JPH09275997A - メラニン産生抑制物質の評価方法とメラニン産生抑制 剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 メラニン産生抑制物質を簡便かつ高精度に評
価する方法と、副作用の少ないメラニン産生抑制剤を提
供する。 【解決手段】 被検物質を添加した培養液でメラニン産
生細胞を所定期間培養し、培養したメラニン産生細胞を
膜にスロットブロットし、ブロットされた膜上のメラニ
ン産生細胞の色調を画像処理装置により測定し、この色
調を指標として被検物質のメラニン産生抑制効果を評価
するメラニン産生抑制物質の評価方法と、この評価方法
によりその有効性が確認されたκ−カゼイン等のメラニ
ン産生抑制物質を有効成分とするメラニン産生抑制剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、メラニン産生抑
制物質の評価方法とメラニン産生抑制剤に関するもので
ある。さらに詳しくは、この発明は、皮膚の色素沈着の
予防または治療に有効なメラニン産生抑制物質を評価す
るための方法と、この評価方法で評価されたメラニン産
生抑制物質を有効成分として含有するメラニン産生抑制
剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】皮膚のメラニン沈着は、メラニン産生細
胞であるメラノサイト内にメラニンが沈着すること、お
よびメラノサイトの樹状突起からメラニンが表皮角化細
胞に移行することによって生じることが知られている
［アメリカン・サイエンティスツ(American Scientist
s) 、第７０巻、第１３６ページ、１９８２年］。一般
にシミ、ソバカス、日焼け等における皮膚の色素沈着
は、皮膚内に存在するメラニン色素産生細胞がメラニン
色素を過剰に産生することに起因するとされている。以
前から、メラニン色素の沈着を予防または治療する美白
剤の開発を目的としたメラニン色素の産生を抑制する物
質の評価が広く実施されている。

【０００３】チロシナーゼは、チロシン、その他の１価
フェノール類および相当するオルソ−２価フェノール類
の分子状酵素による酸化を触媒する酵素であり、キノ
コ、ジャガイモ、リンゴ等多くの植物および動物組織に
広く存在し、植物においては切傷部分の黒変現象に関与
し、動物においては組織、特に皮膚のメラニン色素の生
成に関与していることが知られている（化学大辞典編集
委員会編、化学大辞典、第５巻、第９７６ページ、共立
出版、昭和３５年）。チロシナーゼがメラニン色素の生
成に関与する酵素であることから、美白剤開発のため、
特にマッシュルーム由来のチロシナーゼを用い、その酵
素活性を阻害する物質が評価されている。

【０００４】また、従来の美白剤の開発研究において
は、メラニン産生細胞のメラニンの産生に対する効果を
評価することによってメラニン産生抑制物質を評価する
方法も一般的に採用さられている。これらの評価方法で
評価された物質は極めて多数存在する。チロシナーゼ活
性阻害剤としては、例えば、システイン、グルタチオ
ン、ビタミンＣ（三島豊等、基礎皮膚化学、第２５８ペ
ージ、朝倉書店、昭和４８年）、コウジ酸（日経産業新
聞、昭和６３年５月２４日）、アルブチン（富田健一、
第２０回ＦＪセミナー予稿集、第２１ページ、フレグラ
ンスジャーナル社、平成２年３月１４日）、トリコデル
マ属に属する微生物の産生物（特開平２−１４５１８９
号公報）、シルク蛋白質のアルカリ分解物（特公昭５８
−１７７６３号公報）、乳蛋白質の加水分解物（特開平
４−６９３１５号公報）、乳から得られる蛋白質である
ラクトフェリン（特開平４−５９７１４号公報）および
その加水分解物（特開平５−３２００６８号公報）、コ
ウジ酸のアミノ酸誘導体とペプチド誘導体（特開平４−
１８７６１８号公報）等が知られている。

【０００５】また、メラニン産生細胞のメラニンの産生
を抑制するものとしては、コウジ酸、アルブチン［フレ
グランス・ジャーナル(Fragrance Journal) 、臨時増
刊、第１４号、第１２７ページ、１９９５年］、不飽和
脂肪酸［フレグランス・ジャーナル(Fragrance Journa
l) 、臨時増刊、第１４号、第１４５ページ、１９９５
年］、リン酸Ｌ−アスコルビンマグネシウム［フレグラ
ンス・ジャーナル(Fragrance Journal) 、臨時増刊、第
１４号、第１５１ページ、１９９５年］、乳清（特開平
４−１８７６１９号公報）、乳清ミネラル（特開平７−
２５２１２６号公報）、アミノ安息香酸（特公平７−１
２１８５５号公報）、ナフタレンカルボキサミドおよび
イソキノリンカルボキサミド（特開平７−６１９１９号
公報）、イソフラボン誘導体（特開昭５８−２２５００
４号公報）、桂皮酸誘導体（特開昭５９−１９６８１３
号公報）等が知られている。

【０００６】さらに、メラニン産生細胞を用いる被検物
質の評価方法を例示すれば、次のとおりである。 被検物質を添加した培養液でメラニン産生細胞を所定
期間培養した後、細胞をトリプシンで処理し、細胞を浮
遊させ、細胞塊の色調（黒色度または白色度）を肉眼で
判定する方法（特開平７−６１９１９号公報および特開
平６−３２１７５７号公報の実施例１）。 被検物質を添加した培養液でメラニン産生細胞を所定
期間培養した後、細胞およびメラニン色素を溶解し、メ
ラニン産生量をメラニン色素の吸光波長である４７０ｎ
ｍで測定し、判定する方法［キャンサー・リサーチ(Can
cer Research) 、第４５巻、第１４７４ページ、１９８
５年、およびジャーナル・オブ・セルラー・フィジオロ
ジー(Journal of Cellular Physiology)、第１６３巻、
第６０８ページ、１９９５年］。 被検物質を添加した培養液でメラニン産生細胞を所定
期間培養した後、¹⁴Ｃで放射ラベルしたチオウラシル（
¹⁴C-Thiouracil）の細胞内への取り込みまたは ³Ｈで放
射ラベルしたチロシン（³Ｈ- Tyrosine）に由来する ³
Ｈ₂ Ｏの細胞外への分泌を測定し、細胞内のチロシナー
ゼ活性の程度を測定することにより間接的にメラニンの
産生度を判定する方法［ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistr
y) 、第２６６巻、第１８３５２ページ、１９９１年、
およびジャーナル・オブ・セルラー・フィジオロジー(J
ournal of Cellular Physiology)、第１６３巻、第６０
８ページ、１９９５年］。

【０００７】一方、カゼインは哺乳類の乳汁に含まれる
蛋白質であり、乳汁に酸を添加することにより凝固沈殿
する性質を有している。カゼインは、すべての必須アミ
ノ酸を適当に含有しているので、栄養学的にはほぼ完全
な蛋白質であり、食品素材として用いられていることは
言うまでもない。カゼインは電気泳動的にα−、β−及
びγ−の３成分に分離される。このうち量的に最大であ
るα−カゼインは、カルシウムイオンにより沈殿するα
s −カゼインと、カルシウムイオンにより沈殿しないκ
−カゼインとに更に分離される。これらのカゼイン成分
は、それぞれ単独では特定の高次構造を示さないが、乳
中ではカルシウムカゼイネート・リン酸複合体の状態で
カゼインミセルを形成し、コロイド状に分散しているこ
とが知られている（生化学辞典、第２版、第２６９ペー
ジ、東京化学同人社、１９９０年）。 また、カゼイン
は工業的にも用途が広範であり、アルカリまたは石灰と
混合して接着剤として用いられている他、アルカリでゼ
ラチン化して成形し、のちホルマリンで硬化してプラス
チックを製造することも可能であり、ラニタールと称す
る人造繊維の製造、ペイント、紙のコーティングにも使
用されている（世界大百科事典、第４巻、第４６３ペー
ジ、平凡社、１９６５年）。

【０００８】さらに、カゼインは化粧品原料として用い
られ（日本公定書協会編、「化粧品原料基準」、第２版
追補注解、第４６ページ、薬事日報社、１９８７年）、
カゼインの一成分であるκ−カゼインを酵素で分解して
得られるミルクグリコペプチド（グリコマクロペプチド
またはＧＭＰとも表記されている）も化粧品原料として
用いられている（厚生省薬務局審査第二課監修、「化粧
品種別許可基準」、第５巻、第２４ページ、薬事日報
社、１９９０年）。

【０００９】このようにカゼインは食品としての安全性
は信頼されており、また工業的にも極めて有用な物質で
あることは知られていたが、カゼインの一成分であるκ
−カゼインがメラニン産生細胞のメラニン産生を抑制す
ることは、従来知られておらず、文献も皆無であった。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】前記メラニン産生細胞
を用いたメラニン産生抑制物質の評価方法のおよび
の方法においては改善すべき問題があった。すなわち、
前記の方法においては、判定を肉眼で行っているた
め、評価が極めて定性的であり、肉眼で判定するために
は通常１０⁶ 個以上の数の細胞が必要であり、このた
め、一度に多数の被検物質を評価する場合、例えば、１
０種類の被検物質を評価するためには、被検物質を評価
する前には少なくとも１０⁷ 個以上の数の細胞を用意す
る必要があり、多大な労力と時間を要するのであった。
同様に、前記の方法の場合も多数の細胞が必要であ
り、培養に多大な時間を要するのであった。また、前記
の方法は、人体に危険なアイソトープを用いるという
欠点があるうえに、メラニンの量を直接評価できないと
いう不都合がある。

【００１１】さらに、前記の方法においては、メラニ
ンの産生量を評価する作業が次に記載するとおり極めて
繁雑である。例えば、安藤らの方法［ジャーナル・オブ
・セルラー・フィジオロジー(Journal of Cellular Phy
siology)、第１６３巻、第６０８ページ、１９９５年］
によれば、被検物質を含む培養液で培養した約１０⁷個
の細胞を１，０００ｇ、５分間の遠心で回収し、次い
で、細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、再び１，
０００ｇで５分間遠心し、この洗浄の作業を２度繰り返
し、のち細胞塊を精製水０．２ｍｌに懸濁し、１ｍｌの
エタノール・エーテル溶液（エタノール：エーテル、
１：１）を添加し、室温で１５分間放置する。メラニン
はエタノール・エーテル溶液に不溶であり、細胞内脂溶
性物質はエタノール・エーテル溶液に溶解するので、
３，０００ｇで５分間遠心し、沈殿物（メラニンを含
む）にジメチルスルフォキシドを１０％含有する１規定
水酸化ナトリウム溶液を１ｍｌ添加し、キャップで蓋を
して８０℃で３０分間処理し、メラニンを溶解し、放冷
後、４７０ｎｍで吸光度を測定し、メラニンの産生量を
測定する。このように、メラニンの産生量を測定するた
めには、細胞の２度の洗浄、エタノール・エーテル溶液
での処理、エタノール・エーテル溶液不溶塊の調製、８
０℃で３０分間の熱処理および吸光度測定の少なくとも
５段階の作業が必要であり、極めて繁雑である。

【００１２】従来、一般的には前記およびの方法に
よりメラニン産生抑制物質が評価されてきたが、評価の
精度が低いため、安全性に問題がなく極めて有用な物質
であるにもかかわらず、メラニン産生抑制物質としては
見逃されていたものも存在した。この発明は、以上のと
おりの事情に鑑みてなされたものであり、従来方法の問
題点を解消し、簡便かつ精度の高いメラニン産生抑制物
質の評価方法を提供することを目的としている。

【００１３】また、昨今はすべての分野において化学合
成品に頼らない安全なものが望まれているが、この発明
は、安全性に問題のない天然物を有効成分とするメラニ
ン産生抑制剤を提供することを目的としている。

【００１４】

【課題を解決するための手段】この発明は、前記の課題
を解決するものとして、被検物質を添加した培養液でメ
ラニン産生細胞を所定期間培養し、培養したメラニン産
生細胞を膜にスロットブロットし、ブロットされた膜上
のメラニン産生細胞の色調を画像処理装置により測定
し、その色調を指標として被検物質のメラニン産生抑制
効果を評価することを特徴とするメラニン産生抑制物質
の評価方法を提供する。

【００１５】この評価方法においては、膜が、ニトロセ
ルロース膜、ポリ弗化ビニリデン膜、セルロース混合エ
ステル膜、ポリカーボネート膜、ポリテトラフルオロエ
チレン膜、親水性ポリテトラフルオロエチレン膜、ポリ
プロピレン膜またはポリビニリデンフロライド膜である
ことを望ましい態様としている。また、画像処理装置
が、イメージスキャナーまたはゲルスキャナーとコンピ
ュータとからなるものであることを別の望ましい態様と
してもいる。

【００１６】さらにこの発明は、前記メラニン産生抑制
物質の評価方法によりその有効性を確認したメラニン産
生抑制物質を有効成分として含有するメラニン産生抑制
剤を提供する。このメラニン産生抑制剤においては、メ
ラニン産生抑制物質が、κ−カゼインであること、およ
びこのκ−カゼインが、少なくとも０．１μｇ／ｇの割
合で含有されていることを望ましい態様としてもいる。

【００１７】以下、実施の形態を示してこの発明につい
て詳しく説明する。

【００１８】

【発明の実施の形態】この発明の評価方法において使用
するメラニン産生細胞は、メラニンを産生する細胞であ
ればいずれのものでもよい。具体的には、マウスメラノ
ーマＢ１６細胞、ヒト包皮由来メラノサイト等、容易に
入手し得る細胞を例示することができる。

【００１９】メラニン産生細胞を培養する器具は、通常
用いられている市販の培養シャーレ、培養プレート等で
あり、特に限定されるものではない。培養液および培養
条件も特に限定されず、メラニン産生細胞の培養に適合
するものであればよいが、具体的一例を示せば、牛胎児
血清を１０％（重量。以下特に断りのない限り同じ。）
添加したダルベッコ変法イーグル培養液を用い、５％
（容量）炭酸ガス含有雰囲気下において３７℃の温度で
培養する。

【００２０】培養したメラニン産生細胞をスロットブロ
ットする膜は、メラニン産生細胞がトラップされればい
ずれのものでもよく、例えば、ニトロセルロース膜、ポ
リ弗化ビニリデン膜、セルロース混合エステル膜、ポリ
カーボネート膜、ポリテトラフルオロエチレン膜、親水
性ポリテトラフルオロエチレン膜、ポリプロピレン膜ま
たはポリビニリデンフロライド膜等であり、より具体的
には、ポアサイズ０．４５μｍのニトロセルロース膜
（ファルマシア社製）、ポアサイズ１．２μｍのニトロ
セルロース膜（ザルトリウス社製）を例示することがで
きる。この膜に培養したメラニン産生細胞を、常法によ
りスロットブロットする。

【００２１】スロットブロットされたメラニン産生細胞
の色調の画像への取り込みに用いる画像解析装置は、そ
の装置構成および画像解析ソフトについては特に限定さ
れず、例えば、イメージスキャナーまたはゲルスキャナ
ーとコンピュータとによって構成された装置を使用する
ことができる。より具体的には、画像取り込み装置とし
ては、エプソンＧＴ−６０００イメージスキャナー（エ
プソン社製）、コンピュータしては、マッキントッシュ
・コンピュータ（ＥｐＳｃａｎ・Ｍａｃソフトを使用。
エプソン社製）を例示することができる。画像解析に用
いるソフトはＮＩＨ・Ｉｍａｇｅソフト［ウエイン・ラ
ズバンド（Wayne Rasband)氏作製］を例示することがで
きる。

【００２２】画像解析は、使用するソフトにより一様で
はないが、例えば、後記する図１に示すとおり、画像と
して取込んだバンドの色調の濃さを、画像解析ソフトに
より２次元化し、個々のバンドの色調の濃さの相対強度
を示すピークの面積を求め、定量的に測定することがで
きる。次にこの発明のメラニン産生抑制剤について詳し
く説明する。

【００２３】この発明のメラニン産生抑制剤は、前記の
評価方法によってその有効性が確認されたメラニン産生
抑制物質を有効成分として含有することを特徴としてい
る。そして、このようなメラニン産生抑制物質として
は、後記する試験例４においてその優れた効果が確認さ
れたκ−カゼインを例示することができる。このκ−カ
ゼインは、哺乳類の乳汁から公知の方法で分離したも
の、または市販品のいずれであってもよいが、工業的に
は牛乳由来のものが、より望ましい。

【００２４】この発明のメラニン産生抑制剤は、κ−カ
ゼイン等のメラニン産生抑制物質を有効成分として含有
する以外は、通常の外用剤、化粧料等と同様に各種の形
態で、公知の方法により調製することができる。具体的
には、例えば軟膏、クリーム、ファンデーション等であ
る。この発明のメラニン産生抑制剤の有効成分であるメ
ラニン産生抑制物質の配合量は、特に制限されず広範囲
から適宜選択できるが、例えばκ−カゼインを有効成分
とする場合には、後記試験例から明らかなとおり、望ま
しくは０．１μｇ〜２００ｍｇ／ｇの範囲である。ま
た、この発明のメラニン産生抑制剤は、前記評価方法に
よって新たに特定された未知のメラニン産生抑制物質と
公知のメラニン産生抑制剤とを併用することもできる。

【００２５】次に試験例を示してこの発明の作用効果に
ついて説明する。 試験例１ この試験は、ニトロセルロース膜にブロットされたメラ
ニン産生細胞の色調が画像解析できるか否かを調べるた
めに行なった。 （１）試料の調製 マウスメラノーマＢ１６細胞（理研セル・バンクから入
手。以下「Ｂ１６細胞」と記載する。）を、牛胎児血清
を１０％添加したダルベッコ変法イーグル培養液（日水
製薬社製）５ｍｌを用い、２５ｃｍ² 培養フラスコ（フ
ァルコン社製）内で、５％（容量）炭酸ガス含有雰囲気
下において３７℃の温度で単層になるまで培養した。培
養終了後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）でＢ１６細胞を洗浄
し、０．２５％トリプシン溶液を０．５ｍｌ添加し、Ｂ
１６細胞を浮遊させ、次いで、５ｍｌの１０％牛胎児血
清を含むダルベッコ変法イーグル培養液（日水製薬社
製）を添加した。１，２００ｒｐｍで１０分間遠心し、
上清を除去し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を添加し、Ｂ１
６細胞浮遊液を調製した。なお、対照としてメラニンを
産生しないマウス線維芽細胞Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞（大
日本製薬社製）を同様に培養し、細胞浮遊液を調製し
た。 （２）試験方法 前記Ｂ１６細胞浮遊液から、細胞を１×１０⁴ 個、２×
１０⁴ 個、４×１０⁴個、および８×１０⁴ 個ずつ含む
Ｂ１６細胞浮遊液（０．２ｍｌ）を調製し、バイオドッ
トＳＦ（バイオラッド社製）を用い、Ｂ１６細胞をニト
ロセルロース膜（ザルトリウス社製。ポアサイズ１．２
μｍ）にスロットブロットし、室温で乾燥し、ブロット
された膜の画像を、エプソンＧＴ−６０００スキャナー
（ＥｐＳｃａｎ・Ｍａｃソフトを使用。エプソン社製）
によりマッキントッシュ・コンピュータに取り込んだ。
ブロットされたＢ１６細胞のメラニン産生量は、ＮＩＨ
・Ｉｍａｇｅソフト［ウエイン・ラズバンド（Wayne Ra
sband)氏作製］により、画像として取り込んだ色調の濃
さを２次元化し、個々のバンドの色調の濃さの相対強度
をピーク面積から求め定量した。なお、対照のマウス線
維芽細胞Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞についても同様に画像解
析し、メラニン産生量を定量した。 （２）試験結果 この試験の結果は、図１に示すとおりである。図１のＡ
は、スロットブロットされたＢ１６細胞およびマウス線
維芽細胞Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞の色調を示し、図１のＢ
は、Ｂ１６細胞数と色調の濃さとの関係を示し、縦軸お
よび横軸は、それぞれ色調の濃さ（相対値）およびＢ１
６細胞数（×１０⁴ ）を示す。

【００２６】図１のＡから明らかなとおり、各細胞をブ
ロットした膜上において、対照細胞であるメラニン非産
生３Ｔ３細胞では黒色のバンドが認められないが、Ｂ１
６細胞では、使用した細胞数に応じてバンドの黒色の程
度が増加することが明瞭に認められた。また、図１のＢ
から明らかなとおり、Ｂ１６細胞の画像解析の結果か
ら、細胞数１〜８×１０⁴ の範囲でメラニンの産生量が
細胞数に比例して増加することが確認された。

【００２７】以上の結果から、この発明の方法では、メ
ラニン産生細胞の培養細胞数が少数（１０⁴ 個）であっ
ても、メラニンの産生量を定量的に測定し得ることが立
証された。この細胞数は、前記従来法の約１００分の１
であり、少数の培養細胞によってもメラニン産生量の定
量が可能であるというこの発明方法の利便性が確認され
た。 試験例２ この試験は、公知のメラニン産生抑制物質を使用し、実
際にそれらのメラニン産生抑制効果がこの発明の方法で
測定し得るか否かを調べるために行なった。 （１）試料の調製 公知のメラニン産生抑制物質として、コウジ酸（シグマ
社製）、アルブチン（シグマ社製）およびウシラクトフ
ェリン（オレオフィナ社製）を用い、表１および表２に
示す各種濃度で１０％牛胎児血清を含むダルベッコ変法
イーグル培養液（日水製薬社製）に溶解した。 （２）試験方法 ２４穴培養プレート（ファルコン社製）に試験例１で用
いたＢ１６細胞を１穴当たり１．５×１０⁴ ずつ蒔き、
０．５ｍｌの１０％牛胎児血清を含むダルベッコ変法イ
ーグル培養液（日水製薬社製）で培養した。２４時間
後、培養液を２ｍＭテオフィリン（シグマ社製）および
各種濃度の試料を含む同培養液（０．５ｍｌ）に交換
し、さらに３日間培養した。培養液を除去し、リン酸緩
衝液（ＰＢＳ）でＢ１６細胞を洗浄し、０．２５％トリ
プシン溶液を０．１ｍｌ添加し、Ｂ１６細胞を浮遊さ
せ、次いで、０．５ｍｌの１０％牛胎児血清を含むダル
ベッコ変法イーグル培養液（日水製薬社製）を添加し、
細胞浮遊液を調製した。バイオドットＳＦ（バイオラッ
ド社製）を用いてＢ１６細胞をニトロセルロース膜（ポ
アサイズ１．２μｍ、ザルトリウス社製）にスロットブ
ロットし、ブロットされた細胞のメラニン産生量を、試
験例１と同一の方法により測定した。なお、各表に示し
た数値は、試験検体を添加しない試料の色の濃さを１０
０として他の試料のそれを、相対的に表示した。 （３）試験結果 この試験の結果は、表１および表２に示すとおりであ
る。表１から明らかなとおり、コウジ酸およびアルブチ
ンでは、それぞれ１〜１６ｍＭおよび０．１〜１．６ｍ
Ｍの範囲で用量依存的に色調度（黒色度）が低下し、こ
れらの物質がメラニンの生産を抑制することが認められ
た。また、表２から明らかなとおり、ウシラクトフェリ
ンにおいては１００〜４００μｇ／ｍｌの濃度範囲で同
様に、メラニン産生抑制効果があることが認められた。

【００２８】以上の結果から、この発明の評価方法は、
公知のメラニン産生抑制物質の効果とその有効量を特定
可能であることが立証され、この発明方法の信頼性が確
認された。

【００２９】

【表１】

【００３０】

【表２】

【００３１】試験例３ この試験は、カゼインおよび乳清蛋白質のメラニン産生
抑制効果を調べるために行なった。 （１）試料 牛乳由来のカゼイン（和光純薬社製）および乳清蛋白質
（ＷＰＩ。ミライ社製）を、表３に示す各濃度で１０％
牛胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培養液（日水
製薬社製）に溶解した。 （２）試験方法 試験例２の同一の方法により、メラニン産生抑制効果を
測定した。 （３）試験結果 この試験の結果は、表３に示すとおりである。表３から
明らかなとおり、カゼインは１０〜１０００μｇ／ｍ
ｌ、乳清蛋白質は１００〜１０００μｇ／ｍｌの濃度範
囲でメラニン産生抑制効果があり、カゼインが乳清蛋白
質よりも、その効果が強いことが認められた。

【００３２】

【表３】

【００３３】試験例４ この試験は、カゼインの構成成分であるα−、β−、κ
−カゼイン、およびグリコマクロペプチド（ＧＭＰ）の
メラニン産生抑制効果を調べるために行なった。 （１）試料の調製 牛乳由来のα−、β−、κ−カゼイン（いずれもシグマ
社製）および参考例２記載の方法により調製したグリコ
マクロペプチド（ＧＭＰ）を、表４に示す各濃度で１０
％牛胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培養液（日
水製薬社製）に溶解した。 （２）試験方法 試験例２と同一の方法により、メラニン産生抑制効果を
測定した。 （３）試験結果 この試験の結果は、表４に示すとおりである。表４から
明らかなとおり、カゼインの構成成分ではκ−カゼイン
のみに用量依存的にメラニン産生抑制効果が認められ、
その作用濃度は１０〜１０００μｇ／ｍｌであった。こ
のことから、試験例３で認められたカゼインのメラニン
産生抑制効果はその構成成分であるκ−カゼインによる
ものであることが判明した。

【００３４】一方、κ−カゼインのＣ端側ペプチド部分
に相当するグリコマクロペプチドでは、メラニン産生抑
制効果が認められなかった。

【００３５】

【表４】

【００３６】参考例１（κ−カゼインの調製） κ−カゼインは、ジットルおよびクスター（C.A.Zittle
& J.H.Custer)の方法［ジャーナル・オブ・デイリー・
サイエンス(Journal of Daily Science)、第４６巻、第
１１８３ページ、１９６３年］により、ウシ酸カゼイン
から次のとおり調製した。

【００３７】ウシ酸カゼイン（オリエンタル酵母社製）
３５０ｇを１リットルの６．６Ｍ尿素に溶解し、この溶
液に７Ｎ硫酸を２００ｍｌを添加して酸性とし、精製水
を２リットル添加して放置し、２時間後に析出した沈殿
を濾別し、濾液１リットルに硫酸アンモニウムを１３２
ｇの割合で添加し、放置して沈殿物を濾別し、これを精
製水に懸濁し、１Ｎ水酸化ナトリウムを添加し、ｐＨを
７．５に調整して溶解し、この溶液を水に対して透析
し、凍結乾燥し、約３０ｇのκ−カゼインを得た。 参考例２（グリコマクロペプチドの調製） グリコマクロペプチドは、東らの方法［アグリカルチャ
ル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricult
ural and Biological Chemistry)、第４８巻、第２１５
９ページ、１９８４年］により、κ−カゼインから次の
とおり調製した。

【００３８】参考例１と同一の方法で得た１ｇのκ−カ
ゼインを１００ｍｌの０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６．２）に溶解し、１０ｍｇのレンネット（シグマ社
製）を添加し、３７℃で１時間振盪し、１００ｍｌの２
４％トリクロロ酢酸溶液を添加し、析出した沈殿を除去
するため１８，０００ｒｐｍで３０分間遠心し、上清を
回収し、水に対して透析し、凍結乾燥し、グリコマクロ
ペプチド約０．３ｇを得た。

【００３９】次に実施例を示してこの発明をさらに具体
的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるもの
ではない。

【００４０】

【実施例】

実施例１ カゼインの構成成分であるα−、β−およびκ−カゼイ
ン（いずれもシグマ社製）をそれぞれ１０、１００およ
び１０００μｇ／ｍｌの濃度で２ｍＭテオフィリン（シ
グマ社製）および１０％牛胎児血清を含むダルベッコ変
法イーグル培養液（日水製薬社製）に溶解した。

【００４１】２４穴培養プレート（ファルコン社製）に
Ｂ１６細胞（理研セル・バンクから入手）を１穴当たり
１．５×１０⁴ ずつ蒔き、０．５ｍｌの１０％牛胎児血
清を含むダルベッコ変法イーグル培養液（日水製薬社
製）で２４時間培養した。次いで前記各種濃度の試料を
含む培養液（０．５ｍｌ）に交換し、さらに３日間培養
し、培養液を除去し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で細胞を
洗浄し、０．２５％トリプシン溶液を０．１ｍｌ添加
し、細胞を浮遊させ、０．５ｍｌの１０％牛胎児血清を
含むダルベッコ変法イーグル培養液（日水製薬社製）を
添加し、Ｂ１６細胞浮遊液を調製した。

【００４２】バイオドットＳＦ（バイオラッド社製）を
用いてＢ１６細胞をニトロセルロース膜（ポアサイズ
１．２μｍ、ザルトリウス社製）にスロットブロット
し、室温で乾燥し、ブロットされた膜の画像をエプソン
ＧＴ−６０００イメージスキャナー（ＥｐＳｃａｎ・Ｍ
ａｃソフトを使用。エプソン社製）によりマッキントッ
シュコンピュータ−に取り込み、ブロットされたＢ１６
細胞のメラニン産生量を、ＮＩＨ・Ｉｍａｇｅソフト
［ウエイン・ラズバンド氏(Wayne Rasband) 作製］によ
り画像として取り込んだ色調の濃さを２次元化し、個々
のバンドの色調の濃さの相対強度をピーク面積から求め
定量化した。

【００４３】その結果は、表５に示すとおりであり、κ
−カゼインのみが１０〜１０００μｇ／ｍｌの濃度で用
量依存的にメラニン産生抑制効果が認められ、カゼイン
構成成分のメラニン産生抑制成分を評価することができ
た。

【００４４】

【表５】

【００４５】実施例２ κ−カゼイン（参考例１の方法で調製） １（ｇ） 白色ワセリン ２５ ステアリルアルコール ２２ プロピレングリコール １２ ウラリル硫酸ナトリウム １．５ パラオキシ安息香酸メチル ０．０２５ パラオキシ安息香酸プロピル ０．０１５ 精製水 ３８．４６ 常法により前記成分を配合し、１００ｇの親水性軟膏を
製造した。なお、κ−カゼイン以外の原料はいずれも市
販品を用いた。 実施例３ κ−カゼイン（参考例１の方法で調製） １０（ｇ） ポリオキシエチレンステアリルエーテル ２ ポリオキシエチレンセチルエーテル ３ ミツロウ ４ セタノール ３ ラノリン １ イソプロピルパルミテート ２ 流動パラフィン １５ ポリエチレングリコールモノステアレート ０．５ パラオキシ安息香酸メチル ０．１ 精製水 ５９．４ 常法により前記成分を配合し、１００ｇのクリームを製
造した。なお、κ−カゼイン以外の原料はいずれも市販
品を用いた。 実施例４ κ−カゼイン（参考例１の方法で調製） ０．１（ｇ） ステアリン酸 ２．４ モノステアリン酸プロピレングリコール ２．０ セトステアリルアルコール ０．２ 液状ラノリン ２．０ 流動パラフィン ３．０ ミリスチン酸イソプロピル ８．５ 防腐剤 適量 カルボキシメチルセルロースナトリウム ０．２ ベントナイト ０．５ プロピレングリコール ４．０ トリエタノールアミン １．０ 酸化チタン ８．０ タルク ４．０ 着色料 適量 精製水 ６４．１ 常法により前記成分を配合し、約１００ｇのファンデー
ションを製造した。なお、κ−カゼイン以外の原料はい
ずれも市販品を用いた。 実施例５ κ−カゼイン（参考例１の方法で調製） ０．０１（ｇ） エタノール ３．０ パラオキシ安息香酸メチル ０．１ カルボキシビニルポリマー １．０ 炭酸カルシウム ０．３ 精製水 ９５．５９ 常法により前記成分を配合し、約１００ｇのパックを製
造した。なお、κ−カゼイン以外の原料はいずれも市販
品を用いた。

【００４６】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって、被検物質のメラニン産生抑制効果を簡便かつ高
精度に評価することのできる評価方法と、この評価方法
によって有効性が確認されたメラニン産生抑制物質を有
効成分として含有するメラニン産生抑制剤が提供され
る。このメラニン産生抑制剤は、例えば、食品である乳
由来の蛋白質であるカゼインの構成成分であるκ−カゼ
インを有効成分としているので安全であり、副作用等の
問題はない。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ａは、膜にスロットブロットされた各細胞の色
調を示し、ＢはＢ１６細胞の画像処理後の色の濃さ（メ
ラニンの産生度）と細胞数との関係を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (72)発明者 中島 光業 神奈川県座間市東原５−１−83 森永乳業 株式会社栄養科学研究所内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被検物質を添加した培養液でメラニン産
   生細胞を所定期間培養し、培養したメラニン産生細胞を
   膜にスロットブロットし、ブロットされた膜上のメラニ
   ン産生細胞の色調を画像処理装置により測定し、この色
   調を指標として被検物質のメラニン産生抑制効果を評価
   することを特徴とするメラニン産生抑制物質の評価方
   法。
2. 【請求項２】 膜が、ニトロセルロース膜、ポリ弗化ビ
   ニリデン膜、セルロース混合エステル膜、ポリカーボネ
   ート膜、ポリテトラフルオロエチレン膜、親水性ポリテ
   トラフルオロエチレン膜、ポリプロピレン膜またはポリ
   ビニリデンフロライド膜である請求項１のメラニン産生
   抑制物質の評価方法。
3. 【請求項３】 画像処理装置が、イメージスキャナーま
   たはゲルスキャナーとコンピュータとからなる請求項１
   または２のメラニン産生抑制物質の評価方法。
4. 【請求項４】 請求項１記載のメラニン産生抑制物質の
   評価方法によりその有効性を確認したメラニン産生抑制
   物質を有効成分として含有するメラニン産生抑制剤。
5. 【請求項５】 メラニン産生抑制物質が、κ−カゼイン
   である請求項４のメラニン産生抑制剤。
6. 【請求項６】 κ−カゼインが、少なくとも０．１μｇ
   ／ｇの割合で含有されている請求項５のメラニン産生抑
   制剤。