНК.
029359 В1
029359
Область техники
Изобретение относится к способу передачи резистентности к вирусам или толерантности по отношению к одному или более чем одному вирусу(ам), в частности к вирусу слабого пожелтения свеклы (ВМУУ) и к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы (ΒΝΥνν) или исключительно к ВМУУ в растении, в частности в растении сахарной свеклы. Кроме того, настоящее изобретение относится к резистентному или толерантному по отношению к вирусу растению, полученному согласно данному способу, а также к семенам и потомству, полученному из них.
Изобретение также относится к конструкциям для сайленсинга гена, особенно к шпилечным конструкциям, опосредующим ΒΜΥν, или сайленсинг РНК ΒΜΥν и ΒΝΥνν, и их применению.
Предшествующий уровень техники
Вирусы растений являются серьезной проблемой для многих основных сельскохозяйственных культур, так как вирусные инфекции приводят к большим потерям урожая.
У сахарной свеклы основными причинами заболеваний являются: (т) пожелтение, вызываемое полеровирусом, вирусом слабого пожелтения свеклы (ΒΜΥν), передаваемым посредством своего главного переносчика Му/щ регасае персистирующим способом; (тт) ризомания сахарной свеклы, вызываемая бенивирусом, вирусом некротического пожелтения жилок свеклы (ΒΝΥνν), передаваемым Ро1утуха Ье1ае. Широкое применение резистентных по отношению к ΒNΥVV сортов позволило защитить урожаи, однако возникают вирусные изоляты, преодолевающие резистентность, и существует острая необходимость в новых резистентных сортах.
Вирусы, передаваемые грибом, такие как ΒΝΥνν, могут сохраняться в покоящихся спорах в почве годами, после того как заражается поле. Так как не существует эффективных химических или физических способов уничтожения вируса, ни в растениях, ни в почве, единственно возможным вариантом для фермера, возделывающего сахарную свеклу, является применение генетически резистентных культур. Несколько компаний предложили ряд толерантных, даже частично резистентных сортов посредством селекции. Однако, это очень утомительный и трудоемкий процесс, обычно занимающий длительный период времени перед тем, как получают полезные резистентные растения.
Быстрая революция в областях растительной инженерии привела к развитию новых стратегий придания генетической резистентности по отношению к вирусам. Резистентность по отношению к вирусным заболеваниям посредством введения частей последовательностей вирусного генома, при котором вирусной последовательностью (конструкцией) трансформируют растительную клетку и растение, стала новым источником резистентности.
Известно, что сахарная свекла является неподатливым видом в генной инженерии, осложняя возможную успешную индукцию резистентности к вирусам.
Было опубликовано несколько примеров конструирования толерантности, например по отношению к ΒΝΥνν посредством трансформации и экспрессии последовательности белка оболочки вируса ΒΝΥνν в геноме сахарной свеклы (АО 91/13159), хотя существуют только немногочисленные опубликованные данные по целостным функциональным трансгенным растениям сахарной свеклы, такие как данные, описанные в ЕР 1169463 В1. В частности, сообщения свидетельствуют об ограниченном количестве данных по уровню резистентности, наблюдаемой в условиях инфицирования у трансгенных растений сахарной свеклы, трансформированных геном, кодирующим последовательность белка оболочки вируса ΒΝΥνν.
Геном фуровируса некротического пожелтения жилок свеклы (ΒΝΥνν) состоит из пяти плюссмысловых РНК, две из которых (РНК 1 и 2) кодируют функциональные белки, необходимые для инфицирования всех растений, в то время как другие три (РНК 3, 4 и 5) вовлечены в опосредованное переносчиком инфицирование корней сахарной свеклы (Βеίа уи1даг18). Движением ΒΝΥνν от клетки к клетке управляет набор трех последовательных, немного перекрывающихся вирусных генов на РНК 2, известных как тройной блок генов (ΤΟΒ), которые по порядку кодируют вирусные белки Р42, Р13 и Р15 (продукты генов обозначают их рассчитанной Мг (молекулярная масса) в килодальтонах).
Геном ΒΜΥV состоит из линейной плюс-смысловой РНК с шестью главными открытыми рамками считывания (ОКЕ 0-5). ОКЕ 1 и 2 кодируют белки, вовлеченные в репликацию вируса, в то время как каждый из других трех ОКЕ (ОКЕ 3, 4 и 5) кодирует структурные белки (основные и минорные белки оболочки) и предполагаемый двигательный белок.
Было показано, что белок Р0 ΒΜΥV имеет слабую экспрессию вследствие неоптимального контекста инициирующего кодона ЛИО Р0 и сильной тенденции к поддержанию низкого уровня экспрессии. Кроме того, данная часть генома является высоковариабельной, и это разнообразие последовательности было использовано для проведения различия разных видов.
Как показано, заболевания, вызываемые ΒΝΥνν, распространяются географически со скоростью, зависящей от комбинации многочисленных факторов местной окружающей среды и сельскохозяйственных факторов. Поэтому существует необходимость в улучшении механизмов генетической резистентности, которые могут, по отдельности или в сочетании, придавать стабильную и длительную устойчивость растений сахарной свеклы, которых выращивают для производственного применения.
- 1 029359
Уровень техники
В патентной заявке XVО 2007/128755 описывается последовательность ΊΌΒ-3, используемая для снижения и/или подавления вредных воздействий ΊΌΒ-3 дикого типа в растениях, для создания трансгенных растений, резистентных по отношению вирусу, особенно растений сахарной свеклы, резистентных к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы.
В Сагтеп §1тои-Ма!ео е! а1., ВюсЫтюа е! Вюркуыса Ас!а, 1809 Νο. 11-12, рр. 722-731, 2011, описываются разные противовирусные стратегии, применяемые для получения растений, резистентных по отношению к вирусам, за последние 25 лет.
В А. Ко/1о\У5ка-Маки15ка е! а1., 1оита1 о£ Оеиега1 Уио1оду Уо1. 91, Νο. 4, рр. 1082-1091, 2010, описана подавляющая активность сайленсинга РНК белков Р0 из разных изолятов полеровирусов, инфицирующих свеклу, вируса хлороза свеклы и вируса слабого пожелтения свеклы.
В Ри Уаи е! а1. 1оигиа1 о£ Уио1одюа1 МеШобк Уо1. 166, №. 1-2, рр. 101-105, 2010, описаны конструкции для сайленсинга РНК для выведения растений, резистентных по отношению к вирусу, посредством экспрессии шпилечных РНК вирусного происхождения.
Краткое описание изобретения
Согласно настоящему изобретению предложены способы и средства придания толерантности или резистентности по отношению к вирусам, которые не показывают недостатки современного уровня техники, предпочтительно способы и средства, которые придают толерантность, резистентность, предпочтительно супер- или общую резистентность, особенно толерантность по отношению к вирусу ВМУУ (вирус слабого пожелтения свеклы) или резистентность (включая супер- или общую резистентность к ВМУУ), или предпочтительно комбинированную толерантность к ВМУУ (вирус слабого пожелтения свеклы) и ΒΝΥΥ^ (вирус некротического пожелтения жилок свеклы) или резистентность (включая супер- или общую резистентность к ВМ^У и ΒΝΥΥ^ в растительной клетке или в растении, в частности в растительной клетке сахарной свеклы или в растении сахарной свеклы (возможно генерированном из данной растительной клетки).
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложены генетически модифицированные или трансформированные растительные клетки, получаемые как таковые или полученные данным способом, и из которых могут быть получены растения, которые проявляют эту повышенную толерантность или резистентность по отношению к упомянутым вирусам растений.
Согласно изобретению также предложены потомство, т.е. потомство, толерантное по отношению к вирусам или резистентное по отношению к вирусам, семена или другие воспроизводящиеся органы или структуры, происходящие из денного трансформированного растения или растительных клеток.
Первым аспектом настоящего изобретения является РНК конструкция, содержащая последовательность смыслового сегмента и последовательность антисмыслового сегмента, имеющие последовательности, полученные на основе гена Р0 (или на основе гена, кодирующего В0 белок) генома ΒМΥУ или на основе ортологичного гена, где последовательности указанного смыслового сегмента и указанного антисмыслового сегмента обе содержат нуклеотидный сегмент, имеющий последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную последовательности гена Р0 из генома ΒМΥУ или из ортологичного гена.
Предпочтительно, в данной РНК конструкции последовательность(ти) смыслового сегмента и/или антисмыслового сегмента дополнительно содержит(ат) нуклеотидный фрагмент, имеющий последовательность(ти), обладающую(ие) по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с 5'-концевой нетранслируемой последовательностью (5' ИТК), находящейся рядом с нуклеотидной последовательностью гена Р0.
Более предпочтительно в данной РНК конструкции последовательности смыслового сегмента и антисмыслового сегмента содержат нуклеотидный фрагмент, имеющий последовательности, обладающие по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью гена Р0 из генома ΒМΥУ.
Преимущественно, в данной РНК конструкции последовательности смыслового сегмента и антисмыслового сегмента дополнительно содержат нуклеотидный фрагмент, имеющий последовательности, обладающие по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с геном Р1 генома ΒМΥУ.
Возможно, в данных РНК конструкциях смысловой сегмент содержит или состоит из последовательности §Еф ГО N0:1 и/или антисмысловой сегмент содержит или состоит из последовательности §Еф ГО N0:3.
Преимущественно, в данных РНК конструкциях последовательности смыслового сегмента и антисмыслового сегмента дополнительно обе содержат нуклеотидный фрагмент, обладающий по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с геномом В№УУУ.
Родственный аспект настоящего изобретения представляет собой ДНК конструкцию, транскрибируемую в данную (данные) РНК конструкцию(ии).
Другой родственный аспект представляет собой вектор, содержащий нуклеотидную последовательность данных (ДНК) конструкций нуклеиновой кислоты.
Другой родственный аспект представляет собой молекулу двухцепочечной самокомплементарной РНК, экспрессируемую данными ДНК конструкцией или вектором.
- 2 029359
Настоящее изобретение также относится к способу индуцирования в растении или растительной клетке толерантности или резистентности, предпочтительно полной резистентности, по меньшей мере, к вирусу ВМУУ и возможно другому вирусу, причем указанный способ включает следующие стадии: получение конструкции нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению (например, содержащей последовательность, полученную на основе гена Р0 и/или генома ВМУУ), функционально связанной с одной или более чем одной регуляторной последовательностью(ми), активной(ми) в растении или растительной клетке, и трансформация растительной клетки конструкцией нуклеиновой кислоты, с индуцированием, таким образом, в растении или в растительной клетке резистентности по меньшей мере к вирусу ВМУУ.
Преимущественно данный способ дополнительно вызывает толерантность по отношению к другому вирусу, который выбран из группы, состоящей из вируса пожелтения турнепса, вируса пожелтения тыквенных, переносимого тлей, вируса скручивания листьев картофеля, вируса пожелтения листьев сахарного тростника, вируса деформирующей мозаики гороха, западного вируса пожелтения свеклы - США (Соединенные Штаты Америки), вируса хлороза свеклы, вируса желтой карликовости злаков и вируса ВИУУУ, предпочтительно вируса ВИУУУ.
Родственный аспект представляет собой способ индуцирования толерантности по отношению, по меньшей мере, к вирусу ВМУУ, включающий стадию получения конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей смысловой и антисмысловой сегменты, полученные на основе гена, кодирующего белок Р15 указанного ВИУУУ.
Еще один родственный аспект представляет собой применение нуклеотидной последовательности, содержащей последовательность, полученную на основе гена Р0, и/или генома ВМУУ и/или РНК, ДНК или вектора по настоящему изобретению для индуцирования в растении или растительной клетке толерантности или резистентности, предпочтительно полной резистентности по отношению к вирусу ВМУУ и/или к вирусу ВИУУУ.
Другой аспект представляет собой трансгенное растение или трансгенную растительную клетку, которые толерантны или резистентны, предпочтительно полностью резистентны по отношению, по меньшей мере, к вирусу ВМУУ и возможно одному или более чем одному другому(им) вирусу(ам), и содержат конструкцию нуклеиновой кислоты, способную экспрессировать нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению (содержащую последовательность, полученную на основе гена Р0 и/или из генома ВМУУ), функционально связанную с одной или более чем одной регуляторной последовательностью(ями), активной в растении или растительной клетке, содержат вектор по изобретению или содержат молекулу двухцепочечной самокомплементарной РНК по настоящему изобретению.
Предпочтительно данное трансгенное растение или данная растительная клетка являются резистентными по отношению к другому вирусу, который выбран из группы, состоящей из вируса пожелтения турнепса, вируса пожелтения тыквенных, переносимого тлей, вируса скручивания листьев картофеля, вируса пожелтения листьев сахарного тростника, вируса деформирующей мозаики гороха, западного вируса пожелтения свеклы - США, вируса хлороза свеклы, вируса желтой карликовости злаков и вируса ВИУУУ, предпочтительно вируса ВИУУУ.
Предпочтительно, данное трансгенное растение, или трансгенная растительная клетка, выбрано из группы, состоящей из салата-латука, огурца, картофеля, сахарного тростника, гороха, ячменя и сахарной свеклы, причем предпочтительными являются сахарная свекла или клетка сахарной свеклы.
Родственный аспект представляет собой ткань трансгенного растения и/или воспроизводящуюся структуру, происходящую из данной трансгенной растительной клетки (согласно настоящему изобретению), где указанная ткань выбрана из группы, состоящей из плода, стебля, корня, клубня и семени, или где указанная воспроизводящаяся структура выбрана из группы, состоящей из каллусов, почек или зародышей.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1А и Б показан фрагмент последовательности Р0 вируса согласно изобретению (фиг. 1А и Б; 8ЕО ГО N0:13) со смысловой нуклеотидной последовательностью Р0 (8Е0 ГО N0:1, короче, чем полная последовательность Р0 8Е0 ГО N0:17) и соответствующей гомологичной антисмысловой нуклеотидной последовательностью Р0 (выделено жирным, 8Е0 ГО N0:3), между которыми находится интронная последовательность петунии, составляющей 1352 п.н. (пар нуклеотидов) (выделено жирным и подчеркнуто, 8Е0 ГО N0:11). Несколько нуклеотидов на фиг. 1Б обозначены жирным курсивом. Эти нуклеотиды соответствуют 5' ИТК генома вируса ВМУУ. Небольшое количество других нуклеотидов, выделенных курсивом и подчеркнутых на фиг. 1Б, не принадлежат ни Р0, ни интрону, но, тем не менее, представлены, так как они являются остатками стратегии клонирования. Конструкция, образующая полную шпильку (8Е0 ГО N0:13), также называется ЬрР0 конструкцией 1;
на фиг. 2 (А и Б) показан другой фрагмент последовательности Р0 вируса согласно изобретению (фиг. 2А и Б; 8Е0 ГО N0:14) со смысловой нуклеотидной последовательностью Р0 и антисмысловой нуклеотидной последовательностью Р0 (выделено жирным), между которыми находится интронная последовательность свеклы, составляющая 91 п.н. (выделено жирным и подчеркнуто, 8Е0 ГО N0:12). Несколько нуклеотидов на фиг. 2Б обозначены жирным курсивом. Эти нуклеотиды соответствуют 5' ИТК. генома вируса ВМУУ. Небольшое количество других нуклеотидов, выделенных курсивом, и подчеркну- 3 029359
тых на фиг. 2Б, которые не принадлежат ни к Р0, ни к интрону, тем не менее, представлены, так как они являются остатками стратегии клонирования. Смысловая и антисмысловая нуклеотидные последовательности Р0 здесь являются такими же, как смысловая и антисмысловая нуклеотидные последовательности Р0, данные на фиг. 1Б. Конструкция, образующая полную шпильку (8ЕО ГО N0:14) также называется ЬрР0 конструкцией 2;
на фиг. 3 выделены различия в 5'-конце 8Е0 ГО N0:1, по сравнению с 5'-концом Р0 ВМУУ, кодирующим последовательность, представленную 8Е0 ГО N0:17. Подчеркнутая последовательность фиг. 3 соответствует нефункциональной 5' лидерной последовательности 8Е0 ГО N0:1;
фиг. 4 (А и Б) представляет собой схематичное изображение вектора рР0С5941, в который фрагмент гена Р0 был введен в смысловой (8Е0 ГО N0:1) и антисмысловой (8Е0 ГО N0:3) ориентации, или вперемежку с интронной последовательностью гена халконсинтазы А петунии (СН8А; 8Е0 ГО N0:11) (фиг. 4А, рР0С5941, конструкция 1; 8Е0 ГО N0:13), или вперемежку с интронной последовательностью свеклы (8Е0 ГО N0:12), составляющей 91 нуклеотид (фиг. 4Б, рР0С5941, конструкция 2; 8Е0 ГО N0:14). СаМУ 358 промотор: промотор 358 СаМУ; 0С8 3': сигнал полиаденилирования гена октопинсинтазы; МА8 промотор: промотор гена маннопинсинтазы; МА8 3': сигнал полиаденилирования гена маннопинсинтазы; ВАК: ген устойчивости к гербициду Ва§1а; рУ81: точка начала репликации рУ81; ИРТП: ген устойчивости к канамицину; ЬВ, КВ: левая и правая границы Т-ДНК;
фиг. 5 - статистический анализ теста на резистентность, полученный с помощью конструкции 1 (йрР0и с интроном петунии). Каждая гистограмма изображает среднее значение титра ВМУУ со стандартной ошибкой на 10 растениях, инокулированных ВМУУ (Υ). Ьр: шпилька; Инф: инфицированный. На оси Υ: оптическая плотность (А405), полученная посредством ЕЫ8А (твердофазный иммуноферментный анализ), 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1, 1,2. На оси X, слева направо: трансгенные линии: ЬрР0-7, ЬрР0-8, ЬрР09, ЬрР0-10, ЬрР0-11 и ЬрР0-12; ВМΥУ-инфицированный контроль: Со10 инф; Со10 здоровый;
фиг. 6 - статистический анализ теста на резистентность, полученный с помощью конструкции 2 (ЬрР0и с интроном свеклы). Каждая гистограмма изображает среднее значение титра ВМΥУ со стандартной ошибкой на 10 растениях, инокулированных ВМΥУ (Υ). Ьр: шпилька; ЬрР0: конструкция 1; ЬрР0Ьее1: конструкция 2; Инф: инфицированный. На оси Υ: оптическая плотность (А405), полученная посредством ЕЫ8А, 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3. На оси X, слева направо: трансгенные линии: ЬрР0-12 (конструкция 1), ЬрР0Ьее1-1 (конструкция 2), ЬрР0Ьее1-2, ЬрР0Ьее1-3, ЬрР0Ьее1-4, ЬрР0Ьее1-5, ЬрР0Ьее1-6, ЬрР0Ьее1-7 и ЬрР0Ьее1-8; ВМУУ-инфицированный контроль: Со10 инф; Со10 здоровый;
фиг. 7 - статистический анализ теста на резистентность, полученный с помощью конструкций 1 и 2 соответственно. Каждая гистограмма изображает среднее значение титра вируса со стандартной ошибкой на 10 инокулированных растениях (Υ). Гистограммы с темно-серым цветом изображают инфицирование клоном ВМУУ-ЕΚ, а гистограммы со светло-серым цветом - инфицирование изолятом ВМУУ-2^ΐЬ способом передачи тлями соответственно, Ьр: шпилька; ЬрР0: конструкция 1; ЬрР0свекла: конструкция 2; Инф: инфицированный. На оси Υ: оптическая плотность (А405), полученная посредством ЕЫ8А, 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5. На оси X, слева направо: трансгенные линии: ЬрР0-9 (конструкция 1), ЬрР0-10, ЬрР0-12, ЬрР0Ьее1-2 (конструкция 2), ЬрР0Ьее1-7 и ЬрР0Ьее1-8; инфицированный контроль: Со10 инф; Со10 здоровый;
на фиг. 8 изображена последовательность УТ Р0 (8Е0 ГО N0:17 и 18);
на фиг. 9 (А и Б) - последовательность шпилечной конструкции ЬрР15А4-Р0 согласно изобретению (фиг. 9А и Б, 8Е0 ГО N0:15) со смысловой Р15А4-Р0 нуклеотидной последовательностью (8Е0 ГО N0:7, нуклеотиды, выделенные курсивом, для последовательности Р15А4 с 3 подчеркнутыми мутациями и невыделенные нуклеотиды для Р0 последовательности; по сравнению с УТ Р15: А заменен на С, а АО - на ОС) и 8Е0 ГО N0:8, соответствующей антисмысловой Р15А4-Р0 нуклеотидной последовательности (выделено жирным курсивом для Р15А4 и жирным - для Р0), между которыми находится интронная последовательность свеклы, составляющая 91 п.н. (жирно, подчеркнуто, 8Е0 ГО N0:12). Несколько нуклеотидов на фиг. 9Б обозначены жирным курсивом и подчеркнуты. Эти нуклеотиды соответствуют 5' ИТК генома вируса ВМУУ. Небольшое количество других нуклеотидов, подчеркнутых на фиг. 9Б, которые не принадлежат ни к Р15А4-Р0, ни к интрону, тем не менее, представлены, так как они являются остатками стратегии клонирования. Конструкция, образующая полную шпильку (8Е0 ГО N0:15), также называется ЬрР15А-Р0 конструкцией 1;
на фиг. 10 (А и Б) - последовательность шпилечных конструкций ЬрР0-Р15А4-А и ЬрР0-Р15А4-Б согласно изобретению (фиг. 10А и Б, 8Е0 ГО N0:16) со смысловой Р0-Р15А4 нуклеотидной последовательностью (8Е0 ГО N0:9, невыделенные нуклеотиды для Р0 последовательности и нуклеотиды, выделенные курсивом, для Р15А4 последовательности с 3 подчеркнутыми мутациями) и 8Е0 ГО N0:10, соответствующей антисмысловой Р0-Р15А4 нуклеотидной последовательности (выделено жирным для Р0 и жирным курсовом - для Р15А4), между которыми находится интронная последовательность свеклы, составляющая 91 п.н. (жирно, подчеркнуто, 8Е0 ГО N0:12). Различие между двумя шпилечными конструкциями заключается в наличии двух дополнительных нуклеотидов в последовательности Р15А4 (нуклеотиды, заключенные в рамку) для конструкции ЬрР0-Р15А4-Б. Несколько нуклеотидов на фиг. 10Б обозначены жирным курсивом и подчеркнуты. Эти нуклеотиды соответствуют 5' ИТК генома вируса
- 4 029359
ΒΜΥν. Небольшое количество других нуклеотидов, подчеркнутых на фиг. 10Б, которые не принадлежат ни к Р0-Р15А4, ни к интрону, тем не менее, представлены, так как они являются остатками стратегии клонирования. Конструкция, образующая полную шпильку (δΕΟ ГО N0:16), также называется ЬрР0Р15А4-А конструкцией 2 и йрР0-Р15А4-Б конструкцией 3;
фиг. 11 (А и Б) представляет собой схематичное изображение вектора рР0С5941, в который последовательность Р15А4-Р0 или последовательность Р0-Р15А4 вводили в смысловой и антисмысловой ориентации, вперемежку с интронной последовательностью свеклы, составляющей 91 нуклеотид (фиг. 11А, рРОСйрР14А4-Р0, конструкция 1 и фиг. 11Б, рРОСйрР0-Р15А4-А и рРОСйрР0-Р15А4-Б, конструкция 2 и 3 соответственно). СаΜV 35δ промотор: промотор 35δ СаΜV; 0С8 3': сигнал полиаденилирования гена октопинсинтазы; ΜАδ промотор: промотор гена маннопинсинтазы; ΜАδ 3': сигнал полиаденилирования гена маннопинсинтазы; ВАК: ген устойчивости к гербициду ВаЧа; рVδ1: точка начала репликации рVδ1; №ТП: ген устойчивости к канамицину; ЬВ, КВ: левая и правая границы Т-ДНК.
Подробное описание изобретения
Принимая во внимание распространенность обоих вирусов в районах выращивания сахарной свеклы, авторы изобретения разработали трансгенные растения, которые являются резистентными по отношению к одному или обоим вирусам (ΒΜΥν и/или ΒΝΥνν), или даже дополнительным вирусам, способным инфицировать то же растение.
В действительности, ΒΝΥνν является главной проблемой, но авторы изобретения предполагают, что существует риск того, что распространенность ΒΜΥν также вырастет.
Первый аспект настоящего изобретения относится к конструкции РНК (такой как шпилечная РНК, предпочтительно описанная ниже как ЬрР0), содержащей смысловой сегмент (РНК) и антисмысловой сегмент (РНК), (оба) имеющие последовательности, полученные (т.е. обладающие по меньшей мере 85% идентичностью последовательности) на основе гена Р0 (или нуклеотидной последовательности) или на основе гена (нуклеотидной последовательности, кодирующей белок В0) генома ΒΜΥν или на основе ортологичных генов, или имеющие последовательности, полученные (т.е. обладающие по меньшей мере 85% идентичностью последовательности) на основе генома ΒΜΥν.
Преимущественно, данная (шпилечная; ЬрР0) РНК конструкция содержит смысловой (РНК) сегмент и антисмысловой (РНК) сегмент, (оба) дополнительно содержащие (РНК) (смысловой и/или антисмысловой) фрагменты, полученные (т.е. обладающие по меньшей мере 85% идентичностью) на основе 5'-нетранслируемой (5' - ИТК) области ΒΜΥν (находящейся рядом с этим геном, кодирующим Р0 ΒΜΥν или ортологичными генами), и/или данная (шпилечная) РНК конструкция содержит смысловой сегмент РНК и антисмысловой сегмент РНК, имеющие последовательности, полученные как на основе нуклеотидного фрагмента 5' - ИТК, так и на основе (находящегося рядом) нуклеотидного фрагмента нуклеотидной последовательности Р0 ΒΜΥν или ортологичных генов.
Предпочтительно, эти фрагменты 5'-ИТК и Р0 нуклеотидной последовательности находятся рядом в геноме ΒΜΥν.
Данная РНК шпилька, в тех случаях, когда содержит фрагмент 5'-ИТК и Р0, предпочтительно относится, в настоящем изобретении, к йрР0и нуклеотидной последовательности.
Возможно (но менее предпочтительно), эта(эти) (ЬрР0 и/или йрР0и (РНК) шпилька(и)) конструкция(и) согласно изобретению не содержит(ат) фрагмент, имеющий последовательность, полученную на основе другого вируса, такого как геном ΒΝΥνν.
Преимущественно эта(и) РНК (шпилька; ЬрР0 и/или йрР0и) конструкция(и) согласно изобретению содержит(ат) смысловой РНК сегмент и антисмысловой РНК сегмент, дополнительно имеющий (фрагмент, представляющий) последовательности, полученные на основе генома ΒΝΥνν, предпочтительно в дополнение к 5'ИТК последовательности из генома ΒΜΥν (находящаяся рядом с Р0), и/или данная(ые) РНК (шпилька; ЬрР0 и/или йрР0и) конструкция(и) содержит(ат) смысловой РНК сегмент и антисмысловой РНК сегмент (содержащий фрагмент, имеющий последовательность, полученную на основе гена Р0), оба дополнительно содержащие нуклеотидный фрагмент, обладающий по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с (частью) геномом ΒΝΥνν.
Более предпочтительно, данный смысловой и антисмысловой РНК сегменты, полученные на основе генома ΒΝΥνν, являются смысловой и/или антисмысловой последовательностями, соответствующими (части) последовательности Р15 генома ΒΝΥνν (в том случае, когда это шпилька, здесь ниже относятся к йрР0-Р15 или йрР0и-Р15, причем последняя дополнительно содержит нуклеотидный фрагмент, полученный на основе последовательности 5'-ИТК генома ΒΜΥν).
Преимущественно, эта ЬрР0 и/или йрР0и РНК (шпилечная) конструкция(и) также содержит смысловой и антисмысловой нуклеотидный (РНК) фрагменты, имеющие последовательности, полученные на основе нуклеотидной последовательности Р1ΒΜΥV.
В контексте настоящего изобретения "ортологи" относятся к генам в разных видах, которые сохраняют ту же функцию (например, в ходе эволюции). Пример ортологичных генов гена Р0 (или нуклеотидной последовательности) генома ΒΜΥν предложен в таблице.
- 5 029359
Неполный перечень идентифицированных ортологов последовательности Р0
Вирус Размер РО Хозяин
Вирус пожелтения турнепса (ранее В\Л/У\/Р1_1) 27,5 кДа (килоДальтон) салат-латук
Вирус пожелтения тыквенных, 26,4 кДа огурец
переносимый тлей
Вирус скручивания листьев картофеля 27,2 кДа картофель
Вирус пожелтения листьев сахарного тростника 28,3 кДа сахарный тростник
Вирус деформирующей мозаики гороха 34 кДа горох
Западный вирус пожелтения свеклы США 26,3 кДа сахарная свекла
Вирус хлороза свеклы 27,4 кДа сахарная свекла
Вирус желтой карликовости злаков 28,3 кДа ячмень
В контексте настоящего изобретения термин "сегмент" относится к нуклеотидной (РНК) смысловой и/или антисмысловой нуклеотидной последовательности(ям), способной(ым) быть использованной(ми) в сайленсинге генов. Таким образом, сегмент может иметь длину 10 (предпочтительно по меньшей мере 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35 или 40) нуклеотидов, а может также охватывать несколько генов и/или гены и находящиеся рядом (5'-) нетранслируемые области (5'ϋΤΚ). Предпочтительный сегмент охватывает (5' часть) ген Р0 (или нуклеотидную последовательность) и находящуюся рядом 5' ϋΤΚ.
В контексте настоящего изобретения термин "фрагмент" относится к нуклеотидной (РНК) смысловой последовательности и/или антисмысловой нуклеотидной последовательности, имеющей последовательность, полученную на основе целевой вирусной нуклеотидной последовательности. Таким образом, фрагмент может иметь длину 10 (предпочтительно по меньшей мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 30, 35 или 40) нуклеотидов, а может также охватывать более, чем один ген.
В контексте настоящего изобретения возможно несколько фрагментов ассоциированы с образованием (РНК) смыслового и/или антисмыслового сегмента(ов).
Возможно (особенно в случае, когда ассоциированы два фрагмента, полученные на основе генома разных вирусов) фрагменты ассоциированы посредством последовательности линкера или спейсера (полученного не на основе целевой вирусной последовательности) с образованием (РНК) смыслового сегмента и/или (РНК) антисмыслового сегмента(ов).
Предпочтительно в настоящем изобретении 5'ϋΤΚ фрагмент и находящийся рядом Р0 фрагмент ассоциированы не посредством последовательности линкера или спейсера.
Эти конструкции могут содержать измененные последовательности (мутированные последовательности).
Вследствие этого, термин "полученная последовательность" относится к нуклеотидным последовательностям, имеющим по меньшей мере 85% (более предпочтительно по меньшей мере 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или даже 100%) идентичность последовательности с вышеупомянутым геном. Например, последовательность, полученная на основе гена Р0 (или последовательности) генома ВМУУ относится предпочтительно к нуклеотидной последовательности, имеющей по меньшей мере 85% идентичность последовательности с последовательностью δΕΟ ГО N0:17.
Предпочтительно, эти конструкции не содержат более 15% мутированных остатков по сравнению с последовательностью дикого типа (δΕ^ ГО N0:17) и/или с последовательностью δΕΟ ГО N0:1 или последовательностью δΕΟ ГО N0:3.
Преимущественно, эти (РНК) конструкции (включая сегменты и, более предпочтительно, фрагменты) имеют размер, больше чем 25 нуклеотидов, предпочтительно больше чем примерно 50 нуклеотидов. Возможно, данные (РНК) конструкции (в форме смыслового и/или антисмыслового сегмента) имеют размер, меньше чем примерно 10000 нуклеотидов, возможно меньше, чем примерно 5000, примерно 3000, примерно 2000 или примерно 1000 нуклеотидов.
Предпочтительно, смысловой (РНК) сегмент и/или антисмысловой (РНК) сегмент (имеющий последовательность, полученную на основе 5'ϋΤΚ Р0) содержат фрагмент(ты), который охватывает по меньшей мере 5 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 10 нуклеотидов, еще более предпочтительно по меньшей мере 20 нуклеотидов 5'ϋΤΚ (находящейся рядом с геном Р0), а возможно меньше чем 40 нуклеотидов и предпочтительно меньше чем 30 нуклеотидов данной 5'ϋΤΚ (находящейся рядом с геном Р0).
Молекулярная характеристика растительного материала показала наличие малых молекул РНК, комплементарных как смысловой, так и антисмысловой последовательности ВМУУ Р0, указывая на то, что был достигнут механизм сайленсинга, и он инициировал распад геномной РНК.
- 6 029359
Данные РНК (шпилечные) конструкции эффективно инициируют РТО8 (постгранскрипционный сайленсинг генов), нацеливаясь на распад транскрибируемой РНК ВМУУ (или как ВМУУ, так и ΒΝΥνν).
Авторы изобретения в действительности открыли более сильное ингибирование ΒΜΥν (и ΒΝΥνν) с помощью конструкций, несущих 5' ИТК ΒΜΥν, в дополнение к Р0 (возможно в дополнение к (фрагментам) последовательностям, полученным на основе генома ΒΝΥνν).
Например, при использовании ЬрР0-Р15 нуклеотидной конструкции авторы изобретения обратили внимание на образование миРНК (малые интерферирующие РНК), действие которых нацелено на последовательность ΒΜΥν, а также последовательность РНК2 ΒΝΥνν, приводя в результате к очень эффективному и неожиданному ингибированию обеих вирусных инфекций.
В случае данной двойной конструкции авторы изобретения обратили внимание на более выраженное снижение обеих вирусных инфекций (ΒΜΥν и/или ΒΝΥνν), чем при использовании сопоставимой конструкции, нацеленной исключительно на ΒΝΥνν или ΒΜΥν.
Родственным аспектом является РНК конструкция (такая как шпилечная РНК), содержащая смысловой (РНК) сегмент и антисмысловой (РНК) сегмент, (оба) имеющие последовательности, полученные на основе (т.е. обладающие по меньшей мере 85% идентичностью последовательности) генома ΒΜΥν (или его нуклеотидной последовательности).
Предпочтительно, РНК конструкция (такая как шпилечная РНК), полученная на основе генома ΒΜΥν, содержащая смысловой (РНК) сегмент и антисмысловой (РНК) сегмент, имеет смысловую последовательность, полученную на основе (т.е. из обладающую по меньшей мере 85% идентичностью последовательности) 5'-части генома ΒΜΥν и/или на основе группы, состоящей из нуклеотидов генома ΒΜΥν, кодирующих Р0, Р1, Р2, Р3, Р4 и Р5 белки, более предпочтительно из нуклеотидов генома ΒΜΥν, кодирующих белки Р1 или Р2.
Преимущественно, эти (РНК) конструкции, полученные на основе генома ΒΜΥν (включающие сегменты и, более предпочтительно, фрагменты) имеют размер, больше чем примерно 25 нуклеотидов, предпочтительно больше чем примерно 50 нуклеотидов.
Возможно эти (РНК) конструкции, полученные на основе генома ΒΜΥν (в форме смыслового сегмента и/или антисмыслового сегмента), имеют размер меньше чем примерно 10000 нуклеотидов, возможно меньше чем 5000, примерно 3000, примерно 2000 или примерно 1000 нуклеотидов.
Наоборот, авторы изобретения тестировали воздействие конструкций РНК (в форме шпилек), имеющих последовательность, полученную исключительно на основе генома ΒΝΥνν (такую как последовательность, кодирующая белок Р15) или на основе генома ΒΜΥν.
Эти шпилечные Р15 конструкции, полученные на основе ΒΝΥνν, привели в результате к сниженному уровню ΒΝΥνν инфекции у растений, совместно инфицированных двумя вирусами (по сравнению с контрольными конструкциями), а также вызвали некоторое снижение выраженности симптомов ΒΜΥν (по сравнению с контрольными конструкциями).
Данные шпилечные НрР0 и главным образом ЬрР0и конструкции, полученные на основе ΒΜΥν, привели к сниженному уровню ΒΜΥν инфекции у растений, совместно инфицированных обоими вирусами (по сравнению с контрольными конструкциями), а также вызвали снижение выраженности симптомов, обусловленных ΒΝΥνν инфекцией (по сравнению с контрольными конструкциями).
Две ΒΜΥν нуклеотидные последовательности тестировали в качестве ЬрР0и нуклеотидной конструкции (последовательность 5>ЕО ΙΌ ΝΟ:13 или 14).
Нуклеотидную последовательность 5>ЕО ΙΌ ΝΟ:1, 13 или 14 можно сравнить с последовательностью 5>ЕО ΙΌ ΝΟ:17, которая представляет собой нуклеотидную последовательность Р0 дикого типа (см. фиг. 8). Длина последовательности 5>ЕО ГО ΝΟ:1 короче, чем нуклеотидная последовательность 5ЕО ГО ΝΟ:17 (659 нуклеотидов по сравнению с 720 нуклеотидами), и она содержит 5'ИТК вирусного генома (подчеркнутые нуклеотиды), за исключением первого нуклеотида 5' конца.
Преимущественно смысловая и антисмысловая Р0 нуклеотидная последовательности содержатся в одной молекуле, и/или смысловой Р0 РНК сегмент и антисмысловой Р0 РНК сегмент содержатся в одной единственной молекуле РНК. Преимущественно, молекула РНК согласно изобретению способна сворачиваться, так что указанные РНК сегменты, содержащиеся там, образуют молекулу двухцепочечной шпилечной РНК.
В данном контексте "шпилечная РНК" относится к любой молекуле самоотжигающейся двухцепочечной РНК. В своем самом простом представлении шпилечная РНК состоит из двухцепочечного стебля, составленного отжигающимися нитями РНК, соединенного с петлей одноцепочечной РНК. Однако термин "шпилечная РНК" также направлен на то, чтобы охватывать более сложные вторичные структуры РНК, содержащие самоотжигающиеся двухцепочечные РНК последовательности, а также внутренние выпетливания и петли. Конкретная адаптированная вторичная структура будет определяться посредством свободной энергии молекулы РНК, и может быть предсказана для разных ситуаций с использованием соответствующего программного обеспечения, такого как ΡΟΕΌΚΝΑ.
В качестве альтернативы, смысловая и антисмысловая нуклеотидные последовательности Р0 могут находиться (или кодироваться) в или на двух отдельных молекулах или нуклеотидных последовательно- 7 029359
стях, которые могут быть введены или привнесены в растительную клетку одновременно и/или последовательно, так что при транскрибировании молекула двухцепочечной РНК может образовываться посредством спаривания оснований.
Изобретение также относится к конструкции ДНК, способной к транскрипции в конструкцию(и) РНК по изобретению, и к вектору, содержащему данную ДНК конструкцию, в частности экспрессионному (и/или самореплицирующемуся вектору (такому как плазмида или вирусный вектор)) вектору или экспрессионной кассете (или системе), предпочтительно кодирующей смысловой и антисмысловой сегменты РНК, имеющие последовательности, полученные на основе последовательности(ей) Р0, функционально связанные с одной или более чем одной регуляторной последовательностью (последовательность промотора или оператора, включая поли(А)- последовательность), активной в растении или растительной клетке, предпочтительно в специфичной ткани (предпочтительно корень) растения.
Другой аспект настоящего изобретения относится к трансгенному растению или клетке растения, такого как ЛгаЫборвБ ШаНапа или растение сахарной свеклы (Вс1а унЦапв). которое трансформируют нуклеотидной (ДНК) конструкцией, вектором и/или молекулой РНК согласно изобретению.
Преимущественно, наблюдается низкая, или даже не наблюдается, амплификация вируса в инокулированном растении, трансформированном фрагментом(и) нуклеотидной(ых) последовательности(ей) Р0 согласно изобретению.
Предпочтительно, ДНК конструкции согласно изобретению стабильно встраиваются в геном растительной клетки, трансформированной генетически модифицированными последовательностями Р0 вирусов согласно изобретению и/или вектором, содержащим данные последовательности.
В качестве альтернативы, трансген, содержащий генетически модифицированную нуклеотидную последовательность Р0 согласно настоящему изобретению, может быть локализован на эписоме или самореплицирующемся векторе. Примерами самореплицирующихся векторов являются вирусы, в частности геминивирусы или плазмиды.
Многочисленные вектора для трансформации, доступные для трансформации растений, известны специалистам в данной области, а ДНК или нуклеотидные конструкции согласно данному изобретению (содержащие генетически модифицированную последовательность Р0 вируса) можно использовать в сочетании с любыми такими векторами. Выбор вектора зависит от предпочтительной методики трансформации.
Компоненты экспрессирующей системы можно модифицировать, например, с увеличением экспрессии смысловых и антисмысловых РНК сегментов.
Промотор, функционально связанный со смысловой и/или антисмысловой нуклеотидными последовательностями согласно изобретению, может представлять собой нативный промотор клетки для трансформации. Промотор в качестве альтернативы может представлять собой гетерологичный промотор, например тканеспецифичный промотор, промотор, регулируемый в процессе развития, конститутивный промотор или индуцибельный промотор. Соответствующие промоторы хорошо известны специалисту в данной области. В настоящем изобретении предпочтительными являются сильные гетерологичные промоторы, которые являются активными в тканях корня или являются первоначально активными в них (когда не желательна экспрессия в других тканях).
Разнообразие терминаторов транскрипции доступно для применения в экспрессионных кассетах. Они ответственны за прекращение транскрипции вне трансгена и его правильное полиаденилирование. Соответствующие терминаторы транскрипции представляют собой терминаторы транскрипции, которые, как известно, функционируют в растениях и включают терминатор СаМУ 358, 1т/терминатор, терминатор нопалинсинтазы и терминатор гЬс8 Е9 гороха и тому подобное.
Смысловые и антисмысловые нуклеотидные последовательности (сегменты) в (генетически модифицированной) последовательности Р0 вируса согласно изобретению предпочтительно находятся под контролем одного единственного промотора, главным образом тогда, когда оба сегмента включены в одну единственную нуклеотидную (шпилечную) последовательность. Однако они также могут быть, каждая, под контролем отличного промотора (например, когда РНК конструкция сделана из сегментов, являющихся двумя разными молекулами). Т.е. смысловая последовательность ДНК может быть функционально связана с первым промотором, а антисмысловая ДНК последовательность - функционально связана со вторым промотором. Первый промотор и второй промотор могут быть одним и тем же промотором или могут быть разными промоторами. Промотор может быть дивергентным или двунаправленным промотором, способным инициировать транскрипцию ДНК последовательностей (в два сегмента РНК) на каждой стороне промотора.
РНК и ДНК конструкция или последовательность согласно изобретению, кроме смысловой и антисмысловой модифицированной (Р0) нуклеотидной (фрагмент) последовательности вируса, преимущественно дополнительно содержат нуклеотидную последовательность линкера или спейсера между ДНК последовательностями, кодирующими смысловой и антисмысловой РНК сегменты.
Ожидают, что отсутствуют ограничения длины или требования к последовательности, связанные с областью спейсера, при условии, что эти параметры не затрагивают способность РНК областей со смысловой и антисмысловой нуклеотидной (сегмент) последовательностью образовывать двухцепочечную
- 8 029359
РНК. Предпочтительно, область спейсера или последовательность варьирует по длине от примерно 5 до примерно 1000 п.н., более предпочтительно от примерно 10 до примерно 500 п.н., еще более предпочтительно от примерно 50 до примерно 200 п.н.
Предпочтительной нуклеотидной последовательностью спейсера или линкера является интронная последовательность, предпочтительно интронная последовательность в смысловой ориентации, усиливающая эффективность снижения уровня экспрессии целевой нуклеотидной последовательности. Усиление эффективности может быть выражено как повышение частоты встречаемости растений, у которых происходит сайленсинг, или как повышение уровня снижения экспрессии вируса.
Предпочтительные интронные нуклеотидные последовательности (или интроны) происходят из генов растений, подобно предполагаемым генам рибосомальной РНК или высокотранскрибируемым генам растений. Данные интроны могут происходить из генов двудольных растений, например, из генов Ре1ита, еще более предпочтительно - происходят из генов (сахарной) свеклы. Также возможно применять только часть этих (растительных) интронов, например, по меньшей мере границы, содержащие сигналы сплайсинга (см. ниже). Все данные интроны и их части в контексте изобретения называются "интронными фрагментами" или "интронными последовательностями".
Предпочтительная длина для таких интронных нуклеотидных последовательностей находится между примерно 5 и примерно 1000 п.н., предпочтительно между примерно 50 и примерно 600 п.н., более предпочтительно между примерно 90 и примерно 550 п.н. Предпочтительные интронные последовательности содержат последовательность §ЕО ГО N0:11 или 12, или даже более предпочтительно состоят из последовательности §ЕО ГО N0:11 или 12.
РНК конструкцию, содержащую смысловую и антисмысловую нуклеотидную (сегмент) последовательности, способные образовывать, например, структуру шпильки, которые образуются посредством транскрипции соответствующей рекомбинантной ДНК, можно также вводить непосредственно в растительную клетку.
Такие молекулы РНК могли бы быть образованы, например, посредством
клонирования ДНК области, способной транскрибироваться в молекулу РНК с нуклеотидной последовательностью, содержащей смысловую нуклеотидную последовательность (сегмент) по меньшей 10 (предпочтительно по меньшей мере 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более) последовательных нуклеотидов, имеющую 75-100% идентичность последовательности с (по меньшей мере частью) интересующей нуклеотидной последовательностью, и антисмысловую нуклеотидную последовательность (сегмент), имеющую по меньшей мере 10 нуклеотидов (предпочтительно по меньшей мере примерно 15 нуклеотидов, 20 нуклеотидов, в частности по меньшей мере примерно 50 нуклеотидов, конкретнее по меньшей мере примерно 100 нуклеотидов, главным образом по меньшей мере примерно 150 нуклеотидов, особенно по меньшей мере примерно 200 нуклеотидов, 250 нуклеотидов, 300 нуклеотидов, совсем конкретно по меньшей мере примерно 350 нуклеотидов или примерно 400 нуклеотидов) и имеющую от примерно 75% до примерно 100% идентичности последовательности с последовательностью, комплементарной нуклеотидам смысловой нуклеотидной последовательности (и с целевой мРНК), в результате чего данная конструкция РНК (содержащая смысловой и антисмысловой сегменты) способна образовывать двухцепочечную РНК посредством спаривания оснований между областями со смысловой и антисмысловой нуклеотидной последовательностью, давая в результате, например, шпилечную РНК структуру;
проведения ίη νίίτο реакции транскрипции посредством добавления помимо прочего подходящей ДНК-зависимой РНК полимеразы, а также необходимых реагентов для образования молекул РНК; и
выделения молекул РНК.
Согласно изобретению также дополнительно предложено ВМУУ и/или ΒΝΥνν резистентное или толерантное растение, которое содержит в геноме по меньшей мере части своих клеток, предпочтительно большинства своих клеток, (генетически модифицированную; смысловую, и/или антисмысловую, и/или шпилечную) Р0 последовательность (и возможно также смысловую, и/или антисмысловую, и/или шпилечную последовательность, полученную на основе генома ΒΝΥνν) согласно изобретению и/или вектор, содержащий то же самое, который, при транскрибировании, дает молекулу РНК, которая инициирует РТО8 ΒΜΥν и, возможно, ΒΝΥνν. Также предложено ΒΜΥν и/или ΒΝΥνν резистентное или толерантное растение, которое содержит по меньшей мере в части своих клеток, предпочтительно в большинстве своих клеток, молекулу РНК согласно изобретению с достижением описанного выше эффекта.
"Растение" относится к любому растению или части растения на любой стадии развития. Сюда также включены черенки, клеточные или тканевые культуры и семена. Используемый в связи с нестоящим изобретением термин "растительная ткань" включает целые растения, растительные клетки, органы растений, семена растений, протопласты, каллус, клеточные культуры и любые группы растительных клеток, организованных в структурные и/или функциональные единицы, но не ограничивается ими. Последние также называются (вегетативно) воспроизводящимися структурами, означая то, что из них можно регенерировать целое растение.
Полученное трансформированное растение, растительные ткани и растительный материал можно использовать в традиционной селекции и размножении растений или схемах регенерации с получением большего количества трансформированных растений с теми же характеристиками (резистентность или
- 9 029359
толерантность по отношению к вирусам) или с введением конструкции ДНК согласно настоящему изобретению в другие сорта того же или родственного вида растения.
"Резистентность или толерантность по отношению к вирусам" в данном документе означает, что резистентная или толерантная клетка или растение или является нечувствительным, или имеет пониженную чувствительность к одному или более чем одному вирусу по сравнению с чувствительной клеткой или растением. В настоящем случае рассматривают резистентность и предпочтительно суперрезистентность по отношению к ВМУУ и/или ΒΝΥνν инфекциям. Толерантность, например, означает, что обычные симптомы вирусной инфекции отсутствуют, или их выраженность снижена, или накопление или репликация вируса в клетке предупреждена или снижена, или движение вируса, например, от клетки к клетке предупреждено или уменьшено. Далее изобретение будет дополнительно описано посредством ссылки на следующие подробные (неограничивающие) примеры.
Примеры
Для изучения функциональности последовательности Р0, вызывающей РТО8, конструировали бинарный вектор АдтоЪасГетшт, например, согласно фиг. 4 А и 4Б.
Создание ДНК конструкций согласно изобретению и клонирование этих конструкций в АдтоЪаеГетшт Гите£ае1еи5 ((нейтрализованный) штамм Ον3101) проводили согласно способам и методикам, хорошо известным в данной области. (Р0) смысловой и антисмысловой фрагменты и интроны генерировали посредством генетической амплификации (ПЦР (полимеразная цепная реакция)), включая специфичные сайты рестрикции на концах. Будучи смешанными с основой вектора, только одна рекомбинация/вставка фрагментов была возможной на основе совместимости данных специфичных сайтов на конце фрагментов.
Штамм Ον3101 АдтоЪаеГетшт ЩтеГасает. несущий шпилечную конструкцию, применяли для содействия в проведении трансформации АгаЫ4ор818 Гйайаиа способом окунания цветков.
Материал листьев трансгенного АгаЫйорхй ГйаИапа инфицировали встречающимся в природе изолятом ΒΜΥν-2ί&, используя передачу с помощью тлей, или штаммом ΒΜΥν-ΕΚ, полученным из инфекционного клона и переносимым с помощью тлей.
Для экспериментов по передаче с помощью тлей: для приобретения вируса тлям давали 48-часовой период доступа для приобретения (ААР) на очищенной суспензии ВМУУ-2йЪ изолята или клона ΒΜΥνΕΚ. После ААР тлей переносили тонкой кисточкой на листья трансгенного АгаЫ4ор818 Гйайаиа (10 тлей на растение) в течение 96-часового периода доступа для инокуляции (1АР). Затем тлей убивали обработкой инсектицидами, а детектирование вирусов посредством ЕЫ§А проводили 3 недели спустя на системных листьях.
Для всех экспериментов, описанных ниже, данные по ЕЫ§А оценивали посредством программного обеспечения §А§ 9.1 (метод АNΟVА) с последующим использованием критерия Тьюки. Значение Р менее 0,05 указывало на достоверное различие.
Пример 1.
Механизм РНК сайленсинга нацелен на консервативные последовательности и вызывает их разрушение. Наиболее консервативные последовательности в пределах полеровирусов располагаются на 3' конце РНК.
Считается, что экспрессия шпилечных конструкций, имеющих последовательности, полученные на основе консервативных частей вирусного генома, приводит (в растении) к образованию двухцепочечной РНК, которая узнается и расщепляется на дуплексы, составляющие примерно 21-24 нуклеотида (миРНК) с помощью фермента ЭКек Специфичные миРНК будут загружены в ККС комплекс (комплекс сайленсинга, индуцированный РНК), который в свою очередь будет нацелен на гомологичную вирусную геномную РНК и будет вызывать распад последней. В связи с этим метаболизм вируса будет серьезно нарушен, и выраженность симптомов вирусной инфекции будет снижена. В наиболее благоприятных случаях будет получена общая резистентность.
Авторы изобретения, прежде всего, генерировали две шпилечные последовательности, происходящие из 3'-конца вируса вирусного генома (ΒΜΥν).
Первая конструкция несла последовательность СР (белок оболочки) под названием ЬрСР, а вторая 3' конец последовательности КТ (белок с "прочитанным" терминатором) с 3' концом некодирующей последовательности ΒΜΥν генома под названием ΙφΡΤ+Να.
Обе конструкции применяли для трансформации растений АгаЫйорхй ГйаИапа и для каждой получали десять независимых трансгенных линий и тестировали на их резистентность по отношению к ΒΜΥν.
Растения, экспрессирующие миРНК, специфичные к 3' концу вирусного генома, инфицировали вирусом. Ни одно из трансгенных растений не было резистентным по отношению к ΒΜΥν, независимо от того, применяли ли ЬрСР или ΙφΡΤ+Να шпильку.
Пример 2.
Трансгенные растения АгаЫйорйх ГйаИапа, кодирующие ЬрР0(и) конструкции согласно изобретению, затем инфицировали изолятом ΒΜΥν-2ίΛ.
Создавали шесть независимых трансгенных линий АгаЫйорхй ГЬайапа, которые экспрессируют
- 10 029359
брР0 (или бр0и) мРНК (матричная РНК). Результаты, полученные с конструкцией 1 (фиг. 4А), обобщены на фиг. 5. Проведенный статистический анализ ΑΝΟνΑ показал существующие различия в пределах значений по ЕЫ§А трансгенных растений и растений дикого типа (р менее 0,0001). Критерий Тьюки показал отсутствие значимого различия между трансгенными линиями, тогда как все линии значимо отличались от Со10 инф (р менее 0,05), выявляя резистентность трансгенных линий по отношению к инокуляции ΒΜΥν.
Р0-специфичные молекулы миРНК детектировали в шести линиях, но на более высоких уровнях - в трех резистентных линиях (брР0-9, -10 и -12). У чувствительных растений (Со1 0) миРНК не детектировали.
Данные результаты указывают на то, что брР0(и) конструкции подходят для того, чтобы вызывать РТО8 в растениях АгаЫбор818 (бабапа, и могут вызывать резистентность по отношению к ΒΜΥν.
Пример 3.
Эксперименты из примера 2 повторяли с конструкцией 2 (фиг. 4Б) и с большим количеством (восемь) трансгенных линий АгаЫбор818 (бабапа, инфицированных изолятом ΒΜΥν-266.
Результаты обобщены на фиг. 6. Для данной конструкции, за исключением линии брР0свекла-3, все линии были резистентными по отношению к ΒΜΥν, что подтверждается ΑΝΟνΑ и статистическим анализом Тьюки (р меньше 0,05). Значимого различия между брР0-12 и резистентными линиями брР0свекла не наблюдали.
Было обнаружено, что уровень Р0-специфичных молекул миРНК значительно выше в резистентных линиях (брР0Ьее!-1, -2, -5, -7 и 8), чем в других линиях.
Пример 4.
Результаты, описанные в примере 2 и в примере 3, повторяли как с типом трансгенных линий АгаЬ1бор818 1бабаиа (брР0-9, -10, -12, брР0Ьее(-2, -7 и -8), так и двумя источниками инокулята (ΒΜΥν-ΕΚ или ΒΜΥν-2ίΦ).
Результаты представлены на фиг. 7. Все трансгенные линии АгаЫбормх (бабапа оказались резистентными по отношению к инокуляту ΒΜΥν-ΕΚ (р менее 0,05). Трансгенные линии отвечают поразному на ΒΜΥν-2ίώ изолят.
В своей совокупности данные результаты показывают лучшую защищенность по отношению к ΒΜΥν, когда трансген содержит интрон свеклы.
Индукция РТО8 посредством шпилечной конструкции, таким образом, по-видимому, является хорошим источником резистентности по отношению к вирусной инфекции, и в частности по отношению к ΒΜΥν.
Из вышеприведенных примеров получается, что резистенитность по отношению к брР0(и) патогенного происхождения согласно изобретению является высокоэффективной.
Конструкции брР0 по изобретению успешно индуцировали вызванную патогеном резистентность растений. Все тестируемые конструкции брР0 вызывали распад геномной РНК посредством РТО8, что давало в результате резистентные по отношению к ΒΜΥν растения.
Пример 5.
Авторы изобретения протестировали эффективность других стратегий с использованием конструкции брСР, содержащей ген, кодирующий белок оболочки генома ΜΒΥν, и 3' дистальную последовательность (брКТ + NС конструкция гена ΒΜΥν, кодирующего КТ белок, за которым следует некодирующий конец вирусной ΒΜΥν РНК). Авторы изобретения неожиданно открыли, что данные две дополнительные конструкции являлись неэффективными для индуцирования в растении резистентности по отношению к вирусам.
Перечень последовательностей
<110> СЕС
<120> Р0 шпилечные конструкции и применение
<130> ВР5Е33009ВИО
<160> 18
<170> РаЕепЫп νθΓ3ίοη 3.3
<210> 1
<211> 659
<212> ДНК
<213> Вирус слабого пожелтения свеклы
- 11 029359
<220>
<221> ген
<222> (1)..(659)
<223> ΒΜΥν 5'иТК и Р0
<220>
<221> 5'ИТК
<222> (1)..(30)
<220>
<221> СИЗ
<222> (31)..(657)
<400> 1
саааадааас садсдадда5 с5адсад5с5 а5д саа 555 сад с55 ааа аса аас 54
Ме5 О1п РЬе О1п Ьеи Ьуз ТЬг Азп 1 5
ад5 55с ас5 5д5 5сд 55д
Зег РЬе 10 ТЬг Суз Зег Ьеи
55а аас асс дсд 5а5 555
Ьеи 25 Азп ТЬг А1а Туг РЬе 30
дад аа5 даа аас 5д5 а55
О1и Азп О1и Азп Суз 45 11е
с5с ад5 аад сад с5с дас
Ьеи Зег Ьуз О1п 60 Ьеи Азр
сдс сад 5с5 55а сда с5д
Агд О1п Зег 75 Ьеи Агд Ьеи
55а ссс адс ас5 сдс аас
Ьеи Рго 90 Зег ТЬг Агд Азп
д55 ааа ада 555 5ас с55
ν&ι 105 Ьуз Агд РЬе Туг Ьеи 110
адд с5а саа сдс сдс ада
Агд Ьеи О1п Агд Агд 125 Агд
ааа аад 55с с55 5са д5а
Ьуз Ьуз РЬе Ьеи 140 Зег ν&1
дад ад5 сс5 ааа а5с да5
О1и Зег Рго 155 Ьуз 11е Азр
сдс да5 а5д ддс ас5 с5с
Агд Азр 170 Ме5 О1у ТЬг Ьеи
аас сда ссд с5а аса дс5
Азп 15 Агд Рго Ьеи ТЬг А1а 20
с55 асд аа5 са5 55а ссд
Ьеи ТЬг Азп Н1з Ьеи 35 Рго
сд5 5с5 с55 с5с дс5 дс5
Агд Зег Ьеи Ьеи 50 А1а А1а
ссс ддд адс 555 а55 5ас
Рго О1у Зег 65 РЬе 11е Туг
дсс адд 55с 5ас аа5 5ас
А1а Агд 80 РЬе Туг Азп Туг
а55 дас 55а сда д5д ссс
11е 95 Азр Ьеи Агд ν&1 Рго 100
дсс сда аа5 5са ддс ада
А1а Агд Азп Зег О1у 115 Агд
даа а55 55с 5с5 сдс дд5
О1и 11е РЬе Зег 130 Агд О1у
5дд 5д5 дс5 даа адс дад
Тгр Суз А1а 145 О1и Зег О1и
а55 ада а5д дас са5 а55
11е Агд 160 Ме5 Азр Н1з 11е
55д сас сд5 с5д д5а с55
Ьеи 175 Нгз Агд Ьеи ν&1 Ьеи 180
аса ТЬг дад О1и сда Агд д55 ν&1 102
с5с д5а ас5 555 150
Ьеи ν&1 ТЬг РЬе 40
с5д сс5 55д с5д 198
Ьеи Рго Ьеи 55 Ьеи
дс5 ссс ддд ааа 246
А1а Рго 70 О1у Ьуз
5дс дда дсс д5д 294
Суз 85 О1у А1а ν&1
ссс ада ааа дас 342
Рго Агд Ьуз Азр
да5 с5д ддд дад 390
Азр Ьеи О1у О1и 120
даа дса дад 555 438
О1и А1а О1и 135 РЬе
ада аад с5а сдд 486
Агд Ьуз 150 Ьеи Агд
а55 а5д д5с 55а 534
11е 165 Ме5 ν&1 Ьеи
д55 даа даа с5а 582
ν&1 О1и О1и Ьеи
- 12 029359
бас Туг 185 саб Ηΐ3 ада Агд ааб Азп асб ТЬг баб Туг 190 дсб А1а дад О1и сбс Ьеи дсб А1а ббб РЬе 195 бдс Суз дбб Уа1 сас ΗΪ3 сас ΗΪ3 сбб Ьеи 200 630
ббб ддб даа дсб сдб ддб абд даб ббб бд 659
РЬе О1у О1и А1а Агд О1у Меб Азр РЬе
205
<210> 2
<211> 209
<212> РКТ
<213> Вирус слабого пожелтения свеклы
<400> 2
Меб 1 О1п РЬе О1п Ьеи 5 Ьуз ТЬг Азп Зег РЬе 10 ТЬг Суз Зег Ьеи Азп 15 Агд
Рго Ьеи ТЬг А1а ТЬг О1и Агд Уа1 Ьеи Азп ТЬг А1а Туг РЬе Ьеи ТЬг
20 25 30
Азп Ηΐ3 Ьеи Рго Ьеи Уа1 ТЬг РЬе О1и Азп О1и Азп Суз 11е Агд Зег
35 40 45
Ьеи Ьеи А1а А1а Ьеи Рго Ьеи Ьеи Ьеи Зег Ьуз О1п Ьеи Азр Рго О1у
50 55 60
Зег РЬе 11е Туг А1а Рго О1у Ьуз Агд О1п Зег Ьеи Агд Ьеи А1а Агд
65 70 75 80
РЬе Туг Азп Туг Су3 О1у А1а Уа1 Ьеи Рго Зег ТЬг Агд Азп 11е Азр
85 90 95
Ьеи Агд Уа1 Рго Рго Агд Ьуз Азр Уа1 Ьуз Агд РЬе Туг Ьеи А1а Агд
100 105 110
Азп Зег О1у Агд А3р Ьеи О1у О1и Агд Ьеи О1п Агд Агд Агд О1и 11е
115 120 125
РЬе Зег Агд О1у О1и А1а О1и РЬе Ьуз Ьуз РЬе Ьеи Зег Уа1 Тгр Суз
130 135 140
А1а О1и Зег О1и Агд Ьуз Ьеи Агд О1и Зег Рго Ьуз 11е Азр 11е Агд
145 150 155 160
Меб Азр Ηΐ3 11е 11е Меб Уа1 Ьеи Агд Азр Меб О1у ТЬг Ьеи Ьеи Шз
165 170 175
Агд Ьеи Уа1 Ьеи Уа1 О1и О1и Ьеи Туг Шз Агд Азп ТЬг Туг А1а О1и
180 185 190
- 13 029359
Ьеи А1а РЬе Суз Уа1 Ыз Ηΐ3 Ьеи РЬе О1у О1и А1а Агд О1у Ме! Азр 195 200 205
РЬе
<210> 3
<211> 659
<212> ДНК
<213> Вирус слабого пожелтения свеклы
<220>
<221> т1зс_беабиге
<222> (1)..(659)
<223> Антисмысловая Р0 и 5'иТК.
<400> 3
сааааабсса бассасдадс ббсассаааа аддбддбдаа сдсааааадс дадсбсадса 60
баадбабббс бабддбабад ббсббсааса адбассадас ддбдсаадад адбдсссаба 120
бсдсдбаада ссабаабааб абддбссабб сбаабабсда ббббаддасб сбсссдбадс 180
бббсбсбсдс бббсадсаса ссабасбдаа аддаасбббб бааасбсбдс ббсассдсда 240
дадааааббб сбсбдсддсд ббдбадссбс бсссссадаб сбсбдссбда абббсдддса 300
аддбаааабс ббббаасдбс ббббсбдддд ддсасбсдба адбсаабдбб дсдадбдсбд 360
ддбаасасдд сбссдсадба аббдбадаас сбддссадбс дбааадасбд дсдбббсссд 420
ддадсдбааа бааадсбссс ддддбсдадс бдсббасбда дсадсааадд сададсадсд 480
адаададаас даабасадбб ббсаббсбса ааадббасда дсддбааабд аббсдбаада 540
ааабасдсдд бдбббаааас бсдсбсбдба дсбдббадсд дбсддббсаа сдаасаадбд 600
ааасбдбббд ббббаадсбд аааббдсаба дасбдсбада бссбсдсбдд бббсббббд 659
<210> 4
<211> 5722
<212> ДНК <213> Вирус слабого <220> <221> т1зс_беабиге <222> (1)..(5722) <223> Геном ΒΜΥν пожелтения свеклы
<400> 4
асаааадааа ссадсдадда бсбадсадбс бабдсааббб садсббаааа сааасадббб 60
сасббдббсд ббдаассдас сдсбаасадс басададсда дббббаааса ссдсдбаббб 120
бсббасдааб сабббассдс бсдбаасббб бдадаабдаа аасбдбаббс дббсбсббсб 180
сдсбдсбсбд ссбббдсбдс бсадбаадса дсбсдасссс дддадсббса бббасасбсс 240
- 14 029359
сдддааасдс садЕсЕЕЕас дасЕддссад дЕЕсЕасааЕ ЕасЕдсддад ссдЕдЕЕасс 300
садсасЕсдс аасаЕЕдасЕ ЕасдадЕдсс ссссадаааа дасдЕЕаааа даЕЕЕЕассЕ 360
ЕдсссдаааЕ Есаддсадад аЕсЕддддда даддсЕасаа сдссдсадад аааЕЕЕЕсЕс 420
ЕсдсддЕдаа дсададЕЕЕа аааадЕЕссЕ ЕЕсадЕаЕдд ЕдЕдсЕдааа дсдададааа 480
дсЕасдддад адЕссЕаааа ЕсдаЕаЕЕад ааЕддассаЕ аЕЕаЕЕаЕдд ЕсЕЕасдсда 540
ЕаЕдддсасЕ сЕсЕЕдсасс дЕсЕддЕасЕ ЕдЕЕдаадаа сЕаЕассаЕа даааЕасЕЕа 600
ЕдсЕдадсЕс дсЕЕЕЕЕдсд ЕЕсассассЕ ЕЕЕЕддЕдаа дсЕсдЕддЕа ЕддаЕЕЕЕЕд 660
дсддЕЕддсЕ аасЕЕсссЕд дЕаааЕддЕЕ ЕаЕЕЕдсЕсЕ сасдаааЕдЕ аЕЕЕЕдаааа 720
сЕсЕЕЕсаЕс садааададс ЕасдЕЕЕдЕд адсдаЕсЕдЕ ааааддЕЕЕЕ сЕсассЕЕЕа 780
ссаЕсаааса аадсссдссд сдЕааЕЕдса ЕЕсЕЕсаааЕ асаасасдса дасддЕЕссс 840
аЕдссддЕЕа ЕдсаасаЕдс дЕаассЕЕаЕ Есдасдддас ааасддаЕЕд ЕЕдасЕдсдс 900
аасаЕдЕадЕ ЕдасдаЕЕЕЕ Еасдааддад асссдадааа дасЕсЕаааа дЕсдЕсЕсса 960
сссдсааЕдд ааасааааЕс ссссЕЕдаЕд ааЕЕсададЕ дасдЕасаса ЕсЕдадаааа 1020
дддаЕсадЕЕ дЕЕдаЕдсаЕ дддсссссаа асЕдддаадд адЕЕсЕЕдсс Едсааддсад 1080
ЕЕсасаЕдаЕ ЕссддсаЕсд адЕдЕЕдсаа ааЕсдааадс аасЕЕЕсЕЕЕ дсЕсЕдЕсдд 1140
аЕддЕдааЕд дсаЕЕссЕсЕ ааЕдссдадс ЕсдЕЕддсас аЕссаадЕдс ддааааЕЕса 1200
ЕЕЕсЕдЕасЕ садЕдасаса аададЕддЕс аЕЕсдддсас ЕсссЕаЕЕЕс ааЕддЕаада 1260
дЕдЕЕсЕЕдд адЕЕсасаЕа ддсЕсЕссда аадааЕЕЕда дЕсддааааЕ дЕЕаасЕаса 1320
ЕдЕсЕссЕаЕ ассасдЕЕЕЕ ссЕддаЕЕаа ссадсссдаа сЕасаЕаЕЕЕ дааассасад 1380
сссЕЕдсЕдд ааааЕЕЕЕЕс адссаададд аадЕсдаада дсЕааЕддаа дасЕЕсЕсЕс 1440
ЕссаададаЕ ЕЕаЕЕсЕаЕа дсдасддсас дЕдддаадЕа саЕааааЕаЕ даддсЕЕдЕс 1500
саддЕдаада дасаЕЕссаЕ даЕдЕдсЕаа сададЕссЕс сссдаЕдсад ддддааддаа 1560
дддсддсЕсс дассдссдда асаассддаа асдсаадсас ссасдадада Ессдсаддаа 1620
аЕддааааад сссЕсдЕдсЕ дсЕссЕЕсЕа сассдсддда асссЕЕддЕд аааасЕдсас 1680
сдсаадссас дЕасаЕЕдЕа ссЕсаааада ддааЕаЕдас дааЕддссда даЕдсЕддЕд 1740
ссаааЕЕдса ддссасдасЕ дссасЕассд аЕсаааЕсЕс ададаЕааад ааддсЕсЕда 1800
ЕадасааааЕ ддаЕЕЕдааа ЕсдаЕсдада дасаадЕддЕ ададасасЕа ЕсдЕсдаЕдд 1860
ссаЕдаадаа дссссдсЕса ададддсдда даадаЕссаа даасаадсаа аасааЕЕЕдд 1920
асдсЕЕсЕЕс аааасссадЕ ассасЕддда аададссдса даддЕсЕдсс ссддЕЕЕсаЕ 1980
сааадЕсддЕ дадсЕсссса адЕЕЕЕасЕЕ сЕсЕааасаа аааддаЕдсЕ сддаЕЕдддд 2040
сасдаадсЕс ассадссЕсс асссадааЕЕ ддаддадааа асссдаддсЕ ЕсдддЕддсс 2100
- 15 029359
саадЕЕсддд ссадсддсдд аасЕдаааЕс сЕЕдсддсЕа саадссдсаа даЕддсЕсда 2160
асдсдссдад саадЕЕаааа ЕсссЕЕсаас Едаддааадд дадсдсдЕсд ЕдаддаааЕд 2220
ЕдЕддаадса ЕЕсЕсдссса сЕсааасасд аддЕсссаЕд дссасдадад дааасааасЕ 2280
дЕсЕЕддаас ааЕЕЕссЕЕд аадаЕЕЕЕаа аасддсадЕЕ ЕЕсЕсЕсЕсд адсЕсдаадс 2340
сддсдЕаддс дЕсссдЕаЕд ЕЕдсЕЕасдд Есдасдсасд сасададдсЕ ддаЕЕдаада 2400
ЕссадаЕсЕд ЕЕдссддЕЕЕ ЕадсЕсдЕЕЕ сассЕЕсдаЕ сдаЕЕасада адЕЕаЕсдда 2460
ддЕдаааЕЕЕ дадсаЕаЕда дсссЕдааса аЕЕддЕЕсад дааддЕсЕдЕ дЕдасссааЕ 2520
асддЕЕаЕЕс дЕааааддсд адссасасаа асааЕссааа сЕЕдаЕдаад дасдсЕассд 2580
ссЕсаЕсаЕд адЕдЕсЕсаЕ ЕддЕЕдаЕса асЕддЕадсс сдддЕЕсЕдЕ ЕЕсааааЕса 2640
даасаадсдс дадаЕсдсдс ЕЕЕддадддс даЕЕсссЕса ааасссддаЕ ЕсддаЕЕдЕс 2700
сасадасдда саадЕсдЕсд аЕЕЕсаЕдса адсаЕЕаЕсд дсдсаддЕдд дадЕдаасас 2760
ЕдсЕдааЕЕа сЕссааааЕЕ ддаааЕссса ссЕЕаЕЕссЕ асадаЕЕдсЕ сЕддЕЕЕЕда 2820
сЕддадсдЕЕ ЕсддасЕддс ЕЕсЕададда ЕдаааЕддаа дЕссддааса ддсЕсасдЕЕ 2880
ддасаЕаааЕ даЕсЕаасса ддсдЕсЕдсд адсЕддаЕдд сЕЕаааЕдсс ЕсдсаааЕад 2940
ЕдЕЕсЕсЕдЕ сЕаЕсадаЕд даасаЕЕдсЕ сЕсдсадсаа дЕдссЕддЕд Еасаааадад 3000
ЕддсадсЕас аасассЕссЕ сдЕсЕаасЕс ЕадааЕЕсда дЕдаЕддссд сЕЕассасЕс 3060
сддадссЕсс ЕдддссаЕсд ссаЕдддЕда ЕдаЕдсссЕЕ дааЕсЕдЕад аЕдсадассЕ 3120
аадЕсдаЕас ЕсаЕссЕЕад дсЕЕсааадЕ сдаддЕЕЕсЕ ЕсасаасЕдд ааЕЕсЕдсЕс 3180
ЕсасаЕЕЕЕЕ даддаддада ассЕсдссдЕ ЕссддЕааас ааадсЕаааа ЕдсЕЕЕаЕаа 3240
аЕЕдаЕасаЕ ддЕЕаЕдаас сддааЕдЕдд саассЕЕдаа дЕЕсЕдасда асЕаЕсЕЕдс 3300
адсЕЕдЕЕЕс ЕсааЕЕЕЕаа асдадсЕдад аЕссдаЕсаа даасЕсдЕЕд ссЕсссЕсЕа 3360
ЕсадЕддсЕд дЕссЕЕссад Едсадссаса ааадаЕаЕаа сдадддасаа ЕаЕааасадс 3420
сдддЕаааса ЕсадЕЕдсаа асдссддаад ЕЕЕааадЕсЕ даЕЕасаЕаа саадссаааа 3480
ЕадаЕЕЕсаа дЕЕЕЕЕадса ддаЕЕЕЕсаа дЕддЕсЕаЕд ЕсадсааЕас сЕдЕаасддЕ 3540
адЕЕддсЕЕд ЕаЕЕЕсдЕсЕ ассЕЕаадаЕ ЕЕсЕсассас дЕсадаЕсаа ЕЕдЕЕааЕда 3600
аЕасддЕсдЕ дддЕаддада асдаЕсааЕд даадаадасд ассасдЕадд сааасасдас 3660
дсдсЕсадсд сЕсЕсадсса дЕддЕЕдЕдд ЕссаадссЕс Есддасааса саасдссдас 3720
сЕадасдасд асдаададдс аасаассдда саадаадаас ЕдЕЕЕсЕасс ададдаасад 3780
дЕЕсдадсда дасаЕЕсдЕЕ ЕЕсЕсаааад асааЕсЕсдс дддаадЕЕсс адсддадсаа 3840
ЕсасдЕЕсдд дссдадЕсЕа ЕсадасЕдсс сддсаЕЕсдс ЕдаЕддааЕд сЕсааддссЕ 3900
ассаЕдадЕа ЕааааЕсЕса аЕддЕсаЕЕЕ ЕддадЕЕсдЕ сЕссдаддсс ЕсЕЕсссааа 3960
аЕЕссддЕЕс саЕсдсЕЕас дадсЕддасс сасасЕдЕаа асЕсадЕдсс сЕЕЕсаЕсаа 4020
- 16 029359
ссаЕЕаасаа дЕЕсдддаЕс асаааасссд дсаддадддс аЕЕЕдсадсд ЕсЕЕасаЕса 4080
асддддсдда сЕддсаЕдас дЕЕдссаадд ассааЕЕсад даЕссЕсЕас аааддсааЕд 4140
дЕЕсЕЕсаЕс даЕадсЕддЕ ЕсЕЕЕЕадаа ЕсассаЕдаа дЕдссадЕЕс сасааЕссда 4200
ааЕаддЕада сааддаассс ддсссЕадсс садддссЕЕс ЕсссЕсЕсса саасссасас 4260
ссЕсааадаа аЕаЕсдЕЕЕЕ аЕсдЕсЕаЕа сЕддЕдЕссс ЕдЕдасссдЕ аЕааЕддссс 4320
ааЕссасЕда ЕдасдссаЕс ЕсЕсЕдЕасд асаЕдссЕЕс ссаасддЕЕЕ сдсЕасаЕад 4380
аадасдадаа ЕаЕдаасЕдд асааассЕсд аЕЕсЕсдаЕд дЕаЕЕсссад ааЕЕсЕЕЕда 4440
аадссаЕссс ааЕдаЕааЕа дЕассадЕсс сЕсааддЕда дЕддасЕдЕд даааЕЕЕсда 4500
ЕддаддддЕа Есаассаасс Есаадсасса садаЕссЕаа Еааддасааа саадаЕддЕс 4560
ЕЕаЕЕдсаЕа ЕааЕдаЕдас сЕсааддадд дЕЕддааЕдЕ аддддЕЕЕаЕ аасааЕдЕдд 4620
адаЕаассаа сааЕааддсЕ даЕаасасЕЕ ЕдаадЕасдд ссаЕссадас аЕддадсЕса 4680
аЕадЕЕдЕса ЕЕЕЕааЕсаа ддасааЕдЕЕ Еддааадада ЕддадаЕЕЕд асЕЕдЕсасд 4740
ЕЕаааасаас ЕддЕдасааЕ дссЕссЕЕсЕ ЕЕдЕЕдЕЕдд ЕсссдсЕдЕс садаадсааЕ 4800
ссаааЕасаа ЕЕаЕдссдЕЕ ЕсаЕасддад ссЕддасада ЕсддаЕдаЕд дадаЕаддда 4860
ЕдаЕадссаЕ адсасЕЕдаЕ даасааддсЕ саЕссддЕЕс сдсааадаЕа дааадассаа 4920
адададЕсдд дсасЕссаЕд дсадЕсЕсаа ссЕдддадас ЕаЕааасЕЕа ссддадаадд 4980
аааасЕссдд ЕдааЕЕсааа ассдаЕсааа дасаадаЕсЕ саааасЕссЕ сссасаЕсЕд 5040
дЕдддадЕЕс сдаЕаЕдссд даЕаЕсдЕЕс ааддаддсЕЕ ассссЕЕссс аЕЕдаадаад 5100
асаЕЕссЕда ЕЕЕсаЕсадд даЕдасссЕЕ ддЕссаасаЕ ассддссаад асЕЕсдсддд 5160
аадасдаддс ЕдсдЕсаЕса аададЕддЕЕ ЕЕааасссса аЕЕдаадссЕ ссЕддсЕЕдс 5220
сааадссаса ассддЕсада асдаЕссдаа асЕЕсдаЕсс адаассЕдас ЕЕддЕЕдадд 5280
саЕддсдасс ЕдасдЕдаас сссддаЕаЕЕ ссааддаада сдЕддсадсд дссасЕдЕЕа 5340
ЕдЕасддддд ЕЕссдЕЕааЕ дааддссддЕ сЕаЕдаЕЕда саадсдЕдаЕ ааадсЕдЕдЕ 5400
Еадасддссд саададЕЕдд ддЕЕсЕЕссЕ ЕддсдЕссЕс сЕЕдасддда ддсасдсЕЕа 5460
аддссЕсЕдс ааадЕсадад аадсЕЕдсса аасЕсасЕЕс дадЕдааадд дсдсадЕЕса 5520
аасдааЕЕаа дсдссадсаа ддЕдссасас дадсЕЕсада аЕЕЕЕЕадаа саасЕЕсЕдд 5580
сЕддсасааа сссЕдассса аддЕссЕдаЕ даассЕЕЕсс сааЕсаЕсас адЕсаадссс 5640
дЕдасЕЕЕаа асдсддаасд асЕссдааад даЕаддсаас дадЕдЕЕЕЕа сдсЕдддаЕа 5700
асЕсссЕасд дсасЕЕсддЕ дЕ 5722
<210> 5
<211> 397
<212> ДНК
- 17 029359
<213> Вирус некротического пожелтения жилок свеклы
<220>
<221> т1зс_£еаВиге
<222> (1)..(397)
<223> Мутантный Р15 (смысловая)
<400> 5
ддВдсВВдВд дВВааадВад аВВВаВсВаа ВаВВдВаВВд ВасаВадВВд ссддВВдВдВ 60
ВдВВдВсадВ аВдВВдВасВ сассдВВВВВ садсаасдаВ дВВааадсдВ ссадсВаВдс 120
дддадсааВВ ВВВаадддда дсддсВдВаВ саВддссдсд ааВВсдВВВд сВсааВВВдд 180
дадВВдсдаВ аВВссааадс аВдВадссда дВссаВсасВ ааддВВдсса ссааададса 240
сдаВдВВдас аВааВддВаа аааддддВда адВдассдВВ сдВдВВдВда сВсВсассда 300
аасВаВВВВВ аВааВаВВаВ сВадаВВдВВ ВддВВВддсд дВдВВВВВдВ ВсаВдаВаВд 360
ВВВааВдВсВ аВадВВВддВ ВВВддВаВса ВадаВаа 397
<210> 6
<211> 397
<212> ДНК
<213> Вирус некротического пожелтения жилок свеклы
<220>
<221> т1зс_£еаВиге
<222> (1)..(397)
<223> Мутантный Р15 ΒΝΥνν (антисмысловая)
<400> 6
ВВаВсВаВда Вассаааасс ааасВаВада саВВааасаВ аВсаВдааса аааасассдс 60
сааассааас ааВсВадаВа аВаВВаВааа ааВадВВВсд дВдададВса саасасдаас 120
ддВсасВВса ссссВВВВВа ссаВВаВдВс аасаВсдВдс ВсВВВддВдд саассВВадВ 180
даВддасВсд дсВасаВдсВ ВВддааВаВс дсаасВссса ааВВдадсаа асдааВВсдс 240
ддссаВдаВа садссдсВсс ссВВаааааВ ВдсВсссдса ВадсВддасд сВВВаасаВс 300
дВВдсВдааа аасддВдадВ асаасаВасВ дасаасааса саассддсаа сВаВдВасаа 360
ВасааВаВВа даВаааВсВа сВВВаассас аадсасс 397
<210> 7
<211> 1056
<212> ДНК
<213> ΒΜΥν и ΒΝΥνν
<220>
<221> т1зс_£еаВиге <222> (1)..(1056)
<223> Р15-Р0 смысловая
<400> 7
- 18 029359
ддЕдсЕЕдЕд дЕЕааадЕад аЕЕЕаЕсЕаа ЕаЕЕдЕаЕЕд ЕасаЕадЕЕд ссддЕЕдЕдЕ 60
ЕдЕЕдЕсадЕ аЕдЕЕдЕасЕ сассдЕЕЕЕЕ садсаасдаЕ дЕЕааадсдЕ ссадсЕаЕдс 120
дддадсааЕЕ ЕЕЕаадддда дсддсЕдЕаЕ саЕддссдсд ааЕЕсдЕЕЕд сЕсааЕЕЕдд 180
дадЕЕдсдаЕ аЕЕссааадс аЕдЕадссда дЕссаЕсасЕ ааддЕЕдсса ссааададса 240
сдаЕдЕЕдас аЕааЕддЕаа аааддддЕда адЕдассдЕЕ сдЕдЕЕдЕда сЕсЕсассда 300
аасЕаЕЕЕЕЕ аЕааЕаЕЕаЕ сЕадаЕЕдЕЕ ЕддЕЕЕддсд дЕдЕЕЕЕЕдЕ ЕсаЕдаЕаЕд 360
ЕЕЕааЕдЕсЕ аЕадЕЕЕддЕ ЕЕЕддЕаЕса ЕадаЕаасаа аадааассад сдаддаЕсЕа 420
дсадЕсЕаЕд сааЕЕЕсадс ЕЕаааасааа садЕЕЕсасЕ ЕдЕЕсдЕЕда ассдассдсЕ 480
аасадсЕаса дадсдадЕЕЕ Еааасассдс дЕаЕЕЕЕсЕЕ асдааЕсаЕЕ ЕассдсЕсдЕ 540
аасЕЕЕЕдад ааЕдаааасЕ дЕаЕЕсдЕЕс ЕсЕЕсЕсдсЕ дсЕсЕдссЕЕ ЕдсЕдсЕсад 600
ЕаадсадсЕс дассссддда дсЕЕЕаЕЕЕа сдсЕсссддд ааасдссадЕ сЕЕЕасдасЕ 660
ддссаддЕЕс ЕасааЕЕасЕ дсддадссдЕ дЕЕасссадс асЕсдсааса ЕЕдасЕЕасд 720
адЕдсссссс адаааадасд ЕЕаааадаЕЕ ЕЕассЕЕдсс сдаааЕЕсад дсададаЕсЕ 780
дддддададд сЕасаасдсс дсададаааЕ ЕЕЕсЕсЕсдс ддЕдаадсад адЕЕЕааааа 840
дЕЕссЕЕЕса дЕаЕддЕдЕд сЕдааадсда дадааадсЕа сдддададЕс сЕааааЕсда 900
ЕаЕЕадааЕд дассаЕаЕЕа ЕЕаЕддЕсЕЕ асдсдаЕаЕд ддсасЕсЕсЕ ЕдсассдЕсЕ 960
ддЕасЕЕдЕЕ даадаасЕаЕ ассаЕадааа ЕасЕЕаЕдсЕ дадсЕсдсЕЕ ЕЕЕдсдЕЕса 1020
ссассЕЕЕЕЕ ддЕдаадсЕс дЕддЕаЕдда ЕЕЕЕЕд 1056
<210> 8 <211> 1056
<212> ДНК <213> ΒΜΥν и ΒΝΥνν <220> <221> т1зс_£еаЕиге <222> (1)..(1056) <223> Р15 Р0 антисмысловая <400> 8 саааааЕсса Еассасдадс ЕЕсассаааа аддЕддЕдаа сдсааааадс дадсЕсадса 60
ЕаадЕаЕЕЕс ЕаЕддЕаЕад ЕЕсЕЕсааса адЕассадас ддЕдсаадад адЕдсссаЕа 120
ЕсдсдЕаада ссаЕааЕааЕ аЕддЕссаЕЕ сЕааЕаЕсда ЕЕЕЕаддасЕ сЕсссдЕадс 180
ЕЕЕсЕсЕсдс ЕЕЕсадсаса ссаЕасЕдаа аддаасЕЕЕЕ ЕааасЕсЕдс ЕЕсассдсда 240
дадааааЕЕЕ сЕсЕдсддсд ЕЕдЕадссЕс ЕсссссадаЕ сЕсЕдссЕда аЕЕЕсдддса 300
аддЕааааЕс ЕЕЕЕаасдЕс ЕЕЕЕсЕдддд ддсасЕсдЕа адЕсааЕдЕЕ дсдадЕдсЕд 360
ддЕаасасдд сЕссдсадЕа аЕЕдЕадаас сЕддссадЕс дЕааадасЕд дсдЕЕЕсссд 420
- 19 029359
ддадсдЬааа 5ааадс5ссс ддддЬсдадс 5дс55ас5да дсадсааадд сададсадсд 480
адаададаас даа5асад55 55са55с5са ааад55асда дсдд5ааа5д а55сд5аада 540
аааЬасдсдд 5д555аааас 5сдс5с5д5а дс5д55адсд д5сдд55саа сдаасаадЬд 600
ааас5д555д 5555аадс5д ааа55дса5а дас5дс5ада 5сс5сдс5дд 555с5555д5 660
5а5с5а5да5 ассаааасса аас5а5адас а55аааса5а 5са5даасаа ааасассдсс 720
ааассаааса а5с5ада5аа 5а55а5аааа а5ад555сдд 5дадад5сас аасасдаасд 780
д5сас55сас ссс55555ас са55а5д5са аса5сд5дс5 с555дд5ддс аасс55ад5д 840
а5ддас5сдд с5аса5дс55 5ддаа5а5сд саасЬсссаа а55дадсааа сдаа55сдсд 900
дсса5да5ас адссдсЬссс с55ааааа55 дс5сссдса5 адсЬддасдс 555ааса5сд 960
55дс5даааа асдд5дад5а сааса5ас5д асаасаасас аассддсаас 5а5д5асаа5 1020
асаа5а55ад а5ааа5с5ас 555аассаса адсасс 1056
<210> 9
<211> 1058
<212> ДНК
<213> ΒΜΥν и ΒΝΥνν
<220>
<221> т1зс_£еа5иге <223> Р0 Р15 смысловая
<400> 9
саааадааас садсдаддаЬ с5адсад5с5 а5дсаа555с адс55аааас ааасад555с 60
ас55д55сд5 Ьдаассдасс дс5аасадс5 асададсдад 5555ааасас сдсд5а5555 120
с55асдаа5с а555ассдс5 сд5аас5555 дадааЬдааа ас5д5а55сд 55с5с55с5с 180
дс5дс5с5дс с555дс5дс5 садЬаадсад сЬсдассссд ддадс555а5 55асдс5ссс 240
дддааасдсс ад5с555асд асЬддссадд 55с5асаа55 асЬдсддадс сд5д55ассс 300
адсасЬсдса аса55дас55 асдадЬдссс сссадаааад асд55аааад а5555асс55 360
дсссдааа55 саддсадада 5с5дддддад аддсЬасаас дссдсадада аа5555с5с5 420
сдсддЬдаад садад555аа ааад55сс55 5сад5а5дд5 д5дс5дааад сдададааад 480
сЬасдддада д5сс5аааа5 сда5а55ада а5ддасса5а 55а55а5дд5 с55асдсда5 540
а5дддсас5с 5с55дсассд 5с5дд5ас55 д55даадаас 5а5асса5ад ааа5ас55а5 600
дс5дадс5сд с55555дсд5 5сассасс55 555дд5даад с5сд5дд5а5 дда55555да 660
5дд5дс55д5 дд55ааад5а да555а5с5а а5а55д5а55 д5аса5ад55 дссдд55д5д 720
55д55д5сад 5а5д55д5ас 5сассд5555 Ьсадсаасда 5д55ааадсд 5ссадс5а5д 780
сдддадсааЬ 5555аадддд адсддс5д5а 5са5ддссдс даа55сд555 дс5саа555д 840
ддад55дсда 5а55ссааад са5д5адссд ад5сса5сас 5аадд55дсс ассааададс 900
- 20 029359
асдаЕдЕЕда саЕааЕддЕа ааааддддЕд аадЕдассдЕ ЕсдЕдЕЕдЕд асЕсЕсассд 960
ааасЕаЕЕЕЕ ЕаЕааЕаЕЕа ЕсЕадаЕЕдЕ ЕЕддЕЕЕддс ддЕдЕЕЕЕЕд ЕЕсаЕдаЕаЕ 1020
дЕЕЕааЕдЕс ЕаЕадЕЕЕдд ЕЕЕЕддЕаЕс аЕадаЕаа 1058
<210> 10 <211> 1572 <212> ДНК <213> ΒΜΥν и ΒΝΥνν
<220> <221> т1зс_ЕеаЕиге <222> (1)..(1572) <223> Р0 Р15 антисмысловая
<400> 10 ддЕдсЕЕдЕд дЕЕааадЕад аЕЕЕаЕсЕаа ЕаЕЕдЕаЕЕд ЕасаЕадЕЕд ссддЕЕдЕдЕ 60
ЕдЕЕдЕсадЕ аЕдЕЕдЕасЕ сассдЕЕЕЕЕ садсаасдаЕ дЕЕааадсдЕ ссадсЕаЕдс 120
дддадсааЕЕ ЕЕЕаадддда дсддсЕдЕаЕ саЕддссдсд ааЕЕсдЕЕЕд сЕсааЕЕЕдд 180
дадЕЕдсдаЕ аЕЕссааадс аЕдЕадссда дЕссаЕсасЕ ааддЕЕдсса ссааададса 240
сдаЕдЕЕдас аЕааЕддЕаа аааддддЕда адЕдассдЕЕ сдЕдЕЕдЕда сЕсЕсассда 300
аасЕаЕЕЕЕЕ аЕааЕаЕЕаЕ сЕадаЕЕдЕЕ ЕддЕЕЕддсд дЕдЕЕЕЕЕдЕ ЕсаЕдаЕаЕд 360
ЕЕЕааЕдЕсЕ аЕадЕЕЕддЕ ЕЕЕддЕаЕса ЕадаЕаассЕ аддаааЕЕЕа ааЕЕаааЕсс 420
ЕддЕЕЕЕаЕа ЕдЕасЕасЕд ЕЕдЕадсЕда ааЕЕЕаддЕс ЕЕсЕЕдсЕда аЕЕЕаЕЕЕсЕ 480
дЕЕЕсдЕЕЕЕ сасЕдЕЕаЕЕ саддддаЕсс ЕаддЕЕаЕсЕ аЕдаЕассаа аассааасЕа 540
ЕадасаЕЕаа асаЕаЕсаЕд аасаааааса ссдссааасс ааасааЕсЕа даЕааЕаЕЕа 600
ЕаааааЕадЕ ЕЕсддЕдада дЕсасаасас даасддЕсас ЕЕсассссЕЕ ЕЕЕассаЕЕа 660
ЕдЕсаасаЕс дЕдсЕсЕЕЕд дЕддсаассЕ ЕадЕдаЕдда сЕсддсЕаса ЕдсЕЕЕддаа 720
ЕаЕсдсаасЕ сссаааЕЕда дсааасдааЕ ЕсдсддссаЕ даЕасадссд сЕссссЕЕаа 780
аааЕЕдсЕсс сдсаЕадсЕд дасдсЕЕЕаа саЕсдЕЕдсЕ дааааасддЕ дадЕасааса 840
ЕасЕдасаас аасасаассд дсаасЕаЕдЕ асааЕасааЕ аЕЕадаЕааа ЕсЕасЕЕЕаа 900
ссасаадсас саЕсаааааЕ ссаЕассасд адсЕЕсасса ааааддЕддЕ даасдсаааа 960
адсдадсЕса дсаЕаадЕаЕ ЕЕсЕаЕддЕа ЕадЕЕсЕЕса асаадЕасса дасддЕдсаа 1020
дададЕдссс аЕаЕсдсдЕа адассаЕааЕ ааЕаЕддЕсс аЕЕсЕааЕаЕ сдаЕЕЕЕадд 1080
асЕсЕсссдЕ адсЕЕЕсЕсЕ сдсЕЕЕсадс асассаЕасЕ даааддаасЕ ЕЕЕЕааасЕс 1140
ЕдсЕЕсассд сдададаааа ЕЕЕсЕсЕдсд дсдЕЕдЕадс сЕсЕссссса даЕсЕсЕдсс 1200
ЕдааЕЕЕсдд дсааддЕааа аЕсЕЕЕЕаас дЕсЕЕЕЕсЕд дддддсасЕс дЕаадЕсааЕ 1260
дЕЕдсдадЕд сЕдддЕааса сддсЕссдса дЕааЕЕдЕад аассЕддсса дЕсдЕааада 1320
- 21 029359
сРддсдРРРс ссдддадсдР аааРааадсР сссддддРсд адсРдсРРас Рдадсадсаа 1380
аддсададса дсдадаадад аасдааРаса дРРРРсаРРс РсаааадРРа сдадсддРаа 1440
аРдаРРсдРа адааааРасд сддРдРРРаа аасРсдсРсР дРадсРдРРа дсддРсддРР 1500
саасдаасаа дРдааасРдР РРдРРРРаад сРдаааРРдс аРадасРдсР адаРссРсдс 1560
РддРРРсРРР Рд 1572
<210> 11 <211> 1351
<212> ДНК <213> Вид Петуния
<220> <221> т1зс_РеаРиге <222> (1)..(1351) <223> Интрон петунии <400> 11 дРдРаадааР РРсРРаРдРР асаРРаРРас аРРсаасдРР РРаРсРРааР РддсРсРРса 60
РРРдаРРдаа аРРРдасааР РаРРРсРРдР РРРРРРРРРР дРсасасРсР РРРРдддРРд 120
дддРддссда сдааРРдРдд дааддРадаа ададдддадд асРРРРдРРа РасРссаРРа 180
дРааРРасРд РРРссдРРРс ааРРРаРдРд асааРаРРРс сРРРРРадРс ддРРссаааа 240
дааааРдРса дсаРРаРааа сааРРРааРР РРдаааРРас ааРРРРдсса РРааРааааР 300
даРРРасаас сасаааадРа РсРаРдадсс РдРРРдддРд ддсРРаРаад садсРРаРРР 360
РаадРддсРР аРаадРсааа аадРдасапР РРРРдадаад РРадааааРс сРаасРРсРс 420
ааааадРадс РРРРаадсса сРРаРдасРР аРаадРссаа аааРРРРРаа дРРассааас 480
аРаРаРРааР дддРРРаРаа дсРРаРаадс сасРРРРаад сРсасссааа сдддРРсРаР 540
дРсРсасРРР адасРасааа РРРРаааадР сРРсаРРРаР РРсРРааРсР ссдРддсдад 600
РпааасРаРа асасаРааад Рдааасддад ддааРаадаР ддадРсаРаа асРааРссаа 660
аРсРаРасРс РсРссдРРаа РРРдРРРРРР адРРРдаРРР ддРасаРРаа РаааасадаР 720
РРРРсдаадд РРаРааасас адасадаРдР РРсссадсда дсРадсаааа РРссаадаРР 780
РсРдРсдааа аРРсдРдРдР РРсРадсРад РасРРдаРдР РаРсРРРаас сРРРРадРаа 840
РРРРРРдРсс РРРРсРРРсР аРРРРРсаРс РРасааРдаа РРаРдадсаа дРРссРРаад 900
РадсаРсаса сдРдадаРдР РРРРРаРдаР аРРдасРааа РссааРсРРР ассаРРссРР 960
аасРадРааа аРасаасаса РдРРааРРда РасаРРдсРР аасасРдадд РРадааааРР 1020
РРадаааРРа дРРдРссааа РдсРРРдааа РРадаааРсР РРааРсссРР аРРРРРРРРР 1080
ааааРдРРРР РРсРсасРсс ааадааадад ааасРдасаР дааадсРсаа аадаРсаРда 1140
аРсРРасРаа сРРРдРддаа сРаааРдРас аРсадааРдР РРсРдасаРд РдааааРдаа 1200
- 22 029359
адсЕсЕЕааЕ ЕЕЕсЕЕсЕЕЕ ЕаЕЕЕаЕЕда дддЕЕЕЕЕдс аЕдсЕаЕдса ЕЕсааЕЕЕда 1260
дЕасЕЕЕааа дсассЕаЕаа асасЕЕасЕЕ асасЕЕдссЕ ЕддадЕЕЕаЕ дЕЕЕЕадЕдЕ 1320
ЕЕЕсЕЕсаса ЕсЕЕЕЕЕЕдд ЕсааЕЕЕдса д 1351
<210> 12 <211> 91 <212> ДНК <213> Свекла обыкновенная
<220> <221> т1зс_ЕеаЕиге <222> (1)..(91) <223> Интрон свеклы
<400> 12 ЕаааЕссЕдд ЕЕЕЕаЕаЕдЕ асЕасЕдЕЕд ЕадсЕдаааЕ ЕЕаддЕсЕЕс ЕЕдсЕдааЕЕ 60
ЕаЕЕЕсЕдЕЕ ЕсдЕЕЕЕсас ЕдЕЕаЕЕсад д 91
<210> 13 <211> 2701 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220> <223> шпилька Р0
<220> <221> т1зс_ЕеаЕиге <222> (1064)..(1064) <223> η представляет собой а, с, д или Е
<220> <221> т1зс_ЕеаЕиге <222> (1277)..(1277) <223> η представляет собой а, с, д или Е
<400> 13 саааадааас садсдаддаЕ сЕадсадЕсЕ аЕдсааЕЕЕс адсЕЕаааас ааасадЕЕЕс 60
асЕЕдЕЕсдЕ Едаассдасс дсЕаасадсЕ асададсдад ЕЕЕЕааасас сдсдЕаЕЕЕЕ 120
сЕЕасдааЕс аЕЕЕассдсЕ сдЕаасЕЕЕЕ дадааЕдааа асЕдЕаЕЕсд ЕЕсЕсЕЕсЕс 180
дсЕдсЕсЕдс сЕЕЕдсЕдсЕ садЕаадсад сЕсдассссд ддадсЕЕЕаЕ ЕЕасдсЕссс 240
дддааасдсс адЕсЕЕЕасд асЕддссадд ЕЕсЕасааЕЕ асЕдсддадс сдЕдЕЕассс 300
адсасЕсдса асаЕЕдасЕЕ асдадЕдссс сссадаааад асдЕЕаааад аЕЕЕЕассЕЕ 360
дсссдаааЕЕ саддсадада ЕсЕдддддад аддсЕасаас дссдсадада ааЕЕЕЕсЕсЕ 420
сдсддЕдаад сададЕЕЕаа ааадЕЕссЕЕ ЕсадЕаЕддЕ дЕдсЕдааад сдададааад 480
сЕасдддада дЕссЕааааЕ сдаЕаЕЕада аЕддассаЕа ЕЕаЕЕаЕддЕ сЕЕасдсдаЕ 540
- 23 029359
аЕдддсасЕс ЕсЕЕдсассд ЕсЕддЕасЕЕ дЕЕдаадаас ЕаЕассаЕад аааЕасЕЕаЕ 600
дсЕдадсЕсд сЕЕЕЕЕдсдЕ ЕсассассЕЕ ЕЕЕддЕдаад сЕсдЕддЕаЕ ддаЕЕЕЕЕдс 660
сЕаддаааЕЕ ЕаааЕдЕдЕа адааЕЕЕсЕЕ аЕдЕЕасаЕЕ аЕЕасаЕЕса асдЕЕЕЕаЕс 720
ЕЕааЕЕддсЕ сЕЕсаЕЕЕда ЕЕдаааЕЕЕд асааЕЕаЕЕЕ сЕЕдЕЕЕЕЕЕ ЕЕЕЕЕдЕсас 780
асЕсЕЕЕЕЕд ддЕЕддддЕд дссдасдааЕ ЕдЕдддаадд Еадааададд ддаддасЕЕЕ 840
ЕдЕЕаЕасЕс саЕЕадЕааЕ ЕасЕдЕЕЕсс дЕЕЕсааЕЕЕ аЕдЕдасааЕ аЕЕЕссЕЕЕЕ 900
ЕадЕсддЕЕс саааадаааа ЕдЕсадсаЕЕ аЕааасааЕЕ ЕааЕЕЕЕдаа аЕЕасааЕЕЕ 960
ЕдссаЕЕааЕ ааааЕдаЕЕЕ асаассасаа аадЕаЕсЕаЕ дадссЕдЕЕЕ дддЕдддсЕЕ 1020
аЕаадсадсЕ ЕаЕЕЕЕаадЕ ддсЕЕаЕаад ЕсааааадЕд асапЕЕЕЕЕд адаадЕЕада 1080
аааЕссЕаас ЕЕсЕсааааа дЕадсЕЕЕЕа адссасЕЕаЕ дасЕЕаЕаад ЕссаааааЕЕ 1140
ЕЕЕаадЕЕас сааасаЕаЕа ЕЕааЕдддЕЕ ЕаЕаадсЕЕа ЕаадссасЕЕ ЕЕаадсЕсас 1200
ссааасдддЕ ЕсЕаЕдЕсЕс асЕЕЕадасЕ асаааЕЕЕЕа ааадЕсЕЕса ЕЕЕаЕЕЕсЕЕ 1260
ааЕсЕссдЕд дсдадЕпааа сЕаЕаасаса ЕааадЕдааа сддадддааЕ аадаЕддадЕ 1320
саЕааасЕаа ЕссаааЕсЕа ЕасЕсЕсЕсс дЕЕааЕЕЕдЕ ЕЕЕЕЕадЕЕЕ даЕЕЕддЕас 1380
аЕЕааЕаааа садаЕЕЕЕЕс дааддЕЕаЕа аасасадаса даЕдЕЕЕссс адсдадсЕад 1440
сааааЕЕсса адаЕЕЕсЕдЕ сдааааЕЕсд ЕдЕдЕЕЕсЕа дсЕадЕасЕЕ даЕдЕЕаЕсЕ 1500
ЕЕаассЕЕЕЕ адЕааЕЕЕЕЕ ЕдЕссЕЕЕЕс ЕЕЕсЕаЕЕЕЕ ЕсаЕсЕЕаса аЕдааЕЕаЕд 1560
адсаадЕЕсс ЕЕаадЕадса ЕсасасдЕда даЕдЕЕЕЕЕЕ аЕдаЕаЕЕда сЕаааЕссаа 1620
ЕсЕЕЕассаЕ ЕссЕЕаасЕа дЕааааЕаса асасаЕдЕЕа аЕЕдаЕасаЕ ЕдсЕЕаасас 1680
ЕдаддЕЕада аааЕЕЕЕада ааЕЕадЕЕдЕ ссаааЕдсЕЕ ЕдаааЕЕада ааЕсЕЕЕааЕ 1740
сссЕЕаЕЕЕЕ ЕЕЕЕЕааааЕ дЕЕЕЕЕЕсЕс асЕссааада аададааасЕ дасаЕдааад 1800
сЕсаааадаЕ саЕдааЕсЕЕ асЕаасЕЕЕд ЕддаасЕааа ЕдЕасаЕсад ааЕдЕЕЕсЕд 1860
асаЕдЕдааа аЕдааадсЕс ЕЕааЕЕЕЕсЕ ЕсЕЕЕЕаЕЕЕ аЕЕдадддЕЕ ЕЕЕдсаЕдсЕ 1920
аЕдсаЕЕсаа ЕЕЕдадЕасЕ ЕЕааадсасс ЕаЕааасасЕ ЕасЕЕасасЕ ЕдссЕЕддад 1980
ЕЕЕаЕдЕЕЕЕ адЕдЕЕЕЕсЕ ЕсасаЕсЕЕЕ ЕЕЕддЕсааЕ ЕЕдсаддЕаЕ ЕЕддаЕссЕа 2040
ддсаааааЕс саЕассасда дсЕЕсассаа аааддЕддЕд аасдсааааа дсдадсЕсад 2100
саЕаадЕаЕЕ ЕсЕаЕддЕаЕ адЕЕсЕЕсаа саадЕассад асддЕдсаад ададЕдссса 2160
ЕаЕсдсдЕаа дассаЕааЕа аЕаЕддЕсса ЕЕсЕааЕаЕс даЕЕЕЕадда сЕсЕсссдЕа 2220
дсЕЕЕсЕсЕс дсЕЕЕсадса сассаЕасЕд аааддаасЕЕ ЕЕЕааасЕсЕ дсЕЕсассдс 2280
дададааааЕ ЕЕсЕсЕдсдд сдЕЕдЕадсс ЕсЕсссссад аЕсЕсЕдссЕ дааЕЕЕсддд 2340
сааддЕаааа ЕсЕЕЕЕаасд ЕсЕЕЕЕсЕдд ддддсасЕсд ЕаадЕсааЕд ЕЕдсдадЕдс 2400
ЕдддЕаасас ддсЕссдсад ЕааЕЕдЕада ассЕддссад ЕсдЕааадас ЕддсдЕЕЕсс 2460
- 24 029359
сдддадсдЕа ааЕааадсЕс ссддддЕсда дсЕдсЕЕасЕ дадсадсааа ддсададсад 2520
сдадаадада асдааЕасад ЕЕЕЕсаЕЕсЕ саааадЕЕас дадсддЕааа ЕдаЕЕсдЕаа 2580
дааааЕасдс ддЕдЕЕЕааа асЕсдсЕсЕд ЕадсЕдЕЕад сддЕсддЕЕс аасдаасаад 2640
ЕдааасЕдЕЕ ЕдЕЕЕЕаадс ЕдаааЕЕдса ЕадасЕдсЕа даЕссЕсдсЕ ддЕЕЕсЕЕЕЕ 2700
д 2701
<210> 14
<211> 1435
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Шпилька Р0 (интрон свеклы)
<220>
<221> т1зс_1еаЕиге
<222> (1)..(1435)
<223> Шпилька Р0 (интрон свеклы)
<400> 14
саааадааас садсдаддаЕ сЕадсадЕсЕ аЕдсааЕЕЕс адсЕЕаааас ааасадЕЕЕс 60
асЕЕдЕЕсдЕ Едаассдасс дсЕаасадсЕ асададсдад ЕЕЕЕааасас сдсдЕаЕЕЕЕ 120
сЕЕасдааЕс аЕЕЕассдсЕ сдЕаасЕЕЕЕ дадааЕдааа асЕдЕаЕЕсд ЕЕсЕсЕЕсЕс 180
дсЕдсЕсЕдс сЕЕЕдсЕдсЕ садЕаадсад сЕсдассссд ддадсЕЕЕаЕ ЕЕасдсЕссс 240
дддааасдсс адЕсЕЕЕасд асЕддссадд ЕЕсЕасааЕЕ асЕдсддадс сдЕдЕЕассс 300
адсасЕсдса асаЕЕдасЕЕ асдадЕдссс сссадаааад асдЕЕаааад аЕЕЕЕассЕЕ 360
дсссдаааЕЕ саддсадада ЕсЕдддддад аддсЕасаас дссдсадада ааЕЕЕЕсЕсЕ 420
сдсддЕдаад сададЕЕЕаа ааадЕЕссЕЕ ЕсадЕаЕддЕ дЕдсЕдааад сдададааад 480
сЕасдддада дЕссЕааааЕ сдаЕаЕЕада аЕддассаЕа ЕЕаЕЕаЕддЕ сЕЕасдсдаЕ 540
аЕдддсасЕс ЕсЕЕдсассд ЕсЕддЕасЕЕ дЕЕдаадаас ЕаЕассаЕад аааЕасЕЕаЕ 600
дсЕдадсЕсд сЕЕЕЕЕдсдЕ ЕсассассЕЕ ЕЕЕддЕдаад сЕсдЕддЕаЕ ддаЕЕЕЕЕдс 660
сЕаддаааЕЕ ЕаааЕЕаааЕ ссЕддЕЕЕЕа ЕаЕдЕасЕас ЕдЕЕдЕадсЕ даааЕЕЕадд 720
ЕсЕЕсЕЕдсЕ дааЕЕЕаЕЕЕ сЕдЕЕЕсдЕЕ ЕЕсасЕдЕЕа ЕЕсаддддаЕ ссЕаддсааа 780
ааЕссаЕасс асдадсЕЕса ссаааааддЕ ддЕдаасдса аааадсдадс ЕсадсаЕаад 840
ЕаЕЕЕсЕаЕд дЕаЕадЕЕсЕ ЕсаасаадЕа ссадасддЕд саадададЕд сссаЕаЕсдс 900
дЕаадассаЕ ааЕааЕаЕдд ЕссаЕЕсЕаа ЕаЕсдаЕЕЕЕ аддасЕсЕсс сдЕадсЕЕЕс 960
ЕсЕсдсЕЕЕс адсасассаЕ асЕдааадда асЕЕЕЕЕааа сЕсЕдсЕЕса ссдсдадада 1020
аааЕЕЕсЕсЕ дсддсдЕЕдЕ адссЕсЕссс ссадаЕсЕсЕ дссЕдааЕЕЕ сдддсааддЕ 1080
- 25 029359
ааааЕсЕЕЕЕ аасдЕсЕЕЕЕ сЕддддддса сЕсдЕаадЕс ааЕдЕЕдсда дЕдсЕдддЕа 1140
асасддсЕсс дсадЕааЕЕд ЕадаассЕдд ссадЕсдЕаа адасЕддсдЕ ЕЕсссдддад 1200
сдЕаааЕааа дсЕсссдддд ЕсдадсЕдсЕ ЕасЕдадсад саааддсада дсадсдадаа 1260
дадаасдааЕ асадЕЕЕЕса ЕЕсЕсаааад ЕЕасдадсдд ЕаааЕдаЕЕс дЕаадааааЕ 1320
асдсддЕдЕЕ ЕаааасЕсдс ЕсЕдЕадсЕд ЕЕадсддЕсд дЕЕсаасдаа саадЕдааас 1380
ЕдЕЕЕдЕЕЕЕ аадсЕдаааЕ ЕдсаЕадасЕ дсЕадаЕссЕ сдсЕддЕЕЕс ЕЕЕЕд 1435
<210> 15
<211> 2229
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Шпилька Р15 Р0
<400> 15
ддЕдсЕЕдЕд дЕЕааадЕад аЕЕЕаЕсЕаа ЕаЕЕдЕаЕЕд ЕасаЕадЕЕд ссддЕЕдЕдЕ 60
ЕдЕЕдЕсадЕ аЕдЕЕдЕасЕ сассдЕЕЕЕЕ садсаасдаЕ дЕЕааадсдЕ ссадсЕаЕдс 120
дддадсааЕЕ ЕЕЕаадддда дсддсЕдЕаЕ саЕддссдсд ааЕЕсдЕЕЕд сЕсааЕЕЕдд 180
дадЕЕдсдаЕ аЕЕссааадс аЕдЕадссда дЕссаЕсасЕ ааддЕЕдсса ссааададса 240
сдаЕдЕЕдас аЕааЕддЕаа аааддддЕда адЕдассдЕЕ сдЕдЕЕдЕда сЕсЕсассда 300
аасЕаЕЕЕЕЕ аЕааЕаЕЕаЕ сЕадаЕЕдЕЕ ЕддЕЕЕддсд дЕдЕЕЕЕЕдЕ ЕсаЕдаЕаЕд 360
ЕЕЕааЕдЕсЕ аЕадЕЕЕддЕ ЕЕЕддЕаЕса ЕадаЕаасаа аадааассад сдаддаЕсЕа 420
дсадЕсЕаЕд сааЕЕЕсадс ЕЕаааасааа садЕЕЕсасЕ ЕдЕЕсдЕЕда ассдассдсЕ 480
аасадсЕаса дадсдадЕЕЕ Еааасассдс дЕаЕЕЕЕсЕЕ асдааЕсаЕЕ ЕассдсЕсдЕ 540
аасЕЕЕЕдад ааЕдаааасЕ дЕаЕЕсдЕЕс ЕсЕЕсЕсдсЕ дсЕсЕдссЕЕ ЕдсЕдсЕсад 600
ЕаадсадсЕс дассссддда дсЕЕЕаЕЕЕа сдсЕсссддд ааасдссадЕ сЕЕЕасдасЕ 660
ддссаддЕЕс ЕасааЕЕасЕ дсддадссдЕ дЕЕасссадс асЕсдсааса ЕЕдасЕЕасд 720
адЕдсссссс адаааадасд ЕЕаааадаЕЕ ЕЕассЕЕдсс сдаааЕЕсад дсададаЕсЕ 780
дддддададд сЕасаасдсс дсададаааЕ ЕЕЕсЕсЕсдс ддЕдаадсад адЕЕЕааааа 840
дЕЕссЕЕЕса дЕаЕддЕдЕд сЕдааадсда дадааадсЕа сдддададЕс сЕааааЕсда 900
ЕаЕЕадааЕд дассаЕаЕЕа ЕЕаЕддЕсЕЕ асдсдаЕаЕд ддсасЕсЕсЕ ЕдсассдЕсЕ 960
ддЕасЕЕдЕЕ даадаасЕаЕ ассаЕадааа ЕасЕЕаЕдсЕ дадсЕсдсЕЕ ЕЕЕдсдЕЕса 1020
ссассЕЕЕЕЕ ддЕдаадсЕс дЕддЕаЕдда ЕЕЕЕЕдссЕа ддаааЕЕЕаа аЕЕаааЕссЕ 1080
ддЕЕЕЕаЕаЕ дЕасЕасЕдЕ ЕдЕадсЕдаа аЕЕЕаддЕсЕ ЕсЕЕдсЕдаа ЕЕЕаЕЕЕсЕд 1140
ЕЕЕсдЕЕЕЕс асЕдЕЕаЕЕс аддддаЕссЕ аддсаааааЕ ссаЕассасд адсЕЕсасса 1200
ааааддЕддЕ даасдсаааа адсдадсЕса дсаЕаадЕаЕ ЕЕсЕаЕддЕа ЕадЕЕсЕЕса 1260
- 26 029359
асаадВасса дасддВдсаа дададВдссс аВаВсдсдВа адассаВааВ ааВаВддВсс 1320
аВВсВааВаВ сдаВВВВадд асВсВсссдВ адсВВВсВсВ сдсВВВсадс асассаВасВ 1380
даааддаасВ ВВВВааасВс ВдсВВсассд сдададаааа ВВВсВсВдсд дсдВВдВадс 1440
сВсВссссса даВсВсВдсс ВдааВВВсдд дсааддВааа аВсВВВВаас дВсВВВВсВд 1500
дддддсасВс дВаадВсааВ дВВдсдадВд сВдддВааса сддсВссдса дВааВВдВад 1560
аассВддсса дВсдВааада сВддсдВВВс ссдддадсдВ аааВааадсВ сссддддВсд 1620
адсВдсВВас Вдадсадсаа аддсададса дсдадаадад аасдааВаса дВВВВсаВВс 1680
ВсаааадВВа сдадсддВаа аВдаВВсдВа адааааВасд сддВдВВВаа аасВсдсВсВ 1740
дВадсВдВВа дсддВсддВВ саасдаасаа дВдааасВдВ ВВдВВВВаад сВдаааВВдс 1800
аВадасВдсВ адаВссВсдс ВддВВВсВВВ ВдВВаВсВаВ даВассаааа ссааасВаВа 1860
дасаВВааас аВаВсаВдаа сааааасасс дссааассаа асааВсВада ВааВаВВаВа 1920
ааааВадВВВ сддВдададВ сасаасасда асддВсасВВ сассссВВВВ ВассаВВаВд 1980
ВсаасаВсдВ дсВсВВВддВ ддсаассВВа дВдаВддасВ сддсВасаВд сВВВддааВа 2040
ВсдсаасВсс саааВВдадс ааасдааВВс дсддссаВда ВасадссдсВ ссссВВаааа 2100
аВВдсВсссд саВадсВдда сдсВВВааса ВсдВВдсВда аааасддВда дВасаасаВа 2160
сВдасаасаа сасаассддс аасВаВдВас ааВасааВаВ ВадаВаааВс ВасВВВаасс 2220
асаадсасс 2229
<210> 16
<211> 2233
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> Шпилька Р0 Р15
<400> 16 саааадааас садсдаддаВ сВадсадВсВ аВдсааВВВс адсВВаааас ааасадВВВс 60
асВВдВВсдВ Вдаассдасс дсВаасадсВ асададсдад ВВВВааасас сдсдВаВВВВ 120
сВВасдааВс аВВВассдсВ сдВаасВВВВ дадааВдааа асВдВаВВсд ВВсВсВВсВс 180
дсВдсВсВдс сВВВдсВдсВ садВаадсад сВсдассссд ддадсВВВаВ ВВасдсВссс 240
дддааасдсс адВсВВВасд асВддссадд ВВсВасааВВ асВдсддадс сдВдВВассс 300
адсасВсдса асаВВдасВВ асдадВдссс сссадаааад асдВВаааад аВВВВассВВ 360
дсссдаааВВ саддсадада ВсВдддддад аддсВасаас дссдсадада ааВВВВсВсВ 420
сдсддВдаад сададВВВаа ааадВВссВВ ВсадВаВддВ дВдсВдааад сдададааад 480
сВасдддада дВссВааааВ сдаВаВВада аВддассаВа ВВаВВаВддВ сВВасдсдаВ 540
- 27 029359
абдддсасбс бсббдсассд бсбддбасбб дббдаадаас бабассабад ааабасббаб 600
дсбдадсбсд сбббббдсдб бсассассбб бббддбдаад сбсдбддбаб ддабббббда 660
бддбдсббдб ддббааадба дабббабсба абаббдбабб дбасабадбб дссддббдбд 720
ббдббдбсад бабдббдбас бсассдбббб бсадсаасда бдббааадсд бссадсбабд 780
сдддадсааб ббббаадддд адсддсбдба бсабддссдс дааббсдббб дсбсаабббд 840
ддадббдсда баббссааад сабдбадссд адбссабсас бааддббдсс ассааададс 900
асдабдббда сабаабддба ааааддддбд аадбдассдб бсдбдббдбд асбсбсассд 960
ааасбабббб бабаабабба бсбадаббдб ббддбббддс ддбдбббббд ббсабдабаб 1020
дбббаабдбс бабадбббдд ббббддбабс абадабаасс баддаааббб аааббааабс 1080
сбддббббаб абдбасбасб дббдбадсбд ааабббаддб сббсббдсбд аабббабббс 1140
бдбббсдббб бсасбдббаб бсаддддабс сбаддббабс бабдабасса ааассааасб 1200
абадасабба аасабабсаб даасааааас ассдссааас сааасаабсб адабаабабб 1260
абааааабад бббсддбдад адбсасааса сдаасддбса сббсассссб ббббассабб 1320
абдбсаасаб сдбдсбсббб ддбддсаасс ббадбдабдд асбсддсбас абдсбббдда 1380
абабсдсаас бсссаааббд адсааасдаа ббсдсддсса бдабасадсс дсбссссбба 1440
ааааббдсбс ссдсабадсб ддасдсббба асабсдббдс бдааааасдд бдадбасаас 1500
абасбдасаа саасасаасс ддсаасбабд басаабасаа баббадабаа абсбасббба 1560
ассасаадса ссабсааааа бссабассас дадсббсасс аааааддбдд бдаасдсааа 1620
аадсдадсбс адсабаадба бббсбабддб абадббсббс аасаадбасс адасддбдса 1680
адададбдсс сабабсдсдб аадассабаа баабабддбс саббсбааба бсдаббббад 1740
дасбсбсссд бадсбббсбс бсдсбббсад сасассабас бдаааддаас бббббааасб 1800
сбдсббсасс дсдададааа абббсбсбдс ддсдббдбад ссбсбссссс адабсбсбдс 1860
сбдаабббсд ддсааддбаа аабсббббаа сдбсббббсб ддддддсасб сдбаадбсаа 1920
бдббдсдадб дсбдддбаас асддсбссдс адбааббдба даассбддсс адбсдбааад 1980
асбддсдббб сссдддадсд бааабааадс бсссддддбс дадсбдсбба сбдадсадса 2040
ааддсададс адсдадаада даасдаабас адббббсабб сбсаааадбб асдадсддба 2100
аабдаббсдб аадаааабас дсддбдббба ааасбсдсбс бдбадсбдбб адсддбсддб 2160
бсаасдааса адбдааасбд бббдббббаа дсбдаааббд сабадасбдс бадабссбсд 2220
сбддбббсбб ббд 2233
<210> 17 <211> 720 <212> ДНК <213> Вирус слабого пожелтения свеклы
- 28 029359
<220>
<221> СОЗ
<222> (1)..(720)
<223> Протеин Р0 ΒΜΥν
<400> 17
абд Меб 1 саа О1п ббб РЬе сад О1п сбб Ьеи 5 ааа Ьуз аса ТЬг аас Азп адб Зег ббс РЬе 10 асб ТЬг бдб Суз бсд Зег ббд Ьеи аас Азп 15 сда Агд 48
ссд сба аса дсб аса дад сда дбб бба аас асс дсд баб ббб сбб асд 96
Рго Ьеи ТЬг А1а 20 ТЬг О1и Агд ν&1 Ьеи 25 Азп ТЬг А1а Туг РЬе 30 Ьеи ТЬг
ааб саб бба ссд сбс дба асб ббб дад ааб даа аас бдб абб сдб бсб 144
Азп Шз Ьеи 35 Рго Ьеи ν&1 ТЬг РЬе 40 О1и Азп О1и Азп Суз 45 11е Агд Зег
сбб сбс дсб дсб сбд ссб ббд сбд сбс адб аад сад сбс дас ссс ддд 192
Ьеи Ьеи 50 А1а А1а Ьеи Рго Ьеи 55 Ьеи Ьеи Зег Ьуз О1п 60 Ьеи Азр Рго О1у
адс ббс абб бас асб ссс ддд ааа сдс сад бсб бба сда сбд дсс адд 240
Зег 65 РЬе 11е Туг ТЬг Рго 70 О1у Ьуз Агд О1п Зег 75 Ьеи Агд Ьеи А1а Агд 80
ббс бас ааб бас бдс дда дсс дбд бба ссс адс асб сдс аас абб дас 288
РЬе Туг Азп Туг Суз 85 О1у А1а ν&1 Ьеи Рго 90 Зег ТЬг Агд Азп 11е 95 Азр
бба сда дбд ссс ссс ада ааа дас дбб ааа ада ббб бас сбб дсс сда 336
Ьеи Агд ν&1 Рго 100 Рго Агд Ьуз Азр ν&1 105 Ьуз Агд РЬе Туг Ьеи 110 А1а Агд
ааб бса ддс ада даб сбд ддд дад адд сба саа сдс сдс ада даа абб 384
Азп Зег О1у 115 Агд Азр Ьеи О1у О1и 120 Агд Ьеи О1п Агд Агд 125 Агд О1и 11е
ббс бсб сдс ддб даа дса дад ббб ааа аад ббс сбб бса дба бдд бдб 432
РЬе Зег 130 Агд О1у О1и А1а О1и 135 РЬе Ьуз Ьуз РЬе Ьеи 140 Зег Уа1 Тгр Суз
дсб даа адс дад ада аад сба сдд дад адб ссб ааа абс даб абб ада 480
А1а 145 О1и Зег О1и Агд Ьуз 150 Ьеи Агд О1и Зег Рго 155 Ьуз 11е Азр 11е Агд 160
абд дас саб абб абб абд дбс бба сдс даб абд ддс асб сбс ббд сас 528
Меб Азр Шз 11е 11е 165 Меб ν&1 Ьеи Агд Азр 170 Меб О1у ТЬг Ьеи Ьеи 175 Ηίδ
сдб сбд дба сбб дбб даа даа сба бас саб ада ааб асб баб дсб дад 576
Агд Ьеи ν&1 Ьеи 180 ν&1 О1и О1и Ьеи Туг 185 Шз Агд Азп ТЬг Туг 190 А1а О1и
сбс дсб ббб бдс дбб сас сас сбб ббб ддб даа дсб сдб ддб абд даб 624
Ьеи А1а РЬе 195 Суз ν&1 Ηίδ Шз Ьеи 200 РЬе О1у О1и А1а Агд 205 О1у Меб Азр
ббб бдд сдд ббд дсб аас ббс ссб ддб ааа бдд ббб абб бдс бсб сас 672
РЬе Тгр Агд Ьеи А1а Азп РЬе Рго О1у Ьуз Тгр РЬе 11е Суз Зег Ηίε
210 215 220
- 29 029359
720
даа О1и 225 абд Меб баб Туг ббб РЬе даа О1и аас Азп 230 бсб Зег ббс РЬе абс 11е сад О1п ааа Ьуз 235 дад О1и сба Ьеи сдб Агд ббд Ьеи бда
<210> 18
<211> 239
<212> РКТ
<213> Вирус слабого пожелтения свеклы
<400> 18
Меб О1п РЬе О1п Ьеи Ьуз ТЬг Азп Зег РЬе ТЬг Суз Зег Ьеи Азп Агд
1 5 10 15
Рго Ьеи ТЬг А1а ТЬг О1и Агд Уа1 Ьеи Азп ТЬг А1а Туг РЬе Ьеи ТЬг
20 25 30
Азп Ηΐ3 Ьеи Рго Ьеи Уа1 ТЬг РЬе О1и Азп О1и Азп Суз 11е Агд Зег
35 40 45
Ьеи Ьеи А1а А1а Ьеи Рго Ьеи Ьеи Ьеи Зег Ьуз С1п Ьеи Азр Рго О1у
50 55 60
Зег РЬе 11е Туг ТЬг Рго С1у Ьуз Агд С1п Зег Ьеи Агд Ьеи А1а Агд
65 70 75 80
РЬе Туг Азп Туг Суз С1у А1а Уа1 Ьеи Рго Зег ТЬг Агд Азп 11е Азр
85 90 95
Ьеи Агд Уа1 Рго Рго Агд Ьуз Азр Уа1 Ьуз Агд РЬе Туг Ьеи А1а Агд
100 105 110
Азп Зег О1у Агд Азр Ьеи С1у О1и Агд Ьеи С1п Агд Агд Агд О1и 11е
115 120 125
РЬе Зег Агд О1у О1и А1а О1и РЬе Ьуз Ьуз РЬе Ьеи Зег Уа1 Тгр Суз
130 135 140
А1а О1и Зег О1и Агд Ьуз Ьеи Агд О1и Зег Рго Ьуз 11е Азр 11е Агд
145 150 155 160
Меб Азр Η13 11е 11е Меб Уа1 Ьеи Агд Азр Меб О1у ТЬг Ьеи Ьеи Н1з
165 170 175
Агд Ьеи Уа1 Ьеи Уа1 О1и О1и Ьеи Туг Н1з Агд Азп ТЬг Туг А1а О1и
180 185 190
Ьеи А1а РЬе Суз Уа1 Нгз Нгз Ьеи РЬе О1у О1и А1а Агд О1у Меб Азр
195 200 205
- 30 029359
РЬе Тгр Агд Ьеи А1а Азп РЬе Рго О1у Ьуз Тгр РЬе 11е Суз Зег Н1з
210 215 220
О1и МеЕ Туг РЬе О1и Азп Зег РЬе 11е О1п Ьуз О1и Ьеи Агд Ьеи
225 230 235

Claims (18)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Конструкция РНК, индуцирующая у растения или у растительной клетки толерантность или резистентность к вирусу ВМУУ, содержащая последовательность смыслового сегмента и последовательность антисмыслового сегмента, полученные на основе гена Р0 генома ВМУУ (вирус слабого пожелтения свеклы) или на основе его ортологичного гена, где обе последовательности указанных сегментов содержат нуклеотидный фрагмент по меньшей мере из 20 нуклеотидов, имеющий последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную последовательности гена Р0 (8ЕО ГО N0:17) из генома ВМУУ или его ортологичного гена.
  2. 2. Конструкция РНК по п.1, где последовательность(ти) смыслового сегмента и/или антисмыслового сегмента дополнительно содержит(ат) нуклеотидный фрагмент, имеющий последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную 5'-концевой нетранслируемой последовательности (5' ИТК), находящейся рядом с нуклеотидной последовательностью гена Р0 из генома ВМΥУ.
  3. 3. Конструкция РНК по п.1, где последовательности смыслового сегмента и антисмыслового сегмента дополнительно содержат нуклеотидный фрагмент, имеющий последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную последовательности гена Р1 генома ВМУУ.
  4. 4. Конструкция РНК по любому из пп.1-3, где смысловой сегмент содержит или состоит из последовательности 8Е0 ГО N0:1 и антисмысловой сегмент содержит или состоит из последовательности 8Еф ГО N0:3.
  5. 5. Конструкция РНК по любому из пп.1-4, где обе последовательности сегментов дополнительно содержат нуклеотидный фрагмент по меньшей мере из 20 нуклеотидов, имеющий последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную последовательности генома ВУУУУ (вирус некротического пожелтения жилок свеклы).
  6. 6. Конструкция РНК по п.5, где смысловой сегмент содержит фрагмент 8Е0 ГО N0:5 и антисмысловой сегмент содержит фрагмент 8Е0 ГО N0:6.
  7. 7. Конструкция РНК по любому из пп.1-3 или 5, где указанные сегмент(ы) и фрагмент(ы) содержат более чем 25 нуклеотидов.
  8. 8. Конструкция ДНК, транскрибируемая в конструкцию РНК по любому из пп.1-7.
  9. 9. Вектор, содержащий конструкцию нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-8.
  10. 10. Молекула двухцепочечной самокомплементарной РНК, экспрессируемая конструкцией ДНК по п.8 или вектором по п.9, для придания устойчивости к вирусу ВМУУ, несущему ген Р0 (8Е0 ГО N0:17), или к другому вирусу, несущему ген, ортологичный гену Р0.
  11. 11. Способ индуцирования у растения или у растительной клетки толерантности или резистентности к вирусу ВМУУ, включающий получение конструкции нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-8, функционально связанной с одной или более чем одной регуляторной последовательностью, активной в растении или растительной клетке, или вектора по п.9, и трансформацию растительной клетки указанной конструкцией нуклеиновой кислоты или указанным вектором.
  12. 12. Способ по п.11, где резистентность представляет собой полную резистентность.
  13. 13. Трансгенное растение или клетка трансгенного растения, толерантные или резистентные к вирусу ВМУУ и содержащие конструкцию нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-8, функционально связанную с одной или более чем одной регуляторной последовательностью, активной в растении или растительной клетке, и/или содержащие вектор по п.9, и/или молекулу двухцепочечной самокомплементарной РНК по п.10.
  14. 14. Трансгенное растение или клетка трансгенного растения по п.13, где резистентность представляет собой полную резистентность.
  15. 15. Трансгенное растение или клетка трансгенного растения по любому из пп.13 и 14, где конструкция нуклеиновой кислоты представляет собой конструкцию ДНК по п.8.
  16. 16. Трансгенное растение или клетка трансгенного растения по любому из пп.13-15, выбранные из группы, состоящей из салата-латука, огурца, картофеля, сахарного тростника, гороха, ячменя и сахарной свеклы.
  17. 17. Трансгенное растение или клетка трансгенного растения по п.16, представляющие собой сахарную свеклу или клетку сахарной свеклы.
    - 31 029359
  18. 18. Воспроизводящаяся структура трансгенного растения, происходящая из клетки трансгенного растения по любому из пп.13-17, где указанная воспроизводящаяся структура выбрана из группы, состоящей из каллусов, почек или зародышей.
    | РО смысловая | СНЗА интрон (1352 п.н.) | РО антисмысловая |
EA201490160A 2011-06-23 2012-06-15 Конструкции для сайленсинга гена p0 и их применение EA029359B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11171196A EP2537936A1 (en) 2011-06-23 2011-06-23 P0 gene silencing constructs and use
PCT/EP2012/061436 WO2012175420A1 (en) 2011-06-23 2012-06-15 P0 gene silencing constructs and use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201490160A1 EA201490160A1 (ru) 2014-04-30
EA029359B1 true EA029359B1 (ru) 2018-03-30

Family

ID=44907563

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201490160A EA029359B1 (ru) 2011-06-23 2012-06-15 Конструкции для сайленсинга гена p0 и их применение

Country Status (17)

Country Link
US (2) US9932603B2 (ru)
EP (2) EP2537936A1 (ru)
CN (1) CN103635581B (ru)
CA (1) CA2839371A1 (ru)
CL (1) CL2013003466A1 (ru)
DK (1) DK2723873T4 (ru)
EA (1) EA029359B1 (ru)
ES (1) ES2647077T5 (ru)
HU (1) HUE035070T2 (ru)
LT (1) LT2723873T (ru)
MA (1) MA35283B1 (ru)
PL (1) PL2723873T5 (ru)
PT (1) PT2723873T (ru)
SI (1) SI2723873T1 (ru)
TN (1) TN2013000498A1 (ru)
UA (1) UA114603C2 (ru)
WO (1) WO2012175420A1 (ru)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150291969A1 (en) * 2014-01-30 2015-10-15 Chromatin, Inc. Compositions for reduced lignin content in sorghum and improving cell wall digestibility, and methods of making the same
CN110938645A (zh) * 2019-12-17 2020-03-31 中国农业大学 一种甘蔗黄叶病毒运动蛋白表达纯化方法及其多克隆抗血清的制备
US20230183733A1 (en) 2020-05-20 2023-06-15 KWS SAAT SE & Co. KGaA Multiple virus resistance

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007128755A2 (en) * 2006-05-03 2007-11-15 Sesvanderhave N.V. P15 hairpin constructs and use

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE129745T1 (de) 1990-03-02 1995-11-15 Biocem Regenerierung und genetische transformation der zuckerrübe.
EP1029923A1 (en) 1999-01-27 2000-08-23 D.J. Van Der Have B.V. Method for conveying BNYVV resistance to sugar beet plants
WO2009141446A1 (en) 2008-05-23 2009-11-26 Syngenta Participations Ag Transgenic sugar beet plants
EP2367414A1 (en) 2008-12-19 2011-09-28 Syngenta Participations AG Transgenic sugar beet event gm rz13

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007128755A2 (en) * 2006-05-03 2007-11-15 Sesvanderhave N.V. P15 hairpin constructs and use

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANNA KOZLOWSKA-MAKULSKA, HUBERT GUILLEY, MAREK S. SZYNDEL, MONIQUE BEUVE, OLIVIER LEMAIRE, ETIENNE HERRBACH, AND SALAH BOUZOUBAA: "P0 proteins of European beet-infecting poleroviruses display variable RNA silencing suppression activity", JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY., SOCIETY FOR GENERAL MICROBIOLOGY, SPENCERS WOOD., GB, vol. 91, no. 4, 1 April 2010 (2010-04-01), GB, pages 1082 - 1091, XP002666419, ISSN: 0022-1317, DOI: 10.1099/vir.0.016360-0 *
CARMEN SIM�N-MATEO, JUAN ANTONIO GARC�: "Antiviral strategies in plants based on RNA silencing", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA (BBA) - GENE REGULATORY MECHANISMS, ELSEVIER, vol. 1809, no. 11-12, 1 November 2011 (2011-11-01), pages 722 - 731, XP055015505, ISSN: 18749399, DOI: 10.1016/j.bbagrm.2011.05.011 *
Ourania I. Pavli: "Molecular Characterization of Beet Necrotic Yellow Vein Virus in Greece and Transgenic Approaches towards Enhancing Rhizomania Disease Resistance", Thesis for the degree of doctor at Wageningen University, NL, 11 January 2010 (2010-01-11), pages 1-166, XP002666420, Retrieved from the Internet: URL:http://edepot.wur.nl/15444, [retrieved on 2011-12-20], Chapter 7, pages 97-114 *
PU YAN, SHUCHANG WANG, WENTAO SHEN, XINZHENG GAO, JINYAN WU, PENG ZHOU: "Simple construction of chimeric hairpin RNA for virus resistance in plants", JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS, vol. 166, no. 1-2, 1 June 2010 (2010-06-01), pages 101 - 105, XP055015504, ISSN: 01660934, DOI: 10.1016/j.jviromet.2010.03.008 *
TENLLADO F, LLAVE C, DIAZ-RUIZ J R: "RNA interference as a new biotechnological tool for the control of virus diseases in plants", VIRUS RESEARCH, AMSTERDAM, NL, vol. 102, no. 1, 1 June 2004 (2004-06-01), NL, pages 85 - 96, XP002383766, ISSN: 0168-1702, DOI: 10.1016/j.virusres.2004.01.019 *

Also Published As

Publication number Publication date
HUE035070T2 (en) 2018-05-02
CN103635581A (zh) 2014-03-12
MA35283B1 (fr) 2014-07-03
DK2723873T4 (da) 2020-04-20
PL2723873T3 (pl) 2018-01-31
CA2839371A1 (en) 2012-12-27
SI2723873T1 (sl) 2017-11-30
ES2647077T3 (es) 2017-12-19
CL2013003466A1 (es) 2014-08-08
US20140317779A1 (en) 2014-10-23
DK2723873T3 (da) 2017-11-20
US9932603B2 (en) 2018-04-03
EP2723873A1 (en) 2014-04-30
EP2723873B1 (en) 2017-08-09
TN2013000498A1 (fr) 2015-03-30
LT2723873T (lt) 2018-02-12
CN103635581B (zh) 2016-08-10
EP2537936A1 (en) 2012-12-26
EP2723873B2 (en) 2020-01-15
US10662438B2 (en) 2020-05-26
PT2723873T (pt) 2017-10-04
UA114603C2 (uk) 2017-07-10
PL2723873T5 (pl) 2020-07-13
ES2647077T5 (es) 2020-10-05
WO2012175420A1 (en) 2012-12-27
US20180265888A1 (en) 2018-09-20
EA201490160A1 (ru) 2014-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhan et al. Generation of virus‐resistant potato plants by RNA genome targeting
KR101994953B1 (ko) 침입성 dna 바이러스에 대해 식물 내성을 강화하는 방법
Patil et al. RNAi‐mediated resistance to diverse isolates belonging to two virus species involved in Cassava brown streak disease
Chung et al. Engineered resistance in potato against potato leafroll virus, potato virus A and potato virus Y
Yu et al. Targeting of SPCSV‐RNase3 via CRISPR‐Cas13 confers resistance against sweet potato virus disease
CN102428187A (zh) 植物中的多重病毒抗性
CN109705202B (zh) 一种培育抗灰斑病植物的方法
JP2018537979A (ja) タバコ遺伝子ＮｔＴＣＴＰの、植物における抗ジャガイモＹウイルスへの応用
CN106574260A (zh) 猪繁殖与呼吸障碍综合征防治剂
EA029359B1 (ru) Конструкции для сайленсинга гена p0 и их применение
US10000766B2 (en) Recombinant construct, recombinant microorganism, recombinant plant cell and method of providing plant with resistance against DNA virus and RNA virus
Lee et al. Translation start sequences affect the efficiency of silencing of Agrobacterium tumefaciens T-DNA oncogenes
US10443063B2 (en) Methods for generating transgenic plants
CN109161558B (zh) 一种单子叶植物miRNA高效过表达载体的构建方法
WO2022133186A2 (en) Create huanglongbing tolerance by silencing a citrus negative immune regulator
EA013911B1 (ru) Конструкции-&#34;шпильки&#34; р15 и применение
CN109207510B (zh) 一种单子叶植物miRNA高效沉默载体的构建方法
RU2808216C2 (ru) Композиция на основе интерферирующей дцРНК для защиты растений от фитофтороза
CN114214342B (zh) NtFBA1基因在调控烟草PVY抗性方面的应用
ES2388789B1 (es) Polinucleótidos y su uso para obtener plantas resistentes a virus.
Krishnamurthy et al. Comparison of Post-transcriptional Gene Silencing (PTGS) Strategies for Developing Transgenic Plants Resistant to Tomato Leaf Curl Virus (ToLCV)
EA011687B1 (ru) Способ придания растениям сахарной свеклы резистентности к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы и растение сахарной свеклы, резистентное к данному вирусу
WO2022146195A1 (ru) ИНТЕРФЕРИРУЮЩАЯ дцРНК ДЛЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ ФИТОФТОРОЗА
Dasgupta Use of RNAi Technology for Control of Rice Viruses
Ogwok TRANSIENT STUDIES ON RNA INTERFERENCE AND COAT PROTEIN-MEDIATED RESISTANCE TO CASSAVA BROWN STREAK DISEASE

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG TJ TM