CN117700557A - 一种特异性结合叶酸受体α的抗体或抗原结合片段 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种特异性结合叶酸受体α的抗体或抗原结合片段，抗体或抗原结合片段包括重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3；HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。本发明可通过免疫组织化学法检测人卵巢癌和子宫内膜癌细胞膜组织样本中叶酸受体α的表达情况，用于人源化叶酸受体α抗体偶联药物的伴随诊断试剂盒具有辅助精准用药，避免无效治疗的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种特异性结合叶酸受体α的抗体或抗原结合片段。
背景技术
作为与糖基化磷脂酰肌醇连接的跨膜单链糖蛋白，叶酸受体与叶酸具有很高的亲和力，可以在细胞膜上通过内吞作用实现叶酸的转运，转运完成后的叶酸受体被内化，然后再循环回细胞膜继续参与转运。叶酸受体共有三种亚型，分别是叶酸受体α（FolateReceptor α，FOLR1，FR α）、叶酸受体β（Folate Receptor β，FOLR2）和叶酸受体γ（FolateReceptor γ，FOLR3）。正常细胞中，叶酸受体α的表达高度受限，而在卵巢癌、子宫内膜癌、间皮瘤和肺癌细胞膜上则具有很高的表达性。因此，叶酸受体α可以作为理想的卵巢癌、子宫内膜癌、间皮瘤和肺癌标记物并用以抗体偶联药物研发。
抗体偶联药物（ADC）是一种利用单克隆抗体的特异性，通过识别癌细胞靶抗原，传递细胞毒性药物的新型治疗手段。其不仅可实现药物精准传递，将正常组织的毒性最小化，而且可扩大治疗窗口，增强药代动力学和药效学特性。在ADC中，抗体需要具有高特异性、低免疫原性、半衰期长、稳定性好等特点，是决定药物疗效的关键因素。
基于以上思考，本发明认为人源化叶酸受体α抗体偶联卵巢癌、子宫内膜癌、间皮瘤和肺癌细胞治疗药物的前提在于如何保证特异性地识别具有叶酸受体α膜表达的卵巢癌肿瘤细胞。为克服该问题，本发明利用抗体表达与筛选技术，经历了免疫应答、抗体分选、基因重组、高通量表达与性能评估，筛选出灵敏度最高，特异性最强的叶酸受体α抗体，并将其用于卵巢癌和子宫内膜癌人源化叶酸受体α抗体偶联细胞治疗药物的叶酸受体α伴随诊断试剂盒抗体开发。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种特异性结合叶酸受体α的抗体或抗原结合片段，通过以体外构建的叶酸受体α蛋白作为免疫原进行大白兔免疫，经细胞融合与筛选、获得表达抗体的杂交瘤细胞株。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种特异性结合叶酸受体α的抗体或抗原结合片段，包含SEQ ID NO.7所示重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:8所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者，与上述轻重链CDR区具有单个或者多个CDR不超过每个CDR区3个氨基酸保守性变化的变体。
进一步的，当按照Kabat编码规则对抗体HCDRs编码时，抗体或抗原结合片段包括重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3；HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；或者，与上述6个CDR区具有单个或者多个CDR不超过每个CDR区3个氨基酸保守性变化的变体。
优选地，前述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，序列选自如下：
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，或与SEQ ID NO:7 具有至少75％、85％、95％或99％序列同一性；
轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，或与SEQ ID NO:8 具有至少75％、85％、95％或99％序列同一性。
优选地，前述抗体或抗原结合片段还包括氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的重链恒定区和氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的轻链恒定区。
优选地，前述抗体或抗原结合片段选自由以下组成的组：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fab、Fab'、F（ab'）2、Fv、scFv和dsFv。
上述抗体或抗原结合片段的氨基酸序列如表1所示：
表1 引物和探针的氨基酸序列表
一种核酸分子，核酸分子编码如前述抗体或抗原结合片段。核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，包括以下的步骤：通过基因克隆技术获得编码上述抗体的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述抗体的核酸分子。
本领域技术人员知晓，编码上述抗体的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该抗体序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
一种重组载体，载体包含前述核酸分子。重组载体可通过本领域常规方法获得，即：将本申请核酸分子连接于各种载体上构建而成。载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载前述核酸分子即可。
一种重组宿主细胞，宿主细胞包含前述核酸分子或前述载体。宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组载体稳定地自行复制，且所携带的核酸可被有效表达即可。
一种用于人源化叶酸受体α抗体偶联药物的伴随诊断试剂盒，包含前述抗体或其抗原结合片段。试剂盒可辅助临床医生筛选适用于人源化叶酸受体α抗体偶联药物的癌症患者，精准用药，避免无效治疗。
前述抗体或抗原结合片段在制备卵巢癌和子宫内膜癌靶向药物治疗前配套的叶酸受体α伴随诊断免疫组化检测产品中的应用。其中，检测包括定量、免疫原性检测、流式检测、ELISA检测或IHC检测。
前述抗体或抗原结合片段在肿瘤的诊断或伴随诊断中的应用，或在制备肿瘤的诊断或伴随诊断试剂盒中的应用。
前述抗体或抗原结合片段在制备用叶酸受体α的临床前及临床检测试剂的应用。
一种非诊断目的的检测叶酸受体α表达的方法，采用前述抗体或抗原结合片段，或前述免疫组化抗体试剂或试剂盒，检测离体生物样本。
本发明的有益之处在于：本发明中的抗体或抗原结合片段能够特异性识别叶酸受体α抗原识别位点，可提供一种特异性强、灵敏度高、且免疫组化背景染色更低的检测叶酸受体α蛋白的免疫组化抗体；抗体可广泛用于体外检测叶酸受体α蛋白，制备卵巢癌和子宫内膜癌患者使用抗体偶联靶向药物治疗前配套的叶酸受体α蛋白伴随诊断免疫组化检测产品；且对于人源化叶酸受体α抗体偶联药物的伴随诊断试剂盒具有辅助精准用药作用，避免无效治疗。
附图说明
图1是实施例1中抗体6R1在卵巢癌上的IHC检测结果；
图2是实施例1中抗体12T5在卵巢癌上的IHC检测结果；
图3是实施例1中抗体6R1在子宫内膜癌上IHC实验结果。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
实施例1：特异性抗体的制备和筛选
本实施例中，按照以下方法制备叶酸受体α特异性抗体：
（1）叶酸受体α蛋白免疫原制备：通过基因合成方法构建带有His、Twin-Strep Tag的叶酸受体α蛋白表达质粒，利用Invitrogen Lipofectamine 2000转染试剂将表达质粒转染到HEK293细胞中，培养72小时后取上清，通过亲和层析的方法获得纯化的叶酸受体α蛋白。
（2）大白兔免疫：以步骤（1）制备的叶酸受体α蛋白作为免疫原，用叶酸受体α蛋白蛋白免疫2只新西兰大白兔，采用体内注射免疫手段。免疫结束后，用ELISA方法检测免疫动物血清，以此确定免疫应答的水平。常规免疫结束后，如果动物血清能够达到针对免疫原的免疫应答水平（OD值>1.0，效价达到1：128,00），可进行细胞融合。
（3）细胞融合与铺板：采用电融合方法进行1次细胞融合，融合的一半细胞铺到固体培养基中，另一半融合细胞进行冻存留样。
（4）挑取单克隆细胞株：挑取固体培养基中培养的单个细胞团至96孔培养板中进行培养。
（5）筛选：用ELISA方法筛选融合细胞的上清液，挑选出对叶酸受体α蛋白结合呈阳性的细胞。
（6）克隆扩大培养及复测：将阳性克隆细胞转到48孔板扩大培养，每个扩大培养的克隆收集0.5毫升细胞上清，用于间接ELISA方法进行检测。
（7）克隆扩大培养及复测：将阳性克隆细胞转到12孔板扩大培养，每个扩大培养的克隆收集1.5毫升上清，用于间接ELISA方法进行检测。在抗原识别确认的基础上，本申请筛选到2个效果最优的稳定细胞系（克隆号6R1和12T5）进行低温保存。低温冻存前每个克隆收集4毫升上清，并对所有的克隆进行亚型鉴定和保存。
（8）杂交瘤细胞抗体6R1的基因测序：提取杂交瘤细胞总RNA，通过RT-PCR反应将RNA反转录成cDNA。克隆抗体轻链和重链序列，将抗体轻链和重链序列构建到T载体上，之后进行DNA测序分析获得抗体基因序列。通过测序，按照Kabat编码规则，抗体6R1的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
（9）抗体生产与纯化：将步骤8得到的抗体基因转染到HEK293细胞进行扩大培养，使用蛋白质A/G亲和层析方法纯化抗体，使用磷酸盐缓冲液（PBS）中保存纯化得到的抗体。
将抗体6R1分别应用于卵巢癌细胞样本和子宫内膜癌细胞样本，抗体12T5应用于卵巢癌细胞样本，分别进行IHC检测，检测结果见图1~3，具体检测步骤如表2所示。
表2 IHC检测步骤
通过图1~3可以看出，使用抗体6R1的卵巢癌与子宫内膜癌细胞样本上可以看出清晰的细胞膜染色，结合叶酸受体α在细胞上的分布情况，可以判定为叶酸受体α染色；而使用抗体12T5的卵巢癌也能看出清晰的细胞膜染色，与抗体6R1的染色部位类似，但染色强度略低，表明本专利中的抗体6R1具有更好的染色效果，在应对卵巢癌与子宫内膜癌的伴随诊断检测试剂盒开发时，能够拥有更好的检测效果。
实施例2：抗体6R1特异性分析
本实施例中，按照上述实施例1方法获得单克隆抗体6R1，采用酶联免疫吸附试验对该抗体进行特异性分析，分析步骤如下：
（1）用PBS将叶酸受体α、叶酸受体β和叶酸受体γ蛋白分别稀释至6μg/mL，加入酶标板孔中，每孔80μL。用封板膜封板，放置4℃过夜（约20 h）。
（2）清除孔中剩余液体，风干酶标板，用PBST洗液洗板，300 μL/孔浸泡1 min，风干酶标板，进行下一次清洗，共洗板3次。
（3）每孔加入100 μL封闭剂（含有10％BSA的PBST洗液），用封板膜封板，放置37℃，孵育1.5 h。
（4）重复步骤2洗板3次。
（5）将上述抗体用样品稀释液（含有1％BSA的PBST洗液）稀释至1 μg/mL。加入酶标板中，每孔100 μL。用封板膜封板，放置37℃孵育1.0 h。
（6）重复步骤2洗板3次。
（7）用样品稀释液将HRP-Goat-Anti-rabbit IgG稀释至1:20000倍，每孔加入100μL，用封板膜封板，放置37℃孵育1.0 h。
（8）重复步骤2洗板3次。
（9）每孔加入100 μL显色液.用封板膜封板，放置37℃避光孵育20 min。
（10）每孔加入50 μL中止液，轻轻震荡酶标板至显色均匀。
（11）用酶标仪读取470 nm和650 nm的吸光度值，用OD470扣减OD650得到吸光度值（OD值），具体检测结果如表3所示。
表3 抗体的ELISA检测OD值
实验结果显示，上述抗体针对叶酸受体α蛋白的特异性好、活性高，而且与叶酸受体β蛋白和叶酸受体γ蛋白都没有交叉反应。
实施例3：辅助筛选人源化叶酸受体α抗体偶联药物的适用患者
本实施例中，使用通过上述实施例1方法获得单克隆抗体6R1制备的叶酸受体α伴随诊断试剂盒，为人源化叶酸受体α的抗体偶联药物筛选叶酸受体α阳性表达的临床入组患者。具体操作如下。
通过穿刺活检取得卵巢癌患者的肿瘤组织样本，然后使用带有上述实施例1方法获得单克隆抗体6R1制备的叶酸受体α伴随诊断试剂盒通过免疫组织化学进行叶酸受体α表达量分析，结果显示存在叶酸受体α阳性表达，可以使用人源化叶酸受体α抗体偶联药物。经用药治疗一段时间后，患者体内的肿瘤明显减小。
类似的，再次通过穿刺活检取得另一癌症患者的肿瘤组织样本，用同样方法检测，结果显示不存在叶酸受体α表达，不可以使用人源化叶酸受体α抗体偶联药物。但仍使用该药物治疗一段时间后，患者体内的肿瘤未明显减小，甚至变得更大。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种特异性结合叶酸受体α的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包括重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
2.根据权利要求1所述的一种特异性结合叶酸受体α的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段还包括氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。
3.根据权利要求1或2所述的一种特异性结合叶酸受体α的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段还包括氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的重链恒定区和氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的轻链恒定区。
4.根据权利要求1所述的一种特异性结合叶酸受体α的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段选自由以下组成的组：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fab、Fab'、F（ab'）2、Fv、scFv和dsFv。
5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1~4任一项所述的抗体或抗原结合片段。
6.一种重组载体，其特征在于，所述载体包含权利要求5所述的核酸分子。
7.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的载体。
8.一种用于人源化叶酸受体α抗体偶联药物的伴随诊断试剂盒，其特征在于，包含权利要求1~4任一项所述的抗体或抗原结合片段。
9.权利要求1~4任一项所述的抗体或抗原结合片段在制备卵巢癌和子宫内膜癌靶向药物治疗前配套的叶酸受体α伴随诊断免疫组化检测产品中的应用。
10.一种非诊断目的的检测叶酸受体α表达的方法，其特征在于，采用权利要求1~4任一项所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求8所述的伴随诊断试剂盒，检测离体生物样本。
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