ES2643865T3 - Producción de dienos volátiles por deshidratación enzimática (EC 4.2.1.127) de alquenoles ligeros - Google Patents
Producción de dienos volátiles por deshidratación enzimática (EC 4.2.1.127) de alquenoles ligeros Download PDFInfo
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Description
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Un ejemplo de una secuencia de una linalool deshidratasa-isomerasa (EC 4.2.1.127) que se puede emplear en el procedimiento de acuerdo con la presente invención se da en la SEQ ID NO: 1 (Figura 6). También se puede acceder a una secuencia para una linalool deshidratasa-isomerasa también en la base de datos UniProtKB/TrEMBL bajo el número de acceso E1XUJ2. En una realización preferida, el procedimiento de acuerdo con la presente invención hace uso de una linalool deshidratasa-isomerasa que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID NO: 1 o una secuencia que es al menos un x % idéntica a la SEQ ID NO: 1 y que es capaz de catalizar la conversión de un compuesto que responde a la fórmula general CnH2nO en CnH2n-2 + H2O, con 3 < n < 7, siendo x un número entero entre 60 y 100, preferentemente 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99.
El término "linalool deshidratasa-isomerasa", como se utiliza en la presente invención, se refiere preferentemente, por lo tanto, a una enzima que muestra el grado de identidad de secuencia indicado anteriormente con SEQ ID NO: 1 y que puede catalizar la conversión de un compuesto que responde a la fórmula general CnH2nO en CnH2n-2 + H2O, con 3 < n < 7. Usando la secuencia de SEQ ID NO: 1 o secuencias de nucleótidos codificantes correspondientes, es posible que el experto en la técnica identifique linalool deshidratase-isomerasas que pueden catalizar la conversión indicada anteriormente.
Dichas variantes de una linalool deshidratasa (EC 4.2.1.127), también incluyen versiones acortadas que muestran deleciones en el extremo N o C, preferentemente en el extremo C, como se describe más adelante. Los Ejemplos adjuntos muestran que tales versiones truncadas mantienen la capacidad para catalizar las conversiones descritas anteriormente.
Preferentemente, el grado de identidad se determina comparando la secuencia respectiva con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Cuando las secuencias que se comparan no tienen la misma longitud, el grado de identidad preferentemente se refiere al porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia más corta que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia más larga o al porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia más larga que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia más corta. El grado de identidad de secuencia se puede determinar de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica usando preferentemente algoritmos informáticos adecuados tales como CLUSTAL.
Cuando se utiliza el procedimiento de análisis de Clustal para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, un 80 % idéntica a una secuencia de referencia, se pueden usar los ajustes por defecto o los ajustes son preferentemente los siguientes: Matriz: blosum 30; Penalización por huecos abiertos: 10,0; Aumento de penalización por huecos: 0,05; Retardo divergente: 40; Distancia de separación entre huecos: 8 para comparaciones de secuencias aminoacídicas. Para las comparaciones de secuencias de nucleótidos, el aumento de penalización por huecos se ajusta preferentemente a 5,0.
Preferentemente, el grado de identidad se calcula sobre toda la longitud de la secuencia.
Además, si se usa el término "homología" en el contexto de la presente invención, este término significa preferentemente "identidad de secuencia".
Como se ha descrito anteriormente, la "linalool deshidratasa-isomerasa" identificada en Castellaniella defragrans (anteriormente Alcaligenes defragrans) tiene un péptido señal que asegura el transporte en el espacio periplasmático. En una realización preferida, el procedimiento de acuerdo con la presente invención emplea una enzima que no muestra dicha secuencia señal. Se muestra en los Ejemplos que la interrupción del péptido señal por inserción de una etiqueta his no obstaculiza la expresión de la enzima en E. coli y conduce a la producción intracelular de una proteína activa.
La linalool deshidratasa-isomerasa empleada en el procedimiento de acuerdo con la invención puede ser una linalool deshidratasa-isomerasa de origen natural o puede ser una linalool deshidratasa-isomerasa que se obtiene a partir de una linalool deshidratasa-isomerasa natural, por ejemplo, por la introducción de mutaciones u otras alteraciones que, por ejemplo, alteran o mejoran la actividad enzimática, la estabilidad, en particular la estabilidad térmica, etc.
Los Ejemplos adjuntos muestran que también las versiones truncadas de una linalool deshidratasa (EC 4.2.1.127) pueden catalizar eficientemente las conversiones descritas anteriormente, preferentemente versiones truncadas que muestran deleciones en el extremo C-terminal. Por lo tanto, la expresión "alquenol deshidratasa" también incluye enzimas que se obtienen a partir de una alquenol deshidratasa, tal como una linalool deshidratasa (EC 4.2.1.127) por deleciones, en particular deleciones en el extremo C-terminal. Más preferentemente, es una enzima que se obtiene a partir de una enzima que muestra la secuencia de aminoácidos como se representa en la SEQ ID NO: 1 por deleción de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 residuos aminoacídicos del extremo Cterminal.
La expresión "linalool deshidratasa-isomerasa" o "una proteína/enzima que tiene la actividad de una linalool deshidratasa-isomerasa" en el contexto de la presente solicitud también incluye enzimas que se obtienen a partir de una linalool deshidratasa-isomerasa, que son capaces de catalizar la conversión de un compuesto que responde a la fórmula general CnH2nO en CnH2n-2 + H2O, con 3 < n < 7, pero que sólo tienen una baja afinidad con sus sustratos naturales, es decir, geraniol, linalool y/o mirceno, con la condición de que aún pertenezcan a la clase EC 4.2.1.127.
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Además, pueden prepararse mutantes que poseen un sustrato modificado o especificidad del producto. Preferentemente, dichos mutantes muestran una actividad aumentada. Además, la introducción de mutaciones en los polinucleótidos que codifican una enzima como se definió anteriormente permite que la velocidad de expresión génica y/o la actividad de las enzimas codificadas por dichos polinucleótidos se optimicen, por ejemplo, en lo que respecta a la estabilidad térmica.
Para modificar genéticamente bacterias u hongos, los polinucleótidos que codifican una enzima como se ha definido anteriormente o partes de estas moléculas pueden introducirse en plásmidos que permitan la mutagénesis o la modificación de secuencia por recombinación de secuencias de ADN. Los procedimientos estándares (véanse Sambrook y Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA) permiten realizar intercambios de bases o añadir secuencias naturales o sintéticas. Los fragmentos de ADN pueden conectarse entre sí aplicando adaptadores y enlazadores a los fragmentos. Además, se pueden usar medidas de ingeniería que proporcionen sitios de restricción adecuados o eliminen el exceso de ADN o sitios de restricción. En aquellos casos en los que son posibles inserciones, supresiones o sustituciones, se puede usar mutagénesis in vitro, "reparación de cebador", restricción o ligadura. En general, se realizan análisis de secuencias, análisis de restricción y otros procedimientos de bioquímica y biología molecular como procedimientos de análisis.
El polinucleótido introducido en un (micro)organismo se expresa para conducir a la producción de un polipéptido que tiene la actividad descrita anteriormente. Una descripción general de diferentes sistemas de expresión está contenida, por ejemplo, en Methods in Enzymology 153 (1987), 385-516, en Bitter et al. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544) y en Sawers et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1-9), Billman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-4), Hockney (Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463), Griffiths et al., (Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427-440). Se una visión general de los sistemas de expresión de levaduras, por ejemplo, por Hensing et al. (Antonie van Leuwenhoek 67 (1995), 261-279), Bussineau et al. (Developments in Biological Standardization 83 (1994), 13-19), Gellissen et al. (Antonie van Leuwenhoek 62 (1992), 79-93, Fleer (Current Opinion in Biotechnology 3 (1992), 486-496), Vedvick (Current Opinion in Biotechnology 2 (1991), 742-745) y Buckholz (Bio/Technology 9 (1991), 1067-1072).
Los vectores de expresión han sido ampliamente descritos en la bibliografía. Por regla general, contienen no sólo un gen marcador de selección y un origen de replicación que garantiza la replicación en el huésped seleccionado, sino también un promotor bacteriano o vírico y, en la mayoría de los casos, una señal de terminación para la transcripción. Entre el promotor y la señal de terminación hay en general al menos un sitio de restricción o un polienlazador que permite la inserción de una secuencia de ADN codificante. La secuencia de ADN que controla naturalmente la transcripción del gen correspondiente puede usarse como la secuencia promotora, si está activa en el organismo huésped seleccionado. Sin embargo, esta secuencia también se puede intercambiar por otras secuencias promotoras. Es posible utilizar promotores que aseguren la expresión constitutiva del gen y promotores inducibles que permitan un control deliberado de la expresión del gen. Las secuencias promotoras bacterianas y víricas que poseen estas propiedades se describen en detalle en la bibliografía. Las secuencias reguladoras de la expresión en microorganismos (por ejemplo, E. coli, S. cerevisiae) se describen suficientemente en la bibliografía. Los promotores que permiten una expresión particularmente alta de una secuencia aguas abajo son, por ejemplo, el promotor T7 (Studier et al., Methods in Enzymology 185 (1990), 60-89), lacUV5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer et al., en Rodriguez y Chamberlin (Eds), Promoters, Structure and Function; Praeger, Nueva York, (1982), 462-481; DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 21-25), Ip1, rac (Boros et al., Gene 42 (1986), 97-100). Los promotores inducibles se utilizan preferentemente para la síntesis de polipéptidos. Estos promotores a menudo conducen a mayores rendimientos de polipéptidos que los promotores constitutivos. Con el fin de obtener una cantidad óptima de polipéptido, a menudo se utiliza un proceso de dos fases. En primer lugar, las células huésped se cultivan en condiciones óptimas hasta una densidad celular relativamente alta. En la segunda etapa, la transcripción se induce dependiendo del tipo de promotor utilizado. A este respecto, un promotor tac es particularmente adecuado que puede inducirse por lactosa o IPTG (=isopropil-β-D-tiogalactopiranósido) (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21-25). Las señales de terminación para la transcripción también se describen en la bibliografía.
La región de codificación que codifica la linalool deshidratasa-isomerasa puede ser modificada de manera conocida por el experto en la técnica. Por ejemplo, es posible insertar etiquetas que simplifiquen la purificación de la proteína tal como una etiqueta his (véase el Ejemplo 1). Además, también es posible suprimir o interrumpir la secuencia señal de la enzima que asegura la localización en el periplasma permitiendo así que la proteína se produzca intracelularmente. También es posible unir a la región codificante una señal de secreción que permita la secreción de la proteína en el medio de cultivo.
También es posible expresar la linalool deshidratasa-isomerasa como una proteína de fusión en la que la linalool deshidratasa-isomerasa está fusionada a otro resto polipeptídico, por ejemplo, otra enzima.
La transformación de la célula huésped con un polinucleótido o vector de acuerdo con la invención puede llevarse a cabo por procedimientos estándar, como se describe, por ejemplo, en Sambrook y Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, Estados Unidos; Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990. La célula huésped se cultiva en medio nutriente que cumple los requisitos de la célula huésped particular usada, en particular con respecto al valor de pH, temperatura, concentración de sal, aireación, antibióticos, vitaminas, oligoelementos, etc.
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Los organismos utilizados en la invención que expresan una linalool deshidratasa-isomerasa como se ha descrito anteriormente en el presente documento pueden ser procariotas o eucariotas, preferentemente son microorganismos. El término "microorganismo" en el contexto de la presente invención se refiere a bacterias, así como a hongos, tales como levaduras, y también a algas y arqueas. El término "microorganismo" también incluye células vegetales o células animales. En una realización particular, los microorganismos son bacterias. Las bacterias preferidas a emplear en el procedimiento de acuerdo con la invención son bacterias del género Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Pseudomonas, Zymomonas, Methylobacter o Escherichia. En una realización particularmente preferida, la bacteria pertenece al género Escherichia y aún más preferida es Escherichia coli. En otra realización preferida, la bacteria pertenece a la especie Pseudomonas putida o a la especie Zymomonas mobilis o a la especie Corynebacterium glutamicum.
En otra realización preferida, los microorganismos son bacterias recombinantes, preferentemente del género Escherichia, después de haber sido modificados con el fin de producir endógenamente un compuesto que responde a la fórmula general CnH2nO, con 3 < n < 7, y convertirlo en un dieno como se ha descrito anteriormente en el presente documento.
El término "microorganismo" en el contexto de la presente invención se refiere a bacterias, así como a hongos, tales como levaduras, y también a algas y arqueas. En una realización preferida, el microorganismo es una bacteria. En principio se puede utilizar cualquier bacteria. Las bacterias preferidas a emplear en el procedimiento de acuerdo con la invención son bacterias del género Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Pseudomonas, Zymomonas, o Escherichia. En una realización particularmente preferida, la bacteria pertenece al género Escherichia y aún más preferida es Escherichia coli. En otra realización preferida, la bacteria pertenece a la especie Pseudomonas putida o a la especie Zymomonas mobilis o a la especie Corynebacterium glutamicum.
En otra realización preferida, el microorganismo es un hongo, más preferentemente un hongo del género Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Aspergillus, Trichoderma, Kluyveromyces o Pichia y aún más preferentemente de la especie Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Aspergillus niger, Trichoderma reesei, Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces lactis o Pichia pastoris.
En una realización particularmente preferida, el microorganismo es un hongo recombinante, preferentemente una levadura que produce un compuesto que responde a la fórmula general CnH2nO, con 3 < n < 7, y que lo convierte en un compuesto de dieno tal como se describe con anterioridad en el presente documento.
En otra realización preferida, el procedimiento de acuerdo con la invención hace uso de un microorganismo fotosintético que expresa una linalool deshidratasa-isomerasa. Preferentemente, el microorganismo es una bacteria fotosintética, o una microalga. Incluso más preferentemente, tal microorganismo tiene la propiedad natural o artificial de producir endógenamente un compuesto que responde a la fórmula general CnH2nO, con 3 < n < 7. En este caso el microorganismo será capaz de producir un dieno directamente a partir del CO2 presente en la solución.
En otra realización preferida, el procedimiento de acuerdo con la invención hace uso de un organismo multicelular que expresa una linalool deshidratasa-isomerasa. Los ejemplos de tales organismos son plantas o animales.
En una realización, el procedimiento implica cultivar microorganismos en condiciones de cultivo estándar (30-37 ºC a 1 atm, en un fermentador que permite el crecimiento aeróbico de las bacterias). El butadieno y el isopreno tienen un punto de ebullición de -4 ºC y 34 ºC, respectivamente, y ya estarían en estado gaseoso si se eligiera una temperatura de 34 ºC o superior para el cultivo. En una realización preferida, el procedimiento implica el cultivo de microorganismos en condiciones no estándar, preferentemente a una temperatura más alta para corresponder a las condiciones de cultivo de organismos termófilos. Esta realización tiene la ventaja de que incluso los dienos que tienen un punto de ebullición más alto, en particular dimetilbutadieno (con un punto de ebullición de 68 ºC) se desgasificarían del cultivo y podrían ser recogidos fácilmente de la fase gaseosa. Por lo tanto, en particular en aquellas realizaciones del procedimiento según la invención en las que se produce dimetilbutadieno, el microorganismo es un microorganismo termófilo que puede cultivarse a temperaturas de 68 ºC o superiores.
En una realización preferida adicional, el procedimiento según la invención que hace uso de un microorganismo se lleva a cabo de tal manera que el microorganismo se inmoviliza sobre un soporte.
En una realización preferida adicional, el procedimiento de la invención se lleva a cabo en condiciones microaerófilas. Esto significa que la cantidad de aire inyectado es limitante para minimizar las concentraciones residuales de oxígeno en los efluentes gaseosos que contienen el compuesto de dieno producido.
En otra realización preferida, el procedimiento de acuerdo con la invención se lleva a cabo en condiciones de manera que el dieno producido se desgasifique de la reacción. Esto tiene la ventaja de que el equilibrio termodinámico de la reacción se desplaza hacia la producción del dieno conjugado. Se prefiere que el procedimiento comprenda además la etapa de recoger el dieno gaseoso. Por lo tanto, en una realización preferida, el procedimiento se lleva a cabo en presencia de un sistema para recoger el dieno producido en forma gaseosa durante la reacción.
En una realización particular, el procedimiento comprende también detectar el dieno producido (butadieno, isopreno
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El pH se ajustó a 7,5
Se añadieron 0,25 ml de lisado celular que contenía linalool deshidratasa-isomerasa recombinante a 0,5 ml de mezcla de reacción. Se realizó en paralelo una reacción de control libre de enzimas que contenía lisado de células de E. coli transformadas con vector vacío.
Los ensayos se incubaron a 37 ºC durante 1-22 horas en un vial de vidrio sellado de 2 ml (Interchim) con agitación. Se analizó la producción de isopreno mediante el procedimiento GC/FID como se describe en el ejemplo 4. Se observó una producción significativa de isopreno en un ensayo enzimático con linalool deshidratasa-isomerasa. No se observó ninguna señal de isopreno en el ensayo de control libre de enzimas (Figura 9). El número de recambios para esta conversión ascendió a aproximadamente 3 x 10-5 s-1 moléculas de sustrato por sitio activo enzimático.
Ejemplo 6: Producción de 2-metil-1,3-butadieno (isopreno) a partir de 2-metil-3-buten-2-ol
Los ensayos enzimáticos se realizaron en las siguientes condiciones:
Tris HCl 50 mM pH 7,5
D,L-Ditiotreitol 2 mM
2-metil-3-buten-2-ol 0-80 mM
El pH se ajustó a 7,5
Se añadieron 0,25 ml de lisado celular que contenía linalool deshidratasa-isomerasa recombinante, a 0,5 ml de mezcla de reacción. Se realizó en paralelo una reacción de control libre de enzimas que contenía lisado de células de E. coli transformadas con vector vacío. Los ensayos se incubaron a 37 ºC durante 1-22 horas en un vial de vidrio sellado de 2 ml (Interchim) con agitación. Se analizó la producción de isopreno mediante el procedimiento GC/FID como se describe en el ejemplo 4. Se observó una producción significativa de isopreno en un ensayo enzimático con linalool deshidratasa-isomerasa. No se observó ninguna señal de isopreno en el ensayo de control libre de enzimas
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(Figura 10). El número de recambios para esta conversión ascendió a aproximadamente 10-3 moléculas de sustrato por sitio activo enzimático.
Ejemplo 7: Cinética de producción de 1,3-butadieno a partir de (E)-but-2-en-1-ol (trans alcohol crotílico)
Lisis celular y preparación de sobrenadante
El lisado celular se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 con las siguientes modificaciones. El sedimento obtenido a partir de 200 ml de células cultivadas se descongeló sobre hielo y se suspendió de nuevo en 3 ml de Tris-HCl 50 mM pH 7,5, complementado con D,L-ditiotreitol 4 mM, glutatión 20 mM, MgCl2 25 mM y KCl 25 mM. Después se añadieron 10 μl de lisonasa (Merck). Las células se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente y después se devolvieron al hielo durante 20 minutos. El lisado celular se clarificó por centrifugación a 13.000 rpm, 4 ºC durante 10 min. El sobrenadante recogido se concentró en una unidad de filtro Amicon Ultra-4 de 10 kDa (Millipore). El nivel de expresión de linalool deshidratasa-isomerasa se estimó mediante análisis de SDS-PAGE del sobrenadante. La concentración de proteína total se determinó usando el procedimiento Bradford (Biorad).
Ensayo enzimático
Los ensayos enzimáticos se realizaron en las siguientes condiciones:
Tris-HCl 50 mM pH 7,5
trans alcohol crotílico 0-160 mM (Alfa Aesar)
Se añadieron 0,2-0,4 ml del sobrenadante que contenía la linalool deshidratasa-isomerasa recombinante a 0,5 ml de mezcla de reacción. La concentración de linalool deshidratasa-isomerasa en el ensayo fue de aproximadamente 1,2 mg/ml. Se llevaron a cabo en paralelo reacciones de control libres de enzimas que contenían sobrenadante de células de E. coli transformadas con un vector vacío. Las reacciones se incubaron a 37 ºC en un vial de vidrio sellado de 2 ml (Interchim) con agitación. Las reacciones se detuvieron congelando los tubos de ensayo a -80 ºC. La producción de butadieno se midió analizando alícuotas muestreadas durante un periodo de incubación de 5,5 horas. La cantidad de 1,3-butadieno producida se cuantificó por cromatografía de gases (GC) de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 2. La Figura 11 muestra la cinética de la producción de 1,3-butadieno para una gama de concentraciones de trans alcohol crotílico.
Ejemplo 8: Cinética de la producción de 1,3-butadieno a partir de but-3-en-2-ol
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El lisado celular clarificado que contenía la linalool deshidratasa-isomerasa recombinante se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 7.
Ensayo enzimático
Los ensayos enzimáticos se realizaron en las siguientes condiciones:
Tris-HCl 50 mM pH 7,5
but-3-en-2-ol 0-160 mM (Sigma-Aldrich)
Se añadieron 0,2-0,4 ml del sobrenadante que contenía la linalool deshidratasa-isomerasa recombinante a 0,5 ml de mezcla de reacción. La concentración de linalool deshidratasa-isomerasa en el ensayo fue de aproximadamente 1,2 mg/ml. Se llevaron a cabo en paralelo reacciones de control libres de enzimas que contenían sobrenadante de células de E. coli transformadas con un vector vacío. Los ensayos se incubaron a 37 ºC en un vial de vidrio sellado de 2 ml (Interchim) con agitación. Las reacciones se detuvieron congelando los tubos de ensayo a -80 ºC. La producción de butadieno se midió analizando alícuotas muestreadas durante un periodo de incubación de 5,5 horas. La cantidad de 1,3-butadieno producida se cuantificó por cromatografía de gases (GC) de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 2. La Figura 12 muestra la cinética de la producción de 1,3-butadieno para una gama de concentraciones de but-3-en-2-ol.
Ejemplo 9: Producción 1,3-butadieno a partir de but-3-en-1-ol (isoalcohol crotílico)
Preparación del lisado celular
El lisado celular se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 con las siguientes modificaciones. El sedimento obtenido a partir de 200 ml de células cultivadas se descongeló sobre hielo y se suspendió de nuevo en 3 ml de Tris-HCl 50 mM pH 7,5, complementado con D,L-ditiotreitol 4 mM, glutatión 20 mM, MgCl2 25 mM y KCl 25 mM. Después se añadieron 10 μl de lisonasa (Merck). Las células se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente y después se devolvieron al hielo durante 20 minutos.
Ensayo enzimático
Los ensayos enzimáticos se realizaron en las siguientes condiciones:
Tris-HCl 50 mM pH 7,5
but-3-en-1-ol 50 mM (Sigma)
Se añadieron 0,4 ml de lisado celular que contenía la linalool deshidratasa-isomerasa recombinante a 0,5 ml de la mezcla de reacción. Se realizó en paralelo una reacción de control libre de enzimas que contenía lisado de células de E. coli transformadas con vector vacío. Los ensayos se incubaron a 37 ºC durante 18 horas en un vial de vidrio sellado de 2 ml (Interchim) con agitación. Se recogió entonces un ml de la fase de espacio vacío y se inyectó en un cromatógrafo de gases Varian 450-GC equipado con un detector de ionización de llama (FID). Se utilizó nitrógeno como gas portador con un caudal de 6 ml/min. Los compuestos volátiles se separaron por cromatografía en una columna J&W GS-Alumina (30 m x 0,53 mm de DI) (Restek) usando un modo isotérmico a 130 ºC. El producto de reacción enzimático se identificó por comparación con el estándar de 1,3-butadieno (Sigma-Aldrich). Bajo estas condiciones de GC, el tiempo de retención para el butadieno fue de 3,05 min. Se produjo 1,3-butadieno en el ensayo enzimático en presencia de linalool deshidratasa-isomerasa, no se observó señal de butadieno en el ensayo de control libre de enzimas (Figura 13).
Ejemplo 10: Producción de 2-metil-1,3-butadieno (isopreno) a partir de 2-metilbut-3-en-2-ol
Durante otra ronda de experimentos, se reprodujo la reacción ensayada en el Ejemplo 6 y se confirmó el resultado. Las condiciones de ensayo exactas fueron las siguientes:
El lisado celular clarificado que contenía la linalool deshidratasa-isomerasa recombinante se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 7.
Ensayo enzimático
Los ensayos enzimáticos se realizaron en las siguientes condiciones:
Tris-HCl 50 mM pH 7,5
2-metilbut-3-en-2-ol 160 mM (Sigma)
Se añadieron 0,2-0,4 ml del sobrenadante que contenía la linalool deshidratasa-isomerasa recombinante a 0,5 ml de mezcla de reacción. La concentración de linalool deshidratasa-isomerasa en el ensayo fue de aproximadamente 1,2 mg/ml. Se llevaron a cabo en paralelo reacciones de control libres de enzimas que contenían sobrenadante de
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células de E. coli transformadas con un vector vacío. Los ensayos se incubaron durante 6 horas a 37 ºC en un vial sellado de 2 ml (Interchim) con agitación. Las reacciones se detuvieron entonces congelando los tubos de ensayo a 80 ºC
Se recogió entonces un ml de la fase de espacio vacío y se inyectó en un cromatógrafo de gases Varian 450-GC equipado con un detector de ionización de llama (FID). Se utilizó nitrógeno como gas portador con un caudal de 1,5 ml/min. Los compuestos volátiles se separaron cromatográficamente sobre columna en enlace Rt-Alúmina/Na2SO4 (Restek) usando un modo isotérmico a 155 ºC. El producto de reacción enzimático se identificó por comparación con un estándar de isopreno (Sigma-Aldrich). En estas condiciones de GC, el tiempo de retención para el isopreno fue de 7,5 min.
Se observó una producción significativa de isopreno en el ensayo enzimático establecido en presencia de linalool deshidratasa-isomerasa. No se observó ninguna señal de isopreno en el ensayo de control libre de enzimas (Figura 14).
Ejemplo 11: Producción de 2-metil-1,3-butadieno (isopreno) a partir de 3-metilbut-3-en-2-ol
Preparación del lisado celular
El lisado celular se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 con las siguientes modificaciones. El sedimento obtenido a partir de 200 ml de células cultivadas se descongeló sobre hielo y se suspendió de nuevo en 3 ml de Tris-HCl 50 mM pH 7,5, que contenía D,L-ditiotreitol 4 mM, glutatión 20 mM, MgCl2 25 mM y KCl 25 mM. Después se añadieron 10 μl de lisonasa (Merck). Las células se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente y después se devolvieron al hielo durante 20 minutos.
Ensayo enzimático
Los ensayos enzimáticos se realizaron en las siguientes condiciones:
Tris-HCl 50 mM pH 7,5
3-metilbut-3-en-2-ol 50 mM (Sigma-Aldrich)
Se añadieron 0,45 ml de lisado celular que contenía linalool deshidratasa-isomerasa recombinante a 0,5 ml de mezcla de reacción. Se realizó en paralelo una reacción de control libre de enzimas que contenía lisado de células de E. coli transformadas con vector vacío. Los ensayos se incubaron a 37 ºC durante 1 horas en un vial de vidrio sellado de 2 ml (Interchim) con agitación. Se recogió entonces un ml de la fase de espacio vacío y se inyectó en un cromatógrafo de gases Varian 450-GC equipado con un detector de ionización de llama (FID). Se utilizó nitrógeno como gas portador con un caudal de 6 ml/min. Los compuestos volátiles se separaron por cromatografía en una columna J&W GS-Alumina (30 m x 0,53 mm de DI) (Restek) usando un modo isotérmico a 150 ºC. El producto de reacción enzimático se identificó por comparación con un estándar de isopreno (Sigma-Aldrich). En estas condiciones de GC, el tiempo de retención para el isopreno fue de 3,85 min. Una cantidad significativa de isopreno se produjo en el ensayo enzimático en presencia de linalool deshidratasa-isomerasa; se observó una señal insignificante de isopreno correspondiente a la descomposición espontánea de 3-metilbut-3-en-2-ol en el ensayo de control libre de enzimas (Figura 15, Tabla 2).
Tabla 2: Producción de isopreno después de 1 hora de incubación en ensayos con 3-metilbut-3-en-2-ol 50 mM.
- Ensayo
- Área pico de isopreno, unidades arbitrarias
- Ensayo enzimático con linalool deshidratasa-isomerasa
- 24334,5
- Ensayo de control libre de enzimas
- 66,4
Ejemplo 12: Variantes truncadas de linalool deshidratasa: la actividad con respecto a la reacción global de conversión de alcohol crotílico en 1,3-butadieno y para la reacción de deshidratación de but-3-en-2-ol en 1,3butadieno
Diversas selecciones que buscan mejora en la actividad y la solubilidad de la linalool deshidratasa-isomerasa han conducido a la identificación de una colección de 9 variantes de la enzima, que están truncadas en la porción Cterminal. La enzima de longitud completa de tipo salvaje corresponde a M1-K397 como se muestra en la SEQ ID NO: 1. Las versiones truncadas observadas son M1-L385, M1-R386, M1-P388, M1-P389, M1-A391, M1-K393, M1-L394, M1-A395 y M1-G396 como se muestra en la SEQ ID NO: 1. En estas versiones truncadas en el extremo C, sólo la longitud de la proteína ha sido modificada, el resto de la secuencia de la proteína permanece sin cambios. La variante más corta (M1-L385) tiene una identidad del 96,9 %.
La actividad se ensayó de acuerdo con el siguiente ensayo:
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