ES2642440T3 - Agente terapéutico para enfermedades basado en el efecto inhibidor del factor inhibidor de la migración de macrófagos - Google Patents

Description

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DESCRIPCION

Agente terapeutico para enfermedades basado en el efecto inhibidor del factor inhibidor de la migracion de macrofagos

Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un metodo de uso de un derivado de benzopirano que tiene actividad inhibidora del factor inhibidor de la migracion de macrofagos (denominado en lo sucesivo como mIf) o una sal del mismo para el tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso tal como el dolor neuropatico. Adicionalmente se refiere a una composicion farmaceutica que contiene un derivado de benzopirano o una sal del mismo para un tratamiento terapeutico de una enfermedad del sistema nervioso central.

Tecnica anterior

El dolor neuropatico (en lo sucesivo denominado NP) es una clase de enfermedades de dolor cronico causadas por un trastorno nervioso periferico y/o nervioso central y trastorno funcional debido a cancer o lesion ffsica. Tal dolor ha perdido su trascendencia original de alerta de trastorno tisular pero no es mas que un dolor. La calidad de vida (QOL) de un paciente se reduce notablemente debido a tal dolor.

El smtoma del NP es, ademas de dolor espontaneo continuo, principalmente alodinia en la que un estfmulo tactil se percibe como un dolor drastico. Tal dolor es fuertemente resistente a farmacos antiinflamatorios no inflamatorios no esteroideos (en lo sucesivo denominados AINES) tales como ibuprofeno, y es resistente tambien a morfina, esto es, un analgesico narcotico (Documento No Relacionado con Patentes 1).

La fisiologfa patologica y la causa del NP no se han demostrado completamente como resultado de investigacion fundamental reciente:

(1) El NP es inducido por un dano del nervio periferico y/o central.

(2) Se liberan una variedad de citoquinas y quimioquinas desde celulas nerviosas danadas.

(3) Las citoquinas liberadas y similares causan una activacion notable de la microglia conocida como una celula inmunocompetente para el sistema nervioso central.

El NP es tratado con fines de alivio del dolor, aumentando la capacidad funcional del paciente, y mejorando su actividad. Para estos fines, por ejemplo, se realizan la administracion de un antidepresivo, un analgesico narcotico o similares, un tratamiento de bloqueo nervioso, y un tratamiento de acupuntura y moxibustion. Sin embargo, no se conoce ningun metodo terapeutico excelente basado en el mecanismo desarrollado de NP, y se desea un metodo terapeutico excelente para el NP.

El MIF es una citoquina secretada por los linfocitos activados y que tiene diversas actividades biologicas. Se sabe que presenta actividades para, por ejemplo, el sistema inmunologico, el sistema endocrino, y la proliferacion y diferenciacion de celulas. En particular, el MIF juega un papel importante en la inflamacion sistemica y la respuesta inmunologica, y es un factor que pertenece tambien a una reaccion de hipersensibilidad retardada para inhibir la migracion aleatoria de macrofagos. Ademas, el MIF tiene actividad dopacromo tautomerasa (Documento No Relacionado con Patentes 3).

Por otro lado, se sabe que el MIF tiene homologfa con la glutation S-transferasa, para mostrar desintoxicacion, que va a ser secretada desde la adenohipofisis en el momento del choque endotoxico, que va a ser inducido por un bajo nivel de glucocorticoides, y para oponerse a su efecto inmunosupresor (Documento No Relacionado con Patentes 4). En otras palabras, el MIF inhibe la actividad de los glucocorticoides, suscita antagonismo sobre el efecto anti- inflamatorio de los glucocorticoides endogenos o administrados terapeuticamente, y funciona tambien como una causa o un factor agravante de una enfermedad inflamatoria y un estado inflamatorio.

Ademas, el MIF es indispensable para la activacion de las celulas T, se expresa en diversas celulas, y se expresa fuertemente en particular en el sistema nervioso.

En la relacion entre el MIF y las enfermedades, por ejemplo, un inhibidor de MIF alivia un smtoma de alodinia de un modelo animal para NP. Por otra parte, se puede producir un modelo de raton que muestra una reaccion de sensibilidad a un estfmulo agravado por el estres mediante la inyeccion de MIF recombinante a un raton normal (Documento No Relacionado con Patentes 5). Ademas, en un modelo animal para NP, espedficamente, en un modelo para la alodinia inducida por la ligadura del nervio ciatico, el MIF es altamente expresado en el asta dorsal ipsilateral de la medula espinal, y se activan moleculas de senalizacion en el lado aguas abajo del MIF (Documento No Relacionado con Patentes 6). Ademas, en un raton con el gen de MIF desactivado, se elimina la alodinia inducida por la ligadura del nervio ciatico (Documentos No de Patente 5 y 6). En consecuencia, se presume que el

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MIF es indispensable para la expresion de los smtomas de la NP.

Un derivado de benzopirano exhibe un efecto antiartritico (Documento de Patente 1), un efecto inhibidor de la production de citoquinas inflamatorias, tales como interleuquina-1p e interleuquina-6, y un efecto inmunomodulador (Documentos No de Patente 12, 13 y 14), y se conoce que son utiles para un tratamiento de la artritis reumatoide y otras artritis y enfermedades autoinmunes (Documento de Patente 2). El documento WO2007/042035 describe el uso de N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi-4H-1-benzopiran-3-il]formamida para reducir o eliminar el sofoco.

Sin embargo, no se conoce en absoluto que el derivado de benzopirano se una a MIF para inhibir sus actividades biologicas, como se menciono anteriormente. No se conoce la eficacia del derivado de benzopirano para el NP

Documentos de la tecnica anterior

Documentos de Patente

Documento de Patente 1: JP 02-049778 A

Documento de Patente 2: Folleto de la Publication Internacional Num. WO 94/23714 Documento No Relacionado con Patentes

Documento No Relacionado con Patentes 1: Lancet, 1999, vol. 353, pag. 1959-1964 Documento No Relacionado con Patentes 2: N. Engl. J. Med., 2000, vol. 343, pags. 938-952 Documento No Relacionado con Patentes 3: Nat. Rev. Drug Discov., 2006, vol. 5, pags. 399-410 Documento No Relacionado con Patentes 4: Molecular Medicine, 1996, vol. 2, pags. 143-149 Documento No Relacionado con Patentes 5: Exp. Neurol., 2012, vol. 236, pags. 351-362 Documento No Relacionado con Patentes 6: Anesthesiology, 2011, vol. 114, pags. 643-659 Documento No Relacionado con Patentes 12: Chem. Pharm. Bull., 2000, vol. 48, pags. 131-139 Documento No Relacionado con Patentes 13: J. Pharamcobiodyn., 1992, vol. 15, pags. 649-655 Documento No Relacionado con Patentes 14: Int. J. Immunotherapy, 1993, vol. 9, pags. 69-78

Compendio de la invencion

Problema tecnico

Se desea un producto medico util para un tratamiento terapeutico del NP, y una composition farmaceutica para inhibir el MIF

Solucion al Problema

En estas circunstancias, los autores de la presente invencion encontraron que un derivado de benzopirano representado por la siguiente formula general [1] o una de sus sales se une a MIF, exhibe un efecto inhibidor de MIF, y por lo tanto es util para un tratamiento terapeutico del NP para el que es eficaz la inhibition de MIF, lo que da como resultado la realization de la presente invencion.

[Formula 1]

imagen1

en donde R1 representa un grupo alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido; uno de R2 y R3 representa un atomo de hidrogeno; y el otro de R2 y R3 representa un atomo de hidrogeno, un grupo amino opcionalmente sustituido, un grupo acilamino opcionalmente sustituido, un grupo carbamoflo opcionalmente sustituido o un grupo arilo opcionalmente sustituido.

Efectos ventajosos de la invencion

Un derivado de benzopirano representado por la formula general [1] o una sal del mismo exhibe un efecto inhibidor de MIF y es util para un tratamiento terapeutico de enfermedades para las que es eficaz la inhibicion de MIF, tal

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como el NP.

Descripcion de las realizaciones

La presente invencion se describira a continuacion en detalle.

Los terminos utilizados en la presente memoria tienen los siguientes significados a menos que se indique lo contrario.

Un atomo de halogeno significa un atomo de fluor, un atomo de cloro, un atomo de bromo o un atomo de yodo.

Un grupo alquilo C1-C6 significa un grupo alquilo C1-C6 lineal o ramificado tal como un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo propilo, un grupo isopropilo, un grupo butilo, un grupo sec-butilo, un grupo isobutilo, un grupo terc-butilo, un grupo pentilo, un grupo isopentilo y un grupo hexilo.

Un grupo alcoxi C1-C6 significa un grupo alquiloxi C1-C6 lineal o ramificado tal como un grupo metoxi, un grupo etoxi, un grupo propoxi, un grupo isopropoxi, un grupo butoxi, un grupo isobutoxi, un grupo sec-butoxi, un grupo terc- butoxi, un grupo pentiloxi y un grupo hexiloxi.

Un grupo alcanoilo C2-C12 significa un grupo alcanoilo C2-C12 lineal o ramificado tal como un grupo acetilo, un grupo propionilo, un grupo valerilo, un grupo isovalerilo y un grupo pivaloflo.

Un grupo aroilo significa un grupo benzoilo o un grupo naftoilo.

Un grupo carbonilo heterodclico significa un grupo nicotinoilo, un grupo tenoilo, un grupo pirrolizinocarbonilo o un grupo furoMo.

Un grupo aminoacetilo (a-sustituido) significa un grupo aminoacetilo (a-sustituido) que deriva de un aminoacido (tal como glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cistema, metionina, acido aspartico, acido glutamico, asparragina, glutamina, arginina, lisina, histidina, hidroxilisina, fenilalanina, tirosina, triptofano, prolina e hidroxiprolina) y que pueden tener un N-terminal protegido.

Un grupo acilo significa un grupo formilo, un grupo succinilo, un grupo glutarilo, un grupo maleoilo, un grupo ftaloilo, un grupo alcanoilo C2-C12, un grupo aroilo, un grupo carbonilo heterodclico o un grupo aminoacetilo (a-sustituido).

Un grupo acilamino significa un grupo amino sustituido con un grupo acilo.

Un grupo arilo significa un grupo fenilo, un grupo naftilo, un grupo indanilo, un grupo indenilo, un grupo tetrahidronaftilo o similar.

El grupo alquilo C1-C6 de R1 puede estar sustituido con uno o mas atomos de halogeno.

El grupo amino o el grupo carbamoflo de R2 y R3 pueden estar sustituidos con uno o mas grupos alquilo C1-C6.

El grupo acilamino de R2 y R3 puede estar sustituido con uno o mas atomos de halogeno

El grupo arilo de R2 y R3 puede estar sustituido con uno o mas grupos seleccionados entre un atomo de halogeno, un grupo amino, un grupo hidroxilo, un grupo alquilo C1-C6 que puede estar sustituido con uno o mas atomos de halogeno, y un grupo alcoxi C1-C6 que puede estar sustituido con uno o mas atomos de halogeno.

Los derivados preferibles del derivado de benzopirano representado por la formula general [1] de la presente invencion incluyen los compuestos descritos mas abajo.

Se prefiere un compuesto en el que R1 es un grupo alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido; uno de R2 y R3 es un atomo de hidrogeno; y el otro de R2 y R3 es un grupo acilamino opcionalmente sustituido.

Espedficamente, se prefieren N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi-4H-1-benzopiran-3-il]formamida, N-(3- amino-4-oxo-6-fenoxi-4H-1-benzopiran-7-il)metanesulfonamide, N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi-4H- 1 -benzopiran-3-il]acetamida, N-(4-oxo-6-fenoxi-4H-1 -benzopiran-7-il)metanosulfonamida, 7- [(metilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi-4H-1-benzopiran-2-carboxamida, N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-oxo-6- fenoxi-4H-1-benzopiran-2-il]acetamida, 7-[(metilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi-4H-1-benzopiran-3- carboxamida, N-[7-[(etilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi-4H-1-benzopiran-3-il]formamida, and N-(4-oxo-6-fenoxi- 2-fenil-4H-1-benzopiran-7-il)metanesulfonamida, y es mas preferida N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi- 4H-1 -benzopiran-3-il]formamida.

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El derivado de benzopirano de la formula general [1] utilizado en la presente invencion se produce mediante la combinacion de los metodos reconocidos publicamente, y se puede producir mediante, por ejemplo, un metodo descrito en el Documento de Patente 1.

Ejemplos de la sal del derivado de benzopirano de formula general [1] incluyen una sal con un metal alcalino tal como sodio o potasio; una sal con un metal alcalinoterreo tal como calcio y magnesio; una sal de amonio; y una sal con una base organica que contiene nitrogeno tal como trimetilamina, trietilamina, tributilamina, piridina, N,N- dimetilanilina, N-metilpiperidina, N-metilmorfolina, dietilamina, diciclohexilamina, procama, dibencilamina, N-bencil-p- fenetilamina, 1-efenamina y N,N'-dibenciletilendiamina.

Entre las sales antes mencionadas, se prefieren las sales farmacologicamente aceptables.

MIF tiene alta homologfa con una tautomerasa bacteriana, y cataliza una reaccion de la dopacromo tautomerasa (Molecular Medicine, 1996, vol. 2, pags. 143-149). Por lo tanto, la actividad biologica de MlF se puede evaluar mediante el uso de una reaccion con tautomerasa con un dopacromo como sustrato.

El derivado de benzopirano de la formula general [1] o la sal del mismo de la presente invencion tiene un efecto para inhibir la actividad tautomerasa de MIF (a saber, un efecto inhibidor de MIF), y un farmaco que contiene el derivado de benzopirano de la formula general [1] o la sal del mismo es util para un tratamiento terapeutico o preventivo de enfermedades para las cuales es eficaz la inhibicion MIF.

Los ejemplos de la enfermedad para la cual es eficaz la inhibicion de MIF incluyen NP. Los ejemplos de NP incluyen fibromialgia, dolor postherpetico, neuropatfa diabetica, dolor posterior a lesion de la medula espinal, dolor postapoplejico, dolor cronico, smdrome de dolor regional complejo, dolor lumbar para el cual los AINE son insuficientemente eficaces, ciatica, dolor pelvico, neuralgia trigeminal, dolor por osteoartritis para el cual los AINE son insuficientemente eficaces, smdrome de dolor por desaferenciacion, dolor debido a miositis, dolor debido a fascitis, y dolor debido a artritis seronegativa. Los ejemplos del smdrome de dolor por desaferenciacion incluyen dolor talamico, dolor debido a EM, dolor posterior a lesion por avulsion, dolor de miembro fantasma, y smdrome de dolor postoperatorio. Los ejemplos del dolor debido a artritis seronegativa incluyen dolor debido a trastorno articular axial, dolor debido a espondilitis anquilosante, dolor debido a trastorno articular sacroilfaco, y dolor debido a espodilitis seronegativa.

Los ejemplos preferibles incluyen fibromialgia, dolor postherpetico, neuropatfa diabetica, dolor lumbar para el cual los AINE son insuficientemente eficaces, dolor por osteoartritis para el cual los AINE son insuficientemente eficaces, dolor debido a miositis, dolor debido a fascitis, y dolor debido a artritis seronegativa y los ejemplos mas preferibles incluyen dolor postherpetico, neuropatfa diabetica, dolor lumbar para el cual los AINE son insuficientemente eficaces, dolor por osteoartritis para el cual los AINE son insuficientemente eficaces, dolor debido a miositis, dolor debido a fascitis, y dolor debido a artritis seronegativa.

El compuesto de la presente invencion se puede formar en formulaciones farmaceuticas tales como una preparacion oral (incluyendo un comprimido, una capsula, un polvo, un granulo, un granulo fino, una pfldora, una suspension, una emulsion, un lfquido y un jarabe), un inyectable y una gota ocular mezclando con diversos aditivos farmaceuticos tales como un excipiente, un aglutinante, un disgregante, un inhibidor de la disgregacion, un agente antiapelmazante, un lubricante, un excipiente, un disolvente, un expansor, un agente de ajuste de la tonicidad, un agente solubilizante, un emulsionante, un agente de suspension, un espesante, un agente de recubrimiento, un promotor de absorcion, un promotor de la gelificacion, un acelerador de la coagulacion, un estabilizador de luz, un conservante, un agente desecante, un estabilizador de la emulsion, un estabilizador de la suspension, un estabilizador de la dispersion, un inhibidor de la coloracion, un absorbente de oxfgeno, un antioxidante, un agente de enmascaramiento del sabor, un agente de enmascaramiento del olor, un agente colorante, un agente espumante, un agente antiespumante, un agente calmante, un agente antiestatico, un diluyente, un tampon de pH, y un agente de ajuste del pH.

Las diferentes formulaciones descritas anteriormente se formulan por medio de metodos habituales.

Una formulacion solida oral tal como un comprimido, un polvo y un granulo se puede formular mediante un metodo habitual utilizando un aditivo farmaceutico de, por ejemplo, un excipiente tal como lactosa, sacarosa, cloruro de sodio, glucosa, almidon, carbonato de calcio, caolm, celulosa cristalina, fosfato de calcio dibasico anhidro, almidon parcialmente pregelatinizado, almidon de mafz y acido algmico; un aglutinante tal como un jarabe simple, una solucion de glucosa, una solucion de almidon, una solucion de gelatina, poli(alcohol vimlico), poli(eter vimlico), polivinilpirrolidona, carboximetilcelulosa, goma laca, metilcelulosa, etilcelulosa, alginato de sodio, goma arabiga, hidroxipropil metil celulosa e hidroxipropil celulosa; un disgregante tal como almidon seco, acido algmico, agar en polvo, almidon, polivinilpirrolidona entrecruzada, carboximetilcelulosa sodica entrecruzada, sal de potasio de carboximetilcelulosa y glicolato de almidon sodico; un inhibidor de la disgregacion tal como alcohol esteanlico, acido estearico, manteca de cacao y aceite hidrogenado; un agente antiaglomerante, tal como silicato de aluminio,

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hidrogenofosfato de calcio, oxido de magnesio, talco y anhndrido siKcico; un lubricante tal como cera de carnauba, acido silfcico anhidro ligero, silicato de aluminio, silicato de magnesio, un aceite hidrogenado, un derivado de aceite vegetal hidrogenado, aceite de sesamo, cera de abejas blanca, oxido de titanio, gel seco de hidroxido de aluminio, acido estearico, estearato de calcio, estearato de magnesio, talco, hidrogenofosfato de calcio, laurilsulfato de sodio y polietilenglicol; un promotor de la absorcion tal como una sal cuaternaria de amonio, lauril sulfato de sodio, urea y una enzima; y un vehnculo tal como almidon, lactosa, caolm, bentonita, anhndrido silfcico, dioxido de silicio hidratado, aluminometasilicato de magnesio y acido silfcico coloidal.

El comprimido se puede formar, en caso necesario, en un comprimido recubierto general, tal como un comprimido recubierto con azucar, un comprimido recubierto con gelatina, un comprimido con recubrimiento gastrico soluble, un comprimido con recubrimiento enterico y un comprimido recubierto con pelfcula soluble en agua.

La capsula se prepara cargando una capsula de gelatina dura, una capsula blanda y similares con cualquiera de los diversos aditivos farmaceuticos anteriormente mencionados.

Alternativamente, se pueden utilizar para la preparacion un aditivo farmaceutico tal como un disolvente, un expansor, un agente de ajuste de la tonicidad, un agente solubilizante, un emulsionante, un agente de suspension y un agente espesante por medio de un metodo habitual para obtener una suspension acuosa u oleosa, una solucion, un jarabe y un elixir.

La inyeccion se puede preparar mediante un metodo habitual utilizando un aditivo farmaceutico de, por ejemplo, un diluyente tal como agua, alcohol etflico, macrogol, propilenglicol, acido cftrico, acido acetico, acido fosforico, acido lactico, lactato de sodio, acido sulfurico e hidroxido de sodio; un tampon de pH y un agente de ajuste del pH, tal como citrato de sodio, acetato de sodio y fosfato de sodio; un estabilizador de la emulsion, un estabilizador de la suspension y un estabilizador de dispersion tal como pirosulfito de sodio, acido etilendiaminotetraacetico, acido tioglicolico y acido tiolactico; un agente de ajuste de la tonicidad tal como sal comun, glucosa, manitol y glicerina; un agente solubilizante tal como carboximetilcelulosa sodica, propilenglicol, benzoato de sodio, benzoato de bencilo, uretano, etanolamina y glicerina; un agente calmante tal como gluconato de calcio, clorobutanol, glucosa y alcohol bendlico; y un anestesico local.

Las gotas oftalmicas se pueden preparar mediante un metodo habitual mezclando adecuadamente con un conservante tal como clorobutanol, deshidroacetato de sodio, cloruro de benzalconio, cloruro de cetilpiridinio, alcohol fenetflico, paraoxibenzoato de metilo y cloruro de bencetonio; un tampon de pH y un ajustador de pH, tales como borax, acido borico y dihidrogenofosfato de potasio; un espesante tal como metil celulosa, hidroxietil celulosa, carboximetil celulosa, hidroxipropil metil celulosa, poli(alcohol vimlico), carboximetilcelulosa sodica y sulfato de condroitina; un agente solubilizante tal como polisorbato 80 y aceite de ricino endurecido con polioxietileno 60; un estabilizador de la emulsion, un estabilizador de la suspension y un estabilizador de dispersion tal como edetato de sodio y e hidrogenosulfito de sodio; y un agente de ajuste de la tonicidad tal como cloruro de sodio, cloruro de potasio y glicerina.

Un metodo de administracion de la formulacion no esta especialmente limitado, y se determina apropiadamente de acuerdo con la forma de la formulacion, la edad, el sexo y otras condiciones del paciente, y el grado de los smtomas del paciente.

Una dosis de un ingrediente activo de la presente formulacion se selecciona apropiadamente de acuerdo con el uso, la edad y el sexo del paciente, la forma de la enfermedad y las otras condiciones, y en general, se puede administrar a una dosis de 0,1 a 500 mg, preferiblemente de 10 a 200 mg por dfa de una vez o de forma dividida varias veces al dfa para un adulto.

Ejemplos

A continuacion, la presente invencion se describira con referencia a ejemplos de ensayo, y se observa que la presente invencion no se limita a estos ejemplos.

Las abreviaturas utilizadas en los ejemplos de ensayo respectivos tienen los siguientes significados.

MES: acido 2-(N-morfolino)etanosulfonico DMF: N,N-dimetilformamida

EDC: hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida EDTA: acido etilendiaminotetraacetico NHS: N-hidroxisuccinimida

TBST: Solucion salina tamponada con Tris que contiene Tween 20 Los siguientes compuestos se utilizan como sustancias de ensayo.

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[Tabla 1]

coccV o=s=o R1

Compuesto

R1 R2 R3

Compuesto A

CHs NHCHO H

compuesto B

CH3 NH2 H

Compuesto C

CHs NHCOCH3 H

Compuesto D

CHs H H

Compuesto E

CH3 H CONH2

Compuesto F

CH3 H NHCOCH3

Compuesto G

CH3 CONH2 H

Compuesto H

CH3CH2 NHCHO H

Compuesto I

CH3 H O

Ejemplo de Ensayo 1 (Confirmacion de la union del Compuesto A y MIF)

Como sustancia de ensayo, se utilizo el Compuesto A (N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi-4H-1-benzopiran-3- il]formamida).

(1) Preparacion del producto lisado celular

Se cultivaron celulas THP-1 durante aproximadamente 6 horas en PRMI 1640 que contema 1% de suero bovino fetal y 50 ^moles/L de 2-mercaptoetanol. A continuacion, se anadio lipopolisacarido (E. coli 0127:B8, Sigma Aldrich) a la placa de cultivo a una concentracion final de 1 ^g/ml, y las celulas se cultivaron durante aproximadamente 30 minutos. Las celulas se recogieron y se lavaron con solucion salina tamponada con fosfato, y se mezclaron con un volumen de aproximadamente 2 veces de tampon de lisis celular (20 mmoles/L de Tris, 150 mmoles/L de cloruro de sodio, 1 mmol/L de cloruro de magnesio, NP-40 al 0,1%, 1 mmol/L de ditiotreitol, Triton X-100 al 0,1%, pH 7,4). La mezcla resultante se coloco en hielo con agitacion ocasional durante aproximadamente 30 minutos, y se centrifugo (20.000 x g, 4°C, 8 minutos). El sobrenadante separado y obtenido se utilizo como producto lisado celular. La concentracion de protema del producto lisado celular se midio con reactivo de analisis de protema BCA (Thermo Fisher Scientific K.K.) de acuerdo con su manual.

(2) Smtesis de 4-amino-N- [7-[(metilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi-4H-1-benzopiran-3-il]butanamida

A una solucion de 500 mg de N-(3-amino 4-oxo-6-fenoxi-4H-1-benzopiran-7-il)metanosulfonamida en 5,0 mL de DMF, se le anadieron 293 mg de acido 4-(terc-butoxicarbonilamino)butmco y 304 mg de EDC, seguido de agitacion a temperatura ambiente durante 1 hora y 30 minutos. A la mezcla de reaccion obtenida de este modo, se le anadieron 111 mg de EDC, seguido de agitacion a temperatura ambiente durante 3 horas y 30 minutos. Se anadieron acetato de etilo y una solucion acuosa de acido dtrico al 10% a la mezcla de reaccion resultante, el resultante se agito a temperatura ambiente durante 30 minutos, y se filtro un solido. Al solido obtenido de este modo, se le anadieron DMF, acetato de etilo y una solucion acuosa de acido dtrico al 10%, seguido de agitacion a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuacion, el solido se filtro para obtener 397 mg de [4-[[7-[(metilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi- 4H-1-benzopiran-3-il]amino]-4-oxobutil]carbamato de terc-butilo en forma de un solido de color amarillo palido. Se suspendieron 300 mg del [4-[[7-[(metilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi-4H-1-benzopiran-3-il]amino]-4-oxo- butil]carbamato de terc-butilo obtenido de este modo en 3,0 mL de cloruro de metileno, se anadieron 0,60 mL de acido trifluoroacetico enfriando con hielo, el producto resultante se agito a temperatura ambiente durante 40 minutos, y despues el disolvente se separo por destilacion a presion reducida. Al residuo obtenido de este modo, se le

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anadieron 3 mL de acetato de etilo y 0,25 mL de una solucion de cloruro de hidrogeno/acetato de etilo de 4 moles/L, y el disolvente se separo mediante destilacion a presion reducida. Al residuo obtenido de este modo, se le anadieron 5,0 mL de acetato de etilo y 0,50 mL de una solucion de cloruro de hidrogeno/acetato de etilo de 4 moles/L, seguido de agitacion a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuacion, se filtro un solido para obtener 232 mg de 4- amino-N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi-4H-1-benzopiran-3-il]butanamida en forma de un solido de color amarillo palido.

(3) Preparacion de esferas

La inmovilizacion de hidrocloruro de 4-amino-N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi-4H-1-benzopiran-3- il]butanamida en Dynabeads M-270 Carboxilic Acid (Life Technologies Corporation) se llevo a cabo por medio de un metodo general.

En pocas palabras, despues de esterificacion con NHS de los extremos COOH de aproximadamente 30 mg de las esferas (Dynabeads M-270 Carboxilic Acid, Life Technologies Corporation), se anadieron a esto 0,010 mL de DMF, 0,90 mL de una solucion de 0,01 mol/L de hidrocloruro de 4-amino-N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi-4H-1- benzopiran-3-il]butanamida/DMF, y 0,090 mL de una solucion de 1 mol/L de N,N-diisopropiletilamina/DMF, y el resultante se sacudio a temperatura ambiente durante 70 minutos. Las esferas se lavaron con 0,5 mL de DMF dos veces y, a continuacion, se anadieron 0,94 mL de DMF y 0,060 mL de 2-aminoetanol, seguido de agitacion a temperatura ambiente durante 2 horas. Las esferas se lavaron con 0,5 mL de DMF dos veces, y despues se lavaron con 1 mL de tampon de fosfato de 0,05 mol/L (pH 6) cuatro veces, y de este modo, se obtuvieron las esferas a las que se habfa unido el Compuesto A a traves de un conector (referidas en lo sucesivo como esferas de compuestos). Ademas, las esferas obtenidas por medio de una reaccion similar sin la adicion de hidrocloruro de 4-amino-N-[7- [(metilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi-4H-1-benzopiran-3-il]butanamida se utilizaron como esferas de control. Cada tipo de estas esferas se suspendio en 1 mL de tampon de fosfato de 0,05 moles/L (pH 6) para almacenarlas en un refrigerador hasta su uso. Inmediatamente antes de su uso, una parte de las esferas se separo y se lavo con tampon de lisis celular tres veces.

(4) La reaccion entre el extracto celular y las esferas

Se mezclaron minuciosamente 0,1 mL de producto lisado celular (2 mg/ml de protema) y aproximadamente 0,9 mg de las esferas de compuestos o esferas de control durante la noche a 4°C. Los sobrenadantes se separaron de las esferas utilizando un iman, y se recogieron como la Fraccion de flujo continuo. Ademas, las esferas se lavaron con tampon de lisis celular, y a continuacion se hicieron reaccionar con 40 pL de tampon de lisis celular que contema 0,5 mmol/L de Compuesto A a 4°C durante aproximadamente 8 horas con agitacion vigorosa. Los sobrenadantes se separaron de las esferas utilizando un iman, y se recogieron como el Eluato de Compuesto A. Por otra parte, las esferas se enjuagaron ligeramente con tampon de lisis celular, se mezclaron con 15 pL de tampon de muestra SDS- PAGE (2ME+) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), que habfa sido diluido hasta 4 veces, y se calentaron a aproximadamente 95°C durante 5 minutos. Despues de eso, los sobrenadantes separados de las esferas utilizando un iman se recogieron como la Fraccion eluida con calor.

(5) Deteccion de MIF mediante transferencia Western

Se llevo a cabo una transferencia Western por medio de un metodo general.

Tanto de una parte de la Fraccion de flujo continuo como una parte del eluato de Compuesto A obtenido como se ha descrito anteriormente en el apartado (4) se mezclaron, respectivamente, con el tampon de muestra SDS-PAGE (2ME+), y se calentaron. Estas muestras tratadas con calor y la Fraccion eluida con calor se sometieron a electroforesis en gel de SDS-PAGE (SuperSep Ace al 15%, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) a 30 a 50 mA durante aproximadamente 80 minutos, y a continuacion se transfirieron electroforeticamente a un membrana PVDF (Hybond-P, GE Healthcare Japan Corporation) a 100 mA durante aproximadamente 60 minutos. La membrana de la protema transferida se sumergio y se agito suavemente en una solucion de TBST (Tris de 10 mmol/L, cloruro de sodio de 100 mmol/L, Tween-20 al 0,1%, pH 7,5) que contema 5% de leche desnatada a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora. Despues de eso, la membrana se sumergio en una solucion de TBST que contema 1/50000 volumenes de anticuerpos anti-MIF (Abcam Plc.) y 5% de leche desnatada, y se hizo reaccionar durante la noche a 4°C con agitacion suave. Despues de enjuagar ligeramente la membrana con la solucion de TBST tres veces, la membrana resultante se sumergio en una solucion de TBST que contema un volumen 1/5000 de anticuerpo anti-IgG de cabra modificado con HRP (Santa Cruz Biotechnology Inc.) y 5% de leche desnatada, y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora con agitacion suave. Despues de enjuagar ligeramente la membrana con una solucion de TBST tres veces, el MIF se detecto utilizando ECL Prime Reagent (GE Healthcare Japan Corporation) de acuerdo con su manual.

La Fig. 1 muestra una fotograffa de la membrana en la que se detectan mediante quimioluminiscencia los reaccionantes de union a MIF y el anticuerpo.

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Las fracciones sometidas a electroforesis en las respectivas calles del gel fueron las siguientes:

Calle 1: Fraccion de flujo continuo de las esferas de compuesto Calle 2: Eluato de Compuesto A de las esferas de compuesto Calle 3: Fraccion eluida con calor de las esferas de compuesto Calle 4: MIF recombinante (Abcam Plc.)

Calle 5: Fraccion de flujo continuo de las esferas de control Calle 6: Eluato de Compuesto A de las esferas de control Calle 7: Fraccion eluida con calor de las esferas de control

El eluato de Compuesto A de las esferas de compuesto contiene protemas que tienen una capacidad de union a las esferas de compuesto y se libera de las esferas de compuesto en presencia de una cantidad excesiva del Compuesto A. Se demostro que una banda detectada en el eluato de Compuesto A (es decir, Calle 2) era MIF debido a que se urna al anticuerpo anti-MIF y estaba en una posicion correspondiente al mismo peso molecular que MIF recombinante.

En otras palabras, se revelo que MIF tema capacidad de union a las esferas de compuesto.

Por otra parte, tanto el eluato de Compuesto A de las esferas de control como la fraccion eluida con calor de las esferas de control contienen protemas que tienen capacidad de union a las esferas de control. Puesto que no se detecto MIF en estas fracciones (es decir, calles 6 y 7), se demostro que MIF no tema ninguna capacidad de union a las esferas de control.

En consecuencia, se demostro que MIF se une espedficamente al Compuesto A.

Ejemplo de ensayo 2 (Confirmacion de inhibicion de la actividad MIF)

Los compuestos A a I se utilizaron como sustancias de ensayo.

El efecto inhibidor de las sustancias de ensayo de la actividad tautomerasa de MIF se evaluo remitiendose a un metodo de Healy et al. (Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention, 2011, vol. 20, pags. 1516-1523).

En este metodo, se mide la reaccion tautomerica del ester medico de L-3,4-dihidroxifenilalanina (ester medico de L- dopacromo, coloreado) a ester medico de acido 5,6-hidroxiindol-2-carboxflico (sin color) como un cambio en la absorbancia a 475 nm.

Como fuente de enzima, se utlizo MIF recombinante fabricada por Abcam Plc. o MIF producido y purificado remitiendose a un metodo de Lubetsky et al. (El Journal of Biological Chemistry, 2002, vol. 277, pags. 24976-24982). A continuacion se describe un metodo de purificacion para MIF.

El vector pET15b (Merck) en el que se hada insertado la secuencia del gen completo de MIF se transfecto a la cepa BL21 Star (DE3) de E. coli (Life Technologies Corporation). La E. coli se cultivo hasta que el medio de cultivo exhibio absorbancia (a 600 nm) de 0,5 a 0,8, se anadio a esto isopropil-p-tiogalactopiranosido (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) a una concentracion final de 0,1 mmol/L, y se indujo la expresion de la protema durante 4 horas. Las E. coli se resuspendieron en tampon (pH 7,5) que contema 20 mmol/L de Tris (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 20 mmol/L de cloruro de sodio (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) y 1 mmol/L de ditiotreitol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), y el resultante se sometio a lisis mediante ultrasonidos y centrifugacion a 15.000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante asf obtenido se filtro utilizando un filtro de 0,20 micras, y se dejo pasar a traves de columnas HiTrap Q HP e HiTrap SP HP (GE Healthcare Japan Corporation), para separar las fracciones de flujo continuo, cada una de 5 mL. Cada 10 pl de las fracciones separadas se sometieron a electroforesis utilizando gel de poliacrilamida de 5 al 20% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), y todas las protemas se tineron con reactivo azul brillante de Coomassie (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Basandose en los resultados obtenidos de este modo, se selecciono una fraccion que contema una gran cantidad de MIF y que contema menos cantidad de otras protemas como MIF purificado. La concentracion de la protema MIF se midio mediante el uso de reactivo de analisis de protema BCA (Thermo Fisher Scientific K. K.).

El efecto inhibidor de cada sustancia de ensayo de la actividad tautomerasa de MIF se midio de la siguiente manera.

Una concentracion final de 10 a 50 nmoles/L de MIF y una concentracion final de 30 mmoles/L de cada sustancia de ensayo o dimetilsulfoxido al 0,5% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) como control se anadieron al tampon (pH 6,2) que contema 50 mmoles/L Bis-Tris (Dojindo Laboratories) y 1 mmol/L de EDTA (Dojindo Laboratories), y la reaccion se realizo a temperatura ambiente durante 15 minutos para proporcionar una solucion de reaccion 1.

Por otro lado, se anadieron 1/20 de volumen/L de ester medico de L-3,4-dihidroxifenilalanina 12 mmoles (Sigma

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Aldrich) y 1/20 volumen de 24 mmoles/L de peryodato de sodio (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) al tampon que tema la misma composicion que la utilizada para la obtencion de la solucion de reaccion 1, para proporcionar una solucion de reaccion 2.

A continuacion, la solucion de reaccion 1 y la solucion de reaccion 2, se mezclaron, y se midio inmediatamente el cambio temporal de absorbancia a 475 nm de la mezcla obtenida.

Se obtuvo la diferencia de las absorbancias entre aproximadamente 1 minuto despues del inicio de medicion y aproximadamente 5 minutos despues. Suponiendo que el cambio de absorbancia del control es 100%, se calculo la tasa de inhibicion de la reaccion de tautomerasa en presencia de cada sustancia de ensayo.

Los resultados se muestran en la Tabla 2. En la Tabla 2, la tasa de inhibicion de la reaccion tautomerasa se muestra como sigue. "-"; menos de 50%, "+"; 50% o mas y menos de 75%, "++"; 75% o mas.

[Tabla 2]

Sustancia de ensayo

Tasa de Inhibicion de la reaccion de la tautomerasa

Compuesto A

+

compuesto B

+

Compuesto C

+

Compuesto D

+

Compuesto E

+ +

Compuesto F

+ +

Compuesto G

+

Compuesto H

+ +

Compuesto I

+ +

Todas las sustancias de ensayo inhiben la actividad tautomerasa de MIF.

Los resultados descritos anteriormente muestran que el compuesto de formula general [1] o la sal del mismo muestran el efecto inhibidor MIF y es util como un inhibidor de MIF.

Ejemplo de Ensayo 3 (Efecto del Compuesto A en rata modelo de lesion nerviosa de constriccion cronica)

[0083] Este ensayo se realizo haciendo referencia a un metodo de Bennett et al. (Pain, 1988, vol. 33, pag. 87-107).

[0084] El compuesto A se utilizo como sustancia de ensayo y se utilizo celecoxib, uno de los AINE, como sustancia de referencia. El compuesto A se administro a una dosis de 30 mg/kg (grupo de Compuesto A). El celecoxib se administro a una dosis de 30 mg/kg (grupo de celecoxib). A un grupo de control, se le administro una solucion acuosa de metilcelulosa al 0,5%, utilizada como vehfculo.

[0085] Se realizo una operacion de constriccion nerviosa en los nervios ciaticos izquierdos de ratas macho Sprague-Dawley (7 semanas de edad) bajo anestesia con Somnopentilo (fabricado por Kyoritsu Seiyaku Corporation, aproximadamente 52 mg/kg, administracion intraperitoneal). En resumen, se disecciono una region femoral izquierda de cada rata, el nervio ciatico se separo de los tejidos circundantes y se apreto el nervio con una sutura de seda 4-0 (fabricada por Eticon Inc., seda quirurgica) para que tuviera partes estrechas en cuatro posiciones a intervalos de aproximadamente 1 mm. La capa muscular y la piel se suturaron respectivamente, y la region de operacion se desinfecto. El vehfculo, la sustancia de ensayo o la sustancia de referencia se administraron oralmente una vez al dfa continuamente durante 14 dfas a partir del dfa 16° despues de la operacion.

[0086] Desde el inicio de la administracion, se evaluo la sensacion de dolor (alodinia mecanica) de la almohadilla de la pata trasera izquierda mediante la prueba de von Frey. En pocas palabras, se presionaron verticalmente filamentos de von Frey, que teman respectivamente diferentes flexibilidades (Estesiometro Semmes-Weinstein Von Frey (fabricado por Danmic Global, LCC)) contra la almohadilla de la pata trasera izquierda sucesivamente en orden desde uno de elasticidad mas ligera y la fuerza elastica del filamento contra el cual la rata mostro una respuesta de retirada se determino como un valor de umbral de dolor.

[0087] La evaluacion del sentido del dolor se expreso como un promedio de los valores umbral del dolor. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

[Tabla 3]

Grupo de Ensayo

Numero de animales Promedio de los umbrales de dolor (g)

Dfa 15 despues de la operacion

Dfa 30 despues de la operacion

Grupo de control

8 2,7 4,2

Grupo compuesto A

8 2,4 13,5

Grupo de Celecoxib

7 2,5 3,1

[0088] El valor umbral de dolor del grupo del Compuesto A aumento a 13,5 g 14 dfas despues del inicio de la 5 administracion (el 30° dfa despues de la operacion), y por lo tanto, el Compuesto A inhibio el smtoma de la alodinia

mecanica en comparacion con el del grupo de control.

[0089] Por otro lado, la administracion de celecoxib (30 mg/kg), AINE, no suprimio el smtoma de alodinia mecanica.

10 [0090] Los resultados descritos anteriormente revelan que el Compuesto A suprime el smtoma de la alodinia

mecanica por medio de un mecanismo diferente del de los AINE.

Breve descripcion del dibujo

15 [0091] [Fig. 1] La Fig. 1 es una fotograffa de una membrana en la que los reaccionantes resultantes de la union

entre MIF y el anticuerpo son detectados mediante quimioluminiscencia.

Aplicabilidad Industrial

20 [0092] Un derivado de benzopirano representado por la formula general [1] o una sal del mismo se une a MIF,

exhibe un efecto inhibidor de MIF, y es util para un tratamiento de dolor neuropatico.

Claims (9)

1. 5

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   REIVINDICACIONES

   1. Un derivado de benzopirano para su uso en el tratamiento de dolor neuropatico, en donde el derivado de benzopirano esta representado por la siguiente formula general, o una sal del mismo,

   [Formula 1]

   imagen1

   en donde R1 representa un grupo alquilo Ci-6; uno de R2 y R3 representa un atomo de hidrogeno; y el otro de R2 y R3 representa un atomo de hidrogeno, un grupo amino opcionalmente sustituido, un grupo acilamino opcionalmente sustituido, un grupo carbamoilo opcionalmente sustituido o un grupo arilo opcionalmente sustituido.
2. 2. El derivado de benzopirano para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde uno de R2 y R3 representa un atomo de hidrogeno; y el otro de R2 y R3 representa un grupo acilamino opcionalmente sustituido.
3. 3. El derivado de benzopirano para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el derivado de benzopirano es N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi-4H-1-benzopiran-3-il]formamida, N-3-amino-4-oxo-6-fenoxi-4H-1- benzopiran-7-il)metanosulfonamida, N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi-4H-3-il]acetamida, N-(4-oxo-6-fenoxi- 4H-1-benzopiran-7-il)metanosulfonamida, 7-[(metilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi-4H-benzopiran-2-carboxamida, N- [7-[(metilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi-4H-1-benzopiran-2-il]acetamida, 7-[(metilsulfonil)amino]-6-fenoxi-4H-1- benzopiran-3-carboxamida, N-[7-[(etilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi-4H-1-benzopiran-3-il]formamida o N-(4-oxo-6- fenoxi-2-fenil-4H-1-benzopiran-7-il)metanosulfonamida.
4. 4. El derivado de benzopirano para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el derivado de benzopirano es N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi-4H-1-benzopiran-3-il]formamida.
5. 5. Un agente de tratamiento para uso en el tratamiento de dolor neuropatico, en donde el agente de tratamiento comprende un derivado de benzopirano representado por la siguiente formula general, o una sal del mismo,

   [Formula 2]

   imagen2

   en donde R1 representa un grupo alquilo C1-6; uno de R2 y R3 representa un atomo de hidrogeno; y el otro de R2 y R3 representa un atomo de hidrogeno, un grupo amino opcionalmente sustituido, un grupo acilamino opcionalmente sustituido, un grupo carbamoilo opcionalmente sustituido o un grupo arilo opcionalmente sustituido.
6. 6. El agente de tratamiento para uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde uno de R2 y R3 representa un atomo de hidrogeno; y el otro de R2 y R3 representa un grupo acilamino opcionalmente sustituido.
7. 7. El agente de tratamiento para uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde el derivado de benzopirano es N- [7-[(metilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi-4H-1-benzopiran-3-il]formamida, N-3-amino-4-oxo-6-fenoxi-4H-1-benzopiran- 7-il)metanosulfonamida, N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi-4H-3-il]acetamida, N-(4-oxo-6-fenoxi-4H-1- benzopiran-7-il)metanosulfonamida, 7-[(metilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi-4H-benzopiran-2-carboxamida, N-[7- [(metilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi-4H-1-benzopiran-2-il]acetamida, 7-[(metilsulfonil)amino]-6-fenoxi-4H-1- benzopiran-3-carboxamida, N-[7-[(etilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi-4H-1-benzopiran-3-il]formamida o N-(4-oxo-6- fenoxi-2-fenil-4H-1-benzopiran-7-il)metanosulfonamida.
8. 8. El agente de tratamiento para su uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde el derivado de benzopirano es N-[7-[(metilsulfonil)amino]-4-oxo-6-fenoxi-4H-1-benzopiran-3-il]formamida.
9. 9. El agente de tratamiento para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde el dolor neuropatico es fibromialgia, dolor postherpetico, neuropatia diabetica, dolor posterior a lesion de la medula espinal, dolor postapoplejico, dolor cronico, smdrome de dolor regional complejo, dolor lumbar para el cual los AINE son insuficientemente eficaces, ciatica, dolor pelvico, neuralgia del trigemino, dolor por osteoartritis para el cual los 5 AINE son insuficientemente eficaces, smdrome del dolor de la desaferenciacion, dolor debido a miositis, dolor debido a fasciitis, y dolor debido a artritis seronegativa.

   10