PT2723873T - Construções de silenciamento de genes p0 e utilização - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO CONSTRUÇÕES DE SILENCIAMENTO DE GENES PO E UTILIZAÇÃO Campo da invenção

«mwmwvmwvmwmwmwwwmwmwmHmwwmmmmwM A presente invenção está relacionada corn um método para a transmissão de resistência ou tolerância viral a um ou ma is vírus, em particular ao vírus dG amarelecimento suave da beterraba (BMYV) e ao vírus da veia amarela necrótica da beterraba (BNYW) ou ao BMYV sozinho numa planta, em particular numa planta de beterraba. Além disso, a presente invenção relaciona-se com a planta resistente ou tolerante ao vírus obtida de acordo com este método, bem como com sementes e descendência derivada das mesmas. A presente invenção relaciona-se igualmente a construções de silenciamento de genes, especialmente construções em gancho que medeiam silenciamento de ARN BMYV ou BMYV e BNYW e respetiva utilização.

Antecedentes da invenção

Os vírus de plantas são um problema grave para muitas das principais culturas agrícolas, uma vez que as infeções por vírus provocam grandes perdas de colheita.

Na beterraba, as principais causas de doença são: (i) amarelecimento causado por um polerovírus, o Vírus do amarelecimento suave da beterraba (BMYV) transmitido pelo respetivo vetor principal Myzus persícae de urna maneira persistente; (ii) rizomania da beterraba causada por um benyvírus, o Vírus da veia amarela necrótica da beterraba (BNYW) transmitido por Polymyxa betae. A utilização extensiva de resistente contra BNYW permitiu preservar produções, apesar de estarem a ocorrer isolados virais de quebra de resistência e de existir uma necessidade urgente de novas 'variedades resistentes.

Os vírus transmitidos por fungos, tal como BNYW, podem ser retidos em esporos de repouso no sgIo durante anos depois de um campo ficar infestado. Uma vez que não existem nenhuns métodos químicos ou físicos eficazes para a eliminação do vírus, nem nas plantas nem no solo, a única GpçâG para o produtor de beterraba é a utilização de cultivares geneticamente resistentes. Várias empresas forneceram diversas variedades tolerantes e mesmo parcialmente resistentes através de reprodução. Contudo, trata-se de um processo muito tedioso e moroso, que demora geralmente muito tempo até serem obtidas plantas resistentes úteis. A rápida revolução nas áreas de engenharia industrial originou o desenvolvimento de novas estratégias para conferir a resistência genética aos vírus. A resistência a doenças virais através da introdução de porções de sequências de genomas virais em que a sequência (cGnstruçâG) virai é transformada numa célula de planta e numa planta tornou-se uma nova fonte de resistência. A beterraba ê conhecida por ser uma espécie recalcitrante na engenharia genética, complicando uma possível indução bem-sucedida de resistência virai.

Alguns exemplos de tolerância de engenharia, por exemplo para o BNYW transformando e expressando a sequência de proteínas de revestimento BNYW no genGma de beterraba, foram publicados (W091/13159), embora existam apenas dados de relatório raros sobre as plantas de beterraba transgénicas funcionais completas, tais como as divulgadas em EP 1 169 463 BI. Em particular, os relatórios mostram dados limitados sobre o nível de resistência observada nas condições infetadas com plantas de beterraba transgénicas transformadas com um gene que codifica uma sequência de proteínas de revestimento BNYW, 0 genoma do furovírus da veia amarela necrõtica da beterraba (BNYW) consiste em cinco ARNs plus-sense, dois dos quais (ARNs 1 e 2) codificam funções essenciais para a infeçâG de todas as plantas enquantG os outros três (ARNs 3, 4 e 5) são implicados na infeção mediada por vetor de raízes de beterraba (Beta vulgaris) . 0 movimento de célula-para-célula de BNYW é gerido por um conjunto de três genes virais sucessivos e ligeiramente sobrepostos no ARN 2 conhecido como o bloco triplo de genes (TGB), que codifica, por ordem, as proteínas virais P42, P13 e P15 (os produtos de gene são designados pelo respetivo Mr calculado em quilodaltons). 0 genoma de BMYV consiste num ARN plus-sense linear com seis grelhas de leitura abertas (ORFs 0 a 5) principais. As ORFs 1 e 2 codificam proteínas envolvidas na replicação de vírus, enquanto cada uma das outras três ORFs (ORFs 3, 4 e 5) é codificada relativamente a proteínas estruturais (proteínas de revestimento maiores e menores) e uma proteína de movimento putativo.

Foi mostrado que a proteína PO de BMYV tem uma expressão fraca, uma consequência de contexto de codões de iniciação desfavorável do PO AUG e uma forte tendência para manter uma baixa expressão. Além disso, esta parte do genoma é altamente variável, e esta diversidade de sequência foi explorada para discriminar as diferentes espécies.

As doenças causadas por BNYW mostram expandir-se geograficamente a uma velocidade que depende da combinação de numerosos fatores ambientais e agrícolas locais. Por conseguinte, existe uma necessidade de melhorar os mecanismos de resistência genética que pGdem, sozinhos ou em conjunto, conferir uma resistência estável e de longa duração de plantas de beterraba que são cultivadas para utilização industrial.

Estado da técnica 0 pedido de patente WO 2007/128755 divulga uma sequência TGB-3 utilizada para reduzir e/ou suprimir os efeitos deletérios de TGB-3 de tipo selvagem nas plantas, para gerar plantas transgénicas resistentes ao vírus, especialmente beterrabas resistentes ao Vírus da veia amarela necrótiea da beterraba.

Carmen Simon--Mateo et al. , Bíochímica el Biophysíca Acta, 1809 N.° 11 e 12, páginas 722 a 731, 2011, divulga diferentes estratégias antivirais utilizadas para obter plantas resistentes virais nos últimos 25 anos, A. Kozlowska-Makulska et al. , Journal of General Virologyr Vol. 91, N.° 4, páginas 1082 a 1091, 2010, divulga a atividade supressora de silenciamento de ARN de proteínas P0 de diferentes isolados dos polerovírus de beterraba infetada, vírus da clorose da beterraba e vírus do amarelecimento suave da beterraba.

Pu Yan et ai. Journal of Virological Methods Vol. 166, N. 0 1 e 2, páginas 101 a 105, 2010, divulga construções de silenciamento de ARN para desenvolver plantas resistentes ao vírus através da expressâG de ARNs em gancho derivados de vírus.

Sumário âa invenção A presente invenção fornece métodos e meios para conferir tolerância ou resistência virai que não apresentem as desvantagens do estado da técnica, preferencialmente métodos e meios que conferem tolerância, resistência, preferencialmente resistência extrema ou total, especialmente tolerância ou resistência viral a BMYV (Vírus do amarelecimento suave da beterraba) (incluindo resistência extrema ou total a BMYV) ou preferencialmente tolerância ou resistência a BMYV (Vírus do amarelecimento suave da beterraba) e BNYW (Vírus da veia amarela necrótiea da beterraba) combinados (incluindo resistência extrema ou total a BMYV e BNYW) numa célula de planta ou numa planta, em particular numa célula de planta de beterraba ou numa planta de beterraba (possivelmente gerada a partir desta célula de planta), A presente invenção fornece ainda células de planta geneticamente modificadas ou transformadas que podem ser obtidas como tal, ou obtidas a partir deste método, e que podem ser geradas nas plantas que apresentam esta maior tolerância ou resistência aos vírus de planta mencionados. A invenção fornece igualmente descendência, isto é, descendência resistente ao vírus ou tolerante ao vírus, sementes ou outros órgãos reproduzíveis ou estruturas originárias desta planta ou destas células de plantas transformadas.

Um primeiro aspeto da presente invenção é uma construção de ARN compreendendo uma sequência de segmento sense e uma sequência de segmento antisense que têm sequências deduzidas a partir do gene PO (ou a partir da proteína BO de codificação de genes) do genoma BMYV ou a partir de um gene ortólogo, em que a referida sequência de segmento sense e a referida sequência de segmento antisense compreendem ambas um fragmento de nucleótidG com a sequência que partilha pelo menos 85 % de identidade de sequência com o gene PO do genoma BMYV ou de um gene ortólogo.

Preferencialmente, nesta construção de ARM, a{s) sequência(s) de segmentos sense e/ou segmentos antisense compreende (iit) ainda um fragmento de nucleótído com a(s) sequência(s) que partilha(m) pelo menos 85 % de identidade de sequência com a sequência não traduzida de extremidade 5' (IJTR 5') adjacente à sequência de nucleótidos de gene PO .

Maís preferencialmente nesta construção de ARM, as sequências de segmentos sense e segmentos antisense compreendem um fragmento de nucleótído com sequências que partilham pelo menos 85 % de identidade de sequência com o gene PO do genoma BMYV.

Vantajosamente, nesta construção de ARM, as sequências de segmentos sense e segmentos antisense compreendem ainda um fragmento de nucleótidos com sequências que partilham pelo menos 85 % de identidade de sequência com o gene PI do genoma BMYV.

Possivelmente, nestas construções de ARN, o segmento sense compreende ou consiste na sequência SEQ.ID.NO:1 e/ou g segmento antisense compreende ou consiste na sequência SEQ.ID,MO:3.

Vantajosamente, nestas construções de ARM, as sequências de segmentos sense e segmentos antisense compreendem ambas ainda um fragmento de nucleótido que partilha pelo menos 85 % de identidade de sequência com o genoma BNYW.

Um aspeto relacionado da presente invenção é uma construção de ADN que pode ser transcrita nesta (s) construção(ões) de ARM.

Outro aspeto relacionado é um vetor compreendendo a sequência de nucleótidos destas construções de ácido nucleico (ADN).

Outro aspeto relacionado é uma molécula de ARM autocomplementar bicatenârio expressada por este vetor ou esta construção de ADN. A presente invenção relaciona-se igualmente com um método para a indução de tolerância ou resistência, preferencialmente resistência total pelo menos ao vírus BMYV e possivelmente outro vírus, numa planta ou numa célula de planta, o referido método compreendendo as etapas de: preparação da construção de ácido nucleico da presente invenção (p. ex. compreendendo uma sequência deduzida a partir do gene PO e/ou dG genoma BMYV) , ligada de modo funcional a uma ou mais sequências reguladoras ativas na planta ou na célula de planta, e a transformação da célula de planta com a construção de ácido nucleico, induzindo assim a resistência pelo menos ao vírus BMYV na planta ou na célula de planta.

Vantajosamente, este método induz ainda tolerância a outro vírus, que é selecionado a partir do grupo que consiste em Vírus do mosaico amarelo do nabo, Vírus do amarelo transmitido pelo pulgão da curcuma, Vírus do enrolamento da folha da batata, Vírus da folha amarela da cana-de--açúcar, Vírus do Mosaico da Enação da Ervilha, Vírus do amarelo da beterraba ocidental-E.U.A., Vírus da clorose da beterraba, Vírus do nanismo amarelo do cereal e vírus BNYW, preferencialmente o vírus BNYW,

Um aspeto relacionado é um método para a indução de tolerância pelG menos ao vírus BMYV compreendendo a etapa de preparação de uma construção de ácido nucleico compreendendo um segmento sense e um segmento antisense deduzidos a partir da sequência de nucleõtidos BNYW, sendo preferencialmente deduzidos a partir do gene que codifica a proteína P15 do referido BNYW.

Ainda um aspeto relacionado é a utilização de uma sequência de nucleõtidos compreendendo uma sequência deduzida a partir do gene PO e/ou do genoma BMYV e/ou do ARN, ADN ou vetor da presente invenção para a indução de tolerância ou resistência, preferencialmente resistência total ao vírus BMYV e/ou ao vírus BNYW, numa planta ou numa célula de planta.

Outro aspeto é uma planta transgénica ou uma célula de planta transgénica tolerante ou resistente, de preferência totalmente resistente pelo menos ao vírus BMYV e possivelmente a um ou mais outros vírus e compreendendo uma construção de ácido nucleico capaz de expressar a sequência de nucleõtidos da presente invenção (compreendendo uma sequência deduzida a partir do gene PO e/ou do genoma BMYV) , ligada de modo funcional a uma ou mais sequências reguladoras ativas na planta ou na célula de planta, compreendendo o vetor da presente invenção, ou compreendendo uma molécula de ARN autocomplementar bicatenário da presente invenção.

Preferencialmente, esta planta transgénica ou célula de planta transgénica é resistente a outro vírus, que é selecionado a partir do grupG que consiste em Vírus do mosaico amarelo do nabo, Vírus do amarelo transmitido pelo pulgão da cúrcuma, Vírus do enrolamento da folha da batata, Vírus da folha amarela da cana--de--açúcar, Vírus do Mosaico da Enação da Ervilha, Vírus do amarelo da beterraba ocidental-E„U.A., Vírus da clorose da beterraba, Vírus do nanismo amarelo do cereal e vírus BNYW, preferencialmente o vírus BNYW.

Preferencialmente, esta planta transgénica ou célula de planta transgénica é selecionada a partir do grupo que consiste em alface, pepino, batata, cana-de-açúcar, ervilha, cevada e beterraba, sendo preferencialmente uma beterraba ou uma célula de beterraba.

Um aspeto relacionado é um tecido de planta transgénica e/ou uma estrutura reproduzível derivada a partir desta célula de planta transgénica (de acordo com a presente invenção), em que o referídG tecido é selecionado a partir do grupo que consiste em fruto, caule, raiz, tubérculo e semente, ou em que a referida estrutura reproduzível é selecionada a partir do grupo que consiste em calos, rebentos ou embriões. DνΛΐΡΛ «aαλ*f- í mvr*acs £7 X, V ^ Uc Jr JL Vg* (Stv/ Ui€k W lia ^ Ui· s3

As Figuras IA e B representam um fragmento da sequência de PO viral de acGrdo com a invenção (Figuras IA e B; SEQ. ID.NO:13) com uma sequência de nucleótidos PO sense (SEQ. ID.NO: 1, mais curta do que a sequência de PO completa SEQ ID NO: 17) e urna sequência de nucleótidos PO antisense homóloga correspondente (negrito, SEQ.ID.NO:3) intercalada com uma sequência de intrões de petúnia de 1352 bp (negrito sublinhado, SEQ. ID.NO:11) . Alguns nucleótidos na Figura 1B são indicados em negrito itálico. Estes correspondem à UTR 5' do genoma BMYV virai. Outros poucos nucleótidos em itálico e sublinhados na Figura 1B não pertencem a PO nem ao intrão, mas ainda se encontram presentes, uma vez que estes correspondem aos restos da estratégia de clonagem. Uma construção compreendendo o gancho completo (SEQ. ID.MO:13) ê igualmente referida como construção hpPO 1. A Figura 2 (A e B) representa outro fragmento da sequência de PO viral de acGrdo com a invenção (Figuras 2A e B; SEQ. ID.NO:14) com uma sequência de nucleótidos PO sense e urna sequência de nucleótidos PO antisense (negrito) intercalada corn uma sequência de íntrões de beterraba de 91 bp (negrito sublinhado, SEQ.ID.NO:12). Alguns nucleótidos na Figura 2B são indicados em negrito itálico. Estes correspondem à UTR 5' do genoma BMYV virai. Outros poucos nucleótidos em itálico e sublinhados na Figura 2B que não pertencem a PO nem pertencem ao intrão ainda se encontram presentes, uma vez que estes correspondem aos restos da estratégia de clonagem. As sequências de nucleótidos PO sense e antisense aqui são iguais às apresentadas na Figura 1B. Uma construção compreendendo o gancho completo (SEQ.ID.MO:14) ê igualmente referida como construção hpPO 2. A Figura 3 realça as diferenças na extremidade 5' da SEQ.ID.NO:1 em comparação com a extremidade 5' da sequência de codificação BMYV PO representada por SEQ ID NO: 17. A sequência sublinhada da Fig. 3 corresponde â sequência líder 5' não funcional da SEQ.ID,MO:1. A Figura 4 (A e B) ê uma representação esquemática do vetor pFGC5941 no qual um fragmento do gene PO foi introduzido na orientação sense (SEQ.ID. N0:1) e antisense (SEQ.ID. N0:3), intercalado por uma sequência intrónica do gene Chalcona Sintase A de petúnia (CHSA; SEQ.ID. NO:11) (Figura 4A, pFGC5941, construção 1; SEQ.ID. MO :13), ou intercalado por uma sequência intrónica de beterraba (SEQ.ID, NO:12) de 91 nt (Figura 4B, pFGC5941, construção 2; SEQ.ID. NO:14). Promotor CaMV 35S: promotor 35S de CaMV; 3' OCS: sinal de políadenilação do gene octopina sintase; promotor MAS: promotor do gene manopina sintase; 3' MAS: sinal de poliadenilação do gene monopina sintase; BAR: gene de resistência ao herbicida Basta; pVSl: origem de replicação de pVSl; NPTII: gene de resistência a canamicina; LB, RB: bordas T-ADN esquerda e direita. A Figura 5 é uma análise estatística do teste de resistência obtido com a construção 1 (hpPOu com o intrão de petunia). Cada histograma representa o título BMYV médio com erro padrão em 10 plantas inoculadas com BMYV (Y) . hp: gancho; Inf: infetado. No eixo Ύ: densidade ótica (A405) obtida por ELISA 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1, 1,2. No eixo X, da esquerda para a direita: linhas transgénicas: hpPO-7, hpPO-8, hpPO-9, hpP0-10, hpP0-ll e hpPO-12; controlo infetado por BMYV: ColO Inf; ColO saudave!. A Figura 6 é uma análise estatística do teste de resistência obtido com a construção 2 (hpPOu com o intrão de beterraba). Cada histograma representa o título BMYV médio com erro padrão em 10 plantas inoculadas com BMYV (Y). hp: gancho; hpPO: construção 1; hpPObeterraba: construção 2; Inf: infetado. No eixo Y: densidade ótica (A4o5) obtida por ELISA 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3. No eixo X, da esquerda para a direita: linhas transgénicas: hpPO-12 (construção 1) , hpPObeterraba-1 (construção 2) , hpPQheterraba-2, hpPQheterraba-3, hpPQheterraba-4, hpPObeterraba-5, hpPObeterraba-6, hpPObeterraba-7 e hpPObeterraba-8; controlo infetado por BMYV: ColO Inf; ColO saudável. A Figura 7 é uma análise estatística do teste de resistência obtido com as construções 1 e 2 respetivamente. Cada histograma representa o título de vírus médio com erro padrão em 10 plantas inoculadas (Y). Os histogramas com cor cinzento escuro representam a infeção por clone BMYV-ΕΚ e os histogramas com cinzento claro a infeção por isolado BMYV-2itb através do método de transmissão de pulgões, respetivamente, hp: gancho; hpPO: construção 1; hpPQbeterraba: construção 2; Inf: infetado. No eixo Y: densidade ótica (A405) obtida por ELISA 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5. No eixo X, da esquerda para a direita: linhas transgénicas: hpPO-9 (construção 1), hpPQ-10, hpPO-12, hpP0beterraba-2 (construção 2), hpPObeterraba-7 e hpP0beterraba-8; controlo infetado: ColO Inf; ColO saudável. A Figura 8 representa a sequência PO WT (SEQ. ID.NO:17 e 18) . A Figura 9 (A e B) representa a sequência da construção em gancho hpP15A4~P0 de acordo com a invenção (Figuras 9A e B, SEQ. ID .NO: 15) com uma sequência de nucleõtidos P15A4-P0 sense (SEQ.ID.NO:7, nucleõtidos em itálico para a sequência de P15A4 com as 3 mutações sublinhadas e nucleõtidos habituais para a sequência de PO; em comparação com WT P15: A é substituído por C, e AG por GC.) e SEQ.ID.NO:8 que corresponde a uma sequência de nucleõtidos P15A4-P0 antisense (negrito itálico para P15A4 e negrito para PO) intercalada com uma sequência de intrões de beterraba de 91bp (negrito sublinhado, SEQ. ID.NO:12) . Alguns nucleõtidos na Figura 9B são indicados em negrito itálico e sublinhado. Estes correspondem à UTR 5' do genoma BMYV virai. Outros poucGS nucleõtidos sublinhados na Figura 9B que não pertencem a P15A4-P0 nem pertencem ao intrão ainda se encontram presentes, uma vez que estes correspondem aos restos da estratégia de clonagem. Uma construção compreendendo o gancho completo (SEQ.ID.NO:15) é igualmente referida como construção hpP15A4-P0 1. A Figura 10 (A e B) representa a sequência das construções em gancho hpP0-P15A4-A e hpP0-P15A4-B de acordo com a invenção (Figuras 10A e B, SEQ. ID.NO:16) com uma sequência de nucleõtidos P0-P15A4 sense (SEQ. ID.NO:9, nucleõtidos habituais para a sequência PO e nucleõtidos em itálico para a sequência de P15A4 com as 3 mutações sublinhadas) e SEQ,ID.NO:10 que corresponde a uma sequência de nucleótidos P0-P15A4 antisense (negrito para PO e negrito itálico para P15A4) intercalada com uma sequência de intrões de beterraba de 91bp (negrito sublinhado, SEQ. ID.NO:12) . A diferença entre as duas construções em gancho é a presença de dois nucleótidos adicionais na sequência de P15A4 (nucleótidos em caixa) para a construção hpP0-P15A4-B. Alguns nucleótidos na Figura 10B são indicados em negrito itálico e sublinhados. Estes correspondem à UTR 5' do genoma BMYV virai. Outros poucos nucleótidos sublinhados na Figura 10B que não pertencem a P0-P15A4 nem pertencem ao intrão ainda se encontram presentes, uma vez que estes correspondem aos restos da estratégia de clonagem. Uma construção compreendendo o gancho completo (SEQ. ID.NO:16) é igualmente referida como construção hpPO-P15A4-A 2 e como construção hpP0-P15A4-B 3. A Figura 11 (A e B) é uma representação esquemática do vetor pFGC5941 no qual uma sequência de P15A4-P0 ou sequência de P0-P15A4 foi introduzida na orientação sense e antisense, intercalada por uma sequência intrõnica de beterraba de 91 nt (Figura 11A, pFGChpP15A4- PO, construção 1 e Figura 11B, pFGChpP0-P15A4-A e pFGChpPO-P15A4-B, construção 2 e 3, respetivamente). Promotor CaMV 35S: promotor 35S de CaMV; 3' OCS: sinal de poliadenilação do gene octopina sintase; promotor MAS: promotor do gene manopina sintase; 3' MAS: sinal de poliadenilação do gene monopina sintase; BAR: gene de resistência ao herbicida Basta; pVSl: origem de replicação de pVSl; NPTII: gene de resistência a canamicina; LB; RB: bordas T-ADN esquerda e direita. Descrição detalhada da invenção

Considerando a ocorrência de ambos os vírus dentro das áreas de crescimento de beterraba, os inventores desenvolveram planas transgénicas que são resistentes relativamente a um ou ambos os vírus (BMYV e/ou BMW) , ou mesmo vírus adicionais capazes de infetar a mesma planta.

Na realidade, BNYW ê urna grande preocupação e os inventores preveem que a prevalência de BMYV também corre o risco de crescer.

Um primeiro aspeto da. presente invenção está relacionado com uma construção de ARN (tal como um ARN em gancho preferencialmente descrito em seguida como hpPO) compreendendo segmento sense (ARN) e segmento antisense (ARN) (ambos) tendo sequências deduzidas (isto é, que partilham pelo menos 85 % de identidade de sequência) a partir dG gene PO (ou sequência de nucleótidos) ou a partir do gene (sequência de nucleótidos que codifica a proteína BO) do genoma BMYV ou a partir de genes ortólogos ou que têm sequências deduzidas (isto é, que partilham pelo menos 85 % de identidade de sequência) a partir do genoma BMYV.

Vantajosamente, esta construção de ARN (gancho; hpPO) compreende um segmento sense (ARN) e um segmento antisense (ARM) (ambos) compreendendo ainda fragmentos (sense e/ou antisense) (ARN) deduzidos (isto é, que partilham pelo menos 85 % de identidade) a partir da região não traduzida 5' (UTR 5') de BMYV (adjacente a este gene que codifica PO de BMYV ou genes ortólogos) e/ou esta construção de ARM (gancho) compreende um segmento ARM sense e um segmento ARN antisense com sequências deduzidas a partir de um fragmento de nucleótidos da UTR 5' e de um fragmento de nucleótido (adjacente) da sequência de nucleótidos PO de BMYV ou de genes ortólogos.

Preferencialmente, estes fragmentos da UTR 5' e da sequência de nucleótidos PO são adjacentes no genoma BMYV.

Este gancho ARN, ao compreender um fragmento da UTR 5' e de PO, ê preferencialmente referido na presente invenção como sequência de nucleótidos hpPOu.

Possivelmente (mas menos preferencialmente), esta(s) construção(ões) (gancho(s) hpPO e/ou hpPOu (ARN)) de acGrdo com a invenção não compreende (m) um fragmento que tem uma sequência deduzida a partir de outro vírus, tal como genoma BNYW.

Vantajosamente, esta(s) construção(ões) de ARM (gancho; hpPO e/ou hpPOu) de acordo com a invenção compreende(m) um segmento de ARM sense e um segmento de ARM antisense tendo ainda (um fragmento sendo) sequências deduzidas a partir do genoma BNYW, preferencialmente além da sequência 5' UTR a partir do genoma BMYV (adjacente a PO) e/ou esta(s) construção(ões) de ARN (gancho; hpPO e/ou hpPOu) compreende(m) um segmento de ARM sense e um segmento de ARM antisense (compreendendo um fragmento tendG uma sequência deduzida a partir do gene PO) ambos compreendendo ainda um fragmento de nucleótido que partilha pelo menos 85 % de identidade de sequência com (uma parte de) o genoma BNYW.

Mais preferencialmente, estes segmentos de ARM sense e antisense deduzidos a partir do genoma BNYW são sequências sense e/ou antisense que correspondem â (uma parte da) sequência PI5 do genoma BNYW (quando o mesmo corresponde a um gancho, são aqui abaixo referidos como hpP0-P15 ou hpPOu-PI5, o último contendo ainda um fragmento de nucleótido deduzidG a partir da sequência UTR 5' dG genoma BMYV).

Vantajosamente, esta(s) construção(ões) (em gancho) de ARN hpPO e/ou hpPOu compreende(m) igualmente fragmentos (ARN) de nucleótidos sense e antisense com sequências deduzidas a partir da sequência de nucleótidos PI de BMYV.

No contexto da presente invenção, "ortólogos" referem-se a genes em espécies diferentes que retêm a mesma função (p. ex. no decorrer da evolução) . Um exemplo de genes ortólogos do gene PO (ou sequência de nucleótidos) do genoma BMYV é fornecido na tabela 1.

Tabela 1: lista não exaustiva de ortõlogos de sequência de PO identificados

No contexto da presente invenção, o termo "segmento" refere-se a uma ou ma is sequências de nucleótidos (ARN) sense e/ou antisense que podem ser utilizadas no silencíamentG de genes. Um segmento pode, por conseguinte, ter um comprimento de, no mínimo, 10 (preferencialmente pelo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35 ou 40) nucleótidos, mas pode igualmente estender-se por diversos genes e/ou genes e regiões não traduzidas (5') (UTR 5') adjacentes. 0 segmento preferido estende-se pelo (pela parte 5' do) gene PO (ou sequência de nucleótidos) e pela UTR 5' adjacente.

No contexto da presente invenção, o termo "fragmento" refere-se a uma sequência de nucleótidos (ARN) sense e/ou sequência de nucleótidos antisense com uma sequência deduzida a partir de uma sequência de nucleótidos virais alvo. Um fragmento pode, por conseguinte, ter um comprimento de, no mínimo, 10 (preferencialmente 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35 ou 40) nucleótidos, mas pode igualmente estender-se pGr mais de um gene.

No contexto da presente invenção, possivelmente, diversos fragmentos são associados para formar um ou mais segmentos sense e/ou antisense (ARN),

Possivelmente (especialmente no caso de dois fragmentos deduzidos a partir do genoma de diferentes vírus serem associados), os fragmentos são associados através de uma sequência de ligantes ou espaçadores (não derivados da sequência virai alvo) para formar um segmento sense (ARN) e/ou um ou mais segmentos antisense (ARM).

Preferencialmente, na presente invenção, o fragmento UTR 5' e o fragmento PO adjacente estão associados sem uma sequência de ligantes ou espaçadores.

Estas construções podem compreender sequências modificadas (sequências mutantes).

Por conseguinte, o termo "sequência deduzida" refere-se a sequências de nucleótidos com pelo menos 85 % (mais preferencialmente, pelo menos 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou até 100 %) de identidade de sequência com o gene mencionado. Por exemplo, uma sequência deduzida a partir do gene P0 (ou sequência) do genoma BMYV refere-se preferencialmente a uma sequência de nucleótidos com pelo menos 85 % de identidade de sequência com a sequência SEQ. ID.NO:17.

Preferencialmente, estas construções não contêm mais de 15 % de resíduos mutantes em comparação com a sequência de tipo selvagem (SEQ.ID.NO:17) e/ou com a sequência SEQ. ID.NO:1 OU a sequência SEQ.ID.NO:3.

Vantajosamente, estas construções (ARN) (incluindo segmentos e, mais preferencialmente, fragmentos) têm um tamanho superior a cerca de 25 nucleótidos, preferencialmente superior a cerca 50 nucleótidos.

Possivelmente, estas construções (ARN) (na forma de segmento sense e/ou de segmento antisense) têm um tamanho inferior a cerca de 10 000 nucleótidos, possivelmente inferior a cerca de 5000, cerca de 3000, cerca de 2000 ou cerca de 1000 nucleótidos.

Preferencialmente, o segmento sense (ARN) e/ou o segmento antisense (ARN) (com sequência deduzida a partir da UTR 5' de P0) compreendem fragmento(s) que se estende(m) por pelo menos 5 nucleótidos, mais preferencialmente pelo menos 10 nucleótidos, ainda mais preferencialmente pelo menos 20 nucleótidos da UTR 5' (adjacente ao gene P0), mas possivelmente por menos de 40 nucleótidos e preferencialmente por menos de 30 nucleótidos desta UTR 5' (adjacente ao gene P0) . A caracterização molecular do material de planta demonstrou a presença de pequenas niGlêculas de ARN complementares tanto a sense como a antisense da sequência de P0 BMYV, indicando que o mecanismo de silenciamento foi obtido e acionou a degradação do ARN genómico.

Estas construções (em gancho) de ARN acionam eficientemente PTGS, visando a degradação do ARN transcrito de BMYV (ou de BMYV e BNYW) .

Os inventores encontraram na realidade uma inibição mais potente de BMYV (e de BNYW) através das construções que albergam uma UTR 5' de BMYV, além de P0 (possivelmente além de sequências (fragmentos) deduzidas a partir do genoma BNYW) .

Por exemplo, ao utilizar a construção de nucleótidos hpP0-P15, os inventores observaram a produção de pARNis que visam a sequência BMYV, mas igualmente a sequência de ARN2 BNYW, resultando numa inibição muito eficaz e inesperada de ambas as infeções virais.

No caso desta construção dupla, os inventores observaram uma redução mais marcada de ambas as infeções virais (BMYV e/ou BNYW) do que se for utilizada uma construção comparável que visa exclusivamente BNYW ou BMYV.

Um aspeto relacionado é uma construção de ARN (tal como um ARN em gancho) compreendendo um segmento (ARN) sense e um segmento (ARN) antisense (ambos) tendo sequências deduzidas (isto é, que partilham pelo menos 85 % de identidade de sequência) a partir do genoma BMYV (ou a sequência de nucleGtídGS dG mesmo).

Preferencialmente, a construção de ARN (tal como um .ARN em gancho) deduzida a partir do genoma BMYV compreendendo um segmento (ARN) sense e um segmento (ARN) antisense tem uma sequência sense deduzida (isto é, que partilha pelo menos 85 % de identidade de sequência) a partir da metade 5' do genoma BMYV e/ou forma o grupo que consiste em nucleótidos do genoma BMYV que codifica proteínas PO, PI, P2, P3, P4 e P5, mais preferencialmente a partir dos nucleótidos do genoma BMYV que codifica proteínas PI ou P2,

Vantajosamente, estas construções (ARN) deduzidas a partir do genoma BMYV (incluindo segmentos e, mais preferencialmente, fragmentos) têm um tamanho superior a cerca de 25 nucleótidos, preferencialmente superior a cerca 50 nucleótidos.

Possivelmente, estas construções (ARN) deduzidas a partir do genoma BMYV (na forma de segmento sense e/ou de segmento antisense) têm um tamanho inferior a cerca de 10 000 nucleótidos, possivelmente inferior a cerca de 5000, cerca de 3000, cerca de 2000 ou cerca de 1000 nucleótidos.

Contrariamente, os inventores testaram o efeito de construções ARN (na forma de ganchos) com uma sequência deduzida exclusivamente a partir do genoma BNYW (tal como a sequência que codifica a proteína P15) ou a partir do genoma BMYV.

Estas construções P15 em gancho deduzidas a partir de BNYW resultaram numa infeção por BNYW reduzida em plantas coinfetadas por ambos os vírus (em comparação com construções de controlo), mas induziram igualmente alguma redução de sintomas BMYV (em comparação com as construções de controlo).

Estas construções hpPO em gancho e especialmente hpPOu deduzidas a partir de BMYV resultaram numa infeção por BMYV reduzida em plantas coinfetadas por ambos os vírus (em comparação com construções de controlo), mas induziram igualmente a redução dos sintomas devido à infeção por BNYW (em comparação corn as construções de controlo) .

Duas sequências de nucleõtidos BMYV foram testadas como construção de nucleótidos hpPOu (sequência SEQ„ID,NO:13 OU 14)„ A sequência de nucleõtidos de SEQ.ID.NO:1, 13 ou 14 pode ser comparada com a sequência SEQ. ID.NO:17, que corresponde à sequência do nucleótido PO de tipo selvagem (consulte a Figura 8) . 0 comprimento da sequência SEQ.ID,NO:1 é mais curto do que a sequência de nucleótidos da sequência SEQ.ID,NO:17 (659 nt versus 720 nt) e contém a UTR 5' do genoma virai (nucleótidos sublinhados) exceto o primeiro nucleótido de extremidade 5'.

Vantajosamente, a sequência de nucleõtidos PO sense e antisense são compreendidas numa molécula, e/ou o segmento de ARM PO sense e o segmento de ARN PO antisense são compreendidos numa única molécula de ARN. Vantajosamente, a molécula de ARN de acordo com a invenção é capaz de dobramento, de modo a que os referidos segmentos de ARN aí compreendidos formem uma molécula de ARN em gancho bicatenãrio.

Conforme aqui utilizado, "ARN em gancho" refere-se a qualquer molécula de ARN bicatenário de autorrecozimento. Na respetiva representação mais simples, um ARN em gancho consiste num caule bicatenário constituído pelas cadeias de ARN de recozimento, ligadas a um único ciclo de ARN monocatenãrio. Contudo, o termo "ARN em gancho" pretende igualmente abranger estruturas de ARM secundárias mais complicadas compreendendo sequências de ARN bicatenãrio de autorrecozimento, mas igualmente ciclos e bojos internos. A estrutura secundária específica adaptada será determinada pela energia livre da molécula de ARM, e pode ser prevista para diferentes situações utilizando software apropriado, tal como FOLDRNA.

Em alternativa, as sequências de nucleótidos PO sense e antisense podem estar presentes (ou codificadas) em duas moléculas separadas ou sequências de nucleótidos, que podem ser administradas ou fornecidas a uma célula de planta em simultâneo e/ou consecutivamente, de modo a que, quando transcritas, uma molécula de ARM bicatenãrio possa ser formada por emparelhamento de bases. A presente invenção está igualmente relacionada com uma construção de ADM que pode ser transcrita na(s) construção (ões) de ARM da invenção e com um vetor compreendendo esta construção de ADM, em particular um vetor de expressão (e/ou vetor de autorreplicação (tal como um plasmídeo ou um vetor virai)) ou cassete de expressão (ou sistema), preferencialmente codificando um segmento de ARM sense e um segmento de ARM antisense com sequências deduzidas a partir da(s) sequência(s) de PO, ligada(s) de modo funcional a uma ou mais sequências reguladoras (sequência promotora ou operadora, incluindo uma sequência de políA), ativas numa planta ou célula de planta, preferencialmente num tecido específicG (preferencialmente a raiz) da planta.

Outro aspeto da presente invenção relaciona-se com uma célula de planta ou planta transgénica, tal como Arabídopsis thalíana ou planta de beterraba (Beta vulgaris) que é transformada com a construção de nucleótidos (ADM), o vetor e/ou a molécula de ARM de acordo com a invenção.

Vantajosamente, existe uma baixa, e até nenhuma, amplificação virai na planta inoculada transformada com oís) fragmento(s) da{s) sequência(s) de nucleótidos PO de acordo com a invenção.

Preferencialmente, as sequências de ADN de acordo com a invenção são estavelmente integradas no genoma da célula de planta sendo transformada com as sequências virais PO geneticamente modificadas de acordo com a invenção e/ou com um vetor compreendendo estas sequências.

Em alternativa, o transgene compreendendo uma sequência de nucleótidos PO geneticamente modificada de acordo com a presente invenção pode ser localizada num epissoma ou num vetor de autorreplicação. Os exemplos de vetores de autorreplicação são vírus, em particular geminivírus ou plasmídeos.

Diversos vetores de transformação disponíveis para transformação de planta são conhecidos dos peritos na técnica, e as construções de ADN ou de nucleótidos de acordo com esta invenção (compreendendo a sequência virai PO geneticamente modificada) podem ser utilizadas em conjunto com quaisquer desses vetores. A seleção de vetor depende da técnica de transformação preferida.

Os componentes do sistema de expressão podem ser modificados, por exemplo, para aumentar a expressão dos segmentos de ARN sense e antisense. 0 promotor ligado de modo funcional às sequências de nucleótidos sense e/ou antisense de acordo com a invenção pode ser um promotor nativo da célula a transformar. 0 promotor, em alternativa, pode ser um promotor heterólogo, por exemplo um promotor específico de tecido, um promotor regulado em desenvolvimento, um promotor constitutivo ou um promotor induzível. Os promotores apropriados são bem conhecidos do perito na técnica. Na presente invenção, são preferidos promotores heterõlogos fortes que são ativos em tecidos de raiz ou são essencialmente ativos aí (quando a expressão noutros tecidos não é desejada). Vários terminadores de transcrição encontram-se disponíveis para a utilização em cassetes de expressão. Estes são responsáveis pela terminação de transcrição para além do transgene e a respetiva poliadenilação correta. Os terminadores de transcrição apropriados são os que são conhecidos por funcionarem em plantas e incluem o terminador CaMV 3 5S, o terminador tm/, o terminador de opalina sintase e o terminador rbcS E9 de ervilha e afins.

As sequências (segmentos) de nucleótidos sense e antisense na sequência virai PO (geneticamente modificada) de acordo com a invenção preferencialmente encontram-·se sob controlo de um único promotor, especialmente quando ambos os segmentos são compreendidos numa única sequência de nucleótidos (em gancho). Contudo, cada uma destas pode estar igualmente sob controlo de um promotor diferente (por exemplo, quando a construção de ARN é feita de segmentos que sâG 2 moléculas diferentes). Isto é, a sequência de ADN sense pode ser ligada de modo funcional a um primeiro promotor e a sequência de ADN antisense ligada de modo funcional a um segundo promotor, 0 primeiro promotor e o segundo promotor podem ser o mesmo promotor ou podem ser promotores diferentes, 0 promotor pode ser um promotor divergente ou bidirecional capaz de iniciar a transcrição de sequências de ADN (nos dGis segmentos de ARN) em cada lado do promotor. A construção ou sequência de ARN ou ADN de acordo com a invenção, para além de uma sequência (fragmento) de nucleótidos virai (PO) modificada sense e antisense, compreende ainda vantajosamente uma sequência de nucleótidos ligantes ou espaçadores entre as sequências de ADN que codificam os segmentos de ARN sense e antisense.

É esperado que não existam nenhuns limites de comprimento ou requisitos de sequência associados à região de espaçador, desde que estes parâmetros não interfiram com a capacidade das regiões de ARN com a sequência (segmento) de nucleótidos sense e antisense para formar um ARN bicatenário. Preferencialmente, a região de espaçador ou sequência varia em comprimento de cerca de 5 a cerca de 1000 bp, mais preferencialmente, de cerca de 10 a cerca de 500 bp, ainda mais preferencialmente de cerca de 50 a cerca de 200 bp.

Uma sequência de nucleótidos espaçadores ou ligantes preferida corresponde a uma sequência de intrões, preferencialmente uma na orientação sense, melhorando a eficiência de redução de expressão da sequência de nucleótidos alvo. 0 melhoramento na eficiência pode ser expressado como um aumento na frequência de plantas, em que g silenciamento ocorre, ou como um aumento no nível de redução de expressão virai.

As sequências (ou intrões) de nucleótidos de intrões preferidas são derivadas de genes de planta, como genes de ARN de ribossoma presumidos ou genes de planta altamente transcritos. Estes intrões podem ser derivados de qualquer gene de planta, mas preferencialmente são derivados de genes de planta dicotiledónea, p. ex. a partir de genes de Petunia, ainda mais preferencialmente são derivados de genes de beterraba. É igualmente possível utilizar apenas parte destes intrões (planta) , por exemplo pelo menos as bordas que contêm sinais de splicing (excisão-junção) (consulte abaixo). A totalidade destes intrões e partes dos mesmos no contexto da invenção são referidas como "fragmentos de intrão" ou "sequências de intrão".

Um comprimento preferido para essas sequências de nucleótidos de intrões é entre cerca de 5 e cerca de 1000 bp, preferencialmente entre cerca de 50 e cerca de 600 bp, mais preferencialmente entre cerca de 90 e cerca de 550 bp. As sequências de intrões preferidas compreendem a sequência SEQ ID MO 11 ou 12, ou até mais preferencialmente consistem na sequência SEQ ID NO 11 ou 12. A construção de ARM, compreendendo as sequências (de segmentos) de nucleótidos sense e antisense capazes de formar, por exemplo, uma estrutura em gancho, que são produzidas pela transcrição do ADN recombinante correspondente, pode igualmente ser introduzida diretamente numa célula de planta.

Essas moléculas de ARN podem ser produzidas, p. ex. através de clonagem da região de ADN capaz de ser transcrita numa molécula de ARN com uma sequência de nucleótidos compreendendo uma sequência (de segmentos) de nucleótidos sense de pelo menos 10 (preferencialmente pelo menos 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais) nucleótidos consecutivos que têm entre 75 e 100 % de identidade de sequência com (pelo menos parte da) a sequência de nucleótidos de interesse e um nucleótido (segmento) antisense com pelo menos 10 nucleótidos, (preferencialmente pelo menos cerca de 15 nt, 20 nt, particularmente pelo menos cerca de 50 nt, mais particularmente pelo menos cerca de 100 nt, especialmente pelG menos cerca de 150 nt, mais especialmente pelo menos cerca de 200 nt, 250 nt, 300 nt, muito especialmente pelo menos cerca de 350 nt ou cerca de 400 nt) e que têm entre cerca de 75 % e cerca de 100 % de identidade de sequência com o complemento de nucleótidos da sequência de nucleótidos sense (e com o ARNm alvo) , pelo que esta construção de ARN (compreendendo um segmento sense e um segmento antisense) é capaz de formar um ARN bicatenãrio através de emparelhamento de bases entre as regiões com sequência de nucleótidos sense e antisense resultante, por exemplo, numa estrutura de ARN em gancho; realização de uma reação de transcrição in vitro adicionando inter alia a ARN polimerase dependente de ADN adequada, bem como os reagentes necessários para gerar as moléculas de ARN; e isolamento das moléculas de ARN. A invenção fornece ainda uma planta resistente ou tolerante a BMYV e/ou BNYW que compreende no genoma de pelo menos parte das respetivas células, de preferência em substancialmente todas as respetivas células, uma sequência de PO (geneticamente modificada,* sense e/ou antisense e/ou em gancho) (e possivelmente também uma sequência sense e/ou antisense e/ou em gancho deduzida a partir do genoma de BNYW) de acordo com a invenção e/ou um vetor compreendendo a mesma, que, quando transcrita, produz uma molécula de ARN que aciona PTGS de BMYV e possivelmente de BNYW. Ê igualmente fornecida uma planta resistente ou tolerante a BMYV e/ou BNYW7· que compreende pelo menos em parte das respetivas células, de preferência em substancialmente todas as respetivas células, uma molécula de ARN de acordo com a invenção para alcançar o efeito acima descrito.

Uma "planta" refere-se a qualquer planta ou parte de uma planta em qualquer estádio de desenvolvimento. Neste caso, são igualmente incluídas estacas, culturas de células ou tecidos e sementes. Conforme utilizado em conjunto com a presente invenção, o termo "tecido de planta" inclui, mas não se limita a, plantas inteiras, células de planta, órgâGS de planta, sementes de planta, protoplastos, calos, culturas de célula e quaisquer grupos de células de planta organizados em unidades estruturais e/ou funcionais. Os últimos são igualmente referidos como estruturas reproduzíveis (de forma vegetativa), o que significa que as mesmas podem ser regeneradas numa planta inteira. A planta, transformada, os tecidos de planta e o material de planta obtidos podem ser utilizados numa reprodução convencional e em esquemas de propagação ou regeneração de plantas para produzir mais plantas transformadas com as mesmas características (resistência ou tolerância ao vírus) ou para introduzir a construção de ADN de acordo com a presente invenção noutras variedades da mesma ou uma espécie de planta relacionada. "Resistência ou tolerância ao vírus" significa, neste caso, que uma célula ou planta resistente ou tolerante não é suscetível ou reduziu a suscetibilidade a um ou mais vírus em comparação com uma célula ou planta sensível. No presente caso, são consideradas a resistência e preferencialmente a resistência extrema a infeções por BMYV e/ou BNYVV. Tolerância, pGr exemplo, significa que os sintomas habituais de uma infeção por vírus são inexistentes ou reduzidos, ou que a acumulação ou replicação do vírus na célula é prevenida ou reduzida, ou que o movimento do vírus, por exemplo, de célula para célula ê prevenido ou reduzido. A invenção será em seguida mais descrita através de referência aos seguintes exemplos (não limitativos) detalhados.

EXEMPLOS

Para estudar a funcionalidade da sequência de PO de indução de PTGS, foi construído um vetor Agrobacterium binário, por exemplo, de acordo com as Figuras 4A e 4B. A criação das construções de ADN de acordo com a invenção e a clonagem destas construções para Agrobacterium tumefaciens (estirpe GV3101 (tornada inofensiva)) foram efetuadas de acordo com métodos e técnicas bem conhecidos na técnica. Os fragmentos sense e antisense (PO) e os intrões foram gerados através de amplificação genética (PCR) incluindo sítios de restrição específicos nas extremidades. Misturados com a estrutura principal de vetor, apenas foi possível uma recombinação/'inserção dos fragmentos com base na compatibilidade destes sítios específicos na extremidade dos fragmentos. A estirpe Agrobacterium tumefaciens GV31Q1 que transporta uma construção em gancho foi utilizada para mediar a transformação de Arabídopsis thaliana através do método de mergulho floral. 0 material de folha de

Arabidopsis t ha liana transgénicia foi infetado pelo isolado natural BMYV-2itb utilizando transmissão de pulgões ou através da estirpe BMYV-EK emitida a partir do clone e pulgão infeciosos transmitidos.

Relativamente às experiências de transmissão de pulgões: para adquirir o vírus, foi permitido aos pulgões um período de acesso de aquisição (AAP) de 48 h em suspensão purificada de isolado BMYV-2itb ou clone BMYV-EK. Após o AAP, os pulgões foram transferidos com um pincel de ponta fina em folhas Arabidopsis thaliana transgénicas (10 pulgões por planta) durante um período de acesso de inoculação (IAP) de 96 h. Em seguida, os pulgões foram mortos através de tratamento com inseticida e a deteção de vírus através de ELISA foi efetuada 3 semanas ma is tarde nas folhas sistémicas.

Relativamente a todas as experiências abaixo, os dados ELISA foram avaliados por meio do software SAS 9.1 (método ANOVA) seguindo-se o teste de Tukey. 0 valor P < 0,05 indicou uma diferença significativa.

Exemplo 1 0 mecanismo de silenciamento de ARN visa sequências conservadas e induz a respetiva degradação. As sequências mais conservadas nos Polerovírus residem na metade 3' do ARN. É assumido que a expressão das construções em gancho com sequências deduzidas a partir de partes conservadas do genoma virai resulta (in planta) na formação de ARNbc que é reconhecido e cortado em duplos de cerca de 21 a 24 nts (pARNi) pela enzima Dicer. Os pARNis específicos serão carregados num complexo RISC (complexo de silenciamento induzido por ARN), que irã por sua vez visar o ARN genômico virai homologo e induzir a degradação do último. Como tal, o metabolismo do vírus será severamente enfraquecido e os sintomas da infeção virai serão reduzidos. Nos casos mais favoráveis, será obtida resistência total.

Os inventores primeiramente geraram duas sequências em gancho derivadas a partir da extremidade 3' virai do genoma viral (BMYV). A primeira construção albergou a sequência CP (coat protein - proteína de revestimento) denominada hpCP e a segunda a extremidade 3' da sequência RT (readtrough protein - proteína de transleitura) com a sequência de não codificação de extremidade 3' do genoma BMYV denominada hpRT+Nc.

Ambas as construções foram utilizadas para transformar plantas Arabidopsis tha liana e, para cada, foram obtidas dez linhas transgénicas independentes e testadas relativamente à respetiva resistência contra BMYV.

As plantas que expressam pARNi específico da extremidade 3' do genoma virai foram confrontadas com o vírus. Nenhuma planta transgénica foi resistente a BMYV independentemente do gancho hpCP ou hpRT+Nc utilizado. Exemplo 2

As construções hpPO(u) de codificação de Arabidopsis thaliana transgénicas de acordo com a invenção foram depois confrontadas com isolado BMYV-2itfo,

Foram criadas seis linhas de Arabidopsis thaliana transgénicas independentes que expressam o ARNm hpPO (ou hpOu). Os resultados obtidos com a construção 1 (Figura 4A) são resumidos na Figura 5. A análise ANOVA estatística efetuada revelou diferenças existentes nos valores ELISA de plantas transgénicas e de tipo selvagem (p<0,0001). 0 teste de Tukey revelou a ausência de uma diferença significativa entre linhas transgénicas, ao passo que todas as linhas eram significativamente diferentes para ColO Inf (p<0,05) revelando a resistência das linhas transgénicas relativamente à inoculação de BMYV.

As moléculas de pARNi específicas de PO foram detetadas nas seis linhas, mas em níveis mais altos nas três linhas resistentes (hpPO-9, -10 e -12). Não foi detetado nenhum pARNi nas plantas suscetíveis (Col 0).

Estes resultados realçam que as construções hpPO(u) são adequadas para induzir PTGS em plantas Arabídopsis thaliana e pGdem induzir resistência a BMYV.

Exemplo 3

As experiências do exemplo 2 foram repetidas com a construção 2 (Figura 4B) e com um número mais alto (oito) de linhas de Arabídopsis thaliana transgénicas confrontadas com isolado BMYV-2itb.

Os resultados são resumidos na Figura 6. Relativamente a esta construção, exceto a linha hpP0beterraba-3, todas as linhas foram resistentes a BMYV conforme confirmado pela análise estatística de Tukey e ANOVA (p<0,Q5). Não foi observada nenhuma diferença significativa entre as linhas hpPO-12 e hpPObeterraba resistente. Os níveis de moléculas de pARNi específicas de PO mostraram ser significativamente mais elevados nas linhas resistentes (hpPObeterraba-1, - 2, -5, -7 e -8) do que nas outras linhas.

Exemplo 4

Os resultados descritos no exemplo 2 e no exemplo 3 foram repetidos tanto com o tipo de linhas de Arabídopsis thaliana transgénicas (hpPO-9, -10, -12, hpPObeterraba-2, -7 e -8) como com duas fontes de inoculo (BMYV-ΕΚ ou BMYV-2itb).

Os resultados são representados na Figura 7. Todas as linhas de Arabídopsis thaliana transgénicas mostraram ser resistentes ao inoculo de BMYV-ΕΚ (p<0,05). As linhas transgénicas respondem de forma diferente ao isolado de BMYV-2 itb.

Considerados em conjunto, estes resultados indicam uma melhor proteção contra BMYV quando o transgene contém o intrão de beterraba. A indução de PTC4S por meio de uma construção em gancho parece assim ser uma boa fonte de resistência contra uma infeção virai e, em particular, contra BMYV. A partir dos exemplos acima, parece que a resistência hpPO(u) derivada de patogénio hpPO(u) de acordo com a invenção é altamente eficiente.

As construções de hpPO da invenção induziram com êxito resistência à planta derivada de patogénio. Todas as construções hpPO testadas induziram uma degradação de ARM genómíco através de PTGS, que resultou em plantas resistentes a BMYV.

Exemplo 5

Os inventores testaram a eficiência de outras estratégias utilizando a construção hpCP compreendendo o gene que codifica a proteína cápside do genoma BMYV e a sequência distai 3' (hpRT + construção MC do gene BMYV que codifica a proteína RT seguida pela extremidade de não codificação do ARM BMYV virai). Os inventores descobriram inesperadamente que estas duas construções adicionais fGram ineficazes para a indução de uma resistência virai numa planta.

LISTA DE SEQUÊNCIAS

<110> SES <120> Construções em gancho PO e utilização

<13 0 > BPSESS00 9BWO <16 0 > 18 <170> PatentIn versão 3.3 <210> 1 <211> 659

< 212 > ADN <213> Vírus do amarelecimento suave da beterraba < 2 2 0 > <221> gene <222> (1) . . (659)

<22.3 > UTR 5 ’ de BMYV e PO <220> <221> UTR 5' <222> (1) . . (30) < 2 2 0 > <221> CDS <222> (31) . . (657) < 4 Q 0 > 1 caaaagaaac cagcgaggat ctagcagtct atg caa ttt cag ctt aaa aca aac 54

Met Gin Phe Gin Leu Lys Thr Asn I 5 agt ttc act tgt teg ttg aac ega ccg eta aca get aca gag ega gtt 102

Ser Phe Thr Cys Ser Leu Asn Arg Pro Leu Thr Ala Thr Glu Arg Val 10 15 20 tta aac acc geg tat ttt ctt aeg aat cat tta ccg etc gta act ttt 150

Leu ash Thr Ala Tyr Phe Leu Thr ash his Leu Pro Leu val Thr Phe 25 30 35 40 gag aat gaa aac tgt att cgt tet ctt etc get get ctg cct ttg ctg 198

Glu Asn Glu Asn Cys lie Arcs Ser Leu Leu Ala Ala Leu Pro Leu Leu 45 " 50 55 etc agt aag cag etc gac ccc ggg age ttt att tac get ccc gqg aaa 246

Leu ser Lys Gin Leu Asp Pro Gly Ser Phe lie Tyr Ala Pro Gly Lys 60 65 70 ege cag tet tta ega ctg gee agg ttc tac aat tac tgc gga gee gtg 294

Arg Gin Ser Leu Arg Leu Ala Arg Phe Tyr Asn Tyr Cys Gly Ala Val 75 80 ' 85 tta ccc age act ege aac att gac tta ega gtg ccc ccc aga aaa gac 342

Leu Pro Ser Thr Arq Asn lie Asp Leu Arg Val Pro Pro Arq Lvs Asp 90 ‘ 95 100 riHK-?· aaa sna +-^-+1 rar nrr j-nta aa+· +*i~a fine an a n a fr* nnrt nan

VJ U UUU VI %j) U C Ί- U U VI W V. V U V.VJVÍ. I.VU "W* y V. UVJW yvil·· T— V Vf y VJ y yv«-yj V „· W val Lvs Arg Phe Tyr Leu Ala Arg Asn ser Gly Arg Asp Leu gIv Glu 105 ' 1.1.0 115 ' .1.20 agg eta caa ege ege aga gaa att ttc tet ege ggt gaa gca gag ttt 438

Arg Leu Gin Arg Arg Arg Glu lie Phe Ser Arg Gly Glu Ala Glu Phe 125 130 135 aaa aag ttc ctt tea gta tgg tgt get gaa age gag aga aag eta egg 486

Lys Lys Phe Leu Ser Val Trp Cys Ala Glu Ser Glu Arg Lys Leu Arg

140 145 ISO gag agt cct aaa ate gat att aga atg gac cat att att atg gtc tta 534

Glu ser Pro Lys lie Asp lie Arg Met Asp His lie lie Met val Leu 155 160 165 ege gat atg gge act etc ttg eac cgt ccg gta ctt gtt gaa gaa eta 582

Arg Asp Met Gly Thr Leu Leu His Arg Leu val Leu val Glu Glu Leu 170 175 ' 180 tac cat aga aat act tat get gag etc get ttt tgc gtt cac cac ctt 630

Tyr His Arg Asn Thr Tyr Ala Glu Leu Ala Phe Cys Val His His Leu 185 190 195 200 ttt ggt gaa get cgt ggt atg gat ttt tg 659

Phe Gly Glu Ala Arg Gly Met Asp Phe 205 <210> 2 <211> 209

< 212 > PRT <213> Virus do amarelecimento suave da beterraba < 4 0 0 > 2

Met Gin Phe Gin Leu Lys Thr Asn Ser Phe Thr Cys Ser Leu Asn Arg 1 5 10 15

Pro Leu Thr Ala Thr Glu Arg Val Leu Asn Thr Ala Tyr Phe Leu Thr 20 25 30

Asn His Leu Pro Leu Val Thr Phe Glu Asn Glu Asn Cys lie Arg Ser 35 40 45

Leu Leu Ala Ala Leu Pro Leu Leu Leu Ser Lys Gin Leu Asp Pro Gly 50 55 60

Ser Phe lie Tyr Ala Pro Gly Lys Arg Gin ser Leu Arg Leu Ala Arq 65 70 75 80'

Phe Tyr Asn Tyr cys Gly Ala val Leu Pro ser Thr Arg Asn lie Asp 85 90 95

Leu Arg Val Pro Pro Arg Lys Asp Val Lys Arg Phe Tyr Leu Ala Arq 100 105 110

Asn Ser Gly Arg Asp Leu Gly Glu Arg Leu Gin Arg Arq Arg Glu lie 115 120 125

Phe Ser Arg Gly Glu Ala Glu Phe Lys Lys Phe Leu Ser val Trp cys 130 135 ' 140

Ala Glu Ser Glu Arg Lys Leu Arg Glu Ser Pro Lys lie Asp lie Arg 145 ISO 155 160

Met Asp His lie lie Met val Leu Arg Asp Met Gly Thr Leu Leu His 165 170 175

Arg Leu val Leu val Glu Glu Leu Tyr His Arg Asn Thr Tyr Ala Glu 180 185 190

Leu Ala Phe Cys Val His His Leu Phe Gly Glu Ala Arg Gly Met Asp 195 200 205

Phe < 210 > 3 <211> 659

< 212 > ADN <213> Virus do amarelecimento suave da beterraba < 2 2 Ο > <221> misc_feature < 2 2 2 > (1) . . (659)

<223> Antisense PO&amp;S'UTR <400> 3 caaaaatcca taccacgagc ttcaccaaaa aggtggtgaa cgcaaaaagc gagctcagca 60 taagtatttc tatggtatag ttcttcaaca agtaccagac ggtgcaagag agtgcccata 120

tcgcgtaaga ccataataat atggtccatt ctaatatcga ttttaggact ctcccgtagc ISO tttctctcgc tttcagcaca ccatactgaa aggaactttt taaactctgc ttcaccgcga 240 gagaaaattt ctctgcggcg ttgtagcctc tcccccagat ctctgcctga atttcgggca 300 aggtaaaatc ttttaacgtc ttttctgggg ggcactcgta agtcaatgtt gcgagtgctg 360 ggtaacacgg ctccgcagta attgtagaac ctggccagtc gtaaagactg gcgtttcccg 420 ggagcgtaaa taaagctccc ggggtcgagc tgcttactga gcagcaaagg cagagcagcg 480 agaagagaac gaatacagtt ttcattctca aaagttacga gcggtaaatg attcgtaaga 540 aaatacgcgg tgtttaaaac tcgctctgta gctgttagcg gtcggttcaa cgaacaagtg 600 aaactgtttg ttttaagctg aaattgcata gactgctaga tcctcgctgg tttcttttg 659 < 210 > 4 <211> 5722

<212> ADN <213> Virus do amarelecimento suave da beterraba <220> <221> misc__feature <222> (1) . . (5722)

<223> Genoma BMYV < 4 0 0 > 4 acaaaagaaa ccagcgagga tctagcagtc tatgcaattt cagcttaaaa caaacagttt 60 cacttgttcg ttgaaccgac cgctaacagc tacagagcga gttttaaaca ccgcgtattt 120 tcttacgaat catttaccgc tcgtaacttt tgagaatgaa aactgtattc gttctcttct ISO cgctgctctg cctttgctgc tcagtaagca gctcgacccc gggagcttca tttacactcc 240 cgggaaacgc cagtctttac gactggccag gttctacaat tactgcggag ccgtgttacc 300 cagcactcgc aacattgact tacgagtgcc ccccagaaaa gacgttaaaa gattttacct 360 tgcccgaaat tcaggcagag atctggggga gaggctacaa cgccgcagag aaattttctc 420 tcgcggtgaa gcagagttta aaaagttcct ttcagtatgg tgtgctgaaa gcgagagaaa 480 gctacgggag agtcctaaaa tcgatattag aatggaccat attattatgg tcttacgcga 540 tatgggcact ctcttgcacc gtctggtact tgttgaagaa ctataceata gaaatactta 600 tgctgagctc gctttttgcg ttcaccacct ttttggtgaa gctcgtggta tggatttttg 560 gcggttggct aacttccctg gtaaatggtt tatttgctct cacgaaatgt attttgaaaa 720 ctctttcatc cagaaagagc tacgtttgtg agcgatctgt aaaaggtttt ctcaccttta 780 ccatcaaaca aagcccgccg cgtaattgca ttcttcaaat acaacacgca gacggttccc 840 atgccggtta tgcaacatgc gtaaccttat txgacgggac aaacggattg ttgactgcgc 900 aacatgtagt tgacgatttt tacgaaggag acccgagaaa gactctaaaa gtcgtctcca 960 cccgcaatgg aaacaaaatc ccccttgatg aattcagagt gacgtacaca tctgagaaaa 1020 gggatcagtt gttgatgcat gggcccccaa actgggaagg agttcttgcc tgcaaggcag 1080 ttcacatgat tccggcatcg agtgttgcaa aatcgaaagc aactttcttt gctctgtcgg 1140 atggtgaatg gcattcctct aatgccgagc tcgttggcac atccaagtgc ggaaaattca 1200 tttctgtact cagtgacaca aagagtggtc attcgggcac tccctatttc aatggtaaga 1260 gtgttcttgg agttcacata ggctctccga aagaatttga gtcggaaaat gttaactaca 1320 tgtctcctat accacgtttt cctggattaa cc&amp;gcccgaa ctacatattt gaaaccacag 1380 cccttgctgg aaaatttttc agccaagagg aagtcgaaga gctaatggaa gacttctctc 1440 tccaagagat ttattctata gcgacggcac gtgggaagta cataaaatat gaggcttgtc 1500 caggtgaaga gacattccat gatgtgctaa cagagtcctc cccgatgcag ggggaaggaa 1560 gggcggctcc gaccgccgga acaaccggaa acgcaagcac ccacgagaga tccgcaggaa 1620 atggaaaaag ccctcgtgct gctccttcta caccgcggga acccttggtg aaaacigcac 1680 cgcaagccac gtacattgta cctcaaaaga ggaatatgac gaatggccga gaigctggtg 1740 ccaaattgca ggccacgact gccactaccg atcaaatctc agagataaag aaggctctga 1800 tagacaaaat ggatttgaaa tcgatcgaga gacaagtggt agagacacta tcgtcgatgg 1860 ccatgaagaa gccccgctca agagggcgga gaagatccaa gaacaagcaa aacaatttgg 1920 acgcttcttc aaaacccagt accactggga aagagccgca gaggtctgcc ccggtttcat 1980 caaagtcggt gagctcccca agttttactt ctctaaacaa aaaggatgct cggattgggg 2040 cacgaagctc accagcctcc acccagaatt ggaggagaaa acccgaggct tcgggtggcc 2100 caagttcggg ccagcggcgg aactgaaatc cttgcggcta caagccgcaa gatggctega 2160 acgcgcegag caagttaaaa tcccttcaac tgaggaaagg gagcgcgtcg tgaggaaatg 2220 tgtggaagca ttctcgccca ctcaaacacg aggtcccatg gccacgagag gaaacaaact 2280 gtcttggaac aatttccttg aagattttaa aacggcagtt ttctctctcg agctcgaagc 2340 cggcgtaggc gtcccgtatg ttgcttacgg tcgacgcacg cacagaggct ggattgaaga 2400 tccagatctg ttgccggttt tagctcgttt caccttcgat cgattacaga agttatcgga 2460 ggtgaaattt gagcatatga gccctgaaca attggttcag gaaggtctgt gtgacccaat 2520 acggttattc gtaaaaggcg agccacacaa acaatccaaa cttgatgaag gacgctaccg 2580 cctcatcatg agtgtctcat tggttgatca actggtagcc cgggttctgt ttcaaaatca 2640 gaacaagcgc gagatcgcgc tttggagggc gattcccixa aaacccggat tcggattgtc 2700 cacagacgga caagtcgtcg attteatgca agcattatcg gcgcaggtgg gagtgaacac 2760 tgctgaatta ctccaaaatt ggaaatccca ccttattcct acagattgct ctggttttga 2820 ctggagcgtt tcggactggc ttctagagga tgaaatggaa gtccggaaca ggctcacgtt 2880 ggacataaat gatctaacca ggcgtctgcg agctggatgg cttaaatgcc tcgcaaatag 2940 tgttctctgt ctatcagatg gaacattgct ctcgcagcaa gtgcctggtg tacaaaagag 3000 tggcagctac aacacctcct egtctaactc tagaattcga gtgatggccg cttaccactc 3060 cggagcctcc tgggccatcg ccatgggtga tgatgccctt gaatctgtag atgcagacct 3120 aagtcgatac tcatccttag gcttcaaagt cgaggtttct tcacaactgg aattctgctc 3180 tcacattttt gaggaggaga acctcgccgt tccggtaaac aaagctaaaa tgctttataa 3240 attgatacat ggttatgaac cggaatgtgg caaccttgaa gttctgacga actatcttgc 3300 agcttgtttc tcaattttaa acgagctgag atccgatcaa gaactcgttg cctccctcta 3360 tcagtggctg gtccttccag tgcagccaca aaagatataa cgagggacaa tataaacagc 3420 cgggtaaaca tcagttgcaa acgccggaag tttaaagtct gattacataa caagccaaaa 3480 tagatttcaa gtttttagca ggattttcaa gtggtctatg tcagcaatac ctgtaacggt 3540 agttggcttg tatttcgtct accttaagat ttctcaccac gtcagatcaa ttgttaatga 3600 atacggtcgt gggtaggaga acgatcaatg gaagaagacg accacgtagg caaacacgac 3660 gcgctcagcg ctctcagcca gtggttgtgg tccaagcctc tcggacaaca caacgccgac 3720 ctagacgacg acgaagaggc aacaaccgga caagaagaac tgtttctacc agaggaacag 3780 gttcgagcga gacattcgtt ttctcaaaag acaatctcgc gggaagEtce agcggagcaa 3840 tcacgttcgg gccgagtcta tcagactgcc cggcattcgc tgatggaatg ctcaaggcct 3900 accatgagta taaaatctca atggtcattt tggagttcgt ctccgaggcc tcttcccaaa 3960 attccggttc catcgcttac gagctggacc cacactgtaa actcagtgcc etttcateaa 4020 ccattaacaa gttcgggatc acaaaacccg gcaggagggc atttgcagcg tcttacatca 4080) acggggcgga ctggcatgac gttgccaagg accaattcag gatcctctac aaaggcaatg 4140 gttcttcatc gatagctggt tcttttagaa tcaccatgaa gtgccagttc cacaatccga 4200 aataggtaga caaggaaccc ggccctagcc cagggccttc tccctctcca caacccacac 4260 cctcaaagaa atatcgtttt atcgtctata ctggtgtccc tgtgacccgt ataatggccc 4320 aatccactga tgacgccatc tctctgtacg acatgccttc ccaacggttt cgctacatag 4380 aagacgagaa tatgaactgg acaaacctcg attctcgatg gtattcccag aattctttga 4440 aagccattec aatgataata gtaccagtcc cteaaggtga gtggactgtg gaaatttcga 4500 tggaggggta tcaaccaacc tcaagcacca cagatcctaa taaggacaaa caagatggtc 4560 ttattgcata taatgatgac ctcaaggagg gttggaatgt aggggtttat aacaatgtgg 4620 agataaccaa caataaggct gataacactt tgaagtacgg ccatccagac atggagctca 4680 atagttgtca ttttaatcaa ggacaatgtt tggaaagaga tggagatttg acttgtcacg 4740 ttaaaacaac tggtgacaat gcctccttct ttgttgttgg tcccgctgtc cagaagcaat 4800 ccaaatacaa ttatgccgtt tcatacggag cctggacaga tcggatgatg gagataggga 4860 tgatagccat agcacttgat gaacaaggct catccggttc cgcaaagata gaaagaccaa 4920 agagagtcgg gcactccatg gcagtctcaa cctgggagac tataaactta ccggagaagg 4980 aaaactccgg tgaattcaaa accgatcaaa gacaagatct caaaactcct cccacatctg 5040 gtgggagttc cgatatgccg gatatcgttc aaggaggctt accccttccc attgaagaag 5100 acattcctga tttcatcagg gatgaccctt ggtccaacat accggccaag acttcgcggg 5160 aagacgaggc tgcgtcatca aagagtggtt ttaaacccca attgaagcct cctggcttgc 5220 caaagccaca accggtcaga acgatccgaa acttcgatcc agaacctgac ttggttgagg 5280 catggcgacc tgacgtgaac cccggatatt ccaaggaaga cgtggcagcg gccactgtta 5340 tgtacggggg ttccgttaat gaaggccggt ctatgattga caagcgtgat aaagctgtgt 5400 tagacggccg caagagttgg ggttcttcct tggcgtcctc cttgacggga ggcacgctta 5460 aggcctctgc aaagtcagag aagcttgcca aactcacttc gagtgaaagg gcgcagttca 5520 aacgaattaa gcgccagcaa ggtgccacac gagcttcaga atttttagaa caacttctgg 5580 ctggcacaaa ccctgaccca aggtcctgat gaacctttcc caatcatcac agtcaagccc 5640 gtgactttaa acgcggaacg actccgaaag gataggcaac gagtgtttta cgctgggata 5700 actccctacg gcacttcggt gt 5722 < 210 > 5 <211> 397

< 212 > ADN <213> Vírus da veia amarela necrótica da beterraba <220> <221> misc_feature < 2 2 2 > (1) . . (397) <223> P15 mutante (sense) < 4 0 0 > 5 ggtgcttgtg gttaaagtag atttatctaa tattgtattg tacatagttg ccggttgtgt 60 tgttgtcagt atgttgtact caccgttttt cagcaacgat gttaaagcgt ccagctatgc 120 gggagcaatt tttaagggga gcggctgtat catggccgcg aattcgtttg ctcaatttgg 180 gagttgcgat attccaaagc atgtagccga gtccatcact aaggttgcca ccaaagagca 240 cgatgttgac ataatggtaa aaaggggtga agtgaccgtt cgtgttgtga ctctcaccga 300 aactattttt ataatattat ctagattgtt tggtttggcg gtgtttttgt tcatgatatg 360 tttaatgtct atagtttggt tttggtatca tagataa 397 < 210 > 6 <211> 397

< 212 > ADN <213> Vírus da veia amarela necrótica da beterraba <220> <221> misc feature < 2 2 2 > (1).,(397) <223> BNYW P15 mutante (antisense) < 4 0 0 > 6 ttatctatga taccaaaacc aaactataga cattaaacat atcatgaaca aaaacaccgc 60 caaaccaaac aatctagata atattataaa aatagtttcg gtgagagtca caacacgaac 120 ggtcacttca ccccttttta ccattatgtc aacatcgtgc tctttggtgg caaccttagt 180 gatggaclcg gctacatgct ttggaatatc gcaactccca aattgagcaa acgaattcgc 240 ggccatgata cagccgctcc ccttaaaaat tgctcccgca tagctggacg ctttaacatc 300 gttgctgaaa aacggtgagt acaacatact gacaacaaca caaccggcaa ctatgtacaa 360 tacaatatta gataaatcta ctttaaccac aagcacc 397 <210> 7 < 211> 1056

< 212 > ADN

< 213 > BMYV e BNYW < 2 2 0 > <221> misc feature <222> (1) . . (1056) <223> PO PI5 sense < 4 0 0 > 7 ggtgcttgtg gttaaagtag atttatctaa tattgtattg tacatagtta ccggitgtgt 60 tgttgtcagt atgttgtact caccgttttt cagcaacgat gttaaagcgt ccagctatgc 120

gggagcaatt tttaagggga gcggctgtat catggccgcg aattcgtttg ctcaatttgg ISO gagttgcgat attccaaagc atgtagccga gtccatcact aaggttgcca ccaaagagca 240 cgatgttgac ataatggtaa aaaggggtga agtgaccgtt cgtgttgtga ctctcaccga 300 aactattttt ataatattat ctagattgtt tggtttggcg gtgtttttgt tcatgatatg 360 tttaatgtct atagtttggt tttggtatca tagataacaa aagaaaccag cgaggatcta 420 gcagtctatg caatttcagc ttaaaacaaa cagtttcact tgttcgttga accgaccgct 4S0 aacagctaca gagcgagttt taaacaccgc gtattttctt acgaatcatt taccgctcgt S40 aacttttgag aatgaaaact gtattcgttc tcttctcgct gctctgcctt tgctgctcag 600 taagcagctc gaccccggga gctttattta cgctcccggg aaacgccagt ctttacgact 660 ggccaggttc tacaattact gcggagccgt gttacccagc actcgcaaca ttgacttacg 720 agtgcccccc agaaaagacg ttaaaagatt ttaccttgcc cgaaattcag gcagagatct 780 gggggagagg ctacaacgcc gcagagaaat tttctctcgc ggtgaagcag agtttaaaaa 840 gttcctttca gtatggtgtg ctgaaagcga gagaaagcta cgggagagtc ctaaaatcga 900 tattagaatg gaccatatta ttalggtctt acgcgatatg ggcactctct tgcaccgtct 960 ggtacttgtt gaagaactat accatagaaa tacttatgct gagctcgctt tttgcgttca 1020 ccaccttttt ggtgaagctc gtggtatgga tttttg 10S6 <210> 8 < 211> 1056

< 212 > ADN

< 213 > BMYV e BNYW < 2 2 0 > <221> misc feature <222> (1) . . (1056) <223> PO P15 antisense < 4 0 0 > 8 caaaaatcca taccacgagc ttcaccaaaa aggtggtgaa cgcaaaaagc gagctcagca 60 taagtatttc tatggtatag ttcttcaaca agtaccagac ggtgcaagag agtgcccata 120 tcgcgtaaga ccataataat atggtccatt ctaatatcga ttttaggact ctcccgtagc 180 tttctctcgc tttcagcaca ccatactgaa aggaactttt taaactctgc ttcaccgcga 240 gagaaaattt ctctgcggcg ttgtagcctc tcccccagat ctctgcctga atttcgggca 300 aggtaaaatc ttttaacgtc ttttctgggg ggcactcgta agtcaatgtt gcgagtgctg 360 ggtaacacgg ctccgcagta attgtagaac ctggccagtc gtaaagactg gcgtttcccg 420 ggagcgtaaa taaagctccc ggggtcgagc tgcttactga gcagcaaagg cagagcagcg 480 agaagagaac gaatacagtt ttcattctca aaagttacga gcggtaaatg attcgtaaga 540 aaatacgcgg tgtttaaaac tcgctctgta gctgttagcg gtcggttcaa cgaacaagtg 600 aaactgtttg ttttaagctg aaattgcata gactgctaga tcctcgctgg tttcttttgt 660 tatctatgat accaaaacca aactatagac attaaacata tcatgaacaa aaacaccgcc 720 aaaccaaaca atctagataa tattataaaa atagtttcgg tgagagtcac aacacgaacg 780 gtcacttcac ccctttttac cattatgtca acatcgtget etttggtggc aaccttagtg 840 atggactcgg ctacatgctt tggaatatcg caactcccaa attgagcaaa cgaattcgcg 900 gccatgatac agccgctccc cttaaaaatt gctcccgcat agctggacgc tttaacatcg 960 ttgctgaaaa acggtgagta caacatactg acaacaacac aaccggcaac tatgtacaat 1020 acaatattag ataaatctac tttaaccaca agcacc 1056 < 210 > 9 < 211> 1058

< 212 > ADN < 213 > BMYV e BNYW <220> <221> misc_feature <223> P0 PI5 sense < 4 0 0 > 9 caaaagaaac cagcgaggat ctagcagtct aigcaatttc agcttaaaac aaacagtttc 60 acttgttcgt tgaaccgacc gctaacagct acagagcgag ttttaaacac cgcgtatttt 120 cttacgaatc atttaccgct cgtaactttt gagaatgaaa actgtattcg ttctcttctc 180 gctgctctgc ctttgctgct cagtaagcag ctcgaccccg ggagctttat ttacgctccc 240 gggaaacgcc agtctttacg actggccagg ttctacaatt actgcggagc cgtgttaccc 300 agcactcgca acattgactt acgagtgccc cccagaaaag acgttaaaag attttacctt 360 gcccgaaatt caggcagaga tctgggggag aggctacaac gccgcagaga aattttctct 420 cgcggtgaag cagagtttaa aaagttcctt tcagtatggt gtgctgaaag cgagagaaag 480 ctacgggaga gtcctaaaat cgatattaga atggaccata ttattatggt cttacgcgat S40 atgggcactc tcttgcaccg tctggtactt gttgaagaac tataccatag aaatacttat 600 gctgagctcg ctttttgcgt tcaccacctt tttggtgaag ctcgtggtat ggatttttga 660 tggtgcttgt ggttaaagta gatttatcta atattgtatt gtacatagtt gccggttgtg 720 ttgttgtcag tatgttgtac tcaccgtttt tcagcaacga tgttaaagcg tccagctatg 780 cgggagcaat ttttaagggg agcggctgta tcatggccgc gaattcgttt gctcaatttg 840 ggagttgcga tattccaaag catgtagccg agtccatcac taaggttgcc accaaagagc 000 acgatgttga cataatggta aaaaggggtg aagtgaccgt tcgtgttgtg actctcaccg 960 aaactatttt tataatatta tctagattgt ttggtttggc ggtgtttttg ttcatgatat 1020 gtttaatgtc tatagtttgg ttttggtatc atagataa 1058 < 210 > 10 < 211> 1572

< 212 > ADN

< 213 > BMYV e BNYW <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1572) <223> PO P15 antisense < 4 0 0 > 10 ggtgcttgtg gttaaagtag atttatctaa tattgtattg tacatagttg ccggttgtgt 60 tgttgtcagt atgttgtact caccgttttt cagcaacgat gttaaagcgt ccagctatgc 120 gggagcaatt tttaagggga gcggctgtat catggccgcg aattcgtttg ctcaatttgg 180 gagttgcgat attccaaagc atgtagccga gtccatcact aaggttgcca ccaaagagca. 240 cgatgttgac ataatggtaa aaaggggtga agtgaccgtt cgtgttgtga ctctcaccga 300 aactattttt ataatattat ctagattgtt tggtttggcg gtgtttttgt tcatgatatg 360 tttaatgtct atagtttggt tttggtatca tagataacct aggaaattta aattaaatcc 420 tggttttata tgtactactg ttgtagctga aatttaggtc ttcttgctga atttatttct 480 gtttcgtttt cactgttatt caggggatcc taggttatct atgataccaa aaccaaacta 540 tagacattaa acatatcatg aacaaaaaca ccgccaaacc aaacaatcta gataatatta 600 taaaaatagt ttcggtgaga gtcacaacac gaacggtcac ttcacccctt tttaccatta 660 tgtcaacatc gtgctctttg gtggcaacct tagtgatgga ctcggctaca tgctttggaa 720 tatcgcaact cccaaattga gcaaacgaat tcgcggccat gatacagccg ctccccttaa 780 aaattgctcc cgcatagctg gacgctttaa calcgttgct gaaaaacggt gagtacaaca 840 tactgacaac aacacaaccg gcaactatgt acaatacaat attagataaa tctactttaa 900 ccacaagcac catcaaaaat ceataccacg agcttcaeca aaaaggtggt gaacgcaaaa 960 agcgagctca gcataagtat ttctatggta tagttcttca acaagtacca gacggtgcaa 1020 gagagtgccc atatcgcgta agaecataat aatatggtcc attctaatat cgattttagg 1080 actctcccgt agctttctct cgctttcagc acaccatact gaaaggaact ttttaaactc 1140 tgcttcaccg cgagagaaaa tttctctgcg gegttgtagc ctctccccca gatctctgcc 1200 tgaatttcgg gcaaggtaaa atcttttaac gtcttttctg gggggcactc gtaagtcaat 1260 gttgcgagtg ctgggtaaca cggctccgca gtaattgtag aacctggcca gtcgtaaaga 1320 ctggcgtttc ccgggagcgt aaataaagct cccggggtcg agctgcttac tgagcagcaa 1380 aggcagagca gcgagaagag aacgaataca gttttcattc tcaaaagtta cgagcggtaa 1440 atgattcgca agaaaatacg cggtgtttaa aactcgctct gtagctgtta gcggtcggtt 1500 caacgaacaa gtgaaactgt ttgttttaag ctgaaattgc atagactgct agatcctcgc 1560 tggtttcttt tg 1572

< 210 > 11 <211> 1351 <212> AMD < 213 > Pet uni a sp. < 2 2 0 > <221> misc_feature <222> (1) . . (1351) <223> Intrão de petunia < 4 Ο Ο > 11 gtgtaagaat ttcttatgtt acattattac attcaacgtt ttatcttaat tggctcttca 60 tttgattgaa atttgacaat tatttcttgt tttttttttt gtcacactct ttttgggttg 120 gggtggccga cgaattgtgg gaaggtagaa agaggggagg acttttgtta tactccatta 180 gtaattactg tttccgtttc aatttatgtg acaatatttc ctttttagtc ggttccaaaa 240 gaaaatgtca gcattataaa caatttaatt ttgaaattac aattttgcca ttaataaaat 300 gatttacaac cacaaaagta tctatgagcc tgtttgggtg ggcttataag cagcttattt 360 taagtggctt ataagtcaaa aagtgacant ttttgagaag ttagaaaatc ctaacttctc 420 aaaaagtagc ttttaagcea cttatgactt ataagtccaa aaatttttaa gttaccaaac 480 atatattaat gggtttataa gcttataagc cactttlaag ctcacccaaa cgggttctat S40 gtctcacttt agactacaaa ttttaaaagt cttcatttat ttcttaatct ccgtggcgag 600 trsaaactata acacataaag tgaaacggag ggaataagat ggagtcataa actaatccaa 660 atctatactc tctccgttaa tttgtttttt agtttgattt ggtacattaa taaaacagat 720 ttttcgaagg ttataaacac agacagatgt ttcccagcga gctagcaaaa ttccaagatt 780 tctgtcgaaa attcgtgtgt ttctagctag tacttgatgt tatctttaac cttttagtaa 840 ttttttgtcc ttttctttct atttttcatc ttacaatgaa ttatgagcaa gttccttaag 900 tagcatcaca cgtgagatgt tttttatgat attgactaaa tccaatcttt accattcctt 960 aactagtaaa atacaacaca tgttaattga tacattgctt aacactgagg ttagaaaatt 1020 ttagaaatta gttgtccaaa tgctttgaaa ttagaaatct ttaatccctt attttttttt 1080 aaaatgtttt ttctcactcc aaagaaagag aaactgacat gaaagctcaa aagatcatga 1140 atcttactaa ctttgtggaa ctaaatgtac atcagaatgt ttctgacatg tgaaaatgaa 1200 agctcttaat tttcttcttt tatttattga gggtttttgc atgctargca ttcaatttga 1260 gtactttaaa gcacctataa acacttactt acacttgcct tggagtttat gttttagtgt 1320 tttcttcaca tcttttttgg tcaatttgca g 1351 < 210 > 12 < 211> 91

< 212 > AND <213> Beta vulgaris <220> <221> misc feature < 2 2 2 > (1).,(91) <223> Intrão de beterraba < 4 0 0 > 12 taaatcctgg ttttatatgt actactgttg tagctgaaat ttaggtcttc ttgctgaatt 60 tatttctgtt tcgttttcac tgttattcag g 91 < 210 > 13 <211> 2701

<212> ADN <213> Sequência artifi c i cil < 2 2 0 > <223> PO em gancho < 2 2 0 > <221> misc feature <222 > (1064) , . (1064) <223> n corresponde a a, c, g ou t < 2 2 0 > <221> misc_feature <222> (1277) . . (1277) <223> n corresponde a a, c, g ou t < 4 0 0 > 13 caaaagaaac cagcgaggat ctagcagtct atgcaatttc agcttaaaac aaacagtttc 60 acttgttcgt tgaaccgacc gctaacagct acagagcgag ttttaaacac cgcgtatttt 120 cttacgaatc atttaccgct cgtaactttt gagaatgaaa actgtattcg ttctcttctc 180 gctgctctgc ctttgctgct cagtaagcag ctcgaccccg ggagctttat ttacgctccc 240 gggaaacgcc agtctttacg actggccagg ttctacaatt actgcggage cgtgttaecc 300 agcactcgca acattgactt acgagtgccc cccagaaaag acgttaaaag attttacctt 360 gcccgaaatt caggcagaga tctgggggag aggctacaac gccgcagaga aattttctct 420 cgcggtgaag cagagtttaa aaagttcctt tcagtatggt gtgctgaaag cgagagaaag 480 ctacgggaga gtcctaaaat cgatattaga atggaccata ttattatggt cttacgcgat 540 atgggcactc tcttgcaccg tctggtactt gttgaagaac tataccatag aaatacttat 600 gctgagctcg ctttttgcgt tcaccacctt tttggtgaag ctcgtggtat ggatttttgc 660 ctaggaaatt taaatgtgfa agaatttctt atgttacatt attacattca acgttttatc 720 ttaattggct cttcatttga ttgaaatttg acaattattt cttgtttttt tttttgtcac 780 actctttttg ggttggggtg gccgacgaat tgtgggaagg tagaaagagg ggaggacttt 840 tgttatactc cattagtaat tactgtttcc gtttcaattt atgtgacaat atttcctttt 900 tagtcggttc caaaagaaaa tgtcagcatt ataaacaatt taattttgaa attacaattt 960 tgccattaat aaaatgattt acaatcacaa aagtatctat gagcctgttt gggtgggctt 1020 ataagcagct tattttaagt ggcttataag tcaaaaagtg acantttttg agaagttaga 1080 aaatcctaac ttctcaaaaa gtagctttta agccacttat gacttataag tccaaaaatt 1140 tttaagttac caaacatata ttaatgggtt tataagctta taagccactt ttaagctcac 1200 ccaaacgggt tctatgtctc actttagact acaaatttta aaagtcttca tttatttctt 1260 aatctccgtg gcgagtnaaa ctataacaca taaagtgaaa cggagggaat aagacggagt 1320 cataaactaa tccaaatcta tactctctcc gttaatttgt tttttagttt gatttggtac 1380 attaataaaa cagatttttc gaaggttata aacacagaca gatgtttccc agcgagctag 1440 caaaattcca agatttctgt cgaaaattcg tgtgtttcta gctagtactt gatgttatct 1500 ttaacctttt agtaattttt tgtccttttc tttctatttt tcatcttaca atgaattatg 1560 agcaagttcc ttaagtagca tcacacgtga gatgtttttt atgatattga ctaaatccaa 1620 tctttaccat tccttaacta gtaaaataca acacatgtta attgatacat tgcttaacac 1680 tgaggttaga aaattttaga aattagttgt ccaaatgctt tgaaattaga aatctttaat 1740 cccttatttt tttttaaaat gttttttctc actccaaaga aagagaaact gacatgaaag 1800 ctcaaaagat catgaatctt actaactttg tggaactaaa tgtacatcag aatgtttctg I860 acatgtgaaa atgaaagctc ttaattttct tcttttattt attgagggtt tttgcatgct 1920 atgcattcaa tttgagtact ttaaagcacc tataaaeaet tacttacact tgecttggag 1980 tttatgtttt agtgttttct tcacatcttt tttggtcaat ttgcaggtat ttggatccta 2040 ggcaaaaatc cataccacga gcttcaccaa aaaggtggtg aacgcaaaaa gcgagctcag 2100 cataagfatt tctatggtat agttcttcaa caagtaccag acggtgcaag agagtgccca 2160 tatcgcgtaa gaccataata atatggtcca ttctaatatc gattttagga ctctcccgta 2220 gctttctctc gctttcagca caccatactg aaaggaactt tttaaactct gcttcaccgc 2280 gagagaaaat ttctctgcgg cgttgtagcc tctcccccag atctctgcct gaatttcggg 2340 caaggtaaaa tcttttaacg tcttttctgg ggggcactcg taagtcaatg ttgcgagtgc 2400 tgggtaacac ggctccgcag taattgtaga acctggccag tcgtaaagac tggcgtttcc 2460 cgggagcgta aataaagctc ccggggtcga gctgcttact gagcagcaaa ggcagagcag 2520 cgagaagaga acgaatacag ttttcattct caaaagttac gagcggtaaa tgattcgtaa 2580 gaaaatacgc ggtgtttaaa actcgctctg tagctgttag cggtcggttc aacgaacaag 2640 tgaaactgtt tgttttaagc tgaaattgca tagactgcta gatcctcgct ggtttctttt 2700 g 2701 < 210 > 14 < 211> 1435

< 212 > ADN <213> Sequência artificial <220> <223> PO em gancho (intrão de beterraba) < 2 2 0 > <221> misc__feature < 2 2 2 > (1)..(1435) <223> PO em gancho (intrão de beterraba) <400> 14 caaaagaaac cagcgaggat ctagcagtct atgcaatttc agcttaaaac aaacagtttc 60 acttgttcgt tgaaccgacc gctaacagct acagagcgag ttttaaacac cgcgtatttt 120 cttacgaatc atttaccgct cgtaactttt gagaatgaaa actgtattcg ttctcttctc 180 gctgctctgc ctttgctgct cagtaagcag ctcgaccccg ggagctttat ttacgctccc 240 gggaaacgcc agtctttacg actggccagg ttctacaatt actgcggagc cgtgttaccc 300 agcactcgca acattgactt acgagtgccc cccagaaaag acgttaaaag attttacctt 360 gcccgaaatt caggcagaga tctgggggag aggctacaac gccgcagaga aattttctct 420 cgcggtgaag cagagtttaa aaagttcctt tcagtatggt gtgctgaaag cgagagaaag 480 ctacgggaga gtcctaaaat cgatattaga atggaccata ttattatggt cttacgcgat 540 atgggcactc tcttgcaccg tctggtactt gttgaagaac tataccatag aaatacttat 600 gctgagctcg ctttttgcgt tcaccacctt tttggtgaag ctcgtggtat ggatttttgc 660 ctaggaaatt taaattaaat cctggtttta tatgtactac tgttgtagct gaaatttagg 720 tcttcttgct gaatttattt ctgtttcgtt ttcactgtta ttcaggggat cctaggcaaa 780 aatccatacc acgagcttca ccaaaaaggt ggtgaacgca aaaagcgagc tcagcataag 840 tatttctatg gtatagttct tcaacaagta ccagacggtg caagagagtg cccatatcgc 900 gtaagaccat aataatatgg tccattctaa tatcgatttt aggactctcc cgtagctttc 960 tctcgctttc agcacaccat actgaaagga actttttaaa ctctgcttca ccgcgagaga 1020 aaatttctct gcggcgttgt agcctctccc ccagatctct gcctgaattt cgggcaaggt 1080 aaaatctttt aacgtctttt ctggggggca ctcgtaagtc aatgttgcga gtgctgggta 1140 acacggctcc gcagtaattg tagaacctgg ccagtcgtaa agactggcgt ttcccgggag 1200 cgtaaataaa gctcccgggg tcgagctgct tactgagcag caaaggcaga gcagcgagaa 1260 gagaacgaat acagttttca ttctcaaaag ttacgagcgg taaatgattc gtaagaaaat 1320 acgcggtgtt taaaactcgc tctgtagctg ttagcggtcg gttcaacgaa caagtgaaac 1380 tgtttgtttt aagctgaaat tgcatagact gctagatcct cgctggtttc ttttg 1435 < 210 > 15 <211> 2229

< 212 > ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> P0 PI5 em gancho < 4 0 0 > 15 ggtgcttgtg gttaaagtag atttatctaa tattgtattg tacatagttg ccggttgtgt 60 tgttgtcagt atgttgtact caccgttttt cagcaacgat gttaaagcgt ccagctatgc 120 gggagcaatt tttaagggga gcggctgtat catggccgcg aattcgtttg ctcaatttgg ISO gagttgcgat attccaaagc atgtagccga gtccatcact aaggttgcca ccaaagagca 240 cgatgttgac ataatggtaa aaaggggtga agtgaccgtt cgtgttgtga ctctcaccga 300 aactattttt ataatattat ctagattgtt tggtttggcg gtgtttttgt tcatgatatg 360 tttaatgtct atagtttggt tttggtatca tagataacaa aagaaaccag cgaggatcta 420 gcagtctatg caatttcagc ttaaaacaaa cagtttcact tgttcgttga accgaccgct 480 aacagctaca gagcgagttt taaacaccgc gtattttctt acgaatcatt taccgctcgt S40 aacttttgag aatgaaaact gtattcgttc tcttctcgct gctctgcctt tgctgctcag 600 taagcagctc gaccccggga gctttattta cgctcccggg aaacgccagt ctttacgact 660 ggccaggttc tacaattact gcggagccgt gttacccagc actcgcaaca ttgacttacg 720 agtgcccccc agaaaagacg ttaaaagatt ttaccttgcc cgaaattcag gcagagatct 780 gggggagagg ctacaacgcc gcagagaaat tttctctcgc ggtgaagcag agtttaaaaa 840 gttcctttca gtatggtgtg ctgaaagcga gagaaagcta cgggagagtc ctaaaatcga 900 tattagaatg gaccatatta ttatggtctt acgcgatatg ggcactctct tgcaccgtct 960 ggtacttgtt gaagaactat accatagaaa tacttatgct gagctcgctt tttgcgttca 1020 ccaccttttt ggtgaagctc gtggtatgga tttttgccta ggaaatttaa attaaatcct 1080 ggttttatat gtactactgt tgtagctgaa atttaggtct tcttgctgaa tttatttctg 1140 tttcgttttc actgttattc aggggatcct aggcaaaaat ccataccacg agcttcacca 1200 aaaaggtggt gaacgcaaaa agcgagctca gcataagtat ttctatggta tagttcttca 1260 acaagtacca gacggtgcaa gagagtgccc atatcgcgta agaccataat aatatggtcc 1320 attctaatat cgattttagg actctcccgt agctttctct cgctttcagc acaccatact 1380 gaaaggaact ttttaaactc tgcttcaccg cgagagaaaa tttctctgcg gcgttgtagc 1440 ctctccccca gatctctgcc tgaatttcgg gcaaggtaaa atcttttaac gtcttttctg 1500 gggggcactc gtaagtcaat gttgcgagtg ctgggtaaca cggctccgca gtaattgtag 1560 aacctggcca gtcgtaaaga ctggcgtttc ccgggagcgt aaataaagct cccggggtcg 1620 agctgcttac tgagcagcaa aggcagagca gcgagaagag aacgaataca gttttcatte 1680 tcaaaagtta cgagcggtaa atgattcgta agaaaatacg cggtgtttaa aactcgctct 1740 gtagctgtta gcggtcggtt caacgaacaa gtgaaactgt ttgttttaag ctgaaattgc 1800 atagactgct agatcctcgc tggtttcttt igttatctat gataccaaaa ccaaactata 1860 gacattaaac atatcatgaa caaaaacacc gccaaaccaa acaatctaga taatattata 1920 aaaatagttt cggtgagagt cacaacacga acggtcactt cacccctttt taccattatg 1980 tcaacatcgt gctctttggt ggcaacctta gtgatggact cggctacatg ctttggaata 2040 tcgcaactcc caaattgagc aaacgaattc gcggccatga tacagccgct ccccttaaaa 2100 attgctcccg catagctgga cgctttaaca tcgttgctga aaaacggtga gtacaacata 2160 ctgacaacaa cacaaccggc aactatgtac aatacaatat tagataaatc tactttaacc 2220 acaagcacc 2229 < 210 > 16 <211> 2233

< 212 > ADN <213> Sequência artificial <220> <223> PI5 PO em gancho < 4 0 0 > 16 caaaagaaac cagcgaggat ctagcagtct atgcaatttc agcttaaaac aaacagtttc 60 acttgttcgt tgaaccgacc gctaacagct acagagcgag ttttaaacac cgcgtatttt 120 cttacgaatc atttaccgct cgtaactttt gagaatgaaa actgtattcg ttctcttctc 180 gctgctctgc ct.tt.gctgct. cagtaagcag ctcgaccccg ggagctttat ttacgctccc 240 gggaaacgcc agtctttacg actggccagg ttctacaatt actgcggagc cgtgttaccc 300 agcactcgca acattgactt acgagtgccc cccagaaaag acgttaaaag attttacctt 360 gcccgaaatt caggcagaga tctgggggag aggctacaac gccgcagaga aattttctct 420 cgcggtgaag cagagtttaa aaagttcctt tcagtatggt gtgctgaaag cgagagaaag 480 ctacgggaga gtcctaaaat cgatattaga atggaccata ttattatggt cttacgcgat 540 atgggcactc tcttgcaccg tctggtactt gttgaagaac tataccatag aaatacttat 600 gctgagctcg ctttttgcgt tcaccacctt tttggtgaag ctcgtggtat ggatttttga 660 tggtgcttgt ggttaaagta gatttatcta atattgtatt gtacatagtt gccggttgtg 720 ttgttgtcag tatgttgtac tcaecgtttt teageaaega tgttaaagcg tccagctatg 780 cgggagcaat ttttaagggg agcggctgta tcatggccgc gaattcgttt gctcaatttg 840 ggagttgcga tattccaaag catgtagccg agtccatcac taaggttgcc accaaagagc 900 acgatgttga cataatggta aaaaggggtg aagtgaccgt tcgtgttgtg actctcaccg 960 aaactatttt tataatatta tctagattgt ttggtttggc ggtgtttttg ttcatgatat 1020 gtttaatgtc tatagtttgg ttttggtatc atagataacc taggaaattt aaattaaatc 1080 ctggttttat atgtactact gttgtagctg aaatttaggt cttcttgctg aatttatttc 1140 tgtttcgttt tcactgttat tcaggggatc ctaggttatc tatgatacca aaaccaaact 1200 atagacatta aacatatcat gaacaaaaac accgccaaac caaacaatct agataatatt 1260 ataaaaatag tttcggtgag agtcacaaca egaacggtca cttcacccct ttttaccatt 1320 atgtcaacat cgtgctcttt ggtggcaacc ttagtgatgg actcggctac atgctttgga 1380 atatcgcaac tcccaaattg agcaaacgaa ttcgcggcca tgatacagcc gctcccctta 1440 aaaattgctc ccgcatagct ggacgcttta acatcgttgc tgaaaaacgg tgagtacaac 1500 atactgacaa caacacaacc ggcaactatg tacaatacaa tattagataa atctacttta 1560 accacaagca ccatcaaaaa tccataccac gagcttcacc aaaaaggtgg tgaacgcaaa 1620 aagcgagctc agcataagta tttctatggt atagttcttc aacaagtacc agacggtgca 1680 agagagtgcc catatcgcgt aagaccataa taatatggtc cattctaata tcgattttag 1740 gactctcccg tagctttctc tcgctttcag cacaccatac tgaaaggaac tttttaaact 1800 ctgcttcacc gcgagagaaa atttctctgc ggcgttgtag cctctccccc agatctctgc 1860 ctgaatttcg ggcaaggtaa aatcttttaa cgtcttttct ggggggcact cgtaagtcaa 1920 tgttgcgagt gctgggtaac acggctccgc agtaattgta gaacctggcc agtcgtaaag 1980 actggcgttt cccgggagcg taaataaagc tcccggggtc gagctgctta ctgagcagca 2040 aaggcagagc agcgagaaga gaacgaatac agttttcatt ctcaaaagtt acgagcggta 2100 aatgattcgt aagaaaatac gcggtgttta aaaetcgctc tgtagctgtt agcggtcggt 2160 tcaacgaaca agtgaaactg tttgttttaa gctgaaattg catagactgc tagatcctcg 2220 ctggtttctt ttg 2233 < 210 > 17 <211> 720

< 212 > ADN <213> Virus do amarelecimento suave da beterraba < 2 2 0 >

<221> CDS <222 > (1) . . (720)

<223> Proteína PO de BMYV < 4 0 0 > 17 atg caa ttt cag ctt aaa aca aac agt ttc act tgt teg ttg aac ega 48

Met Gin Phe Gin Leu Lys Thr Asn ser Phe Thr cys ser Leu Asn Arg 15 10 15 ccg eta aca get aca gag ega gtt tta aac acc geg tat ttt ctt aeg 96

Pro Leu Thr Ala Thr Glu Arg val Leu Asn Thr Ala Tyr Phe Leu Thr 20 25 30 aat cat tta ccg etc gta act ttt gag aat gaa aac tgt att cgt tet 144

Asn His Leu Pro Leu Val Thr Phe Glu Asn Glu Asn Cys lie Arcs Ser 35 40 45 ctt etc get get ctg cct ttg ctg etc agt aag cag etc gac ccc ggg 192

Leu Leu Ala Ala Leu Pro Leu Leu Leu Ser Lys Gin Leu Asp Pro Gly 50 55 60 age ttc att tac act ccc ggg aaa ege cag tet tta ega ctg gee agg 240

Ser Phe lie Tyr Thr Pro Gly Lys Arq Gin Ser Leu Arg Leu Ala Arg 65 70 ' 75 80 ttc tac aat tac tgc gga gee gtg tta ccc age act ege aac att gac 288

Phe Tyr Asn Tyr Cys Gly Ala Val Leu Pro Ser Thr Arg Asn lie Asp 85 90 95 tta ega gtg ccc ccc aga aaa gac gtt aaa aga ttt tac ctt gee ega 336

Leu Arg val Pro Pro Arg Lys Asp val Lys Arg Phe Tyr Leu Ala Arg 100 ‘ 105 110 aat tea ggc aga gat ctg ggg gag agg eta caa ege ege aga gaa att 384

Asn Ser Gly Arg Asp Leu Gly Glu Arg Leu Gin Arg Arg Arq Glu lie 115 120 125 ttc tet ege ggt gaa gca gag ttt aaa aag ttc ctt tea gta tgg tgt 432

Phe Ser Arq Gly Glu Ala Glu Phe Lys Lys Phe Leu ser val Trp cys 130 ‘ 135 140 get gaa age gag aga aag eta egg qag agt cct aaa ate gat att aga 480

Ala Glu Ser Glu Arg Lvs Leu Arg Glu Ser Pro Lys lie Asp lie Arg 145 .1.50 155 ' 160 atg gac cat att att atg gtc tta ege gat atg ggc act etc ttg cac 528

Met Asp His lie lie Met Val Leu Arg Asp Met Gly Thr Leu Leu His lb5 170 175 cgt ctg gta ctt gtt gaa gaa eta tac cat aga aat act tat get gag 576

Arg Leu Val Leu Val Glu Glu Leu Tvr His Arg Asn Thr Tyr Ala Glu 180 .1.85 190 etc get ttt tgc gtt cac cac ctt ttt ggt gaa get cgt ggt atg gat 624

Leu Ala Phe cys val His His Leu Phe Gly Glu Ala Arg Gly Met Asp 195 200 205 ttt tgg egg ttg get aac ttc cct ggt aaa tgg ttt att tgc tet cac 672

Phe Trp Arg Leu Ala Asn Phe Pro Gly Lys Trp Phe lie cys ser His 210 215 220 gaa atg tat ttt gaa aac tet ttc ate cag aaa gag eta cgt ttg tga 720

Glu Met Tyr Phe Glu Asn ser Phe lie Gin Lys Glu Leu Arg Leu 225 230 235

< 210 > 18 <211> 239 < 212 > PRT <213> Virus do amarelecimento suave da beterraba < 4 Ο Ο > 18

Met Gin Phe Gin Leu Lys Thr Asn ser Phe Thr cys Ser Leu Asn Arq 1 5 10 15

Pro Leu Thr Ala Thr Glu Arg val Leu Asn Thr Ala Tyr Phe Leu Thr 20 25 30

Asn His Leu Pro Leu val Thr Phe Glu Asn Glu Asn cys lie Arg ser 35 40 45

Leu Leu Ala Ala Leu Pro Leu Leu Leu Ser Lys Gin Leu Asp Pro Gly 50 55 60

Ser Phe lie Tyr Thr Pro Gly Lys Arg Gin ser Leu Arg Leu Ala Arq 65 70 75 80'

Phe Tyr Asn Tyr cys Gly Ala val Leu Pro Ser Thr Arg Asn lie Asp 85 90 95

Leu Arg val Pro Pro Arg Lys Asp val Lys Arg Phe Tyr Leu Ala Arg 100 105 ' 110

Asn Ser Gly Arg Asp Leu Gly Glu Arq Leu Gin Arg Arg Arg Glu lie 115 120 125

Phe Ser Arg Gly Glu Ala Glu Phe Lys Lys Phe Leu Ser Val Trp Cys 130 ' 135 140

Ala Glu Ser Glu Arq Lys Leu Arg Glu Ser Pro Lys lie Asp lie Arg 145 ~ 150 155 160

Met Asp His lie lie Met Val Leu Arg Asp Met Gly Thr Leu Leu His 165 170 ' 175

Arq Leu Val Leu Val Glu Glu Leu Tyr His Arq Asn Thr Tyr Ala Glu 180 185 ~ 190

Leu Ala Phe Cys Val His His Leu Phe Gly Glu Ala Arg Gly Met Asp 195 200 ' 205

Phe Trp Arq Leu Ala Asn Phe Pro Gly Lys Trp Phe lie Cys Ser His 210 ~ 215 ' 220

Glu Met Tyr Phe Glu Asn Ser Phe lie Gin Lys Glu Leu Arg Leu 225 230 235

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 9113159 A [0008] ® EP 1169463 BI [0008] ® WO 2007128755 A [0013]

Documentos de não patente citados na descrição • CARMEN SIMON-MATEO et al. Biochimica et Biophysica Acta, 2011, vol. 1809 (11-12), 722-731 [0014] ® A. K02L0WSKA-MAKULSKA et al. Journal of General Virology, 2010, vol. 91 (4), 1082-1091 [0015] • PU YAN et al. Journal of Virological Methods, 2010, vol. 166 (1-2), 101-105 [0016]

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Uma construção de ARN compreendendo uma sequência de segmentos sense e uma sequência de segmentos antisense tendo sequências deduzidas a partir do gene PO do genoma BMYV ou de um gene ortólogo, em que a referida sequência de segmentos sense e a referida sequência de segmento antisense compreendem ambas um fragmento de nucleótidos tendo a sequência que partilha pelo menos 85 % de identidade de sequência com o gene PO (SEQ.ID.NO:17) do genoma BMYV ou de um gene ortólogo.
2. 2. A construção de ARN de acordo com a reivindicação 1, em que a(s) sequência(s) de segmentos sense e/ou segmentos antisense compreende(m) ainda um fragmento de nucleótido tendo a(s) sequência(s) que partilha(m) pelG menos 85 % de identidade de sequência com a sequência não traduzida de extremidade 5' (UTR 5') adjacente â sequência de nucleótidos de gene PO do genoma BMYV.
3. 3. A construção de ARM de acordo com qualquer uma das anteriores reivindicações, em que as sequências de segmentos sense e segmentos antisense compreendem um fragmento de nucleótido tendo sequências que partilham pelo menos 85 % de identidade de sequência com o gene PO do genoma BMYV.
4. 4. A construção de ARM de acordo com a reivindicação 3, em que as sequências de segmentos sense e segmentos antisense compreendem ainda um fragmento de nucleótidos tendo sequências que partilham pelo menos 85 % de identidade de sequência com o gene PI do genoma BMYV.
5. 5. A construção de ARM de acordo com qualquer uma das anteriores reivindicações, em que o segmento sense compreende ou consiste na sequência SEQ.ID.NO:1 e/ou o segmento antisense compreende ou consiste na sequência SEQ. ID.NO:3.
6. 6. A construção de ARM de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que as sequências de segmentos sense e segmentos antisense compreendem ambas ainda um fragmento de nucleótido que partilha pelo menos 85 % de identidade de sequência com o genoma BNYW e preferencialmente em que o referido segmento sense compreende um fragmento de SEQ.ID.NO:5 e o referido segmento antisense compreende um fragmento de SEQ.ID.NO:6.
7. 7. A construção de acordo com qualquer uma das anteriores reivindicações, em que o(s) segmento(s) e o(s) fragmento(s) compreende(m) mais de 10 nucleótidos, preferencialmente entre 15 e 25 nucleótidos.
8. 8. Uma construção de ADN que pode ser transcrita na construção de ARN de acordo com qualquer uma das anteriores reivindicações 1 a 7.
9. 9. Um vetor compreendendo a sequência de nucleótidos da construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das anteriores reivindicações 1 a 8.
10. 10. Uma molécula de ARN autocomplementar bicatenãrio expressada através da construção de ADN de acordo com a reivindicação 8 ou o vetor de acordo com a reivindicação 9,
11. 11. Um método para a indução de tolerância ou resistência, preferencialmente resistência total, pelo menos ao vírus BMYV e possivelmente a outro vírus, numa planta ou numa célula de planta, o referido método compreendendo as etapas de: preparação da construção de ácido nucleico de acGrdo com qualquer uma das anteriores reivindicações 1 a 9, ligada de modo funcional a uma ou mais sequências reguladoras ativas na planta ou na célula de planta, e a transformação da célula de planta com a construção de ácido nucleico, induzindo assim a resistência pelo menos ao vírus BMYV na. planta ou na célula, de planta. 12. 0 método de acGrdo com a reivindicação 11, em que o outro vírus é selecionado a partir do grupo que consiste em Vírus do mosaico amarelo do nabo, Vírus do amarelo transmitido pelo pulgão da curcuma, Vírus do enrolamento da folha da batata. Vírus da folha amarela da cana-de-açúcar, Vírus do Mosaico da Enação da Ervilha, Vírus do amarelo da beterraba ocidental-E.U.A. , Vírus da clorose da beterraba, Vírus do nanismo amarelo do cereal e vírus BNYW, preferencialmente o vírus BNYW.
12. 13. Um método para. a indução de tolerância pelo menos ao vírus BMYV compreendendo a etapa de preparação de uma construção de ácido nucleico compreendendo um segmento sense e um segmento antisense deduzidos a. partir de uma sequência de nucleótidos BNYW7, sendo preferencialmente deduzidos a partir do gene que codifica a proteína P15 do referi do BNYW.
13. 14. Uma planta transgénica ou uma célula de planta transgénica tolerante ou resistente, de preferência totalmente resistente pelo menos ao vírus BMYV e possivelmente a um ou mais outros vírus e compreendendo uma construção de ácido nucleico capaz de expressar a sequência de nucleótidos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, preferencialmente a construção de ADN de acordo com a. reivindicação 8, ligada de modo funcional a urna ou mais sequências reguladoras ativas na planta ou na célula de planta, e/ou compreendendo um vetor de acordo com a reivindicação 9, e/ou compreendendo uma molécula de ARM autocomp.lement.ar bicatenário de acordo com a reivindicação 10 .
14. 15. A planta transgénica ou célula de planta transgénica de acordo com a reivindicação 14 selecionada a partir do grupo que consiste em alface, pepino, batata, cana-de-açúcar, ervilha, cevada e beterraba, sendo preferencialmente uma beterraba ou uma célula de beterraba.
15. 16. Um tecido de planta transgénica e/ou urna estrutura reproduzível derivados da célula de planta transgénica de acordo com as reivindicações 14 ou 15, em que o referido tecido é selecionado a partir do grupo que consiste em fruto, caule, raiz, tubérculo e semente, ou em que a referida estrutura reproduzível é selecionada a partir do grupo que consiste em calos, rebentos ou embriões.