ES2644423T3 - Anticuerpos humanos anti-receptor alfa de folato y fragmentos de anticuerpo para radioinmunoterapia de carcinoma de ovario - Google Patents

Description

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DESCRIPCION

Anticuerpos humanos anti-receptor alfa de folato y fragmentos de anticuerpo para radioinmunoterapia de carcinoma de ovario

[0001] La presente invencion se refiere a anticuerpos humanos de alta afinidad y a fragmentos de anticuerpo, particularmente fragmentos Fab, especificos para el receptor alfa humano de folato. La invencion tambien se refiere a metodos para producir dichos anticuerpos y fragmentos, y a su uso en entornos terapeuticos y de diagnostico, tales como radioinmunoterapia, particularmente en cancer de ovario. La invencion se refiere ademas a composiciones farmaceuticas que contienen los anticuerpos y los fragmentos.

[0002] El cancer epitelial de ovario (EOC) es la neoplasia ginecologica mas mortifera en los paises industrializados y en Europa. A pesar de la incidencia relativamente baja (aproximadamente 1/100 000 casos nuevos cada ano), EOC presenta una alta relacion de mortalidad por casos y la supervivencia global de 5 anos ha permanecido en aproximadamente un 44 % (1)’ (2). Las mujeres con tumores confinados en el organo tienen un excelente pronostico, pero la mayoria de los canceres en fase temprana son asintomaticos y mas de dos tercios de los pacientes se diagnostican con enfermedad avanzada. EOC en fase temprana generalmente es asintomatico y la mayoria de las mujeres (70-75 %) presentan enfermedad avanzada, que a menudo se propaga como depositos tumorales de pequeno volumen difusos. La cirugia inicial es casi siempre necesaria en el tratamiento de cancer de ovario sospechoso para la confirmacion histologica, la estadificacion y citorreduccion del tumor. La cirugia citorreductora eficaz en el momento del diagnostico, que se puede conseguir principalmente en la enfermedad en fase temprana, se ha correlacionado con supervivencia mejorada. Sin embargo, debido a las dificultades en el diagnostico prematuro y la propension a enfermedad difusa de pequeno volumen, la inmensa mayoria de los pacientes con EOC requiere tratamiento adyuvante en un intento por erradicar la enfermedad residual.

[0003] La quimioterapia ha desempenado una funcion cada vez mas importante en el tratamiento eficaz del carcinoma de ovario (3)’ (4). Se considera que EOC es un tumor quimiosensible; de hecho, un 70-80 % de los pacientes con EOC que reciben quimioterapia de primera linea muy activa entran en remision clinica. Sin embargo, a pesar del desarrollo de nuevas estrategias terapeuticas y la supervivencia global media mejorada, se produce recidiva en la mayoria de los pacientes en fase avanzada despues de una respuesta completa a los tratamientos iniciales, y al menos un 70-90 % de estos pacientes finalmente mueren con canceres resistentes a farmacos (tratamiento), mostrando solamente un 10-30 % supervivencia a largo plazo.

[0004] Por tanto, existe una gran necesidad de metodos de tratamiento alternativos para cancer de ovario. Uno de estos tratamientos alternativos es radioinmunoterapia. El carcinoma de ovario puede tratarse con radioinmunoterapia adyuvante para erradicar las metastasis que son quimiorresistentes. La radioinmunoterapia consiste en marcar un anticuerpo monoclonal especifico para un epitopo canceroso con un componente radiactivo. El anticuerpo monoclonal radiomarcado despues se inyecta in vivo y su especificidad dara lugar a su acumulacion en la masa cancerosa. Esta tecnica permite la concentracion del agente terapeutico, en este caso el componente radiactivo, en las celulas cancerosas y, contrario a la quimioterapia, que no es especifica de sitio, tiene menos toxicidad y efectos secundarios debido a su direccion selectiva y un posible mecanismo diferente de accion, y la menor dosificacion de agente terapeutico usada en el tratamiento global.

[0005] Para carcinoma de ovario, hasta ahora se han identificado varios marcadores diferentes y se han generado muchos anticuerpos diferentes. Entre ellos, los mejor caracterizados son anticuerpos anti-CA125(5)’ (6) y anti-MUC-1, y anticuerpos anti-receptor de folato tales como Mov28(7). El ultimo presenta varias ventajas significativas.

[0006] El receptor alfa de folato (aFR) es una proteina unida a glucosil fosfatidilinositol con una alta afinidad por acido folico y algunos folatos reducidos tales como 5-metiltetrahidrofolato y tetrahidrofolato. Tambien esta presente en una cantidad limitada de celulas epiteliales, especialmente el rinon, la placenta y el plexo coroideo, pero se expresa en su superficie apical volviendolo inaccesible para los anticuerpos. La sobreexpresion del aFR por celulas de carcinoma de ovario y su distribucion restringida en tejidos normales proporciona una oportunidad para el desarrollo de anticuerpos anti-aFR para radioinmunoterapia. MOv18 es un anticuerpo monoclonal que es especifico para el receptor alfa de folato que es una diana ideal para radioinmunoterapia ya que se sobreexpresa en un 90 % de los carcinomas de ovario. MOv18 radiomarcado con 131I ya se ha llevado, con algun exito, a ensayo clinico en fase I/II. Otros anticuerpos monoclonales murinos generados contra aFR incluyen MOv19.

[0007] En Figini et al. "Panning Phage Antibody Libraries on cells: isolation of human Fab fragments against ovarian carcinoma using guided selection" Cancer research, American Association For Cancer Research, Baltimore, MD, US vol. 58, n.° 5, 1 de marzo de 1998 (1998-03-01), paginas 991 - 996 ISSN: 0008-5472 se describe la produccion de un fragmento de Fab humano llamado C4 que se une especificamente a FRa.

[0008] Otros varios mAb, incluyendo MOV18, han mostrado eficacia en diferentes ensayos clinicos, pero se han visto limitados en su desarrollo clinico por su origen murino. Para evitar su inmunogenicidad, algunos anticuerpos se han modificado por ingenieria para formar anticuerpos quimericos o humanizados antes o durante su desarrollo clinico, siendo la ultima generacion completamente humanos y estando en desarrollo clinico.

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[0009] Una limitacion que a menudo encuentra la radioinmunoterapia es la larga semivida de los anticuerpos que puede ser de varios dias. Por un lado, esta propiedad puede representar una ventaja, dando una cantidad adecuada de tiempo al anticuerpo ha abordar el tumor. Sin embargo, por otro lado, esto tambien significa que el paciente puede tener varios dias, dependiendo del marcador, un componente radioactivo descomponiendose en las venas en todo el organismo. En este caso, la relacion de tumor a sangre u organo excederia por poco un logaritmo en las condiciones mas favorables ya que el anticuerpo se elimina lentamente del organismo del paciente. Desde este punto de vista, reducir la semivida del anticuerpo disminuiria la toxicidad del tratamiento reduciendo los efectos secundarios debido a la acumulacion de radiaciones inespecificas en tejidos sanos.

[0010] Un punto adicional a considerar es la penetracion en el tumor. La impedancia esterica de las moleculas mAb no tiene influencia siempre que la diana sea una celula aislada en el torrente sanguineo, pero llega a ser critica cuando se consideran los tumores solidos como en el caso de carcinoma de ovario(8) (9). La penetracion en el tumor solido tambien se ve influenciada por la afinidad del anticuerpo por su ligando y se ha demostrado previamente que una afinidad demasiado baja evita la localizacion del tumor mientras que una afinidad demasiado alta limita la union del anticuerpo a la periferia del tumor(10)’ describiendose este ultimo fenomeno como la barrera de antigeno.

[0011] En vista de las consideraciones anteriores (origen, tamano, semivida y afinidad) se ha propuesto el uso de fragmentos de anticuerpos (Fab) humanos para la radioinmunoterapia de carcinoma de ovario. De hecho, una molecula mas pequena que un anticuerpo completo probablemente favorece la penetracion en el tumor y su origen humano debe eliminar las reacciones inmunogenicas. Ademas, se acortara la semivida. La afinidad de dichas moleculas tiene que abordarse especificamente como una funcion del fragmento de anticuerpo seleccionado. Otra ventaja del formato Fab es que este tipo de molecula no requiere ninguna glucosilacion para ser funcional. Esto es compatible con la produccion de microorganismos y las ventajas asociadas.

[0012] Dicho fragmento de anticuerpo se ha generado en el pasado usando seleccion guiada partiendo de MOv19, un anticuerpo monoclonal (mAb) seleccionado de la misma fusion de la que se genero MOv18, que reconoce un epitopo que no tiene reaccion cruzada en el mismo antigeno diana, es decir, aFR. El fragmento Fab seleccionado, llamado C4(11), se ha descrito como capaz de unirse especificamente a aFR por ensayos in vitro. C4 mostro una Kaff estimada de 200 nM, por un analisis de Scatchard realizado sobre celulas EOC completas.

[0013] Se ha previsto, por lo tanto, el desarrollo de un fragmento C4-Fab adecuado para uso clinico in vivo en el tratamiento y el diagnostico de cancer de ovario. Sin embargo, los presentes inventores han descubierto que la afinidad relativamente baja del fragmento Fab del anticuerpo C4 y su semivida in vivo son incompatibles con las necesidades para el desarrollo clinico. De hecho, los experimentos in vivo realizados por los inventores con el fragmento C4-Fab mostraron que:

- la afinidad del fragmento C4-Fab era demasiado baja para una localizacion tumoral eficaz;

- la semivida in vivo de C4-Fab era muy corta que, junto con su baja afinidad, evitaba cualquier localizacion

tumoral; fue casi imposible detectar el fragmento Fab en sangre de animales incluso justo una hora despues de

la administracion intravenosa. Esta eliminacion demasiado rapida evitaba la acumulacion del fragmento de

anticuerpo en el tumor solido que da lugar a resultados incoherentes de biodistribucion.

[0014] Ademas, los inventores descubrieron que la produccion del C4-Fab recombinante en E. coli, y su posterior purificacion, se veia enormemente impedida por la produccion simultanea de un homodimero de cadena ligera no funcional contaminante (L2) que es dificil de eliminar durante las etapas de purificacion.

[0015] Los inventores, por lo tanto, decidieron investigar la posibilidad de producir un fragmento Fab dimerico adecuado para la radioinmunoterapia de carcinoma de ovario. El cambio de formato de Fab al formato F(ab')2 proporciona varias ventajas, tales como bivalencia, que aumenta la avidez del fragmento y, por lo tanto, su afinidad global, duplica su peso molecular con respecto al fragmento Fab correspondiente, que a su vez disminuye la excrecion en orina que protege los rinones y por consiguiente prolonga su semivida in v/vo(12).

[0016] Los inventores, sin embargo, descubrieron sorprendentemente que no era posible dimerizar de forma eficaz el fragmento C4-Fab. Ni los metodos de dimerizacion naturales ni los metodos de dimerizacion quimica dieron lugar a rendimientos aceptables del dimero C4; cualquier pequena cantidad de producto dimerico correcto estaba enormemente contaminada por especies dimericas sucedaneas incorrectas que no podian eliminarse por purificacion por cromatografia de filtracion en gel. Los inventores descubrieron que la produccion de un dimero Fab requeria modificacion extensa del fragmento C4-Fab original, incluyendo el remplazo de la cadena ligera lambda C4 con una cadena ligera kappa. Esto se hizo usando un procedimiento de seleccion guiado. El nuevo fragmento Fab que comprende la cadena ligera kappa asi seleccionada se llamo AFRA y dio lugar a un Fab que tiene afinidad de union mejorada. La nueva cadena ligera kappa tambien evitaba el problema de la formacion de homodimeros de cadena ligera y mejoraba la estabilidad, que es ventajoso para la radioinmunoterapia(13). Un beneficio adicional es el hecho de que las cadenas kappa se expresan mas facilmente en Escherichia co//14) que es particularmente ventajosa en el caso de una aplicacion industrial. La secuencia de aminoacidos de la cadena ligera kappa AFRA de la invencion se ilustra en las figuras 1 y 7 (SEQ ID NO: 1). Para una comparacion, la secuencia de aminoacidos de la cadena ligera C4 tambien se muestra en la figura 1 (SEQ ID NO: 12).

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[0017] La presente invencion, por tanto, se refiere a un anticuerpo, o un fragmento del mismo, que se une especificamente al receptor alfa de folato (FRa),

donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo es un fragmento Fab que comprende una cadena ligera cuya region variable (VL) comprende:

- las regiones determinantes de complementariedad (CDR) que tienen las siguientes secuencias de aminoacidos:

RASESVSFLGINLIH, (SEQ ID NO: 3)

QASNKDT, (SEQ ID NO: 4)

LQSKNFPPYT, (SEQ ID NO: 5)

- la region variable (Vh) que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2 y la primera region constante

(Ch1) de una cadena pesada

y donde la region constante de dicha cadena ligera es una region constante kappa.

[0018] En el contexto de la presente invencion, se usa la siguiente terminologia:

- Las expresiones "anticuerpos y fragmentos de la invencion" o "anticuerpos AFRA" o "fragmentos de anticuerpos AFRA", salvo que se indique de otro modo, significan anticuerpos o fragmentos que comprenden una cadena ligera que comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos que es identica a la ilustra en las figuras 1 y 7 (SEQ ID NO: 1), o una secuencia de aminoacidos que es funcionalmente equivalente a la ilustrada en las figuras 1 y 7.

- La expresion "anticuerpo derivado de AFRA" o "fragmento de anticuerpo derivado de AFRA" se usa para indicar anticuerpos o fragmentos que comprenden una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoacidos que es funcionalmente equivalente a la ilustrada en las figuras 1 y 7 (SEQ ID NO: 1).

- La expresion "cadena ligera AFRA" significa la cadena ligera ilustrada en las figuras 1 (AFRA) y 7 (SEQ ID NO: 1). La expresion "cadena ligera derivada de AFRA" significa una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoacidos que es funcionalmente equivalente a la ilustrada en las figuras 1 (AFRA) y 7 (SEQ ID NO: 1).

- El termino "anticuerpo" se usa como sinonimo del termino "inmunoglobulina" (o "Ig"). Salvo que se especifique de otro modo, el termino "anticuerpo" o el termino "inmunoglobulina", significa una molecula de anticuerpo intacta (o completa). Los fragmentos se denominan como tales.

- La numeracion de las posiciones de los aminoacidos dentro de la molecula de anticuerpo se hace usando el sistema de numeracion de Kabat (Kabat, H. A., et al. Sequences of Proteins of Immunological interest, 5.a Ed. (U.S. Dept. Health and Human Services, Bethesda, Md., 1991), salvo que se indique lo contrario.

[0019] En la naturaleza, los anticuerpos son moleculas glucoproteicas producidas por los linfocitos B. Los anticuerpos de la invencion pueden producirse por linfocitos B, por hibridoma, por expresion del anticuerpo recombinante en una celula hospedadora procariota o eucariota o por tecnicas sinteticas tales como ingenieria de anticuerpos a partir de anticuerpos existentes. Pueden estar glucosilados o no. Hablando en lineas generales, los anticuerpos se unen a antigenos con un alto grado de especificidad, y pueden subdividirse basandose en las propiedades fisicas y funcionales en cinco clases (o isotipos), denominadas IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Estos diferentes tipos de anticuerpos comparten una unidad estructural basica comun que tiene un peso molecular de aproximadamente 150 000 Dalton (150 kDa) y esta compuesta por dos cadenas polipeptidicas pesadas (H) identicas y dos cadenas ligeras (L) identicas, unidas covalentemente mediante enlaces disulfuro (S-S) intercatenarios entre restos de cisteina. Los anticuerpos intactos de la invencion tambien tienen esta estructura. Preferiblemente, son del tipo IgG.

[0020] En el contexto de la presente invencion, un "fragmento de anticuerpo" significa cualquier parte de un anticuerpo, preferiblemente una parte de union a antigeno e incluye variantes de dichas partes. Los ejemplos de fragmentos de union a antigeno de acuerdo con la invencion son fragmentos Fab; fragmentos Fab'; fragmentos F(ab)2 y minicuerpos. Las variantes de dichos fragmentos incluyen dimeros y trimeros de los fragmentos, y fusiones entre fragmentos, obtenidas por el uso de secuencias de bisagra naturales, secuencias de bisagra sinteticas, conectores peptidicos o conjugados quimicos. Los fragmentos de la invencion pueden ser monovalentes (por ejemplo, fragmentos Fab), bivalentes (por ejemplo, fragmentos F(ab)2) o multivalentes (por ejemplo, un conjugado quimico que comprende un fragmento Fab trimerico).

[0021] El antigeno al que se unen especificamente los anticuerpos AFRA y los fragmentos de la invencion es el receptor alfa humano de folato (aFR). El receptor de folato tiene tres isoformas, alfa, beta y gamma, que muestran aproximadamente un 70 % de identidad en la secuencia de aminoacidos. Estas diferentes isoformas presentan diferencias significativas en sus afinidades relativas por acido folico y son especificas de tejido de forma diferencial y estan elevadas de forma diferencial en varias neoplasias. La isoforma alfa esta normalmente unida a la superficie celular por un anclaje a membrana de glucosil fosfatidilinositol(15). Tiene una alta afinidad por el acido folico, mediando la internalizacion de los compuestos de folato unidos al receptor y los conjugados de folato. El receptor alfa de folato tiene una distribucion muy restringida en tejidos normales (es decir, esta presente en una cantidad limitada de celulas epiteliales normales), pero se sobreexpresa en carcinoma de tejidos ginecologicos, por ejemplo,

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en carcinoma de ovario. De acuerdo con la invencion, la expresion "receptor alfa de folato" es sinonimo de los siguientes terminos: FR-alfa; FRa; receptor 1 de folato; receptor de folato adulto; proteina adulta de union a folato; FBP; antigeno MOv18 asociado a tumor de ovario. En el contexto de la invencion, la expresion abarca el receptor expresado en la superficie de una celula y tambien su forma soluble. La secuencia primaria de aminoacidos del receptor alfa humano de folato se muestra en la figura 10A y una forma soluble en la figura 10B.

[0022] Una caracteristica importante de los anticuerpos y de los fragmentos de la invencion es que su union al receptor alfa de folato es especifica. Como los anticuerpos y los fragmentos de la invencion tienen una reactividad superponible a la de C4 y Mov19, no se unen a las isoformas beta y gamma del receptor de folato. La expresion "se unen especificamente" significa que los anticuerpos y los fragmentos de la invencion se unen con alta afinidad (preferiblemente con una Kd de al menos 100 nM y mas preferiblemente con una Kd de al menos 20 nM) a FRa, que se expresa sobre la superficie de una celula de mamifero, y no se une a proteinas que tienen, en la misma region epitopica, menos de un 90 % de identidad, preferiblemente menos de un 95 % de identidad y mucho mas preferiblemente menos de un 98 % de identidad. El epitopo reconocido por los anticuerpos monoclonales de la invencion puede ser un epitopo continuo o puede ser un epitopo discontinuo (conformacional), formado por el receptor cuando adopta su configuracion nativa en la superficie de una celula humana, preferiblemente en la superficie de una celula humana de carcinoma de ovario. Por ejemplo, los anticuerpos y los fragmentos de la invencion no se unen a proteinas que tienen menos de un 90 % de identidad global, preferiblemente menos de un 95 % de identidad global, y mucho mas preferiblemente menos de un 98 % de identidad global. Por tanto, es posible que los anticuerpos y los fragmentos de la invencion se unan a proteinas que tienen un grado muy elevado de identidad con el receptor alfa humano de folato mostrado en las figuras 10A y B, tales como variantes alelicas que tienen entre una y cinco diferencias de aminoacidos con respecto a las secuencias de la figura 10, y que son identicas sustancialmente a las secuencias de la figura 10 con respecto a la region o regiones epitopicas reconocidas por los anticuerpos de la invencion.

[0023] Como se indica anteriormente, aunque FRa se sobreexpresa en celulas de carcinoma de ovario, tambien se expresa en ciertos tipos de celulas epiteliales normales. Sin embargo, la expresion en celulas normales es en la superficie apical, haciendo que el receptor sea inaccesible para los anticuerpos de la invencion en un contexto in vivo. Por consiguiente, in vivo, los anticuerpos y los fragmentos de la invencion se unen especificamente a FRa expresado en celulas de carcinoma de ovario donde, como consecuencia de la transformacion, las celulas pierden su polaridad y entonces el receptor alfa de folato se expresa en toda la superficie de la celula (u otro carcinoma) y no puede unirse al receptor expresado en la superficie de celulas humanas epiteliales normales. Por el contrario, en el caso de que los anticuerpos y los fragmentos de la invencion se ensayen por ensayos in vitro, en celulas o tejidos epiteliales humanos normales aislados (tales como celulas epiteliales de la pituitaria, endometrio, tiroides o pancreas) o lineas celulares que expresan bajos niveles de FRa, puede detectarse una union especifica.

[0024] Los anticuerpos AFRA y los fragmentos de anticuerpos AFRA de la invencion se caracterizan por una cadena ligera especifica, cuya secuencia de aminoacidos se ilustra en la figura 1 (SEQ ID NO: 1). La cadena ligera AFRA ilustrada tiene una estructura que es tipica de una cadena ligera de inmunoglobulina (L). De hecho, hablando en lineas generales, las cadenas ligeras (L) son de aproximadamente 220 aminoacidos de longitud y tienen un dominio variable ("Vl") en el extremo amino-terminal de la cadena ligera (de aproximadamente 110 aminoacidos) y un dominio constante ("Cl") que consiste en la mitad carboxilo restante de la cadena L. La cadena ligera AFRA de la invencion comprende 218 aminoacidos, componiendo los 113 aminoacidos N-terminales y la region variable ("Vl") y componiendo los restantes 105 aminoacidos del extremo carboxi-terminal la region constante ("Cl"). La secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera es unica para el anticuerpo AFRA de la invencion. Junto con la region variable de una cadena pesada asociada, forma el sitio de union a antigeno del anticuerpo. La region constante de la cadena ligera AFRA es una cadena ligera kappa tipica.

[0025] Aunque la cadena ligera de los anticuerpos AFRA y fragmentos de la invencion es habitualmente identica a la ilustrada en las figuras 1 y 7, no obstante, pueden hacerse ciertos cambios en esta secuencia sin alejarse de la invencion. De hecho, la invencion tambien se refiere a "anticuerpos derivados de AFRA" o "fragmentos de anticuerpo derivados de AFRA" que comprenden una cadena ligera que es funcionalmente equivalente a la ilustrada en las figuras 1 y 7 (SEQ ID NO: 1). Dicha cadena ligera funcionalmente equivalente es una secuencia de aminoacidos que:

comprende una cadena ligera cuya region variable comprende las regiones de la cadena ligera AFRA ilustrada en las figuras 1 y 7 que determinan la especificidad por el receptor alfa de folato y una region constante kappa. Las regiones que determinan la especificidad corresponden a las regiones "hipervariables" de la cadena Vl, tambien llamadas "regiones determinantes de complementariedad" (CDR). Estas CDR se denominan CDR1, CDR2 y CDR3 o como alternativa L1, L2 y L3. Las regiones determinantes de complementariedad, confirmadas por la estructura cristalina de Fab, de la secuencia AFRA (SEQ ID NO: 1) son:

RASESVSFLGINLIH (SEQ ID NO: 3),

QASNKDT (SEQ ID NO: 4),

LQSKNFPPYT (SEQ ID NO: 5).

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Estas regiones se ilustran en la figura 7 en negrita, subrayadas. Por tanto, la invencion se refiere al anticuerpo derivado de AFRA o fragmento de anticuerpo derivado de AFRA, se une especfficamente al receptor alfa de folato (FRa) y comprende una cadena ligera cuya region variable comprende las secuencias de aminoacidos:

CDR1: RASESVSFLGINLIH (SEQ ID NO: 3),

CDR2: QASNKDT (SEQ ID NO: 4),

CDR3: LQSKNFPPYT (SEQ ID NO: 5).

[0026] Las secuencias de CDR enumeradas anteriormente estan presentes en la cadena ligera derivada de AFRA en las mismas posiciones que aquellas en la cadena ligera AFRA original, es decir, CDR1: 24-38; CDR2: 54-60; CDR3: 93-102 (usando el sistema de numeracion de Kabat). La secuencia restante de la region variable de dicha cadena ligera derivada de AFRA puede ser cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo, una secuencia flanqueante que difiere de la secuencia de las figuras 1 y 7 (SEQ ID NO: 1) por la sustitucion, eliminacion o insercion de hasta diez o veinte aminoacidos, por ejemplo, 1,2, 3, 4 o 5 aminoacidos y que, cuando se usa para reemplazar la secuencia flanqueante de la cadena ligera AFRA ilustrada en la figura 1, en un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que contiene las CDR AFRA, no modifica cualitativamente la especificidad del anticuerpo o fragmento del mismo por el receptor alfa humano de folato. La region variable (Vh) tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2 y la primera region constante (Ch1) de una cadena pesada.

[0027] La region constante de dicha cadena ligera derivada de AFRA es una region constante kappa clasica, por ejemplo, identica a los aminoacidos 114 a 219 de la secuencia AFRA de la figura 7 (doble subrayado). Preferiblemente, estos anticuerpos derivados de AFRA o fragmentos de anticuerpo derivados de AFRA se unen al receptor a de folato (FRa) con una afinidad (Kd) de menos de 50 nM, preferiblemente menos de 20 nM.

[0028] La especificidad de los anticuerpos derivados de AFRA o fragmentos de anticuerpo derivados de AFRA como se define anteriormente, por el receptor a de folato, puede ensayarse in vitro y/o in vivo usando medios experimentales convencionales para mostrar la reactividad con el FRa, y la ausencia de reactividad cruzada con protefnas receptoras que tienen menos de un 90 % de identidad de secuencia, preferiblemente menos de un 95 % de identidad de secuencia.

[0029] Independientemente de si la cadena ligera (L) es una secuencia AFRA inalterada de la SEQ ID NO: 1 o un derivado de la misma como se describe anteriormente, el anticuerpo o fragmento de acuerdo con la invencion comprende la primera region constante, habitualmente denominada Ch1. Otras partes de la cadena pesada que pueden estar asociadas con la cadena ligera de la invencion son fragmentos de cadena pesada que comprenden la region variable (Vh), la primera region constante (Cm) y todo o parte de la region bisagra. Como alternativa, la cadena pesada puede estar intacta, que comprende en secuencia: Vh, Chi, la region bisagra, Ch2, Ch3 y opcionalmente Ch4. La asociacion entre la cadena pesada y la cadena ligera es normalmente covalente, mediante enlace disulfuro que implica una cistefna en el extremo carboxi-terminal de la cadena ligera.

[0030] La region variable de la cadena pesada contiene tres regiones hipervariables, llamadas de nuevo "regiones determinantes de complementariedad" (CDR), denominadas H1, H2 y H3 o, como alternativa, CDR 1, CDR2 y CDR3. Las CDR de la cadena pesada tienen una longitud de aproximadamente 3 a 25 aminoacidos y desempenan una funcion importante en la especificidad del anticuerpo.

[0031] Existen cinco cadenas H diferentes en la naturaleza, denominadas alfa (a), gamma (y), delta (5), epsilon (e) y mu (p), que difieren entre sf en la secuencia de aminoacidos. El isotipo de un anticuerpo dado (es decir, si pertenece a la clase IgA, IgG, IgD, IgE o IgM) se determina por la cadena H del anticuerpo en cuestion, definiendo la cadena H alfa el isotipo IgA, definiendo la cadena H gamma el isotipo IgG y asf sucesivamente. Dentro de la clase IgG existen cuatro subclases denominadas IgG1 a IgG4. De acuerdo con la invencion, la cadena pesada del anticuerpo AFRA o fragmento o derivado del mismo puede ser uno cualquiera de estos isotipos, pero el isotipo IgG es particularmente preferido, por ejemplo, IgG1.

[0032] Preferiblemente, la cadena ligera y la cadena pesada se unen covalentemente juntas por un enlace disulfuro que implica la cistefna carboxi-terminal en la cadena ligera. Los fragmentos Fab de la invencion tfpicamente tienen un tamano de aproximadamente 55 kDa.

[0033] La invencion, por lo tanto, se refiere a un fragmento Fab donde la region variable de la cadena pesada (Vh) tiene la secuencia de aminoacidos de la figura 8 (SEQ ID NO: 2) y la primera region constante de la region de cadena pesada (Cm) es la region Ch1 de una cadena pesada gamma, particularmente una cadena pesada gamma1. Un ejemplo de una cadena pesada Ch1 tfpica se ilustra en la figura 9 (SEQ ID NO: 9).

[0034] Por consiguiente, un fragmento Fab de la invencion comprende o consiste en los siguientes elementos de secuencia:

una cadena ligera cuya region variable (VL) que comprende:

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- las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) que tienen las siguientes secuencias de aminoacidos:

RASESVSFLGINLIH, (SEQ ID NO: 3)

QASNKDT, (SEQ ID NO: 4)

LQSKNFPPYT, (SEQ ID NO: 5)

- la region variable (Vh) que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2 y la primera region constante (Ch1) de una cadena pesada.

y donde la region constante de dicha cadena ligera es una region constante kappa.

De acuerdo con otro aspecto de la invencion, el fragmento de anticuerpo puede ser un fragmento Fab'. En el contexto de la invencion, un fragmento Fab' es un fragmento Fab en que la cadena pesada comprende adicionalmente la region bisagra natural en su extremo carboxi-terminal, adecuado para la union covalente a un segundo fragmento de anticuerpo. La bisagra contiene uno o mas restos de aminoacido o grupos quimicos que son adecuados para la formacion de enlace covalente, por ejemplo, una cisteina libre, permitiendo de ese modo la dimerizacion del fragmento Fab'. La region bisagra puede ser al menos parte de una region bisagra natural de anticuerpo, por ejemplo, una region bisagra de origen natural en una cualquiera de las cadenas pesadas alfa (a), gamma (y), delta (5), epsilon (e) y mu (p). Son particularmente preferidas las regiones bisagra, o partes de las mismas, que corresponden a la secuencia natural de la subclase gamma, particularmente gammal, tal como el pentapeptido DKTSC, o el hexapeptido DKTHTC. La parte de la region bisagra usada para la creacion del fragmento Fab' tipicamente contiene al menos un resto libre de cisteina, por ejemplo, en el extremo carboxi-terminal, pero puede modificarse por ingenieria para que contenga dos o tres restos libres de cisteina.

[0035] Como alternativa, el fragmento Fab' puede dimerizarse de forma artificial por, por ejemplo, un resto no proteinico tal como un conector quimico que confiere a resistencia a la hidrolisis en un entorno in vivo. Un ejemplo de dicho conector artificial es bismaleimida etano (BMOE) pero se ha informado de otros varios conectores en la bibliograffa(16)' (17).

[0036] La ventaja de usar fragmentos Fab' es que pueden dimerizarse para formar fragmentos F(ab')2 que tienen dos dominios de union a antigeno. Los fragmentos F(ab')2 son, por lo tanto, divalentes, lo que aumenta la avidez de union con respecto a un monomero Fab. Los dos fragmentos Fab' que componen el dimero se unen juntos por enlace entre cada una de las dos regiones bisagra, de las dos cadenas pesadas de Fab'. Los monomeros Fab' pueden dimerizarse por la oxidacion natural de las cisteinas libres en los extremos C-terminales de las cadenas pesadas. Los fragmentos F(ab)2 tipicamente tienen un tamano de aproximadamente 100 a 110 kDa.

[0037] Si se dimerizan por un conector artificial no proteinico, los dos monomeros Fab' que componen el dimero F(ab')2 se unen covalentemente en si a traves de este conector quimico. Por ejemplo, un bismaleimida etano (BMOE) da lugar a un enlace maleimida que es no hidrolizable y, por lo tanto, confiere estabilidad al dimero en un entorno in vivo.

[0038] De acuerdo con este aspecto de la invencion, los dos dominios de union a antigeno del dimero F(ab')2 pueden tener especificidades identicas, ambas se unen especificamente a un epitopo dado del receptor alfa de folato. Como alternativa el dimero F(ab')2 puede ser biespecifico, siendo especifico uno de los dominios de union a antigeno por un primer epitopo del receptor alfa de folato y siendo especifico el otro por un segundo epitopo del receptor alfa de folato. Una posibilidad adicional es que el segundo dominio de union a antigeno se una a un antigeno completamente distinto del receptor alfa de folato, tal como un segundo antigeno de carcinoma o a un marcador citolitico natural de celulas efectoras.

[0039] Los anticuerpos y fragmentos de la invencion son preferiblemente humanos completamente. La cadena ligera AFRA de la invencion es de origen humano. Por lo tanto, es ventajoso combinar la cadena ligera con una cadena pesada de origen humano. Como alternativa, la cadena ligera AFRA puede combinarse inicialmente con una cadena pesada de origen no humano, por ejemplo, murino y despues pueden usarse tecnicas de ingenieria de anticuerpos para humanizar la cadena pesada.

[0040] Los anticuerpos y fragmentos de la invencion se caracterizan por una alta afinidad de union y avidez por el receptor alfa humano de folato. La afinidad de union es la fuerza de la interaccion entre un unico sitio de union a antigeno en un anticuerpo, o fragmento del mismo, y su epitopo antigenico especifico. Cuanto mayor sea la afinidad, mas fuerte sera la asociacion entre el antigeno y el anticuerpo o fragmento, y mayor probabilidad habra de que el antigeno permanezca en el sitio de union. El termino "avidez" se usa para describir la fuerza global de la interaccion entre un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, y depende tanto de la afinidad como de la valencia de las interacciones. Cuantos mas sitios de union a antigeno tenga una molecula de anticuerpo individual, mayor sera la avidez por el antigeno.

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[0041] La afinidad puede expresarse como una constante de afinidad Ka que es la relacion entre las constantes de velocidad para la asociacion (kasociacion) y disociacion (kdisociacion) del anticuerpo y el antfgeno. La Ka se mide en M-1; cuanto mayor sea la afinidad, mayor sera la Ka. Como alternativa la afinidad puede expresarse como una constante de disociacion Kd, donde Kd = 1 /Ka. Las unidades de Kd M, y cuanto mayor sea la afinidad, menor sera la Kd. En el contexto de la invencion, las afinidades normalmente se expresan como Kd. Como la mayorfa de los metodos de medicion de la afinidad tienen en cuanta la cantidad de sitios de union de un anticuerpo o fragmento, los valores de afinidad Ka y Kd, de hecho, puede considerarse que reflejan la afinidad para anticuerpos o fragmentos monovalentes, y la avidez para anticuerpos o fragmentos multivalentes.

[0042] Los anticuerpos AFRA y fragmentos de la invencion preferiblemente se unen al receptor alfa de folato (FRa) con una afinidad (Kd) en el intervalo de 100 nM a 1 pM. Mas particularmente, tienen una afinidad (Kd) de menos de 75 nM, preferiblemente de menos de 50 nM, mas preferiblemente de menos de 30 nM y mucho mas preferiblemente de menos de 5 nM. A modo de ejemplo, los fragmentos monovalentes de la invencion, tales como fragmentos Fab tfpicamente muestran una Kd de menos de 50 nM. Esta afinidad representa una mejora considerable sobre el fragmento C4 Fab monomerico conocido. Los fragmentos divalentes de la invencion tales como F(ab')2 o un Di Fab Maleimida (DFM) tfpicamente muestran una Kd de menos de 30 nM, por ejemplo, de menos de 5 nM. Estos valores pueden obtenerse usando el receptor soluble o el receptor expresado en superficie celular como antfgeno.

[0043] De acuerdo con la invencion, la afinidad de union puede medirse por varias tecnicas convencionales, tales como dialisis en equilibrio, con analisis de Scatchard de los datos, de acuerdo con el cual:

r/c = K(n-r),

donde:

• r = moles de ligando unido/moles de anticuerpo en equilibrio;

• c = concentracion de ligando libre en equilibrio;

• K = constante de asociacion en equilibrio; y

• n = numero de sitios de union a antfgeno por molecula de anticuerpo (valencia)

[0044] Tambien pueden usarse ensayos de union competitiva de ELISA para la determinacion de la Ka, de nuevo usando analisis de Scatchard. Como alternativa, la Kd relativa puede determinarse como la concentracion a la que se obtiene la mitad de la senal estable de ELISA.

[0045] Una tecnica adicional que puede usarse para medir la afinidad de union es la resonancia de plasmon superficial (SPR), por ejemplo, usando tecnologfa Biacore (Pharmacia). Con este metodo, es posible medir la cinetica de union, asf como las constantes de afinidad. De acuerdo con esta tecnica, Kd = kdisociacion/kasociacion donde kdisociacion es la constante de velocidad de disociacion (tambien denominada koff) y la kasociacion es la constante de velocidad de asociacion (tambien denominada kon).

[0046] De acuerdo con la invencion, el antfgeno usado en los analisis de afinidad puede ser el receptor alfa de folato que se expresa en la superficie de celulas completas, particularmente celulas humanas, por ejemplo, celulas de carcinoma de ovario humano tales como OVCAR3 (ATCC), IGROVI (aportacion proporcionada por Dr. J. Benard, Institut Gustave Roussy, Villejuif, Francia) o celulas transfectadas con el receptor alfa humano de folato tal como celulas A431-Fr(18). Como alternativa, el antfgeno puede estar en forma de un receptor soluble, por ejemplo, FRa recombinante como se muestra en la figura 10. El uso de receptor soluble es particularmente ventajoso para analisis de resonancia de plasmon superficial (SPR) y puede usarse para predecir la union in vivo en seres humanos.

[0047] Los anticuerpos AFRA y fragmentos de la invencion pueden usarse en varias aplicaciones terapeuticas, de diagnostico y de imagenes. La invencion, por tanto, se refiere a un anticuerpo AFRA o fragmento de acuerdo con la invencion para el tratamiento de trastornos que implica la sobreexpresion de receptor alfa de folato (FRa). En particular los anticuerpos AFRA y fragmentos de la invencion pueden usarse para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de cancer humano. Un aspecto de la invencion, por tanto, se refiere a un metodo para tratar cancer humano, comprendiendo dicho metodo administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento una cantidad eficaz de un anticuerpo AFRA o fragmento de acuerdo con la invencion.

[0048] Para muchas de las aplicaciones terapeuticas, de diagnostico y de imagenes, el anticuerpo o fragmento se conjuga a un resto efector tal como un agente citotoxico o marcador. Este es el caso para el tratamiento de trastornos tales como carcinoma, por ejemplo, carcinoma ginecologico.

[0049] Un uso terapeutico particularmente preferido de los anticuerpos AFRA y fragmentos es en radioinmunoterapia de carcinoma de ovario en seres humanos. Para dicha aplicacion, los anticuerpos y fragmentos se conjugan a un

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radionuclido citotoxico, tal como I, Y, Lu, RE. Un radionuclido mucho mas preferido es I. Ademas, pueden usarse otros radionuclidos tales como 99Tc, por ejemplo, en un entorno de diagnostico o de imagenes.

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[0050] Los anticuerpos AFRA y fragmentos son particularmente muy adecuados para radioinmunoterapia en vista de su bajo valor Kd para el receptor alfa de folato, significativamente mejorado sobre el C4 Fab conocido. La mayor afinidad de los anticuerpos AFRA y fragmentos con respecto a la afinidad de C4 representa una ventaja real para radioinmunoterapia, ya que esto influye directamente en la localizacion del tumor y la dosificacion del anticuerpo. En este caso particular, la mayor afinidad de los anticuerpos AFRA y fragmentos refleja directamente la cantidad de anticuerpo unido al tumor. En otras palabras, como los anticuerpos AFRA y fragmentos tienen un valor de Kd muy inferior a C4, las moleculas AFRA alcanzaran, a la misma dilucion, una concentracion mayor en tejidos tumorales de lo que lo haria C4. Esto reduce el fondo y por consiguiente tambien reduce los efectos secundarios del tratamiento que se deben principalmente a la union inespecifica del anticuerpo. La radioinmunoterapia se basa de forma eficaz en la acumulacion especifica de radiactividad en el tumor, y la mayor relacion de tejidos tumorales/sanos obtenida con los anticuerpos AFRA y fragmentos proporciona un indicador claro para un efecto terapeutico mejorado.

[0051] La conjugacion del radionuclido a los anticuerpos o fragmentos de la invencion puede hacerse usando cualquier tecnica convencional tal como el uso de un conector entre el anticuerpo y el radioisotopo. Preferiblemente, el radioinmunoconjugado tiene una actividad especifica de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 15 mCi/mg, dependiendo del radionuclido, y puede administrarse por via intravenosa u otra via. Dependiendo de la duracion deseada y la eficacia del tratamiento, los conjugados de radionuclido-anticuerpo de la invencion pueden administrarse una vez o varias veces, en combinacion con otros farmacos terapeuticos o agentes radiosensibilizantes. La cantidad del radioinmunoconjugado aplicado depende de la naturaleza precisa del carcinoma. La dosis de radiactividad para administracion debe ser suficientemente alta para ser eficaz, pero debe estar por debajo de la toxicidad limitante de la dosis (DLT). Se prefieren administraciones individuales; tambien son posibles multiples administraciones. En general, la dosis de radiactividad por administracion estara entre 20 y 80 mCi/m2 de area superficial corporal (BSA).

[0052] De acuerdo con una realizacion preferida de la invencion, el fragmento de anticuerpo AFRA usado para radioinmunoterapia es un fragmento dimerico, por ejemplo, F(ab')2 o un dimero Fab quimico tal como F(ab')2-DFM. Los dimeros de Fab AFRA tipicos para aplicaciones de radioinmunoterapia comprenden la cadena ligera AFRA en asociacion con una cadena presada de IgG, que tiene una region variable tal como la ilustrada en la figura 8, o una region variable que comprende las CDR de la secuencia de la figura 8 en una secuencia flanqueante diferente.

[0053] Los anticuerpos y fragmentos de la invencion pueden usarse como agentes terapeuticos individuales en el tratamiento de trastornos tales como cancer, particularmente cancer de ovario. Como alternativa, pueden usarse en asociacion con otros agentes terapeuticos, en tratamiento combinado que implica multiples farmacos y/o metodos de tratamiento. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de la invencion pueden usarse junto con quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal o terapia biologica.

[0054] Esta realizacion de la invencion, por tanto, se refiere a un producto que contiene un anticuerpo o fragmento de acuerdo con la invencion y al menos un agente terapeutico adicional, como una preparacion combinada para uso simultaneo, separado o secuencial en tratamiento. Un agente terapeutico adicional se selecciona tipicamente del grupo que consiste en un agente quimioterapeutico y un agente radioterapeutico. Dichos productos para tratamiento combinado son particularmente adecuados para el tratamiento de cancer humano, por ejemplo, cancer de ovario.

[0055] En el contexto de dicho tratamiento de combinacion, los anticuerpos o los fragmentos de la invencion pueden usarse como el tratamiento principal en asociacion con un tratamiento secundario adecuado, que se administra simultaneamente con o sucesivamente a los anticuerpos AFRA o fragmentos. Como alternativa, los anticuerpos o los fragmentos de la invencion pueden usarse como tratamiento secundario para ayudar al tratamiento principal, tal como quimioterapia. Este aspecto de la invencion, por tanto, incluye un metodo para tratar el cancer humano, comprendiendo dicho metodo la administracion a un sujeto que necesita dicho tratamiento, una cantidad eficaz de un primer agente terapeutico y una cantidad eficaz de un segundo agente terapeutico, donde el primer y el segundo agente terapeutico se administra al sujeto simultaneamente, secuencialmente o por separado, y el primer o el segundo agente terapeutico comprende un anticuerpo AFRA o un fragmento de acuerdo con la invencion.

[0056] Los anticuerpos o los fragmentos de la invencion, por tanto, pueden usarse para realizar un tratamiento complementario o adyuvante con un agente terapeutico adicional, por ejemplo, un agente quimioterapeutico, para el tratamiento de cancer humano, particularmente cancer de ovario.

[0057] De acuerdo con un aspecto adicional, los anticuerpos AFRA o los fragmentos pueden estar presentes junto con otros anticuerpos o fragmentos, en forma de un coctel o mezcla. Estos otros anticuerpos o fragmentos pueden ser anticuerpos AFRA adicionales o fragmentos, especificos para el receptor alfa de folato, o pueden ser anticuerpos o fragmentos que tienen especificidad por un antigeno diferente. Los cocteles o mezclas tambien incluyen mezclas de anticuerpos AFRA o fragmentos que comprenden diferentes formatos de anticuerpo AFRA tales como mezclas de fragmentos AFRA monomericos y dimericos o fragmentos que tienen al menos una cadena ligera con la secuencia de aminoacidos de AFRA ilustrada en la figura 1 o 7 (SEQ ID NO: 1) o el equivalente funcional de dicha cadena ligera.

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[0058] La invencion, por tanto, incluye mezclas de anticuerpos AFRA o fragmentos, comprendiendo dicha mezcla una composicion heterogenea de fragmentos de anticuerpo que comprende o que consisten en:

i) fragmentos de anticuerpos divalentes que se unen especificamente al receptor alfa humano de folato, comprendiendo dichos fragmentos divalentes dos fragmentos Fab' unidos covalentemente que tienen cada uno una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de AFRA ilustrada en la figura 1 o 7 (SEQ ID NO: 1) o el equivalente funcional de dicha cadena ligera, y

ii) fragmentos de anticuerpos adicionales que comprenden al menos una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de AFRA ilustrada en la figura 1 o 7 (SEQ ID NO: 1) o el equivalente funcional de dicha cadena ligera,

comprendiendo el fragmento de anticuerpo divalente (i) al menos un 50 %, preferiblemente al menos un 60 % y mucho mas preferiblemente al menos un 70 % de la composicion. Preferiblemente, los fragmentos (ii) representan menos de un 20 % de la composicion, mucho mas preferiblemente menos de un 10 %.

[0059] Las especies bivalentes pueden ser dimeros naturales, unidos por enlaces de disulfuro entre las regiones bisagra de los fragmentos Fab' o pueden ser dimeros quimicos tales como DFM-AFRA.

[0060] Por ejemplo, en condiciones de dimerizacion natural, aproximadamente un 80 % del producto de dimerizacion de AFRA se encuentra que es F(ab')2 despues de la purificacion. La alta proporcion de dimeros de union a antigeno formados por los fragmentos AFRA de la invencion constituye una ventaja adicional en comparacion con el C4-Fab conocido. Los inventores han observado que se forma un pseudodimero durante la dimerizacion. Este pseudodimeros esta compuesto de dos cadenas ligeras unidas covalentemente a una cadena pesada y una segunda cadena pesada se mantiene en la estructura a traves de interacciones hidrofobas. Como este pseudodimero puede resolverse en SDS-PAGE en dos especies, una de 75 kDa (L2H) y otra de 25 kDa (cadena pesada), se llamo L2H por motivos de simplificacion. Durante la dimerizacion "natural" del C4-Fab', el dimero correcto, L2H2, solamente representa aproximadamente un 30 % del producto de reaccion mientras que el 70 % restante del material corresponde al dimero L2H. No es posible purificar cromatograficamente el dimero C4 de su sucedaneo y como el porcentaje de pseudodimero es mucho mayor que el del dimero correcto, no es factible el desarrollo de la molecula C4 para radioinmunoterapia.

[0061] Para dimeros obtenidos por dimerizacion quimica, los fragmentos AFRA dan lugar a mezclas de producto de dimerizacion que tiene al menos un 50 % de F(ab')2. Puede haber una especie L2H presente, que representa menos de un 20 % de la composicion, mucho mas preferiblemente menos de un 10 % y existe una composicion heterogenea en forma purificada si las dos formas no pueden separarse por metodos cromatograficos. A pesar de la presencia de la especie L2H, las mezclas AFRA-DFM heterogeneas han demostrado tener alta afinidad de union por el receptor alfa humano de folato, por ejemplo, con una KD de menos de 50 nM, preferiblemente de menos de 30 nM y mucho mas preferiblemente de menos de 5 nM.

[0062] La fuerte tendencia de la cadena ligera C4 a reaccionar durante la formacion de dimeros "naturales" es incluso mas pronunciada durante la sintesis de dimeros quimicos (DFM) y casi evita cualquier ensamblaje de dimeros, incluso cuando se ensayan varias condiciones de pH y temperatura. La reaccion de dimerizacion quimica de C4 da un rendimiento de menos de un 5%, del cual solamente un 30 % aproximadamente es el dimero correcto. El porcentaje global de dimero obtenido al final de la reaccion es, por tanto, diez veces inferior que para AFRA. Esta propiedad peculiar junto con la baja afinidad del C4-Fab, que no puede usarse como monomero, evita el desarrollo del fragmento de anticuerpo C4 para radioinmunoterapia.

[0063] Un aspecto adicional de la invencion se refiere a una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia que codifica la cadena ligera de un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une especificamente al receptor alfa de folato (FRa), donde dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1 o un equivalente funcional de la misma. El acido nucleico puede ser ADN o ARN; y puede ser bicatenario o monocatenario.

[0064] Esta invencion tambien se refiere a un vector de expresion que comprende dicha secuencia de acido nucleico, donde dicha secuencia codificante de acido nucleico esta unida de forma funcional a senales reguladoras de la transcripcion, que permiten de ese modo la expresion de la cadena ligera AFRA en una celula hospedadora adecuada. El acido nucleico puede comprender ademas una secuencia que codifica una cadena pesada de anticuerpo o un fragmento de la misma, por ejemplo, en una disposicion bicistronica, que facilita la asociacion natural de las cadenas ligera y pesada en la celula hospedadora. 0065 * * * *

[0065] La invencion tambien se amplia a celulas hospedadoras que contienen un acido nucleico que codifica la

cadena ligera AFRA, por ejemplo, una celula hospedadora transformada con el vector de expresion de la invencion.

Las celulas hospedadoras pueden ser procariotas o eucariotas. Como un ejemplo de celulas hospedadoras

procariotas, Escherichia coli es particularmente preferida. El ejemplo de celulas eucariotas adecuadas incluye

celulas humanas, de primate, murinas o de levadura.

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[0066] Una celula particularmente preferida es la cepa de E. coli depositada en el CNCM el 15 de marzo de 2006 segun los terminos del tratado de Budapest con el numero de acceso CNCM I-3586. Este microorganismo (Escherichia coli cepa BW25113 A PyrC::kan (lacP, rmBru, AiacZwm hsdR514, ArhaBADAH33, ArhaBADLD7s)) contiene el plasmido DoB0134 y produce un Fab AFRA de la invencion. El fragmento Fab AFRA que se puede obtener de esta cepa depositada tambien esta dentro del alcance de la invencion.

[0067] La invencion tambien se refiere a un metodo para producir anticuerpos humanos de alta afinidad o fragmentos de los mismos, uniendose especificamente dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos al receptor alfa de folato (FRa), donde dicho metodo comprende las etapas de:

- transfectar un vector de expresion como se describe anteriormente en una celula hospedadora adecuada;

- recuperar el anticuerpo AFRA expresado o el fragmento del mismo;

- opcionalmente mutar y/o dimerizar el anticuerpo recuperado o el fragmento del mismo.

[0068] La mutacion del anticuerpo o del fragmento asi expresado puede realizarse para anadir partes de bisagra o restos de cisteina, o puede usarse para ajustar o modular la afinidad y la especificidad del anticuerpo/fragmento.

[0069] En una realizacion, el vector de expresion se co-expresa en la celula con un segundo vector de expresion que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una cadena pesada de anticuerpo o fragmento de la misma, estando dicho acido nucleico unido de forma funcional a senales reguladoras de la transcripcion.

[0070] Un metodo alternativo para producir los anticuerpos de la invencion comprende las etapas de:

- construccion del repertorio VhCh humano; el repertorio humano se construye preferiblemente a partir de linfocitos B humanos, obtenidos de medula osea, ganglios linfaticos, bazo o sangre periferica de pacientes con carcinoma de ovario, pero que estan preferiblemente libres de la enfermedad en el momento de la construccion del repertorio o, como alternativa, de donantes sanos. El repertorio tambien puede generarse por sintesis.

- seleccion de una cadena pesada de anticuerpo humano que tiene la capacidad de unirse especificamente al receptor alfa de folato (FRa), realizandose dicha seleccion por seleccion guiada usando un fragmento de anticuerpo que comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1 como molde de guia sobre un repertorio VhCh humano, seguido por seleccion en celulas humanas que sobreexpresan aFR o en la proteina aFR soluble.

- expresion de un gen que codifica la cadena pesada de anticuerpo humano seleccionada junto con un gen que codifica la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1 en una celula hospedadora adecuada en condiciones que permiten el ensamblaje de dichas cadenas ligera y pesada.

En una realizacion, el gen que codifica la cadena pesada de anticuerpo humano seleccionada y el gen que codifica la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1 se expresan en la celula por un vector de expresion que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica la cadena pesada de anticuerpo humano seleccionada y la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1 unidas de forma funcional a senales reguladoras de la transcripcion.

[0071] En una realizacion alternativa, el gen que codifica la cadena pesada de anticuerpo humano seleccionada se expresa en la celula por un primer vector de expresion que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica la cadena pesada de anticuerpo humano seleccionado unida de forma funcional a senales reguladoras de la transcripcion y el gen que codifica la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1 en la celula se expresa por un segundo vector de expresion que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica la cadena ligera AFRA unida de forma funcional a senales reguladoras de la transcripcion.

[0072] Este metodo permite la seleccion de diferentes cadenas pesadas que crean dominios de union especificos para el receptor alfa de folato cuando se combinan con la cadena ligera AFRA. Se proporcionan detalles especificos de este tipo de metodo en los ejemplos a continuacion.

[0073] Un aspecto adicional de la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo o el fragmento de la invencion, en asociacion con un vehiculo farmaceuticamente aceptable. En dicha composicion, el anticuerpo o el fragmento del mismo puede conjugarse con un resto efector tal como un agente citotoxico, por ejemplo, un radionuclido tal como 131I, 90Y, 177Lu, 188Re o con una toxina, o con un agente quimioterapeutico o con un profarmaco o con una enzima, habitualmente usados unidos a anticuerpos. Puede usarse 99Tc en aplicaciones de diagnostico. 0074 * * * * *

[0074] La invencion tambien se refiere a un metodo para el diagnostico o la formacion de imagenes de carcinoma de

ovario o metastasis del mismo, que comprende, por ejemplo, poner en contacto un tejido, o una muestra del mismo,

de un sujeto con un anticuerpo o un fragmento de acuerdo con la invencion, estando dicho anticuerpo o fragmento

conjugado con un marcador adecuado tal como un radionuclido. El proceso de diagnostico o de formacion de

imagenes puede realizarse in vivo, donde la deteccion de union significativa del anticuerpo al tejido indica la

presencia de sobreexpresion de receptor alfa de folato, lo que sugiere transformacion maligna de las celulas. Como

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alternativa, el proceso de diagnostico o de formacion de imageries puede realizarse fuera del organismo, por ejemplo, in vitro, sobre una muestra biologica tal como una muestra tisular, obtenida del sujeto. En este ultimo caso, la comparacion del nivel de union de los anticuerpos o los fragmentos de la invencion con el nivel de union observado con una muestra de tejido normal se recomienda para justificar la deteccion de cualquier expresion apical de receptor alfa de folato en celulas normales no transformadas de dicho tejido.

[0075] Se ilustran diversos aspectos de la invencion en las figuras:

Figura 1: alineacion de las secuencias de aminoacidos de cadena ligera C4 (SEQ ID NO: 12) y AFRA (SEQ ID NO: 1). La cadena ligera AFRA comprende 218 aminoacidos, de los cuales los primeros 113 aminoacidos constituyen la region variable kappa, y los 105 aminoacidos restantes representan la region constante kappa. Las diferencias principales entre los anticuerpos C4 y AFRA recae en las CDR.

Figura 2: representacion esquematica del vector de expresion bicistronico DoB0134, adecuado para expresar Fab AFRA en E. coli. Este vector, que contiene las secuencias de acido nucleico que codifican la cadena ligera AFRA ilustrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 1) y la cadena pesada AFRA (que incluye una mutacion Q1N), contenida en E. coli, se deposito el 15 de marzo de 2006 en el CNCM con el numero de acceso CNCM I-3586. BW25113 A PyrC::Kan (lacq, rmBru, A lacZwuie, hsdR514, ArhaBA-DAH33, ArhaBADLD78-

Figura 3: (union BIAcore): determinacion de parametros de union de fragmentos de anticuerpo en el receptor alfa de folato. Para esto, se hicieron fluir varias concentraciones de monomero Fab (de 3 a 200 nM) en la celda del chip detector previamente recubierta con el receptor recombinante y se registro la union durante 30 minutos. Despues de este periodo de tiempo, se controlo el lavado durante otros veinte minutos. Para AFRA la Kd se determino en 43,9 nM con un Chi2 de 1,85 (panel A) mientras para C4 la Kd determinada fue 168 nM con un Chi2 de 2,19 (panel B). Figura 4 (dimerizacion natural): el Fab AFRA y C4 se redujeron levemente y se oxidaron suavemente para obtener dimeros naturales. Los productos de reaccion se analizaron por SDS-PAGE y los resultados se presentan en panel A superior para AFRA con su analisis de densitometria relativa, mientras que el panel B corresponde a C4. La generacion de la especie L2H se presenta en el dibujo del panel C.

Figura 5 (inmunohistoquimica): el anticuerpo monoclonal anti-CA125 se sondeo como control positivo interno en una biopsia humana correspondiente a un carcinoma de ovario (panel A). De la misma manera, se evaluo AFRA-DFM (0,5 ug/ml) en el mismo tejido (panel B). Ambos anticuerpos se estimaron por FITC y el fondo en el portaobjetos C. Figura 6 (biodistribucion de AFRA-DFM-131I): el Di-Fab-maleimida radiomarcado con 131I se inyecto iv en ratones que albergaban tumor. Los animales se sacrificaron 1,3, 6, 15, 24 y 48 horas despues de la inyeccion. Se aislo el tumor, sangre y organos predefinidos, se pesaron y se contaron para determinar la concentracion del AFRA-DFM. El resultado de la biodistribucion se presenta en la figura de abajo como el porcentaje de la dosis inyectada por gramo. Figura 7: secuencia de aminoacidos de la cadena ligera kappa AFRA (SEQ ID NO: 1) que muestra:

- la region variable (Vk) que se extiende entre los aminoacidos 1 a 113;

- regiones hipervariables confirmadas a partir de la estructura cristalina: CDR1 (aminoacidos 24 a 38), CDR2 (aminoacidos 54 a 60) y CDR3 (aminoacidos 93 a 102) (negrita, subrayado);

- region constante kappa (Ck) que se extiende entre los aminoacidos 114 a 219 (doble subrayado).

Figura 8: secuencia de aminoacidos de la cadena pesada (region variable) AFRA (SEQ ID NO: 2):

- region variable (Vk) que se extiende entre los aminoacidos 1 a 120;

- regiones hipervariables: CDR1 (aminoacidos 31-35), CDR2 (aminoacidos 50-66) y CDR3 (aminoacidos 99-110) (negrita, subrayado).

Figura 9: cadena pesada AFRA (region constante: IgG1 CH1) (SEQ ID NO: 8)

Figura 10: (receptor alfa de folato):

A: secuencia de aminoacidos del receptor alfa de folato (SEQ ID NO: 10):

- Secuencia senal: aminoacidos 1 a 24

- Secuencia receptora madura: aminoacidos 25 a 234

- Secuencia propep: aminoacidos 235 a 237, eliminada en la forma madura

- Sitios de glucosilacion: aminoacidos 69, 161 y 201.

B: receptor alfa de folato soluble recombinante con la marca de purificacion His6 (SEQ ID NO: 11).

Figura 11: eficacia in vivo de AFRA-DFM radiomarcado en tumores xenoinjertados en ratones a una dosis promedio de 1 mCi/raton. Barras negras: tumor de celulas A431 transfectadas con receptor alfa humano de folato (A431 FR). Barras sombreadas de forma diagonal: tumor de celulas A431 no transfectadas con receptor alfa humano de folato (A431). Barras abiertas: control.

Figura 12: localizacion in vivo despues de administracion i.p. El AFRA-DFM radiomarcado con 131I se inyecto i.p. (dosis promedio = 0,074 mCi/raton) en ratones que albergaban celulas tumorales IGROV1 que crecen i.p. Los animales se sacrificaron 1, 3, 6, 15 y 24 horas despues de la inyeccion. Se aislo el liquido ascitico, masas tumorales

i.p. solidas, sangre y organos predefinidos, se pesaron y se contaron para determinar la concentracion de la AFRA- DFM. El resultado de la biodistribucion se presenta como el porcentaje de la dosis inyectada por gramo.

Figura 13: eficacia in vivo de AFRA-DFM radiomarcado en celulas de cancer de ovario xenoinjertadas en ratones. A: supervivencia global de ratones a los que se ha inyectado i.p. celulas IGROV1, que sobreexpresan de forma natural

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el receptor alfa humano de folato, y tratados i.p. en el dia +2 con 1 mCi/raton de 131I-DFM AFRA o solucion salina (control). B: supervivencia global de ratones a los que se ha inyectado i.p. celulas OVCAR3, que sobreexpresan de forma natural el receptor alfa humano de folato, y tratados i.p. en el dia +2 o +4 con 1 mCi/raton de 131I-DFM-AFRA o solucion salina (control).

Ejemplos

1. Produccion de un fragmento Fab humano de alta afinidad especi'fico por el receptor alfa de folato

[0076] Se hicieron modificaciones significativas al fragmento C4 Fab apa obtener un fragmento Fab humano con caracteristicas de union mejoradas, incluyendo afinidad de union aumentada. Estas modificaciones se describen a continuacion:

a) Reordenamiento de cadena: seleccion de una cadena ligera kappa especi'fica para el receptor alfa de folato

[0077] Primero se decidio sustituir la cadena ligera lambda C4 con una kappa. La sustitucion de la cadena ligera Fab se realizo como se describe previamente para el fragmento C4 por seleccion guiada de presentacion en fagos (11).

[0078] Especificamente, se genero una biblioteca de cadenas ligeras kappa de anticuerpo (VkCk) a partir de linfocitos B humanos.

[0079] La biblioteca se obtuvo de ARNm combinado de linfocitos de sangre periferica obtenidos de cuatro mujeres que habian tenido previamente carcinoma de ovario, pero que estaban libres de enfermedad en el momento de la extraccion de la sangre. Las mujeres habian tenido un estado libre de enfermedad durante varios anos antes de la recogida de sangre. Tres de las mujeres habian tenido carcinoma de isotipo seroso, diagnosticadas en la fase III o IV de la enfermedad. La cuarta paciente habia tenido carcinoma de ovario de isotipo endometrioide, diagnosticado en fase III. Se recogieron entre 2,0 x 107 y 5,0 x 107 PBMC de cada paciente para la preparacion de la biblioteca. Cada familia de cadenas se habia amplificado por separado por pares de cebadores apropiados para compensar la eficacia especifica de PCR de acuerdo con la temperatura de hibridacion de los cebadores.

[0080] El repertorio VkCk unico asi obtenido no era un repertorio virgen, ya que las pacientes habian estado expuestas previamente a sobreexpresion del antigeno del receptor alfa de folato. Contenia potencialmente genes de anticuerpos desarrollados contra el tumor especifico y posiblemente contra el receptor alfa de folato expresado en mujeres con dicha enfermedad.

[0081] La biblioteca asi obtenida se uso para seleccionar una nueva cadena ligera compatible con la pesada C4. Como los inventores estaban buscando un fragmento de anticuerpo que compartiera la misma especificidad por el receptor alfa de folato que la molecula C4, se aplico un protocolo de seleccion guiada. Despues de tres pases de paneo sobre celulas de carcinoma de ovario (celulas OVCAR-3), usando la cadena pesada C4 como molde de guia para seleccionar una nueva cadena ligera kappa, se recogieron varios fagos de forma aleatoria y se evaluaron para su capacidad de union en estas celulas. El de mejor union se identifico y se llamo AFRA (anti receptor alfa de folato) y se secuencio su cadena ligera.

[0082] La secuencia de aminoacidos de la cadena ligera kappa seleccionada se presenta en la figura 1. AFRA y el fragmento C4 tiene la misma cadena pesada, con la excepcion de una mutacion Q1N introducida en el primer aminoacido de la cadena pesada AFRA, como se presenta en el ejemplo 1C.

b) Expresion de Fab en E. coli

[0083] Despues se prepararon construcciones de expresion adecuadas para la expresion del fragmento AFRA Fab y el fragmento C4 Fab en E. Coli: se clonaron los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de AFRA o C4 en fase con secuencias lider (lider de StlI derivado de la enterotoxina II termoestable de E. Coli) para dirigir la sintesis de fragmentos al compartimento periplasmico de Escherichia coli. El vector de expresion se diseno especialmente para fermentacion, que contiene una construccion bicistronica que codifica tanto la cadena ligera como la pesada bajo el control del promotor de arabinosa araP junto con un marcador de seleccion pyrC que codifica la dihidroorotasa (el casete de expresion basico se describe en la solicitud de patente europea Ep 05109274.0 presentada en nombre de Dompe S.p.a. el 6 de octubre de 2005 y en el documento WO 2007/039632). El vector bicistronico se diseno para que expresara un ligero exceso de la primera cadena (ligera), en comparacion con la expresion de la segunda cadena (pesada) porque en el presente caso, la cadena pesada, cuando se expresa en solitario puede ser toxica para Escherichia coli.

[0084] El vector que expresa AFRA se denomina DoB0134 (vease la figura 2) y se ha depositado en el CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, el 15 de marzo de 2006, en Escherichia coli cepa BW25113 A PyrC::Kan (lacq, rmBru, AlacZwji6, hsdR514, AaraBA-DAH33, ArhaBADLD7s-)) con el numero de acceso CNCM I-3586. Esta cepa expresa la cadena

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ligera AFRA con la modificacion N-terminal descrita en el Ejemplo 1c y una cadena pesada que incluye la region bisagra natural.

[0085] El vector de expresion DoB0134 se transformo en Escherichia coli y el fragmento de anticuerpo AFRA se expreso y se purifico. Con fines comparativos, se realizaron experimentos analogos usando la construccion correspondiente que expresa el C4 Fab conocido.

[0086] Durante la produccion de C4, se observo acumulacion significativa de homo dimero de cadena ligera (L2), que representa hasta un 50 % de la sintesis de proteina recombinante. Esto puede deberse parcialmente al diseno del vector de expresion que expresa un ligero exceso de la primera cadena, en comparacion con la expresion de la segunda cadena. Sin embargo, este vector de expresion se ha usado para producir varios Fab diferentes y nunca se ha observado produccion de homo dimero de cadena ligera con otras secuencias. Este homo dimero L2 es un subproducto inservible del microorganismo que representa una desventaja considerable en el proceso de produccion. De hecho, influye mucho sobre el metabolismo del hospedador, es dificil de separar del Fab' util, no tiene ninguna capacidad de union diana y se produce en lugar del fragmento deseado.

[0087] Por el contrario, el AFRA Fab de la invencion no produce ningun homo dimero detectable de cadena ligera a partir del mismo vector de expresion y a partir de la misma cepa de Escherichia coli. Por lo tanto, el rendimiento de produccion global se aumenta artificialmente y se reducen fuertemente las capacidades de la columna cromatografica ya que no hay competicion por la union a la resina entre el fragmento Fab' de interes y el homo dimero de cadena ligera.

[0088] Se evaluo la especificidad del AFRA Fab usando FACS. Se registro desplazamiento de la fluorescencia solamente con celulas que expresaban el receptor alfa humano de folato.

c) Modificacion del AFRA con mutacion Q1N N-terminal:

[0089] Como resultado del protocolo de seleccion guiada inicial usando la cadena pesada de C4 como molde de guia, AFRA y el fragmento C4 originalmente tenian la misma cadena pesada, cuyo primer aminoacido era una glutamina. Sin embargo, se sabe que la glutamina en esta posicion puede estar sometida a conversion en un acido piroglutamico(19) que genera heterogeneidad de producto. La glutamina N-terminal, por lo tanto, se sustituyo con asparagina usando mutagenesis dirigida al sitio. Dicho reemplazo reduce la longitud de la cadena lateral del aminoacido en un carbono, evitando su ciclacion. Se realizo una mutagenesis dirigida al sitio para modificar el codon de triplete de ADN correspondiente al primer aminoacido de la cadena pesada AFRA y convertirlo en el resto de asparagina deseado.

[0090] La mutacion dirigida al sitio se confirmo secuenciando el gen completo para verificar que, con la excepcion de esta mutacion, no se habian insertado otras mutaciones inesperadas durante la amplificacion por PCR. La proteina correspondiente se produjo y purifico hasta homogeneidad. Este analisis de HPLC en fase inversa en el tiempo sobre una columna de difenilo revelo un unico pico a cualquier pH correspondiente a una especie unica. Esto se confirmo por analisis de masas por electronebulizacion donde el peso molecular de AFRA estaba de acuerdo con el calculado a partir de su estructura primaria.

2. Caracteristicas de union del fragmento AFRA Fab al receptor alfa humano de folato:

[0091] Se evaluo el nuevo fragmento Fab humano AFRA para su capacidad de unirse al receptor alfa humano de folato y se comparo su union a la union de C4. Se realizo el analisis cinetico por resonancia de plasmon con equipo BIAcore (Pharmacia) usando receptor alfa humano de folato recombinante soluble como proteina diana (vease la figura 8).

a) Purificacion de la isoforma alfa soluble del receptor de folato (aFR)

[0092] Se construyo una linea celular de ovario de hamster chino (CHO-K1) que expresaba la isoforma alfa del receptor de folato (aFR). Para facilitar la purificacion, se subclono el gen de aFR soluble en el vector de expresion pIRESneo para expresar la isoforma alfa marcada con His soluble de la glucoproteina receptora de folato.

Para generar una proteina soluble y por la tecnica de PCR usando pares de cebadores oportunos, se diseno una forma acortada de aFR, que termina en la posicion del aminoacido 234, para eliminar la parte carboxi-terminal del receptor que mediaba el anclaje de la proteina a la membrana plasmatica (anclaje GPI).

[0093] Los cebadores de PCR se disenaron para que poseyeran el sitio de restriccion, la mitad de EcoRV en el cebador directo y EcoRI en el cebador inverso, que son compatibles con los sitios de restriccion de clonacion multiple del vector pIRES-neo. Los productos de PCR se purificaron usando el kit de extraccion de gel Quiaex (Quiagen) y se digirieron con EcoRI. Despues, los productos de digestion se purificaron y ligaron durante una noche al vector pIRES-neo digerido con EcoRI y EcoRV y desfosforilado usando el sistema de ligamiento T4 (Biolabs). Las muestras ligadas se transformaron en Escherichia coli DH5a y se sembraron en las placas de LB-agar ampicilina.

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[0094] Se recogieron varias colonias ampR y se comprobaron usando la tecnica de PCR. Se selecciono un clon que mostraba el patron correcto para la extraccion de ADN y estudios de expresion. La secuencia de ADN del vector de expresion se confirmo usando secuenciacion automatica.

[0095] El vector de expresion entonces se transfecto en celulas CHO y se seleccionaron los clones estables a traves de resistencia a neomicina. Entre ellos, el mejor clon productor se confirmo por analisis de transferencia de Western del sobrenadante de cultivo y la produccion se aumento en escala hasta 1 litro. El sobrenadante de cultivo se aclaro por centrifugacion a 10 000 x g durante 15 min para separar el sobrenadante de las celulas y se filtro a 0,22 pm y se realizo la purificacion a 4 °C mientras todos los tampones contenian Tween-20 al 0,05 %.

[0096] La proteina receptora de folato se purifico del sobrenadante del siguiente modo. En la primera etapa, se concentro la glucoproteina marcada con His con cromatografia de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) usando Sepharose Fast Flow quelante de Ni++ cargada (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) segun se describe. El sobrenadante de cultivo de celulas CHO se aplico a la columna preequilibrada con fosfato 20 mM, NaCl 0,15 M pH 7,0 al caudal de 5 ml/min. Despues de todo, el sobrenadante se aplico a la columna, que se lavo con el tampon de inicio hasta que la A280 nm en el eluyente volvio a la medida inicial. La proteina se eluyo con el mismo tampon que contenia 0,5 M de imidazol. El pico de A280 nm se recogio para la siguiente etapa. En este punto, la molecula de folato endogena se disocio del aFR disminuyendo el pH hasta 3,0 por adicion gota a gota de HCl 1 M y se agito en un bano de hielo durante 1 h. A continuacion, la muestra se sometio a intercambio de tampon en una columna G-25 Sephadex (HiPrep 26/10 desalting Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) con fosfato 20 mM, NaCl 0,15 M pH 7,0. Finalmente, la muestra se paso lentamente (0,5 ml/min) a traves de una columna de 2 ml de acido folico-Sepharose (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) equilibrada con 5 CV de fosfato 20 mM, NaCl 0,15 M pH 7,0. El flujo directo se recogio para el analisis. Despues de lavar la columna con el tampon de equilibrado, el aFR se eluyo de la resina de afinidad con glicina 0,1 M, NaCl 0,5 M pH 2,8.

[0097] Las fracciones se recogieron en un tubo de ensayo de polipropileno que contenia 50 ml de fosfato sodico 1 M pH 7,0 para elevar el pH del eluyente hasta 7,0. La pureza del aFR en esta preparacion se determino por electroforesis en gel de SDS (15 %) poliacrilamida (PAGE) en condiciones no reductoras de acuerdo con el metodo de Laemmli (13) y el gel se tino para las proteinas con azul brillante de Coomassie. Las fracciones que parecian un 100 % puras se combinaron y se sometieron a una determinacion de concentracion de proteinas usando el kit de ensayo de proteinas DC (Bio-Rad Richmond, CA) usando BSA como patron (14). El aFR purificado se almaceno a -25 °C en pequenas alicuotas.

b) Medicion de afinidad

[0098] La proteina diana se recubrio sobre un chip detector C5 BIAcore y se usaron varias concentraciones de ambos fragmentos de anticuerpo para determinar la cinetica de union. En particular, el FR recombinante se unio covalentemente a un chip detector CM5 usando el kit de acoplamiento de amina (Pharmacia) con una concentracion de antigeno de 0,6 pl en acetato de sodio 10 mM, pH 4,8 produciendo una superficie de 280 UR. Los grupos activados residuales se bloquearon por inyeccion de 35 pl de etanolamina (1,0 M pH 8,5). Las constantes de velocidad de disociacion cinetica aparentes (Koff) se calcularon en condiciones de saturacion de anticuerpo de 200 nM a 3.125 nM, con un caudal de tampon de 50 pl/min usando el programa asistente. La evaluacion se realizo durante al menos 30 minutos. Posteriormente, se realizo el desprendimiento del anticuerpo residual unido al chip detector con tampon glicina 100 mM pH 2,7.

[0099] Las afinidades respectivas se dedujeron a partir de las curvas de union. Tanto C4 como AFRA fueron capaces de unirse al antigeno inmovilizado. Sin embargo, la Kd calculada (43,9 nM) de AFRA fue mas de 3 veces inferior a la de C4 (168 nM), lo que indica una mayor afinidad. Los resultados se presentan en la figura 3. La cinetica de union del monomero AFRA muestra una velocidad de asociacion muy elevada pero tambien una constante de disociacion elevada, que a veces puede ser una desventaja para un anticuerpo destinado a radioinmunoterapia, ya que, una vez que el anticuerpo se une al tumor, su efecto de larga duracion es esencial para una eficaz irradiacion del tumor.

3. Produccion de di'mero natural F(ab')2 y caracteristicas de union in vitro de F(ab')2 a) dimerizacion natural

[0100] Para ralentizar la velocidad de disociacion de AFRA Fab, y para aumentar adicionalmente la avidez del fragmento, se decidio dimerizar el fragmento Fab. Para hacerlo, se anadio el pentapeptido DKTSC, correspondiente a la secuencia bisagra natural de la familia de Gamma1 humana, al extremo carboxi-terminal de ambas cadenas pesadas AFRA y C4, dando lugar a un fragmento denominado Fab' (es decir, Fab con una cisteina libre adicional en el extremo carboxi-terminal que pertenece a la region bisagra). A partir de este formato Fab' entonces fue posible obtener un dimero F(ab')2 por la oxidacion natural del resto de cisteina libre intencionadamente anadido al extremo carboxi-terminal de la cadena pesada del anticuerpo(20) y correspondiente a la primera cisteina de la region bisagra del anticuerpo de longitud completa natural.

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[0101] Ambos fragmentos AFRA y C4 se incubaron en TCEP (clorhidrato de Tris(2-carboxietil)fosfina) en condiciones suaves para reducir la cistefna de la cadena pesada carboxi-terminal, se intercambio el tampon para eliminar el agente reductor y se ajusto el pH a 8, en el que se sabe que esta qufmicamente favorecida la formacion de enlace disulfuro.

[0102] Los dfmeros se separaron de la mezcla de reaccion por cromatograffa de filtracion en gel donde se resolvieron como un pico unico. El analisis de SDS-PAGE revelo que las preparaciones de dfmero no eran tan homologas como las que se esperarfan y los picos originaban varias bandas en el gel:

- Para el fragmento AFRA la banda principal, que representa un 80 % del material, migraba como se esperaba en el intervalo de 100 kDa y se asigno al dfmero AFRA. Otra banda, que representa un 16 % del material completo, con un peso molecular aparente de 75 kDa podfa detectarse y se atribuyo a un "dfmero" compuesto de un monomero normal unido covalentemente a otra cadena ligera Fab (L2H). Este "dfmero" se producfa por el ataque inusual de la cistefna carboxi-terminal del primer monomero en la cistefna carboxi-terminal de la cadena ligera de un segundo monomero Fab. Esta cistefna de la cadena ligera es el normalmente implicado en el enlace disulfuro con la cadena pesada y, por lo tanto, no puede estar disponible para la formacion de ningun otro enlace disulfuro. Como en el dfmero resultante la cadena pesada Fab ya no esta unida covalentemente al resto de la molecula, y solamente interactua a traves de interacciones de Van der Waals e hidrofobas con la cadena ligera, esta entidad eluye como un dfmero normal durante la purificacion de filtracion en gel que se ejecuta en condiciones nativas, pero se resuelve como dos bandas durante el analisis de SDS-PAGE donde la concentracion de detergente (SDS) es suficiente para descomponer la molecula (figura 4). De hecho, en este carril, junto con L2H, puede detectarse otra banda correspondiente a la cadena pesada no unida covalentemente extrafda del dfmero sucedaneo en la parte inferior del gel y representa un 4 % del material global.

- En el caso del C4 Fab, la situacion fue sorprendentemente incluso peor, ya que esta vez en SDS-PAGE la banda principal (un 43 % del material completo) correspondfa al compuesto L2H o, en otras palabras, la impureza de la reaccion AFRA ahora se habfa convertido en el producto mas abundante de la reaccion de dimerizacion de C4. El dfmero unido covalentemente representaba solamente un 29 % del material completo y la cadena pesada separada en SDS un 25 % de la mezcla.

Este analisis se confirma adicionalmente por investigacion de CL de masas que era capaz de identificar de forma inequfvoca todas las especies presentes en el material obtenido despues de la purificacion de filtracion en gel.

En condiciones acuosas nativas, las diferencias en el comportamiento cromatografico entre el dfmero correcto y la impureza, correspondiente al "dfmero" con la cadena pesada no unida covalentemente, pueden usarse para separar las dos especies. Los inventores intentaron de forma insatisfactoria separar ambas especies por cromatograffa de intercambio ionico o interacciones hidrofobas para intentar obtener un dfmero puro. Los inventores tambien intentaron, sin exito, eliminar la impureza del dfmero por desnaturalizacion termica selectiva.

b) ELISA: union directa al receptor alfa de folato de F(ab')2

[0103] Despues se ensayaron los dos dfmeros F(ab')2 para la union, en un formato ELISA, directamente en una lfnea celular A431 transfectada con el receptor alfa humano de folato, y en lfneas de carcinoma de ovario humano OVCAR3 y celulas IGROVI.

[0104] Se sembraron 4 x 104 celulas (lfneas celulares de carcinoma de ovario humano OVCAR3 e IGROVI (una aportacion del Dr. J. Benard, lnstitut Gustave Roussy, Villejuif, Francia) y celulas A431-FR(17) que son celulas de carcinoma epidermoide humano transfectadas con receptor alfa de folato) en cada pocillo de una placa de formato de 96 pocillos, y se cultivaron hasta que se obtuvo una monocapa confluyente. Las celulas se fijaron, durante 5 minutos, a temperatura ambiente con glutaraldehfdo al 0,1 % en PBS. Las placas se lavaron dos veces con PBS, despues una vez (5 minutos) con glicina 0,1 M en PBS + NaN3 al 0,02 %, sucesivamente cinco veces con PBS y finalmente con PBS que contenfa BSA al 1 % y NaN3 al 0,02 %.

Se permitio que las diluciones en serie de los fragmentos de anticuerpo (C4 o AFRA) se unieran durante 1 hora a temperatura ambiente en PBS + BSA al 0,03 % y se lavaron tres veces con PBS.

Se uso un anticuerpo anti-IgG humana (especffico de Fab, Sigma) conjugado con peroxidasa diluido 1:1000 en PBS + BSA al 0,03 % para revelar la union de los fragmentos de anticuerpo. La placa ELISA se revelo con la adicion de 100 pl de solucion TMB (Sigma) durante 30 minutos a temperatura ambiente, se detuvo por la adicion de 50 pl de solucion H2SO4 (1 M) y se leyo a 450 nm. 0105 * * * * * *

[0105] Como no pudo detectarse ninguna senal en las celulas simuladas A431 que son celulas transfectadas con el

vector vacfo, en comparacion con las celulas transfectadas con FR-alfa, ambos anticuerpos AFRA y C4 se

consideraron especfficos para el receptor alfa de folato. Ambos fragmentos mostraron casi las mismas afinidades

globales en el intervalo nanomolar bajo, potencias compatibles con un uso en radioinmunoterapia (observese, sin

embargo, que el C4 F(ab')2 esta tan altamente contaminado con el pseudodfmero L2H que sus usos practicos,

particularmente en radioinmunoterapia, no son factibles). La tabla I presenta la determinacion por ELISA de los valores Kd de F(ab')2 de fragmentos de anticuerpos C4 y AFRA. La Kd se determino como la concentracion a la que

se obtiene la mitad de la senal estable de ELISA.

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TABLA I

F(ab')2

Kd (nM)

OVCAR3

A431-FR IGROV1

C4

11 ± 2 1,2 ± 0,1 118 ± 64

AFRA

26 ± 10 2,5 ± 0,7 57 ± 21

4. Dimerizacion qui'mica de Fab' y caracteristica de union in vivo:

[0106] Se realizaron ensayos in vivo para verificar la especificidad y localizacion tumoral. Sin embargo, in vivo, el puente disulfuro que mantiene juntas las dos mitades de la molecula F(ab')2 se hidroliza rapidamente y el F(ab')2 se reconvierte rapidamente en un fragmento Fab y se elimina del torrente sanguineo. La dimerizacion quimica, como se describe a continuacion, se realiza, por lo tanto, para mantener el formato F(ab')2 in vivo.

a) Dimerizacion del factor Fab' con bismaleimida (BMOE)

[0107] Para conservar el formato F(ab')2 in vivo, se uso un conector hidrolizable que conecta los dos Fab' que forman el F(ab')2(21). Mas especificamente, se identifico un conector de bismaleimida etano (BMOE) para dimerizar el fragmento Fab'(22) en un Di Fab maleimida (DFM). Ambos fragmentos AFRA y C4 Fab se sometieron a este tratamiento y se ensayaron en un experimento de biodistribucion in vivo para identificar el mejor candidato para desarrollo clinico.

[0108] La dimerizacion quimica de Fab' en DFM ya se ha informado en la bibliografia. Esta reaccion quimica se basa en la capacidad unica de los restos de cisteina de reaccionar especificamente con el heterociclo maleimida. La reaccion quimica da lugar a la formacion de un enlace quimico entre los restos de cisteina y la maleimida. En el presente caso, la cisteina libre unica en la proteina Fab' estaba en el extremo carboxi-terminal de la cadena pesada de Fab'. Por lo tanto, el ataque de maleimida era especifico de sitio y en el lado opuesto del sitio de union al receptor de folato.

[0109] La proteina se incubo con 70 moles de TCEP (clorhidrato de Tris(2-carboxietil fosfina)) por mol de Fab' durante 5 horas a temperatura ambiente para reducir el resto de cisteina carboxi-terminal de la cadena pesada. El TCEP se elimino por cromatografia de desalacion HiPrep 26/10 (General Electrics) previamente equilibrada en MES 40 mM pH 6,0. La proteina se concentro hasta 8 mg/ml y se incubo con agitacion suave a TA durante 2,5 horas para permitir que el enlace disulfuro presente entre las cadenas Fab se reoxide. La cinetica de la reaccion se controlo por analisis de RP-HPLC. El conector BMOE (Sigma) se anadio a la solucion de proteina (1 mg/ml en DMSO) en una relacion molar de 0,35 conector/proteina y se incubo durante 16 horas a temperatura ambiente con agitacion suave.

[0110] Para eliminar el F(ab')2 natural, la mezcla de reaccion se redujo de nuevo con 70 moles de TCEP por mol de Fab' durante 3,5 horas a temperatura ambiente. El dimero se purifico en columna HiPrep Sephacryl S100 HR, previamente equilibrada con mEs 40 mM pH 6,0. La proteina se analizo por SDS-PAGE y se cuantifico por Bradford.

[0111] Con esta estrategia se obtuvo AFRA-DFM con casi la misma cantidad de impureza L2H. Sorprendentemente, sin embargo, fue practicamente imposible obtener ningun C4-DFM correcto. Se estimo, por filtracion en gel despues de reduccion de disulfuro para desprenderse del dimero "natural", que solamente un 4 % de las moleculas C4 reacciona con el conector para formar el DFM. El protocolo se repitio varias veces con el C4 Fab' y se usaron diferentes condiciones, pero los inventores nunca consiguieron obtener concentraciones mayores de dimero. La reaccion se siguio etapa por etapa por analisis de masas y se demostro que la reaccion no continuaba despues de la adicion de una molecula BMOE en el Fab'. El conector probablemente estaba reaccionando de una manera inesperada, probablemente debido a la cadena ligera lambda de C4 que constituye la unica diferencia entre los fragmentos AFRA y C4 Fab. Por el contrario, en las mismas condiciones siempre se observo dimerizacion para el resto AFRA (tabla II). 0112

TABLA II

Fragmento de anticuerpo

% global de dimerizacion Porcentaje de producto del pico de dimero analizado oor SDS-PAGE

PM alto

Dimero L2H2 L2H 60 kDa Fab' Cadena libre H

F(ab')2-C4

65 - 29 43 - - 25

F(ab')2-AFRA

61 - 80 16 - - 4

DFM-C4

4 3 34 17 17 14 15

DFM-AFRA

44 10 48 17 - 17 8

[0112] A partir de esta tabla puede observarse que con C4 puede caracterizarse un producto inesperado a 60 kDa, pero que el resto de la reaccion de dimerizacion da lugar a casi los mismos productos en las mismas cantidades. Puede observarse una diferencia significativa entre AFRA y C4 con respecto al porcentaje de dimero obtenido al final de la reaccion con mas de un factor 10 entre las dos moleculas a favor de AFRA.

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b) Ensayo de inmunohistoquimica en muestras de biopsia

[0113] Los ensayos presentados anteriormente se realizaron in vitro sobre celulas transfectadas o lineas celulares de carcinoma de ovario. Sin embargo, las diferentes lineas celulares pueden expresar cada una diferentes cantidades y diferentes variantes de glucosilacion del receptor. Por lo tanto, es importante ensayar los dimeros Fab en un contexto in vivo. Se ensayo AFRA en un ensayo de inmunohistoquimica para su capacidad de reconocer in situ el receptor alfa de folato expresado a partir de un carcinoma de ovario.

[0114] El dimero AFRA-DFM se marco con FITC in vitro, y se prepararon muestras de biopsia para la tincion. Especificamente, se cortaron secciones congeladas de muestras de biopsia, de 5 mm de grosor, se secaron y se fijaron en acetona fria durante 5 minutos. El exceso de acetona se elimino lavando los portaobjetos en PBS (pH 7,4) y despues secando al aire. Las secciones de criostato se bloquearon con BSA al 3 %, suero humano al 10 % en leche desnatada al 3 % durante 60 minutos a temperatura ambiente. El fragmento de anticuerpo DFM-AFRA marcado con FITC se incubo primero, durante una noche a 4 °C, a tres diluciones diferentes.

[0115] Se realizo lavado con tampon de autotincion. Se anadio un mAb anti-FITC (de conejo, dilucion 1:200) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron sucesivamente con un tampon de autotincion. Despues, se anadio un mAb de cerdo anti-Ig de conejo, conjugado con fosfatasa alcalina (dilucion 1:80) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron con un tampon de autotincion. Sucesivamente, se anadio tampon Red (proporcionado por Vector), se lavo, y el ultimo lavado se hizo en agua destilada. Se anadio hematoxilina, durante 15 segundos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron en agua corriente, se deshidrataron, se aclararon y se montaron para la observacion en microscopio.

[0116] AFRA-DFM de nuevo fue capaz de localizarse en el area tumoral y no tenir ningun tejido sano adyacente (figura 5), lo que confirma la especificidad del dimero AFRA-DFM en un contexto in vivo.

c) Biodistribucion in vivo

[0117] Habiendo demostrado la especificidad de AFRA-DFM, se realizo un experimento de biodistribucion. Para este objetivo, la macromolecula se radiomarco con yodo131 por los tubos de yodacion recubiertos previamente con yodogen usando el metodo de Chizzonite, esencialmente como se describe por el fabricante (Pierce) usando reactivos de calidad clinica libres de pirogenos(17). El metodo de Chizzonite posibilita conservar mejor la integridad de la funcionalidad de la molecula; de hecho, el producto radiomarcado final, a una actividad especifica de 5 mCi/mg, mostro una inmunorreactividad media de al menos un 65 %. El AFRA-DFM marcado con 131I se inyecto en sangre animal.

[0118] En varios momentos predeterminados despues de la inyeccion se sacrificaron los animales, se aislaron los organos, se pesaron y se contaron para determinar la cinetica de la acumulacion de radiactividad y la eliminacion en cada uno de ellos. Los tejidos normales se usaron como referencias frente al tumor que se habia implantado previamente bajo la piel del animal.

[0119] Mas especificamente, se obtuvieron ratones CD1 nu/nu (atimicos) hembra a las 5-6 semanas de edad de Charles River Laboratories (Calco, Italia). Despues de 1 semana de aclimatacion, los ratones se xenoinjertaron por via subcutanea con 3,4 x 106 celulas A431 transfectadas con el receptor alfa humano de folato o con celulas A431t simuladas en 0,1 mL de NaCl al 0,9 %. De dos a tres semanas despues de la inyeccion de las celulas tumorales, los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos y se les inyecto por via intravenosa en la vena lateral de la cola el fragmento de anticuerpo radiomarcado (31I-DFM-AFRA5.3). El experimento se realizo con este radioisotopo y los detalles se presentan en la tabla III a continuacion:

Tabla III

Tumor xenoinjertado examinado

A431 FR

Tamano del grupo por tiempo

4

Actividad especifica (mCi/mg)

5,0

Dosis inyectada total (pCi)/animal

30,0

Dosis inyectada total (pg)/animal

6,0

Puntos temporales evaluados d.i. para biodistribucion (h)

1,3, 6, 15, 24, 48

Puntos temporales evaluados d.i. para farmacocinetica (h)

10 min, 30 min, 1,3, 6, 15, 24, 48

d) Radiolocalizacion

[0120] Despues de la diseccion, los tumores y otros tejidos/organos (bazo, rinon, higado, vejiga con orina, esternon, corazon y musculo) se recogieron y se pesaron en humedo. Se evaluo la radiactividad asociada con cada tejido con un contador gamma con patrones internos (5 y 10 pl de la solucion inyectada).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

[0121] Los resultados se presentan en la figura 6 y se expresan como el porcentaje de la dosis inyectad por gramo de tejido (% ID/g) y se compensan para la extincion de la radiactividad. De esta manera, la normalizacion permite la comparacion directa de organos o de animales. Para radioinmunoterapia, la molecula ideal tendra una alta acumulacion con un tiempo duradero en el tumor y el fondo mas bajo posible en tejidos sanos.

[0122] El resultado de este experimento de biodistribucion demuestra que AFRA-DFM se acumula especificamente en el tumor. Los valores elevados correspondientes a vejiga y a orina se corresponden bien con la excrecion esperada de DFM y validan la ruta de desintoxicacion. Como se esperaba, DFM se acumula en el tumor donde, seis horas despues de la inyeccion, su concentracion empieza a ser superior a la concentracion medida en otros organos.

Demostracion preliminar de la eficacia in vivo de AFRA-DFM radiomarcado

[0123] Habiendo demostrado que el fragmento de anticuerpo radiomarcado 0128 * * 131I-DFM-AFRA se acumulaba especificamente en el tumor que expresa de forma ectopica FR (A431FR), se evaluo su capacidad de controlar el crecimiento del tumor. La dosis inyectada total se definio de acuerdo con la farmacocinetica.

[0124] La macromolecula se radiomarco con yodo131 y se inyecto en el torrente sanguineo en animales que albergaban celulas tumorales implantadas por via subcutanea.

[0125] Mas especificamente, se obtuvieron ratones CD1 nu/nu (atimicos) hembra a las 7 semanas de edad de Charles River Laboratories (Calco, Italia). Despues de una semana de aclimatacion, los ratones se xenoinjertaron por via subcutanea con 3,5 x 106 celulas A431 transfectadas con receptor alfa humano de folato (A431 FR) o con celulas A431t simuladas en 0,1 mL de NaCl (solucion salina) al 0,9 %. Una semana despues de la inyeccion de las celulas tumorales, los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos y se les inyecto por via intravenosa en la vena lateral de la cola 0,3 mL del AFRA-DFM radiomarcado en solucion salina o solucion salina solamente como control. El crecimiento del tumor se controlo cada 2-3 dias y se midio por un calibre; el volumen del tumor se determino de la siguiente manera: D x d2 x 1/6 x n donde D = diametro mayor, d = diametro menor. Se realizaron tres experimentos independientes y los detalles se presentan en la tabla IV a continuacion:

Tabla IV

Tumor xenoinjertado examinado

A431 FR y A431 simulado

Numero de experimentos independientes

3

Tamano del grupo por tratamiento

6-7

Actividad especifica media (mCi/mg)

4,87 ± 0,57

Dosis radiactiva inyectada total (pCi)/animal

1002±80

Proteina inyectada total (pg)/animal

211 ± 35

[0126] Los resultados se presentan en la figura 11 y se expresan como el porcentaje de crecimiento del tumor respecto al control tratado con solucion salina solamente. El AFRA-DFM radiomarcado con 131I se inyecto en ratones que albergaban tumor a una dosis promedio de 1 mCi/raton. El crecimiento del tumor se controlo cada 2-3 dias despues de la inyeccion. Los resultados del retardo del crecimiento del tumor, registrados en tres experimentos independientes, se presentan en la figura 11 como el porcentaje medio de crecimiento del tumor respecto al control respectivo. En cada experimento, se comparo el volumen medio en cada grupo tratado, es decir, A431 FR o A431 simulado, con el volumen medio del grupo de control respectivo. Los resultados de estos experimentos de eficacia demuestran que AFRA-DFM radiomarcado retarda especificamente el crecimiento de los tumores que expresan el antigeno diana de interes (A431 FR) pero no de tumores irrelevantes (A431 simulado) y que el porcentaje de reduccion del tumor era significativo tanto a los 11 como a los 16 dias despues del tratamiento (p=0,006 y p=0,05, respectivamente).

Localizacion de AFRA-DFM radiomarcado en celulas de carcinoma de ovario que crecen como tumores i.p.

[0127] Habiendo demostrado que el fragmento de anticuerpo radiomarcado 131I-DFM-AFRA despues de inyeccion i.v., era capaz de acumularse especificamente y controlar el crecimiento del tumor que expresa de forma ectopica FR (A431 FR), se evaluo su capacidad de localizarse en celulas de carcinoma de ovario, que sobreexpresan de forma natural el receptor de folato. Se inyecto 131I-DFM-AFRA en la cavidad peritoneal en animales que albergaban celulas de carcinoma de ovario implantadas por via intraperitoneal, un modelo que imita el crecimiento natural y la diseminacion del cancer epitelial de ovario humano.

[0128] Mas especificamente, se obtuvieron ratones CD1 nu/nu (atimicos) hembra a las 7 semanas de edad de

Charles River Laboratories (Calco, Italia). Despues de 1 semana de aclimatacion, los ratones se xenoinjertaron por via intraperitoneal con 8-10 x 106 celulas IGROV1, que sobreexpresan el receptor alfa humano de folato, en 0,3 mL

de NaCl (solucion salina) al 0,9 %. Cuando llega a ser evidente la formacion de liquido ascitico (14-20 dias despues de la inyeccion de celulas tumorales), se administro AFRA-DFM radiomarcado por via intraperitoneal en 0,3 mL de

solucion salina, los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos y diferentes puntos temporales, se recogio el

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

liquido ascitico, las masas tumorales solidas, el crecimiento adherente al peritoneo y otros tejidos/organos (sangre, rinones, higado y musculo) y se pesaron en humedo. El liquido ascitico se centrifugo, las celulas tumorales asciticas sedimentadas se separaron del liquido y se contaron por separado. Se evaluo la radiactividad asociada con cada tejido con un contador gamma con patrones internos (5 y 10 gl de la solucion inyectada). Se realizaron tres experimentos independientes y los detalles se presentan en la tabla V a continuacion:

Tabla V

Tumor xenoinjertado examinado

IGROV1

Numero de experimentos independientes

3

Tamano del grupo por tiempo

3-4

Intervalo de actividad especifica (mCi/mg)

3,9-9,7

Dosis radiactiva inyectada total gCi/animal (intervalo)

30-158

Proteina inyectada total gg/animal (intervalo)

3,6-40

Puntos temporales evaluados para biodistribucion (h)

1,3, 6, 15, 24

[0129] Los resultados se presentan en la figura 12 y se expresan como el porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido (% ID/g) y se compensan para la extincion de la radiactividad. De esta manera, la normalizacion permite la comparacion directa de organos o animales. Los resultados de estos experimentos demuestran que AFRA-DFM radiomarcado se unfa especificamente a la superficie de celulas de cancer de ovario presentes en el liquido ascitico (IGROV1) y que AFRA-DFM radiomarcado persistia sobre la superficie celular y masas de tumores solidos durante hasta 15 horas.

Eficacia de AFRA-DFM radiomarcado contra celulas de carcinoma de ovario que crecen como tumores i.p.

[0130] Habiendo demostrado que 131I-DFM-AFRA era capaz de acumularse especificamente en tumores que expresan de forma natural FR ((IGROV1) despues de administracion i.p., se evaluo su capacidad de controlar la diseminacion tumoral intraperitoneal de carcinoma de ovario. Se inyecto 131I-DFM-AFRA en la cavidad peritoneal en animales que albergaban celulas de carcinoma de ovario intraperitoneal implantadas 2-4 dias antes de la administracion del fragmento de anticuerpo.

[0131] Mas especificamente, se obtuvieron ratones CD1 nu/nu (atimicos) hembra a las 7 semanas de edad de Charles River Laboratories (Calco, Italia). Despues de 1 semana de aclimatacion, los ratones se xenoinjertaron por via intraperitoneal con 8-10 x 106 celulas de carcinoma de ovario, que sobreexpresan el receptor alfa humano de folato (IGROV1 u OVCAR3) en 0,3 mL de NaCl (solucion salina) al 0,9 %. De 2 a 4 dias despues de la inyeccion de celulas tumorales, los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos y se les inyecto por via intraperitoneal en la cola 0,3 mL del AFRA-DFM radiomarcado en solucion salina o solucion salina solamente como control. Se controlo el crecimiento del tumor cada 2-3 dias, se peso y se controlo para la formacion de liquido ascitico o desarrollo de masas solidas i.p.. Se registro la supervivencia del animal. Se realizaron dos experimentos independientes y los detalles se presentan en la tabla VI a continuacion:

Tabla VI

Tumor xenoinjertado examinado

IGROV1 u OVCAR3

Numero de experimentos independientes

2

Tamano del grupo por tratamiento

8-9

Actividad especifica media (mCi/mg)

4.3

Dosis radiactiva inyectada total (gCi/animal)

1,004

Proteina inyectada total (gg/animal)

250

[0132] Los resultados se presentan en la figura 13 y se expresan como curvas de supervivencia. El aumento en la supervivencia se evaluo por ensayo de rango logaritmico. Los resultados de estos experimentos demuestran que AFRA-DFM radiomarcado, cuando se inyecta hasta 4 dias despues del implante del tumor en la cavidad peritoneal, era capaz de retardar significativamente el crecimiento del tumor y por consiguiente de prolongar la supervivencia del animal en ambos modelos de tumor ortotopico (p=0,0014 y p<0.0001 en modelos IGROV1 y OVCAR3, respectivamente).

Bibliografia

[0133]

1 Jemal A, Murray T, Ward E, et al. Cancer statistics, 2005. CA Cancer J Clin 2005;55:10-30.

2 Cannistra SA. Cancer of the ovary. N Engl J Med 2004; 351:2519-29.

3 Harries M, Gore M. Part I: chemotherapy for epithelial ovarian cancer-treatment at first diagnosis. Lancet Oncol 2002; 3:529-36.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

4 Vasey PA. Resistance to chemotherapy in advanced ovarian cancer: mechanisms and current strategies. Br J Cancer 2003;89 SupI. 3:S23-S28.

5 Bast RC Jr, Klug TL, St John E, Jenison E, Niloff JM, Lazarus H, Berkowitz RS, Leavitt T, Griffiths CT, Parker L, Zurawski VR Jr, Knapp RC. A radioimmunoassay using a monoclonal antibody to monitor the course of epithelial ovarian cancer. N Engl J Med. 13 de octubre de 1983; 309(15):883-7.

6 Lavin PT, Knapp RC, Malkasian G, Whitney CW, Berek JO, Bast RC Jr. CA 125 for the monitoring of ovarian carcinoma during primary therapy. Obstet Gynecol. Febrero de 1987; 69(2):223-7.

7 Miotti S, Canevari S, Menard S, Mezzanzanica D, Porro G, Pupa SM, Regazzoni M, Tagliabue E, Colnaghi Ml. Characterization of human ovarian carcinoma-associated antigens defined by novel monoclonal antibodies with tumor-restricted specificity. Int J Cancer. 15 de marzo de 1987; 39(3):297-303.

8 Netti PA, Baxter LT, Boucher Y, Skalak R, Jain RK Time-dependent behavior of interstitial fluid pressure in solid tumors: implications for drug delivery. Cancer Res. 15 de noviembre de 1995; 55(22):5451-58.

9 Jain RK. Physiological barriers to delivery of monoclonal antibodies and other macromolecules in tumors. Cancer Res. 1 de febrero de 1990; 50(Supl. 3):814s-819s.

10 Adams GP, Schier R, McCall AM, Simmons HH, Horak EM, Alpaugh RK, Marks JD, Weiner LM. High affinity restricts the localization and tumor penetration of single-chain fv antibody molecules. Cancer Res. 15 de junio de 2001; 61 (12):4750-5.

11 Figini M et al., Cancer Res. 1 de marzo de 1998; 58 (5): 991 -6.

12 King DJ, Turner A, Farnsworth AP, Adair JR, Owens RJ, Pedley RB, Baldock D, Proudfoot KA, Lawson AD, Beeley NR, et al., Improved tumor targeting with chemically cross-linked recombinant antibody fragments. Cancer Res. 1 de diciembre de 1994; 54(23):6176-85.

13 Willuda, J., Honegger, A., Waibel, R., Schubiger, P. A., Stahel, R., Zangemeister-Wittke, U. y Pluckthun, A. High thermal stability is essential for tumor targeting of antibody fragments: Engineering of a humanized antiepithelial glycoprotein-2 (epithelial cell adhesion molecule) single-chain Fv fragment. (1999) Cancer Res. 59, 5758-5767.

14 Ewert, S., Huber, T., Honegger, A. y Pluckthun, A. Biophysical properties of human antibody variable domains J. Mol. Biol. 3(2003) 5, 531-553.

15 Tomassetti et al., J. Cellular Biochemistry, 1999 72:111-118.

16 Stalteri MA, Mather SJ. A cross-linked monoclonal antibody fragment for improved tumor targeting. Bioconjug Chem. marzo-abril de 1995; 6(2):179-86.

17 Sharkey RM, McBride WJ, Karacay H, Chang K, Griffiths GL, Hansen HJ, Goldenberg DM. A universal pretargeting system for cancer detection and therapy using bispecific antibody. Cancer Res. 15 de enero de 2003; 63(2):354-63.

18 Coliva A et al., Cancer Immunol. Immunotherap. Diciembre de 2005; 54 (12); 1200-13.

19 Adamczyk M, Gebler JC, Wu J, Yu Z. Complete sequencing of anti-vancomycin Fab fragment by liquid chromatography-electrospray ion trap mass spectrometry with a combination of database searching and manual interpretation of the MS/Ms spectra. J Immunol Methods. 1 de febrero de 2002; 260(1-2):235-49.

20 Humphreys DP, Vetterlein OM, Chapman AP, King DJ, Antoniw P, Suitters AJ, Reeks DG, Parton TA, King LM, Smith BJ, Lang V, Stephens PE. F(ab’)2 molecules made from Escherichia coli produced Fab’ with hinge sequences conferring increased serum survival in an animal model. J Immunol Methods. 1 de agosto de 1998; 217(1 -2):1-10.

21 Casey JL, Napier MP, King DJ, Pedley RB, Chaplin LC, Weir N, Skelton L, Green AJ, Hope-Stone LD, Yarranton GT, Begent RH. Tumor targeting of humanised cross-linked divaient-Fab’ antibody fragments: a clinical phase I/II study. Br J Cancer. 6 de mayo de 2002; 86(9):1401 -10.

22 DeSilva BS, Wilson GS. Synthesis of bifunctional antibodies for immunoassays. Methods. septiembre de 2000; 22(1 ):33-43.

5

10

15

20

25

LISTADO DE SECUENCIAS

[0134]

<110> Dompe pha.r.ma s.p.a. Istituto Nazionale per lo studio e la Cura dei Tumori

<120> ANTICUERPOS HUMANOS ANTI-RECEPTOR ALFA DE FOLATO Y FRAGMENTOS DE ANTICUERPO PARA RADIOINMUNOTERAPIA DE CARCINOMA DE OVARIO

<130> B6671A-CA/SR/FJ

<150> EP 06 019 399.2 <151 >

<160> 12

<170> Patentln version 3.1

<210> 1

<211> 219

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly 15 10 15

Gin Arg Ala Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser phe Leu 20 25 30

Gly lie Asn Leu lie His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45

Lys Leu Leu lie Tyr Gin Ala Ser Asn Lys Asp Thr Gly Val Pro Ala 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn 65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Leu Gin Ser Lys 85 90 95

Asn Phe Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

<210>2 <211 > 120 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

5

10

15

20

25

<400>2

Asn Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr 20 25 30

Ala Met lie Trp Ala Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ser lie Ser Ser Ser Ser Ser Tyr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Arg Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Met Asp Val Trp Gly Lys 100 105 110

Gly Thr Thr val Thr val Ser Ser 115 120

<210>3

<211 > 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Phe Leu Gly lie Asn Leu lie His 15 10 15

<210>4

<211>7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Gin Ala Ser Asn Lye Asp Thr 1 S

<210>5

<211 > 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Leu Gin Ser Lys Asn Phe Pro Pro Tyr Thr 15 10

<210>6 <211>5

5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400>6

10

<210>7 <211 > 17 <212> PRT

15 <213> Homo sapiens

<400> 7

Asp Tyr Ala Met He 1 5

Ser lie Ser Ser Ser Ser Ser Tyr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

20

<210>8 <211 > 11 <212> PRT <213> Homo sapiens 25

<400> 8

Glu Arg Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Met Asp Val IS 10

30 <210>9

<211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens

35 <400> 9

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Lys

<210> 10 <211> 257 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

imagen1

imagen2

<210> 11 <211> 214 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Arg He Ala Trp Ala Arg Thr Glu Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala 15 10 15

10

imagen3

imagen4

<210> 12 <211> 216 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Sin Ser Ala Leu Thr Gin Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gin 15 io 15

Ser Ele Thr lie Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr

Claims (22)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo que se une especfficamente al receptor alfa de folato (FRa), en el que dicho anticuerpo es un fragmento Fab que comprende una cadena ligera cuya region variable (VL) comprende:

   - las regiones determinantes de complementariedad (CDR) que tienen las siguientes secuencias de aminoacidos:

   RASESVSFLGINLIH, (SEQ ID NO: 3)

   QASNKDT, (SEQ ID NO: 4)

   LQSKNFPPYT, (SEQ ID NO: 5) y la region variable (Vh) que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID No: 2 y la primera region constante (Ch1) de una cadena pesada y en que la region constante de dicha cadena ligera es una region constante kappa.
2. 2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de la figura 1 (SEQ ID NO: 1).
3. 3. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 1 y 2 que es completamente humano.
4. 4. El anticuerpo de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que es monoclonal.
5. 5. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 1 que es un fragmento Fab', en el que la cadena pesada comprende adicionalmente una region bisagra adecuada para la union covalente a un segundo fragmento de anticuerpo.
6. 6. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 1 y 2 que esta conjugado a un resto efector seleccionado de un agente citotoxico o un marcador.
7. 7. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que el agente citotoxico es un radionuclido.
8. 8. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 7, en el que el radionuclido se selecciona del grupo que consiste en

   131I, 90Y, 177Lu, 188Re.
9. 9. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que el resto efector es el agente marcador 99Tc.
10. 10. Anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 1, que es un dimero F(ab')2 que comprende dos fragmentos Fab'

    unidos covalentemente.
11. 11. Una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia que codifica un anticuerpo como se define en las reivindicaciones 1 o 2.
12. 12. Un vector de expresion que comprende el acido nucleico de la reivindicacion 11, estando dicho acido nucleico unido de forma funcional a senales reguladoras de la transcripcion.
13. 13. Una celula hospedadora transformada con el vector de la reivindicacion 12.
14. 14. La celula hospedadora de acuerdo con la reivindicacion 13 que es Escherichia coli.
15. 15. Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en asociacion con un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
16. 16. Un anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso como medicamento para el tratamiento o la prevencion de cancer humano.
17. 17. Un anticuerpo para el uso de acuerdo con la reivindicacion 16, en el que el trastorno es carcinoma de ovario en seres humanos.
18. 18. Un producto que contiene un anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un agente terapeutico adicional, como una preparacion combinada para uso simultaneo, separado o secuencial en tratamiento.
19. 19. El producto de acuerdo con la reivindicacion 18, en el que el agente terapeutico adicional se selecciona del grupo que consiste en un agente quimioterapeutico y un agente radioterapeutico.
20. 20. El producto de acuerdo con la reivindicacion 18 o 19 como una preparacion combinada para uso simultaneo, separado o secuencial en tratamiento de cancer de ovario.

    Figura 1

    C4

    (1)

    AFRA

    (1)

    C4

    (49)

    AFRA

    (51)

    C4

    (99)

    AFRA

    (101)

    C4

    (149)

    AFRA

    (150)

    C4

    (198)

    AFRA

    (200)

    -QSALTQPASVSGSPGQSITISCTG-TS SDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKL ElVLTQS PASLAVS PGQRATITCRASE SVS FLGINLI HWYQQKPGQPPKIi

    imagen1

    imagen2

    imagen3

    imagen4

    imagen5

    DoBO134

    7343 pb

    m HI (1912)

    pycjL

    Bam HI (4217)

    Bam HI (3828^

    \ Pst I (2174) v Pst I (2385) Cadena ligera

    Xba I (3822) Sal I (3816/ Pst I (3814)

    \ Apa I (2959)

    jCadena pesada

    1 4pa I (3224)

    Sal I (3488)

    FIGURA 2

    imagen6

    imagen7

    imagen8

    Figura 5

    Figura 6

    GO

    Biodistribucion de AFRA-DFM-131!

    15,00
21. 13.00
22. 11.00 4-

    9,00

    25,69

    imagen9

    imagen10

    li

    imagen11

    Sangre Tumor Bazo Rinones Hi'gado Hueso Corazon Musculo

    Organos

    oihB3ho6hHi5haZ4rtB48h

    Secuencia de aminoacidos de la cadena ligera kappa (Vk Ck) AFRA

    AFRA

    AFRA

    AFRA

    AFRA

    AFRA

    {1) EIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSFLGINLIHWYQQKPGQPPKL (51) LI YQASMKD TGVPARFSGSGSGTDFTLT INPVEANDTANYY CLQSKHFPP (101) YTFGOGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEOLKSGTASWCLLNNFYPREA (150) KVQWKVDMALQ5GHSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL5KADYEKHKVYAC (200) EVTHOGLSSPVTKSFMRGEC

    FIGURA 7

    FIGURA8

    NVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTTSGFTFGDYAMIWARQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTIS

    RDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARERYDFWSGMDVWGKGTTVTVS S

    FIGURA9

    1 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 61 GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKK

    A: Receptor alfa de folato

    MAQRMTTQLL LLLVWVAWG EAQTRIAWAR TELLNVCMNA KHHKEKPGPE 50 DKLHEQCRPW RKNACCSTNT SQEAHKDVSY LYRFNWNHCG EMAPACKRHF 100 IQDTCLYECS PNLGPWIQQV DQSWRKERVL NVPLCKEDCE QWWEDCRTSY 150 TCKSNWHKGW NWTSGFNKCA VGAACQPFHF YFPTPTVLCN EIWTHSYKVS 200 NYSRGSGRCI QMWFDPAQGN PNEEVARFYA AAMSGAGPWA AWPFLLSLAL 250 MLLWLLS 257

    B: Receptor alfa de folato soluble recombinante con marca de purificacion His6

    RIAWAR TELLNVCMNA KHHKEKPGPE 26 DKLHEQCRPW RKNACCSTNT SQEAHKDVSY LYRFNWNHCG EMAPACKRHF 76 IQDTCLYECS PNLGPWIQQV DQSWRKERVL NVPLCKEDCE QWWEDCRTSY 126 TCKSNWHKGW NWTSGFNKCA VGAACQPFHF YFPTPTVLCN EIWTHSYKVS 176 NYSRGSGRCI QMWFDPAQGN PNEEVARFYA AAHHHHHH 214

    FIGURA 10

    imagen12

    11 dias 16dias

    % de crecimiento del tumor (media +- ET)

    imagen13

    imagen14

    imagen15

    £U

    Q.

    O

    0

    O

    O

    n

    i-Hh

    o

    imagen16

    % de supervivencia global OT % de supervivencia global

    imagen17