ES2642038T3

ES2642038T3 - Utilización de una base nutritiva compleja en el campo cosmético, especialmente el capilar

Info

Publication number: ES2642038T3
Application number: ES05850571.0T
Authority: ES
Inventors: Hugues Gatto
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2004-12-21
Filing date: 2005-12-21
Publication date: 2017-11-15
Anticipated expiration: 2025-12-21
Also published as: WO2006067335A1; CA2593923C; WO2006067335B1; JP2008524314A; CA2593923A1; CN101098674B; KR20070091647A; US20070248559A1; US7820148B2; FR2879443B1; FR2879443A1; EP1827365B1; KR101291489B1; CN101098674A; HK1116668A1; EP1827365A1; JP5448343B2

Description

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DESCRIPCION

Utilizacion de una base nutritiva compleja en el campo cosmetico, especialmente el capilar

La presente invencion se refiere a una base nutritiva compleja (abreviada como BNC) en medio acuoso, tambien denominada base econutritiva, adaptada para el tratamiento del cabello y/o del cuero cabelludo en el hombre o la mujer, y de sus diferentes usos en el campo de la cosmetica capilar.

Por "base nutritiva compleja", se entiende cualquier composicion o formulacion, en medio acuoso, que se distingue, como se indica a continuacion, de un medio de cultivo celular, por que excluye cualquier factor de crecimiento celular, y/o cualquier extracto de origen animal o celular, sin trazador, y que se parece a un medio de cultivo celular, porque permite por sf misma un cultivo viable in vitro de queratinocitos epidermicos humanos, por ejemplo, durante al menos 72 horas, con al menos una proliferacion clonal en el primer paso, sin asistencia nutritiva viva, tales como fibroblastos.

Se han descrito BNC de este tipo en el documento WO/96/21421, que describe su uso, sola o combinada con otros componentes, bien como principio activo o bien como excipiente.

Una BNC tal como la considerada de acuerdo con la presente invencion, no incluye, ni en su composicion original ni en su aplicacion, factores de crecimiento de origen celular, por ejemplo, EGF (Epidermal Growth Factor [factor de crecimiento epidermico ]), y/o ningun extracto biologico de origen animal o celular.

Por naturaleza, estos extractos no solamente tienen una composicion variable, es decir, indeterminada, incluso a veces un origen biologico mal determinado y, por tanto, sin posibilidad de trazabilidad o sin trazar, sino que tambien determinados componentes tienen una indeterminacion en lo que respecta a su estructura qmmica, especialmente bioqmmica, exacta.

Una BNC tal como la considerada de acuerdo con la presente invencion, no incluye ningun extracto biologico tal como suero feto de ternera (SFT), ni ningun extracto de glandula pituitaria de buey, no trazable o sin trazar.

Por "trazar" o "trazable", se entiende la caractenstica segun la que el origen y posteriormente el tratamiento de una materia biologica pueden establecerse y controlarse.

Una BNC de acuerdo con la presente invencion no incluye, por ejemplo, ningun extracto biologico celular, vegetal o animal, trazable o no, trazado o no.

Una BNC considerada de acuerdo con la presente invencion no incluye ningun principio activo medicamentoso, tal como un antibiotico.

Dichas BNC estan constituidas, ademas del medio acuoso, por una fraccion de aminoacidos, de los que algunos son esenciales, menor del 0,5%, preferentemente del 0,35% en peso, por una fraccion de vitaminas hidrosolubles inferior al 0,2%, y preferentemente al 0,015% en peso, y por una fraccion inorganica, con oligoelementos y sales metalicas, inferior al 5%, y preferentemente al 2% en peso, siendo el resto de la composicion agua.

Preferentemente, una BCN de acuerdo con la invencion esta completamente formulada en fase acuosa, a partir de entidades qmmicas, bioqmmicas y biologicas, donde la estructura de cada una de ellas esta identificada, por ejemplo, se sabe su nomenclatura o esta en un mdice, de forma que la composicion qmmica de la BNC esta estrictamente definida.

Una BCN de acuerdo con la invencion es el resultado de una accion de la mano del hombre, y este hecho no sena asimilable a ningun extracto de origen natural y/o biologico obtenido, por ejemplo, mediante el fraccionamiento de un material biologico, por ejemplo, animal o vegetal.

De acuerdo con el documento WO 96/21421, una base nutritiva de este tipo tiene, por ejemplo, la composicion siguiente, segun la Tabla 1 siguiente:

Tabla 1

COMPONENTES: Concentracion en mg/l

Agua: qsp.

Aminoacidos: 9,2

L-Alanina

L-Arginina HCl: 421,4

L-Asparagina (anhidra): 14,2

Acido L-aspartico: 4,0

L-Cistema HCl. H2O: 42,0

Acido L-glutamico: 14,8

L-Glutamina: 1754,4

Glicina: 7,6

L-Histidina HCl. H2O: 50,0

L-lsoleucina: 6,0

L-Leucina: 131,2

L-Lisina HCl: 54,0

L-Metionina: 13,5

L-Fenilalanina: 10,0

L-Prolina: 34,6

L-Serina: 126,1

L-Treonina: 24,0

L-Triptofano: 9,3

L-Tirosina 2 Na 2H2O: 11,7

L-Valina: 70,3

Vitaminas: 0,02

d-Biotina

Acido folico: 0,80

Nicotinamida: 0,04

Pantotenato D-Ca: 0,30

Piridoxina HCl: 0,06

Riboflavina: 0,04

Tiamina HCl: 0,30

i-Inositol: 18,0

Piruvato de sodio: 55,0

Timidina: 0,73

Adenina (HCl): 24,0

Acido DL-lipoico: 0,20

Componentes inorganicos: 6800,0

Cloruro de sodio

KCI: 112,0

Na2 HPO4: 284,0

CuSO4.5H2O: 0,003

Acetato de sodio: 300,0 (anhidro)

D-Glucosa: 1080,0

Hepes (piperazina): 6600,0

Fosforiletanolamina: 0,06768

Etanolamina: 0,04684

Sulfato de sodio: 3,4

Bicarbonato de sodio: 1160,0

FeSO4.7H2O: 1,39

MgCl2.6H2O: 120,0

CaCl2.2H2O: De 13,0 a 22,05

ZnSO4.7H2O: 0,144

(NH4)6 MoyO24.4H2O: 0,00120

Na2SiOa.5H2O: 0,142

MnCl2.4H2O: 0,00002

SnCl2.2H2O: 0,00011

NH4VO3: 0,00057

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J

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Bien 2808,3 mg o bien 0,281% en peso

Es decir 99,49 mg o

0099% en peso

Es decir, de 16474,2 mg a 16483,25 mg o aproximadamente un 1,65% en peso

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El documento EP-A-0 383 467 describe la utilizacion de jarabe de melazas, obtenidas de la industria azucarera, mediante aplicacion local sobre el cuero cabelludo (u otras zonas pilosas), para tratar los problemas de caspa y luchar contra la cafda del cabello.

Una jarabe de melaza es un extracto natural obtenido por fraccionamiento o separacion a partir de la cana de azucar, cuya composicion exacta sigue siendo indefinida o variable dependiendo de su origen, y que tiene un importante contenido, que representa al menos el 5% de la composicion total del jarabe, de azucares, es decir, glucosa, sacarosa, fructosa, y monooligosacaridos.

El documento FR-A-2 535 201 describe una composicion o preparacion cosmetica destinada especialmente a mejorar la nutricion de los folfculos pilosos. La parte activa de esta composicion consiste basicamente en un medio para el cultivo in vitro de celulas epiteliales humanas aisladas, complementado con suero de feto de ternera.

Como se ha indicado anteriormente, un medio de cultivo celular, adicionalmente complementado con suero de feto de ternera, no es una BNC tal como pretende la presente invencion.

De acuerdo con el documento-A-2 535 201, para mejorar el paso de las sustancias nutritivas desde el medio de cultivo a traves de la piel, la composicion cosmetica comprende un vefnculo o soporte dermofilo que comprende, por ejemplo, alcohol etflico, polialcoholes o poliglicoles, y emulsionantes, asf como agentes rubefacientes que tienen el papel de vasodilatadores locales.

Un vefnculo o soporte de transporte, no "ecologico", parece incompatible con una BNC tal como pretende la presente invencion, y que esta constituida principalmente por agua, ya que no respeta el equilibrio biologico de la parte superficial del cuerpo humano.

El documento US-C-5 597 575 describe una composicion medica topica, para estimular el rebrote del cabello, que incluye como principio activo una o varias vitaminas liposolubles, tales como la vitamina D3 (o algunos de sus derivados metabolicos activos), preferentemente fijados sobre micropartfculas minerales no cargadas.

Analogamente a Minoxidil, principio activo analizado a continuacion y que es un vasodilatador local, el modo de accion de esta composicion es el resultado de la irritacion inducida por la vitamina D3 en el cuero cabelludo, irritacion que produce una vasodilatacion superficial, la que estimula el crecimiento del tallo piloso, ya que el aumento de la vascularizacion de la papila dermica favorece el aporte de nutrientes a las celulas de la matriz del folfculo piloso.

Pero un efecto vasodilatador de ese tipo, generado por la accion irritante del principio activo, va siempre acompanado de una pequena inflamacion local, inaceptable en un tratamiento cosmetico.

La presente invencion tiene por objeto resolver los inconvenientes de las soluciones de la tecnica anterior identificados en lo que antecede.

En general, la invencion tiene por objeto adaptar una BNC tal como se ha definido anteriormente para responder espedficamente a las necesidades nutricionales de los queratinocitos de los folfculos pilosos o de la matriz del tallo del pelo (zona de crecimiento del tallo piloso situada por debajo de la papila dermica del folfculo piloso).

Mas concretamente, gracias a la aplicacion local de una base adaptada de esta forma, la invencion tiene por objeto un tratamiento cosmetico del cabello y/o del cuero cabelludo en el hombre o la mujer, que actua por simple puesta en contacto de la BNC con el cuero cabelludo o el cabello; y esto, ademas de, o independientemente de cualquier accion mecanica, tal como el masaje del cuero cabelludo, que favorezca la irrigacion sangumea del bulbo piloso o la vascularizacion del folfculo piloso y, por tanto, el crecimiento del tallo piloso, y con exclusion de cualquier efecto vasodilatador, aumentando la vascularizacion de la papila dermica, y favoreciendo por sf mismo el aporte de nutrientes a las celulas de la matriz del folfculo piloso.

La invencion tiene tambien por objeto un tratamiento no terapeutico del cabello y/o del cuero cabelludo que favorezca el rebrote del cabello y que estabilice el fenomeno de cafda, con exclusion de cualquier otra actividad relacionada con la caspa.

En un primer paso, la presente invencion tiene por objeto una base nutritiva compleja en medio acuoso que se distingue de un medio de cultivo celular por que excluye cualquier factor de crecimiento celular, y cualquier extracto biologico de origen animal o celular, de composicion indeterminada, sin trazador, y que se parece a un medio de cultivo celular, porque permite por sf misma un cultivo viable in vitro de un inoculo de queratinocitos epidermicos humanos, con al menos una proliferacion clonal de estos ultimos en el primer paso, sin asistencia nutritiva viva, estando constituida dicha base, ademas del medio acuoso, por una fraccion de aminoacidos inferior al 0,5%, y preferentemente al 0,35% en peso, una fraccion de vitaminas hidrosolubles inferior al 0,2%, y preferentemente al 0,015%, y una fraccion inorganica, con oligoelementos y sales metalicas, inferior al 5% en peso, y preferentemente al 2% en peso, de acuerdo con la reivindicacion 1.

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De acuerdo con la invencion, dicha base comprende una concentracion en peso total de aminoacido(s) azufrado(s) suficiente para permitir, en condiciones convencionales in vitro, un aumento de la smtesis de queratinas del tallo piloso del cabello en el hombre o la mujer.

Dicha BNC incluye, ademas, al menos una de las caractensticas siguientes, que se pueden considerar solas o en combinacion:

- su concentracion en peso total de aminoacido(s) azufrado(s) es como maximo igual a 104 mg/l,

- su concentracion en peso total de aminoacidos, de los que los aminoacidos azufrados, esta comprendida entre 0,25 y 0,35%, y por ejemplo igual a aproximadamente un 0,326%,

- la concentracion en peso de la fraccion de vitaminas esta comprendida entre 0,005 y 0,011%,

- su concentracion en peso de componentes organicos, con oligoelementos y sales metalicas, esta comprendida entre 1,25 y 1,35%, y por ejemplo igual a un 1,347-1,348% en peso,

- su concentracion en glucosa esta comprendida entre 0,1% y 0,6%, y por ejemplo comprendida entre 0,45% y 0,6%,

- su concentracion en L-hidroxiprolina esta comprendida entre 0,01% y 0,01%, y por ejemplo comprendida entre 0,003% y 0,01%,

- su concentracion en acido ascorbico esta comprendida entre 0,00001%, y 0.001%, y por ejemplo comprendida entre 0,0001% y 0,001%

- su concentracion en cada uno de los compuestos siguientes, es decir adenosina, guanina, desoxirribosa y ribosa, esta comprendida entre 0,000001% y 0,0001%, y por ejemplo comprendida entre 0,00001% y 0,0001%,

- comprende una cantidad cosmeticamente activa de al menos un inhibidor de la enzima 5a-reductasa de tipo I.

- el inhibidor de la enzima 5a-reductasa de tipo I comprende una sal de cinc, por ejemplo, de sulfato de cinc, y/o vitamina B6.

- la base nutritiva compleja comprende una cantidad total de calcio comprendida entre 0 y 22,05 mg/l, y preferentemente comprendida entre 5 y 15 mg/l,

- la base nutritiva compleja comprende peptidos extrafdos de la leche, a una concentracion comprendida entre 0,01 y 1% en peso,

- el pH de la fase acuosa esta ajustado entre 7,4 y 7,5,

- la osmolaridad de la fase acuosa esta ajustada, como maximo, entre 300 y 350 pOsm.

La presente invencion tiene por objeto, por tanto, adaptar una BNC, tal como se ha definido anteriormente, a diferentes aplicaciones cosmeticas, como el tratamiento del cabello y/o del cuero cabelludo en el hombre o la mujer.

En un segundo paso, la invencion se refiere a una composicion cosmetica de uso local, especialmente para el tratamiento del cabello y/o del cuero cabelludo en el hombre, que comprenda una BNC tal como se ha definido anteriormente.

En un tercer paso, la presente invencion se refiere al uso de una BNC tal como se ha definido anteriormente, para fabricar u obtener una composicion cosmetica adaptada a un tratamiento no terapeutico del cabello y/o del cuero cabelludo en el hombre o la mujer.

En un cuarto paso, la invencion se refiere a un procedimiento de tratamiento no terapeutico del cabello y/o del cuero cabelludo, en el hombre o la mujer, que consiste de una forma general en aplicar de una forma local y superficial, sobre el cuero cabelludo, una BNC tal como se ha definido anteriormente.

Un procedimiento de este tipo permite tratar la alopecia androgena del adulto, en el hombre o la mujer.

Un procedimiento de este tipo permite estimular el crecimiento de queratinocitos en la matriz del tallo del cabello y, por tanto, favorecer el rebrote del cabello, y estabilizar el fenomeno de cafda. Por tanto, este procedimiento esta indicado en el caso de una cafda de cabello moderada, y especialmente en caso de alopecia androgena.

Preferentemente, la BNC se aplica una o dos veces al dfa sobre el cuero cabelludo del hombre o de la mujer en tratamiento.

La funcion inhibidora de la enzima 5a-reductasa de tipo I, de cualquier producto, compuesto o sustancia, o de cualquier cantidad cosmetica activa de esta ultima, se puede caracterizar o poner de relevancia segun las ensenanzas de la publicacion:

- D. Stamatiadis et al, "Inhibition of 5a-reductase activity, in human skin by zinc and azelaic acid', British Journal of Dermatology (1988) 119, 627-632; cf especialmente las paginas 628-629.

De acuerdo con este metodo de caracterizacion:

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- los materiales usados son 1,2[ H]-testosterona, [ C]-testosterona, [ C]-dihidrotestosterona, y [ C]-A4- androstenodiona, y los [14C]-androstenodioles, asf como el NADPH;

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- la fuente in vitro de la enzima 5a-reductasa esta compuesta por muestras de piel de prepucios de bebes de 2 a 3 meses;

- se incuban los homogenates de esta piel en presencia de concentraciones crecientes de [3H]-testosterona y de NADPH, asf como el producto o la sustancia candidata a la inhibicion; tras la adicion de los [14C] esteroides, se separan los metabolites, y se determinan las cantidades de testosterona y de A4- androstenodiona.

Tratandose de peptidos naturales, o de origen natural, que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invencion, se utilizaran fracciones o extractos obtenidos a partir de leche de origen animal, denominados a partir de ahora en el presente documento "Milk Peptide Complex [Complejo de peptidos lacteos]" o MPC, por ejemplo, el extracto denominado Whey Protein (Lactis Proteinum) que tiene como n.° CAS 84082-51-9 y el n.° EinEcS 281-998-7, fabricado y vendido por la empresa CLR-Chemisches Laboratorium de la Republica Federal de Alemania.

Este extracto tiene, como ejemplo, los datos analtticos siguientes:

pH 5,0-7,0

(0,5% de MPC en polvo en H2O)

Perdida tras desecacion (2 h a 102°C) 2,0-6,0%

Nitrogeno (Kjeldahl) 1,4-1,9%

Protemas (Kit Sigma BCA-1) 11,0-16,0%

Lactosa (Kit Boehringer) 65,0-71,0%

Acido (+) Lactico (Kit Boehringer) 4,5-8,0%

Cenizas (1000°C) 6,0-9,0%

Grasa residual <0,5%

Electroforesis (SDS-PAGE) corresponde

Actividad biologica CE50 50-500 pg/ml

(ensayo de migracion)

Como se trata de aminoacido(s) azufrado(s) que se pueden utilizar de acuerdo con la caractenstica de composicion (f), su concentracion en peso que permite aumentar la smtesis de las queratinas del tallo piloso, se puede determinar mediante la aplicacion del ensayo descrito en el ejemplo 3.

Como se trata en particular del tratamiento del cabello y/o del cuero cabelludo, la aplicacion de la presente invencion conlleva las siguientes ventajas determinantes:

- desarrollo del crecimiento de queratinocitos en la matriz del tallo del cabello, lo que favorece el crecimiento o el rebrote del cabello y estabiliza el fenomeno de cafda, especialmente en el caso de alopecia androgena del adulto,

- practicamente no existe ningun efecto secundario o indeseable, tal como hipertricosis a distancia.

Mas generalmente, en sus aplicaciones cosmeticas, una BNC de acuerdo con la presente invencion tiene un uso especialmente simple, no graso y no adherente. Es bien tolerada localmente, y esta desprovista de efectos secundarios e indeseados, tales como irritaciones locales, sensaciones de ardor y prurito, eczema de contacto y, en algunos casos, modificacion de la presion arterial y del pulso.

Una BNC de acuerdo con la presente invencion parece desprovista de citotoxicidad, independientemente de su concentracion en la composicion a la que pertenece, por ejemplo, con un excipiente.

La presente invencion se describe ahora, como ejemplo, con una composicion en peso de acuerdo con la Tabla 2.

En particular, a continuacion, en su aplicacion capilar, es decir, para el tratamiento del cabello y/o del cuero cabelludo, una BCN de acuerdo con la invencion se comparara con una especialidad farmaceutica que tenga la misma indicacion, pero medica, es decir, el Minoxidil (Denominacion comun internacional).

Tabla 2

NRO. LfNEA: DENOMINACION INTERNACIONAL NOMENCLATURA DEL INGREDIENTE COSMETICO (NOMBRE INCI) CONCENTRACION En mg/l

1: AGUA q.s.p. (1000 ml)

2: CLORURO DE SODIO (Cl)_________________ 6085

3: GLUTAMINA (AA) 2043.2

4: BICARBONATO DE SODIO (Cl) 1160

5: GLUCOSA (Cl) 4500

6: ARGININA HCl (AA) 421,4

7: ACETATO DE SODIO (Cl) 300

8: FOSFATO DISODICO (Cl) 284

9: LEUCINA (AA) 131,2

10: SERINA (AA) 136,6

11: CLORURO DE Mg (Cl) 120,0

12: CLORURO DE K (Cl) 112

13: VALINA (AA) 70,3

14: PIRUVATO DE SODIO (V) 55

15: LISINA HCl (AA) 54

16: HISTIDINA HCl (AA) 50

17: CISTEiNA HCL (AA)* 84

18: ADENINA (V) 24

19: TREONINA (AA) 24

20: CLORURO DE Ca (Cl) 0 a 22,05

21: INOSITOL (V) 18

22: Acido glutAmico (AA) 29,5

23: ASPARAGINA (AA) 29,2

24: METIONINA (AA)* 20

25: TIROSINA (AA) 11,7

26: FENILALANINA (AA) 10,0

27: TRIPTOFANO (AA) 9,3

28: ALANINA (AA) 18,1

29: GLICINA (AA) 15,1

30: ISOLEUCINA (AA) 6,0

31: Acido aspArtico (AA) 17,3

32: SULFATO DE SODIO (Cl)_________________ 3,4

33: SULFATO FERROSO (Cl) 1,4

34: Acido fOlico (V) 1,8

35: TIMIDINA (V) 0,73

36: CIANOCOBALAMINA (V) 0,41

37: PANTOTENATO DE CALCIO (V) 1,3

38: TIAMINA HCl (V) 1,3

39: Acido tiOctico (V) 0,3

40: SULFATO DE CINC (Cl) 0,288

41: SILICATO DE SODIO (Cl) 0,142

42: PIRIDOXINA HCl (Cl) 2,1

43: NIACINAMIDA (V) 1,04

44: RIBOFLAVINA (V) 0,4

45: BIOTINA (V) 0,02

46: SULFATO DE COBRE (Cl) 0,003

47: MOLIBDATO AMONICO (Cl) 0,00120

48: VANADATO AMONICO (Cl) 0,003

49: CLORURO DE Mn (Cl) 0,00002

50: HIALURONATO DE SODIO (Cl) 700

51: HIDROXIPROLINA (AA) 30

52: PROLINA (AA) 46

53: Acido ascOrbico (V) 1

54: ADENOSINA (V) 0.1

55: GUANINA (AA) 0.1

56: DESOXIRRIBOSA (Cl) 0.1

57: RIBOSA (Cl) 0.1

58: "COMPLEJO DE PEPTIDOS LACTEOS" (Cl) 200

59: CLORURO DE COLINA (AA) 1

60: MIOINOSITOL (V) 2

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A= Aminoacido = 3258 mg = 0,326% en peso * = Aminoacido azufrado

V= Vitamina = 109,5 mg =0,011 % en peso

Cl= Componente inorganico = 13466 mg a 13488 mg = 1,347% a 1,348% en peso

Ejemplo 1

Se trata de un ensayo relativo al Minoxidil, como compuesto de referencia, para comparar a continuacion la eficacia de una BCN de acuerdo con la invencion, con respecto a dicho compuesto de referencia.

El objetivo del ensayo es evaluar el efecto del Minoxidil (en forma de sulfato hidrosoluble) sobre la viabilidad celular de queratinocitos humanos normales.

La viabilidad celular de los queratinocitos se evalua mediante la tecnica de conversion del WST-1(*), que consiste en evaluar la actividad del sistema mitocondrial succinato-tetrazolio reductasa de las celulas vivas.

El WST-1 (Boehringer/Roche) se reduce en un precipitado coloreado de formazan. La viabilidad celular se determina mediante lectura espectrofotometrica a 450 nm. La intensidad de la densidad optica es proporcional al numero de celulas vivas.

(*) Sal de tetrazolio WST-1: (4-(3-(4-yodofenil)-2-(4-nitrofenil)2H-5-tetrazolio)-1,3-benzeno disulfonato).

Se obtuvieron los siguientes resultados:

Hasta una concentracion del 0,01%, se observa una ausencia de efecto citotoxico del Minoxidil, tras 24 y 48 h de contacto. Incluso, se puede notar un efecto de estimulacion del crecimiento celular a una concentracion del 0,001%.

Mas alla de esto, se observa, a partir del 0,1%, un efecto citotoxico muy importante, de una intensidad similar para las 3 concentraciones mas elevadas.

Se aplica el siguiente metodo:

Siembra

Los queratinocitos se sembraron en microplacas de 96 pocillos a razon de 20.000 celulas por pocillo en 200 pl de medio de cultivo convencional KSFM (Invitrogen). Las placas se incubaron durante 24 h a 37°C en atmosfera humeda que contema un 6% de CO2.

Intervalo de concentraciones estudiadas

Las diferentes concentraciones a ensayar se prepararon a partir de una solucion madre de Minoxidil (sulfato hidrosoluble) al 5% en PBS.

El intervalo de concentraciones estudiadas esta comprendido entre 0,0001% y 2%.

Tratamiento

Tras la eliminacion del medio KSFM, las diferentes diluciones de Minoxidil se pusieron en contacto con las celulas. Los medios no se renovaron durante la experimentacion.

Cada punto se realizo por cuadruplicado.

La citotoxicidad (ensayo del WST-1) se midio despues de 24 y 48 horas de contacto.

Analisis

La densidad optica se leyo con un lector de microplacas ELISA a 450 mm.

Ejemplo 2

El objetivo de este ensayo es evaluar el crecimiento de queratinocitos humanos normales, sembrados a baja densidad en la BNC cuya composicion se describe en la Tabla 2.

El estudio se realizo en esta BNC, con 0,2 mg/ml de complejo MPC (y sin complejo MPC), comparado con el medio de cultivo normalizado de queratinocitos, el KSFM.

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Se procedio de la forma siguiente:

Los queratinocitos se sembraron a baja densidad en una placa de 96 pocillos en el medio normalizado KSFM, y crecieron durante 24 horas despues de la siembra en este medio.

El 2° dfa, las celulas se introdujeron en los diferentes medios estudiados:

- KSFM

- BNC de acuerdo con la tabla 2, sin complejo MPC

- BNC de acuerdo con la tabla 2, con complejo MPC a 0,2 mg/ml

Cada condicion se realizo por cuadruplicado. Los medios se renovaron cada 3 dfas durante la experimentacion.

La densidad celular se evaluo 24 h despues de la siembra de las celulas, antes de la puesta en contacto con las diferentes condiciones del estudio (= T0), a continuacion, la concentracion de los queratinocitos se evaluo en el 2°, 4°, 6° y 8° dfas de cultivo segun el metodo de conversion del WST-1 (lectura a 450 nm).

El crecimiento celular se analizo por medida de la viabilidad celular en diferentes momentos de la experimentacion:

• En presencia de complejo MPC a la concentracion de 0,2 mg/ml, se observa un crecimiento celular continuo de los queratinocitos con la BNC de acuerdo con la Tabla 2.

• Sin adicion del complejo MPC, se observa una ausencia de crecimiento celular con la BNC de acuerdo con la Tabla 2 (en condiciones hipocaloricas).

En conclusion, en las condiciones experimentales asf definidas, con una BNC que comprendfa un complejo MPC a la concentracion de 0,2 mg/ml, se observo un crecimiento celular regular de queratinocitos humanos normales durante los 8 dfas del cultivo, de una intensidad superior a la observada con la misma BNC, pero sin dicho complejo.

Ejemplo n.° 3

Se trata de evaluar el efecto de la BCN de acuerdo con la Tabla 1 sobre la proliferacion y diferenciacion de fragmentos de cuero cabelludo mantenidos en supervivencia.

El fin de este ensayo es poner de manifiesto la eficacia de la base de acuerdo con la Tabla 1 sobre la supervivencia ex vivo de fragmentos de cuero cabelludo humano. La evaluacion de la proliferacion mediante el anticuerpo Ki67 se llevo a cabo en la vaina epitelial externa que rodea el cabello. La evaluacion de la diferenciacion de los queratinocitos mediante un anticuerpo dirigido contra citoqueratinas totales se realizo en el tallo piloso del cabello y, mas especialmente, en su corteza.

Se aplicaron los siguientes materiales y metodos:

1) Mantenimiento en supervivencia de cuero cabelludo en presencia de la BNC de acuerdo con la Tabla 1

Fragmentos de cuero cabelludo de 5 donantes diferentes (pacientes afectados por alopecia androgena, tomados en la confluencia entre la zona donde persiste cabello y la zona alopecica) se depositaron en inserciones introducidas en pocillos de cultivo.

Puesto que la BNC carece de conservantes, se anadieron antibioticos (fungizone, gentamicina). La eficacia de la BNC sobre la supervivencia y diferenciacion de los fragmentos de piel se comparo con la obtenida en presencia de un tampon fosfato de tipo PBS. La BNC de acuerdo con la Tabla 1 comparada con el PBS se anadio diariamente en el fondo de los pocillos, realizandose un paso por difusion lenta entre ambos compartimentos mediante una membrana porosa (12 pm).

Los fragmentos de cuero cabelludo se mantuvieron en supervivencia en una estufa a 37°C y en una atmosfera aire/CO2 5% durante 48 horas.

Analisis

Los fragmentos de cuero cabelludo se fijaron en solucion de Bouin y se incluyeron en parafina.

La evaluacion inmunohistoqmmica de la proliferacion se estudio en la vaina epitelial externa que rodea el cabello. Esta vaina epitelial externa esta considerada histologicamente como la prolongacion de la epidermis superficial. La evaluacion de la diferenciacion se realizo en el plano cortical del tallo piloso. Efectivamente, la parte central del tallo piloso esta constituida por medula (columna central constituida por celulas sin nucleo), corteza compuesta por celulas queratinizadas que contienen pigmentos de melanina y cutfcula.

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55

a) Analisis inmunohistoqmmico de la actividad mitotica de la vaina epitelial externa de los folmulos pilosos

La proliferacion epitelial se analizo mediante inmunohistoqmmica mediante un anticuerpo dirigido contra Ki67 (marcador de las celulas en fases M, S, G1 y G2 del ciclo celular). La inmunodeteccion se llevo a cabo mediante una tecnica de inmunoperoxidasa indirecta en 3 capas, amplificada (kit DAKO) y revelada con DAB.

El numero de celulas marcadas se evaluo en la vaina epitelial externa de secciones del bulbo piloso presentes en el cuero cabelludo (8 a 10 por copa). De esta forma se calculo el numero de celulas en proliferacion.

b) Analisis inmunohistoqmmico de la diferenciacion epitelial de la corteza del tallo piloso

La diferenciacion epitelial se puso de manifiesto con un anticuerpo dirigido contra las citoqueratinas totales (Novocastra).

La inmunodeteccion se llevo a cabo mediante una tecnica de inmunoperoxidasa indirecta en 3 capas (kit ABC Peroxydase, Vector Laboratories) y revelada con DAB (Diaminobenzidina).

La intensidad del marcado inmunohistoqmmico se evaluo mediante las puntuaciones semicuantitativas siguientes para todos los folmulos pilosos de la copa de cuero cabelludo examinada:

- negativo: puntuacion 0 -

- ligero: puntuacion 1

- moderado: puntuacion 2

- importante: puntuacion 3

- muy importante: puntuacion 4

3) Estadistica

El analisis estadfstico se realizo mediante la denominada prueba de Student de desviacion reducida, o prueba de muestras emparejadas. El umbral de significado se fijo en el 5%.

Se obtuvieron los siguientes resultados:

a) Analisis inmunohistoqmmico de la actividad mitotica en la vaina epitelial externa de los folfculos pilosos El analisis de la actividad mitotica se expone en la tabla I siguiente.

El tratamiento con la BNC de acuerdo con la Tabla 1 permitio aumentar significativamente la renovacion de las celulas epiteliales (p < 0,05). Efectivamente, despues del tratamiento, un 7,6% de las celulas de la vaina epitelial externa estan marcadas con el anticuerpo dirigido contra Ki67, en comparacion con un 2,6% de los cueros cabelludos tratados con PBS. Tambien se realizo un analisis del mdice mitotico en la epidermis superficial. Los resultados tambien favorecen la BNC de acuerdo con la Tabla 1, con un mdice de proliferacion del 6,4% versus 1,1% (p < 0,05).

b) Analisis para inmunohistoqmmico de la diferenciacion epitelial en la corteza del tallo piloso El analisis de la diferenciacion epitelial se expone en la tabla II siguiente.

La diferenciacion epitelial tiende a ser de mejor calidad en los cueros cabelludos tratados con la BNC de acuerdo con la Tabla 1, en comparacion con los tratados con PBS: la puntuacion global obtenida es de 3,3 frente a 2,4. No se ha obtenido una diferencia significativa, sin embargo, el analisis caso por caso permite observar una diferenciacion mucho mejor en 3 casos tratados con BNC de acuerdo con la Tabla 1 sobre 5, y una diferenciacion no modificada en 1 caso.

tabla I:

Proliferacion celular (inmunohistoqmmica mediante el anticuerpo dirigido contra Ki67): % de celulas marcadas en la epidermis superficial y en la vaina epitelial externa de los folmulos pilosos

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15

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35

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45

50

: epidermis Vaina epitelial externa

Cuero cabelludo + BNC de acuerdo con la Tabla 1: 6,4 ± 2,7* 7,6 ± 1,9*

Cuero cabelludo + PBS: 1,1 ± 0,9 2,6 ± 1,9

*: comparacion entre la BNC de acuerdo con la Tabla 1 y el control PBS: diferencia estadfsticamente significativa (prueba de Student emparejada monolateral, p < 0,05)

tabla II:

Diferenciacion epitelial (inmunohistoqmmica mediante un anticuerpo dirigido contra citoqueratinas totales) de la corteza de los tallos pilosos_______________________________________________________________________

Cuero cabelludo + BNC de acuerdo con la tabla 1: 2,4 ± 1

Cuero cabelludo + PBS: 3,3 ± 0,9

En conclusion, el tratamiento con la BNC de acuerdo con la Tabla 1 permite obtener un aumento estadfsticamente significativo del mdice mitotico en la vaina epitelial externa de los folmulos pilosos. La diferenciacion epitelial de la corteza de los tallos pilosos mejora, pero sin embargo, sin caracter significativo.

Ejemplo n.° 4

Este ensayo tiene por objeto someter a ensayo el efecto de la BNC de acuerdo con la Tabla 2 sobre la estimulacion del bulbo piloso (proliferacion celular) a partir de fragmentos de cuero cabelludo mantenidos en supervivencia.

De acuerdo con el ejemplo n.° 3, se puso de manifiesto un aumento estadfsticamente significativo del mdice mitotico en la vaina epitelial externa tras el mantenimiento en supervivencia de folmulos pilosos en presencia de una BNC de acuerdo con la Tabla 1.

El objetivo del presente estudio es poner de manifiesto la eficacia de una BCN de acuerdo con la invencion y de acuerdo con la Tabla 2, sobre la estimulacion del bulbo piloso. La evaluacion de la proliferacion celular, mediante el anticuerpo dirigido contra Ki67, se realizo en la zona matricial del bulbo (zona de crecimiento del tallo piloso), pero tambien en la vaina epitelial externa del folmulo piloso.

Se aplicaron los siguientes materiales y metodos

1) Mantenimiento en supervivencia de cuero cabelludo en presencia de una BNC de acuerdo con la Tabla 2

Fragmentos de cuero cabelludo procedente de 6 donantes diferentes (estiramiento cervico-facial de sujeto no alopecico) se depositaron en inserciones introducidas en pocillos de cultivo.

La eficacia de la BNC de acuerdo con la Tabla 2 sobre la supervivencia y la estimulacion de los bulbos pilosos se comparo, por una parte, con la obtenida en presencia de un tampon fosfato de tipo PBS y, por otra parte, en presencia de un compuesto de referencia estudiado en 2 concentraciones, Minoxidil al 0,01 y al 2% (dilucion en el tampon PBS), Minoxidil al 0,01%, que es una dosis no citotoxica sobre cultivos en monocapa de queratinocitos humanos normales, al 2% que es la concentracion utilizada in vivo en el ser humano, en la mayona de especialidades comercializadas para el tratamiento de la alopecia. Puesto que carecen de conservantes, se anadieron antibioticos a todos los medios estudiados (fungizone, gentamicina). Se anadieron diariamente en el fondo de los pocillos, realizandose un paso por difusion lenta entre ambos compartimentos mediante una membrana porosa (12 pm).

2) Analisis inmunohistoqmmico de la actividad mitotica en el bulbo piloso y en la vaina epitelial externa del folmulo piloso

5

10

15

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35

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45

50

55

La evaluacion inmunohistoqmmica de la proliferacion se realizo en el bulbo piloso, asf como en la vaina epitelial externa que rodea el cabello. Esta vaina epitelial externa esta considerada histologicamente como la prolongacion de la epidermis superficial.

La proliferacion epitelial se analizo mediante inmunohistoqmmica mediante un anticuerpo dirigido contra Ki67 (marcador de las celulas en fases M, S, G1 y G2 del ciclo celular). La inmunodeteccion se llevo a cabo mediante una tecnica de inmunoperoxidasa indirecta en 3 capas, amplificada (kit DAKO) y revelada con AEC.

El numero de celulas marcadas de la vaina epitelial externa se conto entre el origen de las glandulas sebaceas y el comienzo de la zona bulbosa. Por otra parte, tambien se enumeraron las celulas de la matriz marcadas en los bulbos pilosos. De esta forma, se calculo el numero de celulas en proliferacion con respecto a las celulas no marcadas.

3) Estadistica

Se obtuvieron los siguientes resultados:

a) Analisis inmunohistoqmmico de la actividad mitotica en los bulbos pilosos El analisis de la actividad mitotica se expone en la tabla I siguiente.

La incubacion de fragmentos de cuero cabelludo en presencia de la BNC de acuerdo con la Tabla 2 indujo un aumento significativo del mdice mitotico en las celulas de la matriz del bulbo piloso (15,2% de celulas marcadas), en comparacion con el tampon PBS (0,26% de celulas positivas) o con el Minoxidil 0,01% (4,2% de celulas positivas) (p < 0,05). El mdice de proliferacion obtenido con la BNC de acuerdo con la Tabla 2 esta proximo al observado con el Minoxidil al 2% (11,60% de celulas positivas).

b) Analisis inmunohistoqmmico de la actividad mitotica en la vaina epitelial externa de los folmulos pilosos El analisis de la actividad mitotica se expone en la tabla II siguiente.

La incubacion de fragmentos de cuero cabelludo en presencia de la BNC de acuerdo con la Tabla 2 indujo un aumento significativo del mdice mitotico en los queratinocitos de la vaina epitelial externa de los folmulos pilosos (22,3% de celulas marcadas), en comparacion con el tampon PBS (2,6% de celulas positivas) (p < 0,05). De acuerdo con el ejemplo n.° 3, el tratamiento con una BNC de acuerdo con la Tabla 1 ya habfa permitido aumentar significativamente la renovacion de las celulas en la vaina epitelial, pero con una eficacia muy inferior a la medida de acuerdo con la Tabla 2 (p < 0,05). Efectivamente, despues del tratamiento, solamente un 7,6% de las celulas de la vaina epitelial externa estaban marcadas con el anticuerpo dirigido contra Ki67, en comparacion con un 2,6% de los cueros cabelludos tratados con PBS.

tabla I:

Proliferacion celular (inmunohistoqmmica mediante el anticuerpo dirigido contra Ki67): % de celulas de la matriz marcadas en el bulbo del folmulo piloso

N = 6: %

Cuero cabelludo + BNC de acuerdo con la Tabla 2: 15,2 ±6,7*#

Cuero cabelludo + PBS: 0,26 ± 0,6

Cuero cabelludo + Minoxidil 0,01%: 4,2 ± 2,45

Cuero cabelludo + Minoxidil 2%: 11,6 ± 8,7

* comparacion entre BNC de acuerdo con la Tabla 2 y PBS: diferencia estadfsticamente significativa (prueba de Student emparejada monolateral, p < 0,05)

# comparacion entre BNC de acuerdo con la Tabla 2 y Minoxidil 0,01%: diferencia estadfsticamente significativa (prueba de Student emparejada monolateral, p < 0,05)

10

15

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25

tabla II

Proliferacion celular (inmunohistoqmmica mediante un anticuerpo dirigido contra Ki67): % de celulas marcadas en la vaina epitelial externa de los folmulos pilosos

N = 6: %

Cuero cabelludo + BNC de acuerdo con la Tabla 2: 22,3 ± 4,4*#

Cuero cabelludo + PBS: 2,6 ± 2,7

Cuero cabelludo + Minoxidil 0,01%: 10,2 ± 5

Cuero cabelludo + Minoxidil 2%: 17,6 ± 7#

# comparacion entre BNC de acuerdo con la Tabla 2 y PBS: diferencia estad^sticamente significativa (prueba de Student emparejada monolateral, p < 0,05)

# comparacion entre Minoxidil 0,01% y Minoxidil 2%: diferencia estadfsticamente significativa (prueba de Student emparejada monolateral, p < 0,05).

N = 5, para recuerdo: %

Cuero cabelludo + BNC de acuerdo con la Tabla 1: 7,6 ± 1,9*

Cuero cabelludo + PBS: 2,6 ± 1,9

En este estudio, se pone de manifiesto un aumento significativo de la proliferacion de los queratinocitos en la vaina epitelial externa de los folmulos pilosos con la BNC de acuerdo con la Tabla 2, en comparacion con el Minoxidil 0,01% (10,2% de celulas positivas) (p < 0,05). Este mdice de proliferacion celular (22,3%) esta cerca del obtenido con el Minoxidil 2% (17,6% de celulas positivas).

En conclusion, con un modelo de fragmento de cuero cabelludo mantenido en supervivencia, el tratamiento con una BNC de acuerdo con la Tabla 2 permite obtener un aumento estadfsticamente significativo del mdice mitotico de las celulas de la matriz del bulbo piloso y de los queratinocitos de la vaina epitelial externa de los folmulos pilosos. El resultado es muy superior al obtenido con una BNC de acuerdo con la Tabla 1.

Claims

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50

55

REIVINDICACIONES

1. Base nutritiva compleja en medio acuoso, destinada a su uso en un tratamiento para favorecer el brote de cabello y estabilizar el fenomeno de ca^da, que se distingue de un medio de cultivo celular, por que excluye cualquier factor de crecimiento celular, y cualquier extracto biologico de origen animal o celular, de composicion indeterminada, sin trazabilidad, que se parece a un medio de cultivo celular, y constituida, ademas del medio acuoso, por una fraccion de aminoacidos inferior al 0,5%, y preferentemente al 0,35% en peso, por una fraccion de vitaminas hidrosolubles inferior al 0,2%, y preferentemente al 0,015%, y por una fraccion inorganica, con oligoelementos y sales metalicas, inferior al 5% en peso, y preferentemente al 2% en peso, y por que comprende ademas las siguientes caractensticas:

- una concentracion en peso total de aminoacido(s) azufrado(s) como maximo igual a 104 mg/l

- peptidos extrafdos de la leche a una concentracion comprendida entre 0,01 y 1% en peso.

- la concentracion en peso total de aminoacidos, de los que los aminoacidos azufrados, esta comprendida entre 0,25 y 0,35%,

- la concentracion en peso de la fraccion de vitaminas esta comprendida entre 0,005 y 0,015%,

- la concentracion en peso de componentes inorganicos, con oligoelementos y sales metalicas, esta comprendida entre 1,25 y 1,35%,

- la concentracion de glucosa esta comprendida entre 0,1% y 0,6%,

- la concentracion de hidroxiprolina esta comprendida entre 0,003% y 0,01%,

- la concentracion de acido ascorbico esta comprendida entre 0,00001% y 0,001%,

- la concentracion de cada uno de los compuestos siguientes, es decir adenosina, guanina, desoxirribosa y ribosa, esta comprendida entre 0,000001% y 0,0001%,

- comprende al menos un inhibidor de la enzima 5a-reductasa de tipo I,

- comprende una cantidad total de calcio comprendida entre 0 y 22,05 mg/l.
2. Base de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizada por que la concentracion en peso total de aminoacidos, entre los que los aminoacidos azufrados es igual a aproximadamente un 0,326%.
3. Base de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizada por que la concentracion de peso de la fraccion de vitaminas es igual a aproximadamente un 0,011%.
4. Base de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizada por que la concentracion en peso de componentes inorganicos, con oligoelementos y sales metalicas, es igual a 1,347-1,348% en peso.
5. Base de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizada porque su concentracion en glucosa esta comprendida entre 0,45% y 0,6%.
6. Base de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizada porque su concentracion de acido ascorbico esta comprendida entre 0,0001% y 0,001%.
7. Base de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizada por que su concentracion en cada uno de los compuestos siguientes, es decir adenosina, guanina, desoxirribosa y ribosa, esta comprendida entre 0,00001% y 0,0001%.
8. Base de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizada por que el inhibidor de la enzima 5a-reductasa de tipo I es una sal de cinc, por ejemplo, de sulfato de cinc, y/o vitamina B6.
9. Base de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizada por que comprende una cantidad total de calcio comprendida entre 5 y 15 mg/l.
10. Base de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizada por que el pH de la fase acuosa esta ajustado entre 7,4 y 7,5.
11. Base de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizada por que la osmolaridad de la fase acuosa esta ajustada, como maximo, entre 300 y 350 pOsm.
12. Base nutritiva compleja de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11 destinada a usarse como medicamento para el tratamiento de la alopecia androgena del adulto, en el hombre o la mujer.