ES2645076T3

ES2645076T3 - Adyuvante

Info

Publication number: ES2645076T3
Application number: ES13711463.3T
Authority: ES
Inventors: Sara HOWIE; Kenneth DONALDSON; Wan Seob Cho
Original assignee: University of Edinburgh
Current assignee: University of Edinburgh
Priority date: 2012-03-26
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2017-12-04
Anticipated expiration: 2033-03-15
Also published as: CL2014002578A1; KR20150013464A; AU2013239497A1; CA2868679A1; AU2013239497B2; EP2830656B1; GB201205237D0; JP2015511624A; CN104427998B; NZ701115A; CN104427998A; US20150150965A1; WO2013144562A1; NO2830656T3; EP2830656A1

Abstract

Un adyuvante que comprende nanopartículas de cobalto y/o nanopartículas de óxido de cobalto.

Description

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DESCRIPCION

Adyuvante

CAMPO DE LA INVENCION

[0001] La presente invencion proporciona adyuvantes innovadores para su uso en la modificacion, modulacion o aumento de respuestas inmunitarias en sujetos humanos o animales. La invencion proporciona ademas composiciones y vacunas que los comprenden.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

[0002] Se considera que las vacunas son la ultima herramienta inmunologica en la prevencion de enfermedades infecciosas al proporcionar una inmunidad protectora de larga duracion con una buena respuesta de anticuerpos [1;2]. El papel del adyuvante es mejorar la respuesta espedfica del sistema inmunitario ante una cantidad minima del antfgeno suministrado a traves de la activacion de celulas que presentan antigenos [3]. El adyuvante ideal no sena en sf mismo antigenico y estimulana respuestas inmunitarias mientras que no se induce la reaccion excesiva del sistema inmunitario que podna danar al paciente (tal como la induccion del exceso de inflamacion local, alergia o hipersensibilidad retardada).

[0003] Debido a problemas de seguridad, los adyuvantes autorizados son muy limitados y el dolor y la inflamacion en las zonas de inyeccion son efectos secundarios comunes del uso de adyuvantes en vacunas clmicas. Los adyuvantes mas ampliamente utilizados en vacunas humanas contienen aluminio [4] tal como alumbre, una sal mineral, normalmente formada como Al(OH)3 o Al(PO)4. Los adyuvantes de alumbre son, por tanto, partmulas de oxido metalico.

[0004] En ratones, los adyuvantes que contienen aluminio inducen inmunidad humoral principalmente mediante la promocion de respuestas de tipo Th2 mientras se tiene una peor capacidad para simular anticuerpo dependiente de Th1. Los adyuvantes de este tipo no inducen normalmente fuertes respuestas inmunitarias mediadas por celulas especialmente respuestas de celulas T citotoxicas [4] aunque se ha observado que preparan respuestas citotoxicas CD8 en presencia de adyuvante lfpido adicional [5]. Por lo tanto, el adyuvante que contiene alumbre es adecuado para respuestas contra antigenos de protemas u organismos inactivados pero no es optimo para inducir respuestas ante patogenos intracelulares [1-4].

[0005] Las nanopartmulas (NP) se han expandido hasta una amplia variedad de aplicaciones biomedicas debido a sus unicas propiedades fisicoqmmicas en comparacion con los productos qrnmicos a granel [6]. Por ejemplo, las NP presentan un area mayor y una alta afinidad de union a protemas mediante interaccion electrostatica [7]. Las NP tambien pueden penetrar profundamente en el tejido y mejorar la absorcion celular asf como eludir compartimientos lisosomicos [7-9]. Estas propiedades unicas han llevado a considerar las NP como potenciales adyuvantes [10;11]. El tamano de las NP parece afectar a la capacidad del adyuvante y se ha observado que unas NP mas pequenas producen mayores respuestas inmunitarias celulares y de anticuerpos [12]. Sin embargo, la mayona de los candidatos de NP para adyuvantes de vacunas son sustancias organicas [13].

[0006] En modelos murinos de asma, se observo que los nanotubos de carbono de capa multiple [14], las partmulas del humo diesel [15] y el negro de carbono ultrafino de tamano nanometrico [16] aumentaban los niveles sericos de IgE mediante un mecanismo similar al adyuvante. En comparacion con los datos recogidos con el uso de adyuvantes que contienen alumbre [17;18], el negro de carbono de tamano nanometrico presentaba un efecto de adyuvante similar con aumento de IgG1 e IgE [16].

[0007] Se ha demostrado que las NP de oxido de mquel (NiONP) y las NP de oxido de cobalto (Co3O4NP) son capaces de inducir respuestas de citocina asociadas a Th1 en los pulmones de ratas Wistar hembras [19].

[0008] Pusic Kae et al., (2011: Vaccine; vol. 29, n.° 48, p8898-8908) describe nanopartmulas CdSe/ZnS inorganicas para su uso como un sistema de distribucion de vacuna. US2011/123620 da a conocer nanopartmulas de vacuna de dioxido de silicio para la inmunoterapia de cancer. La presente invencion busca obviar uno o mas de los problemas asociados con la tecnica anterior y proporcionar adyuvantes adicionales adecuados para su uso con vacunas contra enfermedades en las que las respuestas inmunitarias mediadas por celulas son importantes para su prevencion o cura.

SUMARIO DE LA INVENCION

[0009] La presente invencion se basa en la identificacion de las propiedades de adyuvante de nanopartmulas inorganicas (metal/oxido de metal). El asunto de la invencion esta definido por las reivindicaciones. En un primer

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aspecto, la presente invencion proporciona un adyuvante que comprende nanopartfculas de cobalto y/o nanopartfculas de oxido de cobalto.

[0010] En una forma de realizacion, el adyuvante puede no comprender alumbre.

[0011] De forma ventajosa, los adyuvantes de la presente invencion pueden comprender uno o mas tipos de nanopartfculas de metal. Por ejemplo, los adyuvantes descritos en el presente documento pueden comprender cocteles o mezclas de diferentes tipos de nanopartfcula inorganica (oxido de metal). En una forma de realizacion, los adyuvantes descritos en el presente documento pueden comprender ademas una cantidad de un adyuvante con base de alumbre.

[0012] Como tal, una forma de realizacion de la presente invencion proporciona un adyuvante que comprende, consiste o consiste fundamentalmente en nanopartfculas de cobalto y/o nanopartfculas de oxido de cobalto.

[0013] El adyuvante de la presente invencion puede comprender, consistir o consistir fundamentalmente en nanopartfculas de cobalto. En una forma de realizacion, las nanopartfculas de cobalto comprenden oxido de cobalto. Las nanopartfculas de oxido de cobalto adecuadas para su uso como adyuvantes de la presente invencion pueden comprender, por ejemplo, nanopartfculas de oxido (Co3O4) de cobalto (11,111).

[0014] En vista de lo anterior, la presente invencion proporciona un adyuvante que comprende, consiste o consiste fundamentalmente en nanopartfculas de cobalto y/o de oxido (Co3O4) de cobalto (II,III).

[0015] Un experto en la tecnica entendera que existen otras formas de oxido de cobalto y que estas pueden tener una aplicacion similar como adyuvantes, por consiguiente, los adyuvantes descritos en el presente documento pueden comprender ademas o pueden consistir o consisten fundamentalmente en oxido cobaltoso (oxido de cobalto (II): CoO) y/o oxido cobaltico (oxido de cobalto (III): Co2O3).

[0016] Los inventores han descubierto que los adyuvantes que comprenden nanopartfculas inorganicas, especialmente aquellos que comprenden nanopartfculas de metal tal como nanopartfculas de cobalto, inducen una respuesta de tipo Thl y Th2 equilibrada cuando se administra in vivo. A diferencia de otros adyuvantes, incluidos, por ejemplo, aquellos que comprenden alumbre, que inducen unicamente una respuesta Th1 o Th2. Un experto en la tecnica entendera que aunque las respuestas Th1 son eficaces a la hora de ayudar a la eliminacion de patogenos intracelulares, la mayona de adyuvantes provocan respuestas Th2 que son mas eficaces para la eliminacion de patogenos extracelulares. Como tal, los adyuvantes de nanopartfculas inorganicas o de cobalto de la presente invencion pueden utilizarse con una amplia variedad de vacunas y son espedficamente adecuados para su uso con vacunas contra enfermedades en las que las respuestas inmunitarias mediadas por celulas y/o humorales son importantes para su prevencion o cura.

[0017] Ademas, los inventores han observado que a diferencia de los adyuvantes con base de alumbre (que comprenden principalmente o consisten en alumbre microparticulado, es decir, partfculas de alumbre de entre 0,1pm y 100pm), los adyuvantes de nanopartfculas inorganicas (con base de cobalto) de la presente invencion inducen respuestas inmunitarias que comprenden mucho menos del isotipo de inmunoglobulina IgE «alergico». Esto es importante ya que reduce las reacciones de hipersensibilidad tras la administracion de adyuvante.

[0018] Como ventaja adicional, los inventores han descubierto que los adyuvantes con base de nanopartfculas inorganicas, tal como, por ejemplo, los adyuvantes de nanopartfculas de cobalto descritos en el presente documento, inducen menos inflamacion tanto en la zona de sensibilizacion como de estimulacion. Esto presenta la ventaja de reducir la dolorosa hinchazon que puede ocurrir normalmente tras la administracion de un adyuvante como alumbre.

[0019] En vista de lo anterior, y sin pretender cenirse a la teona, como consecuencia de la induccion de respuestas inmunitarias TH1 y tH2 equilibradas, la reducida toxicidad en comparacion con los adyuvantes con base de alumbre y la relativa falta de efectos secundarios alergicos, las nanopartfculas inorganicas (por ejemplo, nanopartfculas de metal que comprenden cobalto y/o oxido de cobalto (espedficamente Co3O4)) representan adyuvantes versatiles adecuados para utilizarse con vacunas donde tanto una respuesta Th1 o Th2 o ambas respuestas Th1 y Th2 son necesarias para eliminar patogenos.

[0020] El termino nanopartfcula incluye partfculas que presentan entre aproximadamente 1 nm y aproximadamente 100 nm de diametro. Por ejemplo, las nanopartfculas pueden ser aproximadamente (o tener un diametro medio de) 1 nm, 5 nm, 10 nm, 15 nm, 20 nm, 25 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm , 95 nm o 99 nm. En una forma de realizacion, las nanopartfculas de una composicion de adyuvante proporcionada por la presente invencion pueden presentar un diametro medio de aproximadamente 15 nm, 16 nm, 17 nm, 18 nm, 19 nm o 20 nm. Cuando la nanopartfcula comprenda cobalto, pueden presentar un diametro

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(o un diametro medio) de aproximadamente 17 nm 17,5 nm, 18 nm, 18,1 nm, 18,2 nm, 18,3 nm, 18,4 nm, 18,5 nm, 18,6 nm, 18,7 nm, 18,8 nm, 18,9 nm, 19 nm, 19,5 nm or 20 nm.

[0021] En una forma de realizacion, las nanopartfculas de cobalto de los adyuvantes descritos en el presente documento (incluidas nanopartfculas de oxido de cobalto (11,111)) presentan un diametro medio de aproximadamente 18,4 ± 5,0 nm.

[0022] Tambien se ha descrito en el presente documento el uso de nanopartfculas de metal inorganicas (incluidos cobalto/dioxido de cobalto) descritas en el presente documento como adyuvantes.

[0023] En un segundo aspecto, la invencion proporciona nanopartfculas de cobalto inorganicas y/o nanopartfculas de oxido de cobalto para su uso como adyuvantes. A modo de ejemplo, la invencion puede proporcionar nanopartfculas de Co3O4 y nanopartfculas de Co3O4 para su uso como adyuvantes.

[0024] En un tercer aspecto, los adyuvantes proporcionados por la presente invencion puede presentarse como composiciones. En una forma de realizacion, una composicion de adyuvante de la presente invencion puede comprender uno o mas componentes elegidos del grupo consistente en:

(i) nanopartfculas de cobalto y/o nanopartfculas de oxido de cobalto;

(ii) componentes de adyuvante adicionales (por ejemplo, un adyuvante con base de alumbre); y

(iii) un excipiente, solvente, portador o diluyente farmaceutica o fisiologicamente aceptable.

[0025] Entre los excipientes adecuados se puede incluir, por ejemplo, aceite, y un experto en la tecnica entendera que el termino «aceite» puede incluir alcanos, alquenos, alquinos, y sus correspondientes acidos y alcoholes, eteres y esteres de los mismos, y mezclas de los mismos. Los compuestos individuales del aceite son compuestos de hidrocarburos ligeros, es decir, tales componentes presentan de 6 a 30 atomos de carbono. El aceite puede prepararse de forma sintetica o purificarse a partir de productos derivados del petroleo. El «aceite» puede presentar una estructura de cadena lineal o ramificada. Puede estar completamente saturado o presentar uno o mas enlaces dobles o triples. Algunos aceites no metabolizables para su uso en la presente invencion incluyen aceite mineral, aceite de parafina y cicloparafinas, por ejemplo.

[0026] Tambien se pretende que el termino aceite incluya «aceite mineral ligero», es decir, aceite que se obtiene de forma similar mediante destilacion de petrolato, pero que presenta una densidad relativa ligeramente inferior a la del aceite mineral blanco. Otro «aceite» para su uso como excipiente puede incluir aceites metabolizables (no toxicos). Los aceites de este tipo pueden incluir, por ejemplo, aceites vegetales, aceites de pescado, aceites animales o aceites preparados de forma sintetica que pueden ser metabolizados por el cuerpo del sujeto (humano o animal) al que se le administrara el adyuvante y que no son toxicos. Entre las fuentes de aceites vegetales se incluyen nueces, semillas y granos.

[0027] Un experto en la tecnica entendera que cualquiera de los excipientes de aceite descritos en el presente documento pueden proporcionarse como formas de emulsion de aceite en agua, agua en aceite o agua en aceite en agua.

[0028] Una emulsion de aceite en agua proporcionada por la presente invencion esta compuesta de una formula AMPHIGEN(R). Esta formula comprende un componente acuoso, lecitina, aceite mineral y tensoactivos. Entre las patentes que describen los componentes de la formula se incluyen US 5.084.269 y US 6.572.861.

[0029] Normalmente, el componente de aceite de la presente invencion esta presente con una cantidad desde 1 % hasta 50 % en volumen; o con una cantidad desde 10 % y 45 %; o con una cantidad desde 20 % a 40 %.

[0030] Otros componentes de las composiciones de adyuvante descritas en el presente documento pueden incluir excipientes farmaceuticamente aceptables, tales como portadores, solventes y diluyentes, agentes isotonicos, agentes amortiguadores, estabilizadores, conservantes, agentes vasoconstrictores, agentes antibacterianos, agentes antifungicos y similares. Entre los portadores, solventes y diluyentes tfpicos se incluyen agua, soluciones salinas, dextrosa, etanol, glicerina, aceite y similares. Agentes isotonicos representativos incluyen cloruro sodico, dextrosa, manitol, sorbitol, lactosa y similares. Entre los estabilizadores se incluye gelatina, albumina y similares.

[0031] Los tensoactivos se utilizan para ayudar en la estabilizacion de la emulsion seleccionada para que actue como el portador para el adyuvante y el antfgeno. Entre los tensoactivos adecuados para utilizarse en la presente invencion se incluyen tensoactivos naturales compatibles biologicamente y tensoactivos sinteticos no naturales. Entre los tensoactivos biologicamente compatibles se incluyen compuestos de fosfolfpidos o una mezcla de fosfolfpidos. Los fosfolfpidos preferidos son fosfatidilcolinas (lecitina), tal como lecitina de huevo o soja. La lecitina puede obtenerse como una mezcla de fosfatidos y trigliceridos mediante el lavado con agua de aceites

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vegetales crudos y la separacion y secado de las gomas hidratadas resultantes. Un producto refinado puede obtenerse mediante la fraccion de la mezcla en glucoKpidos y fosfoKpidos insolubles en acetona restantes tras la eliminacion de los trigliceridos y el aceite vegetal mediante el lavado por acetona. De forma alternativa, la lecitina puede obtenerse a partir de diversas fuentes comerciales. Otros fosfolfpidos adecuados incluyen fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, acido fosfatfdico, cardiolipina y fosfatidiletanolamina. Los fosfoUpidos pueden aislarse a partir de fuentes naturales o sintetizarse de forma convencional.

[0032] Entre los tensoactivos sinteticos no naturales adecuados para su uso en la presente invencion se incluyen tensoactivos no ionicos con base de sorbitan, p. ej., tensoactivos de sorbitan de acidos grasos sustituidos (disponibles comercialmente bajo el nombre sPan(R) o ARLACEL(R)), esteres de acido graso de sorbitol polietoxilado (TWEEN(R)), esteres de polietilenglicol de acidos grasos de fuentes tal como aceite de ricino (EMULFOR(R)); acido graso polietoxilado (p. ej., acido estearico disponible bajo el nombre SIMULSOL M-53(R)), polfmero formaldetndo/isoctilfenol polietoxilado (TYLOXAPOL(R)), eteres de alcohol graso polioxietileno (BRIJ(R)); eteres no fenilos de polioxietileno (TRItOn(R) N), polioxietileno isooctilo fenilo eteres (TRITON(R) X).

[0033] En general, el tensoactivo, o la combinacion de tensoactivos, si se utilizan dos o mas tensoactivos, esta presente en la emulsion con una cantidad de 0,01 % a 10 % en volumen, preferentemente, de 0,1 % a 6,0%, mas preferentemente de 0,2% a 5,0%.

[0034] En el presente documento, «un portador farmaceuticamente aceptable» incluye todos y cada uno de los solventes, medios de dispersion, revestimientos, adyuvantes, agentes estabilizadores, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos, agentes retardadores de la adsorcion y similares. El portador (o portadores) debena ser «aceptable» en el sentido de ser compatible con los demas componentes de las composiciones y no perjudicial para el sujeto. Normalmente, los portadores estaran esterilizados y libres de pirogenos y se elegiran segun el modo de administracion que haya de utilizarse. Los expertos en la tecnica saben que determinadas formulas de portadores farmaceuticamente aceptables comprenden aquellos portadores aprobados en la normativa aplicable promulgada por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos o la Administracion de Alimentos y Medicamentos estadounidense o agencia gubernamental equivalente en un pafs no perteneciente a Estados Unidos. Por lo tanto, el portador farmaceuticamente aceptado para la produccion comercial de las composiciones puede ser un portador que ya se ha aprobado o que sera aprobado por la correspondiente agencia gubernamental en Estados Unidos o en el pafs extranjero.

[0035] Las composiciones pueden incluir de forma opcional diluyentes solidos, semisolidos, lfquidos farmaceuticamente aceptables (es decir, esterilizados o no toxicos) que sirvan como medios, excipientes o vetnculos farmaceuticos. Entre los diluyentes se puede incluir agua, solucion salina, dextrosa, etanol, glicerina y similares. Entre los agentes isotonicos se puede incluir cloruro sodico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los estabilizadores incluyen albumina, entre otros.

[0036] Las composiciones tambien pueden contener antibioticos u otros conservantes, incluidos, por ejemplo, gentamicina, mertiolato o clorocresol. Las diferentes clases de antibioticos o conservantes a partir de los cuales se eligen son bien conocidos por los expertos en la tecnica.

[0037] En una forma de realizacion, las composiciones de adyuvante de la presente invencion pueden comprender uno o mas componentes de adyuvante adicionales. Por ejemplo, una composicion de adyuvante puede comprender, ademas de las nanopartfculas inorganicas (cobalto) descritas en el presente documento, uno o mas adyuvantes seleccionados del grupo que consiste en alumbre (que comprende hidroxido/fosfato de aluminio); adyuvantes con base de aceite y adyuvantes organicos (por ejemplo, escualeno).

[0038] En una forma de realizacion, el adyuvante y/o las composiciones de adyuvante descritos en el presente documento pueden proporcionarse en forma liofilizada o como composiciones liofilizadas. Un experto en la tecnica entendera que el adyuvante liofilizado/las composiciones de adyuvante liofilizadas de la presente invencion pueden reconstituirse utilizando cualquiera de los portadores/diluyentes y/o excipientes farmaceuticamente aceptables descritos en el presente documento.

[0039] De forma ventajosa, los adyuvantes y las composiciones de adyuvante descritos en el presente documento pueden comprender ademas uno o mas agentes conservadores, incluidos por ejemplo, un agente de criopreservacion.

[0040] Los adyuvantes se utilizan con frecuencia como componentes de las composiciones de vacuna, en concreto donde el antfgeno de la vacuna es poco inmunogenico. Un experto en la tecnica entendera que se pueden utilizar adyuvantes para cambiar, modular, modificar o aumentar los efectos de una vacuna de forma que estimule una respuesta inmunitaria adecuada o apropiada, una que ayude con la eliminacion de un patogeno de un huesped humano o animal. Como tal, en un aspecto adicional, la presente invencion se extiende a vacunas

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para su uso animal o humano, donde dichas vacunas comprenden o se formulan con un adyuvante descrito en el presente documento.

[0041] En una forma de realizacion adicional, la presente invencion proporciona los adyuvantes de la presente invencion (concretamente, adyuvantes con base de cobalto) para su uso en la mejora de respuestas inmunitarias en sujetos humanos o animales. En una forma de realizacion, los adyuvantes de la presente invencion se administran juntos o de manera simultanea con una vacuna. Normalmente, los adyuvantes se formulan junto con una vacuna para su administracion a un sujeto humano o animal. En otras formas de realizacion, los adyuvantes para su uso pueden formularse como composiciones independientes (junto con portadores, diluyentes y/o excipientes farmaceuticamente aceptables) para ser administradas a sujetos humanos o animales antes o despues de la administracion de una vacuna.

[0042] Un experto en la tecnica entendera que las referencias a "vacuna" en el presente documento pueden incluir cualquier preparacion de antigeno para su uso en la estimulacion de respuestas inmunitarias en huespedes humanos o animales. Actualmente se utilizan muchos tipos diferentes de vacunas y muchas de estas se formulan/combinan o administran (de forma simultanea o por separado) con adyuvantes para mejorar, aumentar o modificar la naturaleza de la respuesta inmunitaria provocada. En algunos casos, un adyuvante es explotado como un medio para mejorar una respuesta inmunitaria en un huesped humano o animal. Por ejemplo, se puede utilizar un adyuvante para mejorar la respuesta inmunitaria provocada por bajas (inferiores al nivel optimo) dosis de antigeno. En este sentido, un adyuvante/composicion de adyuvante de la presente invencion puede combinarse con dosis inferiores al nivel optimo de una vacuna o antigeno, sirviendo la vacuna o antfgeno para aumentar la respuesta inmunitaria provocada por la dosis inferior al nivel optimo. Cuando se administra de forma conjunta o con un adyuvante o composicion de adyuvante de la presente invencion, la respuesta inmunitaria provocada por una dosis de antigeno/vacuna inferior al nivel optimo, puede compararse con una respuesta inmunitaria provocada por la administracion de una dosis optima de la vacuna/antigeno de forma aislada (es decir, sin adyuvante).

[0043] En una forma de realizacion, las vacunas de antigenos bacterianos y/o virales pueden combinarse o administrarse (de forma simultanea o por separado) con los adyuvantes/composiciones de adyuvante descritos en el presente documento. Por ejemplo, las vacunas contra, por ejemplo, formas de «gripe», difteria, tosferina, sarampion, paperas, rubeola, polio, tuberculosis, meningitis, tetanos, fiebre amarilla, rabia pueden combinarse o administrarse con los adyuvantes descritos en el presente documento.

[0044] Tambien se describen en el presente documento (i) metodos para provocar respuestas inmunitarias y/o (ii) metodos para mejorar, modular o aumentar las respuestas inmunitarias en sujetos animales o humanos, comprendiendo dichos metodos la etapa de administrar una vacuna y un adyuvante proporcionado por el primer aspecto de la presente invencion a un sujeto humano o animal que lo necesite.

[0045] El adyuvante puede formularse con una vacuna de forma que se administre a un huesped humano o animal con la misma. De forma alternativa, el adyuvante puede formularse como una composicion separada de forma que pueda administrarse separado de la vacuna o de forma simultanea con la misma.

DESCRIPCION DETALLADA

[0046] A continuacion se describira la presente invencion en detalle haciendo referencia a las siguientes figuras que muestran:

Figura 1: La forma y tamano de Co3O4NP (A) y alumbre-I (B). Las partfculas se dispersaron en agua destilada y se midio mediante una microscopia electronica de transmision.

Figura 2: Citotoxicidad de NP o alumbre-I a celulas RAW264.7 Las partfculas (las concentraciones proporcionadas estaban en pg/ml) se anadieron a las celulas RAW264.7 durante 24 h con o sin un 1 % OVA. Se midieron los niveles de lactato deshidrogenasa (LDH) para determinar la citotoxicidad. Cabe destacar que alumbre-I mostro alrededor de 6 veces mas de citotoxicidad comparado con Co3O4NP y OVA aumento la toxicidad de las partfculas. Los datos son la media ± error estandar de la media (EEM) (n = 4 por grupo). Los datos de citoxicidad de partfculas tratadas con 1 % OVA o sin OVA se compararon con sus respectivos controles. ***P < 0,001.

Figura 3: Niveles IgG1 espedficos de OVA en suero 7 dfas despues de la segunda sensibilizacion subcutanea. Otras inmunoglobulinas (IgG2a, IgE, IgA e IgM) no mostraron aumentos (datos no mostrados). Los datos son la media ± EEM (n = 5 por grupo).

Figura 4: Niveles de inmunoglobulina espedficos de OVA presentes en suero 7 dfas despues de la estimulacion intraperitoneal con ovoalbumina. Las inmunoglobulinas se analizaron para detectar (A) IgG1, (B) IgG2a, (C) IgE, (D) IgA y (E) IgM. Los datos son la media ± EEM (datos representativos, n = 5 por grupo). (F) Proliferacion de celulas esplenicas 7 dfas despues de la estimulacion intraperitoneal con oVa. Incorporacion de 3H-timidina a celulas cultivadas con el medio unicamente o en presencia de 10pM OVA.

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Figura 5: Niveles IgG1 espedficos de OVA en fluido del lavado peritoneal 7 dfas despues de la estimulacion con ovoalbumina. Otras inmunoglobulinas (IgG2a, IgE, IgA e IgM) no mostraron aumentos (datos no mostrados). Los datos son la media ± EEM (n = 5 por grupo).

Figura 6: Los niveles de citocina en el fluido del lavado peritoneal extrafdo 7 dfas despues de la estimulacion. (a) IFN-y; (B) IL-1p. Los datos son la media ± EEM (n = 5 por grupo). P < 0,05 en comparacion con el grupo de tratamiento PBS.

Figura 7: Recuento diferencial de celulas del fluido del lavado peritoneal exfrafdo 7 dfas despues de la estimulacion. Los datos son la media ± EEM (n = 5 por grupo). P < 0,05, P < 0,01 y P < 0,001 en comparacion con grupo de tratamiento PBS.

Figura 8: Histologfa representativa de la zona de inyeccion 7 dfas despues de la estimulacion. A, PBS; B, NP-OVA; C, alumbre-I-OVA; D, solo NP. Cabe destacar que los grupos NP-OVA y solo NP mostraron una inflamacion moderada (flecha) junto con el deposito de Np (puntos negros) mientras que alumbre-I-OVA mostro inflamacion masiva y necrosis (flecha).

Figura 9: Grafico que muestra el numero de celulas dendnticas (DC por sus siglas en ingles) que expresan determinados marcadores.

Figura 10: Grafico que muestra la respuesta citotoxica a las nanopartfculas de oxido de cobalto.

Figura 11: Grafico que muestra la respuesta citotoxica al alumbre Imject.

Figura 12: Grafico que muestra la citotoxicidad de las DC en respuesta a NP de oxido de cobalto ±1 % OVA.

Figura 13: Grafico que muestra la citotoxicidad de las DC en respuesta a alumbre Imject ± 1% OVA.

Figura 14: Grafico que muestra la generacion de IL-1p por DC tratadas con NP de oxido de cobalto ±1% OVA.

Figura 15: Grafico que muestra la generacion de IL-1p por DC tratadas con alumbre Imject ± 1% OVA. Ejemplo 1

[0047] Ya que muy pocos adyuvantes son capaces de provocar una respuesta Th1, se penso que se podnan utilizar NP para mejorar la inmunidad Th1 contra un antfgeno modelo, ovoalbumina (OVA).

[0048] Seleccionamos Co3O4NP como un adyuvante candidato porque Co3O4NP produda una respuesta Th1 sin la grave patologfa de hipersensibilidad retardada vista con NiONP[19]. El objetivo era determinar si Co3O4NP podna ser adecuado para utilizarse como un adyuvante induciendo una respuesta Th1 y Th2 equilibrada al antfgeno modelo OVA proporcionado de forma subcutanea a los ratones hembra C57BL/6.

[0049] Para ello, comparamos las respuestas anti-OVA inducidas por Co3O4NP con aquellas inducidas por un adyuvante que contema aluminio disponible comercialmente. El adyuvante elegido fue alumbre Imject (alumbre- I), un adyuvante de metal particulado usado ampliamente para experimentos murinos, que contiene una mezcla 50/50 de hidroxido de aluminio e hidroxido de magnesio y estabilizadores inactivos. Ademas de las respuestas espedficas a ovoalbumina, tambien se evaluo la toxicidad en la zona de inyeccion y la citotoxicidad de celulas que presentan antfgenos se evaluo utilizando una lmea celular de macrofagos de raton.

METODOS Y MATERIALES

[0050] Todos los productos qmmicos y reactivos se adquirieron de Sigma-Aldrich (Poole, Reino Unido) a menos que se indique lo contrario.

Caracterizacion y dispersion de particulas.

[0051] El tamano de Co3O4NP (Nanostructural and Amorphous Materials, TX, EE. UU.) y del alumbre Imject (Thermo Scientific, Cramlington, RU) se midio mediante una microscopia electronica de transmision (JEM- 1200EX II, JEOL, Tokio, Japon). Los tamanos hidrodinamicos de partfculas se midieron mediante un analizador de tamano de particulas (90Plus/BI-MAS; Brookhaven Instruments Corporation, Nueva York, EE. UU.) en presencia de diferentes concentraciones de un medio de dispersion. Para el estudio in vivo, se utilizo ovoalbumina de huevo de gallina (grado V) como medio de dispersion para Co3O4NP + OVA (NP-OVA) y alumbre-I + OVA (alumbre-I-OVA) mientras que se utilizo suero inactivado por calor (concentracion final: 5 %) extrafdo de ratones C57BL/6 sanos para solo NP. Los niveles de endotoxina en las suspensiones de partfculas se midieron mediante un ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (Cambrex, MD, EE. UU.). La solubilidad de Co3O4NP y alumbre-I se midio en el fluido lisosomico artificial acido (pH 5.5) o fluido intersticial artificial basico (pH 7.4) de conformidad con el metodo descrito anteriormente[19].

Justificacion de la seleccion de las dosis.

[0052] Segun nuestro anterior estudio, elegimos la dosis de alumbre-I como 2,0 mg por raton[17]. Por el contrario, la dosis de Co3O4NP se eligio como 25 |jg por raton segun la capacidad de causar inflamacion en el

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pulmon; la instilacion de 419 pg/rata de C03O4NP mostro una inflamacion neutrofflica aguda e inflamacion neutrofflica/linfodtica con lipoproteinosis alveolar[19].

Ensayo de citotoxicidad (LDH)

[0053] Se cultivo la lmea celular de macrofagos de raton, RAW 264.7 a 37 °C con 5 % CO2 en medio de cultivo Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, por sus siglas en ingles) con L-glutamina, antibioticos (penicilina y estreptomicina) y 10% suero fetal bovino (SFB) inactivado por calor. Las celulas se separaron mediante la utilizacion de Accutase y clasificaron a 5 * 105 en placas de 12 pocillos (Corning, NY, EE. UU.) para los experimentos. Los efectos citotoxicos de las NP y el alumbre se midieron mediante el uso de un kit de ensayo de lactato deshidrogenasa (LDH) (Roche Applied Science, Sussex, RU) de conformidad con las instrucciones del manual. Como partfculas de referencia, se utilizaron NP de TO2 (30,5 ± 1,8 nm) (Nanostructural and Amorphous Materials, TX, EE. UU.) Se trataron las soluciones de alumbre-I o NP con o sin OVA (1 %) en las celulas RAW264.7 durante 24 h. Cada NP se analizo con concentraciones de 10, 30, 100 y 500 pg/ml mientras que el alumbre-I se sometio a concentraciones de 80, 240 y 800 pg/ml. Tras la incubacion, se centrifugaron los sobrenadantes de cultivo libres de celulas a 17000 * g durante 20 min para deshacerse de las partfculas. La citotoxicidad se calculo como porcentaje comparado con el control positivo (0,1% Triton-X).

Inmunizacion animal.

[0054] Se obtuvieron ratones C57BL/6 hembra de 6 semanas de Harlan Laboratories (Hillcrest, RU). Todos los animales fueron mantenidos y manipulados bajo una licencia espedfica concedida por el Ministerio del Interior de Reino Unido a uno de los autores (SEMH) que asegura el trato humano y la mitigacion del sufrimiento en todos los experimentos animales. Despues de 1 semana para aclimatarse, los ratones (5 ratones por grupo) fueron inmunizados dos veces con un intervalo de 2 semanas. Cada raton fue sensibilizado mediante inyeccion subcutanea en la base de cola con una dosis de 100 pl con 25 pl de PBS, 50 pl (100 pg) de ovoalbumina libre de endotoxinas (Worthington Biochemical Corporation, NJ, EE. UU.) y 25 pl de adyuvante (alumbre-I: 2,0 mg; Co3O4NP: 25 pg). Se utilizo PBS (100 pl) y Co3O4NP (25 pg en PbS con 5 % de suero de raton) para los controles negativos. A continuacion, se inyectaron 50 pg de OVA en 100 pl de PBS en el peritoneo como estimulacion. A los 7 dfas despues de la segunda sensibilizacion, se extrajo sangre de la vena de la cola. A los 7 dfas despues de la estimulacion, se extrajo sangre mediante puncion cardfaca y se llevo a cabo un lavado peritoneal tres veces utilizando 2 ml de solucion salina al 0,9 %. El primer fluido del lavado se mantuvo para el ELISA de citocinas e inmunoglobulinas, mientras que las celulas de los tres lavados agruparon para el recuento de celulas. La zona de inyeccion tambien se fijo con formalina tamponada neutral 10% para el analisis histologico. 2.5. ELISA de inmunoglobulina. Se extrajeron muestras de sangre 1 semana despues de la inmunizacion y 1 semana despues de la estimulacion se analizaron para detectar la presencia de inmunoglobulinas espedficas de OVA de IgA, IgE, IgG1, IgG2c (conocido anteriormente como IgG2ab) y suclases de IgM. Las muestras de lavado peritoneal y suero se diluyeron segun corresponda en PBS con 1% ASB. Los anticuerpos secundarios conjugados con biotina se diluyeron como se indica a continuacion: anti-IgA - 1:1000; anti-IgG1 - 1:8000; anti-IgG2c - 1:1000; anti-IgM - 1:1000; anti-IgE - 1:250. Antes de medir IgE, se incubo el suero durante una hora con perlas acopladas a protema-G para eliminar IgG [17;18].

ELISA de citocinas.

[0055] Con el fin de evaluar el perfil de las citocinas, se analizaron la citocina de tipo Th1 (IFN-y), las citocinas de tipo Th2 (IL-10 e IL-13) y la citocina proinflamatoria derivada de macrofagos en el lavado peritoneal. Todos los kits se adquirieron de R&D Systems (Abingdon, RU) y las citocinas se midieron de conformidad con las instrucciones del fabricante.

Recuento diferencial de celulas en lavado peritoneal.

[0056] El numero de celulas totales en el fluido de lavado se evaluo mediante un contador de nucleo celular (Chemometec, Surrey, RU). Las celulas se prepararon en portaobjetos para ponerlas en el Cytospin (Thermo Scientific, Cramlington, RU), fijadas con metanol y tenidas con Diff-Quik (Raymond Lamb, Eastbourne, RU). Se contaron alrededor de 300 - 500 celulas por portaobjetos bajo un microscopio optico segun su morfologfa.

Ensayo de proliferacion de linfocitos.

[0057] Se extrajo el bazo de los ratones y se realizaron suspensiones de celulas unicas pasandolas por filtros 40 pm. Las celulas se extendieron en capas en un medio de separacion de gradiente de densidad Lympholyte-M™ (Fisher Scientific, Loughborough, RU) y se giraron a 2000 * g durante 15 minutos para eliminar celulas muertas, eritrocitos y granulocitos. La capa de tejido mononuclear en la interfaz se extrajo mediante lavado y se volvio a suspender en medio de cultivo tisular (RPMI 1640 suplementado con 10% FCS, 100 U/ml penicilina, 100 pg/ml estreptomicina, 2 mM L-glutamina y 50 pM 2-ME; Sigma, RU). Se contaron las celulas viables y los cultivos

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triplicados con 4 * 105 celulas en 200 |jl con o sin 10 jM ovoalbumina libre de endotoxinas se colocaron en placas de 96 pocillos. Los cultivos se incubaron durante 48 horas y se anadio 0,5 jCi3-H-timidina a cada pocillo durante la noche. Se recogieron los cultivos y se incorporo timidina contados en un contador de centelleo Betaplate (Wallac UK, Milton Keynes, RU). Los sobrenadantes de cultivos paralelos no marcados se cultivaron a 72 h para el analisis de citocina.

Histologia.

[0058] Los tejidos fijados por formalina con parafina incluida de la zona de inyeccion se cortaron en secciones de 3 jm y se tineron con hematoxilina y eosina.

Analisis estadistico.

[0059] Se analizaron los datos con el Software GraphPad Prism (Version 5, GraphPad Software Inc., La Jolla, Ca, EE. UU.). Con el fin de comparar los grupos de tratamiento, se aplico el analisis unilateral de varianza con comparaciones por pares post hoc de Tukey. Se considero P < 0,05 estadfsticamente significativo.

RESULTADOS

Propiedades fisicoquimicas de partfculas.

[0060] Co3O4NP mostro formas esfericas y el tamano primario fue 18,4 ± 5,0 nm. Alumbre-I mostro formas mas heterogeneas y el tamano medio fue 88,7 ± 32,4 nm de longitud y 28.9 ± 19,7 nm de ancho (figura 1). Los niveles de endotoxina de ambas partfculas estaban por debajo del lfmite de deteccion (0,1 EU/ml). Co3O4NP mostro grandes aglomerados sin un medio de dispersion pero pequenos aglomerados con ovoalbumina como dispersante (tabla 1). Alumbre-I mostro pequenos aglomerados incluso sin medio de dispersion. La mayor parte del alumbre-I se disolvio en 3 dfas en fluido lisosomal artificial acido (pH 5.5), mientras que se disolvio mmimamente en el fluido intersticial artificial (pH 7.4) (datos no mostrados). Co3O4NP mostro una minima disolucion en ambas condiciones (datos no mostrados). 3.2. Citotoxicidad in vitro El alumbre-I fue de lejos el mas toxico de las NP analizadas en macrofagos de raton (figura 2). Cuando las partfculas se dispersaron con OVA, las partfculas fueron mas toxicas.

Tabla 1. Tamano hidrodinamico y polidispersidad de partfculas 24 h despues de la dispersion (media ± SD).

Dispersion: Co3O4NP Alumbre Imject

Tamano hidrodinamico: Polidispersidad Tamano hidrodinamico Polidispersidad

Solucion salina: 943,0 ± 251,1 0,15 ± 0,01 218,9 ± 119,2 0,23 ± 0,06

Ovoalbumina 0,1%: 90,3 ± 17,9 0,16 ± 0,02 241,2 ± 62,1 0,29 ± 0,03

Ovoalbumina 1%: 99,8 ± 32,6 0,20 ± 0,02 126,2 ± 36,9 0,19 ± 0,05

Inmunizacion in vivo

Niveles de inmunoglobulinas especificas de ovoalbumina en el suero despues de la sensibilizacion.

[0061] IgG1 fue la unica subclase de inmunoglobulina que se pudo medir en esta etapa. La figura 3 muestra que tanto alumbre-I-OVA como NP-OVA indujeron produccion de IgG1 aunque alumbre-I-OVA fue mas potente que NP-OVA. Los niveles de inmunoglobulinas espedficas de OVA inducidas por solo NP fueron similares a los del vetuculo de control (PBS).

Niveles de inmunoglobulinas espedficas de ovoalbumina en el suero despues de la estimulacion

[0062] Los niveles de inmunoglobulina tras la estimulacion demostraron una amplia variedad de respuestas. Tanto NP-OVA como alumbre-I-OVA produjeron aumentos en la respuesta IgG1 aunque de nuevo alumbre-I- OVA mostro mayores respuestas que NP-OVA (figura 4A). Los niveles de IgG1 tanto en los grupos NP-OVA como en alumbre-I-OVA mostraron un aumento notable cuando se compararon con aquellos tras la sensibilizacion. Ademas, NP-OVA aumento en los niveles IgG2c (figura 4B). Alumbre-I-OVA indujo mayores niveles IgE, IgM e IgA que NP-OVA (figuras 4C - 4E).

Proliferacion de esplenocitos tras la estimulacion.

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[0063] Las celulas esplenicas mononucleares fueron estimuladas in vitro con OVA 7 dfas despues de la estimulacion. La figura 4F muestra que los esplenocitos tanto de ratones estimulados con alumbre-I como con NP-OVA proliferaron.

Niveles de inmunoglobulinas especificas de ovoalbumina en el lavado peritoneal despues de la estimulacion.

[0064] Tanto NP-OVA como alumbre-I-OVA mostraron aumentos en los niveles de IgG1 (figura 5). Alumbre-I- OVA mostro niveles de IgG1 mayores comparado con NP-OVA. Se detectaron otras inmunoglobulinas (IgG2c, IgE, IgA, and IgM) unicamente en concentraciones muy bajas similares al grupo PBS (datos no mostrados).

Expresion de citocina en el fluido de lavado peritoneal.

[0065] El fluido del lavado peritoneal extrafdo de los ratones tambien se utilizo para medir la expresion de citocina. Los niveles de IFN-y se aumentaron de forma significativa mediante NP-OVA mientras que otros grupos no mostraron respuestas significativas (figura 6A). Los niveles de IL-1p se aumentaron de forma significativa mediante alumbre-I-OVA unicamente (figura 6B). IL-10 e IL-13 no mostraron cambios significativos en comparacion con los controles (datos no mostrados).

Recuento diferencial de celulas en lavado peritoneal.

[0066] El numero de linfocitos y celulas totales se aumento de forma significativa mediante NP-OVA y alumbre-I- OVA mientras que solo NP era comparable al vehuculo de control (figuras 7A y 7B). El numero de granulocitos se aumento de forma significativa unicamente mediante alumbre-I-OVA (figura 7C).

Inflamacion en la zona de inyeccion.

[0067] Las muestras histologicas tomadas de la zona de inyeccion 7 dfas despues de la estimulacion proporcionaron resultados llenos de contrastes entre las dos partfculas analizadas. El grupo de tratamiento alumbre-I-OVA mostro una inflamacion notable y necrosis sin deposito de partfculas obvio mientras que el grupo NP-OVA y solo NP mostro inflamacion minima con deposito de partfculas alrededor (figura 8).

Ejemplo 2

Objetivos

[0068]

• Determinar la toxicidad de las nanopartfculas de oxido de cobalto y alumbre-I ante celulas dendnticas derivadas de PBMC mediante el analisis de citotoxicidad de lactato deshidrogenasa.

• Determinar la dosis requerida para inducir una buena respuesta de citocina de IL-1p, IL-10 e IL-12 sin inducir toxicidad en las celulas.

• Tratar las celulas dendnticas derivadas de PBMC bovino con las concentraciones optimas de NP/Alumbre-I ±Ag85. Ag85 se conserva muy bien y la protema es identica en el organismo lo que provoca tuberculosis humana (MTb) y el organismo relacionado (MB) que provoca TB en el ganado. Esto nos permite identificar el perfil de citocinas inmunomoduladoras producidas por las celulas mediante ELISA y evaluar los marcadores de maduracion de la superficie celular y la expresion de CMH de clase 11 mediante el analisis por citometna de flujo.

Resultados

[0069] Veanse las figuras 9-15 y las tablas 2 y 3 (a-f) a continuacion.

Tabla 2: Tamano hidrodinamico y polidispersidad

: PBS

: Medios SFB 2 % Medios SFB 5%

: Diametro medio nm Polidispersidad Diametro medio nm Polidispersidad

Alumbre Imject

CosO4NP: 1780 0,081 567 0,076

: MQ H20

: Medios SFB 2% Medios SFB 5%

: Diametro medio nm Polidispersidad Diametro medio nm Polidispersidad

Alumbre Imject: 337 0,138 193 0,28

CO3O4NP: 66 0,187 136 0,005

Tabla 3 (a-f): Respuesta de citocina a nanoparticulas de oxido de cobalto y alumbre-Imject (n=4)

3A

NP: Media EEM

Medios: 17,30 11,74

10 |jg/ml: 36,42 34,80

30 jg/ml: 8,64 7,26

100 jg/ml: 140,71 121,57

500jg/ml: 10,50 6,99

3B

NP: Media EEM

Medios: 0,19 0,05

10 jg/ml: 0,34 0,18

30 jg/ml: 0,27 0,23

100 jg/ml: 0,56 0,42

500 jg/ml: 0,26 0,12

3C

NP: Media EEM

Medios: 0,14 0,12

10 jg/ml: 0,09 0,08

30 jg/ml: 7,8 3,49

100 jg/ml: 0,06 0,05

500 jg/ml: 1,15 0,27

3D

ALUMBRE-I: Media EEM

Medios: 14,68 12,27

20 jg/ml: 19,75 9,36

80 jg/ml: 22,30 9,43

240 jg/ml: 52,76 20,05

800 jg/ml: 54,61 12,2

3E

ALUMBRE-I: Media EEM

Medios: 0,44 0,23

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20 jg/ml: 0,08 0,05

80 jg/ml: 0,21 0,19

240 jg/ml: 0,19 0,15

800 jg/ml: 0,17 0,12

3F

ALUMBRE-I: Media EEM

Medios: 0,14 0,14

20 jg/ml: 0,21 0,18

80 jg/ml: 10,85 10,61

240 jg/ml: 0,2 0,12

800 jg/ml: 0,75 0,69

Sumario

[0070]

• Se determino con exito el perfil marcador de la superficie celular para las DC restantes. A continuacion, esto se comparo con las DC tratadas con nanopartfculas de oxido de cobalto y alumbre Imject ± Ag85 para producir cambios en el estado de activacion y la expresion de CMH de clase ll.

• Mediante la utilizacion del analisis de citotoxicidad de lactato deshidrogenasa determinamos los niveles de toxicidad contra dosis crecientes de nanopartfculas de oxido de cobalto y alumbre Imject. La concentracion de cada uno sera 50|jg/ml.

• Se miro el perfil de citocinas inmunomoduladoras producidas por las celulas mediante ELISA. Niveles aumentados de IL-1p que se producen en respuesta a mayores dosis de alumbre Imject.

• No existe diferencia en los niveles de toxicidad celular en celulas dendnticas tratadas con NP de oxido de cobalto y alumbre-I (± 1% OVA).

• Los niveles de IL-1p en los sobrenadantes de celulas dendnticas tratadas con NP de oxido de cobalto y alumbre-I son comparables tanto para las DC tratadas con oxido de cobalto como con alumbre Imject.

• La adicion de 1% OVA lleva a mayores niveles de IL-1 beta que se produce con alumbre Imject + 1% OVA lo que muestra niveles superiores en comparacion con NP de oxido de cobalto + 1% OVA.

ANALISIS

[0071] La seguridad de los adyuvantes que han de utilizarse en el ser humano es una cuestion clave en su desarrollo. Estudios recientes han demostrado que el adyuvante autorizado activa monocitos humanos y macrofagos[20], lo que sugiere que lo que se considerana como toxicidad es potencialmente una parte del mecanismo por el cual el funciona el adyuvante de alumbre. En el presente estudio, se formulo la hipotesis de que Co3O4NP podfa producir una respuesta Th1 y Th2 equilibrada con menor toxicidad que el alumbre, lo que sugiere que puede ser una opcion mas segura.

[0072] Co3O4NP mostro una forma esferica relativamente homogenea de partfculas. Resulta interesante que el alumbre-I era mas heterogeneo e inferior a 100 nm en ambas dimensiones. La forma heterogenea puede deberse a la composicion de alumbre-I que comprende una mezcla de hidroxido de aluminio e hidroxido de magnesio. Por lo tanto, tanto Co3O4NP como alumbre-I se encontraban dentro de la definicion de nanopartfculas y clasificados como NP de oxido de metal[21;22]. Como estudios anteriores han demostrado que el tamano importa en cuanto a la propiedad de ser adyuvante, una dispersion optima de NP puede ser util[12]. OVA actuo como un dispersante excelente para ambas partfculas. Co3o4NP mostro pequenos aglomerados cuando se disperso con OVA lo que forma una corona de protemas que proporciona fuerza repulsiva entre las partfculas[23]. A diferencia de Co3O4NP, alumbre-I se disperso relativamente bien en solucion salina lo que podna deberse a los estabilizadores anadidos durante la fabricacion.

[0073] Se cree que los adyuvantes funcionan activando celulas que presentan antfgenos pero hay poca informacion sobre su toxicidad para dichas celulas. Mediante la utilizacion de una lmea celular de macrofagos murinos, el estudio de citotoxicidad con LDH mostro que el propio alumbre-I era aproximadamente 6 veces mas toxico que una cantidad equivalente de Co3o4NP. La dispersion en OVA mostro un aumento de la toxicidad tanto

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de C03O4NP como de alumbre lo que podna deberse a la citotoxicidad de la propia OVA o para facilitar el reconocimiento y fagocitosis de partfculas mediante la formacion de una corona de protemas.

[0074] Los datos tras la sensibilizacion mostraron que tanto alumbre-I-OVA como NP-OVA aumentaron los niveles sericos de IgG1 espedficos de OVA (que es el marcador para la respuesta Th2[3]) mientras que otras inmunoglobulinas no aumentaron. Sin embargo, el potencial de produccion IgG1 mediante alumbre-I-OVA era aproximadamente tres veces mayor que el de NP-OVA. Los datos tras la estimulacion mostraron que se generaba una respuesta de celulas T, confirmado por la proliferacion de celulas esplenicas cultivadas con OVA in vitro. Tambien se observo el impulso de respuestas de inmunoglobulina en ratones inmunizados con cualquier adyuvante. La presencia de inmunoglobulinas con conmutacion de clase espedficas de antigenos (IgG y IgE) en el suero indican que los linfocitos T CD4+ espedficos de OVA tanto de Thl como Th2 han sido activados por OVA tras la sensibilizacion con el antigeno mediante la utilizacion de Co3O4NP como adyuvante. En suero alumbre-I-OVA produjo principalmente respuestas de anticuerpo alergicas (IgE) y de tipo Th2 (IgG1) mientras que NP-OVA produjo una respuesta Th1 (IgG2c) y Th2 (IgG1) mas equilibrada con mucho menos IgE. Esto sugiere que es mas probable que Co3O4NP como adyuvante proporcione inmunidad «completa» robusta y que es menos probable que induzca efectos secundarios/alergicos no deseados. Esto se apoya de forma adicional mediante el analisis del fluido de lavado peritoneal tras la estimulacion. Los niveles de IgC1 dependientes de Th2 se aumentaron significativamente mediante NP-OVA y alumbre-I-OVA con el mismo patron observado en suero. IFN-y del lavado peritoneal, una citocina de tipo Th1 [24], se aumento unicamente en el grupo inmunizado NP- OVA. El recuento diferencial de celulas del fluido del lavado peritoneal mostro que tanto NP-OVA como alumbre- OVA indujo inflamacion linfodtica que es importante para la propiedad de ser adyuvante[5] pero NP-OVA indujo una inflamacion granulocftica bastante menor. Esta inflamacion granulocftica por alumbre-I-OVA fue coherente con el aumento de IL-1p en el lavado peritoneal que es una de las citocinas proinflamatorias derivadas de macrofagos. El patron de respuesta inducido por alumbre-I-OVA es coherente con lo que se ha observado en otros estudios[25;26].

[0075] A los 7 dfas despues de la estimulacion con las dosis utilizadas, alumbre-I indujo inflamacion masiva prolongada y necrosis en la capa muscular y subcutanea de la piel inyectada mientras que Co3O4NP mostro inflamacion moderada. La mayor inflamacion inducida por alumbre-I en comparacion con Co3O4NP era coherente con un aumento de la secrecion de IL-1p peritoneal y el numero de granulocitos identificados en la cavidad peritoneal por alumbre-I lo que indica respuestas inflamatorias en ambas zonas de estimulacion y sensibilizacion. Ademas, el alumbre-I indujo mas anticuerpos sericos IgE anti-OVA alergicos. Esto proporciona un resultado mas redondeado con Co3O4NP que un informe anterior donde las TO2NP mostraron una respuesta IgE mayor que Al(OH)3, aunque en ese caso Al(OH)3 produjo la mayor identificacion de granulocitos que coincide con nuestros datos[27]. Ademas, Co3o4NP mostro una respuesta Th1 y Th2 mas equilibrada incluso con una masa administrada 80 veces menor que el alumbre-I. La ausencia de muerte celular e inflamacion en la zona de inyeccion del grupo NP-OVA indica que provocana menos dolor local. Ademas desde un punto de vista veterinario en animales destinados a la alimentacion, menos muerte celular e inflamacion en la zona de inyeccion significa menos deterioro de carne y piel y puede tener una mejora en los beneficios economicos.

[0076] En 3 dfas de incubacion, la mayor parte del alumbre-I se disolvio en la solucion acida (pH 5.5) que presenta el mismo pH del fluido lisosomal de los macrofagos alveolares[28] mientras que existfa disolucion minima en la solucion basica (pH 7.4). Sin embargo, Co3O4NP mostro una minima disolucion en ambas condiciones. Sena probable que los iones composicionales liberados en el estado lisosomal acido desempenaran una funcion en la muerte celular y la inflamacion para NP de alta solubilidad como CuONP[29] y ZnONP[30]. Por lo tanto, Al3+ disuelto en los lisosomas de celulas fagodticas puede contribuir a la muerte celular y a la inflamacion adicional mediante un mecanismo de tipo caballo de Troya[31]. Co3O4NP no habfa cambiado en solubilidad y esto es coherente con la persistencia en la zona de inyeccion. Esto sugiere que Co3O4NP es muy insoluble y estable. Existe una preocupacion con respecto a la solubilidad de Co3O4NP, ya que los iones de cobalto se liberan muy despacio en las celulas y su efecto a largo plazo es desconocido[19]. La intoxicacion por cobalto no es comun, pero puede darse. Existen informes de reemplazos de cadera (que contienen cobalto y cromo) que se corroen con el tiempo y liberan iones de metal en el cuerpo lo que provoca una enfermedad grave[32]. Esto parece un efecto secundario poco probable en el presente caso para Co3O4NP debido a su pequena dosis y al volumen de la inyeccion y naturaleza insoluble. En nuestro estudio anterior, el deposito de Co3O4NP dentro del pulmon provoca hipersensibilidad retardada y lipoproteinosis alveolar pulmonar[19]. Sin embargo, teniendo en cuenta que el pulmon tiene respuestas inmunitarias mucho mas activas que la piel y el musculo, los efectos secundarios subcutaneos pueden ser mas limitados y de hecho solo se produjo inflamacion moderada en la zona de inyeccion a las 5 semanas despues de dos inyecciones. Sin embargo, si hubiera que administrar multiples vacunas repetidas, la acumulacion de Co3O4NP y la liberacion de iones de cobalto pueden provocar problemas de salud. La acumulacion de Co3O4NP en las capas subcutaneas y musculares indica que Co3O4NP puede proporcionar una fuente continua de antfgeno desorbido que es uno de los modos de accion propuestos para el adyuvante de alumbre[33].

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[0077] La comparacion entre alumbre-I y C03O4NP es adecuada para medir una respuesta en ratones. El alumbre Imject no esta autorizado para su uso en humanos y presenta una fisicoqmmica diferente para productos clmicamente aprobados[33]. Para poder evaluar completamente Co3O4NP en un estudio a largo plazo como un potencial adyuvante para el ser humano se necesitan estudios adicionales, pero creemos que Co3O4NP es muy prometedor a la hora inducir ambas respuestas mediadas de Th1 y Th2.

CONCLUSION

[0078] En conclusion, Co3o4NP estimulo una produccion de anticuerpos alergicos y una inflamacion in vivo (en ambas zonas de estimulacion y sensibilizacion) menor que una dosis estandar del adyuvante con alumbre Imject. Junto con la prueba de que tambien produjeron una toxicidad menor in vitro mientras se estimulaban las respuestas de anticuerpos de Th1 y Th2 in vivo, esto indica que Co3o4NP sena adecuado para su uso como un adyuvante de vacuna.

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20

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Claims

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10

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20

25

30

35

REIVINDICACIONES

1. Un adyuvante que comprende nanopartfculas de cobalto y/o nanopartfculas de oxido de cobalto.
2. Adyuvante de conformidad con la reivindicacion 1, donde el adyuvante no comprende alumbre.
3. Adyuvante de conformidad con la reivindicacion 1 o 2, donde las nanopartfculas de oxido de cobalto comprenden nanopartfculas de oxido (Co3O4) de cobalto (11,111).
4. Adyuvante de conformidad con cualquier reivindicacion anterior, donde el adyuvante comprende o comprende ademas nanopartfculas de oxido cobaltoso (oxido de cobalto (II): CoO) y/o nanopartfculas de oxido cobaltico (oxido de cobalto (III): Co2O3).
5. Adyuvante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las nanopartfculas presentan entre 1 nm y 100 nm de diametro.
6. Adyuvante de conformidad con cualquier reivindicacion anterior, donde las nanopartfculas de cobalto presentan un diametro medio de 18,4 ± 5,0 nm.
7. Nanopartfculas de cobalto inorganicas y/o nanopartfculas de oxido de cobalto para su uso como adyuvantes.
8. Nanopartfculas de cobalto inorganicas y/o nanopartfculas de oxido de cobalto de conformidad con la reivindicacion 7 para su uso segun la reivindicacion 7, donde las nanopartfculas de cobalto y/o las nanopartfculas de oxido de cobalto comprenden nanopartfculas de Co3O4.
9. Una composicion de adyuvante comprendiendo el adyuvante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, un excipiente, solvente, portador o diluyente farmaceutica o fisiologicamente aceptable.
10. Composicion de adyuvante de conformidad con la reivindicacion 9, donde la composicion comprende uno o mas componentes de adyuvante adicionales.
11. Una vacuna que comprende un adyuvante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
12. Adyuvante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o vacuna de conformidad con la reivindicacion 11, para su uso en (i) la mejora de respuestas inmunitarias en sujetos animales o humanos, (ii) el aumento de respuestas inmunitarias y/o (iii) la mejora, modulacion o aumento de respuestas inmunitarias, en sujetos humanos o animales.

imagen1

50-

40-

o

o

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0

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30-

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□ Con 1% OVA Sin OVA

in

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100 500

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240 800

TiOoNP

C03O4NP

Alumbre-I

Figura 2

imagen3

Figura 3

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Figura 4

-©■ PBS -& NP-OVA -*■ Alumbre-I-OVA Solo NP

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... » .....*........-»

200 400 800

Diluciones en serie 1 #

C06
0.4-

i-s

S

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o
0.2-

-e- pbs

-B- NP-OVA -A- Alumbre-I-OVA

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Diluciones en serie 1M

400

*

PBS

■Q- NP-OVA -*• Alumbre-I-OVA h*- Solo NP

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200 400 800

Diluciones en serie 1 #

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Q

O
2.0i

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1.0-
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0 2 4 6

Diluciones en seriel:#

To

Figura 5

A 600-1

ie

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Figura 6

IL-1 p (pg/m!)

imagen14

*

* M

*

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I----

O

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O

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d

imagen15

Granulocitos totales (x 106)

imagen16

QQ

Linfocitos (x 106)

imagen17

Celulas totales (x 106)

Figura 7

imagen18

Figura 8

Perfil marcador superficie celulas dendriticas

Oi
120.00 :

imagen19

Respuesta citotoxica a Nanoparticulas de oxido de cobalto

imagen20

Medios lOng/ml 30|i»/ml lOOng/ml 500ng/ml Triton X

Tratamientos 24 horas

Respuesta citotoxica a Alumbre Imject

100

N>

SO 1

% liberacion total LDH

60 -i

imagen21

Medios

imagen22

20|xg/ml 80ng/ml 240ng/ml 800ng/ml

Tratamientos 24 horas

imagen23

Triton X

N>

00

120 1

100 "S

80

% liberation total LDH

50 i

40 1

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0

imagen24

Medios

SS - OVA ^ + OVA

imagen25

10ng/ml 30ng/ml lOQug/rnl 500jig/ml Triton X

N>

CD

120

OVA

% liberacion total LDH

100

SO

60

40

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imagen28

SOptg/ml 240[i.g/ml 800(ig/ml

imagen29

Triton X

+ OVA

CO

o

450,00 "■
400.00

Generacion IL-1 p por DC tratadas con NP oxido de cobalto ± 1 % OVA
350.00
300.00
250.00 ■

IL-1 Beta Pi/ml
200.00 '
150.00
100.00
50.00 '
0.00 4

imagen30

Medios lOng/ml 3G|ig/ml 100|ig/ml

^ - OVA

imagen31

500jig/ml

® + OVA
600.00
500.00
400.00

IL-1 Beta

Pg/ml
300.00
200.00
100.00
0.00

Generacion IL-1 p por DC tratadas con Alumbre Imject ± 1 % OVA

imagen32

Medios 20|ig/rnl 80|ig/ml

imagen33

240(1g/m!

^ - OVA

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SOOiig/ml

S + OVA